一种用于改善记忆力的混合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域,涉及一种血浆分离物,具体地,涉及一种用于改善记忆力的混合物及其制备方法,该混合物可用于预防、改善和治疗老年痴呆症,并具有增强记忆力的作用。
背景技术
老年痴呆病,又称为阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD),是一种以记忆减退、认知障碍、人格改变为特征的神经退行性疾病。该病早期表现为轻微记忆障碍,随着病情的发展,患者的认知能力逐渐衰退、智力减退,出现情感以及语言障碍,最终神经系统功能遭到严重破坏,导致死亡。
AD的具体发病机制目前存在多种假说:如胆碱能神经元假说、Aβ毒性假说、Tau蛋白假说、胰岛素假说、自由基损伤假说等。AD是由遗传因素和环境因素共同引发的一种复杂性疾病,单一的假说并不能解释AD的全部发病特征。
目前治疗老年痴呆病的药物以化学药物为主,作用于单一靶点。对于老年痴呆病这类发病因素复杂的疾病疗效有限,并需要长期服用,药物副作用大。因此急需研制老年痴呆病的新型治疗性药物,对老年痴呆病相关的多种信号通路进行更有效干预和治疗。
最近的研究表明:输注年轻小鼠的血液给AD模型小鼠能够改善后者的AD症状,(Middeldorp J,Lehallier B,Villeda SA,Miedema SS,Evans E,Czirr E,Zhang H,LuoJ,Stan T,Mosher KI,Masliah E,Wyss-Coray T.Preclinical Assessment ofYoungBlood Plasma for Alzheimer Disease.JAMA Neurol.2016Nov1;73(11):1325-1333.)。美国斯坦福大学正在开展使用30岁以下的年轻人的血液治疗AD患者的临床实验。由此,血浆中含有某些物质能改善和治疗AD患者病症。但是,这些物质的具体组分、以及分离获取方法还未见报道。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的之一在于提供一种用于改善记忆力的混合物。
本发明的目的之二在于提供上述混合物的制备方法。
本发明的目的之三在于提供上述混合物的应用。
为了实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:
一种用于改善记忆力的混合物,来源于血浆,包括多种蛋白质和多种小分子,所述混合物的SDS-PAGE变性胶电泳具有6条肉眼清晰可见的条带,所述条带的分子量为:25kD、55kD、68kD、73kD、100kD、160kD。
在上述用于改善记忆力的混合物中,作为一种优选实施方式,通过蛋白质谱分析,所述混合物中至少含有91种蛋白,具体如下表1:
表1
优选地,所述多种小分子至少包括与所述91种蛋白中任何一种蛋白结合的小分子。
在上述用于改善记忆力的混合物中,作为一种优选实施方式,所述血浆来源于哺乳动物;优选地,所述血浆来源于人类。
一种上述用于改善记忆力的混合物的制备方法,其特征在于:该制备方法依次包括以下步骤:血浆收集、低温过滤、低温超滤、冷乙醇沉淀、SD灭活、离心分离、阴离子交换、透析、浓缩。
在上述制备方法中,作为一种优选实施方式,在所述血浆收集步骤中,利用抗凝管收集血液,再通过离心收集上清液,得到血浆;
优选地,所述离心转速为500-1500g,离心时间为10-30分钟,离心温度为0-4℃。
在上述制备方法中,作为一种优选实施方式,在所述低温过滤步骤中,在压力条件下将所述血浆进行过滤,得到滤液;
优选地,滤膜的孔径为不小于0.22微米,更优选所述滤膜的孔径为0.22微米和0.45微米;
优选地,所述过滤的温度为0-4℃,压力为1-20MPa。
在上述制备方法中,作为一种优选实施方式,在所述低温超滤步骤中,将所述滤液通过施加压力进行膜包超滤,得到低温超滤产物;
优选地,所述膜包截留分子量为3kD-10kD;
优选地,所述超滤的温度为0-10℃,压力为1-20MPa;
优选地,所述超滤使用的缓冲液为磷酸盐缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、HBS缓冲液中的一种;更优选地,所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-100mM、pH值为7.0-9.0,所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-400mM、pH值为6.0-9.2,所述HBS缓冲液的浓度为0.5-400mM、pH值为6.4-8.0;进一步优选地,所述超滤使用的缓冲液是浓度为1mM、pH值为8.0的Tris盐酸缓冲液。
在上述制备方法中,作为一种优选实施方式,在所述冷乙醇沉淀步骤中,将所述低温超滤产物与冷乙醇混合后静置,得到冷乙醇沉淀产物;
优选地,所述冷乙醇的温度为0℃至零下20℃;
优选地,所述冷乙醇和所述低温超滤产物的体积比为1:(1-5);
优选地,所述静置温度为0℃至零下10℃。
在上述制备方法中,作为一种优选实施方式,在所述SD灭活步骤中,将所述冷乙醇沉淀产物用SD灭活剂重新悬浮后静置,得到灭活产物。
优选地,所述静置温度为4~40℃,时间为6~24小时;更优选为所述静置温度为24℃,时间为12小时;
优选地,所述SD灭活剂含有0.3~2%的N-丁基三磷酸盐、0.5~2%的吐温。
在上述制备方法中,作为一种优选实施方式,在所述离心分离步骤中,将所述灭活产物离心后保留上清液,得到离心分离产物;优选地,所述离心转速为2000-5000g,离心时间为10-30分钟,离心温度为0-8℃。
在上述制备方法中,作为一种优选实施方式,在所述阴离子交换步骤中,将所述离心分离产物加入阴离子交换柱中采用洗脱缓冲液进行梯度洗脱,收集洗脱液得到阴离子交换产物;
优选地,所述洗脱缓冲液为含有20-500mM氯化钠的Tris-盐酸缓冲液,所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-9.2;优选地,开始收集洗脱液时的洗脱体积为15-35ml,停止收集洗脱液时的洗脱体积为40-85ml。
在上述制备方法中,作为一种优选实施方式,在所述透析步骤中,将所述阴离子交换产物进行透析,收集透析容器中的产物得到透析产物;
优选地,所述透析使用的透析缓冲液为Tris-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、HBS缓冲液中的一种;更优选地,所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-100mM、pH值为7.0-9.0,所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-400mM、pH值为6.0-9.2,所述HBS缓冲液的浓度为0.5-400mM、pH值为6.4-8.0;进一步优选地,所述透析缓冲液为1mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液;
