KR101298014B1 - 세포침투 효율이 향상된 ｐｒａｓ40 융합단백질 - Google Patents

세포침투 효율이 향상된 ｐｒａｓ40 융합단백질 Download PDF

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Abstract

파킨슨병은 흑색질에서 도파민 뉴런의 손실이 주요 원인이 되어 발병하며, 신경세포 내측에 루이체 (Lewy bodies)를 축적시킨다. 가장 특징적인 증세는 진전, 운동완만증, 강직 및 자세 불안정이다. 포스파티딜이노시톨 3-카이네이즈/AKT/라파마이신 신호경로의 포유류 타겟은 세포 성장, 생존 및 사멸 조절에 결정적인 역할을 수행한다. PRAS40 (Proline-rich Akt substrate 40)은 랩터-mTORC1 복합체에 결합함으로써 mTORC1 활성의 반대조절에 관여한다. 본 발명자들은 인 비트로와 인 비보에서 PRAS40 융합단백질이 MPP+에 의해 유도된 산화 스트레스로부터 도파민 뉴런 세포를 보호할 수 있는지를 시험하였고, 그 결과 도파민 뉴런 세포의 생존율이 증가하였다. 세포도입된 PRAS40 융합단백질은 MPP+에 의해 유도된 활성산소종 생산을 효과적으로 억제하였고, SH-SY5Y 세포에서 세포사멸을 상당한 정도로 약화시켰다. 또한, MPTP에 의해 유도된 마우스 파킨슨병 모델에서 크레실 바이올렛 염색 및 타이로신 수산화효소 면역염색은 PRAS40 융합단백질이 뇌혈관장벽을 효율적으로 가로질러 흑색질에서 도파민 뉴런세포를 보호할 수 있음을 보여주었다. 이상의 결과를 종합하면 PRAS40 융합단백질은 산화 스트레스에 의해 유도된 파킨슨병의 치료제로서 이용될 수 있다.

Description

세포침투 효율이 향상된 ＰＲＡＳ40 융합단백질 {Cell-transducible PRAS40 fusion protein}
본 발명은 PRAS40 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 뇌허혈을 포함하는 뇌신경질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물 및 신경질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
활성산소종은 다양한 생리적 조건에서 생성되며, 세포내 거대분자에 손상을 초래한다. 뇌는 총 체중의 2~3%만을 구성하고 있지만, 신체에 사용되는 산소의 약 20%를 소비한다. 따라서, 산화 스트레스로 인해 유발된 손상된 생체분자들이 뇌에 축적되어 알츠하이머병, 파킨슨병 및 헌팅턴병과 같은 신경퇴행 질병을 일으킬 수 있다는 가능성이 제기되고 있다 [Chinta, S. J.; Anderson, J. K. Biochim. Biophys. Acta 1780:1362-1367; 2008, de Moura, M. B. et al. Environ. Mol. Mutagen. 51:391-405; 2010, Mates, J. M. Toxicol. 83:83-104; 2000]. 특히 파킨슨병은 흑색질 치밀부 (substantia nigra, pars compacta)에 도파민 뉴런이 파괴되고 유비퀴틴 및 α-시누클라인과 같은 단백질로 이루어진 루이체 (Lewy bodies)가 축적되는 것이 특징인데, 이것이 진전, 운동완만증, 강직 및 자세 불안정과 같은 증세를 유발한다 [Dawson, T. M.; Dawson, V. L. Science 302:819-822; 2003, Eriksen, J. L. et al. Arch. Neurol. 62:353-357; 2005, Forno, L. S. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 55:259-272; 1996]. 현재까지 파킨슨병의 정확한 발병 메카니즘은 밝혀지지 않았지만, 유전인자, 노화, 제초제 및 신경독성물질 등이 파킨슨병과 관련이 있다 [Miller, R. L. et al. Neurochem. Res. 34:55-65; 2009].
파킨슨 환자의 도파민 뉴런 손실은 화학물질 및 농약 노출과 관련이 있다. 친유성 물질인 MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)는 혈관-뇌 장벽을 쉽게 통과하는데, 이것은 아교세포 (glial cells)에서 모노아민 산화효소 B에 의해 MPP+ (1-methyl-4-phenylpyridinium)로 전환된다. 결과적으로 MPP+는 뇌 흑색질 내에서 미토콘드리아에서 활성산소종을 생성하고, 전자전달계의 복합체 Ⅰ (complex I)을 차단하며, 세포사멸 일련반응을 활성화시키고 도파민 뉴런을 파괴한다 [Yokoyama, H. et al. Neurol. Sci. 29:293-301; 2008, Eberhardt, O.; Schulz, J. B. Toxicol. Lett. 139:135-151; 2003, Fukuda, T. Neuropathology 21:323-332; 2001, Kalivendi, S. V. et al. Biochem. J. 371:151-164; 2003]. 자유 라디칼과 퀴닌 (quinine)으로 산화되는 신경독성물질인 6-OHDA (6-Hydroxydopamine)는 MPP+와 함께 파킨슨병 실험모델에 이용되어 왔다 [Miller, R. L. et al. Neurochem. Res. 34:55-65; 2009]. 그러나, MPTP 또는 6-OHDA에 노출시키면 파킨슨병의 마크인 루이체가 생성되지 않는다. 다른 연구결과들은 로테논 (rotenone) 및 파라쿠앗 (paraquat: PQ)이 산화 스트레스를 증가시키고, 도파민 뉴런의 퇴화를 유도하여 마침내 동물 모델에서 파킨슨병을 유발한다는 증거를 제시하였다 [Miller, R. L. et al. Neurochem. Res. 34:55-65; 2009, Synder, S. H. et al. Nature 317:198-199; 1985].
