CN101143890B - 新生牛牛脑活性肽与制备方法和在制备抗癌药物的应用 - Google Patents
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Abstract
新生牛牛脑活性肽与制备方法和在制备抗癌药物的应用，涉及一种多肽，尤其是涉及一种从自然界分离提取的新生牛牛脑活性肽和制备方法及其在制备抗癌药物中的应用。提供一种新生牛牛脑活性肽与分离提取方法及在制备抗癌药物中的应用。新生牛牛脑活性肽的组分由8种蛋白组成，其分子量介于10～35kD之间，分子量分别为33.1kD，30.6kD，25.3kD，23.6kD，18.6kD，14.4kD，13.1kD，11.7kD。先将新生牛牛脑匀浆，收集匀浆液；酸抽提后收集匀浆上清液，再冷冻干燥得新生牛牛脑酸抽提物；再进行阳离子交换层析及分子筛层析，纯化新生牛牛脑活性物质，收集含有新生牛牛脑天然活性肽组分。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽，尤其是涉及一种从自然界分离提取的新生牛牛脑活性肽和制备方法及其在制备抗癌药物中的应用。
背景技术
天然活性物质是现代生物学研究热点，现已发现其中含有多种抗肿瘤作用的化合物，而哺乳动物天然活性肽研究是天然活性物质研究的重要组成部分。牛脑中含有丰富的营养成分，富含高质量的蛋白质、脂肪、磷脂以及铁、钙、锌、硒、镁等多种微量元素，牛脑蛋白质中含有人体所需的一切氨基酸，且组成较平衡，特别是必需氨基酸，如赖氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸等含量较高(Verynei J P.New peptide and protein drugs[J].Pharmay world science，1996，18(3)：87-93)。牛脑脂肪酸中亚麻酸和花生四烯酸等不饱和脂肪酸含量也较高。国内外学者在其中发现了大量的生物活性物质，如神经降压素、钙调素、脑啡肽、内啡肽和神经肽等参与神经系统及其它机体系统调节功能的生物活性物质以及成纤维生长因子、胰岛素样生长因子I和脑源的神经营养因子等(Lupidi G，Venardi G，Bollettini M，et al.Purification and partialcharacterization of glyoxalase I from bovine brain.PREPARATIVE BIOCHEMISTRY&BIOTECHNOLOGY，2001，31(3)：305-316)。但是对细胞增殖分化相关的活性肽分离提取及作用机理的研究较为缺乏，至今未见有从自然界分离提取的新生牛牛脑活性多肽组份的报道。
发明内容
本发明旨在提供一种新生牛牛脑活性肽(Neonatal bovine brain bioactive peptides in peakI，NBBP-1)。
本发明的另一目的是提供一种新生牛牛脑活性肽(NBBP-1)的分离提取方法。
本发明的另一目的是提供新生牛牛脑活性肽(NBBP-1)在制备抗癌药物中的应用。
所述的新生牛是指最好出生后3d(即3天)内的新生牛。
所述的新生牛牛脑活性肽的组分由8种蛋白组成，其分子量介于10～35kD之间，分子量分别为33.1kD，30.6kD，25.3kD，23.6kD，18.6kD，14.4kD，13.1kD，11.7kD。
所述的新生牛牛脑活性肽的制备方法包括以下步骤：
1)将新生牛牛脑匀浆，收集匀浆液；
2)对匀浆液酸抽提，收集匀浆上清液，再冷冻干燥后，得新生牛牛脑酸抽提物；
3)对新生牛牛脑酸抽提物进行阳离子交换层析及分子筛层析，纯化新生牛牛脑活性物质，收集含有新生牛牛脑天然活性肽组分。
在新生牛牛脑匀浆时，可加入Tris-HCl缓冲液，牛脑∶Tris-HCl缓冲液体积比可为1∶1。
对匀浆液酸抽提时，可用20mmol/L HCl反复抽提至少2遍。
