CN110106153B

CN110106153B - 一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体

Info

Publication number: CN110106153B
Application number: CN201910440487.8A
Authority: CN
Inventors: 方芳; 周景文; 杨涛; 徐洁; 陈坚; 堵国成
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-05-24
Filing date: 2019-05-24
Publication date: 2020-12-29
Anticipated expiration: 2039-05-24
Also published as: CN110106153A; US11008552B2; US20190382735A1

Abstract

本发明公开了一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体。本发明通过定点突变将野生型多铜氧化酶WT的第317位苏氨酸突变成天冬酰胺、第386位亮氨酸突变成酪氨酸、第427位丝氨酸突变成谷氨酸，构成突变体T317N‑L386Y‑S427E。T317N‑L386Y‑S427E较WT相比，对6％、9％、12％、15％、18％NaCl(W/V)的耐受性均有所提高。

Description

一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体

技术领域

本发明涉及一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体，尤其是一种耐盐性提高的解淀粉芽孢杆菌来源的多铜氧化酶突变体，属于生物工程技术领域。

背景技术

生物胺是一类具有生物活性的低分子量的含氮有机物的总称，是生物体内正常的生理活性物质。人体自身合成的适量的生物胺有助于维持机体正常的生理功能，但是，通过食物摄入过量生物胺时，会引起头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重时危及生命。

生物胺广泛存在于乳制品、水产品、肉制品、果汁、调味品等蛋白质含量比较丰富的发酵食品以及含酒精发酵饮品中。除了食品中本身所含有的生物胺以外，发酵食品中的生物胺大多是经过氨基脱羧作用形成的。食品中丰富的蛋白质在内肽酶和外肽酶的共同作用下分解为氨基酸，在对应的氨基酸脱羧酶的催化下，氨基酸氧化生成生物胺。食品中常见的生物胺主要包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺和组胺等。生物胺中毒性最大的是组胺，其次是酪胺。

随着生活水平的提高，人们对食品安全的要求越来越高，而生物胺的潜在毒性作用对人体健康构成的危害不容小觑，因此应采取有效措施进行控制和减少。目前，食品中生物胺含量的控制主要从三个方面着手：(1)从源头控制：①食品中的生物胺大多是经过氨基脱羧作用形成的，控制游离氨基酸的含量，可以减少生物胺的含量，然而，食品中游离氨基酸主要是原料中蛋白质水解的产物，控制游离氨基酸的含量就意味着要减少蛋白质的含量，这样做会影响某些高蛋白食品的风味；②采用无氨基酸脱羧酶活性的菌株代替原生产菌种，在发酵一开始就加入到发酵体系中，但是，由于混菌发酵和开放发酵的原生产菌株种类多且关系复杂，替代其中一个菌株可能会造成整个发酵体系的改变，最终导致发酵失败，所以这种控制方式一般仅适用于封闭的单菌发酵体系。(2)过程控制：①通过对生产过程中的原料、温度和盐度进行合理选择，抑制生物胺产生菌的生长，以达到抑制生物胺产生的目的；这种方法的局限性在于加工温度和盐度等因素多由食物特性决定，而低温贮藏会提高设备和能耗费用，且有些微生物低温下也能产生生物胺；②在发酵过程中添加降解生物胺的菌株，在不影响发酵体系中的用于生产的优势菌株的情况下，降解发酵过程中产生的生物胺，但，这种方法的局限性在于人们担心添加菌株的安全性以及可能会影响食物风味。(3)末端消除：通过向发酵食品中添加生物胺降解酶来降解食品中已经形成的生物胺，这种方法基本不影响发酵食品的生产工艺，且对食品营养和风味的影响也较小，是目前最具应用前景的方法。

关于生物胺降解酶，有研究者尝试从筛选得到的能够降解生物胺的菌株中分离纯化出具有分解生物胺能力的酶，并对酶的作用机制进行了初步分析。胺氧化酶、胺脱氢酶和多铜氧化酶是目前主要的三类具备降解生物胺能力的酶。可降解生物胺的胺氧化酶和组胺脱氢酶只能特异性地作用于某种或某几种生物胺，且酶的活性还受乙醇或羰基化合物的抑制，同时，酶的最适pH多为中性，因此，当应用这两类酶降解含酒精的发酵饮品以及酸性发酵食品中的生物胺时，难以取得理想的效果。多铜氧化酶可催化多种生物胺氧化生成对应的醛、氨和水，其活性受酸性环境以及乙醇影响较小，但，高盐发酵食品(例如酱油含盐18％)中的高盐环境会使酶很快失活从而影响了酶对生物胺的降解效果。因此，提高多铜氧化酶的耐盐性对于建立发酵食品中生物胺的酶法减控方法具有重要的意义。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体及其制备方法。所述耐盐性是指多铜氧化酶对NaCl的耐受能力，所述耐盐性提高是指多铜氧化酶对NaCl的耐受能力提高。

