KR20150085550A - 세포투과성 헴 옥시게네이즈 융합단백질을 포함하는 파킨슨병 치료용 약학 조성물 - Google Patents
세포투과성 헴 옥시게네이즈 융합단백질을 포함하는 파킨슨병 치료용 약학 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
헴 옥시게네이즈-1 (Heme oxygenase-1; HO-1)은 헴을 이산화탄소, 빌리버딘 및 다양한 생화학적 프로세스에서 중요한 기능을 하는 Fe2 +로 분해한다. 본 발명자들은 SH-SY5Y 세포와 파킨슨병 마우스 모델에서 산화 스트레스에 대한 HO-1의 보호기능을 시험하였다. 웨스턴 블랏과 형광현미경 분석을 통하여 본 발명자들은 PEP-1-HO-1 융합단백질이 세포막을 가로질러 인간 신경아세포종 (neuroblastoma) 세포인 SH-SY5Y 내로 잘 투과할 뿐만 아니라, 투과된 융합단백질이 활성산소종 생성 및 MPP+ (1-methyl-4-phenylpyridinium) 이온에 의해 일어나는 세포 사멸을 저해함을 밝혔다. 반면, SH-SY5Y 세포 내로 투과하지 못하는 HO-1 단백질은 MPP+에 의해 유도되는 세포 독성 및 활성산소종 생성을 감소시키지 못하였다. 뿐만 아니라, 복강 주사한 PEP-1-HO-1 융합단백질은 마우스 뇌의 혈관-뇌 장벽을 투과하였다. 파킨슨병 마우스 모델에서, PEP-1-HO-1 융합단백질은 MPP+로 유도되는 독성 및 도파민 뉴런 사멸에 대하여 HO-1 단백질 또는 PEP-1 펩타이드 처리군과 달리 현저한 보호 효과를 나타내었다. 따라서, HO-1 융합단백질은 파킨슨병을 포함하는 신경질환에 대하여 치료제로서 이용 가능하다.
Description
본 발명은 단백질 수송 도메인 PEP-1과 융합한 PEP-1-헴 옥시게네이즈 융합단백질에 관한 것으로서, 이 융합단백질은 MPP+ 독성에 대하여 SH-SY5Y 신경아세포종 세포를 보호하고, MPTP 독성에 대하여 흑색질의 도파민 뉴런을 보호하였다. 따라서, PEP-1-HO-1 융합단백질은 파킨슨병과 같은 활성산소종 관련 질환에 대한 치료제로서 이용 가능성이 있다.
파킨슨병은 신경 퇴행성 질환이며, 운동완서 (bradykinesia), 떨림 (tremors) 및 경직과 같은 증상을 동반한다 [1]. 파킨슨병은 흑색질 치밀부에서 도파민 뉴런의 현저한 손실로 특징지어진다. 과도한 활성산소종 생성, 산화 스트레스, 잘못 접힌 (misfolded) 단백질 및 손상된 미토콘드리아 기능과 같은 다양한 자극들이 파킨슨병의 원인으로 알려져 있다. 파킨슨병 동물모델에서, MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) 및 6-OHDA (6-hydroxydopamine) 같은 신경독성물질들은 종종 도파민 뉴런을 손상시키는데 이용된다.
헴 옥시게네이즈 (Heme oxygenase-1; HO-1)는 헴 (heme), 내독소 (endotoxin), 과산화수소 및 사이토카인을 포함하는 다양한 자극에 의하여 유도된다 [2]. HO-1은 헴을 일산화탄소, 철 및 빌리루빈 환원효소에 의하여 빌리루빈으로 곧이어 전환되는 빌리버딘으로 분해하는 작용을 촉매한다. 이와 같은 헴의 분해산물은 항-세포자기사멸 (anti-apoptotic), 항염증 및 항산화활성을 나타낸다 [3-5]. 일산화질소와 유사하게 일산화탄소 CO는 신호전달 분자로서 기능한다 [3]. 일산화탄소는 인터류킨인 IL-1β, 종양괴사인자 (TNF)와 같은 몇몇 친염증성 사이토카인의 합성을 저하시킴으로써 염증을 억제하는데, 동시에 항염증성 분자인 IL-10의 발현을 상향조절한다 [3]. 또한, 외생성 일산화탄소는 내피세포에서 TNF-α에 의해 유도되는 세포자기사멸을 억제한다 [6]. 빌리루빈은 수산화기와 수퍼옥사이드 음이온을 제거하고 지질과 단백질의 과산화를 억제한다 [3, 7]. 또한, HO-1에 의해 유도되는 유리 철 (free iron)은 매우 독성이 강한 산화제인데, 이것은 철-저장 항산화 단백질인 페리틴 (ferritin)과 세포 내에서 유리 철의 수준을 빠르게 저감시키는 Fe-ATPase의 발현을 강하게 유도한다 [8]. 상기와 같이, 많은 연구들은 HO-1이 염증 및 자기세포사멸의 조절에 관련되어 있음을 밝혔다 [3, 9]. 그러므로, 특정 세포와 조직에서 HO-1 수준을 증가시키는 방법은 산화 스트레스에 대한 세포 보호를 위한 유용한 방법이 될 수 있다.
