CN105039366B - 一种密码子优化的磷酸胆碱胞苷转移酶的基因及其表达 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于大肠杆菌密码子偏爱性构建的磷酸胆碱胞苷转移酶的cct基因及其表达。所述优化的cct基因采用全合成方法获得，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述基因全长1275bp，编码424个氨基酸，优化后的cct基因与野生基因的同源性为76.6％，优化后cct基因与载体pET‑29a(+)连接得到重组载体pET‑29a‑cct‑op，将该重组载体转化大肠杆菌。经IPTG诱导表达、酶活检测，获得经偏好性改造能高效表达磷酸胆碱胞苷转移酶的工程菌株。本发明的优点在于通过对酿酒酵母cct基因按大肠杆菌密码子偏好重新设计提高了大肠杆菌表达磷酸胆碱胞苷转移酶的效率，可用于胞磷胆碱的生产，提高工业产值，为企业带来经济效益。
Description
技术领域
本发明属微生物技术领域，具体涉及一种按大肠杆菌偏爱密码子优化的磷酸胆碱胞苷转移酶（Cholinephosphate cytidylyltransferase，EC 2. 7. 7. 15，CCT）的基因及其表达。
背景技术
胞磷胆碱（cytidine-5'-diphosphate choline）是一种重要的核酸衍生物，是卵磷脂生物合成的主要辅酶，能够促进脑细胞呼吸，恢复神经组织功能，改善脑代谢和循环，可用于治疗脑血管病、帕金森氏综合症、抑郁症，对于治疗颅脑损伤和脑血管意外所导致的神经系统疾病具有明显的疗效。其对延缓衰老，提高学习效果和记忆力等也有一定的疗效，因此在临床上得到广泛的应用。
关于胞磷胆碱合成的报道较多，主要包括化学合成、生物合成方法制备。化学合成通常需要先制备一些中间体，工艺繁琐且生产成本过高，其操作要求严格，转化率也不高。
生物合成方法利用磷酸胆碱酸转移酶（CCT酶）在温和的条件下，直接催化胞苷三磷酸（CTP）和磷酸胆碱合成胞磷胆碱。生物合成转化率高、成本低且操作简便。因此，近年胞磷胆碱的生产大多都集中在生物合成。
作为参与胞磷胆碱生物合成反应的微生物需具有高活性的 CCT 酶，而微生物细胞中 CCT 酶的活性普遍较低，CCT 酶就成了控制 CDP-胆碱合成的限速酶。
偏爱密码子的使用能够较大幅度提高基因的表达水平。本发明按照大肠杆菌偏爱密码子优化酿酒酵母磷酸胆碱胞苷转移酶基因并构建高效表达菌株，若该菌用于工业化生产，能极大提高工业产值并为企业带来显著经济效益。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种按大肠杆菌偏爱密码子优化的磷酸胆碱胞苷转移酶cct 基因。
本发明还要解决的问题是提供上述基因的表达。
为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案来实现。
一种按大肠杆菌偏爱密码子优化的磷酸胆碱胞苷转移酶基因（cct 基因），其核苷酸序列SEQ ID NO:1所示。
本发明按照大肠杆菌的密码子偏好性对野生型cct基因进行改造，改造后的基因序列与野生型序列同源性为76.6%（图1），其编码的蛋白质共424个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO : 2所示。
本发明中经密码子优化磷酸胆碱胞苷转移酶cct 基因委托南京拓达生物科技有限公司进行全基因合成，基因合成服务中使用pUC57质粒作为亚克隆载体。
一种重组载体，它含有权利要求1所述的核苷酸序列，如SEQ ID NO : l所示。
一种重组菌，它含有权利要求4或5所述的重组载体。
上述重组菌的构建方法，cct基因由全基因合成，将cct基因偏好序列插入pET29a(+)的多克隆位点处得到的重组质粒，所述表达载体中启动所述DNA转录的启动子为T7启动子。再将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)和 Rosetta(DE3)中。具体方法是：合成全基因序列时，分别在5’和3’端引入Nde I和Xho I酶切位点，将质粒pUC57-cct-op双酶切，回收cct-op片段，将cct-op片段用T4 DNA连接酶连接到pET-29a(+) 载体相应的酶切位点上，通过酶切鉴定及测序验证获得了重组质粒pET-29a-cct-op。采用化学转化的方法将重组质粒pET-29a-cct-op转化到大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta (DE3)中，获得重组菌。
