CN107058168A - 一种巨大芽孢杆菌及其产普鲁兰酶的方法与产品 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种巨大芽孢杆菌P6（Bacillus megaterium）CCTCC NO：M 2017009。该菌株具有以下特征：该菌株为革兰氏阳性杆状细菌，产芽孢，芽孢次端生，不运动；该菌株生长温度范围为15~50 ℃，生长pH 范围为4~10，生长的NaCl浓度为0%~8%；该菌株能以普鲁兰糖为唯一碳源生长。本发明还公开了一种利用巨大芽孢杆菌P6产细胞壁结合型普鲁兰酶的方法及按照该方法得到普鲁兰酶产品，该普鲁兰酶在淀粉糖加工工业、医药领域、饲料、食品改性及酿酒等工业中具有广泛应用。

Description

一种巨大芽孢杆菌及其产普鲁兰酶的方法与产品
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种巨大芽孢杆菌P6。本发明还涉及该菌株产普鲁兰酶的方法及其产品。
背景技术
普鲁兰酶(pullulanase,EC 3.2.1.41)是一种可以特异地水解普鲁兰多糖、淀粉及相关分支多糖中α-1,6糖苷键的淀粉脱支酶。由于它对α-1,6糖苷键的特异水解功能，普鲁兰酶被广泛地应用于淀粉糖加工工业、医药领域、饲料、食品改性及酿酒等工业中。由于普鲁兰酶的重要应用价值，我国从上世纪70年代开始即开始其相关研究，近年来研究热度更是逐步升高。
目前，普鲁兰酶的研究和应用中存在以下问题：1.商品化的普鲁兰酶存在商业垄断，我国的普鲁兰酶仍依赖进口，主要为丹麦Novo公司的Promozyme产品。2.虽然基因工程技术使得普鲁兰酶的异源表达研究取得了一些成绩，但总体来说表达量较低、酶稳定性不好。3.通过原始产酶菌株发酵提取获得普鲁兰酶，又存在生物安全性不理想、纯化成本高、产品纯度低等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对目前现有技术的不足，提供一种新的能产细胞壁结合型普鲁兰酶的巨大芽孢杆菌P6(Bacillus megaterium)。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了上述巨大芽孢杆菌P6(Bacillusmegaterium)产普鲁兰酶的方法及酶产品。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。
本发明的特征包括巨大芽孢杆菌P6(Bacillus megaterium)菌株本身(以下简称菌株P6)，以及利用该菌株产普鲁兰酶的方法，以及利用该菌株所产的普鲁兰酶产品。
本发明所涉及的菌株是在中国江苏省连云港港口海泥中分离到的巨大芽孢杆菌P6(Bacillus megaterium)，该菌株已于2017年1月5日保藏于中国典型微生物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC NO：M 2017009，保藏地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
以下对本发明进行详细的阐述。
一、本发明菌株P6的筛选方法
1、本发明中涉及的培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，蒸馏水配制，pH7。
初筛培养基：普鲁兰糖0.3％，酵母粉0.5％，陈海水配制，自然pH。
复筛培养基：普鲁兰糖0.3％，酵母粉0.5％，琼脂2％，陈海水配制，自然pH。
产酶培养基：普鲁兰糖1％，酵母粉1％，磷酸盐缓冲液(pH7，0.1M)，或加琼脂2％(固体平板)。
2、菌株的筛选方法：
取10g海泥加入到装有90mL无菌水的三角瓶中，浸泡1h，振荡30min，使样品充分打散后，吸取1mL于100mL初筛培养基中，25℃、180r/min振荡培养20h。取1mL培养液梯度稀释，选择合适的稀释度涂布在复筛培养基上，25℃培养48h，待长出菌落后，将平皿倒置，向平皿盖中倒入10mL无水乙醇，于4℃放置，每隔2h观察一次，观察菌落周围是否出现透明圈，挑取有透明圈的单菌落，转接到产酶培养基中，25℃、180r/min振荡培养72h，8000r/min离心5min收集细胞，10倍体积无菌水吹吸、润洗细胞，重复洗涤3遍，再次以8000r/min离心5min，取细胞测定酶活力大小。选出普鲁兰酶活性较高的菌株P6。
二、本发明菌株P6的形态特征和生理生化特征
1、形态特征
菌株P6为革兰氏阳性杆状细菌，有芽孢，不能运动。菌体大小约为1.2-1.6μm×2.0-4.0μm，杆状，末端圆，两个或多个呈链状排列，参见图1。芽孢大小为0.7-1.1μm×1.2-2.0μm，椭圆形，次端生，以产酶培养基进行摇瓶培养时，转速180r/min，25℃培养30h产生10％芽孢，培养40h完全变成芽孢。在5mm厚度的产酶培养基上的菌落特征为：独立单菌落的直径为2mm-5mm，圆形、略微土黄色、表面粗糙、干燥无光泽、中间略微隆起，参见图2；当培养时间延长，随着细胞逐渐破裂释放芽孢时，菌落中心出现液化和光泽，逐渐向边缘扩大，当细胞完全破裂释放芽孢时，菌落表面完全湿润光泽。
2、生理生化特征