优选地,所述透析的时间为20-72h;
优选地,所述透析的体积比是1:(100-10000)。
在上述制备方法中,作为一种优选实施方式,在所述浓缩步骤中,将所述透析产物进行浓缩,得到浓缩产物,即为所述混合物;
优选地,所述透析产物的体积是所述浓缩产物的不小于10倍,更优选为10-100倍;
优选地,所述浓缩是采用浓缩管离心,所述浓缩管允许1.5-2.5KD的物质通过,所述离心时转速为2000-3000g;
优选地,所述浓缩是采用浓缩杯加压,所述浓缩杯允许1.5-2.5KD的物质通过,所述加压的压力为1-10MPa。
一种药物组合物,包含上述混合物和药学上可接受的载体。
在上述药物组合物中,作为一种优选实施方式,所述药学上可接受的载体为:药学上可接受的缓冲液、蛋白质、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂、糖醇、聚乙二醇、以及表面活性剂中的一种或多种。
在上述药物组合物中,作为一种优选实施方式,所述药物组合物包括如下组分:1倍体积的上述混合物,9倍体积的8.5wt%NaCl或1.5M、pH7.0的PBS;
优选地,所述药物组合物中还包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺;更优选地,所述白蛋白在所述药物组合物中的质量体积百分比为2%,所述葡萄糖在所述药物组合物中的质量体积百分比为1%,所述谷氨酰胺在所述药物组合物中的质量体积百分比为3%。
一种缓释制剂,包含上述混合物或者上述药物组合物、以及药学上可接受的生物相容物质;优选地,所述缓释制剂的剂型为脂质体、微球、水凝胶、微型渗透泵或微胶囊。
一种试剂盒,包含上述混合物、上述药物组合物,或上述缓释制剂。
上述混合物、上述药物组合物、上述缓释制剂、上述试剂盒,在预防、改善或/和治疗老年痴呆症药物中的应用。
上述混合物、上述药物组合物、上述缓释制剂、上述试剂盒,在增强记忆力药物中的应用。
相比于现有技术,本发明具有如下有益效果:
1、本发明制备的混合物可以用于预防、改善和治疗老年痴呆症,此外其还可以起到增强记忆力的作用。
2、本发明提供的从血浆中分离出的混合物可以比血浆和目前药物更有效地提升老年痴呆症患者的认知水平。与此同时,长期服用这种混合物可以大大降低长期服用西药带来的副作用和药物依赖。
附图说明
图1:实施例2中,HC4201612混合物SDS-变性胶电泳鉴定结果电泳图。泳道M:蛋白分子量标准;泳道1-4:HC4201612混合物。
图2:实施例4中,不同处理后的原代海马细胞的显微成像。往不同的培养有原代海马细胞的DMEM培养基里分别加入HC4201612混合物,和未处理的人血浆,作为实验组。对照组海马细胞加入生理盐水。一天后在显微镜下对海马细胞进行成像;图中(a)、(b)、(c)分别是HC4201612混合物、未处理的人血浆、生理盐水(即对照组)处理后的原代海马细胞。
图3:实施例4中,HC4201612混合物抑制原代海马细胞凋亡的活性的柱状图。往不同的培养有原代海马细胞的DMEM培养基里分别加入HC4201612混合物,和未处理的人血浆,作为实验组;对照组海马细胞只加DMEM培养基;一天后在显微镜下对海马细胞进行计数,计算实验组细胞数目占对照组细胞数目的比例。
图4:实施例4中,HC4201612混合物促进原代海马细胞之间突触形成的活性的柱状图。往不同的培养有原代海马细胞的DMEM培养基里分别加入HC4201612混合物,和未处理的人血浆,作为实验组;对照组海马细胞只加DMEM培养基;一天后在显微镜下对突触数目进行计数,计算实验组突触数目占对照组突触数目的比例。
图5:实施例5中,HC4201612混合物提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力动物模型数据的散点图。将HC4201612混合物系统地注射到阿尔兹海默症小鼠模型中;通过水迷宫实验,评价给药对阿尔兹海默症小鼠记忆力的提升作用。
具体实施方式
为了更好地对本发明的技术特征和效果进行说明,下面采用具体实施方式对本发明进行详细说明,但本发明并不限于此。
第一方面,本发明提供一种用于改善记忆力的混合物,其来源于血浆,即从血浆中分离出的混合物HC4201612,所述混合物包括多种蛋白质和多种小分子,所述混合物的SDS-PAGE变性胶电泳具有6条肉眼清晰可见的条带,所述条带的分子量为:25kD、55kD、68kD、73kD、100kD、160kD。
在本发明第一方面的混合物中,通过蛋白质谱(比如MS/MS)分析,所述混合物至少含有91种蛋白,所述混合物包括的蛋白如上述表1所示,所述多种小分子至少包括与所述91种蛋白中任何一种蛋白结合的小分子。
所述血浆来源于哺乳动物,比如人类、鼠类等,优选来源于人类。
第二方面,本发明提供述混合物HC4201612的制备方法,所述混合物从血浆提取制备而成,所述制备方法依次包括以下步骤:血浆收集、低温过滤、低温超滤、冷乙醇沉淀、SD灭活、离心、阴离子交换、透析、浓缩步骤。具体如下:
步骤一、血浆收集:
利用抗凝管收集血液,再通过离心收集上清液,得到血浆;优选地,所述离心转速为500-1500g,离心时间为10-30min,离心温度为0-4℃。
示例性地,上述离心转速可以为500g、1000g、1250g、1500g等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述离心时间可以为10min、15min、20min、30min等中任意值或任意两者之间的数值范围。
上述离心温度可以为等中任意值或任意两者之间的数值范围。
步骤二、低温过滤:
将所述血浆收集步骤得到的血浆加入滤器中,使用蠕动泵施加压力进行过滤(压力范围为1-20MPa),得到滤液;所述滤器的滤膜孔径不大于0.45微米,优选为0.22或0.45微米,整个过滤装置的温度控制在0-4℃。
上述滤膜孔径不能大于0.45微米,不然血细胞不能通过过滤除去,同时过滤的温度不能高于8℃,最好是0-4℃,不然最终产物里面的蛋白可能变性从而失去活性。
示例性地,上述压力可以为1MPa、5MPa、10MPa、15MPa、20MPa等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述温度可以为0℃、1℃、2℃、3℃、4℃等中任意值或任意两者之间的数值范围。
本步骤的目的是去除血浆中可能残留的血细胞。
步骤三、低温超滤:
将所述低温过滤得到的滤液进行膜包超滤,使用蠕动泵施加压力(范围为1~20MPa),得到低温超滤产物;在膜包超滤过程中,有效成分会进入缓冲液内;所述膜包截留的分子量为3kD-10kD,超滤使用的缓冲液为磷酸盐缓冲液,Tris-盐酸缓冲液和HBS缓冲液等常用缓冲液,整个超滤装置的温度控制在0到10度,优选地,所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-100mM、pH值为7.0-9.0,所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-400mM、pH值为6.0-9.2,所述HBS缓冲液的浓度为0.5-400mM、pH值为6.4-8.0;更优选地,所述缓冲液为1mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液。
