KR20160042214A - Ｐｅａ15 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포투과성 PEA15 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 세포 내로 투과된 PEA15 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰고, 세포 내 활성산소종 수준 및 과산화수소로 유도되는 DNA 단편화를 감소시켰다. 동물모델에서는 전뇌 해마 CA1 부분에 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸에 대해 PEA15 융합단백질이 보호효과를 나타내었다. 이러한 결과들은 PEA15 융합단백질이 세포사멸에 대해 보호효과가 있으며, 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 치료효과가 있음을 말해준다.

Description

ＰＥＡ15 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물 {Pharmaceutical composition for treating ischemia containing PEA15 fusion protein}

본 발명은 세포투과성 PEA15 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 세포 내로 투과된 PEA15 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰고, 세포 내 활성산소종 수준 및 과산화수소로 유도되는 DNA 단편화를 감소시켰다. 동물모델에서는 전뇌 해마 CA1 부분에 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸에 대해 PEA15 융합단백질이 보호효과를 나타내었다. 이러한 결과들은 PEA15 융합단백질이 세포사멸에 대해 보호효과가 있으며, 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 치료효과가 있음을 말해준다.

산소의 신진 대사의 자연 부산물 중 하나는 활성산소종(Reactive Oxygen Species; ROS)이다. 활성산소종은 심혈관 질환, 허혈 손상 면역, 염증 반응을 포함한 다양한 세포활성의 증가에 중요한 역할을 담당한다[1-3]. 활성산소종 증가는 허혈/재관류 신경 세포의 사멸과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 활성산소종 생성 조절은 뇌허혈 손상에 대해 보호 기능을 한다[4-5].

뇌허혈은 뇌 저산소증, 뇌 조직 사멸, 뇌경색, 허혈성 뇌졸중 등을 일으킨다. 뇌허혈의 주요 증상은 시각, 신체의 움직임 저하 및 말하기 손상 등이 있다.

PEA15(phosphoprotein enriched in astrocytes 15)(15KDa)는 신경세포에서 많이 발현되는 단백질이다. PEA15는 ERK1/2 (extra-cellular signal receptors, activated kinases) 및 RSK2 (ribosomal S6 kinase2)와의 상호작용을 통하여 다양한 세포 기능을 조절한다[6-10].

단백질 전달 기술은 포유류 세포 내로 단백질을 효과적으로 전달할 수 있는 유용한 방법이다. CPP(Cell penetrating Peptide)라고도 불리는 PTD(Protein Transduction Domain)는 세포 안으로 단백질을 손쉽게 전달할 수 있는 새로운 개념의 전달 시스템이다. PTD는 일반적으로 인 비트로 및 인 비보에서 치료 단백질을 전달하기 위해 사용된다[11-13]. PEP-1 펩타이드(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV)는 가장 일반적으로 사용된 PTD이다.

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본 발명은 허혈손상 및 허혈손상에 의한 신경세포 손상과 사멸을 치료하기 위한 효과적인 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 PEA15 융합단백질이 인 비트로에서 산화 스트레스에 의해 유도된 신경세포 사멸과 인 비보 허혈동물모델에서 보호효과가 있는지를 밝히고자 하였다. 허혈성 신경세포 사멸에 대해 PEA15 융합단백질의 잠재적인 효과를 연구하기 위해 본 발명자들은 세포 내로 투과할 수 있는 PEP-1-PEA15 융합단백질을 제작하였다. PEP-1-PEA15 융합단백질은 신경세포 내부로 농도 의존적 및 시간 의존적으로 효과적으로 투과하였다. 세포 내로 투과된 PEP-1-PEA15 융합단백질은 과산화수소 독성에 대한 세포 생존율을 증가시켰고, 세포 내 활성산소종 수준을 낮추었다. 그리고, 세포 내로 투과된 PEP-1-PEA15 융합단백질은 과산화수소에 의해 유도된 DNA 단편화 현상도 저하시켰다. 동물모델에서 PEP-1-PEA15 융합단백질은 전뇌의 해마 CA1 부분에서 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸로부터 세포를 보호하였다. 이러한 결과들은 PEP-1-PEA15 융합단백질이 인 비트로와 인 비보에서 일어나는 세포사멸에 대해 보호효과를 나타내며, 산화 스트레스와 관련된 허혈손상에 대해 치료제로 이용될 수 있음을 말해준다.

본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명하면, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 먼저 PEA15 융합단백질을 과대 발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 PEA15 발현 벡터를 개발하였다. 이 발현 벡터는 인간 PEA15 단백질, PEP-1 단백질 수송 도메인, 그리고 아미노산 말단부분에 6개의 히스티딘 잔기를 발현시킬 수 있는 cDNA를 포함하고 있다.