菌株P6的生理生化特征参见表1(a-c)。菌株P6的精氨酸双水解酶反应、甲基红反应、赖氨酸脱羧酶反应、鸟氨酸脱羧酶反应、吲哚产生反应、H2S反应、硝酸盐还原反应、脲酶、氧化酶反应为阴性，酪素水解反应、β–半乳糖苷酶反应、柠檬酸生长、明胶水解、淀粉水解、VP反应、接触酶反应阳性，能够利用L-丙氨酸、L-天冬氨酸、D-果糖-6-磷酸、L-组氨酸、葡糖醛酰胺、D-天冬氨酸、乙酰乙酸、L-苹果酸、糊精、α-D-葡萄糖、奎宁酸、甲酸进行生长；该菌株对林可霉素、8％NaCl、1％乳酸钠、四唑紫、pH 5.0化学因素不敏感，对二甲胺四环素、盐酸胍、十四烷硫酸钠、利福霉素SV、D-丝氨酸、溴酸钠、醋竹桃霉素敏感。通过Biolog微生物鉴定系统(Gen III MicroStation)的生理生化反应结果，初步判定该菌株P6为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
表1(a).菌株P6的部分生理生化特征
实验项目 结果 实验项目 结果
细胞形态 杆状 革兰氏染色 阳性
形成芽孢 + 接触酶 +
精氨酸双水解酶 - 氧化酶 -
甲基红反应 - VP反应 +
赖氨酸脱羧酶 - 淀粉水解 +
酪素水解 + 明胶水解 +
β–半乳糖苷酶 + 脲酶 -
柠檬酸生长 + 硝酸盐还原 -
鸟氨酸脱羧酶 - H2S -
吲哚产生 - 50℃生长 +
注：+：阳性；-：阴性。
表1(b).菌株P6的生理生化特征(Biolog GENⅢ(生长实验))
注：+：生长；-：不生长。
表1(c).菌株P6的生理生化特征(Biolog GENⅢ(化学敏感))
注：+：不敏感；-：敏感
3、菌株P6的分子生物学鉴定
根据细菌16S rDNA序列和DNA解旋酶B亚基基因(gyrB)序列的保守区设计两对引物：
16SrDNA序列的正向引物F1：5’-TAATACATGCAAGTCGAGCGAACTG-3’，反向引物R1：5’-ACCTTAGGCGGCTAGCTCCTTACGG-3’；
gyrB序列的正向引物F2：5’-GGCGGCGGCGGCTATAAAGTATCTGG-3’，反向引物R2：5’-TGTAAGCTCACGAGCTTTTTTAGCTG-3’。
用Takara试剂盒提取菌株P6的基因组DNA，以其基因组DNA为模板，进行两种序列的PCR扩增反应，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收，对回收后纯化的PCR产物进行测序，得菌株P6的16Sr DNA序列(见SEQ ID NO：5)和gyrB基因序列(见SEQ ID NO：6)。其中，PCR条件为：25μL反应体系，94℃预变性5min；94℃，30s；55℃，45s；72℃，45s；一共35个循环，72℃终延伸7min。
利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的系统进化分析软件(Blast TreeView)基于获得的菌株P6的16Sr DNA序列和gyrB基因序列对菌株P6进行种系关系分析，结果均提示菌株P6为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。
由上述Biolog微生物鉴定系统的生理生化反应结果，以及《伯杰氏系统细菌学手册》(第8版)，鉴定出菌株P6为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。
三、本发明菌株P6的生长特性
对本发明提供的菌株P6的生长特性进行了细致的研究，了解不同条件下该菌的生长情况。
1、种子液的制备：将巨大芽孢杆菌P6接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，转速180r/min，装液量20％，25℃培养12h，得到种子液。
2、温度对菌株P6生长的影响：将种子液以1％接种量接种于牛肉膏蛋白胨培养基，转速180r/min，装液量20％，分别在不同温度下培养，每隔一段时间测定细胞浓度，选择在600nm波长下测定细胞悬液OD值，该菌株生长温度范围为15～50℃，最适生长温度为35℃，参见图3。
3、pH对菌株P6生长的影响：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入终浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，使培养基的pH分别为3.5～11.0之间，将种子液以1％接种量接种于不同pH的培养基，在25℃培养24h，测定细胞浓度，生长pH范围为4～10，最适生长pH为6，参见图4。
4、NaCl对菌株P6生长的影响：配制不同NaCl浓度的牛肉膏蛋白胨培养基，使其浓度为0％～12％，在25℃培养24h，测定细胞浓度，能进行生长的NaCl浓度为0％～8％，最适生长的NaCl浓度为0％，参见图5。
四、菌株P6产普鲁兰酶的方法
1、摇瓶培养：将巨大芽孢杆菌P6接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，装液量15～40％，摇床转速160～200r/min，25℃培养10～20h，得种子液，将种子液以1％的接种比例接种到产酶培养基中，装液量15～40％，摇床转速160～200r/min，25℃培养48h～96h，得发酵液；