mTOR (Mammalian target of rapamycin)는 PI3K (phosphoinositide 3-kinase) 관련 카이네이즈 군에 속하는데, 세포 에너지, 아미노산과 같은 영양분 및 인슐린, 인슐린-유사 성장인자와 같은 동화작용 성장인자의 결핍에 반응하여 단백질 합성 조절, 세포 성장 및 세포사멸의 조절에 중추적인 역할을 수행한다 [Dunlop, E. A.; Tee, A. R. Cell. Signal. 21:827-835; 2009, Vander Haar, E, et al. Nat. Cell Biol. 9:316-323; 2007]. 또한, 많은 종양에서 mTOR는 구조적으로 활성화되는데, 이는 종양유전자 활성화 조절 및 종양억제 유전자의 손실 실패로 인한 것이다 [Garcia, J. A.; Danielpour, D. Mol. Cancer Ther. 7:1347-1354; 2008, Madhunapantula, S. V. et al. Cancer Res. 67:3626-3636; 2007]. mTORC1 (mTOR complexes containing Raptor) 또는 mTORC2 (mTOR complexes containing Rictor)는 두 가지 구별되는 기능을 발휘하며, 다른 메카니즘에 의해 조절된다. mTORC1은 PI3K/AKT 경로를 통해 활성화되며, S6K (S6 kinase) 및 4E-BP (eIF-4E binding protein)을 포함하는 다양한 기질을 인산화하여, 단백질 합성, 리보솜 생합성, 세포 증식 및 성장을 조절한다 [Dunlop, E. A.; Tee, A. R. Cell. Signal. 21:827-835; 2009, Sancak, Y. et al. Mol. Cell 25:903-915; 2007, Dey, N. et al. J Cell Physiol. 225: 27-41; 2010]. 특히, 몇몇 연구결과는 AKT에 의해 활성화되는 기질로 밝혀진 PRAS40이 Raptor와 결합을 통해 mTORC1과 결합할 수 있고 mTORC1 활성화에 관여하는 것으로 나타났다 [Kovacina, K.S. et al. J. Biol. Chem. 278:10189; 2003, Yu, F. et al. J. Cereb. Blood Flow Metab. 28:44-52; 2008, Fonseca, B. D. et al. J. Biol. Chem. 282:24514-24524; 2007]. PRAS40 siRNA를 이용한 다른 연구결과들은 mTORC1 결합에 필요한 TOR-신호 (TOS) 모티프를 포함하는 PRAS40이 mTORC1의 기질이 될 수 있다고 제시하였다 [Oshiro, N. et al. J. Biol. Chem. 282:20329-20339; 2007, Wang, L. et al. J. Biol. Chem. 283:15619-15627; 2008]. 뿐만 아니라, PRAS40은 세포 대사에 다양한 역할을 수행하는 14-3-3-sigma (stratifin)과 결합한다 [Pozuelo Rubio, M. et al. Biochem. J. 379:395-408; 2004].
몇몇 펩타이드 및 단백질 약제는 치료 가능성을 갖고 있지만, 분자 크기, 친수성 및 생화학적 특성으로 인해 타겟 세포 및 조직에 효과적으로 전달되지 못한다. 특히 뇌의 항상성을 유지시키는데 중추적인 역할을 수행하는 혈관-뇌 장벽의 존재는 치료제가 뇌로 확산되는 것을 제한하여 치료 효과를 낮춘다 [Egleton, R. D.; Davis, T. P. Peptides 18:1431-1439; 1997]. 많은 연구자들은 약제를 화학적으로 변형하는 방법 그리고 전달자와 결합시키는 방법 등의 전략이 약제의 생체 내 활용성을 증대시킬 수 있음을 제안하였다 [Egleton, R. D.; Davis, T. P. Peptides 18:1431-1439; 1997, Dietz, G. P. Curr. Pharm. Biotechol. 11:167-174; 2010, Wadia, J.; Dowdy, S. F. Curr. Opin. Biotechnol. 13:52-56; 2002].
본 발명은 파킨슨병을 비롯한 뇌신경질환의 효과적인 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 PRAS40이 단백질 수송 도메인과 융합되면 혈관-뇌 장벽을 넘어 마우스 모델에서 파킨슨병 발병을 방지할 수 있는지를 연구하였다.
사람 면역결핍 바이러스(HIV-1)의 Tat 단백질을 비롯한 단백질 수송 도메인 (Protein Transducing Domain)이 이형 단백질을 세포 내로 이동시키는데 운반체로써 이용될 수 있다는 것이 여러 연구자들에 의하여 밝혀졌다. 따라서 본 발명에서는 이러한 단백질 수송 도메인이 PRAS40을 세포 내로 운반시킬 수 있는지, 운반된 PRAS40 융합단백질이 세포 내에서 단백질의 기능을 나타내는지를 알아보고자 수행하였다.
본 발명에서는 단백질을 세포 및 조직 내로 운반하는 단백질 수송 도메인을 외부 단백질인 PRAS40에 융합시켰고, 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켰으며, 금속 킬레이팅 친화 크로마토그래피로 쉽고 편리하게 정제하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, PRAS40 융합단백질을 과대발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 PRAS40 발현벡터를 개발하였다. 이 발현벡터는 인간 PRAS40 cDNA (서열번호 8), 단백질 수송 도메인 그리고 6개의 히스티딘이 연속적으로 연결되어 있다. 이 발현벡터를 이용하여 PRAS40 융합단백질을 대장균에서 과대발현시켜 Ni2+-친화 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제하였다. PRAS40 융합단백질의 과대발현은 상당히 높게 나타났으며, 이 결과로 정제된 단백질의 양도 높게 나타났다.
또한, 본 발명자들은 정제된 융합단백질이 효과적으로 생물학적인 활성을 지니고 있으며, 세포 내로 운반된다는 것을 배양된 신경세포 및 동물실험을 통하여 확인하였다. 그리고, PRAS40 융합단백질이 신경 세포 내로 운반되며 신경 세포사를 효과적으로 보호함을 밝혀냈다. 즉, 배양된 신경세포에 정제된 PRAS40 융합단백질이 농도 및 시간 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏 방법으로 확인하였다. 또한, 세포 내로 투과된 PRAS40 융합단백질은 세포 내에서 최소 24시간 지속적으로 유지되었다.