所述的阳离子交换层析可将新生牛牛脑酸抽提物溶解于20mmol/L NaAc(pH6.0)中调pH为6.0，将新生牛牛脑酸抽提物加到CM-Sepharose CL-6B凝胶(Sigma公司产品)中进行吸附，吸附完成后采用NaAc-HAc缓冲液(pH6.0含1.5mol/LNaCl)洗脱，人工收集洗脱峰，冷冻干燥后即为新生牛牛脑活性肽组分。
根据实验证实，所述的新生牛牛脑活性肽(NBBP-1)可作为制备抗癌药物的活性组分。
本发明采用匀浆、低温高速离心、冷冻干燥和柱层析等方法从新生牛牛脑中分离提取出NBBP-1，并证实了NBBP-1是一种具有显著的诱导人神经母细胞瘤等肿瘤细胞凋亡作用的生物抗肿瘤活性物质，能有效地抑制人神经母细胞瘤恶性增殖活动，干预人神经母细胞瘤相关癌基因与抑癌基因的表达、调控细胞周期，促使人神经母细胞瘤出现细胞凋亡形态与超微结构特征的改变，从而诱导神经母细胞瘤凋亡。因此NBBP-1可作为具有诱导细胞凋亡作用的活性肽组份在制备抗癌药物中应用。
附图说明
图1为新生牛牛脑细胞提取物SDS电泳图谱。在图1中，M为Marker；1新生牛牛脑匀浆酸初提物；2 NBBP-1。标准蛋白依次从大到小为鸡蛋清溶菌酶：97.4kD，胰蛋白酶抑制剂：66.2kD，牛碳酸酐酶：43kD，兔肌动蛋白：31kD，牛血清蛋白20.1kD，兔磷酸化酶：14.4kD。
图2为分离纯化操作流程图。在图2中，流程为新生牛牛脑-匀浆-酸抽提-CL-6B阳离子交换柱层析-Sephadex G-25分子筛除盐-SDS-PAGE电泳分析。
图3为新生牛牛脑酸初提取物CM-Sepharose CL-6B离子交换柱洗脱曲线。在图3中，横坐标为洗脱体积(mL)，纵坐标OD280值，左峰为穿透峰，右峰为洗脱峰。
图4为NBBP-1过凝胶Sephadex G-25柱脱盐洗脱曲线。在图4中，横坐标为洗脱体积(mL)，纵坐标OD280值。
图5为蛋白SDS-PAGE电泳标准曲线。在图5中，横坐标为电泳相对迁移率，纵坐标为LogMW。
图6为NBBP-1对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞生长的影响。在图6中，横坐标为处理时间(d)，纵坐标为细胞密度(×104个/mL)，从上至下的曲线依次为对照组，40μg/mL，50μg/mL，60μg/mL。
图7为SK-N-SH细胞DNA琼脂糖凝胶电泳图。在图7中，M为小分子量DNA Marker；1为对照组电泳图；2为40μg/mLNBBP-1处理3d电泳图；3为50μg/mLNBBP-1处理3d电泳图；4为60μg/mL NBBP-1处理3d电泳图；5为60μg/mL NBBP-1处理1d电泳图；6为60μg/mL NBBP-1处理2d电泳图；7为60μg/mL NBBP-1处理3d电泳图，从上至下分别为1050bp，900bp，750bp，600bp，450bp，300bp，150bp。
图8为HE染色观察结果图版。图版1：SK-N-SH细胞，细胞形态多样，核质比大，×251；图版2：经40μg/mLNBBP-1处理SK-N-SH细胞，细胞体积减小，核缩细胞增加，×251；图版3：经50μg/mL NBBP-1处理SK-N-SH细胞，细胞体积减小，核缩细胞增加，×251；图版4：经60μg/mLNBBP-1处理SK-N-SH细胞，细胞体积减小，核缩细胞较多，×251。
图9为SK-N-SH细胞透射电镜观察图版。在图9中，图版1：对照组SK-N-SH细胞超微结构；图版2：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞体积减少，核固缩，胞内出现空泡化，致密基质电子密度增加；图版3：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞体积减少，出现核内染色质凝聚，一些较大的团块边聚化，胞质内细胞器减少，细胞膜完整；图版4：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞体积减少，出现核内染色质凝聚，一些较大的团块边聚化，胞质内细胞器减少，细胞膜完整；图版5：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞体积减少，出现核内染色质凝聚，胞质中出现空泡化现象，有小泡形成()；图版6：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞，出现残核及凋亡小体(