2、粗酶液制备：取上述发酵液在12000r/min条件下离心15min得到沉淀，沉淀通过超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，超声温度0℃，超声功率250～300W，超声处理5～10min，取上清即为粗酶液。
3、粗酶液的分离纯化：
(1)取粗酶液置于磁力搅拌器上冰浴搅拌，向粗酶液中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵的饱和度达到60％～80％，搅拌40min后，冰浴静置1～1.5h，离心处理，收集沉淀，用浓度为0.2M、pH值为7磷酸盐缓冲液溶解沉淀，0℃下透析过夜，再用聚乙二醇20000在4℃进行浓缩，得初步纯化的浓缩酶液；
(2)将上述浓缩酶液上葡聚糖凝胶层析柱，以浓度为0.2M、pH值为7磷酸盐缓冲液为洗脱液洗脱，收集洗脱液并检测其活性，即得进一步纯化的普鲁兰酶酶液。进一步优选地，所述的葡聚糖凝胶层析柱的填料为Sephadex G100，葡聚糖凝胶层析柱的径高比为1:60，洗脱的流速为0.5mL/min。
其中，在粗酶液分离纯化的步骤(1)中，对硫酸铵盐析法纯化蛋白的条件进行了筛选：
在0℃下向粗酶液中加入硫酸铵，分别至饱和度0～20％、20％～40％、40％～60％、60％～80％、80％～100％，搅拌40min后静置1～1.5h，12000r/min离心25min，分别收集沉淀，每个硫酸铵梯度的沉淀用0.2M、pH7的磷酸缓冲液溶解，溶解后在冰浴下用1000倍体积纯水透析脱盐过夜，得脱盐酶溶液，对不同的硫酸铵饱和度下得到的脱盐的酶溶液进行普鲁兰酶活性测定。结果显示，在60％-80％饱和度下的盐析沉淀物中具有最高酶活，因此，将硫酸铵的饱和度选为60％-80％。
本发明所述的磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液。
五、普鲁兰酶的性质
1、反应温度对酶活性的影响
将反应体系置于不同温度下与底物发生反应，测定酶活力，结果见图6，酶的最适作用温度为45℃，30℃和65℃均有20％的酶活力，在35℃～50℃温度范围时有70％以上的催化活力。
2、酶的热稳定性
取适量粗酶液分别在不同温度(30℃、40℃、45℃、50℃和65℃)下保温50h，每隔3h取出一组样品，迅速置于4℃冰箱内，待保温结束后统一在标准条件下测定残余酶活，以未进行温度处理的酶液的酶活设为100％，结果见图7，菌株P6产的普鲁兰酶的在中温时热稳定性较好，在45℃下保温5h后酶活仍能保持70％以上，但在65℃下保温1h后酶活即为0％。
3、反应pH对酶活性的影响
用不同pH的缓冲液配制1％的普鲁兰糖溶液，加入酶液后，反应体系为：25μL粗酶液，75μL缓冲液，在45℃下进行酶活力测定，不同pH值的缓冲液为：20mM柠檬酸钠缓冲液(pH3.0到6.0)；20mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0到8.0)；50mM Tris-盐酸缓冲液(pH 8.0～8.5)；50mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH9.0到10.0)。结果见图8，pH6.5该酶的活性最高，在pH5～7.5之间有70％酶活力。
4、酶的pH稳定性
将25μL酶液与75μL不同pH的缓冲液混合，在45℃水浴锅中保温12h，每隔2h取一次样，迅速置于4℃冰箱内，待保温结束后统一在标准条件下测定残余酶活，以未进行温度处理的酶液的酶活设为100％。结果见图9，结果表明在45℃保温下5h后，普鲁兰酶在pH6.0～7.5范围内稳定，残余酶活力保持在50％以上，在pH3.0和pH8.5没有酶活性，在pH4和pH8保持20％以上残余酶活力。
5、酶的活性测定
酶活单位定义为：45℃条件下，每分钟催化普鲁兰糖产生1μM还原糖所需的粗酶蛋白含量(μg)为一个单位。
普鲁兰酶酶活测定方法：将25μL酶液加入到75μL含有1％的普鲁兰糖的磷酸缓冲液(0.02M，pH6.5)中，45℃水浴中反应15min，以麦芽糖制作标准曲线，根据标准曲线用DNS法测定反应液中还原糖含量，然后根据酶活单位定义计算酶活力。
普鲁兰酶在淀粉糖加工工业、医药领域、饲料、食品改性及酿酒等工业中具有广泛的应用。在淀粉制糖工业中，普鲁兰酶和α-淀粉酶、β-淀粉酶等协同作用可以用来提高淀粉得糖率，生产高葡萄糖浆和超高麦芽糖浆。高麦芽糖浆代替酸水解淀粉糖浆制造硬糖，不仅口味柔和，甜度适中，产品透明度高，不易着色，可延长保藏期，而且具有更好的热稳定性可塑性。在医药领域，用超高麦芽糖浆可进一步制备纯麦芽糖，由于其不引起血糖浓度升高，具有在静脉注射中代替葡萄糖的优势。另外，普鲁兰酶可以用于缓慢消化淀粉的制备。缓慢消化淀粉有助于维持血糖的稳态，在治疗和预防糖尿病和心脑血管疾病方面具有一定的保健作用。在饲料和养殖业中，在饲料中添加普鲁兰酶能有效促进动物对饲料中营养物质的消化吸收，减少浪费，缩短生长周期，提高饲料利用率，提高动物的抗病能力，减少疾病发生，节约粮食，提高经济效益，以及提高鸡的产蛋效率和奶牛的产奶率等。
与现有技术相比，本发明提供的菌株P6能以普鲁兰糖为唯一碳源生长，能够产生细胞壁结合型普鲁兰酶，通过收集细胞，并以细胞直接作为粗酶制剂制备普鲁兰酶，简化了传统的以细胞分泌方法制备普鲁兰酶的提取步骤，降低了生产成本，促进了普鲁兰酶生产的工业化。
