CN106085993B - 一种来源于葡萄藤伯克氏菌的酰胺酶、基因、菌株及其应用 - Google Patents

一种来源于葡萄藤伯克氏菌的酰胺酶、基因、菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于葡萄藤伯克氏菌的酰胺酶、基因、菌株及其应用，所述重组酰胺酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示；所述的应用以含重组酰胺酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体分离纯化制备的纯酶为催化剂，以3,3,3‑三氟‑2‑羟基‑2‑甲基丙酰胺为底物，以pH为7～10的缓冲液为反应介质构成转化体系，在60‑80℃条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(R)‑3,3,3‑三氟‑2‑羟基‑2‑甲基丙酸。本发明底物浓度为200g/L，酶活为753.5U/mg(Co2+存在条件下)，与已报道的酰胺酶相比，其底物浓度提高了2倍，酶活提高了近400倍。

Description

一种来源于葡萄藤伯克氏菌的酰胺酶、基因、菌株及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种葡萄藤伯克氏菌，编码酰胺酶的酰胺酶基因、编码酶蛋白，含有该基因的重组载体以及转化得到的重组基因工程菌及其在催化3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺水解制备(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸中的应用。
(二)背景技术
酰胺酶(Amidase,EC 3.5.1.4)可催化各类天然、非天然酰胺类化合物水解生成相应羧酸和氨。近年来，酰胺酶因其高立体选择性、广底物谱、高催化效率等优势，已成为制备手性羧酸和酰胺衍生物的重要生物催化剂，日益受到工业界的重视。目前，酰胺酶已成功用于多个手性药物中间体如(S)-2,2-二甲基环丙甲酰胺(ZL200510061680)和(S)-哌嗪-2-甲酸(US5945534)等的工业化生产。
3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸(3,3,3-trifluoro-2-hydroxy-2-methyl-propionic acid)，是一种重要的医药中间体，其S型或R型单体均可用于系列药物的手性合成。如S型单体可用于制备新型ATP敏感性钾(KATP)通道开放剂，治疗哮喘、尿失禁等；R型单体可用于合成一系列丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)抑制剂。PDK抑制剂通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶的活力可显著提高丙酮酸合成乙酰辅酶A效率，降低血液中葡萄糖含量，从而对肥胖、糖尿病及先天性乳酸血症起治疗作用。此外，(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸还可用于合成一系列缓激肽拮抗剂，用于治疗疼痛和炎症等。
Konigsberger等采用枯草芽孢杆菌蛋白酶subtilisin水解外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸甲酯(乙酯)制备(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸(Tetrahedron-Asymmetry,1999,10:679–687)，但产物光学纯度低，ee值仅为33％；Walter等利用Candidalipolytica酯酶催化外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸乙酯生成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸和(S)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸乙酯(DE19725802A1)，但该路线同样存在产物光学纯度低的问题。瑞士Lonza公司Shaw等采用Klebsiella oxytoca来源重组酰胺酶动力学拆分外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺合成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸(US7553652)，存在酰胺酶酶活、底物浓度及过程时空产率低等问题。
因此，筛选立体选择性严格、酶活高、底物耐受强且稳定性好的生物催化剂对实现(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的工业化生产具有重要意义。
(三)发明内容
本发明的目的在于针对目前酶法合成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸存在酶活低、底物耐受差等缺陷，提供一种高活力、高立体选择性及高底物耐受的酰胺酶产生菌，表达所述酰胺酶的基因、含有该酰胺酶基因的重组载体、该重组载体转化得到的基因工程菌，及其在催化3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺(TFHMM)生成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸((R)-TFHMA)中的应用。
本发明采用的技术方案：
本发明提供一种来源于葡萄藤伯克氏菌的重组酰胺酶，所述重组酰胺酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。所述重组酰胺酶源自葡萄藤伯克氏菌(Burkholderiaphytofirmans)ZJB-15079，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2016260，保藏日期2016年5月11日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
任何对SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有酰胺酶活性的，仍属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种所述重组酰胺酶编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQID NO.3所示。该酰胺酶基因从所述B.phytofirmans ZJB-15079中通过基因挖掘的方法获得，具体为：与筛选获得的B.phytofirmans ZJB-15079同源性较高的B.phytofirmans PsJN(GenBank登记号为No.CP001053)全基因组筛选模板，利用基因挖掘的手段有针对性地筛选一批假定的酰胺酶、乙酰胺酶序列，并设计引物。以所述B.phytofirmans ZJB-15079的基因组为模板，通过PCR技术将选定的酰胺酶序列进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞。
