KR20210155402A - 세포 투과성 gapdh 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

세포 투과성 gapdh 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20210155402A
KR20210155402A KR1020200071984A KR20200071984A KR20210155402A KR 20210155402 A KR20210155402 A KR 20210155402A KR 1020200071984 A KR1020200071984 A KR 1020200071984A KR 20200071984 A KR20200071984 A KR 20200071984A KR 20210155402 A KR20210155402 A KR 20210155402A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gapdh
fusion protein
protein
tat
cell
Prior art date
Application number
KR1020200071984A
Other languages
English (en)
Inventor
최수영
박진서
한규형
이근욱
박종국
조용준
음원식
신민재
여현지
여은지
최연주
황인구
김우석
권현정
김대원
Original Assignee
한림대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한림대학교 산학협력단 filed Critical 한림대학교 산학협력단
Priority to KR1020200071984A priority Critical patent/KR20210155402A/ko
Publication of KR20210155402A publication Critical patent/KR20210155402A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/645—Polycationic or polyanionic oligopeptides, polypeptides or polyamino acids, e.g. polylysine, polyarginine, polyglutamic acid or peptide TAT
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01012—Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (phosphorylating) (1.2.1.12)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/322—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the nervous system or on mental function
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

과제: 부작용이 적거나 없으며, 효과가 우수한 신경질환 치료용 약제를 제공하는 것.
해결수단: 본 발명은 세포투과성 GAPDH 융합단백질을 포함하는 신경질환 치료용 약학 조성물에 관한 것으로서, 세포 내로 투과된 GAPDH 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰고, 세포 내 활성산소종 수준 및 과산화수소로 유도되는 DNA 단편화를 감소시켰다. 이러한 결과들은 GAPDH 융합단백질이 세포사멸에 대해 보호효과가 있으며, 신경질환 손상으로부터 신경세포를 보호하는 치료효과가 있음을 말해준다.

Description

세포 투과성 GAPDH 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물{A pharmaceutical composition containing cell-transducing GAPDH fusion protein for preventing or treating neuronal disorder}
본 발명은 세포 투과성 GAPDH 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
클리닉에서 하반신 마비는 하행 및 흉복부 대동맥류 재건수술 후 허혈의 지속 시간과 정도에 따라 수술 후 1일에서 21일 사이에 예측 불가능한 합병증으로 발전한다 (Crawford and Coseelli, 1991; Etz et al, 2006; Kouchoukos, 1991; Panthee and Ono, 2015).
토끼는 흉부 척수에 부수적인 혈관이 없으므로 척수 허혈 연구에 가장 적합한 동물이다 (Mazensky et al, 2011). 신장 아래에서 복부 대동맥의 폐색은 토끼 척수의 복부 돌기에서 거대하지만 지연된 신경 손상을 일으킨다 (Zivin and DeGirolami, 1980).
지연된 신경세포 사멸과 관련하여 가장 널리 채택되는 가설 중 하나는 높은 수준의 불포화 지방산과 뉴런에 의한 높은 산소 소비로 인해 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 생성이 증가하고, 뒤이어 DNA 및 세포막이 손상된다는 것이다 (Lin et al, 2003; Song et al, 2013). 허혈/재관류 중에 생성된 자유 라디칼은 뉴런에서 단백질 파괴, 지질 과산화 및 DNA 손상을 일으킨다 (Olmez and Ozyurt, 2012). 항산화제와 같은 내생적인 방어 메커니즘이 활성화되어 과잉 자유 라디칼을 억제하고 세포 손상을 약화시킨다. 몇몇 연구는 항산화제 처리가 척수 허혈에 의해 유도된 신경 손상을 현저히 저하한다고 밝혔다 (Hwang et al, 2015; Kim et al, 2012; Zhu et al, 2012).
글리세르알데히드-3-인산탈수소효소 (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH, EC 12112)는 해당작용에 관여하는 효소로서, D-GAP(glyceraldehyde-3-phosphate)의 인산화를 촉매하여 1,3-BPG(1,3-bisphosphoglycerate)를 형성하는 효소이다. 최근에 GAPDH는 막 수송과 융합 등의 세포 내 작용에 관여하며 DNA 복제와 수복, 핵 RNA 배송 등의 전사활성 인자로서 다양한 기능이 밝혀지고 있다. 또한, GAPDH는 전립선암의 진행을 비롯하여 세포예정사를 일으키고 노화 관련 알츠하이머나 헌팅턴 무도병에도 관여하는 중요한 효소로 부각되고 있다.