[技术方案]

本发明提供了一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体，所述突变体是通过将Bacillus amyloliquefaciens多铜氧化酶的第317位的苏氨酸突变成天冬酰胺、第386位的亮氨酸突变成酪氨酸以及第427位的丝氨酸突变成谷氨酸，得到的突变体T317N-L386Y-S427E。所述多铜氧化酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

编码所述多铜氧化酶突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供以上所述的一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

(1)在Bacillus amyloliquefaciens的多铜氧化酶的氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带Bacillus amyloliquefaciens的编码多铜氧化酶的基因的载体为模板进行定点突变，构建得到含编码突变体的基因的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化获得多铜氧化酶突变体。

[有益效果]

本发明通过对来源于Bacillus amyloliquefaciens的多铜氧化酶进行改造，使得突变体T317N-L386Y-S427E在不同浓度(6％、9％、12％、15％、18％(W/V))的NaCl中的耐受性都有所提高，相对酶活较未经突变的多铜氧化酶(WT)提高15％以上。耐盐性提高的多铜氧化酶突变体T317N-L386Y-S427E，可以用于降解发酵食品中的生物胺，例如酱油、发酵香肠、咸肉等。

附图说明

图1不同温度对未经突变的多铜氧化酶(WT)和突变体T317N-L386Y-S427E的酶活的影响。

图2不同pH对未经突变的多铜氧化酶(WT)和突变体T317N-L386Y-S427E的酶活的影响。

图3不同浓度NaCl(W/V)对未经突变的多铜氧化酶(WT)和突变体的酶活的影响。

具体实施方式

PrimerSTAR DNA聚合酶和Soution I DNA连接酶购自TaKaRa公司(大连)；EcoR I、Hind III、DpnI快速限制性内切酶和DNA回收试剂盒均购自Thermo Fisher Scientific公司(美国)；质粒提取试剂盒和卡那霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司；ABTS购自aladdin公司。其他试剂均为分析纯的试剂。

测定多铜氧化酶酶活的反应体系及方法：

采用可见光吸收测定法测定多铜氧化酶酶活：采用的底物为ABTS，利用反应动力学仪器检测酶与底物反应2min后的吸光度来计算多铜氧化酶酶活。反应体系包括100μL酶液、2900μL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中含有0.5mM的ABTS、1mM的CuCl₂)。反应温度和pH采用酶的最适温度和最适pH。将每分钟催化1μmol底物发生氧化所需的酶的量定义为一个酶活力单位(U)。

式中：

ε：ABTS在420nm下的摩尔吸光系数，ε＝3.6×10⁴M^-1cm^-1

Δt：2min；

ΔOD：2min内，吸光度OD₄₂₀的变化值；

V₁：酶反应体系中，反应液的总体积，即3mL；

V₂：酶反应体系中，酶液的体积，即100μL。

实施例1：重组菌构建

选择带有T7启动子的质粒pET28a(+)为表达载体，将pET28a(+)质粒和扩增得到的如GenBank号为CP011252.1所示的编码未经突变的多铜氧化酶的mcob基因(在GenBank号为 CP011252.1所示的核苷酸序列后加上编码组氨酸的序列CATCATCACCACCACCACTAA)分别进行EcoRI和HindIII双酶切，酶切产物切胶回收后，再用DNA连接酶Solution I过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，经37℃培养10h，通过菌落PCR鉴定阳性转化子。

挑取3个阳性转化子，接种于液体LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)，经37℃培养10h，提取质粒进行测序验证，将测序结果正确的质粒pET28a(+)-MCOB转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，然后，将转化物涂布在含50μg/ml卡那霉素的固体LB平板培养基上，37℃培养10h，挑取单菌落，命名为BL21(DE3)-pET28a(+)-MCOB(WT)，并接种于含50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，经37℃培养10h，将菌液保存到甘油管中。

实施例2：突变体T317N-L386Y的制备

(1)突变体T317N的制备

根据B.amyloliquefaciens的多铜氧化酶的基因序列，设计并合成引入T317N突变的引物，利用快速PCR技术，以表达载体pET28a(+)-MCOB为模板，

引入T317N突变的定点突变引物为：

上游引物：5’-TTTTAAACAACGGCACCGGCTG-3’(下划线为突变碱基)

