CN104894024B - 一株假交替单胞菌突变菌株及其应用 - Google Patents

一株假交替单胞菌突变菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体公开了一株假交替单胞菌突变菌株Pseudoalteromonas sp.CSN423‑M及其应用。所述Pseudoalteromonas sp.CSN423‑M菌株已于2015年1月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M 2015024。该菌株的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的假交替单胞菌CSN423‑M能够产胞外蛋白酶，经测定，该菌培养96h后，胞外蛋白酶活性达1461.33U/mL，因此,可用于生产蛋白酶，对蛋白酶的研究和利用具有重要的价值。

Description

一株假交替单胞菌突变菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株假交替单胞菌突变菌株Pseudoalteromonas sp.CSN423-M及其应用。
背景技术
蛋白酶是世界三大工业用酶之一，占世界酶类销售总额的60％，在食品、医药、制革、洗涤剂、废物处理等领域都有很好的应用前景，且广泛分布于植物、动物和微生物中，微生物源蛋白酶较动植物源蛋白酶有显著优势，如来源广、生产周期短、产量高、高产菌株易于选育、下游处理技术相对简单，易于实现工业化生产等，因此，微生物源蛋白酶成为研究的热点。目前芽孢杆菌是工业化生产蛋白酶的主要菌种。
海洋微生物源蛋白酶具有独特的酶学性质，日益引起人们的关注，如海洋微生物产生的蛋白酶在高盐浓度条件下仍具有较高的催化活力，可满足那些高盐条件下酶催化反应受抑制的工业化生产要求。深海嗜压微生物是嗜压酶重要来源，高压增加了酶活性和热稳定性，且使酶具有良好的立体专一性。利用海洋微生物开发的酶制剂，最适催化温度接近自然环境，不仅降低了生产过程中的能耗，而且使工艺流程简单化，在工业上有着良好的应用前景。
然而从自然界分离到的菌株产酶活力一般都很低，要实现高产、低耗和优质的高效转化，则需进行定向或非定向性菌种改良，以期突破或解除微生物代谢调控，获得蛋白酶高产菌株以满足工业化生产需求，这将具有十分显著的经济效益和深远的社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高产胞外蛋白酶的假交替单胞菌突变菌株及其应用。
一株假交替单胞菌突变菌株，分类命名为Pseudoalteromonas sp.CSN423-M，该菌于2015年1月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC No.M 2015024。
所述假交替单胞菌突变菌株(Pseudoalteromonas sp.CSN423-M)由分离自渤海海域的菌株假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.CSN423经紫外诱变选育。
假交替单胞菌突变菌株CSN423-M经菌落形态鉴定：该菌在平板上培养24h后的菌落呈白色，圆形，表面光滑不透明，边缘整齐；革兰氏染色为阴性，菌体杆状，无鞭毛，无荚膜。
假交替单胞菌突变菌株CSN423-M经生理生化测定，氧化酶试验为阳性，脲酶试验为阴性，接触酶试验为阳性，卵磷脂酶实验为阳性；能水解明胶、淀粉、纤维素；甲基红试验为阴性，V-P试验为阴性，H2S实验为阳性，硝酸盐还原测定为阳性、亚硝酸盐还原测定阳性。生长温度范围4～30℃。
该菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
该菌株能够产胞外蛋白酶，具有水解蛋白的功能，经测定，该菌培养96h后，蛋白酶活性达1461.33U/mL，可用于蛋白酶的工业化生产，对蛋白酶的研究和利用具有重要价值。
附图说明
图1.假交替单胞菌突变菌株CSN423-M的扫描电镜照片(80000倍)；
图2.假交替单胞菌突变菌株CSN423-M及部分相关菌株依据16S rDNA序列构建的系统发育树；
图3.平板透明圈法筛选蛋白酶高产菌株；
图4.发酵培养的假交替单胞菌CSN423与突变菌株CSN423-M胞外蛋白酶酶谱活性电泳图；
图5.发酵培养不同时间的假交替单胞菌CSN423与突变菌株CSN423-M产胞外蛋白酶活性。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例进一步解释本发明，但不对本发明构成任何限定。以下实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
实施例1 通过紫外诱变的方法获得假交替单胞菌突变菌株CSN423-M。
紫外诱变的出发菌株假交替单胞菌CSN423，分离自渤海海域。
S1.制备菌悬液
取已活化的假交替单胞菌CSN423接种于液体2216E培养基，15℃，200rpm,培养至对数期，8000rpm离心10min，收集菌体，用0.85％无菌生理盐水离心洗涤2次后，制成菌悬液，用显微镜直接记数法，调整菌液浓度为1×108CFU/mL。
S2.紫外诱变
采用波长253.4nm，功率为20w的紫外灯，照射距离40cm，在无菌工作台进行诱变。
取2mL制备好的菌悬液，于直径6cm的无菌培养皿中，置于磁力搅拌器上搅拌，开启紫外灯，照射一定时间。
S3.平板透明圈法进行蛋白酶高产菌株筛选
将紫外诱变后的菌液涂布脱脂奶粉平板，以未诱变菌株为对照，15℃，避光培养48h，挑取透明圈直径与菌落直径比值较大的菌株。结果见图3。
实施例2 假交替单胞菌突变菌株CSN423-M的生物学性状及生理生化和分子鉴定
S1.形态特征：假交替单胞菌突变菌株CSN423-M在扫描电镜下的形态见图1，该假交替单胞菌突变菌株CSN423-M在平板上培养24h后的菌落呈白色，圆形，表面光滑不透明，边缘整齐；革兰氏染色为阴性，菌体杆状，无鞭毛，无荚膜。