한편 지금까지 연구된 바에 의하면 GAPDH는 모든 종의 생물에서 발견되고 있으며 주로 세포질에 위치하고 있다. 유산균 외의 미생물에서는 바실러스 속 SG-1(Bacillus sp SG-1) 및 타나테포러스 쿠쿠메리스(Thanatephoruscucumeris), 지오바실러스 디모디니트리피컨스 NG80-2( Geobacillus thermodenitrificans NG80-2) 등에서 발견되고 있고, 유산균에서는 락토바실러스 크리스파투스 ST1(Lactobacillus crispatus ST1), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis ATCC367), 락토바실러스 델브룩키(Lactobacillus delbrueckii ATCC BAA-365), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus CAH60997), 락토바실러스 아시도필러스 NCFM (Lactobacillus acidophilus NCFM), 비피도박테리움 아롤레센티스(Bifidobacterium adolescentis ATCC15703), 락토바실러스 카제이 (Lactobacillus casei ATCC334), 비피도박테리움 론검 DJ010A (Bifidobacterium longum DJ010A, ATCC15703), 페디오코커스 펜토사세우스 (Pediococcus pentosaceus ATCC 25745), 류코노스톡 메센테로이드 (Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293), 엔테로코커스 페카리스(Enterococcus faecalis V583), 락토바실러스 프랜타룸( Lactobacillus plantarum WCFS1) 등에서 GAPDH의 존재가 보고되어 있다. 특히 Lactobacillus plantarum LA 318과 L plantarum WCFS1는 40kDa의 GAPDH를 갖고 있으며 사람의 대장 점질 다당체에 결합하는 것으로 나타나 장에 부착하는데 중요한 역할을 하는 것으로 추측되고 있다.
그러나, 활성산소종에 의한 신경 세포사멸에 대한 GAPDH의 기능 또는 효과에 대해서는 아직까지 명확히 밝혀지지 않았다.
본 발명은 신경세포 손상과 사멸로 인한 신경질환의 효과적인 예방 및 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 PEP-1, HIV Tat 펩타이드와 같은 단백질 수송 도메인을 GAPDH 단백질과 재조합하여 NSC34 세포 내로 침투하는 것을 확인하였으며, 산화 스트레스에 대한 세포 침투성 GAPDH 융합단백질의 보호효과에 대해 연구하였다.
본 발명자들은 단백질 수송 도메인과 결합한 GAPDH 융합단백질이 시험관 내에서 산화 스트레스에 의해 유도된 신경세포사멸에 보호효과가 있는지를 밝히고자 하였다. 허혈성 신경세포사멸에 대해 GAPDH 융합단백질의 잠재적인 효과를 연구하기 위해 본 발명자들은 세포 내로 투과할 수 있는 GAPDH 융합단백질을 제작하였다. GAPDH 융합단백질은 신경세포 내부로 농도 의존적 및 시간 의존적으로 효과적으로 투과하였다. 세포 내로 투과된 GAPDH 융합단백질은 과산화수소 독성에 대한 세포 생존율을 증가시켰고, 세포 내 활성산소종 수준을 낮추었다. 이러한 결과들은 GAPDH 융합단백질이 시험관 내에서 일어나는 세포사멸에 대해 보호효과를 나타내며, 산화 스트레스와 관련된 신경질환에 대해 치료제로 이용될 수 있음을 말해준다.
본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명하면, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 먼저 GAPDH 융합단백질을 과대 발현시키고 쉽게 정제할 수 있는 GAPDH 융합단백질 발현 벡터를 개발하였다. 이 발현 벡터는 인간 GAPDH 단백질, 7~21개 아미노산으로 이루어진 단백질 수송 도메인 하나 이상, 그리고 N 말단부분에 6개의 히스티딘 잔기를 발현시킬 수 있는 cDNA를 포함하고 있다. 그 예시로 GAPDH 융합단백질의 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 1임을 특징으로 한다.
이 발현벡터를 이용하여 GAPDH 융합단백질을 대장균에서 과대 발현시켰으며 Ni-친화 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 배양된 세포에 GAPDH 융합단백질이 시간 및 농도 의존적으로 세포에 운반되는 것을 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 세포 내로 투과된 GAPDH 융합단백질은 세포 내에서 최대 12시간 동안 지속적으로 유지되었으며, 산화 스트레스에 의한 세포사멸을 억제하였다.
이러한 결과는 GAPDH 융합단백질이 세포 내로 잘 투과되고, 세포 내에서 GAPDH 단백질의 기능을 잘 나타내고 있음을 의미한다. 따라서 이러한 GAPDH 융합단백질은 활성산소종과 관련된 증세로부터 신경세포를 보호하는 등의 신경질환에 응용할 가능성을 제시해 준다.