本发明的酰胺酶基因具体制备方法为：根据GenBank中收录的预测为酰胺酶、乙酰胺酶的基因序列设计合成引物，共筛选5段基因序列克隆，如表1所示。然后以B.phytofirmans ZJB-15079基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行基因扩增，最终获得一段具有R-选择性水解3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺活力的酰胺酶基因序列bp-ami，全长987bp。其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。该序列编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
表1酰胺酶及酰胺酶引物序列
如本领域技术人员所知，本发明的酰胺酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。
任何对SEQ ID NO.3所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种包含所述重组酰胺酶基因的重组表达载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本发明的酰胺酶核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-28a。较佳地，可通过下述方法获得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的酰胺酶基因产物bp-ami与载体pUC57连接形成克隆载体。该克隆载体经限制性内切酶NcoI/HindⅢ双酶切，切胶回收后与同样经酶切处理回收的pET-28a连接，构建本发明的酰胺酶基因重组表达质粒pET28a-bp-ami。
本发明涉及一种由重组酰胺酶编码基因构建的基因工程菌，可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本发明的酰胺酶基因可以有效表达。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将重组质粒pET28a-bp-ami转化至E.coli BL21(DE3)中，获得工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bp-ami。
本发明所述重组酰胺酶的制备方法，包括如下步骤：培养本发明的重组表达转化体，诱导获得重组酰胺酶。其中，所述的培养重组表达转化体所用的培养基可以是本领域可使转化体生长并产生本发明的酰胺酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为水，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊限制，只要使转化体能够生长并产生酰胺酶即可。优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-bp-ami接种至含卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.5～0.7时，在终浓度为0.1～1.0mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，即可高效表达本发明的重组酰胺酶。
此外，本发明还提供一种重组酰胺酶在立体选择性水解外消旋3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺制备(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸中的应用。所述的方法是利用构建的重组大肠杆菌表达酰胺酶，以该酶或表达该酶的重组大肠杆菌细胞为催化剂催化3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺动力学水解合成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸，反应方程式如下：
进一步，所述的应用以含重组酰胺酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体分离纯化制备的纯酶为催化剂，以3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺为底物，以pH为7～10的缓冲液为反应介质构成转化体系，在60-80℃、200rpm条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。
进一步，所述缓冲液为pH 8.0～8.5、0.02～0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液。
进一步，所述催化剂为湿菌体时，湿菌体用量以缓冲液体积计为0.5～5g/L，所述催化剂为纯酶时，纯酶用量以缓冲液体积计为2～84mg/L(优选2～5mg/L)，所述底物用量以缓冲液体积计为5～200g/L。
进一步，所述转化体系中还添加有促进剂，所述促进剂为下列之一：Ni2+、Ba2+、Co2 +、Mg2+，优选Co2+、Ni2+。所述促进剂添加量以缓冲液体积计为1mM。
进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含重组酰胺酶编码基因的重组基因工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以体积浓度1％接种量接种到含50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37℃，150rpm培养至菌体浓度OD600至0.4-0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃，8000rpm离心10min，收集湿菌体；将湿菌体悬浮于pH 8.0、20mM的Tris-HCl缓冲液中，振荡摇匀后置超声波(350W)下破碎15min，破碎液于12,000rpm离心10min，收集上清液即粗酶液；采用Ni-NTA分离，先用上样平衡缓冲液平衡Ni-NTA柱，以1.5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液洗脱，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集目标蛋白，目标蛋白以20mM，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液为透析液，透析过夜，更换2次透析液，收集截留液，即为纯酶；所述上样平衡缓冲液为含500mM NaCl和20mM咪唑的pH 8.0、20mM Tris-HCl缓冲液，所述洗脱缓冲液为含500mM NaCl和500mM咪唑的pH 8.0、20mM的Tris-HCl缓冲液。