Tat과 PEP-1과 같은 단백질 수송 도메인 (Protein transduction domains; PTDs)은 세포 또는 조직 내로 외생 분자를 효과적으로 전달하는 도구로서 알려져 있다 [5, 10]. 뿐만 아니라, 본 발명자들은 아넥신 (Annexin)과 rpS3 (ribosomal protein S3)가 Tat 또는 PEP-1과 융합된 다양한 재조합 융합단백질들이 산화 스트레스에 의하여 유도되는 손상에 대하여 항-세포자기사멸 및 항염증 활성을 나타냄을 밝혔다 [11, 12].
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본 발명은 파킨슨병에 대하여 유용한 치료제를 제공하려는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 재조합 단백질인 PEP-1-HO-1 융합단백질이 SH-SY5Y 세포 및 뇌 조직 내로 잘 침투할 수 있는지, 그리고 MPP+ 또는 MPTP로 유도되는 SH-SY5Y 세포의 손상과 흑색질에서의 도파민 뉴런 손상에 대하여 보호효과를 나타내는지를 시험하였다. 그리하여, 본 발명자들은 PEP-1-HO-1 융합단백질이 파킨슨병을 포함하는 활성산소종 관련 질환의 치료에 유용함을 제안한다.
본 발명은 헴 옥시게네이즈 (Heme oxygenase-1; HO-1)의 N-말단에 단백질 수송 도메인 PEP-1이 공유결합된 PEP-1-HO-1 융합단백질을 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 융합단백질이 서열번호 2인 것을 특징으로 하는 PEP-1-HO-1 융합단백질을 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
헴 옥시게네이즈 (Heme oxygenase-1; HO-1) 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내 , 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.01㎍~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명에 따른 HO-1 단백질 분자의 세포 내 전달은 HO-1에 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인(hydrophobic domain), 라이신을 4개 이상 다수 포함하는 친수성 도메인(hydrophilic domain) 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서(spacer)로 구성된 수송 도메인이 공유결합된 Pep-1 세포투과성 수송도메인이 목표 단백질인 HO-1의 N-말단과 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"HO-1 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 HO-1을 포함하며, 단백질 수송 도메인과 화물 분자(cargo molecule, 즉 본 발명에서는 HO-1을 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서와 도면에서 구체적인 일 실시예로서 "PEP-1-HO-1"는 HO-1 융합단백질 중 HO-1의 N-말단에 PEP-1 단백질 수송 도메인이 결합된 것을 말한다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
또한, "표적 세포"란 수송 도메인에 의해 화물 분자가 전달되는 세포를 의미하는 것으로서 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물 세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다. 구체적으로 본 명세서에서 표적 세포는 뇌세포를 의미한다.
본 명세서의 "단백질 수송 도메인"은 화물 분자(목표 단백질) 펩타이드 또는 단백질과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 펩타이드나 단백질을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말하며, 예를 들면 PEP-1을 말한다.
본 명세서의 "목표 단백질"은 Tat 단백질 수송 도메인과 공유결합을 이루어 세포 내로 도입되어 활성을 나타내는 분자를 의미한다. "화물 분자"와 동일한 의미이다.
또한, 본 명세서에서는 단백질 또는 펩타이드를 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "형질도입", "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.
본 발명에서 단백질 수송 도메인으로는 15∼30개의 아미노산으로 구성되고, 5개 이상의 트립토판을 포함하는 비친수성 도메인, 라이신을 다수 포함하는 친수성 도메인 및 상기 두 도메인을 분리시켜 주는 스페이서로 구성된 단백질 수송 도메인, 6 내지 12개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인, 6 내지 12개의 라이신으로 구성되는 올리고라이신 수송 도메인, 6 내지 12개의 아르기닌으로 구성되는 올리고아르기닌 수송 도메인 또는 6 내지 12개의 라이신 또는 아르기닌으로 구성되는 올리고(라이신,아르기닌) 수송 도메인을 들 수 있다. 또한, 목표 단백질(화물 분자)는 HO-1이다. 상기 단백질 수송 도메인 및 목표 단백질은 silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내에서 동일·유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
본 발명의 PEP-1-HO-1 융합단백질은 SH-SY5Y 세포 내로 시간 의존적, 투여량 의존적으로 세포 내로 투과되었고, 나아가 세포내 PEP-1-HO-1 융합단백질 수준이 48시간 동안 상당히 유지되었다.