)；图版7：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞，出现致密核及胞质中出现空泡化现象，有小泡形成()。图10为SK-N-SH细胞扫描电镜观察图版。在图10中，图版1：扫描电镜观察示对照组SK-N-SH细胞群体形态；图版2：扫描电镜观察示对照组SK-N-SH细胞群体形态；图版3：扫描电镜观察示对照组SK-N-SH细胞多边形细胞形态；图版4：扫描电镜观察示对照组SK-N-SH细胞梭形细胞形态；图版5：扫描电镜观察示对照组SK-N-SH细胞球形细胞形态；图版6：扫描电镜观察经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞，体积减小，细胞表面光滑，有较多的凋亡小体凸于细胞表面(
)；图版7：扫描电镜观察经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞，体积减小，细胞表面光滑，有较多的凋亡小体凸于细胞表面(
)；图版8：扫描电镜观察经NBBP-1处理SK-N-SH细胞，体积减小，细胞表面光滑，有较多的凋亡小体凸于细胞表面(
)。
图11为NBBP-1对SK-N-SH细胞相关癌基因与抑癌基因表达的影响图版。在图11中，图版1、3、5、7为对照组(Control)，图版2、4、6、8为实验组(NBBP-1)；图版1、2对应于Fas抗体，图版3、4对应于Bax抗体，图版5、6对应于Wtp53抗体，图版7、8对应于Bcl-2抗体。
具体实施方式
新生牛牛脑活性肽(NBBP-1)是新鲜新生牛牛脑经匀浆，低温高速离心再经酸抽提和CM-Sepharose CL-6B凝胶离子交换后，收集洗脱峰，经Sephadex G-25脱盐后得到的一组活性肽组份。参见图1，SDS-PAGE电泳表明该组份由8种蛋白组成，分子量分别为33.1kD，30.6kD，25.3kD，23.6kD，18.6kD，14.4kD，13.1kD，11.7kD。在图1中，标准蛋白依次从大到小为鸡蛋清溶菌酶：97.4kD，胰蛋白酶抑制剂：66.2kD，牛碳酸酐酶：43kD，兔肌动蛋白：31kD，牛血清蛋白20.1kD，兔磷酸化酶：14.4kD。
NBBP-1的分离提取方法如下(参见图2)：
1.NBBP-1的提取。
2.新出生公牛大动脉放血后无菌条件下剖取牛脑，用灭菌预冷的D-Hank’s漂洗3次，除去多余血液，放置于-80℃暂存。取适当量悬浮于50mmol/LNaCl的20mmol/LTris-Cl缓冲液中，用组织匀浆机低温匀浆，将匀浆液在4℃11250×g离心30min，收集的沉淀用含50mmol/L NaCl和20mmol/L Tris-Cl缓冲液洗涤三次后，悬浮于20mmol/L HCl中，搅拌均匀，再次充分匀浆，将匀浆液在4℃低温11250×g离心30min，收集上清液，沉淀用20mmol/L HCl抽提两次，同样收集上清液，弃沉淀，三次收集的上清液为新生牛牛脑混合物，冷冻干燥。
3.NBBP-1的分离：
把CM-Sepharose CL-6B凝胶(Sigma公司产)沸水浴中溶胀，NaAc-HAc缓冲液稀释后缓慢灌入垂直装好的玻璃层析柱(20cm×1.5cm)中自然沉降，NaAc-Hac(pH6.0)缓冲液平衡过夜。将新生牛牛脑初提物冻干品，溶解于NaAc-HAc缓冲液中，1M NaOH调节pH至6.0后加到柱平面上，缓冲液以80mL/h流速跟离子交换柱相结合，核酸蛋白检测仪280nm处检测，收集穿透峰，待基线重新平直后用NaAc-HAc缓冲液(pH6.0含1.5mol/LNaCl)洗脱，人工收集洗脱，冷冻干燥得新生牛牛脑活性肽和NaCl混合物。称取Sephadex G-25凝胶(Sigma公司产)，沸水浴溶胀，20mmol/L HCl缓冲溶液稀释，缓慢灌入垂直装好的层析柱(20cm×2.0cm)中，20mmol/L HCl缓冲溶液平衡过夜，将含有新生牛牛脑活性多肽和NaCl混合物的CM-Sepharose CL-6B柱峰干燥后的样品溶解于加样缓冲液中，80mL/h流速洗脱，核酸蛋白检测仪280nm处检测记录，人工收集峰I，冷冻干燥，用于鉴定和细胞培养实验。
