CN108060142A

CN108060142A - 一种降解酱油中生物胺的酶

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Publication number: CN108060142A
Application number: CN201711444305.1A
Authority: CN
Inventors: 方芳; 徐洁; 陈坚; 周景文; 曾伟主
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2037-12-27
Also published as: CN108060142B

Abstract

本发明公开了一种降解酱油中生物胺的酶，属于发酵技术领域。本发明提供的多铜氧化酶粗酶序列如SEQ ID NO.1所示，该酶对酱油中的色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺这几种生物胺具有，不同程度的降解作用，其中酱油中含量最多的酪胺浓度为540.71mg/L，添加本发明提供的多铜氧化酶粗酶后，24小时内就降低了100mg/L，与现有的纯酶添加进生物胺混合液24h，降低58.57mg/L相比，降解时间短，效果好。

Description

一种降解酱油中生物胺的酶

技术领域

本发明涉及一种降解酱油中生物胺的酶，属于发酵技术领域。

背景技术

生物胺是生物体内产生的一类低分子质量含氮有机化合物的总称，它们是生物体合成荷尔蒙、核苷酸、蛋白质的前体。生物体自身合成的适量生物胺具有促进生长、增强代谢活力、加强肠道免疫系统、控制血压和消除自由基等生理功能，但是摄入过量外源生物胺会引起血管、动脉和微血管的扩大，导致生物体的不良反应，如高血压、头疼、腹部痉挛、腹泻和呕吐等。食品中常见的生物胺主要包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、酪胺、苯乙胺和组胺等。

根据检测市售31种酱油样品，酱油样品的总生物胺含量的范围为41.18-1898.17mg/L，其中组胺、酪胺是酱油样品中含量最高的生物胺，为0-490mg/L、0-650mg/L，其次为腐胺和苯乙胺，含量范围分别为0-595.98mg/L、0-334.96mg/L，FDA规定食品中生物胺总量≤1000mg/kg，而多数市售酱油总量为最高标准的1.5～2倍，组胺≤100mg/kg，而市售酱油为最高标准的4～5倍。酱油一般都是在非密闭环境中生产，杂菌控制十分困难，无法保证生产菌种的绝对单一性，因此，通过控制产氨基酸脱羧酶的微生物来控制生物胺的方法有限。目前，酶法降解生物胺最具可行性，不仅不损害食品营养，还不产生新的毒性物质，现有的生物胺降解酶有胺氧化酶，胺氧化酶包括伯胺氧化酶、二胺氧化酶、单胺氧化酶，其中伯胺氧化酶只能降解苯乙胺，最适pH7.0，二胺氧化酶只对二胺尤其是对组胺起作用，最适pH8.5，单胺氧化酶能降解酪胺、色胺，最适pH6.0～7.0，这几个酶存在3个共性问题：1)降解的生物胺类型少；2)降解效率低；3)最适pH偏中性，不适合应用于酸性发酵食品中，应用到酱油中的酶需要耐盐，耐酸。

多铜氧化酶是一类可通过其光谱学性质，同源性的序列及与底物的反应机理定义的一类含铜氧化酶家族，它将生物胺催化氧化成对应的醛、氨和水，达到降低生物胺含量的目的。含多铜氧化酶基因的菌可代谢产生多铜氧化酶，将其所产生的多铜氧化酶进行粗提后加入酱油中，这将大幅度降低酱油中的生物胺，同时降低生产成本并提高食品安全性。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明创造性地采用酶法来降低生物胺，即筛选含有多铜氧化酶基因的菌株，将其所产生的多铜氧化酶进行粗提后加入酱油中，从而提供一种降解酱油中生物胺的酶及一种降低发酵食品中生物胺的方法。

本发明的第一个目的是提供一种多铜氧化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述多铜氧化酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供携带该基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达该多铜氧化酶的重组菌。

本发明的第五个目的是提供一种降低酱油中生物胺含量的方法，所述方法是向酱油中加入所述多铜氧化酶。

在本发明的一种实施方式中，所述多铜氧化酶以酶液的形式存在。

在本发明的一种实施方式中，所述多铜氧化酶以细胞为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述多铜氧化酶以10～20U/mL的添加量加入至酱油中。

本发明还提供所述多铜氧化酶在食品、化工、医药领域的应用。

有益效果：本发明提供的多铜氧化酶粗酶，对酱油中的色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺这几种生物胺具有不同程度的降解作用，其中酱油中含量最多的酪胺浓度为540.71mg/L，添加本发明提供的多铜氧化酶粗酶后，24小时内就降低了100mg/L，与现有的纯酶降解生物胺混合液(24h降低58.57mg/L)的技术相比，本发明具有在相同时间内降解效率高的优势。