下游引物：5’-GTGCCGTTGTTTAAAATAATATGTTCTCCG-3’(下划线为突变碱基)

PCR反应体系为：2 x PrimerSTARDNA聚合酶25μL，上游引物(10μM)1μL，下游引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，ddH₂O 22μL。

PCR扩增条件为：95℃预变性3min；随后30个循环(98℃30s，55℃30s，72℃7min)；72℃补齐延伸10min。

PCR产物经DpnI消化，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆进行测序，将测序结果正确的菌株保存到甘油管中，菌株命名为BL21(DE3)-pET28a(+)-T317N，该菌株所表达的多铜氧化酶突变体命名为T317N。

(2)突变体T317N-L386Y的制备

根据B.amyloliquefaciens的多铜氧化酶的基因序列，设计并合成引入L386Y突变的引物，利用快速PCR技术，以携带编码突变体T317N的基因的载体为模板，

引入L386Y突变的定点突变引物为：

上游引物：5’-GCCGGTTTATACGCTCAATAACAAGC-3’(下划线为突变碱基)

下游引物：5’-GTTATTGAGCGTATAAACCGGCCGG-3’(下划线为突变碱基)

PCR产物经DpnI消化，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆进行测序，将测序结果正确的菌株进行甘油管保存，菌株命名为BL21(DE3)-pET28a(+)-T317N-L386Y，该菌株所表达的多铜氧化酶突变体命名为T317N-L386Y。

实施例3：突变体T317N-L386Y-S427E的制备

根据B.amyloliquefaciens的多铜氧化酶的基因序列，设计并合成引入S427E突变的引物，利用快速PCR技术，以携带编码突变体T317N-L386Y的基因的载体为模板，

引入S427E突变的定点突变引物为：

上游引物：5’-CACCTGCACTTGGTTGAGTTCCAAGTCCTTGACCGG-3’(下划线为突变碱基)

下游引物：5’-CAAGGACTTGGAACTCAACCAAGTGCAGGTGTATCGG-3’(下划线为突变碱基)

PCR产物经DpnI消化，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑选单克隆送上海生工测序，将测序结果正确的菌株进行甘油管保存，菌株命名为BL21(DE3)-pET28a(+)-T317N-L386Y-S427E，该菌株所表达的多铜氧化酶突变体命名为T317N-L386Y-S427E。

实施例4：突变体T317N-L386Y-S427E的发酵与纯化

将BL21(DE3)-pET28a(+)-T317N-L386Y-S427E接种于含50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基，37℃，220rpm培养10h，按2％接种量将种子发酵液接种到含50μg/ml卡那霉素的TB培养基中，37℃，220rpm培养到OD₆₀₀＝0.6-0.8时，加入0.1mM的IPTG和1mM的CuCl₂，20℃，220rpm诱导培养20-22h。将所得发酵液于4℃、8000r/min离心15min，收集菌体沉淀物，用20mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液将菌体洗涤2遍，之后磷酸盐缓冲液将菌体重悬。将菌体悬液置于冰水浴上，利用超声波破碎菌体，超声波功率为35％、振2s停4s，直至溶液清亮为止。将破碎液于4℃、10 000r/min离心30min收集上清即为粗酶液。粗酶液用0.22μm滤膜过滤后经镍柱纯化获得纯酶，经过测定，比酶活为5.58U/mg。

将重组菌BL21(DE3)-pET28a(+)-MCOB(WT)和BL21(DE3)-pET28a(+)-T317N-L386Y按照上述方法进行发酵培养，并分离得到未经突变的多铜氧化酶(WT)和突变体T317N-L386Y，测定得到多铜氧化酶(WT)和突变体T317N-L386Y的比酶活分别为3.33U/mg和5.79U/mg。

实施例5：多铜氧化酶酶活测定及酶学性质分析

(1)温度对多铜氧化酶酶活的影响

采用可见光吸收测定法，将纯化得到的多铜氧化酶与底物分别在不同温度(40、45、50、55、60、65℃)下测定酶活，以最高的酶活为100％，计算各温度下的相对酶活，以此确定酶的最适反应温度，结果显示WT、T317N-L386Y和T317N-L386Y-S427E的最适反应温度都为55℃。

(2)pH对多铜氧化酶酶活的影响

在最适温度55℃下，采用可见光吸收测定法测定酶在不同pH(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0)下的酶活，以最高的酶活为100％，计算各pH条件下的相对酶活，确定最适反应pH，结果显示WT、T317N-L386Y和T317N-L386Y-S427E的最适反应pH都为pH 3.0。