4.NBBP-1的分子量测定：
Laemmil系统SDS-PAGE电泳可按表1和表2配制电泳缓冲液及浓缩胶和分离胶。取小型玻璃电泳板14cm×17cm，加热1％琼脂(电泳缓冲液配制)将板底部及两边封住，底部高约为0.5～1cm。按上面配方配好分离胶，将胶灌入板中，胶高约为7cm，用水饱和的正丁醇封平，室温放置，直到凝胶凝固(一般要0.5～1h)，去除正丁醇，超纯水洗3次，滤纸吸干，将梳子插入板中，配好浓缩胶后加入到板中，注意不要有气泡生成。室温放置直到凝胶凝固。轻轻拔出梳子，将板架于电泳槽中，先加入下槽电泳缓冲液，再加入上槽液，将蛋白样品以终浓度2mg/mL。
表1 Laemmli-SDS-PAGE电泳缓冲液的配方
| 缓冲液 | Tris | Glysine | pH | SDS | DDW |
| 电泳缓冲液分离胶缓冲液浓缩胶缓冲液 | 3g18.165g12.114g | 14.4g-- | 8.38.86.8 | 1g-- | 1000mL50mL50mL |
表2 Laemmli-SDS-PAGE浓缩胶及分离胶的配方
| 试剂 | 分离胶 | 浓缩胶 | |
| 胶浓度30％T 2.67％C(mL)凝胶缓冲液(mL)10％SDS(mL)DDW(mL)10％AP(μL)TEMED(μL)总体积(mL) | 15％420.081.924048 | 17％4.5320.081.394048 | 5％0.5360.80.0321.842443.2 |
用上样缓冲液溶解，煮沸5min，高速离心1min，上清取20μL加到各个加样孔中，接上电源，先60V稳压跑15min直到样品进入浓缩胶中，提高电压至80V稳压跑2h，再提高电压至120V直至溴酚兰跑到胶底。电泳结束后，按常规聚丙烯酰胺电泳的方法剥胶、用考马斯染液(含0.1％考马斯染料R250、40％甲醇、10％醋酸)染色固定2h，用脱色液(含40％甲醇、10％醋酸)脱色两次每次30min，用10％醋酸溶液维持过夜。绘制标准曲线(参见图5)，计算NBBP-1各组分的分子量，从图5中蛋白种类和标准蛋白分子量上比较(图1)，NBBP-1有8个组分，分子量分别为33.1kD，30.6kD，25.3kD，23.6kD，18.6kD，14.4kD，13.1kD，11.7kD。
NBBP-1分离所用仪器设备参见表3。NBBP-1分离所需试剂参见表4。
表3 NBBP-1分离所用仪器设备
| 电泳槽电泳仪电子d平高速冷冻离心机核酸蛋白检测仪核酸蛋白分析仪记录仪搅拌机冷冻干燥机 | DYCZ-28A，北京六一仪器厂DYYIII-4，北京六一仪器厂HANGPING FA1004，上海d平仪器厂Beckman Avantic<sup>TM</sup> J-25 CentrifugeHD-97-I，上海康华生化仪器制造厂DU640，BeckmanLM17，上海康华生化仪器制造厂HR2839，珠海飞利浦家用电器有限公司LABCONCO，StopPERING TRAY DRYER |
表4 NBBP-1分离所需试剂
| 氯化钠盐酸EDTA醋酸钠三(羟甲基)氨基甲烷Sephadex G-25凝胶CM-Sepharose CL-6B凝胶氯化钾磷酸氢二钠碳酸氢钠 | 国产分析纯国产分析纯国产分析纯国产分析纯国产分析纯Sigma公司产品Sigma公司产品国产分析纯国产分析纯国产分析纯 |
以下给出NBBP-1在制备抗癌药物中应用的实验资料。
以人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞(引自中科院上海细胞生化所细胞库)为实验模型，研究NBBP-1对肿瘤细胞的生物学效应，所得结果如下：
1.NBBP-1对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖抑制作用
