PL151701B1

PL151701B1 - Novel neuronotrophic factor

Info

Publication number: PL151701B1
Application number: PL1987267240A
Authority: PL
Priority date: 1986-08-07
Filing date: 1987-08-07
Publication date: 1990-09-28
Also published as: NO873285D0; EP0258111A2; PT85498B; IL83398A0; PT85498A; FI873415A; YU149087A; EP0258111A3; NO873285L; PL267240A1; AU602925B2; PH23838A; CN87105478A; DK410887A; NZ221313A; HUT45083A; HU202558B; AR243203A1; KR880002533A; DK410887D0

Description

RZECZPOSPOLITA POLSKA	OPIS PATENTOWY	151 701
A	Patent dodatkowy do patentu nr - Zgłoszono: 87 08 07 /P. 267240/	Int. Cl.⁵ A61K 37/02 A61K 35/30 C07K 15/06
IjS;	Pierwszeństwo: 86 08 07 'Włochy	CZYTELHIA
URZĄD PATENTOWY	Zgłoszenie ogłoszono: 88 07 21	D G 0LHA
RP	Opis patentowy opublikowano: 1991 03 29

Twórca wynalazku

Uprawniony z patentu: FIDIA S.p.A., Abano Terme /Włochy/

SPOSÓB WYTWARZANIA CZYNNIKA NBURONOTROPICZNEGO

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowego czynnika neuronotroficznego.

Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowego wielkocząsteczkowego czynnika neuronotroficznego /SDNP/ otrzymanego z mózgu ssaków, a w szczególności z bydlęcego jądra ogoniastego. Z chemicznego punktu widzenia oczyszczony czynnik neuronotrof iczny jest zasadowym białkiem o punkcie izoelektrycznym w przybliżeniu 10, o masie cząsteczkowej, określonej za pomocą elektroforezy w żelu z SDS, podobnej do masy cząsteczkowej lizozymu, a mianowicie około 14400. Z biologicznego punktu widzenia, cząsteczka ta jest zdolna do wzmagania in vitro przeżywalności neuronów układu nerwowego w hodowli, a zwłaszcza neuronów ośrodkowego układu nerwowego. Powyższe źródło, oraz chemiczna i biologiczna charakterystyka czynników neuronotroficznych pozwalają na odróżnienie ich od innych zidentyfikowanych wielkocząsteczkowych czynników neuronotroficznych, o których donoszono. Oprócz tego ustalono farmaceutyczne zastosowania cząsteczki SDNP i zastosowania te stanowią część niniejszego wynalazku.

Stwierdzono, że przeżywanie i wzrost komórek ssaków in vivo i in vitro regulowany jest seriami specyficznych pozakomórkowych sygnałów przekazywanych przez substancje hormonopodobne, znane jako czynniki wzrostu, z których większość są to białka lub peptydy. Każdy czynnik wzrostu działa biologicznie na określoną grupę odpowiadających mu komórek docelowych.

Badania wielkocząsteczkowych białkowych czynników wzrostu, które przyczyniają się u ssaków do przeżywania i wzrostu komórki-neuronu, tak podczas rozwoju jak i w okresie dorosłości, budzą obecnie znaczne zainteresowanie w dziedzinie poszukiwań neurobiologicznych. Sugerowano,.że podczas rozwoju układu nerwowego wydzielane na zewnątrz czynniki neuronotroficzne, pochodzące bezpośrednio z humoralnych lub komórkowych mikrośrodowisk, regulują przeżywanie i śmierć komórek-neuronów /W.M. Cowan i in., Science, 225, 1258 /1984/ /. Co więcej, sugerowano, że współzawodnictwo wzrostowe unerwiających aksonów pod względem docelowo-otrzymywanych czynników neuronotroficznych decyduje, które neurony

151 701 podczas embriogenezy żyją lub giną. U dorosłych, podobne, jeśli nie te same czynniki neurotroficzne, jak wnioskowano, są niezbędne do podtrzymywania przeżywania komórek-neuronów i do prawidłowego funkcjonowania połączeń śródmózgowych /Ś. Varon, Discussions in Neuroscience, tom II, nr 3 /1985/37· ^Tak więc» postępujące słabnięcie i śmierć komórek- neuronów, które następują,w wyniku uszkodzenia przez uraz, procesów patologicznych takich jak udar lub choroby ne urodege nera cy jne, oraz starzenia się, mogą byó związane z brakiem lub zahamowaniem działania czynników neuronotroficznych in vivo /S. Varon, tamże ; S.H. Appel, Ann. Neurol., 10, 499 /1981/; S. Varon i in., Dev. Neurosci., 6, 73 /19B4/_7· Sugerowano także, w rezultacie tych badań, że u dorosłych ssaków czynniki neurotrof iczne zaangażowane są u podstawy prooesów naprawczych i regeneracyjnych po uszkodzeniach nie tylko w obwodowym układzie nerwowym, ale i w ośrodkowym układzie nerwowym.

I rzeczywiście, zastosowanie nowoczesnych metod neu-ro biol o giez nych w eksperymentach dotyczących transplantów i uszkodzeń w ośrodkowym układzie nerwowym zwierząt nasiliło pogląd, że zachodzenie naprawy neuronów jest w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłych ssaków możliwe, zapewniając, że prawidłowe sygnały troficzne są dostępne /P.H. Gage i in·, Naturę, 308, 637 /1984/.7.

Jak dotychczas jedynym dobrze scharakteryzowanym wielkocząsteczkowym, białkowym czynnikiem neuronotroficznym był czynnik wzrostu nerwów /NGF/ Levi-Montalcini i in., Physiol. Rev., 48, 534 /1968/; R. Levi-Montalcini i in·, Ann. Rev. Neurosci·, 5, 341 /1982/7 Odkrycie, że NGF był zdolny do stymulowania przeżywania tylko ograniczonej ilości typów neuronów ssaków in vitro i in vivo prowadzi do poglądu, że NGF jest tylko jednym z rodziny wielkocząsteczkowych czynników neuronotroficznych, z których każdy jest zdolny do regulowania przeżywania określonych typów neuronów. Obecnie otrzymano i scharakteryzowano tylko dwa typy innych wielkocząsteczkowych czynników neuronotroficznych - rzęskowy czynnik neuronotroficzny /CNTF/ /Ś. Varon, Discussions in Neuroscience, tom II, nr 3 /1985/;

S. Varon i in·, Dev. Neurosci., 6, 73 /1984/_7 i pochodzący z mózgu czynnik neuronotroficzny /BDNF/ /S. Varon, Discussions in Neuroscience, tom II, nr 3 /1985/; Y. Barde i in. Embo J·, 1, 549 /1982/_7· Źródła, o których doniesiono, charakterystykę chemiczną i aktyw nośó biologiczną tych czynników przedstawiono poniżej.

Udowodniono, że układy, których podstawą jest hodowla neuronów in vitro stanowią zasadnicze i niezbędne narzędzia do badania aktywności neuronotroficznej w ekstraktach tkankowych oraz kontrolowania skomplikowanych sposobów postępowania odpowiednich do frakcjonowania i oczyszczania czynników neuronotroficznych. Wykazano, że jednowarstwowe pomitotyczne rozdzielone hodowle neuronów, utrzymywane in vitro w odpowiednio restrykcyjnych warunkach hodowli, wymagają podtrzymywania troficznego przy zasilaniu układu hodowlanego z zewnątrz i odpowiadają na nie. Tak więc, aktywność neuronotroficzną w częściowo oczyszczonych lub oczyszczonych preparatach surowych można operatywnie oszacować przez kontrolowanie zdolności tych preparatów do podtrzymywania przeżywania komórek-neuronów in vivo. Oprócz tego, używa się specyficznyoh markerów neuronowych /np. markerów do analizy zawartości neurofilamentów lub specyficznego pobierania/ do podtrzymywania lub potwierdzania kryteriów morfologicznych.