이 발현벡터를 이용하여 PEA15 융합단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며 Ni-친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 배양된 세포에 PEA15 융합단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 세포 내로 투과된 PEA15 융합단백질은 세포 내에서 최대 36시간 지속적으로 유지되었으며, 산화 스트레스에 의한 세포사멸을 억제하였다.

이러한 결과는 PEA15 융합단백질이 세포 내로 투과가 잘 일어나고, 세포 내에서 PEA15 단백질의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 PEA15 융합단백질은 활성산소종과 관련된 증세 또는 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 등의 뇌신경질환에 응용할 수 있는 가능성을 제시해 준다.

세포 투과성 PEA15 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태 등으로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를 들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제 (예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제 (예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)을 함유하고, 정제는 또한 결합제 (예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제 (예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제 (예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한 이들은 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내 , 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 천식에 적용하는 경우에는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 널리 알려진 바와 같이 흡입 방식이나 스프레이 방식의 제제로 제형화할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

나아가, 본 발명은 상기 PEA15 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 뇌허혈 예방과 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 PEA15 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 PEA15 단백질 분자의 세포 내 전달은 PEP-1 펩타이드를 비롯한 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 수송도메인의 일례로는 PEP-1 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 PEP-1 펩타이드로만 한정되는 것은 아니고, PEP-1의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 PEP-1 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 7~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 다수 포함하는 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.

구체적으로, 본 발명은 PEA15 융합단백질, 이 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료, 예방 목적의 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"PEA15 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 PEA15 단백질을 포함하며, 수송 도메인과 목표 단백질 (즉, 본 발명에서는 PEA15 단백질을 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 "PEP-1-PEA15", "PEP-1-PEA15 융합단백질" 등과 혼용하였다.

"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 본래 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 PEA15 단백질을 의미한다.

"융합단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 포함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.

또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.

또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.

본 발명에서의 "단백질 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.

또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"시키는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.

본 발명의 PEA15 융합단백질은 9 내지 15개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 PEA15의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 PEA15 융합단백질을 말한다. 또한, 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, PEP-1 펩타이드, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고 (라이신,아르기닌) 중의 1종 이상을 말한다.

또한, 본 발명의 상기 PEA15 융합단백질 아미노산 서열은 서열번호 4를 포함한다. PEA15 융합단백질 제조에서 제한부위 서열의 선택 등에 따라 다양한 서열의 융합단백질을 얻을 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 보통의 지식을 가진 사람에게 자명하다. 위 아미노산 서열은 예시적인 것일 뿐 PEA15 융합단백질 아미노산 서열이 위의 서열로 한정되는 것이 아님은 자명하다.

또한, 본 발명은 상기 PEA15 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 뇌허혈의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 PEA15 융합단백질을 유효성분으로 하며, 뇌허혈의 예방 및 개선 효과가 있는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 9~15개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 포함하는 단백질 수송 도메인이 PEA15 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포도입성 (cell-transducing) PEA15 융합단백질에 관한 것이다. 또한, silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다.

예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

본 발명에서 세포 내로 투과된 PEA15 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰고, 세포 내 활성산소종 수준 및 과산화수소로 유도되는 DNA 단편화를 감소시켰으며, 동물모델에서는 전뇌 해마 CA1 부분에 일시적 허혈을 유도했을 때 일어나는 신경세포사멸에 대해 PEA15 융합단백질이 보호효과를 나타내었다. 이러한 결과들은 PEA15 융합단백질이 세포사멸에 대해 보호효과가 있으며, 뇌허혈 손상으로부터 신경세포를 보호하는 치료효과가 있음을 말해주며, 세포 투과성 PEA15 융합단백질이 뇌허혈 예방 및 치료용 약학 조성물로 유용함을 말해준다.