본 발명자들은 인 비트로와 인 비보에서 PRAS40 융합단백질이 MPP+에 의해 유도된 산화 스트레스로부터 도파민 뉴런 세포를 보호할 수 있는지를 시험하였고, 그 결과 도파민 뉴런 세포의 생존율이 증가하였다. 세포도입된 PRAS40 융합단백질은 MPP+에 의해 유도된 활성산소종 생산을 효과적으로 억제하였고, SH-SY5Y 세포에서 세포사멸을 상당한 정도로 약화시켰다. 또한, MPTP에 의해 유도된 마우스 파킨슨병 모델에서 크레실 바이올렛 염색 및 타이로신 수산화효소 면역염색은 PRAS40 융합단백질이 뇌혈관장벽을 효율적으로 가로질러 흑색질에서 도파민 뉴런세포를 보호할 수 있음을 보여주었다. 파킨슨병 외에도 헌팅턴병, 알츠하이머병, 뇌허혈과 같은 뇌신경질환은 신경세포 사멸과 밀접한 관련을 가지므로, PRAS40 융합단백질의 위와 같은 신경세포 사멸 저해효과는 PRAS40 융합단백질을 함유한 조성물을 이들 뇌신경질환의 예방 및 치료, 개선 용도로 이용할 수 있음을 말해준다.
본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명하면, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 먼저 Tat-PRAS40 융합단백질을 과대 발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 Tat-PRAS40 발현 벡터를 개발하였다. 이 발현 벡터는 인간 PRAS40, Tat 형질도입 부위의 9개 아미노산(Tat 49-57), 그리고 아미노산 말단부분에 6개의 히스티딘 잔기를 발현시킬 수 있는 cDNA를 포함하고 있다.
이 발현벡터를 이용하여 Tat-PRAS40 융합단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며 Ni-친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 배양된 세포에 Tat-PRAS40 융합단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 세포 내로 투과된 Tat-PRAS40 융합단백질은 세포 내에서 최소 24시간 지속적으로 유지되었으며, 산화 스트레스에 의한 세포사멸을 억제하였다.
이러한 결과는 Tat-PRAS40 융합단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 PRAS40의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 Tat-PRAS40 융합단백질은 활성산소종과 관련된 증세 또는 파킨슨병 및 뇌허혈 등의 뇌신경질환에 응용할 수 있는 가능성을 제시해 준다.
PRAS40 융합단백질을 포함하여 수송도메인 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태 등으로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제(예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제(예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제(예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제(예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내 , 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 천식에 적용하는 경우에는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 널리 알려진 바와 같이 흡입 방식이나 스프레이 방식의 제제로 제형화할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 PRAS40 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 알츠하이머병과 같은 신경 퇴행성 질환, 뇌허혈과 같은 신경질환의 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 PRAS40 융합단백질을 유효성분으로 하며, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 뇌허혈과 같은 뇌신경질환 개선용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 PRAS40 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 PRAS40 단백질 분자의 세포 내 전달은 HIV Tat을 비롯한 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 aa 49-57의 아홉 개의 아미노산으로 구성되고, 서열번호 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33과 같은 아미노산 서열로 이루어진 HIV Tat 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 서열번호 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33의 Tat 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, Tat의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 Tat 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 7~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 다수 포함하는 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.
구체적으로, 본 발명은 PRAS40 융합단백질, 이 융합단백질을 제조하기 위한 재조합 뉴클레오타이드와 벡터, 이 융합단백질을 포함하는 치료, 예방 목적의 약학 조성물, 건강 기능성 식품 등에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"PRAS40 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 PRAS40을 포함하며, 수송 도메인과 목표 단백질(즉, 본 발명에서는 PRAS40을 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "Tat-PRAS40", "PRAS40 융합단백질" 등과 혼용하였다.
"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 PRAS40을 의미한다.
"융합단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.
본 발명에서의 "단백질 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.
또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.
본 발명은 9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 PRAS40 (Proline-rich Akt substrate 40)의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 PRAS40 융합단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 수송도메인이 HIV Tat 49-57 잔기, Pep-1 펩타이드, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고(라이신,아르기닌) 중의 1종 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 PRAS40 융합단백질의 아미노산 서열이 서열번호 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31 또는 33과 같은 것을 특징으로 한다. PRAS40 융합단백질 제조에서 제한부위 서열의 선택 등에 따라 다양한 서열의 융합단백질을 얻을 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 보통의 지식을 가진 사람에게 자명하다. 위 아미노산 서열은 예시적인 것일 뿐 PRAS40 융합단백질 아미노산 서열이 위에 나열된 서열로 한정되는 것이 아님은 자명하다.
또한, 본 발명은 PRAS40 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 상기 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합되어 상기 PRAS40 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드의 염기 서열이 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32와 같은 것을 특징으로 한다. PRAS40 융합단백질 제조를 위한 폴리뉴클레오타이드는 제한부위 서열의 선택 등에 따라 다양한 서열의 폴리뉴클레오타이드를 얻을 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 보통의 지식을 가진 사람에게 자명하다. 위 폴리뉴클레오타이드 서열은 예시적인 것일 뿐 PRAS40 융합단백질 폴리뉴클레오타이드 서열이 위에 나열된 서열로 한정되는 것이 아님은 자명하다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 발현시키기 위하여 PRAS40 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합되어 PRAS40 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 PRAS40 융합단백질 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PRAS40 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 뇌허혈을 포함하는 뇌신경질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PRAS40 융합단백질을 유효성분으로 하며, 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 뇌허혈을 포함하는 뇌신경질환의 예방 및 개선 효과가 있는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 9~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 포함하는 단백질 수송 도메인이 PRAS40 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포도입성(cell-transducing) PRAS40 융합단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다.