1)生长曲线测定：细胞生长曲线测定结果显示人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖速度较快，当接种细胞数为7.5×104cells/mL时，连续计数至第7 d，细胞数为51.15×104cells/mL，为原来的6.82倍，其倍增时间为62.22h。但经不同浓度的NBBP-1处理后，SK-N-SH细胞生长状态分别受到不同程度的抑制，其中40μg/mL NBBP-1处理7d，细胞计数结果为26.70×104cells/mL，为原来的3.56倍，和对照组细胞细胞相比，生长抑制率为47.78％。50μg/mLNBBP-1连续处理7d，细胞减少至12.04×104cells/mL，为原来的1.61倍，细胞生长抑制率为76.46％，与对照组细胞相比较，具有极显著性差异。而经60μg/mL NBBP-1处理7d后，细胞计数结果为5.07×104cells/mL，细胞数较原来少，细胞生长抑制率高达88.84％(图6)。由于40μg/mL及50μg/mL NBBP-1对细胞生长的抑制率相对较低，本实施例选择60μg/mLNBBP-1作为处理SK-N-SH细胞的适宜浓度。
2)细胞周期检测：应用流式细胞仪检测NBBP-1对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞周期分布的影响。检测结果显示，NBBP-1抑制人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖过程分为两阶段：先使细胞停留在G0/G1期；诱导G0期细胞产生凋亡。即DNA组方图出现DNA降解的亚G1峰。随着NBBP-1浓度的增加，亚G1峰增宽、增高。其中以40μg/mLNBBP-1处理细胞，细胞周期无发生明显的G0/G1期阻抑，亚G1期细胞比例上升为3.31％，而G2/M期细胞比例也无明显变化，细胞出现少量凋亡；50μg/mL NBBP-1处理的细胞周期各时相的分布与其处理40μg/mL的相类似，亚G1期细胞比例达6.18％，而G2/M期细胞比例也无明显变化；60μg/mL NBBP-1处理的细胞周期各时相的分布与40μg/mL、50μg/mL处理组相比发生较大变化，NBBP-1对SK-N-SH细胞周期的影响参见表5。亚G1期细胞比例高达19.20％，G0/G1期占细胞周期比例增加至59.92％，出现明显阻抑，G2/M期占细胞周期比例下降至11.98％，S期也降至11.98％。结果显示NBBP-1对SK-N-SH细胞的生长抑制作用与细胞凋亡有关。经不同浓度NBBP-1处理后，SK-N-SH细胞周期发生了变化，这种变化有明显的浓度依赖性，特别是当处理浓度达到60μg/mL时，变化最为明显，亚G1期细胞比例迅速增加，G0/G1期细胞比例很大程度上增加，G2/M期、S期细胞比例明显下降。
表5 NBBP-1对SK-N-SH细胞周期的影响
| 组别/周期 | 亚G<sub>1</sub>期(％) | G<sub>0</sub>/G<sub>1</sub>(％) | S(％) | G<sub>2</sub>/M(％) |
| Control40μg/mL50μg/mL60μg/mL | 1.753.316.1819.20 | 49.448.2950.2759.92 | 21.3320.711611.98 | 27.5227.6927.5511.9 |
2.NBBP-1对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞形态和超微结构变化的影响
1)光学显微镜观察
光镜下，对照组人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞具有人神经母细胞瘤典型的形态特征，细胞群体排列不规则，个体细胞形状不规则，呈圆形、梭形、多边形等不规则形态，细胞常成簇生长，有些细胞同时较常见癌巨细胞、多核细胞以及多极分裂相等。细胞体积较小，细胞核大，核形不规则，常见畸形核，核内常见多个核仁，多达3～5个，大且深染。细胞质较少，HE染色不均匀，着色深浅不一，胞质突起较多。参见图8所示的图版，说明如下：