도 1은 PEP-1-PEA15 융합 단백질의 발현 및 정제.(A) PEA15 단백질과 PEP-1-PEA15 융합단백질의 정제를 나타낸다. (B) 정제된 PEA15 단백질(15Kda)과 PEP-1-PEA15 융합단백질(17Kda)은 15% SDS-PAGE를 이용하여, 그리고 (C) 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 레인 M : 단백질 사이즈 마커 (EBM-1035, Elpisbiotech, 한국); 레인 1 : 정제 PEA15 단백질; 레인 2 : 정제 PEP-1-PEA15 융합단백질.
도 2는 HT22 세포 및 C6 세포로의 PEP-1-PEA15 융합단백질의 투과. (A) HT22 세포에서 다양한 농도(0.5~3.0 μM)로 PEA15 단백질 및 PEP-1-PEA15 융합단백질을 50분 동안 처리하였다. (B) 또한, HT22 세포에서 3 μM 농도로 10~50분 동안 PEA15 단백질 및 PEP-1-PEA15 융합단백질을 처리하였다. (C,D) HT22 세포 및 C6 세포는 50분간 각 단백질(3 μM)에 노출시킨 후, 토끼 항 히스티딘 일차항체 및 알렉사 488 복합 항-토끼 이차항체를 이용하여 검출한 후 공초점 형광 현미경으로 가시화하였다. PEP-1-PEA15 융합단백질로 인한 HT22 세포 및 C6 세포의 안정성에 대하여 나타내었다. 스케일 바 = 20 ㎛. (E) HT22 세포와 C6 세포에 50분 동안 형질도입하여, PEP-1-PEA15 융합단백질의 세포 내 수준을 60시간 동안 웨스턴블랏 분석으로 분석하였다.
도 3은 세포 생존율에 미치는 PEP-1-PEA15 융합 단백질의 효과. (A) HT22 세포에 PEP-1-PEA15 융합단백질(1~3 μM) 및 PEA15 단백질을 50분 동안 전처리하고, 1 mM 과산화수소로 5시간 동안 처리하였다. 세포 생존률은 MTT 분석으로 측정하였다. (B) C6 세포에 PEP-1-PEA15 융합단백질과 PEA15 단백질(1~3 μM)을 50분 동안 전처리한 후 과산화수소(1 mM)를 5시간 동안 처리하였다. 이 결과들은 최소한 세 번의 독립적인 실험에서 얻어진 값이다. *P < 0.01, **P < 0.01은 과산화수소 처리 세포와 비교한 값이다.
도 4는 HT22 세포에서 PEP-1-PEA15 융합단백질의 활성산소종 생성 및 DNA 단편화에 미치는 영향. (A) HT22 세포에서 PEP-1 펩타이드, PEA15 단백질, PEP-1-PEA15 융합단백질을 50분 동안 전처리하고 1 mM 과산화수소를 10분 동안 처리하였다. 활성산소종 수준은 DCF-DA 염색으로 측정하고, 형광 강도는 ELISA 플레이트 리더로 측정하였다. 스케일 바 = 50㎛, ** P <0.01은 과산화수소 처리 HT22 세포와 비교한 값이다. 과산화수소의 DNA 손상에 의한 DNA 단편화에 PEP-1-PEA15 융합단백질이 미치는 영향은 HT22 세포에 PEP-1-PEA15 융합단백질, PEA15 단백질 및 PEP-1 펩타이드를 50분 동안 처리한 후 과산화수소(1 mM)를 6시간 동안 처리하여 알아보았다. DNA 단편화는 TUNEL 염색으로 측정하였다. (B) 그래프를 정량한 것이다. 스케일 바 = 50㎛, ** P <0.05은 과산화수소 처리 HT22 세포와 비교한 값이다.
도 5는 HT22 세포에서 산화 스트레스에 의한 친세포사멸 및 항세포사멸에 미치는 PEP-1-PEA15 융합단백질의 효과. (A 및 B) HT22 세포에서 과산화수소(1 mM)로 8분간(Akt), 30분간(ErK), 50분간(JNK) 유도하였고, PEP-1-PEA15 융합단백질 및 PEA15 단백질을 50분간 전처리하거나 전처리하지 않았다. (C 및 D) HT22세포는 1 mM 과산화수소로 3시간 자극한 후 PEP-1-PEA15 융합단백질 및 PEA15 단백질로 5시간 처리하였다. 케스페이즈-3, 케스페이즈-12 발현 수준은 웨스턴블랏 분석으로 측정하였고, 밴드 강도는 밀도계로 측정하였다.
도 6은 C6 세포에서 DCF-DA 및 TUNEL 분석으로 PEP-1-PEA15 융합단백질의 보호 효과를 측정한 결과이다. (A) 활성산소종 수준은 DCF-DA 염색으로 측정하고, 형광 강도는 ELISA 블랙 플레이트 리더로 측정하였다. 스케일 바 = 50㎛, ** P <0.05은 과산화수소 처리 C6 세포와 비교한 값이다. (B) DNA 단편화는 TUNEL 염색으로 노출시켰다. 스케일 바 = 50㎛, ** P <0.01은 과산화수소 처리 C6 세포와 비교한 값이다.
도 7은 C6 세포에서 과산화수소로 유도되는 세포사멸에 대한 PEP-1-PEA15 융합단백질의 세포보호 효과. (A) C6 세포에서 PEP-1-PEA15 융합단백질 (1~3 μM) 및 PEA15 단백질을 50분 동안 전처리하고, 과산화수소를(1 mM) 8분간(Akt), 35분간(ErK), 6시간 동안(케스페이즈-3 / 절단 케스페이즈-3)으로 각각 처리하였다. (B) C6 세포 추출물을 제조하고 Akt, ErK, 케스페이즈-3, 절단 케스페이즈-3은 웨스턴블랏 분석으로, 밴드 강도는 밀도계로 측정하였다. 막대 그래프는 최소한 세 번의 독립적인 실험에서 얻어진 값이다.
도 8은 허혈 동물모델에서의 CA1 영역 뉴런의 생존에 미치는 PEP-1-PEA15 융합단백질의 효과. (A) 마우스 뇌에 PEP-1-PEA15 융합단백질의 형질을 도입하여 항히스티딘 항체를 이용하여 면역조직화학방법으로 분석하였다. 마우스에 PEP-1-PEA15 융합단백질을 1회 복강주사하고, 6시간 후에 희생하였다. 스케일 바 = 50㎛. (B) 허혈성 손상 7일 후 마우스 뇌의 현미경 사진. 샴 수술군, 담체 처리군, PEP-1 펩타이드 처리군, PEA15 단백질 처리군, PEP-1-PEA15 융합단백질(2mg/kg) 처리군이 있고, 각 시료들은 2mg/kg의 양을 복강주사 하였다. 스케일 바 = 400, 50, 25㎛.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

