CN105176955B - 来源于高山南芥的腈水解酶、基因、载体、工程菌及其应用 - Google Patents

来源于高山南芥的腈水解酶、基因、载体、工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于十字花科南芥属植物高山南芥(Arabis alpina)的腈水解酶、基因、载体、工程菌及其在合成(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸中的应用；本发明所述含腈水解酶Aa‑Nit的静息细胞能够动力学拆分1.2M的IBSN，15h内转化率可达42％左右，产物ee值99％以上；本发明提供了一种区域、立体选择性水解制备(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸的新腈水解酶；本发明中所述(S)‑3‑氰基‑5‑甲基己酸的制备方法具有原子经济性高、条件温和、环境友好等优点，具有较高的工业化应用潜力。

Description

来源于高山南芥的腈水解酶、基因、载体、工程菌及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种(S)-3-氰基-5-甲基己酸合成方法，特别涉及一种来源于高山南芥(Arabis alpina)的腈水解酶及其在合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。
(二)背景技术
普瑞巴林(Pregabalin，简称PGB)，化学名(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸(Ⅰ)，是γ-氨基丁酸的3位异丁基取代物(Angew.Chem.Int.Ed.2008,47:3500-3504)。普瑞巴林对癫痫、神经病理性疼痛有良好的疗效，且具有使用剂量低、服用次数少、副作用小、持续时间长、耐受性强等特点，已成为全球畅销药市场的“重磅炸弹”。
(S)-3-氰基-5-甲基己酸(Ⅱ)是合成普瑞巴林的关键手性中间体，经一步催化加氢即可制得普瑞巴林。Pfizer公司开发的第二代普瑞巴林化学-酶法合成工艺以2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为原料，经脂肪酶拆分、脱羧和碱水解合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸(Org.Process Res.Dev.2008,12:392-398)。由于该工艺涉及脱羧和两次酯水解，原料利用率低。
腈水解酶(Nitrilase，EC 3.5.5.1)是一种重要的腈转化酶，能够高效催化腈化合物水解生成相应的羧酸和氨。腈水解酶生物催化具有严格的立体和区域选择性等独特优势，在高附加值医药化学品的合成中具有巨大应用潜力。Pfizer公司Xie等报道了Arabidopsis thaliana腈水解酶At-Nit1区域、立体选择性催化外消旋异丁基丁二腈水解合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸的方法(J.Mol.Catal.B:Enzym.2006,41:75-80)。该工艺原子经济性高，但At-Nit1酶活性较低。Pfizer公司专利WO2005100580显示在150mM底物浓度下，(S)-3-氰基-5-甲基己酸产率仅17.5％，另提供的NIT-102在400mM底物浓度下反应24h得到的产率仅有31.3％，底物浓度低、反应周期长等缺点导致其均难以实现工业化应用。因此，挖掘具有工业应用潜力的腈水解酶对(S)-3-氰基-5-甲基己酸绿色、高效生产具有重要意义。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种新的能够严格区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈(IBSN)制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸(图1)的新腈水解酶，而且该酶具有更高的催化活力和底物耐受能力，适用于工业化制备该手性中间体，在400mM底物浓度下，本发明所述腈水解酶在3h内底物转化率达42％以上。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种来源于十字花科南芥属植物高山南芥(Arabis alpina)的腈水解酶(Aa-Nit)，所述腈水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
任何对SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要其与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有95％以上同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明还提供一种所述腈水解酶的编码基因，为实现Aa-Nit在大肠杆菌等原核生物中的可溶性异源表达，通过基因工程常规操作，以全合成的方法获得了对应于所述SEQID NO：1氨基酸序列的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2所示。
任何对SEQ ID NO：2所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。
本发明还涉及一种由所述腈水解酶编码基因构建的重组载体，以及由所述重组载体转化获得的重组基因工程菌。
本发明还提供一种腈水解酶编码基因制备腈水解酶Aa-Nit的方法，所述方法是将含腈水解酶编码基因的载体导入宿主细胞，获得工程菌，然后将工程菌进行诱导培养，获得含腈水解酶基因的菌体细胞；具体包括以下步骤：(1)通过基因挖掘技术获得编码腈水解酶Aa-Nit的核苷酸序列。(2)将合成后的编码腈水解酶的基因片段构建到pET28b表达载体上，获得带有目的基因的重组质粒。(3)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌BL21(DE3))，获得相应的工程菌株。(4)将工程菌株接种至LB培养基中，培养至对数期并用0.1-0.2mM的IPTG于28℃诱导表达12小时。(5)收集菌液，取样进行SDS-PAGE电泳验证目的蛋白大小及表达情况(见图2)。