图版1：SK-N-SH细胞。细胞形态多样，核质比大。×251。
图版2：经40μg/mLNBBP-1处理SK-N-SH细胞。细胞体积减小，核缩细胞增加。×251。
图版3：经50μg/mLNBBP-1处理SK-N-SH细胞。细胞体积减小，核缩细胞明显增加。×251。
图版4：经60μg/mLNBBP-1处理SK-N-SH细胞。细胞体积减小，核缩细胞较多。×251。
经40μg/mL NBBP-1处理的人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞，细胞形态发生变化，细胞群体排列较为规则，个体细胞形状较规则，多为梭形，癌巨细胞、多核细胞及多极分裂相减少。细胞体积变小，形态较一致，核仁数目减少，少数细胞出现核固缩，核质比例减少，细胞质增加，着色深浅较均一；50μg/mL NBBP-1处理的人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞，细胞群体较为规则，个体细胞形状较规则，多为梭形，癌巨细胞、多核细胞及多极分裂相减少。细胞体积变小，形态较一致，核仁数目减少，细胞出现核固缩现象增加，少数细胞出现核凝聚现象，核变小，核质比例减少，细胞质增加，着色深浅较均一；经60μg/mL NBBP-1处理的人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞细胞，细胞群体较为规则，个体细胞形状较规则，多为梭形，癌巨细胞、多核细胞及多极分裂相少见。细胞体积变小，形态较一致，核仁数目减少，细胞出现核固缩现象增加，较多细胞出现核凝聚现象，核变小，核质比例减少，细胞质增加，着色深浅较均一。
2)透射电子显微镜观察
透射电子显微镜观察结果显示，人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞体积较小，形状不规则，核质比例大。细胞核较大，形态不规则，核膜向核内有不同程度的凹陷，核内有多个核仁，大小不一，还可见核仁内大小不一的核仁小泡。细胞核内异染色质多，除核内膜与核仁部位较多外，还有一些呈团块地散在分布。在细胞质内，线粒体体积小，形状不规则，常可见呈深色负染，有些还呈空泡化，线粒体嵴数量较少，基质的电子密度也不均匀。高尔基体少见，体积较小，高尔基囊数目少排列不规则，极性不明显，高尔基囊腔有明显的膨胀现象，甚至呈泡状化。粗糙内质网不发达，数量少，长度相对较短，呈散在分布。细胞质多聚核糖体较多，游离核糖体较少。有些细胞还有少量的分泌颗粒，溶酶体少见，细胞表面还有较多的微绒毛突起。参见图9所示的图版，说明如下：
图版1：对照组SK-N-SH细胞超微结构
图版2：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞体积减少，核固缩，胞内出现空泡化，致密基质电子密度增加。
图版3：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞体积减少，出现核内染色质凝聚，一些较大的团块边聚化，胞质内细胞器减少，细胞膜完整。
图版4：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞体积减少，出现核内染色质凝聚，一些较大的团块边聚化，胞质内细胞器减少，细胞膜完整。
图版5：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞体积减少，出现核内染色质凝聚，胞质中出现空泡化现象，有小泡形成()。
图版6：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞，出现残核及凋亡小体(
)。
图版7：经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞，出现致密核及胞质中出现空泡化现象，有小泡形成(
)。