예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
또한, 본 발명은 PRAS40 cDNA에 단백질 수송도메인 펩타이드 코딩 DNA 서열이 결합되어 상기 세포도입성 융합단백질을 코딩하는 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32번을 비롯한 재조합 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명의 범위는 서열번호 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 또는 32번의 재조합 폴리뉴클레오타이드뿐만 아니라 유전암호의 codon degeneracy에 의한 서열을 갖는 핵산분자들에도 미친다.
본 발명의 PRAS40 융합단백질은 인 비보 및 인 비트로에서 신경세포에 원활히 도입되었다.
또한, 본 발명의 PRAS40 융합단백질은 산화 스트레스에 의한 세포사멸로부터 신경세포를 보호하였다.
또한, 본 발명의 PRAS40 융합단백질은 동물 파킨슨병 모델에서 산화 스트레스로 인한 파킨슨병 발병을 억제하였다.
따라서, 본 발명의 PRAS40 융합단백질은 산화 스트레스로 인한 세포사멸과 밀접한 관련이 있는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 뇌허혈 등의 뇌신경질환 예방 및 치료에 유용하다.
도 1은 PRAS40 및 Tat-PRAS40 융합단백질 정제를 나타낸다. (A) Tat-PRAS40 융합단백질 및 PRAS40 서열 모식도이다. (B) 정제된 PRAS40 및 Tat-PRAS40 융합단백질을 10% SDS-PAGE로 확인하였다. (C) PRAS40 및 Tat-PRAS40 융합단백질을 항-토끼 폴리히스티딘 항체로 웨스턴 블랏분석하여 확인하였다. M: 마커 (EBM-1035, Elpisbiotech, Korea); 레인 1, 정제된 Tat-PRAS40 융합단백질; 레인 2, PRAS40.
도 2는 Tat-PRAS40 융합단백질이 SH-SY5Y 세포로 효과적으로 도입됨을 나타낸다. (A) Tat-PRAS40 융합단백질을 농도 (0.1~5 μM)를 달리 하여 한 시간 동안 처리하여 투여량 의존적으로 도입됨을 확인하였다. (B) 3 μM의 Tat-PRAS40 융합단백질 처리 시간 (10~120분)을 달리 하여 시간 의존적으로 도입됨을 확인하였다. (C) 3 μM의 Tat-PRAS40 융합단백질을 한 시간 처리하여 SH-SY5Y 세포에 도입된 융합단백질의 안정성을 48시간 동안 웨스턴 블랏 분석으로 측정하였다. (D) 한 시간 동안 각 단백질을 3 μM 농도로 처리하고 토끼 항-히스티딘 1차 항체 및 Alexa488 결합된 항-토끼 2차 항체로 시각화한 다음 공촛점 형광현미경으로 관찰하였다.
C: 무처리 대조군;
PRAS40: PRAS40 단백질로 처리한 세포;
Tat-PRAS40: Tat-PRAS40 융합단백질로 처리한 세포.
도 3은 인 비트로에서 Tat-PRAS40 융합단백질의 신경세포 보호기능을 나타낸다. (A) Tat-PRAS40 (0.5~3 μM), PRAS40 (3 μM) 및 Tat-GFP (3 μM)로 한 시간 동안 처리한 다음 MPP+ (5 mM)로 18시간 동안 처리하여 세포독성을 유도하여 MTT 평가법으로 무처리 대조군과 비교하여 세포 생존율을 백분율로 나타내었다. (B) SH-SY5Y 세포에서 Tat-PRAS40 융합단백질이 활성산소종 생성에 미치는 영향을 나타낸다. 각 단백질과 함께 배양한 세포를 MPP+로 처리한 다음 배양하였다. 세포를 형광 염료, DCF-DA로 염색한 후 형광현미경으로 관찰하였다. (C) 세포 내 활성산소종 수준을 ELISA 판독기로 측정하였다. 평균 형광강도는 세 번의 관찰에서 얻은 값이다. 별표는 MPP+ 처리군과 다른 군 간의 통계학적으로 유의한 차이를 나타낸다 (* P <0.01).
도 4는 SH-SY5Y 세포에서 Tat-PRAS40 융합단백질이 세포사멸을 억제함을 나타낸다. 세포를 Tat-PRAS40 융합단백질, PRAS40, Tat-GFP 및 스타우로스포린으로 한 시간 동안 미리 처리하고 MPP+ (5 mM)를 24시간 동안 처리하여 세포사멸을 유도하였다. (A) 절단된 캐스페이즈-3 수준, (B) Bax 및 Bcl-2 수준을 웨스턴 블랏 분석으로 나타내고 밀도계로 측정하였다. β-액틴 분석 결과를 내부 대조군 (internal control)으로 보여준다.
레인 1, 대조군; 레인 2, MPP+; 레인 3, MPP+ 및 Tat-PRAS40 융합단백질 (0.5 μM); 레인 4, MPP+ 및 Tat-PRAS40 융합단백질 (1 μM); 레인 5, MPP+ 및 Tat-PRAS40 융합단백질 (3 μM); 레인 6, MPP+ 및 PRAS40 (3 μM); 레인 7, MPP+ 및 Tat-GFP (3 μM); 레인 8, 스타우로스포린 (1 μM).
도 5는 Tat-PRAS40 융합단백질이 SH-SY5Y 세포사멸의 DNA 단편화를 보호함을 나타낸다. (A) DNA 단편화를 TUNEL 평가법으로 탐지하였다. (B) 각각의 형광강도를 밀도계로 측정하였고, 상대적인 형광강도를 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군 투여량은 다음과 같다: Tat-PRAS40 융합단백질, 0.5~3 μM; PRAS40, 3 μM. 별표는 MPP+ 처리군과 다른 군 간의 통계학적으로 유의한 차이를 나타낸다 (* P <0.01).
도 6은 Tat-PRAS40 융합단백질을 복강주사 방법으로 마우스 뇌에 전달할 수 있음을 나타낸다. Tat-PRAS40 융합단백질 및 PRAS40 2 mg/kg씩을 복강주사하였다. 뇌 조직을 토끼 항-히스티딘 항체 (1:400)로 면역염색한 후 바이오틴 결합된 염소 항-래빗 2차 항체 (1:200)로 염색하였다. 절편은 DAB로 시각화하여 현미경으로 관찰하였다.