Jak uprzednio wspomniano, wielkocząsteczkowymi czynnikami neuronotrofioznymi, dotychczas zidentyfikowanymi, są: czynnik wzrostu nerwów /NGF/, rzęskowy czynnik neuronotroficzny /CNTF/ i pochodzący z mózgu czynnik neuronotroficzny /BDNF/. Źródła biologiczne, o których doniesiono, charakterystykę chemiczną i aktywność biologiczną każdego z tych czynników przedstawiono poniżej.

Czynnik wzrostu nerwów /NGF/. Źródło: NGF początkowo odkryto w mysich guzach-mięsakach /R. Levi-Montalcini i in., J. Fxp. Zool., 116, 321 /1951/_7, a następnie oczyszczono do jednorodności ze ślinianek podżuchwowyoh myszy samców /5. Varon i in., Biochemistry, 6, 2202 /1967/J oraz jadu żmii /R.H. Angeletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 65, 668 /1970/J. Doniesiono także o wielu względnie bogatych źródłach NGF, w tym o gruczole krokowym świnki morskiej /5.P. Harper i in·, Naturę, 279, 160 i ludzkim łożysku /I.D. Goldstein i in·, Neurochem. Res., 3, 175 /1978/J.

151 701

Doniesiono również, źe małe ilości NGP są obecne w innych tkankach, w tym w ośrodkowym układzie nerwowym ssaków /S. Varon, Discuasions in Neuroscience, tom II, nr 3 /1985/;

P. Hefti i in·, Neuroscience, 14, 55 /1985/J. Fizjologiczne związki między tymi potencjalnymi źródłami NGP a oczywistymi miejscami działenia nie są zupełnie jasne, ale na ogół przypuszczę się, że NGP wydzielany jest przez różne tkanki obwodowe wymagające unerwienia przez komórki, które odpowiadają na NGP. Dokonano także enalizy sekwencji i klonowania NGP z gruczołów podźuchwowych myszy samca /J· Scott i in·, Naturę, 302,

538 /1983/; A. Ulrich i in., Naturę, 303, 821 /1983/7· Również ludzki gen <3 -NGP wyodrębniono z powodzeniem i klonowano /A. Ulrich i in., Naturę, 303, 821 /1983/; opis patentu europejskiego nr 0121388/.

Charakterystyka chemiczna: NGP otrzymany z podźuchwowych gruczołów myszy był typem najpełniej scharakteryzowanym. NGP z gruezołów myszy działa jako kompleks białkowy 7S /masa cząsteczkowa około 140000/ trzech różnyoh pod jednostek /β< , fi> , 7*/, zawierający Zn⁺. Aktywność NGP jest wyłącznie związana z pod jednostką β /znaną jako 2,5 S NGP/, zasadowym białkiem dimerycznym o masie cząsteczkowej 25300 /wykazującym w elektroforezie w SDS-żelu masę cząsteczkową 12650/ o punkcie izoelektrycznym w przybliżeniu 9,3· Doniesiono o sekwencjach p>-NGP z gruczołów podźuchwowych myszy samców lub ze źródeł ludzkich /7. Scott i in., Naturę, 302, 538 /1983/; A. Ulrioh i in., Naturę, 303, 821 /1983/7- .

Aktywność biologiczna: W większości badań aktywności NGP in vltro i in vlvo stosowano NGP z mysiego gruczołu podżuchwowego·

Zakres aktywności biologicznej NGP in vitro określono tak na pierwotnych komórkaoh-neuronach, jak i na klonowanych komórkach w hodowli. Pierwotne komórki-neurony, o których donoszono, że odpowiadają na NGP in vitro, obejmują płodowe neurony czuciowe /w życiu embrionalnym dzień 8-12/ w zwojach korzeni grzbietowych, autonomiczne noradrenergiozne neurony płodowe w zwojaoh współczulnych, cholinergiczne neurony w przegrodzie i chromochłonnej komórki nadnercza w czasie rozwoju. Podczas gdy neurony ozuclowe i współczulne zależne są od NGP pod względem przeżywania i rozwoju, neurony cholinergiczne, jak się wydaje, nie potrzebują NGP do przeżywania, lecz jedynie do różnicowania się, tak więc można powiedzieć, że do ekspresji ich charakterystycznych cech fenotypowych związanych z neurotransmiterem. Dodanie NGP do chromochłonnych komórek nadnercza /komórki pochoczące z grzebienia nerwowego/ w początkowym stadium ich rozwoju wywołuje ekspresję fenotypów neuronowych· Do komórek klonów, co do których doniesiono, źe odpowiadają ne NGP in vitro, należą chromochłonne komórki nadnercza pochodzące z guzów grzebienia nerwowego, znane jako komórki feochromocytoma /PC 12/ i ludzkiego nerwiaka niedojrzałego.

Po podziałaniu NGF komórki te przechodzą z wysokoproliferującej formy zachowania się do pomitotycznego stanu neuronów. Co do neuronów, o któryoh donoszono, że odpowiadają in vivo na NGP, należą tu czuciowe neurony zwojów korzeni grzbietowych, neurony współczulne i neurony cholinergiczne ośrodkowego układu nerwowego zarówno podczas rozwoju jak i u dorosłych po uszkodzeniu. W tym ostatnim przypadku domózgowe podanie NGP podtrzymuje przeżywanie komórek-neuronów i ekspresję charakterystycznych cech fenotypowych. Efekty te są połączone z poprawą zmian zaohowania się wywołanych uszkodzeniami.

Rzęskowy czynnik neuronotroficzny /CNTP/. Źródło:

CNTP najpierw odkryto i oczyszczono z tkanki embrionalnej /Εθ/ z oczu piskląt, w tym z naczyniówki i ciałka rzęskowego tęczówki łącznie z nabłonkiem barwnikowym. Następnie CNTP zidentyfikowano w różnych ekstraktach tkankowych, w tym z nerwu kulszowego dorosłego szczura i płynu z rany ośrodkowego układu nerwowego szczura.

Charakterystyka chemiczna: CNTP oczyszczony z tkanki śródocznej zarodka pisklęcia /z wydajnością około 2.10^ pod względem białka i 9& pod względem aktywności troficznej/ wykazuje w elektroforezie w żelu z SDS masę cząsteczkową około 20400 i punkt izoelektryczny około 5· Ta sama cząsteczkowa i podobnie jego ujemny ładunek netto wyraźnie różnią CNTP od podżuchwowego białka -NGP myszy. Nie doniesiono o sekwencji CNTP oczyszczonego z oczu pisklęcia, ani o oczyszczeniu CNTF pochodzącego ze ssaków w skali preparatywnej.

151 701

Aktywność biologiczna: Badania biologiczne prowadzono głównie z zastosowaniem ekstraktów z oczu piskląt, częściowo oczyszczonych lub oczyszczonych preparatów CNTF i tylko in vitro. Do neuronów odpowiadających in vitro należą zwoje rzęskowe /Ηθ/ z zarodków piskląt, neurony /Ε^θ/ zwojów korzeni grzbietowych zarodków piskląt, neurony zwojów korzeni grzbietowych noworodków mysich i neurony współczulne zwojów E^ pisklęcia oraz zwoje noworodków szczurzych. Doniesiono, że żadna z tych aktywności nie jest blokowana lub hamowana przez przeciwciała przeciw, mysiemu podżuchwowemu (Ł -NGF. Nie wzmiankowano o efektach działania CNTF in vivo.