재료

Ni^{2 +}-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우는 Qiagen에서 구매하였고, PD-10 컬럼 크로마토그래피(Amersham, Brauncschweig,Germany)를 구매하였다. 마우스 해마신경 세포인 HT22 세포와 마우스의 신경 교종 C6 세포는 한국세포주연구재단(KCLF)에서 제공받았다. 2',7'-DCF-DA(Dichlorofluorescein diacetate)와 Akt, MPAK, 케스페이즈-3(caspase-3), 케스페이즈-12(caspase-12), 액틴, Bax, Bcl-2의 일차 항체는 Cell signaling Technology(Beverly, MA, USA)와 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA )에서 구입하였다. PEA15 cDNA는 분리하여 중합효소 연쇄반응(PCR)에 이용하였다. 이외의 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.

PEP -1- PEA15 융합단백질 발현 및 정제

PEA15 단백질 및 PEP-1-PEA15 융합단백질의 발현 벡터를 구축하였다. 인간의 유전자 중의 하나인 PEA15를 cDNA와 함께 2개의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭시켰다. 센스 프라이머는 5'-CTCGAGGGCAACGCGCAG-3'으로 구성되어 있고, Xho1이라는 제한효소 작용부위가 5' 쪽에 존재한다. 그리고 안티센스 프라이머는 5'-GGATCCTCAGGAATCTTCGGACTC-3'으로 구성되어 있고, BamH1이라는 제한효소 작용부위가 5' 쪽에 존재한다. PCR을 통하여 얻은 결과물을 TA 벡터에 연결하고 Xho1과 BamH1을 이용하여 자른 후에 발현 벡터에 연결하여 PEP-1-PEA15 융합단백질을 제조하였다. 이와 마찬가지로 대조군인 PEA15는 PEP 펩타이드가 결여된 벡터를 이용하여 제조하였다. 재조합된 PEP-1-PEA15 플라스미드를 대장균인 BL21로 형질변환시킨 후 0.5mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)로 유도하여 18℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양한 세포를 초음파로 분쇄하여 PEP-1-PEA15 융합단백질을 얻기 위해 Ni^{2 +}-니트릴로삼초산 세파로즈 슈퍼플로우 컬럼을 이용하여 정제하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 우혈청 알부민을 표준물질로 이용하여 결정하였다.

PEP -1- PEA15 융합단백질의 HT22 세포 및 C6 세포로의 도입

마우스 해마 및 성상세포는 37℃, 95% 공기 및 5% CO₂의 조건을 유지해주며, 10% 우태혈청 (FBS) 및 5 mM NaHCO₃, 항생제 (100 mg/ml 스트렙토마이신, 100U/ml 페니실린), 20 mM HEPES/NaOH (pH 7.4)로 구성된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 이용하여 37 ℃, 95% 공기, 5% 이산화탄소의 습한 조건에서 배양하였다.

PEP-1-PEA15 융합단백질 및 대조군 PEA15의 세포 내 도입에 대한 시간 의존성 및 농도 의존성을 평가하였다. 세포는 60 ㎜ 접시에서, 시간(10~50분) 및 각 단백질의 투여량(0.5~3 μM)으로 처리하였다. 트립신-EDTA(Gibco)를 처리하고 PBS를 이용하여 세척한 다음 세포 내로 투과된 융합단백질을 브래드포드 방법으로 정량하고, 웨스턴블랏으로 분석하였다.

웨스턴블랏 분석

웨스턴블랏 분석을 위해, 세포 분쇄액 내의 단백질을 10%, 12% SDS 폴리아크릴아마이드 젤로 분리한 다음 젤에 있는 단백질을 나이트로셀룰로스 막 (nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이동시켰다. 막은 TBS-T 완충액 (25 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)으로 블로킹하였다[14]. 막은 제조업체에서 권장하는 일차항체를 사용하여 웨스턴블랏 분석하였다. 결합한 항체 복합체는 강화 화학발광제제로 제조자(Amersham, Franklin Lakes, NJ, USA)의 지시에 따라 탐지하였다.