附图说明

图1为降生物胺菌株的颜色筛选示意图；

图2为Bacillus amyloliquefaciens中多铜氧化酶基因的PCR扩增结果；M，Marker；1，阴性对照；2，Bacillus amyloliquefaciens中多铜氧化酶；

图3为多铜氧化酶在不同温度下的相对酶活；

图4多铜氧化酶在不同pH下的相对酶活；

图5金属离子对多铜氧化酶酶活的影响；

图6盐浓度对多铜氧化酶酶活的影响；

图7乙醇浓度对多铜氧化酶酶活的影响。

具体实施方式

实施例1含多铜氧化酶基因的菌株的高通量筛选

1、不产生物胺菌株的高通量筛选

将酱醪样品用无菌生理盐水混匀，稀释不同倍数涂布于LB培养基，37℃，静置过夜培养后，选择单菌落合适的平板。预先在每个孔板中加入1mL LB培养基，用Qpix420自动挑菌仪将单菌挑取至96孔板，37℃静止培养24h。再转接到生物胺检测液体培养基中(空白对照不接菌)，37℃静置培养48h后观察颜色变化，和空白对照颜色一样不变色的为阳性，变紫色的为阴性。通过采用高通量筛选技术，从8000个菌株中筛选获得了70株阳性菌株。

2、降生物胺菌株的筛选

将70株阳性菌株接种到MRS培养基中，37℃静置培养24小时，离心收集菌体，用无菌生理盐水洗两遍，然后添加到生物胺混合液中，共培养48h，离心收集上清液，加入新制Cu(OH)₂加热反应1min。含有多铜氧化酶基因的菌株，能够将生物胺催化氧化成对应的醛、氨和水，根据醛和新制Cu(OH)₂反应生成砖红色的沉淀Cu₂O这一现象，以反应液出现砖红色沉淀的为具有降解生物胺能力的阳性菌株，不变色的为阴性。如图1所示，试管1只含有生物胺混合液的空白对照；试管2为未出现砖红色沉淀的样品，和对照一样为蓝色；试管3为出现砖红色沉淀的样品。根据反应液呈现的砖红色沉淀的效果，筛选获得1株菌株，

3、利用菌落PCR验证上述步骤筛选得到的菌株是否含有编码多铜氧化酶的基因

跟据16S rDNA测序结果，鉴定所筛到的降生物胺菌株为Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)，根据NCBI中的BacillusamyloliquefaciensstrainCMW1(NCBI Reference Sequence:NZ_DF836084.1)中的多铜氧化酶的基因序列，设计引物，验证Bacillus amyloliquefaciens是否含有多铜氧化酶基因。

引物：上游：ATGGCACTTGAAAAATTTGC

下游：TTACTGCTTTTCTGTGACGTC

PCR反应程序：95℃下先预变性3min，然后进行以下循环：95℃下变性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min30s；34个循环后，72℃下延伸10min，4℃下保温。

以Bacillus amyloliquefaciens的基因组为模板，PCR扩增，扩增结束后由1％琼脂糖凝胶电泳显示扩增结果，如图2所示，成功扩增获得1500bp左右的条带，与目的条带大小一致，经测序验证，Bacillus amyloliquefaciens中含有多铜氧化酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2多铜氧化酶粗酶对酱油中生物胺的降解

将所筛含多铜氧化酶基因的菌株，接种到含0.5～1mmol/LCu²⁺的LB培养基中，37℃，220rmp/min，培养18～24h，培养完成后，7000～10000r/min，离心5～10min收集菌体，重复2～3次，进行超声破碎。将得到的破碎液过滤离心，上清液经过3KD蛋白超滤管浓缩，得到浓缩3～5倍的粗酶液。

取2ml粗酶液与2mL某品牌市售酱油进行混合，将混合物置于37℃培养箱中静置48h后，于4℃、10000r/min离心5min取上清液，用HPLC法检测生物胺的含量取2ml加热失活的粗酶液与2mL同品牌市售酱油进行混合作为对照组。结果如表1所示。

表1酱油中生物胺的含量

实施例3多铜氧化酶粗酶的酶学性质

(1)多铜氧化酶的最适温度

将粗酶液与底物分别在25、35、40、45、50、55、60、70、80℃水浴条件下反应10min，测定酶活，确定酶的最适反应温度，以最高的酶活为100％。结果如图3所示，当温度为45～55℃时，酶较稳定，活力能保持在最适温度下酶活的90％以上。