Czynnik neuronotroficzny pochodzący z mózgu /BDNF/.

Źródło: Aktywność BDNF badano tak w kondycjonowanych podłożach linii klonalnyoh komórek C6 szczura, jak i w ekstraktach z mózgu różnych gatunków. Czynnik oczyszcza się z mózgu dorosłych świń.

Charakterystyka chemiczna: BDNF oczyszczony z mózgu dorosłych świń /z wydajnością około 3·10θ pod względem białka i poniżej 5% pod względem aktywności troficznej/ jest w wysokim stopniu zasadowym polipeptydem /punkt izoelektryczny > 10,1/, o masie cząsteczkowej około 12300 w elektroforezie w żelu z SDS. Nie doniesiono w piśmiennictwie o sekwencji. Cząsteczkę BDNF i sposób jego oczyszczania opisano w opisie patentowym RFN nr DE 3213963 A1. ,

Aktywność biologiczna: Badania aktywnośoi biologioznej prowadzono z użyciem surowych ekstraktów pochodzących z mózgu świni, ozęśoiowo oczyszczonych i oczyszczonych preparatów BDNF i tylko in vitro. Wykazano, że podtrzymuje on przeżywanie tak neuronów czuciowych pochodzących z plakody, jak i neuronów czuolowych pochodzących z grzebienia nerwowego, oraz podtrzymuje wzrost aksonów i przeżywanie komórek eksplantów siatkówki in vltro ZJ.E. Turner, Develop. Brain Res·, 16, 251 /1985/; J.E. Turner, Develop. Brain Res·, 18, 265 /l985/_7· Aczkolwiek jego właściwości chemiczne są bardzo podobne do wykazywanych przez (b -NGF, nie wykryto immunologicznej reakcji krzyżowej. Oprócz tego BDNF nie działa na neurony współczulne. Nie donoszono o efektach BDNF in vivo.

Nowy czynnik neuronotroficzny pochodzący z mózgu ssaków. Wynalazek niniejszy dotyczy sposobu otrzymywania nowego czynnika neuronotroficznego /SDNF/ o masie cząsteczkowej 14400, który jest aktywny wobec neuronów układu nerwowego, w szczególności ośrodkowego układu nerwowego. Źródło i sposób oczyszczania. Nowy czynnik neuronotroficzny można wytwarzać, stosując następujący sposób postępowania, który obejmuje homogenizację mózgu ssaka, zwłaszcza bydlęcego, a korzystnie jąder ogoniastych, w warunkach obojętnych, a następnie wytrącanie w środowisku kwaśnym w pH 4-5, oraz frakcjonowanie chromatograficzne na sicie molekularnym z użyciem rozcieńczonego buforowanego eluentu w stężeniu w zakresie od 10 mM do 30 mli, a frakcje aktywne oczyszcza się później na drodze chromatografii na kationicie w gradiencie 0,1 M - 1 M buforu z octanem amonowym, z następującym potem spulowsniem frakcji aktywnych i ich zliofilizowaniem.

Można użyć mózgów ssaków tak świeżych jak i zamrożonych /w temperaturze np. -70°C/. Wszystkie stadia oczyszczania niżej przedstawione przeprowadza się najlepiej w temperaturze od 0°C do 6°0.

W obróbce każdej szarży całe mózgi lub ich części homogenizuje się w 2 lub 4 objętościach buforowanego roztworu rozcieńczonego przy pH 6-7,4, a następnie zakwaszonego, korzystnie HCl, przy pH 4-5, korzystnie 4,5, z następującym po tym mieszaniem w ciągu kilku godzin. Wytrącony materiał oddziela się za pomocą wirowania /np. 40000 obr/min. w ciągu 40 minut/, supernatant zobojętnia się i dializuje wobec rozcieńczonego buforowanego roztworu i liofilizuje. Membrana dializacyjna wykazuje molekularne odcięcie pomiędzy 5000 a 10 000· Frakcjonowanie za pomocą filtra molekularnego prowadzi się z zastosowaniem fazy stacjonarnej z zakresem frakcjonowania pomiędzy 5000 a 150 000. Próbkę eluuj6 się buforowanym roztworem rozcieńczonym do stężenia 10-30 mM i pH 6-7,4· Frakcje biologicznie aktywne puluje się, liofilizuje i nanosi na kolumnę chromatograficzną z kationitem, a następnie eluuje gradientem buforu z octanem amonowym o stężeniu 0,1 M - 1 M i pH 6-7·

151 701

Materiał wykazujący aktywność neuronotroficzną eluuje się przy stężeniu około 1 M i frakcje aktywne znów puluje się i liofilizuje·

Powyższy sposób postępowania można przerywać w każdym stadium oczyszczania, jeżeli materiał biologicznie aktywny jest już dostatecznie czysty, albo jeżeli zamierza się otrzymać frakcje mniej oczyszczone. Wynalazek objaśnia następujący przykład, nie ograniczający zakresu wynalazku.

Przykład. Świeże mózgi bydlęce otrzymuje się z rzeźni i wycina się z nich /ne lodzie/ jądra ogoniaste. Do każdej szarży homogenizuje się około 150 g tkanki jąder ogoniastych /25-30 mózgów/ /Polytron, ustawienie 6, 60 sekund/ w 3 objętościach roztworu soli buforowanego fosforanami /PBS/ rozcieńczonego 1:10 /ph 7,4/, zawierającego fluorek fenylometylosulfonylu /PMSF/ w stężeniu 0,3 mg/ml oraz BOTA /Ewas etylenobis/oksyetylenonitrylo/tetraoctowy/ w stężeniu 1 mM. Otrzymany tak homogenat zakwasza się HCl do pH

4,5, przetrzymuje w lodzie w ciągu 2 godzin, a następnie wiruje /40 000 obr/min. w ciągu 40 minut/· Superntanty puluje się, zobojętnia /pH 7,4/, dializuje przez noc /odcięcie molekularne przy 8000/ wobeo PBS rozcieńczonego 1:10 /pH 7,4/, liofilizuje i utrzymuje jako próbki w temperaturze -20°C. Bezpośrednio przed użyciem próbki ponownie zawiesza się w 1/10 pierwotnej objętośoi stosując wodę destylowaną i zawartość białka ocenia się metodą G.L. Petersona /Anal· Blochem·, 83, 346 /1977/· Następnie próbki rozcieńcza się płynem hodowli, sączy przez filtry Millex 0,45 mikrometra wysycone uprzednio bydlęcą albuminą surowiczą w stężeniu 1 mg/ml i odpowiednie ilości przesączonej frakcji supernatantu dodaje do hodowli komórek śrćdmózgowia /bez surowicy/ w oelu badania aktywności neuronotroficznej.

Używa się kolumny z Sephadex G-150 /fine/ o wymiarach 8 x 120 cm w celu rozdzielenia składników supernatantu pod względem ich masy cząsteczkowej· Liofilizowane aupernatanty zawiesza się ponownie w wodzie destylowanej i nanosi na kolumnę w ilości około 750 mg białka w 6 ml buforu do elucji o pH 7,30 i następującym składzie milimolowym: NaCl 13,68, KOI 0,27, Na₂HP0₄.7 H₂0 0,8, KH₂P0₄ 1,5.