세포 투과성 GAPDH 융합단백질을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 통상적인 방법에 의해 경구 또는 주사 형태 등으로 제형화할 수 있다. 경구용 조성물로는 예를들면 정제 및 젤라틴 캡슐이 있으며, 이들은 활성 성분 이외에도 희석제 (예: 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활탁제(예: 실리카, 탤크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고, 정제는 또한 결합제 (예: 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐 피롤리돈)를 함유하며, 경우에 따라서 붕해제 (예: 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염) 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유하는 것이 바람직하다. 주사용 조성물은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 언급한 조성물은 멸균되고/되거나 보조제 (예: 방부제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제 용액 촉진제, 삼투압 조절을 위함 염/또는 완충제)를 함유한다. 또한, 이들은 기타 치료에 유용한 물질을 함유할 수 있다.
이와 같이 제조된 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구로 투여 하거나, 비경구 방식 즉, 정맥 내, 피하, 복강 내 투여 또는 국소적용할 수 있다. 용량은 일일 투여량 0.0001~100㎎/㎏을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 GAPDH 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 신경질환 예방 및 치료에 유용한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 GAPDH 단백질을 세포 내로 효율적으로 전달하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 GAPDH 단백질 분자의 세포 내 전달은 HIV Tat 펩타이드와 같은 단백질 수송 도메인이 공유결합된 형태의 융합단백질을 구성하여 수행된다. 본 발명의 상기 단백질 수송 도메인의 일례로는 HIV Tat 펩타이드를 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 단백질 수송 도메인이 HIV Tat 펩타이드로만 한정되는 것은 아니며, HIV Tat 펩타이드의 아미노산 서열 일부 치환이나 부가, 결여로 HIV Tat 펩타이드와 유사한 기능을 하는 펩타이드를 제조하는 것이 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 당업자에게는 용이하므로, 7~21개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 다수 포함하는 단백질 수송 도메인과 이로부터 아미노산 일부 치환으로 동일·유사한 단백질 수송기능을 수행하는 단백질 수송 도메인을 이용한 융합단백질도 본 발명의 범위에 속함은 자명하다고 할 것이다.
구체적으로, 본 발명은 GAPDH 융합단백질, GAPDH 융합단백질을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드, GAPDH 융합단백질을 코딩하는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 이 융합단백질, 상기 올리고뉴클레오타이드 또는 상기 벡터를 포함하는 신경질환 치료 또는 예방 목적의 약학 조성물 및 이 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 개선 용도의 건강기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 GAPDH 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 구체적으로 서열번호 1임을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 세포 투과성 GAPDH 융합단백질을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 GAPDH 융합단백질의 양은, 일반적으로 본발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.2 내지 10 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100㎖를 기준으로 0.1 내지 30g, 바람직하게는 0.2 내지 5g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 본 발명의 건강음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 GAPDH 융합단백질을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 수크로스 등 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시리진등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다. 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 중요하지는 않으나 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
"GAPDH 융합단백질"이란 단백질 수송 도메인과 GAPDH 단백질을 포함하며, 단백질 수송 도메인과 목표 단백질 (즉, 본 발명에서는 GAPDH 단백질을 의미함)의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 본 명세서에서는 구체적인 실시예로 HIV-Tat 단백질 수송 도메인을 이용하였으므로 "GAPDH 융합단백질"을 "Tat-GAPDH", "Tat-GAPDH 융합단백질" 등과 혼용하였다.
"목표 단백질"이란 본래 표적 세포로 들어갈 수 없거나, 유용한 속도로 표적 세포로 들어갈 수 없는 수송도메인 또는 이의 단편이 아닌 분자로서, 수송도메인과 융합되기 전의 분자 그 자체 또는 수송도메인-목표 단백질 복합체의 목표 단백질 부분을 의미한다. 목표 단백질로서는 폴리펩티드, 단백질, 펩타이드를 포함하며, 본 발명에서는 GAPDH을 의미한다.
"융합단백질"이란 수송도메인 및 한 개 이상의 목표 단백질 부분을 함하며, 수송도메인과 목표 단백질의 유전적 융합이나 화학 결합으로 형성된 복합체를 의미한다.
또한, 상기 "유전적 융합"이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형, 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다. 또한, "표적 세포"란 수송도메인에 의해 목표 단백질이 전달되는 세포를 의미하는 것으로서, 표적 세포는 체내 또는 체외의 세포를 말한다. 즉, 표적 세포는 체내 세포, 다시 말하여 살아있는 동물 또는 인간의 장기 또는 조직을 구성하는 세포 또는 살아있는 동물 또는 인간에서 발견되는 미생물을 포함하는 의미이다. 또한, 표적 세포는 체외 세포, 즉 배양된 동물세포, 인체 세포 또는 미생물을 포함하는 의미이다.
본 발명에서의 "단백질 수송 도메인"은 고분자 유기화합물, 예컨대 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드, 단백질, 올리고당 또는 다당류 등과 공유결합을 이루어 별도의 수용체나 운반체, 에너지를 필요로 하지 않고 상기 유기화합물들을 세포 내로 도입시킬 수 있는 것을 말한다.