도 7은 세포도입된 Tat-PRAS40 융합단백질이 파킨슨병 마우스 모델에서 신경보호효과를 나타냄을 보여준다. Tat-PRAS40 융합단백질 및 PRAS40 2 mg/kg씩 복강주사하였다. 그 후 MPTP (20 mg/kg)를 4회 복강주사하고 7일 후 마우스를 희생시켰다. 흑색질에서 MPP+로 세포독성을 유도한 후 (A)는 크레실 바이올렛 염색결과이고, (B)는 이중염색 (크레실 바이올렛 및 TH 면역조직화학 염색) 결과이다. (C) 흑색질에서 TH 양성 세포 수를 정량하였다. 별표는 MPP+ 처리군과 다른 군 간의 통계학적으로 유의한 차이를 나타낸다 (* P <0.01).
이하, 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 각 실험예의 결과로서 구체적인 실시예에서 제조한 여러 가지 융합단백질 중 Tat-PRAS40 융합단백질을 시료로 한 데이터를 기재하였으나, 그 외의 융합단백질들 또한 Tat-PRAS40 융합단백질을 시료로 한 결과와 유사한 정도(71~105%)의 결과를 나타내었음을 밝힌다.
재료
제한 엔도뉴클레이즈 (Restriction endonuclease) 및 T4 DNA 연결효소는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하였다. 플라스미드 pET-15b 및 Escherichia coli strain BL21 (DE3)는 Novagen (Hilden, Germany)에서 구입하였다. 올리고뉴클레오타이드는 Bioneer (Dajeon, Korea)에서 합성하였다. Ni2+-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우 컬럼은 Qiagen (Valencia, CA, USA)에서 입수하였다. 우태혈청과 항생제는 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 다른 화학약품은 특별한 언급이 없으면 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입한 것이고 입수 가능한 최상의 분석등급 제품을 사용하였다.
PRAS40 융합단백질 발현과 정제
PRAS40 및 Tat-PRAS40 융합단백질 발현 벡터를 구축하였다: 센스 프라이머 서열은 5'-CTCGAGCGCAGCCCC-3' (서열번호 6)이고 XhoI 제한부위를 포함하며, 안티센스 프라이머 서열은 5'-GGATCCTCAATATTTCCGCTTCAG-3' (서열번호 7)이고 BamHI 제한부위를 포함한다. PRAS40 프라이머들과 cDNA 주형을 이용하여 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 수행하였으며, PCR 산물은 TA 클로닝 벡터에 삽입되었다. PRAS40 cDNA를 포함하는 TA 벡터는 XhoI 및 BamHI으로 절단하여 절단된 PRAS40 cDNA와 함께 두 종류의 pET-15b 벡터에 연결시켰다. 한 벡터는 Tat-PRAS40 발현 벡터로서 Tat 서열과 6개의 연속 히스티딘 서열을 포함한다. 다른 벡터는 PRAS40 발현 벡터로서 여섯 개의 연속 히스티딘 서열만을 포함한다.
PRAS40과 Tat-PRAS40 융합단백질을 생산하기 위하여 각 벡터 구축물로 E. coli BL21 (DE3) 세포를 형질전환시켰다. 형질전환된 세균은 100 ㎖의 LB 배지에서 37 ℃로 600 ㎚의 광학밀도가 0.5가 될 때까지 배양한 다음 0.5 mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 가하여 37 ℃에서 4시간 동안 유도하였다. 세포를 모으고 결합완충액 (10 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) 내에서 4℃ 조건으로 초음파분해하여 용균시키고 원심분리하였다. 상층액을 2.0 ㎖ Ni2+-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우 컬럼에 가하였다. 컬럼을 10배의 결합완충액 및 7배의 세척완충액 (60 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척하였다. PRAS40과 Tat-PRAS40 융합단백질은 용출완충액 (280 mM 이미다졸, 0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9)으로 용출시켰다. 정제된 단백질에 포함된 염은 PD-10 탈염 컬럼 (Amersham, Braunschweig, Germany)으로 제거하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 우혈청 알부민을 표준물질로 이용하여 결정하였다.
세포 배양 및 PRAS40 융합단백질 도입
SH-SY5Y 인간 신경아세포종 (neuroblastoma) 세포주는 10% 우태혈청 (FBS) 및 항생제 (100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 U/ml 페니실린)를 포함하는 EMEM (Eagle's Minimum Essential Medium) 배지에 37 ℃, 95% 공기 및 5% CO2의 습한 조건에서 보관하였다.
PRAS40과 PRAS40 융합단백질이 SH-SY5Y 세포에 투여량 의존적으로 도입되는지를 확인하기 위해 세포를 지름 60 ㎜ 접시에 충분히 자라도록 하였고, 한 시간 동안 다양한 농도 (0.1~5 μM)의 PRAS40 융합단백질과 함께 배양하였다.
각 단백질이 시간 의존적으로 세포도입되는지를 알아보기 위해 세포를 다양한 시간 (10~120분)동안 PRAS40 융합단백질 (3 μM)로 처리하였다.
세포는 하비스트하여 세포 추출물을 제조한 후 웨스턴블랏 분석하였다. 또, SH-SY5Y 세포에 신경독성을 유도하기 위해 세포를 MPP+ (1-methyl-4-phenylpyridinium )(5 mM)로 처리하였다.