(3)NaCl对多铜氧化酶酶活的影响

取100μL镍柱纯化后的WT、T317N-L386Y和T317N-L386Y-S427E放在2mL含3％、6％、9％、12％、15％、18％NaCl(W/V，g/100mL)的磷酸盐缓冲液中，立即测定初始酶活，并于4℃放置1h后测定剩余酶活，相对酶活等于剩余酶活除以初始酶活。酶活是在55℃，pH 3.0的条件下测得的。T317N-L386Y-S427E、T317N-L386Y和WT在3％NaCl(W/V)中处理1h后酶活都几乎没有损失；在6％、9％、12％、15％、18％NaCl(W/V)中处理1h后，T317N-L386Y的剩余酶活和WT变化不大，T317N-L386Y-S427E的剩余酶活都比WT高，表明突变体T317N-L386Y-S427E的耐盐性较WT有所提高(见表1)。

表1 NaCl对WT和突变体酶活的影响

3％

6％

9％

12％

15％

18％

WT

99.5％

83.5％

64.5％

53.0％

37.3％

31.4％

T317N-L386Y

98.2％

84.0％

63.5％

51.0％

35.4％

33.2％

T317N-L386Y-S427E

99.9％

100.2％

76.0％

67.5％

60.3％

41.5％

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种耐盐性提高的多铜氧化酶突变体

<130> BAA190394A

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Leu Glu Lys Phe Ala Asp Glu Leu Pro Ile Ile Glu Thr Leu

1 5 10 15

Lys Pro Gln Lys Thr Ser Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Glu Val Thr Met

20 25 30

Lys Glu Cys Phe His Lys Leu His Arg Asp Leu Pro Pro Thr Arg Leu

35 40 45

Trp Gly Tyr Asn Gly Leu Phe Pro Gly Pro Thr Ile Asp Val Asn Gln

50 55 60

Asp Glu Asn Val Tyr Ile Lys Trp Met Asn Asp Leu Pro Asp Lys His

65 70 75 80

Phe Leu Pro Val Asp His Thr Ile His His Ser Glu Gly Gly His Gln

85 90 95

Glu Pro Asp Val Lys Thr Val Val His Leu His Gly Gly Ala Thr Pro

100 105 110

Pro Asp Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Thr Arg Asp Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Gly Pro Tyr Phe Lys Lys Glu Val Tyr His Tyr Pro Asn Lys

130 135 140

Gln Arg Gly Ala Leu Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Ile Thr

145 150 155 160

Arg Leu Asn Val Tyr Ala Gly Leu Ala Gly Met Tyr Ile Ile Arg Glu

165 170 175

Arg Lys Glu Lys Gln Leu Lys Leu Pro Ala Gly Glu Tyr Asp Val Pro

180 185 190

Leu Met Ile Met Asp Arg Thr Leu Asn Asp Asp Gly Ser Leu Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Gly Pro Asp Asn Pro Ser Glu Thr Leu Pro Asn Pro Ser Ile

210 215 220

Val Pro Phe Leu Cys Gly Asn Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Ala Trp

225 230 235 240

Pro Tyr Met Glu Val Glu Pro Arg Thr Tyr Arg Phe Arg Ile Leu Asn

245 250 255

Ala Ser Asn Thr Arg Thr Phe Ser Leu Ser Leu Asn Asn Gly Gly Arg

260 265 270

Phe Ile Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Val Lys

275 280 285

Thr Gln Ser Ile Ser Leu Ala Pro Ala Glu Arg Tyr Asp Val Leu Ile

290 295 300

Asp Phe Ser Ala Phe Asp Gly Glu His Ile Ile Leu Asn Asn Gly Thr

305 310 315 320

Gly Cys Gly Gly Asp Val Asn Pro Asp Thr Asp Ala Asn Val Met Gln

325 330 335

Phe Arg Val Thr Lys Pro Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ser Arg Lys Pro

340 345 350

Lys Tyr Leu Ser Ala Met Pro Asp Met Thr Ser Lys Arg Ile His Asn

355 360 365

Ile Arg Thr Leu Lys Leu Thr Asn Thr Gln Asp Lys Tyr Gly Arg Pro

370 375 380

Val Tyr Thr Leu Asn Asn Lys Arg Trp His Asp Pro Val Thr Glu Ala

385 390 395 400

Pro Arg Leu Gly Ser Thr Glu Ile Trp Ser Ile Ile Asn Pro Thr Arg

405 410 415

Gly Thr His Pro Ile His Leu His Leu Val Glu Phe Gln Val Leu Asp

420 425 430

Arg Arg Pro Phe Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Phe Gly Asp Ile Val

435 440 445

Tyr Thr Gly Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Glu Lys Gly Trp Lys