공촛점 현미경 관찰

HT22 세포 및 C6 세포 내의 PEP-1-PEA15 융합단백질과 PEA15 단백질을 탐지하기 위해 세포를 유리 커버슬립 상에 시드하고 PEP-1-PEA15 융합단백질과 PEA15 단백질을 3 μM 농도로 60분 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 두 번 세척한 다음 실온에서 5분간 4% 파라포름알데하이드로 고정시켰다. HT22 세포 및 C6 세포는 실온에서 40분간 3% 우혈청 알부민과 0.1% Triton X-100이 함유된 PBS (PBS-BT)로 40분간 블로킹하고, PBS-BT로 세척하였다. 일차 항체 (His-probe, Santa Cruz Biotechnology)는 1:10000 비율로 희석하고, 이차 항체 (Alexa fluor 488, Invitrogen)는 1:15000 비율로 희석한 후 어두운 곳에서 실온으로 한 시간 동안 배양하였다. 세포핵은 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole 1 ㎎/ml; Roche, Mannheim, Germnay)로 3분간 염색하였다. 염색된 HT22 세포 및 C6 세포는 Fv-300 공촛점 형광현미경 (Olympus, Tokyo, Japan) 하에서 관찰하였다.

세포 생존율 분석

과산화수소로 처리한 HT22 세포 및 C6 세포의 생존율을 MTT {3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dipheyltetrazolium bromide}를 이용하여 비색분석법으로 확인하였다. 세포를 1 mM의 과산화수소에 5시간 동안 노출하여 세포사멸을 유도하였다. ELISA 마이크로플레이트 판독기 (Labsystems Multiskan MCC/340)로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 무처리 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.

세포 내 활성산소종 수준 측정

DCF-DA(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 이용하여 세포 내 활성산소종 수준을 측정하였다. DCF-DA는 활성산소종에 의해 세포 내에서 DCF로 전환되어 형광을 발한다. HT22 세포 및 C6 세포에 PEP-1-PEA15 융합단백질을 처리하였을 때와 처리하지 않았을 때의 활성산소종 수준을 비교해 보았다. PEP-1-PEA15 융합단백질은 한 시간 동안 처리하였고 후에 과산화수소를 1 mM의 농도로 15분 동안 처리해 주었다. 그리고 PBS로 두 번 씻어주고 DCF-DA를 20 μM의 농도로 30분 처리해 주었다. 형광 강도는 Fluoroskan ELISA plate reader (LabsystemsOy,Helsinki,Finland)를 이용하여 485㎚ 여기파장 (exitation), 538㎚ 방출파장 (emission)을 측정하였다.

TUNEL 분석

HT22 세포 및 C6 세포에 PEP-1-PEA15 융합단백질을 처리하지 않은 군과 3 μM의 농도로 1시간 동안 처리한 군의 배양액에 과산화수소 (1 mM)를 가하여 6시간 동안 처리하였다. 세포사멸을 측정하기 위해 TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotinylated dUTP nick end labeling staining) 기법은 세포사멸 탐지 킷트 (Roche Applied Science)를 사용하여 수행하였다. 형광현미경 (Nikon eclipse 80i, Japan)을 이용하여 결과를 분석하였다.

실험동물

한림대학교 실험동물센터에서 제공되는 저빌쥐 (Mongolian gerbils; Meriones unguiculatus)를 사용하였다. 23℃, 습도 60% 그리고 고정적으로 12시간의 빛과 음식물이 제공되는 곳에서 사육하였다. 실험동물 취급 및 관리는 최근의 국제법과 정책에 따라 수행하였고 [NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NIH Publication No. 85-23, 1985, revised 1996], 서울대 연구동물 관리 및 사용에 관한 위원회 (IACUC)에서 승인받았다 (SNU-100611-1). 모든 실험에서는 이용되는 동물 수와 본 발명에서 사용되는 공정에 의한 고통을 최소화하기 위해 노력하였다.

실험동물에서 전뇌 허혈 유도

실험동물에서 전뇌 허혈을 유도하였다. 온목동맥을 신경 섬유들로부터 격리시켜 폐색하고, 외상이 크게 남지 않게 하기 위해 동맥류 클립(aneurysm clips)을 이용하였다. 혈류를 폐색하였을 때, 검안경(ophthalmoscope)을 이용하여 혈압을 주의 깊게 관찰하였다. 그 후 5분 동안 폐색하고 동맥류 클립을 제거하였다[15,16]. 그리고 폐색에 대해 혈압이 회복되는 것을 검안경으로 확인하였다. 또한 샴 수술로 정상 경동맥을 폐색하지 않고, 외과적인 절차를 제외하고 얼마나 영향을 받는지 확인해 보았다. 허혈성 손상에 대한 PEP-1-PEA15 융합단백질의 보호효과를 실험하기 위해, 7일 후 허혈 재관류(ischemia-reperfusion)하고 샴 수술군, 담체 처리군, PEP-1-PEA15 융합단백질 처리군, PEA15 단백질 처리군 및 펩타이드 처리군으로 5개 그룹으로 나눠, 허혈-재관류 후 복강 내에 30분을 투여하여 실험을 수행했다.

