HU202558B - Process for isolating neuronotrophic factor and for producing pharmaceutical composition containing them - Google Patents
Process for isolating neuronotrophic factor and for producing pharmaceutical composition containing them Download PDFInfo
- Publication number
- HU202558B HU202558B HU873594A HU359487A HU202558B HU 202558 B HU202558 B HU 202558B HU 873594 A HU873594 A HU 873594A HU 359487 A HU359487 A HU 359487A HU 202558 B HU202558 B HU 202558B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- neuronotrophic
- bovine
- ngf
- neuronotrophic factor
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás emlős agyvelőből, különösen szarvasmarha nucleus caudatusából származó, új, makromolekuláris neuronotrófiás faktor (SDNF) előállítására.
Kémiai szempontból a tisztított neurotrófiás faktor olyan bázikus fehérje, amelynek izoelektromos pontja pH 10 körül van, SDS gélen elektroforézissel meghatározott móltömege hasonló a lizoziméhoz, vagyis 14 000 és 17 000 dalton között van, átlagértéke mintegy 14 400 dalton. Biológiai szempontból a molekula in vitro növelni tudja az idegrendszeri, elsősorban a központi idegrendszeri neuronok túlélését tenyészetben. A fenti és az említett kémiai és biológiai jellemzők ezt a neuronotrófiás faktort megkülönböztetik, más, korábban közölt és azonosított, makromolekuláris neuronotrófiás faktoroktól. Sőt az SDNF molekula gyógyszerészeti alkalmazását is feltártuk; ezek az alkalmazási formák is részét kepezik a jelen találmánynak.
Ismeretes, hogy az emlőssejtekig vivő ésin vitro túlélését és növekedését egy sor specifikus, sejten kívüli, hormonjellegű jelátvivő szabályozza, amelyek növekedési faktorokként ismeretesek, és amelyek többsége fehérje vagy peptid. Biológiailag mindegyik növekedési faktor a reagáló célsejt egy meghatározott csoportjára hat.
Az idegélettani kutatásban ma különös érdeklődésre tart számot azoknak a makromolekuláris, fehérje-jellegű növekedési faktoroknak a vizsgálata, amelyeknek az a feladatuk, hogy az emlősök idegsejtjeinek túlélését és növekedését biztosítsák, mind a fejlődési szakaszban, mind felnőttkorban. WJ4. Cowan és mts. (Science, 225,1258 /1984/) arra az eredményre jutottak, hogy az idegrendszer fejlődése során a közvetlenül a testnedvekből és a sejt mikrokömyezetéből származó, külső előfordulású neuronotrófiás faktorok szabályozzák az idegsejtek túlélését és elpusztulását. Valóban azt tapasztalták, hogy a növekvő neurit hálózatoknak a célsejtből származó neuronotrófiás faktorokért folytatott versengése szabja meg, hogy melyik neuron maradjon életben és melyik pusztuljon el az embriogenezis során. Felnőttkorban hasonló, ha nem is azonos neuronotrófiás faktorokról állapították meg, hogy nélkülözhetelenek az idegsejtek túlélésének fenntartásában és az agyon belüli funkcionális kapcsolatok korrigálásában (S. Varon: Discussions in Neuroscience, Vol. H, No. 3,1985). Tehát az idegsejtek fokozatos elgyengülése és pusztulása (amely traumatikus károsodás, patológiás folyamatok, így agyvérzés, neurodegeneratív betegségek vagy öregedés következménye lehet) maga után vonhatja a neuronotrófiás faktorok in vivő kimerülését vagy gátlását (S. Varon: uott; SK Appel: Ann, Neurol., 10,499 /1981/; S. Varon és mts.: Dev. Neurosci., 6,73/1984/).Ekutatók azt is közölték, hogy a felnőtt emlősök neuronotrófiás faktorai a kiindulópontjai a károsodást követő helyreállásnak és regenerálódásának, nemcsak a perifériás, hanem a központi idegrendszerben is. A korszerű idegélettani eljárások alkalmazása az állatok központi idegrendszerében végrehajtott átültetési és károsító kísérletekben valóban megerősítette azt az elképzelést, hogy felnőtt emlősök központi idegrendszerében lehetséges a neuronok helyreállítása, feltéve, hogy a megfelelő trófiás jelátvivők rendelkezésre állnak (FH. Gage és mts.: Natúré, 308,637 /1984/).
A legutóbbi időkig az egyetlen jóldefiniált, makromolekuláris, fehérje-jellegű neuronotrófiás faktor az idegnövekedési faktor (NGF) volt (R. LeviMontalcini ésmts.:Physiol. Rév., 48,534/1968/); R. Levi-Montalcini: Ann. Rév. Neurosci., 5, 341 /1982/). Az a felismerés, hogy az NGF csak korlátozott számú emlős neuron típus túlélését képes serkentenie vitro ésin vívó, arra az elképzelésre vezetett, hogy az NGF a makromolekuláris neuronotrófiás faktorok családjának csupán egyik tagja, és mindegyik tag meghatározott neuron típusok túlélését tudja szabályozni. Eddig csak két másik, makromolekuláris, neuronotrófiás faktort sikerült tisztán kinyerni és jellemezni: a ciliáris neuronotrófiás faktort (CNTF) (S. Varon: Discussions in Neuroscience, Vol. Π, No. 3,1985; S. Varon és mts.: Dev. Neurosci., 6,73 /1984/) és az agyvelőből származó neuronotrófiás faktort (BDNF) (S. Varon: Discussions in Neuroscience, Vol. Π, No. 3, 1985; Y. Barde és mts.: Embo J., 1,549 /1982/). E faktorok forrásait, kémiai jellemzését és biológiai aktivitását az alábbiakban bemutatjuk.