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：获得了来源于B.phytofirmans的重组酰胺酶，并将其用于催化3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺合成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。底物浓度为200g/L，酶活为753.5U/mg(Co2+存在条件下)，与已报道的酰胺酶相比，其底物浓度提高了2倍，酶活提高了近400倍。
(四)附图说明
图1为Bp-Ami酰胺酶基因琼脂糖凝胶电泳图；其中，泳道1为DL2000 DNA Marker(从上至下条带大小分别为2000、1000、750、500、250、100bp)；泳道2为酰胺酶Bp-Ami基因片段；
图2为pET28a-bp-ami重组质粒物理图谱；
图3为Bp-Ami酰胺酶分离纯化SDS-PAGE图；泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2为未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-bp-ami，泳道3为IPTG诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-bp-ami，泳道4为纯化后的Bp-Ami；
图4为Bp-Ami酰胺酶催化3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺水解生成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的气相色谱图；
图5为重组大肠杆菌催化3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺水解生成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸反应进程。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：葡萄藤伯克氏菌ZJB-15079的筛选
1、菌株ZJB-15079的分离纯化
所述葡萄藤伯克氏菌来源于土壤样本，其分离主要包括以下步骤：将全国各地的85份土壤样本进行微生物筛选，将0.5克土样重悬于生理盐水(0.9％NaCl)，静置，吸取2.0mL的土壤悬液接种于装有48mL富集培养基的250mL三角瓶，置于30℃，200rpm的摇床培养48h后，再吸取2.0mL转接到新鲜的富集培养基中，继续培养48h；如此进行三轮富集，将富集培养液稀释多个梯度后涂布到分离平板上，获得单菌落；
具体的，使用的富集培养基以3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺为唯一氮源，其余各组分的组成为(g/L)：Na2HPO4·12H2O 1.5，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl2·2H2O0.01，FeSO4·7H2O 0.007，ZnSO4 0.0001，葡萄糖5，3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺1，溶剂为水，pH值自然(分离平板培养基组分同富集培养基，另加质量浓度2％琼脂)。
挑取的单菌落接种到发酵培养基，组份如下(g/L)：Na2HPO4·12H2O 7，KH2PO4 2，MgSO4·7H2O 0.4，CaCl2·2H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.008，NH4Cl 2，葡萄糖5，3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺0.5，溶剂为水，pH 7.0。接种后的培养基于30℃，200rpm，摇瓶培养24h，离心后，取约0.5g湿菌体悬浮于10mL、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入终浓度为5g/L的3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺作为底物，35℃进行转化。用手性毛细管气相色谱法分析产物(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸的对映体过量值(ee值)。对产物ee值超过95％的菌株ZJB-15079进行进一步的菌种生理生化鉴定。
2、菌株ZJB-15079的菌种鉴定：
(1)菌落形态：30℃在发酵培养基平板(发酵培养基添加质量浓度2％琼脂)培养24h，菌落呈圆形，光滑湿润、乳白色、边缘整齐、表面隆起不透明。
(2)细胞形态：16h培养物的细胞呈短杆状，大小约为(1-2)μm×1μm。
(3)生理生化特征：革兰氏染色呈阴性，利用VITEK 2 Compact(GN)全自动细菌鉴定及药敏分析系统对该菌株生理生化特征鉴定结果见表2。
表2葡萄藤伯克氏菌ZJB-15079生理生化特征
aNotes:+＝95％to 100％positive；v＝6％to 94％positive；-＝0％to 5％positive
16S rDNA序列测定：用DNA提取试剂盒提取菌体的全基因组DNA，利用通用引物primer A 8F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCGA-3’)和primer B 1510R(5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增菌株的16S rDNA基因，再将PCR产物纯化后测序，所测得的序列如SEQ ID NO.1所述。该序列与GenBank中相关数据进行相似性分析，结果表明，菌株ZJB-15079的16S rDNA基因与伯克氏菌属(Burkholderia)的部分菌株序列同源性较高。其中，与Burkholderia phytofirmans PsJN(GenBank登记号为No.NR_102845)同源性最高(序列同源性98％)。
综合生理生化特征及分子生物学鉴定，确定该菌株为葡萄藤伯克氏菌(Burkholderia phytofirmans)，该菌株命名为葡萄藤伯克氏菌(Burkholderiaphytofirmans)ZJB-15079。