또한, 본 명세서에서는 단백질, 펩타이드, 유기화합물을 세포 내로 "도입"하는 것에 대하여 "운반", "침투", "수송", "전달", "투과", "통과"한다는 표현들과 혼용하였다.
본 발명의 GAPDH 융합단백질은 7 내지 21개의 아미노산 잔기로 구성되며 아르기닌 또는 라이신 잔기를 3/4 이상 포함하는 수송도메인이 GAPDH의 최소한 일측 말단에 공유결합되어 세포침투 효율이 향상된 GAPDH 융합단백질을 말한다. 또한, 상기 수송도메인은 HIV Tat 49-57 잔기, Pep-1 펩타이드, 올리고라이신, 올리고아르기닌 또는 올리고 (라이신,아르기닌) 중의 1종 이상을 말한다.또한, 본 발명의 상기 GAPDH 융합단백질 아미노산 서열은 서열목록의 서열번호 2이다. GAPDH 융합단백질 제조에서 제한부위 서열의 선택 등에 따라 다양한 서열의 융합단백질을 얻을 수 있으며, 이는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 자명하다. 위 아미노산 서열은 예시적인 것 일뿐 GAPDH 융합단백질 아미노산 서열이 위에 나열된 서열로 한정되는 것이 아님은 자명하다.
또한, 본 발명은 상기 GAPDH 융합단백질을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용되는 담체를 포함하며, 신경질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 GAPDH 융합단백질을 유효성분으로 하며, 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 7~21개의 아미노산으로 구성되고, 라이신 또는 아르기닌을 4개 이상 포함하는 단백질 수송 도메인이 GAPDH 단백질의 적어도 일측 말단에 공유결합된 세포 투과성 (cell-transducing) GAPDH 융합단백질에 관한 것이다. 또한, GAPDH 융합단백질은 silent change에 따라 서열 내에서 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)로 치환될 수 있다. 서열 내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성 아미노산 분류는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양성 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합단백질과 아미노산 서열 간의 일정 범위의 상동성 예컨대 85-100% 범위 내의 동일 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
본 발명에서 세포 내로 투과된 GAPDH 융합단백질은 과산화수소 독성에 대해 세포생존율을 증가시켰다. 이러한 결과는 GAPDH 융합단백질이 활성산소종에 의한 신경세포 사멸에 대해 보호효과가 있으며, 세포 투과성 GAPDH 융합단백질이 신경질환 예방 및 치료용 약학 조성물로 유용함을 말해준다.
도 1은 pET-15b 벡터 상에 Tat-GAPDH 발현 벡터를 구축하는 것을 도시한 것이다. 합성 Tat 올리고머는 NdeI 및 XhoI 부위에 클로닝하였고, 사람 GAPDH cDNA는 pET-15b의 XhoI 및 BamHI 부위에 클로닝하였다. (A)는 GAPDH 및 Tat-GAPDH 융합단백질의 발현 벡터를 구축하는 것을 도시한 것이다. Tat-GAPDH 융합단백질은 여섯 개의 히스티딘 잔기를 포함한다. (B)는 IPTG를 첨가하여 각 단백질을 발현한 다음 정제된 GAPDH 및 Tat-GAPDH 융합단백질을 15% SDS-PAGE를 이용하여 정제하고 항 토끼 폴리히스티딘 항체로 웨스턴 블롯팅한 결과이다.
도 2는 NSC34 세포로의 Tat-GAPDH 융합단백질의 투과를 나타낸다. (A)는 Tat-GAPDH 융합단백질(0.5~5μM) 및 GAPDH 단백질(0.5~5μM)을 1시간 동안 배양 배지에 처리하고, (B)는 Tat-GAPDH 융합단백질 및 GAPDH 단백질을 15~60분 동안 배양 배지에 처리하여 웨스턴 블롯팅으로 분석한 결과이다. (C) Tat-GAPDH 융합단백질의 세포 내 분포를 공촛점 형광 현미경으로 가시화하였다. (D) Tat-GAPDH 융합단백질의 NSC34 세포 내 안정성을 분석하였다. Tat-GAPDH 융합단백질 (5μM)로 형질 도입 된 후 세포를 1~60 시간 동안 배양하고 웨스턴 블롯팅으로 분석 하였다.
도 3a는 1시간 동안 각각 Tat-GAPDH 융합단백질 또는 GAPDH 단백질로 전처리한 NSC34세포에 과산화수소(100μM)를 가하고 1시간 동안 둔 다음 MTT 분석법을 이용하여 세포생존율을 측정한 결과이다.
도 3b는 세포 내 활성산소종 수준을 DCF-DA 염색으로 측정한 결과이다.