上述膜包孔径不能大于10kD,不然在超滤过程中一些有效果的蛋白就会流失,同时超滤的温度不能高于8度,最好是0-4℃,不然最终产物里面的蛋白可能变性从而失去活性。
示例性地,上述压力可以为1MPa、5MPa、10MPa、15MPa、20MPa等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述膜包截留分子量可以为3kD、5kD、7kD、10kD等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述Tris-盐酸缓冲液的浓度可以为0.2mM、1mM、5mM、10mM、50mM、100mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为7.0、8.0、9.0等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述磷酸缓冲液的浓度可以为1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、400mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为6.0、7.0、8.0、9.2等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述HBS缓冲液的浓度可以为0.5mM、1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、400mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为6.4、7.0、7.5、8.0等中任意值或任意两者之间的数值范围。
本步骤的目的是将血浆里面的物质置换到在pH确定的缓冲液中,从而方便控制溶液体系的pH。
步骤四、冷乙醇沉淀:
将所述低温超滤产物进行冷乙醇沉淀,得到冷乙醇沉淀产物;其中,冷乙醇是在0-零下20℃预冷后和低温超滤产物以1:(1-5)体积比进行混合,混合后于0-零下10℃放置,直至沉淀自动沉降变实(此处“变实”指的是:上清和沉淀有明显的分界线,上清变得透亮,沉淀数量不再增多),得到冷乙醇沉淀后的上清液,作为到本步骤的产物。
上述乙醇和低温超滤产物采用不同体积比,沉淀出来的蛋白是不同的;同时温度必须保持在0到负10℃范围内,不然沉淀出的蛋白可能会变性。
示例性地,上述冷乙醇预冷的温度可以为0℃、-2℃、-4℃、-5℃、-8℃、-10℃、-15℃、-20℃等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述混合后放置的温度可以为0℃、-2℃、-4℃、-5℃、-8℃、-10℃等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述冷乙醇和低温超滤产物的体积比为1:1、1:2、1:2.5、1:4、1:5等中任意值或任意两者之间的数值范围。
本步骤的目的是沉淀出有功效的蛋白组分以及这些蛋白结合的小分子。
步骤五、SD灭活:
将所述冷乙醇沉淀后的上清液用SD灭活剂重新悬浮,放于4~40℃静置6~24h,优选24℃静置12h,得到灭活产物;SD灭活剂含有0.3~2%TnBP(N-丁基三磷酸盐)和0.5~2%Tween,优选为含有0.3%TnBP和1%Tween80。
上述静置的温度不能低于4℃,时间不能短于6小时,不然病毒灭活的效果会比较一般,不同病毒的灭活时间也不同。
SD灭活剂的配制如下:以配制100mL的SD灭活剂为例,将0.3-2mL TnBP溶于适量水中,然后加入0.5~2mLTween80,混合均匀后用水补至100mL。
示例性地,上述静置的时间可以为6h、12h、18h、20h、24h等中任意值或任意两者之间的数值范围,温度可以为4℃、10℃、25℃、30℃、40℃等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述TnBP的百分比浓度可以为0.3%、0.5%、1%、1.5%、2%,上述Tween的百分比浓度可以为0.5%、1%、1.5%、2%。
本步骤的目的是使得初始原料人血中的潜在病毒失去活性,从而提高最终产品的安全性。
步骤六、离心分离:
将所述灭活产物进行离心分离,保留上清液,作为离心分离产物;优选地,所述离心转速为2000-5000g,离心时间为10-30min,离心温度为0-8℃。
上述离心力不能小于2000g,离心时间不能小于10min,不然变性聚集沉淀的杂蛋白会出现沉降不实的情况。
示例性地,上述离心转速可以为2000g、2500g、4000g、5000g等中任意值或任意两者之间的数值范围,时间可以为10min、15min、20min、25min、30min等中任意值或任意两者之间的数值范围,温度可以为0℃、2℃、4℃、5℃、8℃等中任意值或任意两者之间的数值范围。
本步骤的目的是去除一些因为SD病毒灭活步骤而变性聚集沉淀的杂蛋白,不然这些变性聚沉的杂蛋白会干扰下游的阴离子交换步骤。
步骤七、阴离子交换:
将所述离心分离产物加入阴离子交换柱(比如SourceQ)中,用含有20-500mM氯化钠的缓冲液进行梯度洗脱,洗脱速度为1~5ml/min;当洗脱体积为15-35ml时开始收集洗脱液,当洗脱体积为40-85ml时停止收集洗脱液,收集得到的洗脱液,作为阴离子交换产物;优选地,所述的缓冲液为Tris-盐酸缓冲液,浓度为0.2-200mM、pH值为7.0-9.2;
上述梯度洗脱中,“梯度”的实现是通过蛋白层析仪器进行设立的,具体实现方式是:打开蛋白层析仪器(NGC Chromatography System,BIO-RAD)操作软件,设立梯度洗脱参数:流速3ml/min,时间60min,浓度500mM氯化钠,线性;这样设立参数后,流过层析柱的氯化钠浓度,将会在60min内,从0mM线性变化到500mM,从而实现线性梯度洗脱。
本步骤中限定了氯化钠浓度,流速,缓冲液浓度和pH以及开始和停止收集的洗脱液的体积这些参数的数值范围;如果采用该数值范围以外的参数,制备出的产物,其蛋白和小分子组成上和HC4201612差异会较大,与此同时也会失去HC4201612的疗效。