또한, 본 발명의 PEP-1-HO-1 융합단백질은 MPP+에 대한 반응인 활성산소종 생성을 현저히 억제하였다.
본 발명의 PEP-1-HO-1 융합단백질은 MPP+로 유도되는 산화 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있다.
본 발명의 PEP-1-HO-1 융합단백질은 뇌혈관장벽을 효과적으로 가로지를 수 있으며, MPTP로 유도되는 파킨슨병 마우스 모델에서 MPTP 독성에 대하여 도파민 뉴런을 보호하는 것으로 나타났고, MPTP에 의해 유도되는 흑색질에서의 도파민 뉴런의 사멸을 억제하여 운동기능 장애를 감소시킬 수 있을 것으로 예측된다.
도 1은 HO-1 단백질과 PEP-1-HO-1 융합단백질의 정제를 나타낸다. (A)는 HO-1 단백질과 PEP-1-HO-1 융합단백질의 도식적 서열이다. 히스티딘은 HO-1 단백질과 PEP-1-HO-1 융합단백질의 확인을 위해 이용하였다. (B) HO-1 단백질과 PEP-1-HO-1 융합단백질 정제 후 정제된 단백질은 12% SDS-PAGE 및 항-히스티딘 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 레인 M은 분자량 마커 (EBM-1035, Elpisbiotech, Korea); 레인 1은 정제한 HO-1 단백질; 레인 2는 정제한 PEP-1-HO-1 융합단백질이다.
도 2는 SH-SY5Y 세포 내로 PEP-1-HO-1 융합단백질의 투과를 나타낸다. SH-SY5Y 세포는 (A)는 PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질 (1.0-5.0 μM)로 한 시간 동안 배양한 것이고, (B)는 PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질 (1.0 μM)로 1-60분간 배양한 것이다. 각 시료에서 PEP-1-HO-1 융합단백질 또는 HO-1 단백질은 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (C) PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질 처리한 SH-SY5Y 세포는 항 히스티딘 항체와 함께 배양한 후 Alexa fluoro 488-결합된 이차항체와 배양하였다. 세포는 형광현미경 하에서 관찰하였다. (D) SH-SY5Y 세포 내에서 PEP-1-HO-1 융합단백질의 세포 내 안정성을 시험하기 위하여 세포를 PEP-1-HO-1 융합단백질로 한 시간 동안 처리한 후 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 세포를 원하는 시각에 트립신 처리하여 모았다. 세포 내 PEP-1-HO-1 융합단백질의 수준은 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다.
도 3은 SH-SY5Y 세포에서 MPP+에 의하여 유도되는 세포 사멸을 PEP-1-HO-1 융합단백질이 억제함을 나타낸다. (A) SH-SY5Y 세포를 PEP-1-HO-1 융합단백질 또는 HO-1 단백질로 한 시간 처리하고 MPP+로 24시간 동안 독성을 유도하였다. 생존세포 백분율은 MTT 분석으로 측정하였다. 데이타는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (B) SH-SY5Y 세포를 PEP-1 펩타이드, PEP-1-HO-1 융합단백질 또는 HO-1 단백질로 한 시간 동안 처리한 후 MPP+로 한 시간 처리하였다. 세포는 DCF-DA로 염색하고, 각 시료의 형광은 형광현미경으로 측정하였다.
도 4는 MPTP에 의해 유도되는 도파민 뉴런 사멸에 대해 PEP-1-HO-1 융합단백질이 보호효과를 나타냄을 보여준다. (A) HO-1 단백질 및 PEP-1-HO-1 융합단백질은 마우스에 복강주사하였다. 마우스는 희생시켜 뇌를 절편화하고 항 히스티딘 항체로 염색하였다. 크기 막대는 100 ㎛이다. (B) MPTP에 의하여 유도되는 파킨슨병 마우스 모델에서, 도파민 뉴런 사멸에 대한 PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질의 보호효과는 면역조직화학 분석으로 평가하였다. 모든 군으로부터 얻은 대표적 이미지는 (B)에 나타내었다.
도 2는 SH-SY5Y 세포 내로 PEP-1-HO-1 융합단백질의 투과를 나타낸다. SH-SY5Y 세포는 (A)는 PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질 (1.0-5.0 μM)로 한 시간 동안 배양한 것이고, (B)는 PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질 (1.0 μM)로 1-60분간 배양한 것이다. 각 시료에서 PEP-1-HO-1 융합단백질 또는 HO-1 단백질은 웨스턴 블랏으로 분석하였다. (C) PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질 처리한 SH-SY5Y 세포는 항 히스티딘 항체와 함께 배양한 후 Alexa fluoro 488-결합된 이차항체와 배양하였다. 세포는 형광현미경 하에서 관찰하였다. (D) SH-SY5Y 세포 내에서 PEP-1-HO-1 융합단백질의 세포 내 안정성을 시험하기 위하여 세포를 PEP-1-HO-1 융합단백질로 한 시간 동안 처리한 후 PBS로 세척하였다. 그런 다음, 세포를 원하는 시각에 트립신 처리하여 모았다. 세포 내 PEP-1-HO-1 융합단백질의 수준은 웨스턴 블랏팅으로 측정하였다.