샴 수술군, 담체 처리군, PEP-1-PEA15 융합단백질 처리군, PEA15 단백질 처리군 및 PEP-1 펩타이드 처리군 (2mg/kg)을 7일 후에 마취를 수행하고, 뇌 조직을 적출하고 PBS(pH 7.4)로 처리하고, 4% 포름알데하이드를 포함한 0.1M PBS(pH 7.4)로 처리하였다. 뇌 조직은 30% 자당으로 침윤하여 하룻밤 사이에 동결보존하였다. 뇌 조직은 냉동한 다음 50㎛ 두께로 절편화하고, 연속되는 절편은 PBS를 함유하는 6-웰 플레이트에 수집하였다.

결과 1: PEP -1- PEA15 융합단백질 발현과 정제

본 발명자들은 세포 침투성 PEP-1-PEA15 융합단백질 발현 벡터를 제조하였다. 이 벡터는 인간 PEA15를 인코딩할 수 있는 cDNA와 단백질 수송 도메인인 PEP 펩타이드 코딩 서열, 아미노 말단의 6개의 히스티딘 코딩 서열을 가지고 있다. 또한, 본 발명자들은 단백질 수송 도메인 PEP-1 펩타이드가 결합되지 않은 대조군 PEA15 단백질을 생산하기 위해서 PEA15 발현벡터를 만들었다(도 1A).

과발현 유도 후, PEP-1-PEA15 융합단백질은 Ni²-나이트릴로삼초산 세파로즈 친화 크로마토그래피 컬럼과 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. SDS-PAGE와 웨스턴블랏 분석법을 이용하여 PEP-1-PEA15 융합단백질이 정제된 것을 확인하였다(도 1B, 1C). 정제된 PEP-1-PEA15 융합단백질의 분자량은 대략 17KDa이고, 정제된 PEA15 단백질의 분자량은 대략 15KDa이다. PEP-1-PEA15 융합단백질은 항-토끼 폴리히스티딘 항체를 이용하여 확인하였다[14].

결과 2: HT22 세포 및 C6 세포내로 PEP -1- PEA15 융합단백질의 투과

PEP-1-PEA15 융합단백질의 농도별 세포 내 투과 정도를 측정하였다. PEP-1-PEA15 융합단백질의 농도별 투과는 0.5~3 μM로 다양한 농도 조건에서 진행하였고, 50분 동안 단백질을 세포에 처리한 후 웨스턴블랏팅하였다. 그 결과, PEP-1-PEA15 융합단백질은 농도 의존적으로 세포 내로 침투된 것을 확인하였다. 그러나, 대조군인 PEA15 단백질은 세포 내로 침투되지 않았다.

또한, 웨스턴블랏을 이용하여 PEP-1-PEA15 융합단백질 3 μM를 10~50분까지 시간별로 투과시켰을 때 투과된 단백질 수준을 측정한 결과, 세포 내로 투과된 PEP-1-PEA15 융합단백질 농도는 처리시간이 길어질수록 증가하였다(도 2A, 2B).

또한, HT22 세포 및 C6 세포를 공촛점 현미경으로 관찰하여 PEP-1-PEA15 융합단백질의 세포 내 전달을 확인하였다. PEP-1-PEA15 융합단백질이 HT22 세포 및 C6 세포에 형질 도입하는 것을 알 수 있었다. 반면, 대조군 PEA15 단백질은 HT22 세포 및 C6 세포에 형질 도입하는 능력이 없었다(도 2C 및 2D).

또한, PEP-1-PEA15 융합단백질은 신경세포 내로 투과된 후 세포 내에서 안정성을 보여주었다. 비록 단백질 농도는 점차 줄어드는 것으로 관찰되지만, 침투된 PEP-1-PEA15 융합단백질은 세포 내에서 36시간까지 유지되었다(도 2E).

결과 3: 세포 생존율에 미치는 PEP -1- PEA15 융합단백질의 효과

과산화수소를 처리할 때 유도되는 활성산소종을 PEP-1-PEA15 융합단백질이 효과적으로 억제하는지 확인하기 위하여 MTT 분석을 수행하였다. 도 3A와 같이, HT22 세포는 1 mM 과산화수소로 5시간 처리하였을 때, 48% 생존하였다. PEP-1-PEA15 융합단백질에 노출된 HT22 세포의 생존은 PEA15 단백질을 처리한 대조군의 생존율 20%에 비해 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가하였다. C6 세포를 1 mM 과산화수소에 노출시켜 MTT 분석으로 세포 생존율을 확인하였다. C6 세포 생존율 결과는 PEP-1-PEA15 융합단백질로 처리하였을 때 HT22 세포 생존율 결과와 유사하였다. PEP-1-PEA15 융합단백질을 처리한 C6 세포의 생존율은 36%까지 증가하였다(도 3B).