Następnie kolumnę eluuje się przy przepływie 90 ml/godz. z użyciem pompy perystaltycznej. Gęstość optyczną eluatu kontroluje się w sposób ciągły przy 280 nm za pomocą monitora UV. Frakcje po 15 ml zbiera się automatycznie i po zliofilizowaniu bada się je pod względem aktywności neuronotroficznej. Sączenia żelowego i zbierania frakcji dokonuje się w pokoju-chłodni w temperaturze 4°C.

- Biologicznie aktywne frakcje wyeluowane z kolumny Sephadex G-150 puluje się i liofilizuje. Próbki zliofilizowanego materiału zawiesza się ponownie w 113x1 0,1 M /NI^/C^H^O^ pH 6,45. Zawartość białka oznacza się w 10/tl. Pozostałe 100/<1 /1,9 mg białka/ nanosi się na kolumnę TSK-CM-3SW /jonowymienna kolumna do HPLC/. Frakcje eluuje się 0,1-1 M gradientem /NH₄/C₂H^0₂, pH 6,45, przy przepływie 0,5 ml/min. Bufor A: 0,1 M /N^/C^C^, pH 6,45. Bufor B: 1 M /N^/CgH^Og, pH 6,45. Profil gradientu: 0-20 minut, 100% A/100% B /izokratyczny/; 20-40 minut, 0% A/100% B /liniowy/; 40-70 minut, 0% A /100% B /izokratyczny/; 70-75 minut, 100% A/0% B /liniowy/. Frakcje liofilizuje się i zawiesza ponownie w 0,6 ml 10 mN buforu fosforanowego o pH 5,7.

Białko oznacza się w 100a 1 i pozostałego materiału używa się do biotestu i analizy

SDS-PAGB.

Tablica 1 podsumowuje główne stadia procesu oczyszczania oraz przedstawia przykład stopnia oczyszczania pod względem białka i wydajności procentowej pod względem aktyv;ności neuronotroficznej, którą można osiągnąć w trakcie procesu oczyszczania. Wydajność pod względem białka i aktywności troficznej odróżnia ten sposób postępowania od innych sposobów stosowanych przy oczyszczaniu CCTTF i BDNF.

151 701

Tablica 1

Podsumowanie głównych stadiów oczyszczania czynnika neuronotroficznego z mózgu bydlęcego

Stadium	——---_:Ί Białko całkowite /mg/	r-------- Współczynnik oczyszczenia	Aktywność właściwa Zag/TU*/	Całkowita ilość TU	Odzyskanie TU /«/
Homoge nat	11625	1	-	-	-
Supernatant po wytrąceniu w środowisku kwaśnym	750	15,5	6	125000	100
Sephadex G-150	14,7	791	’ 0,3	49000	39
CM-HPLC	0,361	32202	0,01	36100	29

W powyższej tablicy 1 użyto następujących oznaczeń:

* Jednostkę troficzną /TU/ definiuje się jako stężenie białka /w > g/ml/, które sprzyja przeżywaniu połowy maksymalnej ilości neuronów przeżywających w odpowiedzi na materiał aktywny w stężeniu odpowiadającym nasyceniu·

Charakterystyka chemiczna· Aktywność biologiczna frakcji surowego supernatantu otrzymanego z całkowitego homogenatu po wytrąceniu w środowisku kwaśnym, zobojętnieniu i dializie jest wrażliwa na trypsynę, co wskazuje na to, że cząsteczka aktywna ma charakter białkowy lub peptydowy. Cząsteczka biologicznie aktywna obecna w powyższym ekstrakcie surowego supernatantu eluuje się z kolumny Sephadex G-150 we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej w zakresie od 10000 do 30000 /Pig. 1/.

Figura 1 przedstawia typowy profil elucji, z Sephadex G - 150, supernatantu z bydlęcego jądra ogoniastego otrzymanego z całkowitego homogenatu po wytrąceniu w środowisku kwaśnym, zobojętnieniu i dializie, z identyfikacją biologicznie aktywnych frakcji. Warunki otrzymywania opisano powyżej. Wszystkie frakcje bada się pod względem aktywności biologicznej przy stężeniu białka zmieniającym się w zakresie od 0,01>g/ml do 10Ag/ml. Aktywność obserwuje się we frakcjach wskazanych na Fig. 1 linią poziomą.

Biologicznie aktywna cząsteczka obecna we frakcjach aktywnych otrzymanych z kolumny Sephadex G-15Q eluuje się z kolumny TSK-CM-3SW przy około 1 M stężeniu buforu z octanem amonowym /Figura 2/.

Figura 2 przedstawia typowy profil elucji HPLC z kolumny TSK-CM-3SW aktywnych eluatów otrzymanych z kolumny Sephsdes G-150. Warunki oczyszczania są opisane. Wszystkie frakcje bada się pod względem aktywności biologicznej z zawartością białka w zakresie 0,001 - 0,3 /rg/ml. Aktywność, przedstawioną linią poziomą, obserwuje się we frakcjach eluowanych około 1 M octanem amonowym.

Czas tej ostatniej elucji jest podobny do czasu obserwowanego w przypadku cytochromu C, co wskazuje na to, że punkt izoelektryczny cząsteczki aktywnej jest podobny do wykazywanego przez cytochrom C, to jest w przybliżeniu 10-10,5. Ta charakterystyka odróżnia cząsteczkę aktywną od CNTF, który ma punkt izoelektryczny około 5.

Elektroforeza SDS-PAGE, przeprowadzona metodą V. Lee i in. /Neuroscience, 6, 2773 /1981/J przy zastosowaniu warstw 12,5% wag/obj. żelu poliskrylóamidowego i nieciągłego buforu zawierającego SDS zgodnie z metodą U.K. Laemmli /Naturę, 227, 680 /l97O/_/, dotyczącą materiału aktywnego pochodzącego z głównych stadiów procesu oczyszczania /ekstrakt supernatantu otrzymany z całkowitego homogenatu w wyniku wytrącenia w środowisku kwaśnym, zobojętnienia i dializy oraz zastosowania kolumny Sephadex G-150 i kolumny TSK-CM-3SW/ przedstawiona została na Figurze 3A.

Figura 3A pokazuje przykłady elektroforezy w żelu stanowiącej SDS-PAGE po zaberwieniu srebrowym, ze standardowymi białkami BioRad /ścieżki: 1 i 5/ i materiałem aktywnym /5/»g

151 701 białka/ścieżkę/ pochodzącym z głównych stadiów oczyszczania, to jest ekstraktem otrzymanym z całkowitego homogenatu, w wyniku wytrącenia w środowisku kwaśnym, zobojętnienia i liofilizacji /ścieżka 2/ i aktywnym eluatem z kolumny Sephadex G-150 /ścieżka 3/> oraz z kolumny TSK-CM-3SW /ścieżka 4/.

Zastosowanymi tu standardowymi wskaźnikami masy cząsteczkowej są: miozyna /mesa cząsteczkowa 200 000/, P -galęktozydaza /masa cząsteczkowa 116 250/,fosforylaza b /masa cząsteczkowa 92 500/, bydlęca albumina surowicza /masa cząsteczkowe 66 200/, owoelbumina /masa cząsteczkowa 45000/ anhydraza węglanowa /masa cząsteczkowa 31000/, inhibitor trypsyny z soi /masa cząsteczkowa 21500/ i lizozym /masa cząsteczkowa 14400/·

Bufor dla próbki /do elektroforezy/ składa się z 62,5 mM Tris /tri/hydroksymetylo/ aminometatj/ o pH 6,8, 10% wag/obj. gliceryny, 2% wag/obj. SDS /siarczan dodecylo-sodowy/, 2,5 mM EDTA, 2,5 mM EGTA, 0,01% błękitu bromofenolowego i 5% & -merkaptoetanolu.