实施例2：bp-ami酰胺酶基因的获得
用DNA提取试剂盒提取B.phytofirmans ZJB-15079菌体的全基因组DNA，以该DNA为模板，引物1(CCATGGGCATGAAATGGCTTGAAGAATCG)、引物2(AAGCTTTTACTTCAGGTAGTGCTTGGCGACC)为作用引物进行PCR扩增反应。PCR反应体系各组分加入量(总体积50μL)：10×Pfu DNA Polymerase Buffer 5μL，10mM dNTP mixture(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)1μL，浓度为50μM的克隆引物1、引物2各1μL，基因组DNA 1μL，PfuDNA Polymerase 1μL，无核酸水40μL。PCR反应条件为：预变性94℃ 5min，然后进入温度循环94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。
取50μL PCR反应液用0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。切胶回收该片段并纯化，利用Taq DNA聚合酶向片段5’端引入碱基A。利用TaKaRa公司PMD-18T试剂盒将该片段同T载体进行连接，得到克隆重组质粒pMD18-T-bp-ami。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，随机挑取单菌落测序，利用软件分析测序结果：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为978bp(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，该序列编码一个完整的开放阅读框。利用软件对该基因序列进行分析，推知所述酰胺酶基因编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
将酰胺酶基因bp-ami片段同pUC57载体进行连接，得到克隆重组质粒pUC57-bp-ami。将该重组质粒转化至大肠杆菌JM109中，随机挑取单菌落测序，得到核苷酸序列如SEQID NO.3所示的基因。
培养含重组质粒pUC57-bp-ami的E.coli JM109菌体，利用质粒提取试剂盒提取质粒pUC57-bp-ami，经过限制性内切酶NcoI/HindⅢ(Fermentas)进行双酶切，切胶回收后用T4连接酶(Promega)将该片段同用相同限制性内切酶处理的商业化载体pET-28a(Novagen)连接过夜，构建表达质粒pET28a-bp-ami。将pET28a-bp-ami中bp-ami的终止密码子定点突变，使表达的Bp-Ami尾部(C端)含pET28a中的组氨酸标签。
实施例3：基因工程菌E.coli BL21/pET28a-bp-ami的构建
将实施例2中构建的重组表达载体pET28a-bp-ami转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布含50μg/mL卡那霉素的LB平板，于37℃下培养过夜。随机挑取克隆进行菌落PCR鉴定，阳性克隆测序验证。结果表明重组表达载体pET28a-bp-ami成功转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)中，且酰胺酶基因已成功克隆至pET-28a的NcoI和HindⅢ位点。
实施例4：重组酰胺酶的诱导表达
实施例3构建的工程菌E.coli BL21/pET28a-bp-ami接种至含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，150rpm培养至菌体浓度OD600至0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃，8000rpm离心10min，收集菌体。
以未诱导的E.coli BL21(DE3)/pET28a-bp-ami作为对照，分别取20μL培养液与2×SDS-PAGE上样缓冲液混合后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳分析。图3表明，经IPTG诱导后在38kD附近出现明显表达条带，与目的蛋白大小吻合，进一步证明工程菌构建成功。
实施例5：重组酰胺酶的分离纯化和酶活测定
实施例4收集的菌体细胞悬浮于50mL Tris-HCl缓冲液(20mM，pH 8.0)中，振荡摇匀后置超声波(350W)下破碎(有效时间15min)。破碎液于12,000rpm离心10min去除细胞碎片，收集上清液(粗酶液)用于酶的后续的分离纯化。纯化柱为Ni-NTA，装柱体积为20mL，先用上样平衡缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl和20mM咪唑，pH 8.0)平衡Ni-NTA柱，以1.5mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液洗脱以除去未吸附的蛋白，最后用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl,500mM NaCl,和500mM咪唑，pH 8.0)洗脱收集目标蛋白。酶液在20mM，pH 8.0的Tris-HCl中透析过夜(更换2次透析液)，纯化后的酶液用SDS-PAGE进行分析。SDS-PAGE电泳见图4，结果表明经Ni-NTA亲和层析，得到电泳纯的Bp-Ami约80mg。
转化反应：反应体系为1mL，以Tris-HCl缓冲液(20mM,pH 8.0)为反应介质，终浓度为2.5μg/mL的电泳纯Bp-Ami，终浓度为10g/L的3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺。80℃反应12min测定酶活力。反应完成后，取100μL反应液加10μL HCl(1M)终止反应，后加1000μL乙酸乙酯震荡萃取，12000rpm离心，取800μL上层有机相加40μL甲醇和40μL三甲基硅烷化重氮甲烷混合后于气相色谱GC-14C分析转化率及产物ee值。气相色谱分析条件为：BGB-174手性毛细管气相色谱柱，高纯氦气为载气，流速1.5mL/min，进样量1μL，分流比30:1；检测器及进样口温度均为220℃，柱温为80℃保留3min，10℃/min程序升温至160℃，保留7min。
酶活(U)定义：在80℃，pH 8.0的条件下，每分钟生成1微摩尔(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸所需的酶量。比酶活指每毫克酶蛋白所具有的酶活，U/mg。经测定，电泳纯Bp-Ami的比酶活为19.9U/mg。
实施例6：金属离子对重组酰胺酶酶活的影响