도 3은 SH-SY5Y 세포에서 MPP+에 의하여 유도되는 세포 사멸을 PEP-1-HO-1 융합단백질이 억제함을 나타낸다. (A) SH-SY5Y 세포를 PEP-1-HO-1 융합단백질 또는 HO-1 단백질로 한 시간 처리하고 MPP+로 24시간 동안 독성을 유도하였다. 생존세포 백분율은 MTT 분석으로 측정하였다. 데이타는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. (B) SH-SY5Y 세포를 PEP-1 펩타이드, PEP-1-HO-1 융합단백질 또는 HO-1 단백질로 한 시간 동안 처리한 후 MPP+로 한 시간 처리하였다. 세포는 DCF-DA로 염색하고, 각 시료의 형광은 형광현미경으로 측정하였다.
도 4는 MPTP에 의해 유도되는 도파민 뉴런 사멸에 대해 PEP-1-HO-1 융합단백질이 보호효과를 나타냄을 보여준다. (A) HO-1 단백질 및 PEP-1-HO-1 융합단백질은 마우스에 복강주사하였다. 마우스는 희생시켜 뇌를 절편화하고 항 히스티딘 항체로 염색하였다. 크기 막대는 100 ㎛이다. (B) MPTP에 의하여 유도되는 파킨슨병 마우스 모델에서, 도파민 뉴런 사멸에 대한 PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질의 보호효과는 면역조직화학 분석으로 평가하였다. 모든 군으로부터 얻은 대표적 이미지는 (B)에 나타내었다.
아래에서는 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 구성이 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
PEP
-1-
HO
-1
융합단백질의
제조
종래 기술과 같이 PEP-1-HO-1 융합단백질을 제조하였다 [9]. 간단히 설명하면, PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질 발현 벡터를 구축하고 E. coli BL21 세포로 형질전환 하였다. 두 단백질을 4시간 동안 37℃에서 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드로 유도해 과발현하였다. 수확된 E. coli 배양물은 초음파로 용균처리하고, 세포 잔해물은 원심분리하여 제거하였다. PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질은 Ni2 +-나이트릴로삼초산 세파로즈 친화 크로마토그래피로 정제하였다. 단백질 농도는 브래드포드 분석을 사용하여 평가하였다.
면역블랏
분석
동량의 단백질 용균액을 12% SDS-PAGE로 분리하고, 나이트로셀룰로스 막에 전기이동하였다. 막은 5% 탈지분유로 블로킹하였고, 항 히스티딘 항체 (1:5,000 희석) 및 호스래디쉬 퍼옥시데이즈가 결합된 2차 항체 (1 : 5000 희석)와 함께 배양하였다. 결합된 항체 복합체는 화학발광 탐지 키트를 사용하여 탐지하였다.
공촛점
현미경 관찰
SH-SY5Y 세포를 12-웰 플레이트 커버슬립 상에서 PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질과 함께 1시간 동안 배양하였다. 세포를 0.1% 트리톤 X-100에 용해시킨 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고, 항 히스티딘 항체 (1:2,000) 및 알렉사 플루오르 결합된 이차 항체 (1:10,000)와 함께 배양하였다. 핵은 1㎍/ml DAPI (4'6-diamidino-2-phenylindole)으로 염색하였다. 세포를 형광현미경으로 관찰하였다. 또한, 세포내 활성산소종 수준을 측정하기 위하여, HO-1 단백질 또는 PEP-1-HO-1 융합단백질 처리된 SH-SY5Y 세포를 30분 동안 MPP+와 함께 배양하고 PBS로 세척하였다. 세포는 30분 동안 2',7'-DCF-DA (dichlorofluorescein diacetate)에 노출시켰다. 형광은 형광현미경으로 촬영하였다.
MTT
분석법
SH-SY5Y 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 시딩 하였다. 다음날 PEP-1-HO-1 융합단백질과 HO-1 단백질의 다양한 농도로 세포를 1시간 동안 배양하고, MPP+를 첨가한 후, 세포를 추가로 24시간 동안 유지하였다. 세포를 4시간 동안 MTT와 함께 배양하고, 포르마잔 결정을 DMSO에 용해시켰다. 광학밀도는 595nm에서 측정하였다.