示例性地,上述缓冲液中氯化钠的浓度可以为20mM、50mM、100mM、250mM、400mM、500mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述开始收集洗脱液时的洗脱体积可以为15ml、20ml、25ml、30ml、35ml等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述停止收集洗脱液时的洗脱体积可以为40ml、50ml、60ml、70ml、85ml等中任意值或任意两者之间的数值范围,上述Tris-盐酸缓冲液的浓度可以为0.2mM、0.5mM、1mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为7.0、8.0、8.5、9.2等中任意值或任意两者之间的数值范围。
本步骤的目的为制备含有有效成分的蛋白和与这些蛋白结合的小分子。
步骤八、透析:
将所述阴离子交换后的产物放入透析袋或管中进行透析,透析后收集透析袋或管中的产物,作为透析产物;其中,所述透析时使用的透析缓冲液为Tris-盐酸缓冲液,磷酸缓冲液或HBS缓冲液;优选地,所述Tris-盐酸缓冲液的浓度为0.2-100mM、pH值为7.0-9.0,所述磷酸缓冲液的浓度为1.0-400mM、pH值为6.0-9.2,所述HBS缓冲液的浓度为0.5-400mM、pH值为6.4-8.0;更优选地,所述透析缓冲液为1mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液;透析时间为20-72h,透析体积比是1:(100-10000)。
本步骤中的透析时间小于20小时,会发生杂质去除不完全的情况,当透析时间超过72小时,生产的时间成本又会显著增加。
示例性地,上述Tris-盐酸缓冲液的浓度可以为0.2mM、1mM、5mM、10mM、50mM、100mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为7.0、8.0、9.0等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述磷酸缓冲液的浓度可以为1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、400mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为6.0、7.0、8.0、9.2等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述HBS缓冲液的浓度可以为0.5mM、1mM、10mM、50mM、100mM、200mM、400mM等中任意值或任意两者之间的数值范围,pH值可以为6.4、7.0、7.5、8.0等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述透析时间可以为20h、25h、50h、60h、72h等中任意值或任意两者之间的数值范围;上述透析体积比可以为1:100、1:500、1:1000、1:2500、1:5000、1:10000等中任意值或任意两者之间的数值范围。
本步骤中的透析操作,可以去除之前步骤中的杂质,如乙醇、灭活剂,以防止该介质对下游产品制备产生不良影响。
步骤九、浓缩:
将所述透析产物进行浓缩,得到浓缩后的产物即所述混合物HC4201612;其中,浓缩前体积是浓缩后体积的10倍或10倍以上,优选为10-100倍;优选地,所述浓缩是采用浓缩管离心的方式进行的,所述浓缩管允许1.5-2.5KD的物质通过,所述离心时转速为2000-3000g,温度为2-8℃,浓缩倍数达到要求后停止浓缩即可;优选地,所述浓缩是采用浓缩杯加压的方式进行的,所述浓缩杯允许1.5-2.5KD的物质通过,所述加压的压力范围为1~10MPa。
本步骤中限定了以下参数的数值范围:浓缩倍数、浓缩管和浓缩杯允许通过的分子量大小、浓缩使用的压力或者离心力、浓缩时的温度范围;当浓缩倍数低于10倍时,单位成分的疗效一般,且渗透压偏低,得另行补充一些氯化钠调节渗透压;当浓缩使用的压力小于1MPa或者离心力小于2000g时,浓缩速度会非常慢,耗时比较长;所用的浓缩管或浓缩杯大小大于2.5kD时,最终制备的混合物里面的一些有效成分会流失,但当浓缩管或浓缩杯大小小于1.5kD时,浓缩速度也会非常慢,耗时比较长;浓缩温度高于8℃时,浓缩过程中一些有效成分可能会因为温度偏高而变性从而失去活性,浓缩温度低于2℃时,温度控制系统的价钱又会相对较高,同时存在浓缩产物因为温度太低发生聚集沉淀的风险。
示例性地,上述倍数可以为10倍、25倍、50倍、75倍、100倍等中任意值或任意两者之间的数值范围,所述浓缩管、浓缩杯允许通过的物质的大小均为1.5KD、1.75KD、2KD、2.25KD、2.5KD等中任意值或任意两者之间的数值范围,所述离心转速为2000g、2250g、2500g、2750g、3000g等中任意值或任意两者之间的数值范围,温度为2℃、4℃、5℃、8℃等中任意值或任意两者之间的数值范围,所述压力为等中任意值或任意两者之间的数值范围。
本步骤的目的是提高所述混合物HC4201612中有效组分的浓度,从而提高单位成分的疗效。目的之二是通过浓缩,调节溶液的渗透压。
上述制备方法中使用的各种常用试剂均采用常规方法配制。
第三方面,本发明提供一种药物组合物,包含所述混合物HC4201612和药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体包括:药学上可接受的缓冲液、蛋白质、明胶、单糖、多糖、氨基酸、螯合剂、糖醇、聚乙二醇、以及表面活性剂中的一种或多种。
作为优选的实施方式,所述药物组合物包括如下组分:1倍体积的所述混合物HC4201612,9倍体积的8.5wt%NaCl或1.5M、pH7.0的PBS;优选地,所述药物组合物中还包括白蛋白、葡萄糖以及谷氨酰胺,其中,所述白蛋白在所述药物组合物中的质量体积百分比为2%,所述葡萄糖在所述药物组合物中的质量体积百分比为1%,所述谷氨酰胺在所述药物组合物中的质量体积百分比为3%。
第四方面,本发明提供一种缓释制剂,包含所述混合物HC4201612以及药学上可接受的生物相容物质;优选地,所述缓释制剂的剂型为脂质体、微球、水凝胶、微型渗透泵或微胶囊。上述药学上可接受的生物相容物质(即药学上可接受的载体)可以为:含水的pH缓冲液,包括磷酸盐、柠檬酸盐、或其他有机酸的缓冲液、抗坏血酸或其他抗氧化剂,低分子量(不超过10个残基)多肽、血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白或其他蛋白质、聚乙烯吡咯烷酮或其他亲水性多聚体、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、赖氨酸或其他氨基酸、单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖、糊精或其他糖类、EDTA或其他螯合剂、甘露醇、山梨醇或其他糖醇、钠离子或其他成盐反离子、
聚乙二醇(PEG)、
或其他非离子表面活性剂。
第五方面,本发明提供一种试剂盒,包含有:所述混合物HC4201612、或/和包含所述混合物HC4201612的上述药物组合物、或/和包含所述混合物HC4201612的上述缓释剂。