附图说明
图1为菌株P6细胞形态(×1000)图；
图2为菌株P6单菌落形态图；
图3为不同温度对菌株P6生长的影响图；
图4为不同pH对菌株P6生长的影响图；
图5为不同NaCl浓度对菌株P6生长的影响图；
图6为不同反应温度对酶活性的影响图；
图7为不同温度对酶热稳定性的影响图；
图8为不同反应pH对酶活性的影响图；
图9为不同pH对酶pH稳定性的影响图。
本发明所涉及的菌株P6是在中国江苏省连云港港口海泥中分离到的巨大芽孢杆菌P6(Bacillus megaterium P6)，该菌株已于2017年1月5日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2017009，保藏地址为：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，电话：027-68752319。
具体实施方式
以下通过实例进一步说明本发明，以使本领域技术人员更好地理解本发明，而不构成对本发明权利的限制。
实施实例1，一种巨大芽孢杆菌P6(Bacillus megaterium P6)CCTCC NO：M 2017009。该菌株具有以下特征：菌株为革兰氏阳性杆状细菌、有芽孢、不能运动，菌体大小约为1.2-1.6μm×2.0-4.0μm，杆状，末端圆，两个或多个呈链状排列；芽孢大小为0.7-1.1μm×1.2-2.0μm，椭圆形，次端生；以产酶培养基进行摇瓶培养时，转速180r/min，25℃培养30h产生10％芽孢，40h完全变成芽孢；该菌株在5mm厚度的产酶培养基上的菌落特征为：菌落直径为2mm-5mm，圆形、略微土黄色、表面粗糙、干燥无光泽、中间隆起，随着培养时间延长，当细胞逐渐破裂释放芽孢时，菌落中心出现液化和光泽，逐渐向边缘扩大，当细胞完全破裂释放芽孢时，菌落表面完全湿润光泽；该菌株的精氨酸双水解酶反应、甲基红反应、赖氨酸脱羧酶反应、鸟氨酸脱羧酶反应、吲哚产生反应、H2S反应、硝酸盐还原反应、脲酶、氧化酶反应为阴性，酪素水解反应、β–半乳糖苷酶反应、柠檬酸生长、明胶水解、淀粉水解、VP反应、接触酶反应阳性。能够利用L-丙氨酸、L-天冬氨酸、D-果糖-6-磷酸、L-组氨酸、葡糖醛酰胺、D-天冬氨酸、乙酰乙酸、L-苹果酸、糊精、α-D-葡萄糖、奎宁酸、甲酸进行生长，对林可霉素、8％NaCl、1％乳酸钠、四唑紫、pH5.0化学因素不敏感，对二甲胺四环素、盐酸胍、十四烷硫酸钠、利福霉素SV、D-丝氨酸、溴酸钠、醋竹桃霉素敏感。该菌株的生长特性为：生长温度范围为15～50℃，生长pH范围为4～10，生长的NaCl浓度为0％～8％，最适生长温度为35℃，最适生长pH为6,最适生长的NaCl浓度为0％。
实施实例2，一种如实施例1所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P6产普鲁兰酶的方法，其步骤如下：
(1)摇瓶培养：将巨大芽孢杆菌P6接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，装液量15％，摇床转速160r/min，25℃培养10h，得种子液，将种子液以1％的接种比例接种到产酶培养基中，装液量15％，摇床转速160r/min，25℃培养48h，得发酵液；
所述的牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，蒸馏水配制，pH7；
所述的产酶培养基的组成为：普鲁兰糖1％，酵母粉1％，磷酸盐缓冲液配制，pH7；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1M、pH值为7；
(2)粗酶液制备：取上述发酵液在12000r/min条件下离心15min得到沉淀，沉淀通过超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，超声温度0℃，超声功率250W，超声处理5min，取上清即为粗酶液。
实施实例3，一种如实施例1所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P6产普鲁兰酶的方法，其步骤如下：
(1)摇瓶培养：将巨大芽孢杆菌P6接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，装液量15～30％，摇床转速200r/min，25℃培养15h，得种子液，将种子液以1％的接种比例接种到产酶培养基中，装液量30％，摇床转速200r/min，25℃培养96h，得发酵液；
所述的牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，蒸馏水配制，pH7；
所述的产酶培养基的组成为：普鲁兰糖1％，酵母粉1％，磷酸盐缓冲液配制，pH7；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1M、pH值为7；
(2)粗酶液制备：取上述发酵液在12000r/min条件下离心15min得到沉淀，沉淀通过超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，超声温度0℃，超声功率300W，超声处理10min，取上清即为粗酶液。