웨스턴블랏 분석
각 세포 용균액으로부터 얻은 β-액틴 표준화된 동량의 단백질을 10% SDS-PAGE로 분석하였다. 분석된 단백질은 5% 탈지유를 포함하는 TBS-T 완충액 (25 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)으로 블로킹시킨 나이트로셀룰로스 막으로 전기이동시켰다. 막은 항-히스티딘 다클론항체 또는 다양한 항체 (1:10,000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 탐침한 다음, 호스래디쉬 퍼옥시데이즈-결합된 염소 항-토끼 면역글로블린 (1:10,000; Sigma-Aldrich)으로 탐지하였다. 결합된 항체 복합체는 제조자의 지시 (Immobilon Western Chemiluminescent AP Substrate; Millipore, Billerica, MA, USA)대로 강화 화학발광제로 시각화하였다. 띠의 강도는 밀도계로 측정하였고 이미지 J 소프트웨어 (NIH, Bethesda, MD, USA)로 분석하였다.
공촛점 형광현미경
SH-SY5Y 세포를 유리 커버슬립에 올려놓고 PRAS40 및 Tat-PRAS40 융합단백질 (3 μM)과 함께 37 ℃에서 한 시간 동안 배양하였다. PBS로 두 번 세척한 다음 세포를 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 10분간 고정시켰다. 항-히스티딘 1차 항체를 1:2,000으로 희석하고 각 시료와 함께 실온에서 한 시간 동안 배양하였다. Alexa fluor 488이 결합된 2차 항체 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 1:15,000으로 희석한 다음 암조건으로 실온에서 45분간 배양하였다. 핵은 1 ㎍/㎖의 4'6-다이아미디노-2-페닐인돌 (4'6-diamidino-2-phenylindole : Roche Applied Science, Basel, Switzerland)로 30분간 염색하였다. 형광은 Olympus FV-300 공촛점 형광 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)으로 분석하였다.
생존율 평가
An established assay [34] based on MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheyltetrazolium bromide}를 기반으로 한 확립된 평가방법을 이용하여 6웰 플레이트에 시드되어 70% 배양된 SH-SY5Y 세포의 생존율을 평가하였다. 세포는 다양한 농도의 각 단백질로 한 시간 동안 처리하였다. DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline)로 세척한 다음 세포를 MPP+ (5 mM)에 18시간 동안 노출하였다. 세포 생존율은 MPP+ 를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 백분율로 나타내었다.
산화스트레스 측정
세포내 활성산소종 수준은 활성산소종에 민감한 염료 DCF-DA (2'7'-dichlorofluorescein diacetate)로 측정하였다. 이 염료는 활성산소종에 의해 산화되어 형광을 내는 DCF (2'7'-dichlorofluorescein)이 된다 [Takanashi, T. et al. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 38:2721-2728; 1997]. SH-SY5Y 세포는 Tat-PRAS40 융합단백질 (0.5~3 μM)와 함께 한 시간 동안 배양한 다음 MPP+ (5 mM)로 한 시간 동안 처리하였다. 세포를 DPBS로 두 번 세척한 다음 DCF-DA를 최종 농도 20 μM이 되도록 가하여 한 시간 동안 처리하였고, DPBS로 두 번 세척하여 제거하였다. 각 시료에서 DCF 형광의 수준은 485 nm (여기) 및 538 nm (방출)에서 ELISA 플레이트 판독기 (Labsystems Oy, Helsinki, Finland)로 모니터하였다.
TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling) 평가방법
SH-SY5Y 세포를 유리 커버슬립에 올려놓고 형광 단백질 (0.5~3 μM)과 함께 37 ℃에서 한 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 세포를 DPBS로 두 번 세척하고 MPP+ (5 mM)로 네 시간 동안 처리하였다. TUNEL 염색은 세포 사멸 탐지 키트 (Roche Applied Science, Basel, Switzerland)로 수행하였다. Eclipse 80i fluorescence microscope (Nikon, Tokyo, Japan)을 이용하여 형광현미경 사진을 촬영하였다.
동물모델연구
8주령 수컷 C57BL/6 마우스를 한림대학교 실험동물센터에서 구입하였다. 동물은 일정 온도 (23 ℃)와 일정한 상대습도 (60%) 조건에서 명암을 12시간씩 주며 사육하였다. 음식과 물은 자유롭게 접근 가능한 조건이었다. 동물 및 동물 사육을 포함한 모든 실험 절차는 한국의 국립수의과학검역원의 실험동물사용과 주의지침서에 따랐고 한림대학교 의과대학 실험동물운영위원회에 의해 승인되었다.
마우스 조직으로 PRAS40 융합단백질과 PRAS40의 인 비보 세포도입을 시험하기 위해 각 단백질을 1회 2 mg/kg 양으로 복강주사하였다. 뇌 조직을 제거한 다음 토끼 항-히스티딘 다클론 항체 (1:400) 및 바이오틴 결합된 염소 항-토끼 2차 항체 (1:200)로 면역염색하였다. 또한, PRAS40 융합단백질이 파킨슨병을 막는지를 확인하기 위해 PRAS40 융합단백질을 마우스 체중에 대해 1회 2 mg/kg로 복강주사하였다. 다음 날 신경독성물질 (MPTP; 20 mg/kg)을 두 시간 간격으로 네 번 복강주사하였다. 마우스는 7일 뒤 희생되었다.
흑색질에서 타이로신 하이드록실레이즈 발현을 위한 조직 처리와 면역조직화학
조직 처리와 면역염색을 수행하였다 [Kim, D. S. et al. J. Comp. Neurol. 511:581-598; 2008, Kim, J. E. et al. Epilepsia 50:654-663; 2009, Shin, J. et al. J. Neurosci. 29:15375-15385; 2009]. 간단히 설명하면, 동물에 펜토바비탈 (100 mg/kg 체중)을 복강주사하여 마취시키고 4% 파라포름알데하이드로 심장을 관통하여 (transcardially) 고정하였다. 뇌를 제거한 후 같은 고정제로 네 시간 동안 후고정하였고, 크리오스타트로 30 ㎛ 두께로 동결 및 절단하였다. 절편들을 3% 우혈청 알부민이 포함된 PBS로 30분간 실온으로 블로킹한 다음 토끼 항-TH IgG 일차 항체 (1:500, Santa Cruz Biotechnology) 및 0.3% Triton X-100를 포함하는 PBS와 함께 실온에서 배양하였다. PBS로 10분씩 세 번 세척한 다음 절편을 바이오틴 결합된 항-토끼 IgG (Vector, Burlingame, CA, USA)와 함께 배양하였다. 니슬소체 (Nissl bodies)에 대한 크레실 바이올렛 역염색을 수행하였다. 그 후 절편을 DAB (3,3'-diaminobenzidine)이 포함된 0.1 M 트리스 완충액으로 시각화한 다음 젤라틴 코팅된 슬라이드에 올려놓았다. Olympus DP72 디지탈 카메라 및 DP2-BSW 현미경 디지탈 카메라 소프트웨어로 영상을 캡쳐하고 분석하였다. 도면은 Adobe Photoshop 7.0 (San Jose, CA, USA)로 제작하였다. 영상 조작은 전체 영상에 대해 밝기를 조절하였다.