本发明还提供一种所述腈水解酶在催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。具体地，所述的应用以含腈水解酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋异丁基丁二腈为底物，以pH 5.0-10.0的缓冲液为反应介质(优选100mM、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液)，在25-45℃、150rpm条件下(优选30℃、150rpm)进行水解反应，反应完全后，获得含(S)-3-氰基-5-甲基己酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(S)-3-氰基-5-甲基己酸。所述催化剂的用量以湿菌体重量计为50g/L缓冲液，所述底物的终浓度以缓冲液体积计为0.15-1.5mol/L，优选为0.7-1.2mol/L。
本发明所述催化剂按如下方法制备：将含腈水解酶基因的工程菌(优选E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-Aa-Nit)接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃培养12h，再将培养液以2％(v/v)接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600约0.6左右(0.4-0.8)，再向培养液中加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、12000rpm条件下离心5min，收集湿菌体，即为催化剂。
本发明所述混合液分离纯化的方法为：反应结束后，将转化液离心去除大肠杆菌细胞，上清液减压蒸馏至1/3体积。80℃保温40min，使蛋白质变性，离心去除变性蛋白；为了更好地除去变性蛋白，可使用循环水式真空泵进行再次抽滤，收集澄清的滤液。然后加入2体积(蒸馏后样品)的乙酸乙酯进行萃取，收集下层水相。用2M HCl调节下层水相收集液pH至4.0。再次加入2体积的乙酸乙酯进行萃取，弃下层水相。收集上层有机相并进行旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到呈油状的(S)-3-氰基-5-甲基己酸。
本发明的优点主要体现在：本发明提供了一种区域、立体选择性水解制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸的新腈水解酶，所述含腈水解酶Aa-Nit的静息细胞能够动力学拆分1.2M的IBSN，15h内转化率可达42％左右，产物ee值99％以上(图3)。本发明中所述(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制备方法具有原子经济性高、条件温和、环境友好等优点，具有较高的工业化应用潜力。
(四)附图说明
图1为腈水解酶Aa-Nit不对称拆分IBSN催化反应示意图。
图2为腈水解酶Aa-Nit的SDS-PAGE图谱；M：蛋白质分子量标记，1：诱导表达目的蛋白。
图3为腈水解酶Aa-Nit动力学拆分IBSN的气相检测图谱。
图4为催化反应体系pH的优化结果图。
图5为催化反应体系温度的优化结果图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例所用主要实验材料来源为：
大肠杆菌宿主菌株E.coli BL21(DE3)购自Invitrogen公司，表达载体pET-28b(+)购自Novagen公司，限制性内切酶Xho I和Xba I购自Fermentas公司，T4DNA连接酶和卡那霉素均购自大连宝生物有限公司；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)为Promega公司产品。DNA Marker和染色剂Gold View购自TaKaRa公司；Axygen DNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Axygen生物技术有限公司。
实施例1：腈水解酶Aa-Nit的制备方法
(1)腈水解酶Aa-Nit氨基酸序列、核酸序列的获得：利用蛋白质PDB数据库和NCBI数据库数据对腈水解酶基因序列进行筛选，得到一个腈水解酶氨基酸序列(Genbank编号KFK44999.1)。该腈水解酶来源于十字花科南芥属植物高山南芥(Arabis alpina)，根据该腈水解酶的氨基酸序列，并依据大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，根据表达载体pET28b(+)的特点设计了酶切位点Xho I和Xba I，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了该段腈水解酶核苷酸(SEQ ID NO：2所示)，编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
(2)重组工程菌的构建：利用Xho I和Xba I限制性内切酶对基因片段进行双酶切以及回收处理，并利用T4DNA连接酶将该片段与用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET28b(+)在16℃下连接16h，从而构建得到胞内重组表达载体pET28b(+)-Aa-Nit。将构建的胞内表达载体pET28b(+)-Aa-Nit转化至E.coli BL21(DE3)(Invitrogen)受体菌中，涂布于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB琼脂平板上，37℃下培养过夜，第2天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(3)腈水解酶Aa-Nit的诱导表达：将构建好的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-Aa-Nit接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃培养12h，再以2％接种量(v/v)接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600约0.6左右，再向LB液体培养基中加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、12000rpm条件下离心5min，收集湿菌体(即为静息细胞，用于水解反应)。用0.85％的生理盐水清洗两遍，混匀，将所得菌液用于SDS-PAGE电泳检测，结果见图2所示。