Biologicznie aktywny materiał otrzymany z kolumny TSK-CM-3SW migruje jako pojedyńcze pasmo o masie cząsteczkowej podobnej do lizozymu /BioRad/ użytego jako standard i którego masa cząsteczkowa wynosi około 14400· Ta masa cząsteczkowa odróżnia cząsteczkę aktywną od innych zidentyfikowanych czynników neuronotroficznych /NGF, CNTF, BDNF/· Co więcej, materiał aktywny wyeluowany z kolumny TSK-CM-3SW nie migruje w elektroforezie w żelu stano w iąo ej SDS-PAGE w pozycji podobnej do pozycji f -NGF ze ślinianek mysich /Figura 3B/.

Figura 3B przedstawia przykład elektroforezy w żelu stanowiącej SDS-PAGE po barwienia srebrowym, ze standardowymi wskaźnikami BioRad /ścieżki 1 i 4/, z 2,5>g fi -NGF z mysiego gruczołu podżuohwowego /ścieżka 2/ i z 2,5>g materiału aktywnego z kolumny TSK-CM-3SW /po elucji/ /ścieżka 3/· Standardowe białko jest użyte jak na Fig· 3A·

NGF migruje w pozycji niższej od pozyoji aktywnej cząsteczki eluowanej z kolumny TSK-CM-3SW. Doniesiono, że BDNF migruje w SDS-elektroforezie w pozyoji podobnej do pozycji NGF· Wskazuje to dalej na to, że cząsteczka aktywna eluowana z kolumny TSK-CM-3SW może się różnić od BDNF.

Aktywność biologiczna! Aktywność biologiczną materiału pochodzącego z głównych stadiów oczyszczania /surowy supernatant otrzymany z całkowitego homogenatu po wytrąceniu w środowisku kwaśnym, zobojętnieniu i dializie, elusty otrzymane z kolumny G-150 i eluaty otrzymane z kolumny TSK-CM-3SW/ ustala się zazwyczaj przez kontrolowanie jego wpływu na przeżywanie rozdzielonych pierwotnych komórek śródmózgowia z płodu nysiego utrzymywanych o

w hodowli /bez surowicy/. Dalej, oznacza się specyficzne pobieranie ^H-dopaminj' przez neurony dopaminergiczne i specyficzne pobieranie ^G-GABA przez neurony GABAergiczne obecne w układzie hodowlanym, tak aby potwierdzić lub umocnić kryteria morfologiczne.

Poniżej przedstawiono metody otrzymywania hodowli komórkowej, oceny przeżywania komórek i parametry specyficznego pobierania łącznie z charakterystyką preparatu stanowiącego hodowlę komórkową i wpływu materiału pochodzącego z głównych stadiów oczyszczania.

Sposób otrzymywania hodowli komórkowej i kryteria inmunocheniczne stosowane do oceny typów komórek in vitro. Rostralną nakrywkę śródmózgowia wycina się w warunkach jałowych z mózgów 13-<3niowych płodów mysich. Połączone fragmenty mózgu poddaje się mechanicznemu rozdzielaniu w PBS o następującym składzie milimolowym: NaCl 136,8, KC1 2,7, Na^HPO^.

Η₂θ 8, KHgFO^ 1,5 z glukozą w stężeniu 6 mg/ml i bydlęcą albuminą surowiczą w stężeniu 0,1 mg/ml /pH 7,4/. Następnie komórki odwirowuje się przy 45 obr/min. w ciągu 4 minut, zawiesza ponownie w podłożu hodowli, przeprowadza przez filtr Nytex 20xim, liczy komórki w liczniku /oulter celi counter/ i nanosi na płytki, stosując 35 mm płytki Falcona z tworzywa sztucznego do hodowli tkankowej.

Każdą płytkę pokrywa się kolagenem ze skóry bydlęcej Aitrogen, 100 >fg białka/, stosując podłoże podstawowe Eagle *a /BME/, NaHCOj i NaOH, tak, aby podwyższyć siłę jonową i pH 2Ϊ. Elsdsle i in. J. Celi. Biol., 54, 626 /1972/J.

Podłoże hodowli składa się z mieszaniny BME i podłoża Hama F12 1:1 i zostaje uzupełniona glukozą o stężeniu 33 mM, glutaminą o stężeniu 2 mM, NaHCO^ o stężeniu 15 mM,

HEPES /kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N *-2-e ta no sulfonowy/ o stężeniu 10 mM z uzupełnieniem, jak donieśli U. Di Parzio i in. /Naturę, 288, 370 /1980/^/, insuliną o stężeniu

151. 701

25/* g/ml, transferyną ο stężeniu 100 g/ml, putrescyną o stężeniu 60λΜ, progesteronem o stężeniu 20 nM, seleninem sodowym o stężeniu 30 nM, penicyliną 0 o stężeniu 0,5 jednostki/ml i streptomycyną o stężeniu 0,5>*g/ml, oraz zawiera /3,3*,5*-trijodo-DL-tyronina/ o stężeniu 30 nM · Puymirat i in., Neuroscience, 10, 801 /1983/J. Typowo, do każdej płytki dodaje się 2 ml podłoża hodowli zawierającego pożądaną ilośó rozdzielonych komórek.

Identyfikację typów komórek in vitro prowadzi się na podstawie immunofluorescencji pośredniej z użyciem mo noki o na 1 nego przeciwciała RT97 przeciw białkom neurofilamentów /B.H. Anderton i in., Naturę, 298 , 84 /19 82/ J₉ specyficznego indykatora komórek-neuronów in vitro, jak donieśli P. Doherty i in. /3. Neurochem., 42, 1116 /1984/J. Mówiąc krótko, hodowle utrwala się w ciągu 7 minut w metanolu w temperaturze -20°C. Utrwalonym hodowlom nadaje się przenikalnośó przez działanie na nie w ciągu 30 minut 0,1% obj./obj. Triton Χ-100 /eter polioksyetyle nowy/ w PBS, a następnie dodatkowo inkubuje się je w ciągu 60 minut z PBS zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej /FOS/ w celu zablokowania miejsc niespecyficznie wiążących białko. Inkubację z przeciwciałem przeciw neurofl* lamentom /rozcieńczenie 1:500/ w PBS prowadzi się w ciągu 60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrcfeie przemywa PBS zawierającym 10% FOS. Następnie dodaje się do hodowli kozią oczyszczoną IgG przeciw białkom mysim, o wysokim powinowactwie, sprzężoną z rodaminą /rozcieńczenie 1:100/, inkubując w ciągu 60 minut w temperaturze pokojowej i po trzykrotnym przemyciu PBS z 10% FCS przykrywa się szkiełkami nakrywkowymi z zastosowaniem mieszaniny gliceryny i PBS 1:1 i ocenia przy użyciu fotomikroskopu Zeiss III wyposażonego w optykę do epifluorescencji rodaminy i fazowo-kontrastową. Metodą M.C. Raffa i in. /Brain Res·, 174> 283 /1979/ / doprowadza się do wystąpienia pośredniej immonofluoresoencji z użyciem mysiego przeciwciała GFAP /Glial Fibryllary Acidic Protein/ do specyficznego znakowania komórek-astrocytów in vitro i koziej oczyszczonej IgG przeciw białkom mysim, o wysokim powinowactwie, sprzężonej z rodaminą.