(2)多铜氧化酶的最适pH

配制不同pH的缓冲液：柠檬酸盐缓冲液pH2.2～6.0、磷酸盐缓冲液pH6.0～8.5。在55℃，不同pH下反应10min，反应结束测定不同pH条件下的酶活，确定最适反应pH。以最高的酶活为100％。结果如图4所示，pH为4时酶活最高，pH为3.5时，酶活还能保持在最适pH下酶活的62％以上。

(3)金属离子对多铜氧化酶酶活的影响

将粗酶液与终浓度为1mmol/L的金属离子缓冲液混合，在37℃条件下保温10min，测定酶活力。以未添加金属离子测得酶活为100％，确定金属离子对酶活力的影响。Cu²⁺、Ni² ⁺对酶活有促进作用，在Cu²⁺促进下酶活提高65％，在Ni²⁺促进下酶活提高23％，其余测定的金属离子有不同程度的抑制作用。

(4)盐浓度对多铜氧化酶酶活的影响

将粗酶液在不同质量分数的NaCl缓冲液中保温1h(对照组不添加NaCl)，测定酶活，以未添加NaCl测得酶活为100％，计算在不同NaCl质量分数下的相对酶活，确定NaCl对酶活稳定性的影响。如图6所示，随着NaCl浓度的增加酶活降低。当NaCl质量分数达到15％(Na⁺2.5mmol/L)时，NaCl对多铜氧化酶有激活作用，使酶活提高了80％。

(5)乙醇对多铜氧化酶酶活的影响

将粗酶液在不同体积分数的乙醇缓冲液中保温1h(对照组不添加乙醇)，测定酶活，以未添加乙醇测得酶活为100％，确定乙醇对酶活稳定性的影响。结果显示(图7)，在乙醇浓度为2.5％时，相对酶活达57％；乙醇浓度为5％时，相对酶活为30％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种降解酱油中生物胺的酶

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 512

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Leu Glu Lys Phe Ala Gln Glu Leu Pro Ile Ile Glu Thr Leu

1 5 10 15

Lys Pro Gln Lys Thr Ser Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Glu Val Thr Met

20 25 30

Lys Glu Cys Phe His Lys Leu His Arg Asp Leu Asp Pro Thr Arg Leu

35 40 45

Trp Gly Tyr Asn Gly Leu Phe Pro Gly Pro Thr Ile Asp Val Asn Gln

50 55 60

Asp Glu Asn Val Tyr Ile Lys Trp Met Asn Asp Leu Pro Asp Lys His

65 70 75 80

Phe Leu Pro Val Asp His Thr Ile His His Ser Glu Gly Gly His Gln

85 90 95

Glu Pro Asp Val Lys Thr Val Val His Leu His Gly Gly Ala Thr Pro

100 105 110

Pro Asp Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Thr Arg Asp Phe Lys

115 120 125

Glu Lys Gly Pro Tyr Phe Lys Lys Glu Val Tyr His Tyr Pro Asn Lys

130 135 140

Gln Arg Gly Ala Leu Leu Trp Tyr His Asp His Ala Met Ala Ile Thr

145 150 155 160

Arg Leu Asn Val Tyr Ala Gly Leu Ala Gly Met Tyr Ile Ile Arg Glu

165 170 175

Arg Lys Glu Lys Gln Leu Lys Leu Pro Ala Gly Glu Tyr Asp Val Pro

180 185 190

Leu Met Ile Met Asp Arg Thr Leu Asn Asp Asp Gly Ser Leu Phe Tyr

195 200 205

Pro Ser Gly Pro Asp Asn Pro Ser Glu Thr Leu Pro Asn Pro Ser Ile

210 215 220

Val Pro Phe Leu Cys Gly Asn Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Ala Trp