동물 모델
수컷, 8 주령, C57BL / 6 쥐를 한림대학교 실험동물센터에서 구입하였다. 쥐는 일정 온도 23℃ 및 일정 상대습도 60%로 12시간은 밝게, 12시간은 어둡게 조절하였다. 동물과 관련된 모든 실험 절차와 관리는 국립수의과학검역원 (National Veterinary Research & Quarantine Service of Korea)의 실험동물 보호 및 이용에 관한 가이드를 따랐고, 이를 한림대학교 의과대학 동물 보호 및 이용 위원회가 입증한다.
면역염색은 전술한 바와 같이 수행하였다[25]. 쥐의 두뇌에 PEP-1-HO-1 융합단백질 또는 HO-1 단백질의 생체 내 전달을 조사하기 위해 PEP-1-HO-1 융합단백질, HO-1 단백질 (㎎/kg)을 쥐 (N = 7/그룹)에 복강주입 하였다. 6시간 후에 쥐를 펜토바비탈나트륨 (100㎎/㎏)을 복강주입 하여 희생시켰다. 쥐의 뇌는 4% 파라포름알데하이드와 경심관류로 고정시키고, 절편 하였다. PEP-1-HO-1 융합단백질의 절편을 반대 그의 항체 및 퍼옥시다제 - 결합 이차 항체를 사용하여 시각화하였다.
PEP-1-HO-1 융합단백질이 MPTP에 의해 유도되는 도파민 신경세포의 사멸을 억제하는지 여부를 검사하려면, PEP-1-HO-1 융합단백질 및 HO-1 단백질을 (mg/kg) 마우스 (n=7/그룹)에 복강주사하고, 다음날 MPTP를 2시간 간격으로 4회 각각 마우스에 복강주사하였다. 쥐에 MPTP를 주입하고 1주일 후에 펜토바비탈나트륨 (100㎎/㎏)을 복강주사하여 희생시켰다. 쥐의 뇌는 수거하였다. 흑색질에서 도파민 신경세포를 감지하기 위해 뇌 부분을 티로신하이드록실레이즈 (TH) 항체와 함께 배양하였다. 흑색질에서 생존하는 도파민 신경세포를 감지하기 위해 뇌 부분을 TH 항체와 크레실 바이올렛으로 염색하였다.
결과 1:
PEP
-1-
HO
-1
융합단백질은
투여량 및 시간 의존적으로 세포 내로 투과하였다.
소수성 트립토판이 풍부한 도메인과 친수성 라이신이 풍부한 도메인 및 스페이서 도메인으로 이루어진 PEP-1은 다양한 단백질을 세포 및 조직 내로 전달하는 단백질 수송 도메인으로 알려져 있다 [5]. 본 발명자들은 PEP-1-HO-1 융합단백질이 Raw 264.7 세포 내로 즉시 투과함을 보고한바 있다 [9]. 본 발명에서는 PEP-1-HO-1 융합단백질이 SH-SY5Y 신경아세포종 세포 내로 투과할 수 있는지를 시험하였다. HO-1 단백질과 PEP-1-HO-1 융합단백질의 개략적 구조는 도 1의 A와 같다. PEP-1-HO-1 융합단백질은 HO-1 및 PEP-1 펩타이드를 포함한다. 본 발명자들은 종래 기술에 따라 PEP-1-HO-1 융합단백질과 HO-1 단백질을 정제하였다 [9]. 두 단백질을 정제한 후, 순도는 SDS-PAGE 및 항 히스티딘 항체를 이용한 웨스턴 블랏팅으로 확인하였다 (도 1의 B). 먼저 PEP-1-HO-1 융합단백질과 HO-1 단백질이 SH-SY5Y 세포 내로 투과하는지를 평가하기 위하여 각 단백질을 1-5 μM 농도로 한 시간 동안 처리하거나 또는 각각 1 μM 농도의 두 단백질을 10-60분간 처리하였다. PEP-1-HO-1 융합단백질은 도 2의 A 및 B와 같이 투여량 및 처리시간 의존적으로 SH-SY5Y 세포 내로 투과하였다. 뿐만 아니라, 형광현미경 분석은 PEP-1-HO-1 융합단백질이 SH-SY5Y 세포 내에 상당량 분포되어 있음을 보여준다 (도 2의 C). SH-SY5Y 세포 내로 투과된 PEP-1-HO-1 융합단백질의 안정성을 시험하기 위하여 세포 내 PEP-1-HO-1 융합단백질의 수준은 면역 블랏팅으로 모니터하였다. 세포 내 PEP-1-HO-1 융합단백질은 24시간까지 증가하였고, 그 이후로 감소하였다 (도 2의 D). 따라서, 이 데이타는 PEP-1-HO-1 융함단백질이 SH-SY5Y 세포 내로 20분 내에 투과하여 24시간 동안 세포 내에 상당량 머물러 있음을 말해준다.