Sposób oszacowania przeżywania komórek w zależności od czasu hodowli. Przeżywanie komórek można oszaoowaó na podstawie kryteriów morfologicznych /to jest na podstawie obserwacji w mikroskopie fazowo-kontrastowym dotyczącej ilości przeżywających komórek w zależności od czasu hodowli in vitro/ łącznie z biochemiczną oceną zawartości DNA i ilości przeżywających komórek dopaminergicznych na płytkę w zależności od czasu hodowli in vitro. Zawartość DNA ustala się metodą B.G. Erwina i in. Blochem., 110, 291 /1981/J₉ podczas gdy ilośó komórek dopaminergicznych na komórkę oznacza się na podstawie specyficz_Tnego pobierania dopaminy i uwidocznienia neuronów fluoryzujących metodą dotyczącą fluorescencji indukowanej kwasem glioksalowym /GIF/ opisaną przez G. Bolstads i in. /Ćomp. Blochem. Physiol·, 62, 61 /1979/J* W tym ostatnim celu komórki obserwuje się w fotomikroskopie Zeiss III wyposażonym w optykę do epifluorescenc ji ketecholaminowe j i fazowo-kontrastową. Z wykorzystaniem zamieszczonych współrzędnych oblicza się ilośó GIF-dodatnich neuronów odpowiadającą co najmniej 3% całkowitej danej powierzchni.

Sposób oszacowania specyficznego pobierania dopaminy i GABA. Oszacowania specyficznego pobierania dopaminy dokonuje się tak, jak to opisali B. Berger i in. /Ńeuroscience, 7,

193 /1982/ J. Komórki przemywa się raz uprzednio ogrzanym PBS uzupełnionym glukozą o stężeniu 5 mM, CaCl₂ o stężeniu 1 mŁI, MgSO^ o stężeniu 1 mM, kwasem askorbinowym o stężeniu 0,1 mM, N-metylo-N-/2-propynylo/benzyloaminą o stężeniu 0,1 mM i preinkubuje w ciągu 5 minut z 0,6 ml powyższego roztworu. W przypadku, gdy jest to niezbędne, dodaje się do tego podłoża inkubacyjnego benzotropine o stężeniu 5M, desmethylimipramine o stężeniu

Mi fluoxetine o stężeniu 1 xrM. Rutynowo dodaje się następnie 0,2 ml H-dopaminy /o stężeniu końcowym 50 nil i aktywności właściwej /S.A./ 22-33 Ci/mmol/ i inkubuje się w dalszym ciągu przez 15 minut w temperaturze 37°C. Pobieranie przerywa się za pomocą usunięcia mieszaniny inkubacyjnej z następującym potem czterokrotnym szybkim przemywaniem PBS o temperaturze lodu. Następnie ekstrahuje się ^H-dopaminę z każdej płytki dwukrotnie /każdorazowo 15 minut/ z użyciem 0,5 ml 0,4 M HCIO^ z absolutnym etanolem /3:1» obj/obj/. Odzysk wynosi ponad 95%. Radioaktywność oszacowuje się po dodaniu 10 ml

151 701

Instagel II /ciekły preparat do zliczania scyntylacyjnego/, stosując licznik scyntylacyjny Packard TriCarb /Model 460 C/. W oddzielnych próbkach przy końcu inkubacji i przemywać dokonuje się ekstrakcji wewnątrz-komórkowego materiału radioaktywnego 0,5 ml 0,4 N kwasu nadchlorowego i analizuje za pomocą cieczowej chromatografii ciśnieniowej /HPLC/ /C. Kotake i in., J. Neurosci., 2, 1307 /1982/; A. Shum i in<, J. Chromatog., 228, 123 /1982/ /. Ponad 953 wstrzykniętego materiału radioaktywnego połączone jest z frakcją zbieraną w czasie takim samym jak czas retencji dopaminy.

Specyfiozne pobieranie ^^C-GABA szacuje się przeprowadzając badania jak opisali A. Prochiantz i in·, ^Naturę, 293, 570 /1981/J₉ przy dodaniu 0,1 AM C-G AB A /225 mCi/ nmol/ na okres 15 minut w temperaturze 37°C. Używa się kwasu aminooksyoctowego /10AM/ dla zapobieżenia katabolizmowi GABA. W przypadku, gdy jest to niezbędne, dodaje się inhibitor pobierania GABA, w postaci kwasu diaminomasłowego o stężeniu 10^ Metody przemywania i ekstrakoji są takie, jak oplasne w związku z badaniami nad pobieraniem ^H-dopaminy. Identyfikacji GABA dokonuje aię metodą TLC /S.S. Lasher, Brain Res·, 69,

235 /1974/7· Ponad 90% materiału radioaktywnego związane było z plamą migrującą wspólnie z autentycznym GABA.

Szaoowanie morfologiczne, żywotność i charakterystyka biochemiczna układu hodowli tkanek. Tak 4-ago jak i 8-ego dnia hodowli in vitro ponad 98% przylegającyoh żywotnych komórek obecnych na płytce wykazywało dodatnią immunoreaktywność przy barwieniu immunoc hemie z nym z użyciem monoklonalnego przeciwciała RT 97· Także, mniej niż 1% komórek w hodowli było, we wszystkich tu rozważanych okresach, imnunorp aktyw nych w barwieniu z użyciem przeciwciała GFAP. Wskazuje to na to, że ponad 98% komórek w hodowli można sklasyfikować jako elementy neuronowe. Uwidocznienie ilości neuronów dopaminergioznych w układzie hodowlanym wykazało, że te komórki stanowią około 0,1-0,2% całkowitej ilości komórek obecnych in vitro.

Żywotność komórek w zastosowanym układzie hodowli nie uległa zmianie w czasie do 4 dni in vitro. Jednakże, między czwartym a ósmym dniem in vitro żywotność obniża się o około 60-80%. Jest to oczywiste nie tylko na podstawie oszacowania morfologicznego, ale i na podstawie oszacowania zawartości DNA i ilości komórek dopapinergicznych na płytkę. Wskazuje to na fakt ograniczenia żywotności komórek-neuronów w zastosowanych warunkach hodowli, oraz na to, że nie zachodzą godne uwagi odchylenia w żywotności różnych typów komórek obecnych w układzie hodowlanym /patrz Fig. 4/.

Figura 4 jest wykresem przedstawiającym zależne od czasu zmiany w neuronach jako całości, neuronach GIF-dodatnich i w EZT-zależnym pobieraniu dopaminy. Komórki środmózgowia nanosi się przy gęstości 1.10^ komórek/35 mm płytkę/2 ml podłoża hodowli.

Wskazania na Fig. 4 są następujące:

- DNA/płytkę /o-o/,

- EZP-wrażliwe pobieranie dopaminy /o-o/,

- ilość komórek GIF⁺/płytkę/histogram czysty/,

- BZT - wrażliwe pobieranie dopaminy/10^ komórek GIF⁺ /histogram zakreskowany.

Podobnie jak ma to miejsce przy określaniu żywotności komórek w hodowli, specyficzne pobieranie ^H-dopaminy i ¹^C-GABA obniża się o około 60-80% między czwartym a ósmym dniem in vitro. To dalej sugeruje, że nie ma oczywistej różnicy w zachowaniu się między rozmaitymi typami komórek obecnych in vitro i prowadzi do wniosku, że te parametry pobierania są odpowiednimi indykatorami żywotności komórek in vitro.