통계 분석
데이타는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 각 군 간의 비교는 Student's t test에 의해 수행되었다. P < 0.01 값은 통계적으로 유의함을 나타낸다.
결과 1: PRAS40 융합단백질 발현과 정제
PRAS40 및 PRAS40 융합단백질 발현 벡터를 위 기재와 같이 제조하였다. 도 1A와 같이, Tat-PRAS40 융합단백질은 N-말단에 6개의 연속되는 히스티딘과 Tat 도메인 서열이 연속되며, PRAS40는 6개의 연속되는 히스티딘 서열만을 포함한다. PRAS40 및 PRAS40 융합단백질 모두 과발현되었고, SDS-PAGE와 웨스턴블랏 분석으로 확인하였다 (도 1B 및 1C). 정제된 PRAS40 및 PRAS40 융합단백질의 분자량은 각각 약 40 및 43kDa이었다.
결과 2: PRAS40 융합단백질은 SH-SY5Y 세포에 효과적으로 도입되었다.
PRAS40 융합단백질이 SH-SY5Y 세포에 효과적으로 전달되는지를 확인하기 위하여 도입되는 PRAS40 융합단백질의 양을 측정하여 PRAS40 단백질의 도입량과 비교하였다 (도 2A 및 2B). PRAS40 융합단백질은 시간 및 투여량 의존적으로 세포 내 도입되었다. 반면, PRAS40 단백질은 세포 내로 도입되지 않았다. 세포 내에서 PRAS40 융합단백질의 안정성을 평가하는 시험에서 PRAS40 융합단백질은 3 μM로 한 시간 동안 처리한 결과 36시간 가까이 세포 내에서 안정적인 것으로 나타났다 (도 2C). SH-SY5Y 세포 내에서 PRAS40 융합단백질의 분포를 알아보기 위해 공촛점 형광현미경을 이용하였다. PRAS40 융합단백질은 분명히 세포질 내에 존재하였다 (도 2D). 이러한 결과는 PRAS40이 단백질 수송 도메인과 융합함으로써 SH-SY5Y 세포 내로 전달될 수 있고 세포 내에서 비교적 긴 시간 동안 유지될 수 있음을 말해준다.
결과 3: 세포도입된 PRAS40 융합단백질은 산화 스트레스에서 SH-SY5Y 세포를 보호한다.
MPP+는 도파민 뉴런 세포 사멸을 유도하는 약제로 널리 알려져 있다 [Miller, R. L. et al. Neurochem. Res. 34:55-65; 2009]. PRAS40 융합단백질이 산화 스트레스 유도된 독성으로부터 신경 세포를 보호할 수 있는지를 확인하기 위해 SH-SY5Y 세포를 PRAS40 융합단백질 (0.5~3 μM) 및 PRAS40 단백질 (3 μM)로 한 시간 동안 처리한 다음 MPP+에 18시간 동안 노출시켜 세포독성을 유도하였다.
도 3A와 같이, MPP+는 대조군의 약 50%로 세포 생존율을 감소시켰다. 음성 대조군으로 PRAS40 및 Tat-녹색형광단백질 (Tat-GFP)로 처리한 군은 산화 스트레스로부터 신경세포를 보호하지 못했다. 반면, PRAS40 융합단백질은 SH-SY5Y 세포 생존율을 투여량 의존적으로 현저히 증대시켰다 (MPP+ 단독 처리와 비교하여 P < 0.01). 또한, DCF-DA 염색은 PRAS40 융합단백질 처리가 MPP+ 처리에 의한 활성산소종 생성을 투여량 의존적으로 감소시킴을 보여준다 (도 3B 및 3C). PRAS40 융합단백질은 모든 농도에서 활성산소종 생성을 현저히 억제하였다. 특히 PRAS40 융합단백질 (3 μM) 처리한 세포의 형광 강도는 무처리 대조군과 거의 유사하였다. 반면, MPP+를 단독 처리한 세포와 MPP+ 및 PRAS40을 함께 처리한 세포에서 생성되는 활성산소종의 양은 차이가 없었다. PRAS40은 활성산소종 생성 저해능이 없는 것으로 나타났다. 세포생존시험에 따르면, 세포내 활성산소종 수준 측정에서 일관된 결과가 나타났다. 따라서, 이러한 결과는 PRAS40 융합단백질이 그 자체의 세포막 투과능에 힘입어 SH-SY5Y 세포로 전달되어 MPP+ 처리에 의하여 유발된 활성산소종 생성을 현저히 억제함을 말한다.
결과 4: MPP + -유도된 세포사멸 일련반응 활성화 및 DNA 단편화는 PRAS40 융합단백질에 의해 저해된다.