经过NBBP-1处理后人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的超微结构均产生了明显的变化。细胞体积减小，核出现固缩现象，细胞核内的染色质凝聚，异染色质块增多，一些较大的团块边聚化，使核内出现了透明区域，有些细胞可见明显的致密核和残核；细胞质变得较为致密基质的电子密度增高，细胞质体积缩小，细胞器数目减少，线粒体空泡化明显，内质网网腔扩大，但都可辨认，胞质中出现空泡化现象，有小泡形成，细胞膜皱缩但完整，透射电镜下可见体积小、数目多的凋亡小体。
3)扫描电子显微镜观察
在扫描电镜下可见人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞具有球形、梭形和多边形的细胞和正在分裂中的球形细胞等几种细胞形态。在各类型细胞表面均具有丰富的微绒毛，其中微绒毛在小球形细胞表面呈密集状态分布；在体积较大的球形细胞边缘的丝状伪足增多且呈放射状伸向细胞的四周；在梭形细胞的表面微绒毛也较多，其两侧含有较多的丝状伪足；而在多边形细胞表面的微绒毛，主要依靠少量的片状伪足而铺展在培养基质表面。参见图10所示的图版，说明如下：
图版1：扫描电镜观察示对照组SK-N-SH细胞群体形态。
图版2：扫描电镜观察示对照组SK-N-SH细胞群体形态。
图版3：扫描电镜观察示对照组SK-N-SH细胞多边形细胞形态。
图版4：扫描电镜观察示对照组SK-N-SH细胞梭形细胞形态。
图版5：扫描电镜观察示对照组SK-N-SH细胞球形细胞形态。
图版6：扫描电镜观察经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞，体积减小，细胞表面光滑，有较多的凋亡小体凸于细胞表面(
)。
图版7：扫描电镜观察经NBBP-1处理后SK-N-SH细胞，体积减小，细胞表面光滑，有较多的凋亡小体凸于细胞表面(
)。
图版8：扫描电镜观察经NBBP-1处理SK-N-SH细胞，体积减小，细胞表面光滑，有较多的凋亡小体凸于细胞表面(
)。
经NBBP-1处理后，在细胞群体形态中仍然可以见到球形、梭形和多边形细胞等几种形态，但是不同形态细胞的数量发生了变化，其中球形、梭形细胞相对减少，即是处于分裂状态的细胞减少。另外，经NBBP-1处理后，各种类型细胞的微绒毛的形态和数量也发生了变化，其中细胞表面的微绒毛的数量减少，长度缩短且呈弯曲萎缩状态，有些细胞体积变小，细胞质收缩，整个细胞隆起呈球形，细胞表面相对较为光滑可见有膜包裹的凋亡小体突出于细胞表面。细胞表面的形态特征发生了明显的变化。
3.NBBP-1对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞作用DNA电泳结果
经过NBBP-1处理的人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞DNA琼脂糖电泳显示：随着时间的推移出现了不同与对照组细胞的条带现象。其中40μg/mLNBBP-1实验组随着时间的推移，DNA电泳现象与对照组相比变化不明显，只有少量的DNA水解出现条带，经50μg/mLNBBP-1实验组随着时间的推移，DNA电泳现象与跟40μg/mLNBBP-1组略有些差别，出现一些DNA水解条带，而60μg/mLNBBP-1实验组较对照组相比随着时间的推移，DNA电泳现象与对照组相比变化明显，产生了180bp-200bp或倍数级左右的小分子DNA。推测细胞核DNA可能出现了水解，出现了条带。可见随着牛脑活性肽NBBP-1对神经母细胞瘤SK-N-SH细胞有诱导凋亡作用，这种作用有时间及浓度的依赖性。(参见图6)
4-NBBP-1对SK-N-SH细胞相关癌基因与抑癌基因表达的影响
参见图11所示的图版。
1)NBBP-1对SK-N-SH细胞p53蛋白表达的影响
应用SABC免疫细胞化学方法检测人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞在NBBP-1处理后野生型p53蛋白(Wtp53)表达的变化。检测结果显示，SK-N-SH细胞对照组细胞Wtp53蛋白免疫显色反应呈弱阳性，反应产物为浅黄色颗粒，主要分布于整个细胞中，其中细胞胞质中相对较多些，在胞质中分布较为均匀。