实施实例4，一种如实施例1所述巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P6产普鲁兰酶的方法，其步骤如下：
(1)摇瓶培养：将巨大芽孢杆菌P6接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，装液量20％，摇床转速180r/min，25℃培养12h，得种子液，将种子液以1％的接种比例接种到产酶培养基中，装液量20％，摇床转速180r/min，25℃培养72h，得发酵液；
所述的牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，蒸馏水配制，pH7；
所述的产酶培养基的组成为：普鲁兰糖1％，酵母粉1％，磷酸盐缓冲液配制，pH7；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1M、pH值为7；
(2)粗酶液制备：取上述发酵液在12000r/min条件下离心15min得到沉淀，沉淀通过超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，超声温度0℃，超声功率280W，超声处理8min，取上清即为粗酶液。
实施实例5，一种如实施例2-4任何一项所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P6产普鲁兰酶的方法中，所述的粗酶液采用以下方法进行分离纯化：
(1)取粗酶液置于磁力搅拌器上冰浴搅拌，向粗酶液中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵的饱和度达到60％％，搅拌40min后，冰浴静置1h，离心处理，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，0℃下透析过夜，再用聚乙二醇20000在4℃进行浓缩，得初步纯化的浓缩酶液；
(2)将上述浓缩酶液上葡聚糖凝胶层析柱，以磷酸盐缓冲液为洗脱液洗脱，收集洗脱液并检测其活性，即得进一步纯化的普鲁兰酶酶液。
实施实例6，一种如实施例2-4任何一项所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P6产普鲁兰酶的方法中，所述的粗酶液采用以下方法进行分离纯化：
(1)取粗酶液置于磁力搅拌器上冰浴搅拌，向粗酶液中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵的饱和度达到80％，搅拌40min后，冰浴静置1.5h，离心处理，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，0℃下透析过夜，再用聚乙二醇20000在4℃进行浓缩，得初步纯化的浓缩酶液；
(2)将上述浓缩酶液上葡聚糖凝胶层析柱，以磷酸盐缓冲液为洗脱液洗脱，收集洗脱液并检测其活性，即得进一步纯化的普鲁兰酶酶液。
实施实例7，一种如实施例5或6所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P6产普鲁兰酶的方法的步骤(1)和(2)中，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，浓度为0.2M，pH值为7。
实施实例8，一种如实施例5或6所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P6产普鲁兰酶的方法的步骤(2)中：所述的葡聚糖凝胶层析柱的填料为Sephadex G100，葡聚糖凝胶层析柱的径高比为1:60，洗脱的流速为0.5mL/min。
实施实例9，一种实施例2-8任何一项所述的方法所产生的普鲁兰酶，其特征在于：所述的普鲁兰酶理化性质为：普鲁兰酶的最适作用温度为45℃，30℃和65℃均有20％的酶活力，在35℃～50℃温度范围时有70％以上的催化活力，在45℃下保温5h后酶活仍能保持70％以上，但在65℃下保温1h后酶活即为0％；该酶在pH6.5时活性最高，在pH5～7.5范围内具有70％酶活力；该酶在45℃下保温5h后，在pH6.0～7.5范围内稳定，残余酶活力保持在50％以上，在pH3.0和pH8.5没有酶活性，在pH4和pH8保持20％以上残余酶活力。
SEQUENCE LISTING
<110> 淮海工学院；江苏省海洋资源开发研究院（连云港）
<120> 一种巨大芽孢杆菌及其产普鲁兰酶的方法与产品
<130> 2017-01
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物F1
<400> 1
taatacatgc aagtcgagcg aactg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物R1
<400> 2
accttaggcg gctagctcct tacgg 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物F2
<400> 3
ggcggcggcg gctataaagt atctgg 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物R2