MPP+는 전자전달사슬 복합체를 저해하고 세포사멸 일련반응을 유발하여 세포 사멸을 일으킨다 [Eberhardt, O.; Schulz, J. B. Toxicol. Lett. 139:135-151; 2003]. 따라서, 세포사멸에서 PRAS40 융합단백질의 역할을 시험하기 위해 MPP+로 세포사멸을 유발한 다음 세포사멸 일련반응에서 몇 가지 마커의 수준을 측정하였다. 도 4A 및 4B와 같이, PRAS40 융합단백질은 절단된 캐스페이즈-3 (caspase-3) 및 Bax와 같은 친세포사멸 단백질의 수준을 투여량 의존적으로 감소시켰고, 역으로 Bcl-2와 같은 항세포사멸 단백질 (anti-apoptotic protein)의 수준은 증가시켰다. 그러나, PRAS40 또는 Tat-GFP를 처리한 경우는 MPP+로 처리한 세포에서 친세포사멸 및 친생존 (pro-survival) 단백질 간의 균형이 세포사멸 유도제인 스타우로스포린 (staurosporine)을 처리한 경우와 유사하였다. 또한, DNA 단편화가 세포사멸의 특징으로 널리 알려져 있기 때문에 각 시료에서 DNA 단편화를 조사하여 TUNEL 평가방법을 이용하여 정량하였으며, 이를 무처리 대조군과 비교하였다. 세포사멸 세포는 녹색 형광을 나타내었다. 대부분의 세포사멸 핵은 주로 MPP+ 또는 MPP+ + PRAS40에 노출된 시료에서 관찰되었고, 반면 PRAS40 융합단백질 처리한 시료에서는 세포사멸된 세포의 수가 투여량 의존적으로 감소하였다 (도 5A 및 5B). 특히, PRAS40 융합단백질을 처리한 SH-SY5Y 세포는 무처리 대조군과 비슷한 정도로 세포를 사멸로부터 보호하였다. 이러한 결과는 PRAS40 융합단백질이 MPP+에 의해 자극된 세포사멸을 억제하여 SH-SY5Y 세포의 생존을 증대시킬 수 있음을 의미한다.
결과 5: PRAS40 융합단백질은 복강주사로 마우스 뇌에 전달된다.
PRAS40 융합단백질의 인 비트로 세포도입 효과를 조사하기 위해 PRAS40 융합단백질 및 PRAS40을 복강주사로 마우스에 투여하였고, 뇌 조직으로의 도입을 항-히스티딘 항체로 면역조직화학 분석하여 비교하였다. 무처리 대조군과 비교할 때 PRAS40 융합단백질은 마우스 뇌 흑색질에서 선명하게 관찰된 반면, PRAS40은 뇌 조직에 전달되지 않았다 (도 6). 이러한 결과는 PRAS40 융합단백질이 인 비트로뿐만 아니라 인 비보에서도 효과적으로 도입될 수 있음을 제시한다.
결과 5: 도입된 PRAS40 융합단백질은 파킨슨병 모델에서 신경보호활성을 나타낸다.
다음으로 본 발명자들은 PRAS40 융합단백질이 MPTP/MPP+로 인한 산화적 손상 후 인 비보에서 파킨슨병 발병을 보호할 수 있는지를 마우스 파킨슨병 모델에서 조사하였다. 크레실 바이올렛 염색 데이타 (도 7A)는 흑색질에서 MPTP 처리가 세포사멸을 현저히 증가시킴을 보여준다. PRAS40 처리는 MPTP로 유도된 세포 사멸에 아무런 영향을 미치지 않았다. 그러나, PRAS40 융합단백질로 미리 처리한 마우스의 흑질에서는 대조군과 비교하여 세포가 사멸로부터 보호되는 현상이 관찰되었다. 또한, 도파민 뉴런 손실이 파킨슨병의 분명한 증거이므로 사멸 뉴런의 종류를 확인할 필요가 있다. 그리하여 본 발명자들은 도파민 뉴런 특이적 항-TH 항체를 이용한 면역조직화학 및 크레실 바이올렛 염색으로 이중염색을 수행하였다. 도파민 뉴런을 의미하는 TH-양성 세포는 무처리 대조군 및 MPTP + PRAS40 융합단백질 처리군에서 탐지되었다 (도 7B). 반면, MPTP + PRAS40 군은 MPTP 단독처리군과 마찬가지로 TH 면역반응 세포가 거의 없었다 (도 7C). 대조군과 비교할 때 MPTP 처리군에서 흑색질의 TH-양성 세포수는 현저히 감소하였다. 그러나, PRAS40 융합단백질 처리군은 MPTP에 의해 유발된 도파민 뉴런 사멸에 대해 세포 보호효과를 나타내었다. 종합하여 보면 이러한 결과들은 PRAS40 융합단백질이 MPTP 또는 MPP+와 같은 산화 스트레스에 의해 유도된 세포사멸로부터 흑색질의 도파민 뉴런 세포를 현저히 보호함을 말해준다.
<제형예 1: 정제의 제조>
PRAS40 융합단백질 10 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<제형예 2: 캡슐제의 제조>
PRAS40 융합단백질 5 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<제형예 3: 주사제의 제조>
PRAS40 융합단백질 1 ㎎
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
<제형예 4: 액제의 제조>
PRAS40 융합단백질 0.5 ㎎
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. HIV Tat 49-57 잔기 수송도메인이 PRAS40 (Proline-rich Akt substrate 40)의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 PRAS40 융합단백질.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 PRAS40 융합단백질은 그 아미노산 서열이 서열번호 11, 13 또는 15와 같은 것을 특징으로 하는 PRAS40 융합단백질.
  4. PRAS40 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 HIV Tat 49-57 잔기 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합되어 상기 제1항의 PRAS40 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 재조합 폴리뉴클레오타이드는 그 염기 서열이 서열번호 10, 12 또는 14와 같은 것을 특징으로 하는, PRAS40 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드.
  6. HIV Tat 49-57 잔기 수송도메인이 PRAS40 (Proline-rich Akt substrate 40)의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 PRAS40 융합단백질을 발현시키기 위하여 PRAS40 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합되어 PRAS40 융합단백질을 코딩하는 청구항 4 또는 청구항 5의 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 PRAS40 융합단백질 발현벡터.
  7. 제1항 또는 제3항의 PRAS40 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 파킨슨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 뇌허혈을 포함하는 뇌신경질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
  8. 삭제
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