以实施例5中收集的重组酰胺酶(即电泳纯Bp-Ami)为催化剂，在Cu+,Fe2+,Ni2+,Ca2 +,Ba2+,Cu2+,Mn2+,Zn2+,Co2+,Mg2+和EDTA的存在下，催化底物3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺立体选择性水解生成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。生物催化体系组成及操作如下：1mL反应体系，以Tris-HCl(pH＝8.5，50mM)为反应介质，金属离子及EDTA终浓度为1mM，Bp-Ami添加量为4.12μg/mL(无金属离子添加的对照体系的Bp-Ami添加量为82.4μg/mL)，底物浓度为40g/L。80℃恒温反应，转速为200rpm。酶活力测定表明，Co2+的添加对酶活提高具有显著影响，其酶活可达纯酶的37.7倍，Ni2+的添加也同样具有提高酶活的效果(约10倍)。结果如表3所示：
表3金属离子对重组酰胺酶影响
实施例7：含有重组酰胺酶的重组大肠杆菌水解3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺
以实施例4中收集的重组酰胺酶工程菌湿菌体为生物催化剂，催化底物3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺立体选择性水解生成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。生物催化体系组成及操作如下：称取0.01g湿菌体悬浮于2mL Tris-HCl缓冲液中(pH＝8.5，50mM)，加入0.2g 3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺(终浓度100g/L)，80℃恒温反应10分钟，转速为200rpm。以E.coli BL21(DE3)为对照，结果如表4所示：
表4酰胺酶催化3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺结果
实施例8：重组大肠杆菌水解3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺(含1mM Co2+)
以实施例5中收集的重组酰胺酶工程菌湿菌体为生物催化剂，催化底物3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺立体选择性水解生成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。生物催化体系组成及操作如下：称取0.5g湿菌体悬浮于10mL Tris-HCl缓冲液中(pH＝8.5，50mM)，制成终浓度为50g/L的菌液。取20μL、80μL及200μL上述菌液至2mL加入Tris-HCl缓冲液中(pH＝8.5，50mM)中，使菌体终浓度为0.5g/L、2g/L及5g/L。在各体系中加入0.4g 3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺(终浓度200g/L)，添加终浓度为1mM的Co2+，80℃恒温反应，转速为200rpm。催化结果见图5。当体系催化剂浓度为5g/L时，10分钟反应后，体系转化率可达42.95％，产物ee值为95.22％。

Claims (7)

1.一种来源于葡萄藤伯克氏菌的重组酰胺酶在合成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸中的应用，其特征在于所述重组酰胺酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述来源于葡萄藤伯克氏菌的重组酰胺酶编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用以含所述重组酰胺酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体分离纯化制备的纯酶为催化剂，以3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酰胺为底物，以 pH为7~10的缓冲液为反应介质构成转化体系，在60-80℃条件下进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述催化剂为湿菌体时，湿菌体用量以缓冲液体积计为0.5~5 g/L，所述催化剂为纯酶时，纯酶用量以缓冲液体积计为2~84 mg/L，所述底物用量以缓冲液体积计为5~200 g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化体系中还添加有Co2+或Ni2+作为促进剂，所述促进剂添加量以缓冲液体积计为1 mM。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述纯酶按如下方法制备：将含重组酰胺酶编码基因的重组基因工程菌接种至含50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 oC培养过夜，再以体积浓度1%接种量接种到含50 μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，37 oC，150 rpm培养至菌体浓度OD600至0.4-0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，28 oC诱导培养12 h后，4 oC，8000rpm离心10 min，收集湿菌体；将湿菌体悬浮于pH 8.0、20 mM的Tris-HCl缓冲液中，振荡摇匀后置350W超声波条件下破碎15 min，破碎液于12,000 rpm离心10 min，收集上清液即粗酶液；采用Ni-NTA分离，先用上样平衡缓冲液平衡Ni-NTA柱，以 1.5 mL/min的速率上样粗酶液，用上样平衡缓冲液洗脱，最后用洗脱缓冲液洗脱，收集目标蛋白，目标蛋白以20 mM，pH 8.0的Tris-HCl缓冲液为透析液，透析过夜，更换2次透析液，收集截留液，即为纯酶；所述上样平衡缓冲液为含500 mM NaCl和20 mM咪唑的pH 8.0、20 mM Tris-HCl缓冲液，所述洗脱缓冲液为含500 mM NaCl和500 mM咪唑的pH 8.0、20 mM 的Tris-HCl缓冲液。
7.一种权利要求1所述来源于葡萄藤伯克氏菌重组酰胺酶的供体菌在合成(R)-3,3,3-三氟-2-羟基-2-甲基丙酸中的应用，其特征在于所述供体菌为葡萄藤伯克氏菌（Burkholderia phytofirmans ）ZJB-15079，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2016260，保藏日期2016年5月11日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
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