Aktyy/ność biologiczna materiału pochodzącego z głównych stadiów oczyszczania. VZ powyższym celu, bezpośrednio przed użyciem, próbki zliofilizowanego materiału pochodzącego z głównych stadiów oczyszczania zawiesza się ponownie w 1/10 pierwotnej objętości z zastosowaniem wody destylowanej. Zawartość białka ocenia się metodą G.L. Petersona /Anal. Blochem., 83, 346 /1977/J. Próbki rozcieńcza aię następnie podłożem hodowli, sączy przez 0,45 m filtr Millez i wstępnie nasyca bydlęcą albuminą surowiczą o stężeniu 1 mg/ml. Następnie dodaje się odpowiednie ilości przesączonego materiału do hodowli komórek śródmózgowia w dniu nanoszenia na płytki. Dodaje się także równoważne ilości albuminy bydlęcej

151 701 do kontrolnych hodowli komórkowych· We wszystkich hodowlach podłoże wymienia się po każdych 2 dniach luh alternatywnie ponownie uzupełnia materiałem pochodzącym ze stadiów oczyszczania, względnie albupiną w przypadku hodowli kontrolnych· Materiały pochodzące ze wszystkich głównych stadiów oczyszczania: ekstrakt całkowitego homogenatu będący supernatantem po wytrąceniu w środowisku kwaśnym, frakcje z kolumny Sephadex G-150 eluowane w zakresie masy oząsteozkowej 10 000 - 30 000 i frakcje z kolumny TSK-CM-3SW elu owa ne octanem amonowym o stężeniu w przybliżeniu 1 M są /wszystkie/ zdolne do zwiększania żywotności, to jest przeżywania i rozwoju, rozdzielonych płodowych komórek-neuronów śródmózgowią w hodowli· Wygląd /morfologicznie/ hodowli komórek ln vitro dnia ósmego po dodaniu do podłoża hodowli w dniu nanoszenia na płytki /dzień 0/, albo frakcji surowego supernatantu, albo albuminy /hodowla kontrolna/ jest przedstawiony na Fig· Fig· 5A i 5B. Figury te przedstawiają dwa typowe przypadki wyglądu płodowych mysich komórek śródmózgowia ósmego dnia in vivo po dodaniu albuminy o stężeniu 10 >g/ml w hodowli kontrolnej /Fig· 5A/ 1 ekstraktu oałkowltego homogenatu będącego supernatantem po wytrąceniu w środowisku kwaśnym 1 dializie, o stężeniu 10a»g/ml /Fig· 5B/.

Efekt ten był oczywisty także w odniesieniu do całkowitej zawartości DNA 1 ilości komórek dopaminergioznyoh na płytkę /Fig· 6/, jak też i speoyficznego pobierania ^H-dopaminy oraz ¹^C-GABA w zależności od czasu trwania hodowli ln vitro.

Figura 6 przedstawia ocenę ilości komórek GIF⁺ /to jest DA dopaminerglcznych/ i zawartośoi DNA na płytkę ósmego dnia in vltro po dodaniu 10/rg/ml albuminy do hodowli kontrolnej /histogram czysty/ 1 supernatantu otrzymanego z całkowitego homogenatu po wytrąoeniu w środowisku kwaśnym i dializie /histogram zakreskowany/· Wartości są wartościami średnimi + S.E. /błąd standardowy średniej/ dla próbek trzykrotnyoh· Fig· 7 przedstawia wpływ powyższego supernatantu na pobieranie dopaminy w zależności od stężenia· Obserwowano to na podstawie oznaozania pobierania GABA 1 DNA na płytkę·

Figura 7 przedstawia specyficznie wpływ dodawania ekstraktu bydlęcego w różnych stężeniach /otrzymanego z całkowitego homogenatu po wytrąoaniu w środowisku kwaśnym i dializie/ na BZT-wrażliwe pobieranie dopaminy. Komórki śród mózgowia nanosi się na płytki przy gęstości 0,5.10^ komórek/1 ml podłoża hodowli/24 mm zbiornik. Wskazane ilości ekstraktów bydlęcych dodaje się przy nanoszeniu na płytki w objętości 50χ*1. Gdy jest to potrzebne, próbki uzupełnia się bydlęcą albuminą surowiczą aż do osiągnięcia końcowego stężenia białka 40>g/ml. Parametry pobierania ocenia się czwartego dnia in vitro. Wartości podaje się jako średnią - S.D. /odchylenie standardowe/ dla próbek trzykrotnych. Łącznie wyniki te wskazują, że materiał aktywny jest zdolny do wzmagania przeżywania i rozwoju in vitro różnych typów neuronów, zwłaszcza obecnych w użytych hodowlach. Aczkolwiek podobne efekty wykryto przy badaniu aktywności troficznej ekstraktu stanowiącego supernatant, puli frakcji z Sephed6X G-150 eluowanych w zakresie masy cząsteczkowej 10 000 - 30 000 i grupy frakcji z kolumny TSK-CM-3SY/ eluowanych octanem amonu o stężeniu w przybliżeniu 1 M, to ilości potrzebne do wywołania tych efektów różnią się. W szczególności, gdy surowy ekstrakt stanowiący supernatant wykazuje półmaksymalną aktywność biologiczną, gdy jest dodany ln vltro w stężeniu około 6 4g/ml, półmaksymalna aktywność frakcji otrzymanych z kolumn Sephadex G-150 i TSK-CM-3SW wykrywalna jest przy stężeniu, odpowiednio, 0,3 λ g/ml i 10 ng/ml /patrz tablica 1/.

Test aktywności biologicznej dotyczący innych typów komórek-neuronów w hodowli in vitro, a zwłaszcza rozdzielonych komórek-neuronów z prążkowia płodu mysiego, wskazuje na to, że cząsteczka aktywna jest skuteczna we Yjzmageniu przeżywania i rozwoju różnych typów neuronów obecnych w rozmaitych obszarach układu nerwowego, zwłaszcza ośrodkowego układu nerwowego /CNS/. Oprócz tego, materiał aktywny jest skuteczny we wzmaganiu wzrostu in vitro aksonów neuronów zwojów korzeni grzbietowych 12-dniowych zarodków piskląt, co nie zachodzi w przypadku 8-dniowych zarodków. Efekt ten wskazuje dalej, że czynnik neurotroficz? ny można odróżnić od -NGF pochodzącego z mysich ślinianek. Co więcej, dodanie £-NGF z mysich ślinianek o stężeniu 1-300 ng/ml nie wywiera wpływu na przeżywanie rutynowo stosowanych mysich rozdzielonych komórek śródmózgowla w hodowli.

151 701

Zastosowanie czynnika neuronotroficznego pochodzącego z mózgu ssaków in vivo. Wynalazek obejmuje swym zakresem także zastosowanie czynnika neuronotrof ic zne go /SDNF/ pochodzącego z mózgu ssaków in vivo. Jak to już wyżej omówiono, czynniki neuronotroficzne są obeonie znane z regulowania przeżywania komórek-neuronów i plastyczności neuronów /zdefiniowanej jako zdolność komórki nerwowej do podlegania morfofunkcjonalnym modyfikacjom w odpowiedzi na zmiany w jej mikrootoczeńiu/ nie tylko podczas rozwoju układu nerwowego, lecz także, przypuszczalnie, w stanie dorosłości· Co więcej, gromadzą się obecnie dane, źe czynniki neuronotroficzne kontrolują prawdopodobnie neurony dorosłych w odniesieniu do:

I. Utrzymywanie się, pełnienie funkcji i starzenie się normalnych komórek /s. Varon, Discussions in Neuroscience, tom II, nr 3 /1985/J, to jest musi istnieć wystarczające zasilanie i możliwość wykorzystania ozynników neuronotroficznych, aby wyrównać normalne zmiany w zapotrzebowaniu troficznym i stąd też nienormalne zachowanie się neuronów dorosłych in vivo może być wynikiem niedostatecznego zaopatrzenia w czynniki troficzne·

II· Procesy naprawy 1 regeneracji w chemicznie lub mechanicznie uszkodzonych komórkach /S. Varon, tamże/, a zwłaszcza uszkodzenie aksonów, prowadzą do niewystarczającego zasilania czynnikami neuronotroficznymi komórek-neuronów i ich śmierci następującej, jak wiadomo, po urazowym lub patologicznym uszkodzeniu· Może też istnieć związek czynników neuronotroficznych z procesem starzenia się·

III. Degeneracja i śmierć w pewnych patologicznych warunkach /S. Varon, tamże/, to jest różna warunki patologiczne, mogą być związane z sytuacjami, w któryoh występuje niedobór i mogą być wynikiem /lub też być zależne od/ deficytów troficznych wynikających albo z obniżenia skutecznego zasilania troficznego, albo ze zwiększenia zapotrzebowania, względnie z obydwu przyczyn.