上述重组菌的表达方法，培养重组菌至OD600为0.6-0.8时添加终浓度0.2 - 1mM的IPTG，在28℃，220 rpm条件下诱导10 - 24h。
获得重组菌细胞粗酶液，粗酶液的反应条件为: 1 mL 终浓度为 150 mmol/L 磷酸钾缓冲液( pH 7. 5) 、25 mmol/L 氯化镁、10 mmol/L CTP、20 mmol/L磷酸胆碱及粗酶液组成的反应液， 30 ℃反应2 h。定时 0. 5 h 取样，每次取 50 μL 反应液，添加 50 μL0. 2 mmol / L 醋酸后，通过在 100 ℃ 加热处理 2 min 中止反应。冷却后将该处理物12000 r/min 离心10 min，用适量的蒸馏水稀释上清液，用高效液体色谱( HPLC) 定量生成的CDP-胆碱。
本发明按照大肠杆菌的密码子偏好性优化了来源于酿酒酵母的原始的cct基因，改造后的基因序列与原序列同源性为76.6% (参见图1)，其编码的蛋白质含424个氨基酸与野生型序列一致，密码子优化后的cct基因转化如大肠杆菌后表现出较高的酶活。
本发明的优点在于使用大肠杆菌偏爱密码子优化的cct基因的编码序列来制备表达质粒，优化后的cct基因与野生基因的同源性为76.6%，表现出较高的粗酶液酶活，可应用于磷酸胆碱的合成。
附图说明
图1为密码子优化的磷酸胆碱胞苷转移酶cct基因构建图。
图2 为本发明优化的磷酸胆碱胞苷转移酶cct基因和原始酿酒酵母磷酸胆碱胞苷转移酶cct基因的序列比对图。
图3 为密码子优化前后的mRNA二级结构对比。其中，a为密码子优化前，b为密码子优化后。
具体实施方式
下面结合具体实施方式来进一步阐述本发明。
本发明实施中未注明的实验方法，如连接、转化、相关培养基的配制等参照分子克隆实验指南第三版中方法进行。分子试剂购自大连Takara公司，未注明的化学药品为分析纯级，购自上海国药集团有限公司。
实施例1 重组大肠杆菌的构建。
1.1密码子优化磷酸胆碱胞苷转移酶基因的密码子优化及全基因合成。
本发明根据来源于酿酒酵母磷酸胆碱胞苷转移酶cct基因序列，采取全基因合成的方法按照大肠杆菌偏爱密码子优化的磷酸胆碱胞苷转移酶基因，委托南京拓达生物科技有限公司合成，基因合成服务中使用pUC57质粒作为亚克隆载体，用于磷酸胆碱胞苷转移酶基因大肠杆菌偏爱密码子优化合成的磷酸胆碱胞苷转移酶基因的开放阅读框为1275个碱基。通过Vector NTI软件进行同源性比对，结果发现该合成序列与原序列同源性为76.6%（参见图1），其编码的蛋白质共424个氨基酸。用DNAstar对优化前后的cct基因的mRNA二级结构进行预测，结果显示优化后的mRNA二级结构比优化前简单（见图3），配对碱基数从364减少到333个，茎的结构从87减少到79个，有利于蛋白翻译过程中核糖体与mRNA的结合和快速翻译。
优化后的磷酸胆碱胞苷转移酶基因序列为南京拓达生物科技有限公司合成，质粒命名为pUC57-cct-op。
1.2带有质粒pET-29a-cct-op的大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta (DE3)的构建。
将基因合成的pUC57-cct-op质粒采用Nde I/Xho I双酶切。酶切后的片断采用0.8%琼脂糖凝胶电泳分离pUC57载体骨架与cct-op片段，并切割大小约1200bp左右的基因片段。切割后的凝胶采用胶回收试剂盒进行纯化。
pET-29a(+)质粒用Nde I/Xho I双酶切。0. 8%琼脂糖电泳分离线性化载体，并用胶回收试剂盒回收纯化的pET-29a (+)线性载体。
将回收的pET-29a (+)线性化载体与纯化的cct-op片段用T4 DNA连接酶连接过夜。用连接产物通过热击转化的方法转化大肠杆菌DH5α。涂布筛选阳性重组子。从平板上挑选单菌落，LB液体培养基(含卡那霉素)37℃，220rpm培养12h。提取质粒后采用双酶切鉴定重组子。
双酶切验证正确的质粒由上海美吉测序公司测序，测序结果正确的质粒命名为pET29a-cct-op，提取质粒采用热击转化的方法转化至大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)的感受态中，构建完成BL21(DE3)/ pET-29a-cct-op和Rosetta (DE3) / pET29a-cct-op。
实施例2 密码子优化的磷酸胆碱胞苷转移酶的诱导表达。