도 3c는 TUNEL 염색으로 DNA 단편화를 측정한 결과이다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 GAPDH 융합단백질을 구성하는 단백질 수송 도메인으로 HIV Tat 펩타이드를 이용하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 Tat 펩타이드가 N-말단에 결합된 GAPDH 융합단백질을 응용하여, PEP-1 펩타이드, 올리고아르기닌, 올리고라이신 및 올리고(아르기닌+라이신) 등의 다양한 단백질 수송 도메인을 GAPDH의 N-말단 또는 C-말단 중 한 곳 이상에 결합시킨 융합단백질을 용이하게 형성할 수 있고, 이와 같은 융합단백질 간에 약간의 차이는 있을 수 있으나 유사한 활성을 나타냄을 용이하게 알 수 있다.
재료
Ni2+-니트릴로삼초산 세파로즈 수퍼플로우는 Qiagen에서 구매하였고, PD-10 컬럼 크로마토그래피(Amersham, Brauncschweig, Germany)를 구매하였다. 마우스 운동 뉴런인 NSC34 세포는 한국세포주연구재단(KCLF)에서 제공받았다. DCF-DA(2',7'-Dichlorofluorescein diacetate)와 Bcl-2, Bax, β-액틴, P-p53, p53, 캐스페이즈 3, 캐스페이즈 9, p-p38, p38, p-Erk, Erk, p-JNK 및 JNK의 일차 항체는 Cell signaling Technology(Beverly, MA, USA)와 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 이밖의 모든 시약은 특급 제품을 이용하였다.
Tat-GAPDH 융합단백질의 발현 및 정제
GAPDH 단백질 및 Tat-GAPDH 융합단백질의 발현 벡터를 구축하였다. 인간 GAPDH 유전자를 cDNA와 함께 2개의 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응으로 증폭시켰다. 센스 프라이머는 5'-CTCGAGGGCAACGCGCAG-3'이고, XhoI이라는 제한효소 작용부위가 5' 쪽에 존재한다. 안티센스 프라이머는 5'-GGATCCTCAGGAATCTTCGGACTC-3'이고, BamHI이라는 제한효소 작용부위가 5' 쪽에 존재한다. 중합효소 연쇄반응을 통하여 얻은 결과물을 TA 벡터에 연결하고 XhoI과 BamHI을 이용하여 자른 후에 발현 벡터에 연결하여 Tat-GAPDH 융합단백질을 제조하였다. 이와 마찬가지로 대조군인 GAPDH 단백질은 Tat 펩타이드가 결여된 벡터를 이용하여 제조하였다. 재조합된 Tat-GAPDH 플라스미드를 대장균인 BL21로 형질변환시킨 후 0.5mM IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside)로 유도하여 18℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양한 세포를 초음파로 분쇄하여 Tat-GAPDH 융합단백질을 얻기 위해 Ni2+-니트릴로삼초산 세파로즈 수퍼플로우 컬럼을 이용하여 정제하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 우혈청 알부민을 표준물질로 이용하여 결정하였다.
NSC34 세포로 Tat-GAPDH 융합단백질 도입
NSC34 세포는 37℃, 95% 공기 및 5% CO2의 조건을 유지해주며, 10% 우태혈청 (FBS) 및 5 mM NaHCO3, 항생제 (100㎍/ml 스트렙토마이신, 100U/ml 페니실린), 20 mM HEPES/NaOH (pH 7.4)를 포함하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)을 이용하여 습한 조건에서 배양하였다.
Tat-GAPDH 융합단백질 및 대조군 GAPDH 단백질의 세포 내 도입에 대한 시간 의존성 및 농도 의존성을 평가하였다. 세포는 60㎜ 디쉬에서 시간(15~60분) 및 각 단백질의 투여량(0.5~5μM)을 달리하여 처리하였다. 트립신-EDTA(Gibco)를 처리하고 PBS를 이용하여 세척한 다음 세포 내로 투과된 융합단백질을 브래드포드 방법으로 정량하고, 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
웨스턴 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석을 위해 세포 분쇄액 내의 단백질을 12% SDS 폴리아크릴아마이드 젤로 분리한 다음, 젤에 있는 단백질을 나이트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane; Amersham, UK)으로 전기이동시켰다. 막은 TBS-T 완충액(25 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)으로 블로킹하였다. 막은 제조업체에서 권장하는 일차 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석하였다. 결합한 항체 복합체는 강화 화학 발광제를 이용하여 제조자 (Amersham, Franklin Lakes, NJ,USA)의 지시에 따라 탐지하였다.