W świetle powyższego, wynalazek dotyczy także następujących zastosowań czynnika neuronotrof icznego, znanego jako SDNP, w szczególności podawania pozajelitowego, w tym, aczkolwiek nie wyłącznie, okołooponowego, dozbiornikowego, dokomorowego, doosłonkowego, dożylnego, domięśniowego, podskórnego, dziąsłowego, pod językowego, doodbytniczego i donosowego, cząsteczki SDNF albo samej, albo z gangi dozydami, zwłaszcza mieszaninami gangliozydów z mózgu bydlęcego, gangliozydem jednego rodzaju z mózgu bydlęcego, korzystnie GM^, oraz półsyntetycznymi pochodnymi gangliozydów, korzystnie pochodnymi wewnętrznych eterów gangliozydów, albo z fosfolipidami, zwłaszcza mieszaninami fosfolipidów z mózgu bydlęcego, fosfolipidem jednego rodzaju z mózgu bydlęcego, korzystnie fosfatydyloseryną, oraz półsyntetycznymi pochodnymi fosfolipidów, w stanach neuropatologicznych wynikających z:

I. Ostre, podostre lub przewlekłe uszkodzenie układu nerwowego, w tym uszkodzenie urazowe, chemiczne, naczyniowe i wynikające z niedoborów /takie jak udar/, włącznie z uszkodzeniem zakaźno-zapalnym i wywołanym przez nowotwór.

II. Starzenie się układu nerwowego, w tym choroba Alzheimera.

III. Przewlekłe choroby degeneracy jne układu nerwowego.

IV. Przewlekłe choroby imnunologiezne układu nerwowego lub atakujące układ nerwowy.

Połączone użycie cząsteczki SDNF z gangliozydami lub fosfolipidami jest uzasadnione przez dane wskazujące na to, że gangliozydy z mózgu bydlęcego i fosfolipidy z mózgu bydlęcego wfcmagają, jak wiadomo, odpowiedź komórkową na czynniki neuronotroficzne in vitro i najprawdopodobniej in vivo. Następująca tablica 2 opisuje wpływ GM^ i ekstraktu z prążkowia bydlęcego na komórki śrćdmózgowia w hodowli.

Tablica 2

Substancja	BZT-wrażliwe pobieranie ^H-do- paminy /fmole/płytkę/ /15 min./	DABA-wrażliwe pobieranie ¹^C-GABA /pmole/płytkę/ /15 min./
Albumina	29,51 + 5,78	0,56 + 0,14
Albdmina + GM^	69,14 + 3,38	1,04 + 0,05
Ekstrakt z prążkowia	104,68 + 7,60	2,41 + 0.27
Ekstrakt z prążkowia
+ GM₁	140,58 + 17,82	4,56 + 0,10

151 701

Komórki śródmózgowia /1·lO^/płytkę/ hoduje się w podłożu bez surowicy zawierającym albuminę w stężeniu 15 pg/ml lub ekstrakt z prążkowia /15 ug/ml/, same lub w obecności _ γ

GM^ w stężeniu 10 M. Pobieranie ocenia się czwartego dnia metodą podaną w poprzedniej części opisu. Wartości podaje się jako średnią + S.E. dla próbek trzykrotnych.

Ekstrakt z prążkowia bydlęcego otrzymuje się jak podano w poprzedniej części opisu.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania czynnika neuronotroficznego stanowiącego zasadowe białko o masie cząsteczkowej około 14 400, znamienny tym, że homogenizuje się tkankę mózgu ssaków, wytworzony homogenat poddaje się wytrącaniu w środowisku kwaśnym o pH 4-5, dializuje się utworzony supernatant z użyciem membrany dializacyjnej wykazującej odcięcie molekularne pomiędzy 5000 a 10 000, oraz frakcjonuje się chromatograficznie dializowany supernatant w celu rozdzielenia składników supernatantu pod względem ich masy cząsteczkowej·
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje dalszy etap oczyszczania tak otrzymanych frakcji neuronotroficznie aktywnych metodą chromatograficzną na kationicie z użyciem gradientu buforu z octanem amonowym.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako tkankę mózgu ssaków stosuje się bydlęcą tkankę mózgową.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że obróbce poddaje się jądra ogoniaste z mózgów bydlęcych.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap frakcjonowania chromatograficznego przeprowadza się na sicie molekularnym z użyciem rozcieńczonego buforowanego eluentu o stężeniu od 10 mM do 30 mM.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że frakcjonowanie prowadzi się z użyciem fazy stacjonarnej z zakresem frakcjonowania 5000 - 150 000.
7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że neuronotroficznie aktywne frakcje eluuje się z kationitowej kolumny chromatograficznej gradientem buforu z octanem amonowym o stężeniu 0,1 - 1 Ii i pH 6-7.
8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że sposób przeprowadza się w temperaturze 0-6°C.
9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że neuronotroficznie aktywne frakcje puluje się i liofilizuje.

Profil elucji z Sephadex G-150 dializowanego supernatantu z bydlęcego jadra ogoniastego z identyfikacją frakcji biologicznie aktywnych

FIG.1

100

151 701

Profil elucji HPl£ aktywnych eluatow otrzyma-

3/7

I ż 3 4 5

FIG 3A

FIG.3B

151 701

Komorki GIF-dodatnie/iloSć/ptytkę/,histogram czysty

-1 I-1-1 I-1° ° ° * Jś s 3

BZT-wrazliwe pobieranie 3H-dopaminy /tmole/10 komórek GIF*/, histogram zakreskowany

Lit

FIG. 5A

FIG. 5B

151 701

Wpływ dializowanego supernatantu na zawartość DNA i ilosc DA-komOrek w zależności od czasu trwania hodowli *

FIG. 6

Wpływ dializowanego supernatantu /po wytrąceniu w Środowisku kwaśnym/z bydlęcego jądra ogoniastego na parametry specyficznego pobierania w hodowlach komórek srodmozgcwia □ BZT-wrazliwe pobieranie Ą+dopaminy ⁰ DABA-wrazIiwe pobieranie ^C-GABA

Komorki srodmozgowia naniesiono przy gęstości 0,5.Ϊ0θ komórek 1ml/24mm zbiornik.Wskazane ilośpg/al ci ekstraktów bydlęcych dodano przy nanoszeniu na płytki w objętości 50ulProbki uzupełniono BS+SOaz do osiągnięcia końccwego stężenia białka 40ul/ml.Fbrametry pobierania oceniano czwartego dnia invitro Wartości podano jako średnią ί odchylenie standardowe dla próbek trzykrcf^ych^

FIG. 7