결과 2:
PEP
-1-
HO
-1
융합단백질은
MPP
+
에 의해 유도되는
SH
-
SY5Y
세포 사멸을 억제한다.
파라쿠앗 (paraquat), 로테논 (rotenone) 및 6-OHDA와 함께 MPTP는 파킨슨병과 유사한 증세를 일으키는 신경독성물질이다 [13]. MPTP는 혈관-뇌 장벽을 가로지르며, 모노아민 옥시데이즈 B에 의해 MPP+ (1-methyl-4-phenylpyridinium) 이온으로 전환된다 [14]. MPP+는 흑색질의 도파민 뉴런에서 미토콘드리아 복합체를 차단함으로써 세포 퇴화 (degeneration)를 일으킨다 [14]. 본 발명자들은 SH-SY5Y 세포 내로 투과된 PEP-1-HO-1 융합단백질이 MPP+에 의해 유도되는 활성산소종 또는 세포 독성에 영향을 미치는지를 시험하였다. SH-SY5Y 세포는 HO-1 단백질 또는 PEP-1-HO-1 융합단백질로 한 시간 동안 선처리한 후 MPP+로 24시간 동안 처리하였다. MTT 분석은 PEP-1-HO-1 융합단백질 (1-3 μM)이 투여량 의존적으로 MPP+에 의해 유도되는 세포독성을 현저히 억제함을 보여주었다. 그러나, 3 μM 이상의 농도에서 세포 생존율은 3 μM 처리시 세포생존율과 유사하였다 (도 3의 A). 반면, HO-1 단백질 처리군에서는 세포 사멸에 대한 보호효과가 관찰되지 않았다 (도 3의 A). 본 발명자들은 PEP-1-HO-1 융합단백질이 MPP+에 의하여 유도되는 활성산소종 생성을 저해하는지를 평가하였다. 활성산소종의 세포 내 수준을 나타내는 형광신호는 MPP+ 처리군, HO-1 단백질 및 MPP+ 처리군, 그리고 PEP-1 펩타이드 및 MPP+-처리군에서 상당히 많은 양이 관찰되었다 (도 3의 B). 그러나, PEP-1-HO-1 융합단백질 처리세포에서는 미처리 대조군과 유사한 정도로 매우 약한 형광을 나타내었다 (도 3의 B). 따라서, 이러한 결과는 MPP+에 의해 유도되는 활성산소종 생성 및 세포 독성이 PEP-1-HO-1 융합단백질에 의해 현저히 억제됨을 말해준다.
결과 3: MPTP로 유도되는 파킨슨병 동물모델에서 PEP-1-HO-1 융합단백질은 흑색질의 도파민 뉴런의 사멸을 억제한다.
본 발명자들은 복강주사한 PEP-1-HO-1 융합단백질이 혈관-뇌 장벽을 통과할 수 있는지를 평가하였다. 면역조직화학 분석 결과는 미처리 대조군 및 HO-1 단백질 처리군과 비교하여 PEP-1-HO-1 융합단백질이 주사한 마우스의 흑색질을 포함한 뇌에 상당량 분포함을 보여주었다 (도 4의 A). 이 데이타는 PEP-1-HO-1 융합단백질이 자극 없이도 혈관-뇌 장벽을 효과적으로 가로지를 수 있음을 말해준다.
다음으로, MPTP로 유도되는 마우스 도파민 뉴런의 사멸에 대한 투과된 PEP-1-HO-1 융합단백질의 효과를 시험하였다. 도파민 뉴런의 존재는 타이로신 하이드록실레이즈 (TH)에 대한 항체를 이용하여 확인하였고, 생존하는 도파민 뉴런은 항-TH 항체와 함께 크레실 바이올렛으로 염색되었다. HO-1 단백질 및 PEP-1 펩타이드는 MPTP만으로 처리한 마우스에서 보이는 것과 같이 MPTP로 유도되는 마우스 뇌 흑색질의 도파민 뉴런 사멸을 전혀 억제하지 않았다 (도 4의 B). 반면, PEP-1-HO-1 융합단백질을 주사한 마우스에서는 상당수의 생존하는 도파민 뉴런이 관찰되었다 (도 4의 B). 그러므로, 이러한 결과는 MPTP로 유도되는 독성으로부터 PEP-1-HO-1 융합단백질이 마우스 뇌 흑색질의 도파민 뉴런을 현저히 보호함을 말해준다.