공촛점 현미경 관찰
NSC34 세포 내의 Tat-GAPDH 융합단백질과 GAPDH 단백질을 탐지하기 위해 세포를 유리 커버슬립 상에 시드하고 Tat-GAPDH 융합단백질과 GAPDH 단백질을 5μM 농도로 1시간 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 두 번 세척한 다음 실온에서 5분간 4% 파라포름알데하이드로 고정하였다. NSC34 세포는 실온에서 40분간 3% 우혈청 알부민과 0.1% Triton X-100이 함유된 PBS (PBS-BT)로 40분간 블로킹하고, PBSBT로 세척하였다. 일차 항체 (His-probe, Santa Cruz Biotechnology)는 1:10000 비율로 희석하고, 이차 항체 (Alexa fluor 488, Invitrogen)는 1:15000 비율로 희석한 후 어두운 곳에서 실온으로 1시간 동안 배양하였다. 세포핵은 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole 1 ㎎/ml; Roche, Mannheim, Germnay)로 3분간 염색하였다. 염색된 NSC34 세포는 Fv-300 공촛점 형광현미경 (Olympus, Tokyo, Japan) 하에서 관찰하였다.
세포 생존율 분석
과산화수소로 처리한 NSC34 세포의 생존율을 MTT {3-(4,5-dimethylthiazol -2-yl)-2,5-dipheyltetrazolium bromide}를 이용하여 비색분석법으로 확인하였다. 세포에 0.5~5μM의 Tat-GAPDH 융합단백질을 선처리하거나 또는 처리하지 않고, 세포를 100μM의 과산화수소에 1시간 동안 노출하여 세포사멸을 유도하였다. ELISA 마이크로플레이트 판독기 (Labsystems Multiskan MCC/340)로 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 무처리 대조군에 대한 백분율로 나타내었다.
세포 내 활성산소종 수준 측정
DCF-DA (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 이용하여 세포 내 활성산소종 수준을 측정하였다. DCF-DA는 활성산소종에 의해 세포 내에서 DCF로 전환되어 형광을 발한다. NSC34 세포에 Tat-GAPDH 융합단백질을 처리하였을 때와 처리하지 않았을 때의 활성산소종 수준을 비교해 보았다. Tat-GAPDH 융합단백질은 5μM로 1시간 동안 처리하였고 후에 과산화수소를 700μM의 농도로 30분 동안 처리하였다. 그리고 PBS로 두 번 씻어주고 DCF-DA를 20μM의 농도로 30분 처리하였다. 형광 강도는 Fluoroskan ELISA plate reader (Labsystems, Helsinki, Finland)를 이용하여 485㎚ 여기파장 (exitation), 538㎚ 방출파장 (emission)을 측정하였다.
TUNEL 분석
NSC34 세포에 Tat-GAPDH 융합단백질을 처리하지 않은 군과 5μM의 농도로 1시간 동안 처리한 군의 배양액에 과산화수소 (100μM)를 가하여 1시간 동안 처리하였다. 세포사멸을 측정하기 위해 TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotinylated dUTP nick end labeling staining) 기법은 세포사멸 탐지 킷트 (Roche Applied Science)를 사용하여 수행하였다. 형광현미경(Nikon eclipse 80i, Japan)을 이용하여 결과를 분석하였다.
결과 1: Tat-GAPDH 융합단백질의 정제 및 세포 투과
발명자들은 침투성 Tat-GAPDH 융합단백질을 제조하기 위해 단백질 수송 도메인 PTD (Protein Transduction Domain)의 일종인 Tat이 포함된 Tat-벡터와 GAPDH 유전자를 재조합하였다(도 1의 A). 대장균에서 과대발현시켜 Ni2+-나이트릴로삼초산 세파로즈 친화 크로마토그래피 컬럼과 PD-10 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였고, SDS-PAGE와 웨스턴 블롯 분석법을 이용하여 Tat-GAPDH 융합단백질이 정제된 것을 확인하였다(도 1의 A, B).
결과 2: NSC34 세포 내로 Tat-GAPDH 융합단백질의 투과
Tat-GAPDH 융합단백질의 시간 및 농도별로 NSC34 세포 내 투과 정도를 측정하였다. 그 결과 시간 및 농도 의존적으로 세포 내 투과가 효과적으로 일어났으며, GAPDH 단백질은 투과가 일어나지 않았다(도 2의 A, B). 또한, 공촛점 현미경을 이용하여 DAPI로 세포핵을 염색하고, Tat-GAPDH 융합단백질을 녹색 형광으로 염색하여 효과적으로 세포 내로 투과되는 것을 확인하였다(도 2의 C). Tat-GAPDH 융합단백질의 NSC34 세포 내 안정성을 확인하였다(도 2의 D).
결과 3: 산화스트레스로 인한 세포생존율, 활성산소종 생성 및 DNA 단편화에 대한 Tat-GAPDH 융합단백질의 세포 보호효과
세포에 Tat-GAPDH 융합단백질을 농도별로 전처리 후 과산화수소로 산화스트레스를 유도하였다. 세포 생존능력을 확인하기 위해 MTT 분석을 수행하였다. NSC34 세포에 100μM 과산화수소를 단일 처리하였을 경우 생존한 세포 수가 약 40%로 감소하였으나, Tat-GAPDH를 선처리한 경우 농도 의존적으로 세포생존율이 증가하였다(도 3의 A).