<400> 4
tgtaagctca cgagcttttt tagctg 26
<210> 5
<211> 1434
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌P6（Bacillus megaterium）
<220>
<223> 16S rDNA
<400> 5
taatacatgc aagtcgagcg aactgattag aagcttgctt ctatgacgtt agcggcggac 60
gggtgagtaa cacgtgggca acctgcctgt aagactggga taacttcggg aaaccgaagc 120
taataccgga taggatcttc tccttcatgg gagatgattg aaagatggtt tcggctatca 180
cttacagatg ggcccgcggt gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac 240
gatgcatagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300
cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc 360
cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag aacaagtaca 420
agagtaactg ctcgtacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480
gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttatccggaa ttattgggcg taaagcgcgc 540
gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag ggtcattgga 600
aactggggaa cttgagtgca gaagagaaaa gcggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660
tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcggcttttt ggtctgtaac tgacgctgag 720
gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780
gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc 840
cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960
tctgacaact ctagagatag agcgttcccc ttcgggggac agagtgacag gtggtgcatg 1020
gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080
atcttagttg ccagcattta gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg 1140
aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200
atggatggta caaagggctg caagaccgcg aggtcaagcc aatcccataa aaccattctc 1260
agttcggatt gtaggctgca actcgcctac atgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat 1320
cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga 1380
gtttgtaaca cccgaagtcg gtggagtaac cgtaaggagc tagccgccta aggt 1434
<210> 6
<211> 866
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌P6（Bacillus megaterium）
<220>
<223> DNA解旋酶B亚基基因（gyrB）
<400> 6
ggcggcggcg gctataaagt atctggtgga ttacacggtg taggtgcctc agttgttaat 60
gactttctac ctcattggaa gtgcacgtac atcgtgacgg taaagttcat tatcaaaaat 120
atgaacgagg tgtaccggct gctgacttaa aagtagttgg agaaacagat aaaacaggta 180
ctgttattca attccgtcca gacggtgaaa tttttacaga aacgcttgaa tacgattttg 240