HO-1의 발현은 통상 낮으나 산화 스트레스 및 헴, 과산화수소, 베타 아밀로이드, 자외선, 지다당 (lipopolysaccharide)과 같은 독성 자극 및 다른 친염증성 사이토카인에 대한 반응으로 유도될 수 있다 [15]. 다양한 실험모델에서 HO-1 발현 증가의 효과에 대해서는 상반된 보고들이 있다. 예컨대 상향 조절된 HO-1이 변형된 헴을 산화 스트레스를 악화시키는 철 이온, 빌리버딘 및 일산화탄소로 분해한다 [16]. 또한, HO-1 유도자 (inductor)와 기질 헤민 (hemin)으로 처리한 랫트는 HO-1 발현을 증가시키고 뇌 조직 손실, 소교세포 활성화 및 뉴런 사멸과 같은 신경염증 특성을 나타낸다 [17]. 반면, 다른 연구 결과는 HO-1 증가가 산화 스트레스에 의해 유도되는 손상에 대하여 보호기능을 나타냄을 제시한다. 그리하여, 형질전환 마우스 뉴런에서 HO-1의 과다발현은 전뇌 허혈 유도 이후 1회 박출량 (stroke volume) 및 허혈성 대뇌 부종 (ischemic cerebral edema)을 측정하였을 때 현저한 신경보호효과를 나타내었다 [18]. 형질전환 마우스에서 HO-1 과다발현은 활성산소종 생성을 감소시킴으로써 글루타메이트 독성에 대해 뉴런을 보호하였다 [19]. 랫트 흑색질에서 아데노바이러스 매개 HO-1 과다발현은 MPP+에 의해 촉발되는 도파민 뉴런 사멸을 방지한다 [20]. HO-1 녹아웃 마우스 유래 성상세포는 헴 매개 손상에 좀더 취약하다 [21]. HO-1 제거 마우스에서 허혈로 전조절(preconditioning)하면 HO-1 매개 경로 활성화가 되지 않고, 이어 뇌 손상이 감소하였다 [22]. 또한, 마우스 해마 HT22 및 BV2 세포에서 HO-1 수준을 상향 조절하는 생물활성제인 몰루긴 (mollugin)은 글루타메이트로 유도되는 신경독성 및 LPS로 유도되는 소교세포 활성화에 대해 신경보호효과 및 항염증 효과를 나타낸다 [23]. 뿐만 아니라, 도 3 및 도 4의 B는 PEP-1-HO-1 융합단백질 상향조절이 SH-SY5Y 세포 내에서 MPP+-로 유도되는 독성 또는 마우스 뇌 흑색질의 MPTP로 유도되는 도파민 뉴런 퇴화를 억제함을 보여주며, 이는 HO-1의 신경보호기능을 보여주는 다른 데이타들과 일치한다. 상기와 같이, HO-1의 상향 또는 하향 조절은 세포 퇴화 및 생존과 같은 모순되는 결과를 가져오는 것으로 보인다. 그러나, 실험 모델, HO-1 발현 수준, HO-1의 장기간 또는 일시적 유도 및 HO-1에 의해 생성되는 분해산물의 수준을 포함하는 많은 요소들이 중추신경계 조직에서 HO-1의 다운스트림 신호전달에 관여하는 것으로 보인다. 결과적으로, 이들이 HO-1의 생물학적 역할에 관한 상반된 결과를 가져오는 것으로 보인다.
종합하자면 본 발명은 PEP-1-HO-1 융합단백질이 세포 및 조직 내로 투과하는 능력이 있으며, 산화 스트레스에 의한 활성산소종 생성 및 세포 독성을 현저히 저해하여 마우스 뇌 흑색질의 도파민 뉴런에 대해 보호효과를 나타냄을 밝혔다. 그러므로, PEP-1-HO-1 융합단백질은 산화 스트레스로 유도되는 신경퇴화 억제에 유용하다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University
<120> Pharmaceutical composition for Parkinson's disease containing
cell-transducible Heme oxygenase-1 fusion protein
<130> HallymU-syCHOI-HO-1-PD
<160> 2
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 884
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> polynucleotide encoding PEP-1-HO-1 fusion protein
<400> 1
taaaagaaac ctggtgggaa acctggtgga ccgaatggtc tcagccgaaa aaaaaacgta 60
aagtgctcga gatggagcgt ccgcaacccg acagcatgcc ccaggatttg tcagaggccc 120
tgaaggaggc caccaaggag gtgcacaccc aggcagagaa tgctgagttc atgaggaact 180
ttcagaaggg ccaggtgacc cgagacggct tcaagctggt gatggcctcc ctgtaccaca 240
tctatgtggc cctggaggag gagattgagc gcaacaagga gagcccagtc ttcgcccctg 300
tctacttccc agaagagctg caccgcaagg ctgccctgga gcaggacctg gccttctggt 360
acgggccccg ctggcaggag gtcatcccct acacaccagc catgcagcgc tatgtgaagc 420
ggctccacga ggtggggcgc acagagcccg agctgctggt ggcccacgcc tacacccgct 480
acctgggtga cctgtctggg ggccaggtgc tcaaaaagat tgcccagaaa gccctggacc 540
tgcccagctc tggcgagggc ctggccttct tcaccttccc caacattgcc agtgccacca 600
agttcaagca gctctaccgc tcccgcatga actccctgga gatgactccc gcagtcaggc 660
agagggtgat agaagaggcc aagactgcgt tcctgctcaa catccagctc tttgaggagt 720
tgcaggagct gctgacccat gacaccaagg accagagccc ctcacgggca ccagggcttc 780
gccagcgggc cagcaacaaa gtgcaagatt ctgcccccgt ggagactccc agagggaagc 840