또한, 과산화수소를 처리할 때 유도되는 활성산소종을 Tat-GAPDH 융합단백질이 효과적으로 억제하는지 확인하기 위해 8-OHdG 형광 염료를 사용하여 세포 내 산화 정도를 분석하였다. NSC34 세포가 1시간 동안 100μM의 과산화수소에 노출되었을 때, 과산화수소에 의해 현저하게 8-OHdG 신호가 증가하였다. 그러나 과산화수소에 의해 유도된 활성산소종은 Tat-GAPDH 융합단백질에 의해 감소하였다(도 3의 B).
산화 스트레스로 인해 발생되는 DNA 단편화에 대한 융합단백질의 보호효과는 DNA 단편화 부위에 특이적으로 붙는 형광 염료를 이용한 TUNEL 염색 방법으로 알아보았다. 앞선 실험과 동일한 상태에서 수행하였고, NSC34 세포가 1시간 동안 100μM의 과산화수소에 노출되었을 때, Tat-GAPDH 융합단백질이 DNA 단편화에 대해 보호효과가 있다는 결과를 확인하였다(도 3의 C).
따라서, 본 발명은 Tat-GAPDH 융합단백질이 산화 스트레스로 인한 신경질환 등의 신경퇴행성 질환 및 다양한 질환에 대하여 치료제로서 효과적으로 응용될 수 있다는 가능성을 제시한다.
<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> A pharmaceutical composition containing cell-transducing GAPDH fusion protein for preventing or treating neuronal disorder <130> HallymU-SYCHOI-GAPDH-NSC34 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1035 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-GAPDH fusion protein coding polynucleotide <400> 1 aggaagaagc ggagacagcg acgaagaatg gggaaggtga aggtcggagt caacggattt 60 ggtcgtattg ggcgcctggt caccagggct gcttttaact ctggtaaagt ggatattgtt 120 gccatcaatg accccttcat tgacctcaac tacatggttt acatgttcca atatgattcc 180 acccatggca aattccatgg caccgtcaag gctgagaacg ggaagcttgt catcaatgga 240 aatcccatca ccatcttcca ggagcgagat ccctccaaaa tcaagtgggg cgatgctggc 300 gctgagtacg tcgtggagtc cactggcgtc ttcaccacca tggagaaggc tggggctcat 360 ttgcaggggg gagccaaaag ggtcatcatc tctgccccct ctgctgatgc ccccatgttc 420 gtcatgggtg tgaaccatga gaagtatgac aacagcctca agatcatcag caatgcctcc 480 tgcaccacca actgcttagc acccctggcc aaggtcatcc atgacaactt tggtatcgtg 540 gaaggactca tgaccacagt ccatgccatc actgccaccc agaagactgt ggatggcccc 600 tccgggaaac tgtggcgtga tggccgcggg gctctccaga acatcatccc tgcctctact 660 ggcgctgcca aggctgtggg caaggtcatc cctgagctga acgggaagct cactggcatg 720 gccttccgtg tccccactgc caacgtgtca gtggtggacc tgacctgccg tctagaaaaa 780 cctgccaaat atgatgacat caagaaggtg gtgaagcagg cgtcggaggg ccccctcaag 840 ggcatcctgg gctacactga gcaccaggtg gtctcctctg acttcaacag cgacacccac 900 tcctccacct ttgacgctgg ggctggcatt gccctcaacg accactttgt caagctcatt 960 tcctggtatg acaacgaatt tggctacagc aacagggtgg tggacctcat ggcccacatg 1020 gcctccaagg agtaa 1035 <210> 2 <211> 325 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Tat-GAPDH fusion protein <400> 2 Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro 1 5 10 15 Arg Gly Ser His Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Glu Met 20 25 30 Gly Lys Val Lys Val Gly Val Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu 35 40 45 Val Thr Arg Ala Ala Phe Asn Ser Gly Lys Val Asp Ile Val Ala Ile 50 55 60 Asn Asp Pro Phe Ile Asp Leu Asn Tyr Met Val Tyr Met Phe Gln Tyr 65 70 75 80 Asp Ser Thr His Gly Lys Phe His Gly Thr Val Lys Ala Glu Asn Gly 85 90 95 Lys Leu Val Ile Asn Gly Asn Pro Ile Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp 100 105 110 Pro Ser Lys Ile Lys Trp Gly Asp Ala Gly Ala Glu Tyr Val Val Glu 115 120 125 Ser Thr Gly Val Phe Thr Thr Met Glu Lys Ala Gly Ala His Leu Gln 130 135 140 Gly Gly Ala Lys Arg Val Ile Ile Ser Ala Pro Ser Ala Asp Ala Pro 145 150 155 160 Met Phe Val Met Gly Val Asn His Glu Lys Tyr Asp Asn Ser Leu Lys 165 170 175 Ile Ile Ser Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu Ala Pro Leu Ala 180 185 190 Lys Val Ile His Asp Asn Phe Gly Ile Val Glu Gly Leu Met Thr Thr 195 200 205 Val His Ala Ile Thr Ala Thr Gln Lys Thr Val Asp Gly Pro Ser Gly 210 215 220 Lys Leu Trp Arg Asp Gly Arg Gly Ala Leu Gln Asn Ile Ile Pro Ala 225 230 235 240 Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ala Val Gly Lys Val Ile Pro Glu Leu Asn 245 250 255 Gly Lys Leu Thr Gly Met Ala Phe Arg Val Pro Thr Ala Asn Val Ser 260 265 270 Val Val Asp Leu Thr Cys Arg Leu Glu Lys Pro Ala Lys Tyr Asp Asp 275 280 285 Ile Lys Xaa Val Val Lys Gln Ala Ser Xaa Gly Pro Leu Xaa Ala Ser 290 295 300 Trp Ala Thr Leu Ser Xaa Arg Trp Ser Pro Leu Thr Ser Thr Ala Thr 305 310 315 320 Pro Thr Pro Pro Xaa 325

Claims (7)