225 230 235 240

Pro Tyr Met Glu Val Glu Pro Arg Thr Tyr Arg Phe Arg Ile Leu Asn

245 250 255

Ala Ser Asn Thr Arg Thr Phe Ser Leu Ser Leu Asn Asn Gly Gly Arg

260 265 270

Phe Ile Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Val Lys

275 280 285

Thr Gln Ser Ile Ser Leu Ala Pro Ala Glu Arg Tyr Asp Val Leu Ile

290 295 300

Asp Phe Ser Ala Phe Asp Gly Glu His Ile Ile Leu Thr Asn Gly Thr

305 310 315 320

Gly Cys Gly Gly Asp Val Asn Pro Asp Thr Asp Ala Asn Val Met Gln

325 330 335

Phe Arg Val Thr Lys Pro Leu Lys Gly Glu Asp Thr Ser Arg Lys Pro

340 345 350

Lys Tyr Leu Ser Ala Met Pro Asp Met His Ser Lys Arg Ile His Asn

355 360 365

Ile Arg Thr Leu Lys Leu Thr Asn Thr Gln Asp Lys Tyr Gly Arg Pro

370 375 380

Val Leu Thr Leu Asn Asn Lys Arg Trp His Asp Pro Val Thr Glu Ala

385 390 395 400

Pro Arg Leu Gly Ser Thr Glu Ile Trp Ser Ile Ile Asn Pro Thr Arg

405 410 415

Gly Thr His Pro Ile His Leu His Leu Val Ser Phe Gln Val Leu Asp

420 425 430

Arg Arg Pro Phe Asp Leu Glu Arg Tyr Asn Lys Phe Gly Asp Ile Val

435 440 445

Tyr Thr Gly Pro Ala Val Pro Pro Pro Pro Ser Glu Lys Gly Trp Lys

450 455 460

Asp Thr Val Gln Ala His Ser Gly Glu Val Ile Arg Ile Ala Ala Thr

465 470 475 480

Phe Ala Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu Glu

485 490 495

His Glu Asp Tyr Asp Met Met Arg Pro Met Asp Val Thr Glu Lys Gln

500 505 510

<210> 2

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcacttg aaaaatttgc acaagaactg ccgattatcg aaacactgaa gccgcagaag 60

acatcaaacg gcagcacgta ttatgaagtc acgatgaagg aatgctttca caagctgcac 120

cgtgatctcg acccgacccg gctgtgggga tataacggtt tgtttcccgg cccgacgatt 180

gatgtgaacc aagatgaaaa cgtctatatt aaatggatga atgacctgcc ggataagcat 240

tttctccctg tggaccatac cattcaccat tcagagggcg gccatcagga acccgacgtc 300

aaaactgtcg tccatttaca cggaggagca acgccgccgg acagcgacgg ctatccggaa 360

gcctggttca cacgggattt caaggagaag gggccttatt ttaaaaaaga ggtataccac 420

tatccaaaca aacagcgcgg ggcgctatta tggtatcacg accacgccat ggcaattacg 480

aggctcaatg tgtacgccgg gcttgccggc atgtatatca tccgcgagcg aaaagaaaag 540

cagctgaagc ttcccgccgg agaatacgac gtaccgctta tgattatgga ccgcacgtta 600

aatgacgacg gttccttgtt ttatccgagc gggcccgata atccttccga aacgctgccg 660

aatccttcaa tcgttccgtt tctttgcgga aataccattc tcgtcaacgg caaagcgtgg 720

ccgtatatgg aagtcgaacc gcggacatat cgtttccgta tccttaacgc ctcaaatacg 780

agaacatttt ctctctcgct caataatggc ggccggttta tccaaatcgg ttcagacggc 840

ggactgctcc cccgttctgt caaaacacag tccatcagct tagcaccggc tgagcggtat 900

gatgtgctca ttgatttctc cgcttttgac ggagaacata ttattttaac gaacggcacc 960

ggctgcgggg gcgacgtcaa tccggatacc gacgccaatg tgatgcaatt ccgcgtcaca 1020

aaaccgctga agggagaaga caccagccgg aagcctaaat atctgtcagc catgcctgat 1080

atgcactcaa aaagaataca caatatcagg acgcttaaac tcacaaacac gcaagacaaa 1140

tacggccggc cggttttaac gctcaataac aagcgctggc atgatcccgt gacagaagcg 1200

ccgcggctcg gctcaacgga aatctggtcg attatcaatc cgacgcgggg aacccatccg 1260

atacacctgc acttggtttc cttccaagtc cttgaccggc gtccttttga cttagaacgt 1320

tataacaaat tcggcgacat tgtgtataca ggccccgccg tcccgccgcc tccaagtgaa 1380

aaaggctgga aagacaccgt gcaggcgcac tccggagaag tcatcagaat cgcggcgaca 1440

ttcgcccctt acagcggacg gtacgtatgg cattgtcata ttttagaaca cgaagattat 1500

gacatgatga gaccgatgga cgtcacagaa aagcagtaa 1539

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcacttg aaaaatttgc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttactgcttt tctgtgacgt c 21

Claims

1.一种多铜氧化酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述多铜氧化酶的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.携带权利要求3所述基因的载体。

5.一种基因工程菌，其特征在于，表达权利要求1所述的多铜氧化酶。

6.一种降低酱油中生物胺含量的方法，其特征在于，所述方法是向酱油中加入权利要求1所述的多铜氧化酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多铜氧化酶以酶液或酶粉的形式存在。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述多铜氧化酶以细胞为载体。

9.根据权利要求6～8所述的方法，其特征在于，所述多铜氧化酶以10～20U/mL的添加量加入至酱油中。

10.权利要求1所述的多铜氧化酶在食品、化工、医药领域的应用。