atacgttagc taatcgtctg cgtgagttag ctttcttaaa tcgcggcatt aaaattacga 300
ttgaagacaa acgtgaagaa gataaaagac gtgagtatca ctatgaaggc ggaattaagt 360
cttacgttga acacttaaac cgttcgaaag aagtgattca cgaagagcca atctatattg 420
aaggtaatcg agacaacatt tctgtagaaa ttgctattca atataacgat agctatacaa 480
gtaatttata ttcttttgca aacaatattc acacatatga aggtggaacg cacgaagcag 540
gatttaaaac agcgttaacg cgtgtaatta acgactatgc acgtaaaaac agcgtattta 600
aagacagtga cgccaatcta acaggtgaag atgttcgtga aggaattaca gctatcatct 660
ctattaagca cccagatccg cagttcgaag gacaaacaaa aacaaagctg ggaaatagtg 720
aagcaagaac aattactgac tctgtgtttg cagaacactt agaaacttac ttgctagaga 780
accctattgt ggcgaaaaag gtaattgaaa aaggtttaat ggctgcaaga gcaagaatgg 840
cagctaaaaa agctcgtgag cttaca 866

Claims (6)

1.一种巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）P6，其特征在于：其保藏号为CCTCC NO：M2017009。
2.一种如权利要求1所述的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）P6产普鲁兰酶的方法，其特征在于，其步骤如下：
（1）摇瓶培养：将巨大芽孢杆菌P6接种到牛肉膏蛋白胨培养基中，装液量15~30%，摇床转速160~200 r/min，25 ℃培养10~15h，得种子液，将种子液以1%的接种比例接种到产酶培养基中，装液量15~30%，摇床转速160~200r/min，25 ℃培养48h~96h，得发酵液；
所述的牛肉膏蛋白胨培养基的组成为：牛肉膏0.3%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，蒸馏水配制，pH7；
所述的产酶培养基的组成为：普鲁兰糖1%，酵母粉1%，磷酸盐缓冲液配制，pH7；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为0.1M、pH值为7；
（2）粗酶液制备：取上述发酵液在12000r/min条件下离心15 min得到沉淀，沉淀通过超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，超声温度0℃，超声功率250~300W，超声处理5~10min，取上清即为粗酶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的粗酶液采用以下方法进行分离纯化：
（1）取粗酶液置于磁力搅拌器上冰浴搅拌，向粗酶液中缓慢加入硫酸铵至硫酸铵的饱和度达到60%～80%，搅拌40min后，冰浴静置1~1.5h，离心处理，收集沉淀，用磷酸盐缓冲液溶解沉淀，0℃下透析过夜，再用聚乙二醇20000在4 ℃进行浓缩，得初步纯化的浓缩酶液；
（2）将上述浓缩酶液上葡聚糖凝胶层析柱，以磷酸盐缓冲液为洗脱液洗脱，收集洗脱液并检测其活性，即得进一步纯化的普鲁兰酶酶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤（1）和步骤（2）中：所述的磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液、磷酸钠缓冲液或磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，浓度为0.2M，pH值为7。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中：所述的葡聚糖凝胶层析柱的填料为Sephadex G100，葡聚糖凝胶层析柱的径高比为1:60，洗脱的流速为0.5mL/min。
6.一种如权利要求2或3所述的方法所产生的普鲁兰酶，其特征在于：所述的普鲁兰酶理化性质为：普鲁兰酶的最适作用温度为45 ℃，30 ℃和65 ℃均有20%的酶活力，在35℃~50℃温度范围时有70%以上的催化活力，在45 ℃下保温5 h后酶活仍能保持70%以上，但在65 ℃下保温1 h后酶活即为0%；该酶在pH6.5时活性最高，在pH5~7.5范围内具有70%酶活力；该酶在45 ℃下保温5 h 后，在pH6.0~7.5范围内稳定，残余酶活力保持在50% 以上，在pH3.0和pH8.5没有酶活性，在pH4和pH8保持20%以上残余酶活力。
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