  1. HIV-Tat 단백질 수송 도메인이 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 단백질의 최소한 일측 말단에 공유결합된 세포침투 효율이 향상된 GAPDH 융합단백질을 함유하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 GAPDH 융합단백질은 그 아미노산 서열이 서열번호 2임을 특징으로 하는 GAPDH 융합단백질을 함유하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 HIV-Tat 단백질 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합된 GAPDH 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 재조합 폴리뉴클레오타이드는 그 염기 서열이 서열번호 1임을 특징으로 하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 HIV-Tat 단백질 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합된 GAPDH 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 신경질환 예방 또는 치료용 GAPDH 융합단백질 발현 벡터.
  6. GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 코딩 cDNA의 최소한 일측 말단에 HIV-Tat 단백질 수송 도메인 코딩 올리고뉴클레오타이드 서열이 결합된 GAPDH 융합단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 GAPDH 융합단백질 발현벡터를 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 청구항 1 또는 청구항 2의 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 융합단백질을 유효성분으로 하는 신경질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
KR1020200071984A 2020-06-15 2020-06-15 세포 투과성 gapdh 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 KR20210155402A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200071984A KR20210155402A (ko) 2020-06-15 2020-06-15 세포 투과성 gapdh 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200071984A KR20210155402A (ko) 2020-06-15 2020-06-15 세포 투과성 gapdh 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210155402A true KR20210155402A (ko) 2021-12-23

Family

ID=79175935

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200071984A KR20210155402A (ko) 2020-06-15 2020-06-15 세포 투과성 gapdh 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20210155402A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2006504770A (ja) 細胞浸透効率を向上させた輸送ドメイン−目標蛋白質−輸送ドメイン融合蛋白質及びその用途
Xiang et al. A membrane-targeted peptide inhibiting PtxA of phosphotransferase system blocks Streptococcus mutans
KR100835879B1 (ko) 아넥신 융합 단백질
KR20210003342A (ko) 포스포글리세레이트 뮤테이즈 1 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR20210021186A (ko) 세포 투과성 cnrip1 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20210155402A (ko) 세포 투과성 gapdh 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20220099134A (ko) 세포 투과성 gapdh 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR102581664B1 (ko) 세포 투과성 crym 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR20210114579A (ko) 세포 투과성 엔도필린-a1 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR20220147167A (ko) 세포 투과성 pgam5 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR20210158516A (ko) 세포 투과성 crym 융합단백질을 포함하는 운동신경 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20220095299A (ko) 세포 투과성 hspe1 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR20220003192A (ko) 세포 투과성 pgam5 융합단백질을 포함하는 운동신경 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20220063787A (ko) 세포 투과성 hspe1 융합단백질을 포함하는 운동신경 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20230152198A (ko) 세포 투과성 무기 피로인산 분해효소 1 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR20210114590A (ko) 세포 투과성 tagln3 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR20210008197A (ko) 세포 투과성 pgam1 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 및 치료용 약학 조성물
KR20210018655A (ko) 세포 투과성 p27 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20230171520A (ko) 세포 투과성 cct2 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR20210018568A (ko) 세포 투과성 tagln3 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20210018620A (ko) 세포 투과성 엔도필린-a1 융합단백질을 포함하는 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20230045653A (ko) 세포 투과성 stub1 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR20210018590A (ko) 세포투과성 p27 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR20230149378A (ko) 세포 투과성 pgk1 융합단백질을 포함하는 뇌허혈 치료용 약학 조성물
KR20220158291A (ko) 세포 투과성 무기 피로인산 분해효소 1 융합단백질을 포함하는 운동신경 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물