经NBBP-1处理后细胞内Wtp53蛋白免疫细胞化学反应为强阳性，深棕黄色反应产物在细胞质区域大量表达，尤其是核周边细胞质中，细胞核内也有表达。可以看出随着处理浓度的升高，其细胞内Wtp53蛋白表达量也随之增高。
2)NBBP-1对SK-N-SH细胞Bcl-2蛋白表达的影响
应用SABC免疫细胞化学方法检测人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞在NBBP-1处理后Bcl-2蛋白表达的变化。免疫细胞化学检测显示，人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞对照组细胞Bcl-2蛋白含量较高，免疫显色反应呈强阳性，反应产物为深棕黄色颗粒，大量分布于细胞质内，分布较为致密。
经NBBP-1处理后，细胞内Bcl-2蛋白免疫显色反应有明显下降，反应呈弱阳性，黄色反应产物主要分布于细胞质内，与对照组相比，核内分布变化不大，但细胞质内分布减少明显。可以看出，随着处理浓度的增加，胞内Bcl-2蛋白表达量也逐渐降低。
3)NBBP-1对SK-N-SH细胞Bax蛋白表达的影响
应用SABC免疫细胞化学方法检测人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞在NBBP-1处理后Bax蛋白表达的变化。免疫细胞化学检测显示，人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞对照组细胞Bax蛋白含量较低，免疫显色反应呈弱阳性，反应产物为黄色颗粒，主要分布于核周边细胞质区域。
经NBBP-1处理后，细胞内Bax蛋白免疫显色反应明显增加，反应成强阳性，反应物为深棕黄色颗粒，主要分布于细胞核周边细胞质区域。可以看出，随着处理浓度的增加，胞内Bax蛋白表达量也逐渐提高。
4)NBBP-1对SK-N-SH细胞Fas蛋白表达的影响
应用SABC免疫细胞化学方法检测人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞在NBBP-1处理后Fas蛋白表达的变化。免疫细胞化学检测显示，人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞对照组细胞Fas蛋白含量较低，免疫显色反应呈弱阳性，反应产物为黄色颗粒，主要分布于核周边细胞质区域
经NBBP-1处理后，细胞内Fas蛋白免疫显色反应明显增加，反应成强阳性，反应物为深棕黄色颗粒，主要分布于细胞核周边细胞质区域。可以看出，随着处理浓度的增加，胞内Fas蛋白表达量也逐渐提高。
Claims (4)
1.新生牛牛脑活性肽，其特征在于其组分由8种蛋白组成，其分子量介于10～35kD之间，分子量分别为33.1kD，30.6kD，25.3kD，23.6kD，18.6kD，14.4kD，13.1kD，11.7kD；
所述的新生牛牛脑活性肽的制备方法，包括以下步骤：
1)将新生牛牛脑匀浆，在新生牛牛脑匀浆时，加入Tris-HCl缓冲液，收集匀浆液；
2)对匀浆液酸抽提，对匀浆液酸抽提时，用20mmol/L HCl反复抽提至少2遍，收集匀浆上清液，再冷冻干燥后，得新生牛牛脑酸抽提物；
3)对新生牛牛脑酸抽提物进行阳离子交换层析及分子筛层析，纯化新生牛牛脑活性物质，收集含有新生牛牛脑天然活性肽组分。
2.如权利要求1所述的新生牛牛脑活性肽的制备方法，其特征在于按体积比，牛脑∶Tris-HCl缓冲液为1∶1。
3.如权利要求1所述的新生牛牛脑活性肽的制备方法，其特征在于阳离子交换层析时将新生牛牛脑酸抽提物溶解于20mmol/L NaAc中调pH为6.0，将新生牛牛脑酸抽提物加到CM-Sepharose CL-6B凝胶中进行吸附，吸附完成后采用NaAc-HAc缓冲液洗脱，人工收集洗脱峰，冷冻干燥后即为新生牛牛脑活性肽组分。
4.如权利要求1所述的新生牛牛脑活性肽在制备抗人神经母细胞瘤药物中的应用。
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