결과 4: HT22 세포에서 활성산소종 생성 및 DNA 단편화에 PEP -1- PEA15 융합단백질의 효과

과산화수소를 처리할 때 유도되는 활성산소종을 PEP-1-PEA15 융합단백질이 효과적으로 억제하는지 확인하기 위하여 DCF-DA(2,5-dichlorofluorescin diacetate) 염색법을 수행하였다. 각 시료에 1mM 과산화수소를 10분 동안 처리하였다. 도 4A와 같이, PEP-1 펩타이드 및 대조군 PEA15 단백질 처리군의 세포 내 활성산소종 수준은 1mM 과산화수소 처리군과 유사하였다. 반면, PEP-1-PEA15 융합단백질 처리군에서는 세포 내 활성산소종 수준이 감소하였다. 이러한 결과는 PEP-1-PEA15 융합단백질이 산화스트레스에 대해 HT22 세포를 보호함을 입증해준다. 또한, TUNEL 염색 방법으로 DNA 단편화에 대한 PEP-1-PEA15 융합단백질의 보호효과를 보았다. PEP-1-PEA15 융합단백질을 선처리하고, H₂O₂를 처리한 세포에서 TUNEL 염색된 세포 수를 센 결과, PEP-1-PEA15 융합단백질을 처리하지 않은 군의 세포 수보다 확연히 많은 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 대조군 PEA15 단백질을 처리한 세포는 PEA15 단백질이 세포 내로 침투하지 않아 DNA 단편화에 보호효과가 없는 것을 확인하였다(도 4B).

결과 5: HT22 세포 내에서 산화 스트레스로 인한 자기세포사멸에 대한 PEP-1-PEA15 융합단백질의 보호효과

과산화수소에 노출하여 유도된 산화 스트레스로 인한 자기세포사멸에 대해 PEP-1-PEA15 융합단백질이 미치는 영향을 알아보았다.친세포사멸 및 항세포사멸 마커 단백질들인 Akt(SER 473), ERK, JNK, 케스페이즈-3, 케스페이즈-12의 수준을 웨스턴블랏 분석으로 평가하였다. 도 5A와 같이, PEP-1-PEA15 융합단백질은 투여량 의존적으로 인산화-Akt 수준 증가를 저하조절하였다. 반면, 대조군 PEA15 단백질은 인산화-Akt 수준 증가를 저하시키지 않았다.

PEP-1-PEA15 융합단백질의 항 세포사멸 효과를 확인하고자 과산화수소로 MAPK(ErK, JNK) 인산화를 유도하였다. HT22 세포를 과산화수소 (1 mM)에 35분간(Erk), 45분간(JNK) 노출하고 MAPK(Erk, JNK) 항체를 이용하여 웨스턴블랏 분석하였다 (도 5A)[6,20-21]. 웨스턴블랏 밴드 강도를 밀도계로 측정하였다. 또한 케스페이즈-3, 케스페이즈-12 발현 정도도 측정하였다[22]. 과산화수소에 노출된 HT22 세포에서는 케스페이즈-3, 케스페이즈-12 발현 수준이 감소하였다. 그러나, PEP-1-PEA15 융합단백질은 과산화수소에 의해 유도된 케스페이즈-3, 케스페이즈-12 발현 감소를 저해하였다. 도 5A, 도 5C는 도 5B, 도 5D의 데이터를 정량화한 그래프이다. 이러한 결과는 PEP-1-PEA15 융합단백질이 과산화수소에 의한 세포사멸을 억제함으로써 산화 스트레스로부터 HT22 세포를 보호함을 입증한다[16].

결과 6: C6 세포에서 PEP -1- PEA15 융합단백질의 보호 효과( DCF - DA 및 TUNEL 분석)

과산화수소(1 mM)를 10분 처리한 후 형광 현미경으로 DCF-DA 형광을 관찰한 결과, 활성산소종 수준이 증가한 것으로 나타났다. 도 6A와 같이, PEP-1-PEA15 융합단백질은 세포 내 활성산소종 수준을 감소시켰고, PEA15 단백질 처리군, PEP-1 펩타이드 처리군에서는 세포 내 활성산소종 수준이 감소하지 않았다.이러한 결과는 PEP-1-PEA15 융합단백질이 산화 스트레스에 대하여 C6 세포를 보호함을 말해준다. 성상세포에서 과산화수소(1 mM)로 유도된 DNA 단편화에 대한 PEP-1-PEA15 융합단백질의 보호 효과를 평가하였다. PEP-1-PEA15 융합단백질을 선처리하고, 과산화수소를 처리한 세포에서 TUNEL 염색된 세포 수를 센 결과, PEP-1-PEA15 융합단백질을 처리하지 않은 군의 세포 수보다 확연히 적은 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 대조군 PEA15 단백질을 처리한 세포는 PEA15 단백질이 세포 내로 침투하지 않아 DNA 단편화에 효과가 없는 것을 확인하였다(도 6B).