2.1重组菌BL21(DE3)/ pET-29a-cct-op和Rosetta (DE3) / pET-29a-cct-op的诱导表达。
菌种活化：在超净工作台上将重组菌L21(DE3)/ pET-29a-cct-op和Rosetta(DE3) / pET-29a-cct-op在含卡那霉素LB固体平板上划线分离单菌落，于恒温培养箱内37℃培养过夜。
种子培养：无菌状态下，挑取平板上单菌落，接入添加了卡那霉素的3mL 的LB液体培养基的试管中，在摇床上37℃恒温培养12h，转速200rpm。
诱导表达：将种子液以2% (v/v)接种量转接入50ml含有卡那霉素的LB培养基的三角瓶（250ml）中。在37℃摇床220rpm 增殖2. 5-3h 至OD600至0.6 - 0.8，添加终浓度0. 5mM的IPTG。再置于28 ℃下220rpm诱导。
诱导表达后，取1 mL培养液，于12000 r/min，2 min，收集菌体并重悬于100 μL 1×SDS加样缓冲液，沸水浴中煮沸10 min以充分裂解细胞，12000 r/min室温离心10 min使细胞碎片及DNA等沉淀，取适量溶液上样，SDS-PAGE 分析。
2.2 磷酸胆碱胞苷转移酶在大肠杆菌中表达产物的酶活测定。
粗酶液的制备：将供试菌株接种至3 mL LB 液体培养基（含卡那霉素50 μg/ mL），于37℃培养过夜后，取1 mL菌液转接到LB培养基中，IPTG（1mmol/L）诱导表达，28℃震荡培养10 h。取3 mL培养液离心分离后，弃上清液，将菌体重悬于500 μL 20 mmol/L的磷酸钾缓冲液（pH7.0）中，加入20 μL二甲苯搅拌，30℃处理10 min，此二甲苯处理物即作为粗酶液使用。
反应体系：1 mL终浓度为150 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.5）、25 mmol/L氯化镁、10mmol/L CTP、20 mmol/L磷酸胆碱及粗酶液组成的反应液，在30℃进行2 h反应。定时0.5 h取样，每次提取50 μL反应液，添加50 μL 0.2 mmol/L醋酸后，通过在100℃加热处理2 min中止反应。冷却后将该处理物12000 r/min离心10 min，用适量的蒸馏水稀释上清液，用高效液体色谱（HPLC）定量生成的CDP-胆碱。
HPLC条件：色谱柱为 Hypersil ODS2 5 μm，4.6×250 mm。色谱条件为流动相：磷酸盐缓冲液[0.0625 mol/L的磷酸二氢钾溶液（pH3.3）]，流速：0.45 mL /min，柱温 30℃，261 nm 条件下检测。至少重复三次得出的稳定数值作为统计数据。将1 min 生成1 μmol的 CDP-胆碱的酶量作为1 单位（U）计算 CCT 酶活性。
大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta (DE3) 在没有转化重组质粒的情况下，没有表现出CCT的酶活，重组菌BL21(DE3)/ pET29a-cct-op和Rosetta (DE3) / pET29a-cct-op的粗酶液中检测到的酶活力分别为0.11 U/mL和0.12 U/mL。本发明中的CCT表现出较高的酶活，具有很好的应用价值。
Claims (7)
1.一种DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求1所述的核苷酸序列。
3.权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，骨架为载体pET-29a（+）。
4.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌含有权利要求2或3所述的重组表达载体。
5.权利要求4所述的重组菌的构建方法，其特征在于，基因序列如SEQ ID NO:1所示的优化后编码磷酸胆碱胞苷转移酶基因由全基因合成，并克隆到pET-29a（+）载体的多克隆位点处得到重组质粒，再将重组质粒转化入E. coli BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中。
6.权利要求1所述DNA分子在CDP-胆碱合成中的应用。
7.权利要求3或4所述的重组表达载体或重组菌在CDP-胆碱合成中的应用。
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