第六方面,本发明提供所述混合物HC4201612、或/和包含所述混合物HC4201612的上述药物组合物、或/和包含所述混合物HC4201612的上述缓释剂、或/和包含所述混合物HC4201612的上述试剂盒,在预防、改善或/和治疗老年痴呆症的药物中的应用。
第七方面,本发明提供所述混合物HC4201612、或/和包含所述混合物HC4201612的上述药物组合物、或/和包含所述混合物HC4201612的上述缓释剂、或/和包含所述混合物HC4201612的上述试剂盒,在增强记忆力的药物中的应用。
下面通过实施例对本发明混合物的制备、鉴定和应用进行说明。以下实施例中涉及的分子生物学操作如未注明具体试验条件和方法,请参照SambrookJ等主编,科学出版社,2002,分子克隆实验指南(第三版)或相应产品的说明书。
下面通过实施例对本发明混合物的制备、鉴定和应用进行说明。以下实施例中使用的原代海马细胞是按照如下参考文献培养的:Guo,W.,Y.Ji,et al.(2014)."Neuronalactivity alters BDNF-TrkB signaling kinetics and downstream functions."J CellSci 127(Pt 10):2249-2260。
实施例1
本实施例是混合物HC4201612的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)收集血浆
健康人的血液由医院献血所得(采血管为抗凝管),采血过程中边放血边摇晃采血管,防止血液凝固。将含有血液的采血管放入离心机,设定转速为1500g,离心15分钟,离心温度为4℃。然后用移液器小心吸取上清,即为收集到的人血浆。
(2)低温过滤:
将收集到的血浆加入滤膜孔径为0.22微米的滤器中,使用蠕动泵施加压力10MPa进行过滤,其过程中整个过滤装置的温度控制在0-4℃,得到滤液。
(3)低温超滤:
将该滤液用截留的分子量为5kD的膜包超滤,使用蠕动泵施加压力10MPa,其过程中使用的缓冲液为浓度1mM、pH8.0的Tris盐酸缓冲液,整个超滤装置的温度控制在0-4℃,得到低温超滤产物。
(4)冷乙醇沉淀:
将零下20度预冷的乙醇与该低温超滤产物按照体积比1:3混合,再于0℃放置至沉淀自动沉降变实,得到冷乙醇沉淀产物。
(5)SD灭活:
将该冷乙醇沉淀产物用SD灭活剂(含有1%TnBP,1%Tween)重新悬浮,放于24℃静置12小时,得到灭活产物。
(6)离心分离:
将该灭活产物于3000g、0-4℃离心20分钟,保留上清液,作为离心分离产物。
(7)阴离子交换:
将该离心分离产物200微升加到阴离子交换柱Source Q中,用含有500mM氯化钠的Tris盐酸缓冲液(200mM,pH8.0)进行梯度洗脱,其中阴离子交换柱的填料为Q Sepharose(购自GE Healthcare),平均粒度为3微米,阴离子交换柱体积为25毫升,洗脱速度为4ml/min,上样速度为3ml/ml;当洗脱体积为35毫升时开始收集洗脱液,当洗脱体积为45毫升时停止收集洗脱液;收集到的该部分洗脱液具有疗效活性,作为阴离子交换产物。
(8)透析:
将该离子交换加入到孔径约为0.25纳米透析袋中,然后将该透析袋放入1L的烧杯中,再向该烧杯中透析袋外加入1L的1mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0),边搅拌边透析;透析温度为4℃,透析时间为24小时,得到透析产物。
(9)浓缩:
取少量该透析产物加入到体积为2mL的浓缩管中,浓缩管允许大小为2kD的物质通过;再将浓缩管放入离心机中,设定转速为3000g,设定温度为4℃,启动离心机,开始浓缩,直到最终体积为500微升;之后,将剩余的该透析产物的再次加入该离心管中,以使体积达到2mL,以相同的参数进行离心,再次浓缩至最终体积为500微升;如此循环浓缩,直到将透析后的血浆组分最终浓缩到体积为500微升,作为浓缩产物,即为上述混合物HC4201612。
实施例2
本实施例是将实施例1制备的混合物HC4201612进行SDS-PAGE变性胶电泳鉴定。该鉴定方法包括以下步骤:
(1)从上述混合物HC4201612里取出2微升,在紫外280nm下测定其吸光度,从而计算混合物HC4201612的蛋白浓度。
(2)取一定体积的混合物HC4201612,与1微升5×蛋白上样缓冲液(购自北京兰博利德生物技术有限公司,货号D621)混合,即为需要进行电泳的样品,该样品里面有10微克的蛋白质。
(3)将电泳样品升温至100℃,加热20分钟使蛋白质变性,然后立即将样品放到冰上,等待5分钟后开始跑SDS-PAGE变性还原胶(所述SDS变性还原胶的配制方法如下:30(w/v)%的丙烯酰胺Acr-Bis(购自GE Healthcare)取1.3ml、1.5M Tris-盐酸缓冲液(pH8.8,购自GE Healthcare)取1.3ml、10(w/v)%的SDS取0.05ml、10%(w/v)过硫酸铵(购自GEHealthcare)取0.05ml、TEMED(购自GE Healthcare)取0.003ml、以及水取2.3ml,共计5ml,混合后在室温即可凝固成胶)。跑胶时,每个泳道的蛋白上样量为10微克,设定跑胶电压为100V,开始跑胶,跑胶时间为1小时。
(4)跑完胶后,用考马斯亮蓝染色液(该染色液的制备方法为:将2.5g考马斯亮蓝R-250溶于500ml 95%乙醇溶液,加入100ml 85%的乙酸溶液,然后,用蒸馏水补充至1000ml,此染液放4℃至少6个月保持稳定)对胶进行染色。
检测结果参见图1:其中:泳道M:蛋白分子量标准;泳道1-4:HC4201612混合物;该混合物HC4201612里至少含有6条肉眼可见多肽,其分子量分别为从小到大依次是25kD,55kD,68kD,73kD,100kD,160kD。
实施例3
实施例1制备的混合物HC4201612的蛋白质质谱鉴定
(1)将血浆分离物HC4201613转移到FALCON管中,加入两倍体积的样品缓冲液(缓冲液的配方为:7.5M尿素UREA,1.5M硫脲THIOUREA,4(w/v)%3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPS,0.05(w/v)%十二烷基硫酸钠SDS,100mM二硫苏糖醇DDT,各组分前的所示浓度是其相应组分在缓冲液中的浓度),并通过3kDamolecular weight cut-off spincolumns(Pall GmbH,Austria)离心管离心浓缩,得到浓缩液。
(2)浓缩液用二硫苏糖醇进行还原反应,得到还原产物;其中,浓缩液与二硫苏糖醇的体积比为1:3,反应时间为15分钟,温度为室温。
(3)再将该还原产物与碘乙酰胺进行反应,得到烷基化产物;其中,该还原产物与碘乙酰胺的体积比1:1,反应时间为15分钟,温度为室温;
(4)随后用胰蛋白酶在37℃进行消化反应过夜,其中烷基化产物与胰蛋白酶的体积比1:1,得到消化后的肽段。
(5)胰蛋白酶消化所得肽段通过C18色谱柱纯化,得到样品。