결과 7: C6 세포에서 PEP -1- PEA15 융합단백질의 세포사멸 보호효능 탐색

과산화수소에 노출되면 바로 단백질, 지질 및 DNA를 포함한 세포의 모든 구성 요소 손상 및 활성 산소를 생산한다. PEP-1-PEA15 융합단백질의 과산화수소에 의한 세포사멸 공정에서 세포 생존에 미치는 영향을 조사하기 위해, 친세포사멸 및 항세포사멸 분자 마커를 이용하여 산화적 스트레스에 PEP-1-PEA15 융합단백질의 항세포사멸 반응을 조사하였다[17]. 과산화수소(1 mM) 노출 후, Akt, ERK, 케스페이즈-3 및 절단 케스페이즈-3의 발현 수준은 웨스턴블랏 분석으로 측정하였다. PEP-1-PEA15 융합단백질로 처리한 세포에서는 p-Akt, p-ErK가 감소하였고, 대조군 PEA15 단백질로 처리하였을 때는 변화가 없었다. 또한, 케스페이즈-3도 PEP-1-PEA15 융합단백질로 처리한 경우는 증가하였고, 대조군 PEA15 단백질로 처리한 경우는 변화가 없었다. 또한, 절단된 케스페이즈-3는 PEP-1-PEA15 융합단백질을 처리한 시료에서 현저히 감소하였다(도 7A). Akt, ERK, 케스페이즈-3, 절단 케스페이즈-3의 발현 수준은 웨스턴블랏 분석으로 측정하고, 밴드강도는 밀도계로 측정하였다(도 7B). 이러한 결과는 PEP-1-PEA15 융합단백질이 Akt, ERK 및 케스페이즈-3, 절단 케스페이즈-3의 발현을 조절함으로써 세포 생존을 촉진하는 것으로 보인다[17-19].

결과 8: 허혈 동물모델에서 CA1 영역의 뉴런 생존에 미치는 PEP -1- PEA15 융합단백질의 효과

혈관 뇌 장벽(BBB)에 걸쳐 PEP-1-PEA15 융합단백질이 신경세포 생존에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 시료를 제조하여 6시간 후 PEP-1-PEA15 융합단백질 및 PEP-1 펩타이드(2.0mg/kg)를 복강주사하였다. 히스티딘 항체를 이용한 면역조직화학은 뇌 용균액 시료에서 PEP-1-PEA15 융합단백질을 처리한 군에서만 히스티딘이 감지되었음을 보여준다(도 8A). 한편, 히스티딘은 PEP-1 펩티드 처리군 및 대조군 PEA15 단백질 처리군에서는 검출되지 않았다. 따라서, 히스티딘 항체를 이용한 면역조직화학 결과는 일시적 뇌허혈 동물 모델의 해마 CA1 영역에서 형질전환된 PEP-1-PEA15 융합단백질의 생물학적 활성을 보여준다. 또한, 동물모델에서 일시적 전뇌 허혈 유발 후 신경 세포의 생존 능력을 평가함으로써 CA1 영역에 미치는 PEP-1-PEA15 융합단백질의 효과를 알 수 있었다[22-24]. 허혈손상을 일으킨 다음 7일 후 PEP-1-PEA15 융합단백질 처리군, PEA15 단백질 처리군, PEP-1 펩타이드 처리군, 담체 처리군, 샴 수술 대조군 동물들을 희생시켜 크레실 바이올렛 염색을 하였다. PEP-1-PEA15 융합단백질의 방어 효과는 CV 조직 화학의 증가에 의해 입증되었다(도 8B). 담체 처리군, PEA15 처리군, PEP-1 펩타이드 처리군, 샴 수술 대조군은 양성염색 뉴런 세포가 샴 수술군에 비해 각각 15.8%, 17.2%, 15.6%였다(도 8B). 이러한 결과는 PEP-1-PEA15 융합단백질이효율적으로 혈관 뇌 장벽을 통과하여 허혈로 인한 신경 세포사멸을 방지함을 말해준다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Pharmaceutical composition for treating ischemia containing PEA15 fusion protein <130> HALLYMU-SYCHOI-PEP-PEA15-ISCHEMIA <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer of PEA15 <400> 1 ctcgagggca acgcgcag 18 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer of PEA15 <400> 2 ggatcctcag gaatcttcgg actc 24

Claims (2)

1. PEA15(phosphoprotein enriched in astrocytes 15)의 N-말단에 PEP-1 펩타이드가 공유결합된 PEA15 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 PEA15 융합단백질은 서열번호 4임을 특징으로 하는 PEA15 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.

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