S2.生理生化特征：经生理生化测定，本发明的假交替单胞菌突变菌株CSN423-M的氧化酶试验为阳性，脲酶试验为阴性，接触酶试验为阳性，卵磷脂酶实验为阳性；能水解明胶、淀粉、纤维素；甲基红试验为阴性，V-P试验为阴性，H2S实验阳性，硝酸盐还原测定为阳性、亚硝酸盐还原测定阳性。生长温度范围4～30℃，见表1。
表1假交替单胞菌突变菌株CSN423-M生理生化特征
生理生化特征 CSN423-M
菌落颜色 WH
细胞形状 R
NaCl(％)耐受性 4％
生长：pH 7～11
4℃ +
30℃ +
37℃ -
氧化酶 +
触酶实验 +
明胶液化 +
淀粉水解 +
脲酶 -
纤维素酶 +
甲基红实验 -
V-P实验 -
H2S实验 +
卵磷脂酶实验 +
硝酸盐还原实验 +
亚硝酸盐还原实验 +
S3.假交替单胞菌突变菌株CSN423-M 16S rDNA的序列测定与分析
S31.PCR模板DNA的快速制备：将假交替单胞菌突变菌株CSN423-M划线接种在2216E培养基的平板上，15℃培养过夜。取单一菌落悬浮于10mL ddH2O中，沸水浴加热5min，离心，取上清作为PCR模板DNA。
S32. 16S rDNA基因PCR扩增
PCR引物由华大基因合成。
Primer A：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
Primer B：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′
PCR反应体系如下：
10×PCR buffer 5μL
2mmol/L d NTP 5μL
Primer A 1μM
Primer B 1μM
5U/μL Taq DNA Polymerase 1.25U
25mM MgCl2 4mM
Template DNA 0.5μg
Water,nuclease-free to 50μL
PCR扩增条件：95℃3min，95℃30s，55℃1min，72℃90s，30个循环；72℃10min。
序列测定：PCR产物纯化后，送华大基因测序，其序列如SEQ ID NO:1所示。该序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较分析，并从数据库获得相关种属的16S rDNA序列，构建系统发育树，见图2。经比较分析发现，本发明的假交替单胞菌突变菌株CSN423-M与菌株(Pseudoalteromonas arctica A 37-1-2)亲缘关系最近，假交替单胞菌突变菌株CSN423-M的16S rDNA序列与Pseudoalteromonas arctica A 37-1-2有99％的同源性。
综合16S rDNA序列分析、生理生化特性分析，表明本发明属于假交替单胞菌，命名为假交替单胞菌Pseudoalteromonas sp.CSN423-M，该菌于2015年1月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC No.M 2015024。
实施例3 假交替单胞菌突变菌株CSN423-M产胞外蛋白酶活力测定
将平板透明圈法筛选出的胞外蛋白酶高产菌株假交替单胞菌突变菌株CSN423-M接种于2216E液体培养基，15℃，200rpm培养24h，按2％接种量接种发酵培养基，15℃，200rpm振荡培养120h，每隔24h取发酵液，8000rpm离心除菌体，上清即为粗酶液，然后以酪蛋白为底物进行胞外蛋白酶酶谱活性电泳(何海伦，申请号：201310018497.5)，见图4，图中显示假交替单胞菌突变菌株CSN423-M所产胞外蛋白酶较诱变出发菌CSN423产胞外蛋白酶活性显著增强，且产酶时间提前。
Folin-酚法测定蛋白酶活力(张树政，1998)：用20mM Tris-HCl pH 7.8将酶液稀释合适的倍数，取200μL稀释好的酶液,在40℃下保温2min，加入同样温度的200μL 2％酪蛋白，40℃反应10min，加入400μL 0.4M的三氯乙酸终止反应，9000×g离心10min，取30μL上清液加入150μL 0.4M的碳酸钠，混匀后加入30μL Folin-酚试剂，混匀后反应20min，在660nm波长下测定吸光度，标准曲线用不同浓度的酪氨酸来制定。
酶活力单位定义：
在40℃，每分钟催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸的所需酶量定义为1个活性单位(U)。
测试结果发现，假交替单胞菌突变菌株CSN423-M培养96h后蛋白酶活力可以达到1461.33U/mL，较诱变出发菌株假交替单胞CSN423提高342％，且产酶时间提前，见图5，此结果与活性电泳结果一致，该菌株在工业化应用中不仅可以降低生产过程中的能耗，而且使工艺流程简单化，可有效节约成本。
2216E液体培养基(g/100mL)：蛋白胨0.5g，酵母0.1g，Fe2(PO4)30.001g，人工海水100mL，pH 7.8。
筛选培养基(g/100mL)：蛋白胨0.5g，酵母0.1g，Fe2(PO4)30.001g，脱脂奶粉1g，琼脂粉2g，人工海水100mL，pH 7.8。
发酵培养基(g/100mL)：玉米粉2g，麸皮1g，豆粕2g，Na2HPO40.1g，KH2PO40.03g，CaCl20.1g，Na2CO30.1g，人工海水100mL，pH 7.8。
经平板透明圈法初筛和发酵培养后进行蛋白酶活力测定，筛选出产蛋白酶活力最高的菌株，经过形态学及生理生化和DNA鉴定后，命名为Pseudoalteromonas sp.CSN423-M，简称假交替单胞菌CSN423-M。

Claims (3)

1.一株假交替单胞菌突变菌株Pseudoalteromonas sp.CSN423-M，保藏编号为CCTCCNo.M2015024。
2.权利要求1所述的假交替单胞菌突变菌株在蛋白水解中的应用。
3.权利要求1所述的假交替单胞菌突变菌株在生产胞外蛋白酶中的应用。
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