450 455 460

Asp Thr Val Gln Ala His Ser Gly Glu Val Ile Arg Ile Ala Ala Thr

465 470 475 480

Phe Ala Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu Glu

485 490 495

His Glu Asp Tyr Asp Met Met Arg Pro Met Asp Val Thr Glu Lys Gln

500 505 510

His His His His His His

515

<210> 2

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcacttg aaaaatttgc agatgaactg ccgattatcg aaacactgaa gccgcagaag 60

acatcaaacg gcagcacgta ttatgaagtc acgatgaagg aatgctttca caagctgcac 120

cgtgatctcc cgccgacccg gctgtgggga tataacggtt tgtttcccgg cccgacgatt 180

gatgtgaacc aagatgaaaa cgtctatatt aaatggatga atgacctgcc ggataagcat 240

tttctccctg tggaccatac cattcaccat tcagagggcg gccatcagga acccgacgtc 300

aaaactgtcg tccatttaca cggaggagca acgccgccgg acagcgacgg ctatccggaa 360

gcctggttca cacgggattt caaggagaag gggccttatt ttaaaaaaga ggtataccac 420

tatccaaaca aacagcgcgg ggcgctatta tggtatcacg accacgccat ggcaattacg 480

aggctcaatg tgtacgccgg gcttgccggc atgtatatca tccgcgagcg aaaagaaaag 540

cagctgaagc ttcccgccgg agaatacgac gtaccgctta tgattatgga ccgcacgtta 600

aatgacgacg gttccttgtt ttatccgagc gggcccgata atccttccga aacgctgccg 660

aatccttcaa tcgttccgtt tctttgcgga aataccattc tcgtcaacgg caaagcgtgg 720

ccgtatatgg aagtcgaacc gcggacatat cgtttccgta tccttaacgc ctcaaatacg 780

agaacatttt ctctctcgct caataatggc ggccggttta tccaaatcgg ttcagacggc 840

ggactgctcc cccgttctgt caaaacacag tccatcagct tagcaccggc tgagcggtat 900

gatgtgctca ttgatttctc cgcttttgac ggagaacata ttattttaaa caacggcacc 960

ggctgcgggg gcgacgtcaa tccggatacc gacgccaatg tgatgcaatt ccgcgtcaca 1020

aaaccgctga agggagaaga caccagccgg aagcctaaat atctgtcagc catgcctgat 1080

atgacatcaa aaagaataca caatatcagg acgcttaaac tcacaaacac gcaagacaaa 1140

tacggccggc cggtttatac gctcaataac aagcgctggc atgatcccgt gacagaagcg 1200

ccgcggctcg gctcaacgga aatctggtcg attatcaatc cgacgcgggg aacccatccg 1260

atacacctgc acttggttga gttccaagtc cttgaccggc gtccttttga cttagaacgt 1320

tataacaaat tcggcgacat tgtgtataca ggccccgccg tcccgccgcc tccaagtgaa 1380

aaaggctgga aagacaccgt gcaggcgcac tccggagaag tcatcagaat cgcggcgaca 1440

ttcgcccctt acagcggacg gtacgtatgg cattgtcata ttttagaaca cgaagattat 1500

gacatgatga gaccgatgga cgtcacagaa aagcagcatc atcaccacca ccactaa 1557

Claims

1.一种多铜氧化酶突变体，其特征在于，是将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的多铜氧化酶的第317位苏氨酸突变成天冬酰胺、第386位亮氨酸突变成酪氨酸，且第427位丝氨酸突变成谷氨酸；所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述多铜氧化酶突变体的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

3.携带权利要求2所述基因的细胞或者载体。

4.表达权利要求2所述基因的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌或者酵母菌或者枯草芽孢杆菌或者其他真核细胞为宿主，通过载体表达所述基因或者将所述基因整合到宿主的基因组上进行表达。

5.一种重组表达权利要求1所述多铜氧化酶突变体的重组大肠杆菌，其特征在于，是以大肠杆菌BL21为宿主，以pET系列质粒为表达载体。

6.应用权利要求5所述重组大肠杆菌生产多铜氧化酶的方法，其特征在于，是将重组大肠杆菌接种至培养基中培养并诱导细胞产生多铜氧化酶，然后收集菌体细胞，破碎细胞，从细胞破碎液中获得多铜氧化酶。

7.权利要求1所述多铜氧化酶突变体在降解去除食品中的生物胺中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述食品包括酱油，将多铜氧化酶添加至酱油中，降解酱油中的生物胺。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述生物胺包括色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺、亚精胺中的至少一种。