实施例2：含腈水解酶Aa-Nit的静息细胞的催化条件
考察了含腈水解酶Aa-Nit的静息细胞催化的最适pH值、最适反应温度、pH稳定性以及最高底物耐受浓度。
催化反应体系(10mL)：10mL缓冲溶液为反应介质，以外消旋异丁基丁二腈为底物，以含腈水解酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂构成反应体系；所述底物浓度为0.4mol/L缓冲液，所述反应体系中生物催化剂的质量用量以湿菌体的重量计为20g/L缓冲液，所述湿菌体含水质量为70～90％，在恒温水浴摇床中启动反应。30℃、150rpm反应半小时后以2M HCl终止反应。终止反应后，通过气相色谱测定反应中IBSN的转化率来确定静息细胞催化能力的大小。
(1)最适反应pH值得测定：采用上述催化反应体系，底物浓度为0.4mol/L缓冲液，湿菌体用量为20g/L缓冲液，反应温度30℃，测定在一系列不同pH值(pH＝5、5.5、6、6.5、7.2、7.5、8、8.5、9、9.5、10)反应介质中底物IBSN的转化率。不同pH范围所用的缓冲液为：醋酸缓冲液(pH5.0-6.0)、磷酸钠缓冲液(pH 6.0-7.2)、Tris-HCl缓冲液(pH 7.0-9.0)和Gly-NaOH缓冲液(pH 9.0-10.0)。
(2)最适反应温度的测定：采用上述催化反应体系，选用Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 8.0)，底物浓度为0.4mol/L缓冲液，湿菌体用量为20g/L缓冲液，测定在一系列不同反应温度(25、30、35、40、45℃)下底物的转化率。
(3)最高底物耐受浓度的测定：采用上述催化反应体系，选用Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 8.0)和30℃的反应温度，湿菌体用量为20g/L缓冲液，测定在一系列不同底物浓度(150mM、300mM、450mM、600mM、700mM、1M、1.2M、1.5M)下的转化率。
结果显示：含腈水解酶AaNit的静息细胞在弱碱性条件下催化活力较高，其最适反应pH值为8.0；最适反应温度为30℃；耐受最高底物浓度为1.2M。
实施例3：含腈水解酶Aa-Nit静息细胞的应用
动力学拆分IBSN消旋体：反应示意图如图1所示。反应条件：反应体系10mL，在10mLTris-HCl缓冲液(100mM，pH8.0)中，加入1.2M消旋体IBSN，以及0.5g(湿重)的含腈水解酶Aa-Nit的静息细胞(实施例1制备)，置于30℃水浴摇床中，150rpm反应15h。每隔3h取样，每次取500μL样品，加入200μL 2mol/L HCl中止反应，并用800μL乙酸乙酯萃取，振荡后离心(12000×g，2min)，吸取上清，在上清液中加入无水硫酸钠干燥，样品供气相色谱分析。
手性气相色谱检测对映体过量值以及IBSN转化率：反应液中底物及产物的含量由气相色谱法测定。气相色谱型号为GC-14C(Shimadzu，Japan)，所用毛细管柱型号为BGB-174(BGB Analytik，Switzerland)。色谱条件为：进样量1.0μL，进样口、检测器温度均为220℃，柱温为160℃保持30min；载气为氦气，流速为1.6mL/min，分流比为30:1。对映体过量值(ee)、转化率(c)的计算参考Rakels等(Enzyme Microb Technol,1993,15:1051)的计算方法。
(S)-3-氰基-5-甲基己酸的分离纯化：由催化反应体系获得的转化液，离心去除大肠杆菌细胞，减压蒸馏至1/3体积。80℃保温40min，使蛋白质变性，离心去除变性蛋白；为了更好地除去变性蛋白，可使用循环水式真空泵进行再次抽滤，收集澄清的滤液。然后加入2体积(蒸馏后样品)的乙酸乙酯进行萃取，收集下层水相。用2M HCl调节下层水相收集液pH至4.0。再次加入2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，弃下层水相。收集上层有机相并进行旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到呈油状的(S)-3氰基-5-甲基己酸(ee>99.5％)。
结果显示：含腈水解酶Aa-Nit的静息细胞在15h内动力学拆分1.2M消旋体IBSN的转化率在42％左右，产物ee值大于99％，说明本发明的腈水解酶Aa-Nit催化条件温和、反应转化率及产物光学纯度高，在(S)-3-氰基-5-甲基己酸的绿色合成中具有重要应用潜力。
上述实施例只为说明本发明的技术特点以及构思，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种来源于高山南芥(Arabis alpina)的腈水解酶在催化合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，其特征在于所述的应用以含腈水解酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以外消旋异丁基丁二腈为底物，以pH5.0-10.0的缓冲液为反应介质，在25-45℃、150rpm条件下进行水解反应，反应完全后，获得含(S)-3-氰基-5-甲基己酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(S)-3-氰基-5-甲基己酸；所述腈水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述催化剂的用量以湿菌体重量计为50g/L缓冲液，所述底物的终浓度以缓冲液体积计为0.15-1.5mol/L。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含腈水解酶基因的工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃培养12h，再将培养液以体积浓度2％的接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD600为0.4-0.8，然后向培养液中加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃诱导培养12h后，4℃、12000rpm条件下离心5min，收集湿菌体，即为催化剂。
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