(6)所得样品真空离心干燥并随后保存在-20℃冰箱中用于MS/MS分析。MS/MS分析具体如下:HPLC用的是Ultimate 3000系统,其中配备了PepMap100 C-18 trapcolumn(300μm×5mm)和PepMap100 C-18 analytical column(75μm×250mm)两根柱子。质谱仪采用Amazon speed ETD,MS数据采集范围为400-1400m/z,MS/MS的肽段处理范围为100-2800m/z。随后,每个MS数据会自动搜索与其匹配的三个质量最好的CID MS/MS峰谱。喷嘴口电压设置为1400伏特。氮气保护的温度为150℃,流速为3升/分钟。MS的蛋白质识别和无标记定量(LFQ)数据分析采用开放源代码软件MaxQuant 1.3.0.5。通过搜索SwissProt数据库(版本10/2003 20354项)对蛋白质进行鉴定,鉴定结果参见表1。
实施例4
本实施例是检测实施例1制备的混合物HC4201612具有体外抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性。该检测方法包括以下步骤:
(1)从上述混合物HC4201612里取出2微升,在紫外280nm下测定其吸光度,从而计算上述混合物HC4201612的蛋白浓度。
(2)用24孔板培养原代海马细胞,培养所用培养基为DMEM,培养条件为37℃,5vol%二氧化碳。
(3)等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时,往培养基里加入混合物HC4201612,每个孔中加入的混合物HC4201612含蛋白1000微克,作为实验组1-混合物HC4201612。同时实验组中还包括:即往不同孔的培养基里分别加入蛋白含量为1000微克的人血浆(实施例1制备方法的步骤(1)制备得到),命名为实验组2-人血浆。同时设置对照组,在对照组中,等到细胞密度达到每孔4×105个细胞时,往孔的培养基中添加100微升的生理盐水。
(4)在原先的条件下继续培养细胞24小时,然后在光学显微镜下对各实验组和对照组进行细胞数量和突触数量的计数。
如图2,其中(a),(b),(c)分别是按照实验组1-HC4201612混合物、实验组2-人血浆、对照组处理后得到的原代海马细胞。可观测到无论是海马细胞数量还是形成的突触数量,实验组1-HC4201612混合物均远远大于对照组,大于实验组2-人血浆。
如图3,实验组1的原代海马细胞的数量达到约1200个/平方厘米,远大于实验组2的约250个/平方厘米,和对照组的约600个/平方厘米,证明HC4201612混合物具有抑制原代海马细胞凋亡的活性。
如图4,实验组1的突触形成数量达到约350个/平方厘米,远大于实验组2的约50个/平方厘米,和对照组的约50个/平方厘米,证明HC4201612混合物具有促进海马细胞之间突触形成的活性。
实施例5
本实施例是检测实施例1制备的混合物HC4201612能够有效提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力。该检测方法包括以下步骤:
(1)本实施例采用5XFAD老年痴呆小鼠模型,订购于美国jackson laboratory,并按照动物实验标准进行繁殖和饲养;其中每一只实验模型小鼠都通过鼠尾进行基因鉴定,确保APP基因和PS1基因的稳定突变。
小鼠的分组为:实验组1-混合物HC4201612:采用20只14周龄5XFAD雄性小鼠,注射实施例1制备的混合物HC4201612;实验组2-人血浆:采用20只14周龄5XFAD雄性小鼠,注射实施例1制备方法的步骤(1)制备得到的血浆;对照组:采用20只14周龄5XFAD雄性小鼠,注射生理盐水。
各种给药通过鼠尾静脉注射进小鼠体内,实验组保证30微克蛋白/次的给药剂量,在行为学实验(具体为水迷宫实验,用于检测小鼠的学习能力和记忆力)前24天内每三天给药1次,共给药8次。
(2)水迷宫实验:在每天上午8点到下午1点间进行。水迷宫空间记忆训练期为4天,每天4次,每次训练间隔时间为10分钟;在实验中,每四个小鼠被随机分为一个训练组。对于每个训练组,水迷宫的平台位置被随机分配,且在整个训练中保持不变。训练中,小鼠从任意位置释放入水迷宫中,并允许它在120秒中搜索隐藏的平台。如果小鼠没有在120秒内找到平台,它将被引导到平台。每次训练中找到平台所用的时间和所经过的距离被智能摄像头自动记录下来。水迷宫测试在最后一次训练48小时后进行,每只小鼠被释放入没有放置平台的水迷宫中,并允许其自由活动60秒。其游动路线被智能摄像头自动记录下来。测试期比训练期时间短一倍,以避免小鼠产生抑郁行为。小鼠在目标象限所花费的时间与其他三个象限所花费的时间被记录下来,用于对小鼠记忆力的评估。
测试结果如图5,实验组1的目标象限停留记忆时间达到约43秒,远大于实验组2的约20秒,和对照组的约13秒,证明HC4201612混合物对阿尔兹海默症小鼠记忆力有明显的提升作用。
实施例6
本实施例中,除步骤(9)不同于实施例1以外,其他制备步骤均与实施例1相同,在本实施例中,步骤(9)具体如下:
将实施例1步骤(8)制备的透析产物加入允许2kD物质通过的浓缩杯中,盖上浓缩杯盖,将浓缩杯放入的层析柜,然后将浓缩杯接上液氮瓶,打开液氮瓶气阀门,设定压力为10MPa;在此气压下,浓缩杯开始浓缩透析后产物,观测到浓缩后产物的体积是浓缩前的1/50时,停止浓缩,得到浓缩产物,即为混合物HC4201612。
采用与实施例2-3相同的方法对本实施例得到的混合物进行检测,结果与实施例1得到的混合物相同。
实施例7
本实施例是检测实施例6制备的混合物HC4201612具有体外抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性。该检测方法与实施例4中相同。
检测结果表明,实验组1的原代海马细胞的数量达到约1500个/平方厘米,远大于实验组2的约250个/平方厘米,和对照组的约600个/平方厘米,证明HC4201612混合物具有抑制原代海马细胞凋亡的活性。实验组1的突触形成数量达到约360个/平方厘米,远大于实验组2的约50个/平方厘米,和对照组的约50个/平方厘米,证明HC4201612混合物具有促进海马细胞之间突触形成的活性。
实施例8
本实施例是检测实施例6制备的混合物HC4201612能够有效提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力。该检测方法与实施例5中相同。
测试结果表明,实验组1的目标象限停留记忆时间达到约45秒,远大于实验组2的约20秒,和对照组的约13秒,证明HC4201612混合物对阿尔兹海默症小鼠记忆力有明显的提升作用。
实施例9
本实施例是混合物HC4201612的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)收集血浆:操作与实施例1中步骤(1)相同。
(2)低温过滤:
将收集到的血浆加入滤膜孔径为0.22微米的滤器中,使用蠕动泵施加压力1MPa进行过滤,其过程中整个过滤装置的温度控制在0℃,得到滤液。