ccccactcaa cacccgctcc caggtttatg ccatgtgagg atcc 884
<210> 2
<211> 291
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEP-1-HO-1 fusion protein
<400> 2
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu Met Glu Arg Pro Gln Pro Asp Ser Met
20 25 30
Pro Gln Asp Leu Ser Glu Ala Leu Lys Glu Ala Thr Lys Glu Val His
35 40 45
Thr Gln Ala Glu Asn Ala Glu Phe Met Arg Asn Phe Gln Lys Gly Gln
50 55 60
Val Thr Arg Asp Gly Phe Lys Leu Val Met Ala Ser Leu Tyr His Ile
65 70 75 80
Tyr Val Ala Leu Glu Glu Glu Ile Glu Arg Asn Lys Glu Ser Pro Val
85 90 95
Phe Ala Pro Val Tyr Phe Pro Glu Glu Leu His Arg Lys Ala Ala Leu
100 105 110
Glu Gln Asp Leu Ala Phe Trp Tyr Gly Pro Arg Trp Gln Glu Val Ile
115 120 125
Pro Tyr Thr Pro Ala Met Gln Arg Tyr Val Lys Arg Leu His Glu Val
130 135 140
Gly Arg Thr Glu Pro Glu Leu Leu Val Ala His Ala Tyr Thr Arg Tyr
145 150 155 160
Leu Gly Asp Leu Ser Gly Gly Gln Val Leu Lys Lys Ile Ala Gln Lys
165 170 175
Ala Leu Asp Leu Pro Ser Ser Gly Glu Gly Leu Ala Phe Phe Thr Phe
180 185 190
Pro Asn Ile Ala Ser Ala Thr Lys Phe Lys Gln Leu Tyr Arg Ser Arg
195 200 205
Met Asn Ser Leu Glu Met Thr Pro Ala Val Arg Gln Arg Val Ile Glu
210 215 220
Glu Ala Lys Thr Ala Phe Leu Leu Asn Ile Gln Leu Phe Glu Glu Leu
225 230 235 240
Gln Glu Leu Leu Thr His Asp Thr Lys Asp Gln Ser Pro Ser Arg Ala
245 250 255
Pro Gly Leu Arg Gln Arg Ala Ser Asn Lys Val Gln Asp Ser Ala Pro
260 265 270
Val Glu Thr Pro Arg Gly Lys Pro Pro Leu Asn Thr Arg Ser Gln Val
275 280 285
Tyr Ala Met
290
Claims (2)
- 헴 옥시게네이즈 (Heme oxygenase-1; HO-1) 단백질의 N-말단에 단백질 수송 도메인 PEP-1이 공유결합된 PEP-1-HO-1 융합단백질을 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 융합단백질은 서열번호 2인 것을 특징으로 하는 PEP-1-HO-1 융합단백질을 함유하는 파킨슨병 예방 및 치료용 약학 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140004983A KR20150085550A (ko) | 2014-01-15 | 2014-01-15 | 세포투과성 헴 옥시게네이즈 융합단백질을 포함하는 파킨슨병 치료용 약학 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140004983A KR20150085550A (ko) | 2014-01-15 | 2014-01-15 | 세포투과성 헴 옥시게네이즈 융합단백질을 포함하는 파킨슨병 치료용 약학 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150085550A true KR20150085550A (ko) | 2015-07-24 |
Family
ID=53875785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140004983A KR20150085550A (ko) | 2014-01-15 | 2014-01-15 | 세포투과성 헴 옥시게네이즈 융합단백질을 포함하는 파킨슨병 치료용 약학 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20150085550A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109182232A (zh) * | 2018-07-30 | 2019-01-11 | 浙江工业大学 | 重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用 |
-
2014
- 2014-01-15 KR KR1020140004983A patent/KR20150085550A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109182232A (zh) * | 2018-07-30 | 2019-01-11 | 浙江工业大学 | 重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用 |
| CN109182232B (zh) * | 2018-07-30 | 2022-04-19 | 浙江工业大学 | 重组大肠杆菌zjut-ho1及其在制备胆绿素中的应用 |
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| WITN | Withdrawal due to no request for examination |