(3)低温超滤:
将该滤液用截留的分子量为3kD的膜包超滤,使用蠕动泵施加压力1MPa,其过程中使用的缓冲液为浓度1mM、pH8.0的Tris盐酸缓冲液,整个超滤装置的温度控制在0℃,得到低温超滤产物。
(4)冷乙醇沉淀:
将0℃预冷的乙醇与该低温超滤产物按照体积比1:5混合,再于-10℃放置至沉淀自动沉降变实,得到冷乙醇沉淀产物。
(5)SD灭活:
将该冷乙醇沉淀产物用SD灭活剂(含有1%TnBP,1%Tween)重新悬浮,放于4℃静置24小时,得到灭活产物。
(6)离心分离:
将该灭活产物于2000g、4℃离心30分钟,保留上清液,作为离心分离产物。
(7)阴离子交换:
将该离心分离产物200微升加到阴离子交换柱Source Q中,用含有20mM氯化钠的Tris盐酸缓冲液(200mM,pH8.0)进行梯度洗脱,其中阴离子交换柱的填料为Q Sepharose(购自GE Healthcare),平均粒度为3微米,阴离子交换柱体积为25毫升,洗脱速度为1ml/min,上样速度为3ml/ml;当洗脱体积为15毫升时开始收集洗脱液,当洗脱体积为40毫升时停止收集洗脱液;收集到的该部分洗脱液具有疗效活性,作为阴离子交换产物。
(8)透析:
将该离子交换加入到孔径约为0.25纳米透析袋中,然后将该透析袋放入1L的烧杯中,再向该烧杯中透析袋外加入1L的1mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0),边搅拌边透析;透析温度为4℃,透析时间为20小时,得到透析产物。
(9)浓缩:
取少量该透析产物加入到体积为2mL的浓缩管中,浓缩管允许大小为1.5kD的物质通过;再将浓缩管放入离心机中,设定转速为2000g,设定温度为4℃,启动离心机,开始浓缩,直到最终体积为500微升;之后,将剩余的该透析产物的再次加入该离心管中,以使体积达到2mL,以相同的参数进行离心,再次浓缩至最终体积为500微升;如此循环浓缩,直到将透析后的血浆组分最终浓缩到体积为500微升,作为浓缩产物,即为上述混合物HC4201612。
采用与实施例2-3相同的方法对本实施例得到的混合物进行检测,结果与实施例1得到的混合物相同。
实施例10
本实施例是检测实施例9制备的混合物HC4201612具有体外抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性。该检测方法与实施例4中相同。
检测结果表明,实验组1的原代海马细胞的数量达到约1200个/平方厘米,远大于实验组2的约250个/平方厘米,和对照组的约600个/平方厘米,证明HC4201612混合物具有抑制原代海马细胞凋亡的活性。实验组1的突触形成数量达到约350个/平方厘米,远大于实验组2的约50个/平方厘米,和对照组的约50个/平方厘米,证明HC4201612混合物具有促进海马细胞之间突触形成的活性。
实施例11
本实施例是检测实施例9制备的混合物HC4201612能够有效提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力。该检测方法与实施例5中相同。
测试结果表明,实验组1的目标象限停留记忆时间达到约50秒,远大于实验组2的约20秒,和对照组的约15秒,证明HC4201612混合物对阿尔兹海默症小鼠记忆力有明显的提升作用。
实施例12
本实施例是混合物HC4201612的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)收集血浆:操作与实施例1中步骤(1)相同。
(2)低温过滤:
将收集到的血浆加入滤膜孔径为0.45微米的滤器中,使用蠕动泵施加压力20MPa进行过滤,其过程中整个过滤装置的温度控制在4℃,得到滤液。
(3)低温超滤:
将该滤液用截留的分子量为10kD的膜包超滤,使用蠕动泵施加压力20MPa,其过程中使用的缓冲液为浓度1mM、pH8.0的Tris盐酸缓冲液,整个超滤装置的温度控制在4℃,得到低温超滤产物。
(4)冷乙醇沉淀:
将-10℃预冷的乙醇与该低温超滤产物按照体积比1:4混合,再于-5℃放置至沉淀自动沉降变实,得到冷乙醇沉淀产物。
(5)SD灭活:
将该冷乙醇沉淀产物用SD灭活剂(含有1%TnBP,1%Tween)重新悬浮,放于40℃静置6小时,得到灭活产物。
(6)离心分离:
将该灭活产物于5000g、0℃离心10分钟,保留上清液,作为离心分离产物。
(7)阴离子交换:
将该离心分离产物200微升加到阴离子交换柱Source Q中,用含有500mM氯化钠的Tris盐酸缓冲液(200mM,pH8.0)进行梯度洗脱,其中阴离子交换柱的填料为QSepharose(购自GE Healthcare),平均粒度为3微米,阴离子交换柱体积为25毫升,洗脱速度为5ml/min,上样速度为3ml/ml;当洗脱体积为35毫升时开始收集洗脱液,当洗脱体积为85毫升时停止收集洗脱液;收集到的该部分洗脱液具有疗效活性,作为阴离子交换产物。
(8)透析:
将该离子交换加入到孔径约为0.25纳米透析袋中,然后将该透析袋放入1L的烧杯中,再向该烧杯中透析袋外加入1L的1mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0),边搅拌边透析;透析温度为4℃,透析时间为72小时,得到透析产物。
(9)浓缩:
取少量该透析产物加入到体积为2mL的浓缩管中,浓缩管允许大小为2.5kD的物质通过;再将浓缩管放入离心机中,设定转速为2500g,设定温度为4℃,启动离心机,开始浓缩,直到最终体积为500微升;之后,将剩余的该透析产物的再次加入该离心管中,以使体积达到2mL,以相同的参数进行离心,再次浓缩至最终体积为500微升;如此循环浓缩,直到将透析后的血浆组分最终浓缩到体积为500微升,作为浓缩产物,即为上述混合物HC4201612。
采用与实施例2-3相同的方法对本实施例得到的混合物进行检测,结果与实施例1得到的混合物相同。
实施例13
本实施例是检测实施例12制备的混合物HC4201612具有体外抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性。该检测方法与实施例4中相同。
检测结果表明,实验组1的原代海马细胞的数量达到约1400个/平方厘米,远大于实验组2的约250个/平方厘米,和对照组的约600个/平方厘米,证明HC4201612混合物具有抑制原代海马细胞凋亡的活性。实验组1的突触形成数量达到约350个/平方厘米,远大于实验组2的约50个/平方厘米,和对照组的约50个/平方厘米,证明HC4201612混合物具有促进海马细胞之间突触形成的活性。
实施例14
本实施例是检测实施例12制备的混合物HC4201612能够有效提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力。该检测方法与实施例5中相同。
测试结果表明,实验组1的目标象限停留记忆时间达到约55秒,远大于实验组2的约20秒,和对照组的约15秒,证明HC4201612混合物对阿尔兹海默症小鼠记忆力有明显的提升作用。
实施例15
本实施例是混合物HC4201612的制备方法,该方法包括以下步骤:
(1)收集血浆:操作与实施例1中步骤(1)相同。
(2)低温过滤:
将收集到的血浆加入滤膜孔径为0.45微米的滤器中,使用蠕动泵施加压力15MPa进行过滤,其过程中整个过滤装置的温度控制在4℃,得到滤液。
(3)低温超滤:
将该滤液用截留的分子量为8kD的膜包超滤,使用蠕动泵施加压力15MPa,其过程中使用的缓冲液为浓度1mM、pH8.0的Tris盐酸缓冲液,整个超滤装置的温度控制在4℃,得到低温超滤产物。
(4)冷乙醇沉淀:
将-15℃预冷的乙醇与该低温超滤产物按照体积比1:1混合,再于-4℃放置至沉淀自动沉降变实,得到冷乙醇沉淀产物。
(5)SD灭活:
将该冷乙醇沉淀产物用SD灭活剂(含有1%TnBP,1%Tween)重新悬浮,放于20℃静置15小时,得到灭活产物。
(6)离心分离:
将该灭活产物于4000g、8℃离心15分钟,保留上清液,作为离心分离产物。
(7)阴离子交换:
将该离心分离产物200微升加到阴离子交换柱Source Q中,用含有100mM氯化钠的Tris盐酸缓冲液(200mM,pH8.0)进行梯度洗脱,其中阴离子交换柱的填料为Q Sepharose(购自GE Healthcare),平均粒度为3微米,阴离子交换柱体积为25毫升,洗脱速度为3ml/min,上样速度为3ml/ml;当洗脱体积为30毫升时开始收集洗脱液,当洗脱体积为65毫升时停止收集洗脱液;收集到的该部分洗脱液具有疗效活性,作为阴离子交换产物。
(8)透析:
将该离子交换加入到孔径约为0.25纳米透析袋中,然后将该透析袋放入1L的烧杯中,再向该烧杯中透析袋外加入1L的1mM Tris盐酸缓冲液(pH8.0),边搅拌边透析;透析温度为4℃,透析时间为50小时,得到透析产物。
(9)浓缩:
取少量该透析产物加入到体积为2mL的浓缩管中,浓缩管允许大小为2.0kD的物质通过;再将浓缩管放入离心机中,设定转速为2800g,设定温度为4℃,启动离心机,开始浓缩,直到最终体积为500微升;之后,将剩余的该透析产物的再次加入该离心管中,以使体积达到2mL,以相同的参数进行离心,再次浓缩至最终体积为500微升;如此循环浓缩,直到将透析后的血浆组分最终浓缩到体积为500微升,作为浓缩产物,即为上述混合物HC4201612。
采用与实施例2-3相同的方法对本实施例得到的混合物进行检测,结果与实施例1得到的混合物相同。
实施例16
本实施例是检测实施例15制备的混合物HC4201612具有体外抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性。该检测方法与实施例4中相同。
检测结果表明,实验组1的原代海马细胞的数量达到约1500个/平方厘米,远大于实验组2的约250个/平方厘米,和对照组的约600个/平方厘米,证明HC4201612混合物具有抑制原代海马细胞凋亡的活性。实验组1的突触形成数量达到约400个/平方厘米,远大于实验组2的约50个/平方厘米,和对照组的约50个/平方厘米,证明HC4201612混合物具有促进海马细胞之间突触形成的活性。
实施例17
本实施例是检测实施例15制备的混合物HC4201612能够有效提升阿尔兹海默症(老年痴呆症)小鼠的记忆力。该检测方法与实施例5中相同。
测试结果表明,实验组1的目标象限停留记忆时间达到约45秒,远大于实验组2的约20秒,和对照组的约15秒,证明HC4201612混合物对阿尔兹海默症小鼠记忆力有明显的提升作用。
对比例1
除步骤(3)低温超滤步骤中使用的膜包截留的分子量为30kD以外,其他操作步骤与实施例1相同。
该对比例得到的最终产物命名为C1,C1电泳结果如下:55kD,68kD,73kD,100kD,160kD;采用与实施例4相同的方法测试该产物C1抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性,其结果如下:
实验组1的原代海马细胞的数量达到约580个/平方厘米,实验组2的约300个/平方厘米,和对照组的约620个/平方厘米,证明该方法下制备的C1并不能显著抑制原代海马细胞凋亡,丧失了疗效活性。实验组1的突触形成数量达到约50个/平方厘米,实验组2的约52个/平方厘米,和对照组的约58个/平方厘米,证明该方法下制备的C1并不能显著促进原代海马细胞突触形成,丧失了疗效活性。
对比例2
除步骤(4)冷乙醇沉淀步骤中乙醇与低温超滤产物的体积比为1:10以外,其他操作步骤与实施例1相同。
该对比例得到的最终产物命名为C2,C2电泳结果如下:25kD,68kD,73kD,160kD;采用与实施例4相同的方法测试该产物C2抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性,其结果如下:
实验组1的原代海马细胞的数量达到约430个/平方厘米,实验组2的约380个/平方厘米,和对照组的约560个/平方厘米,证明该方法下制备的C2并不能显著抑制原代海马细胞凋亡,丧失了疗效活性。实验组1的突触形成数量达到约62个/平方厘米,实验组2的约55个/平方厘米,和对照组的约59个/平方厘米,证明该方法下制备的C2并不能显著促进原代海马细胞突触形成,丧失了疗效活性。
对比例3
步骤(7)中洗脱缓冲液(Tris-HCl:500mM,pH6.4)中的氯化钠浓度为5mM,洗脱速度8ml/min,当洗脱体积为60ml时开始收集洗脱液,当洗脱体积为100ml时停止收集洗脱液;除此之外,其他操作步骤与实施例1相同。
该对比例得到的最终产物命名为C3,C3电泳结果如下:73kD,100kD,160kD;采用与实施例4相同的方法测试该产物C3抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性,其结果如下:
实验组1的原代海马细胞的数量达到约500个/平方厘米,实验组2的约380个/平方厘米,和对照组的约550个/平方厘米,证明该方法下制备的C3并不能显著抑制原代海马细胞凋亡,丧失了疗效活性。实验组1的突触形成数量达到约68个/平方厘米,实验组2的约60个/平方厘米,和对照组的约62个/平方厘米,证明该方法下制备的C3并不能显著促进原代海马细胞突触形成,丧失了疗效活性。
对比例4
除步骤(8)中透析时间为2小时之外,其他操作步骤与实施例1相同。
该对比例得到的最终产物命名为C4,C4电泳结果如下:25kD,55kD,68kD,73kD,100kD,160kD;采用与实施例4相同的方法测试该产物C4抑制原代海马细胞凋亡的活性、促进海马细胞之间突触形成的活性,其结果如下:
实验组1的原代海马细胞的数量达到约580个/平方厘米,实验组2的约390个/平方厘米,和对照组的约650个/平方厘米,证明该方法下制备的C4并不能显著抑制原代海马细胞凋亡,丧失了疗效活性。实验组1的突触形成数量达到约70个/平方厘米,实验组2的约68个/平方厘米,和对照组的约63个/平方厘米,证明该方法下制备的C4并不能显著促进原代海马细胞突触形成,丧失了疗效活性。