Bebizonyosodott, hogy neuron rendszerek in vitro tenyészetei alapvető és nélkülözhetetlen eszközei a neuronotrófiás aktivitás vizsgálatának szövetkivonatokban és ama komplex folyamatok nyomonkövetésének, amelyek alkalmasak a neuronotrófiás faktorok frakcionálására és tisztítására. Kimutatták, hogy a mitózis után disszociált neuronok egyrétegű tenyészete, amelyet in vitro kellőképpen „korlátozó” tenyészeti körülmények között tartottak, igényelte a tenyészethez kívülről hozzáadott trófiás segédanyagot, és reagált is rá. A neuronotrófiás aktivitás tehát hatásosan meghatározható félig tisztított vagy tisztított, nyers preparátumokban az idegsejt túlélés serkentő képesség in vitro nyomonkövetésével. Sőt a morfológiai kritériumok alátámasztására vagy megerősítésére specifikus idegsejt jelzők (pl. az idegszál tartalom analízise vagy specifikus felfogó markerek) is használatosak.
Amint korábban jeleztük, az eddig azonosított, makromolekuláris, neuronotrófiás faktorok az idegnövekedési faktor (NGF), a ciliáris neuronotrófiás faktor (CNTF) és az agyvelőből származó neuronotrófiás faktor (BDNF). Mindegyikük biológiai forrásait, kémai jellemzését és biológiai aktivitását az alábbiakban ismertetjük.
Az idegnövekedési faktort (NGF) eredetileg egerek szarkóma daganataiban fedezték fel (R. LeviMontalcini és mts.: J. Exp. Zool., 116, 321 /1951/), majd homogén, tisztított állapotban hím egerek állkapocs alatti nyálmirigyből (S. Varon és mts,: Biochemistry, 6,2202 /1967/) és kígyóméregből (RJI. Angeletti: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 65, 668 /1970/) nyerték ki. Az NGF sok más gazdag forrását is ismertették, így a tengerimalac prosztatát (G.P. Harper és mts.:Natúré, 279,160/1979/) és az emberi méhlepényt (L.D. Goldstein és mts.: Neurochem. Rés., 3,175/1978/). Kismennyiségű NGF jelenlétét észlelték más szövetekben is, igy emlősök központi idegrendszerében (S. Varon: Discussions in Neuroscience, Vol. Π, No. 3,1985; F. Hefti és mts.: Neuroscience, Vol. Π, No. 3,1985: F. Hefti és mts.: Neuros-2HU 202558Β cience, 14,55 /1985/). A fiziológiai összefüggés az NGF e lehetséges forrásai és hatóterületei között nem egészen világos, de általában feltételezik, hogy az NGF-et különféle perifériás szövetek választják ki, amelyek innervációjához NGF-re reagáló sejtekre van szükség. A hím egerek állkapocs alatti mirigyeiből nyert NGF szekvencia-analízisét és klónozását is végrehajtották (J. Scott és mts.: Natúré, 302, 538 /1983/); A. Ulrich és mts.: Natúré, 303, 821 /1983/). Az emberi béta-NGF gént is sikerült izolálni és klónozni (A. Ulrich és mts.: Natúré, 303,821 /1983/; EuropeanPat.No. 0121388).
Az NGF legteljesebb kémiai jellemzését az egerek állkapocs alatti mirigyeiből kinyert típuson végezték el. Az egérmirigy NGF 7S fehérjekomplexként hat (móltömege mintegy 140000dalton) és három különböző alegységből áll (alfa, béta, gamma), amely Znz+ iont tartalmaz. Az NGF-aktivitás kizárólag a béta-alegységgel kapcsolatos (2,5S NGFként ismeretes), amely bázikus, dimer, 25 300 dalton móltömegű fehérje (SDS gélen végzett elektroforézis során 12 650 dalton móltömeget mutat), amelynek izoelektromos pontja mintegy 9,3. A hím egerek állkapocs alatti mirigyeiből és emberi forrásokból származó béta-NGF szekvenciáit is leírták (J. Scott és mts.: Natúré, 302,538 /1983/); A. Ulrich és mts.: Natúré, 303,821 /1983/).
Az NGF biológiai aktivitásának legtöbb in vitro és in vivő vizsgálatára is az egér állkapocs alatti mirigyéből származó NGF-et használták.
Az NGF in vitro biológiai aktivitásának hatókörét primer idegsejteken és tenyészetbeli klónozott sejteken egyaránt meghatározták. Eszerint a primer idegsejtek in vitro reagálnak az NGF-re. Ezt teszik a főtális érző idegsejtek (8-12 napos embrióknál) a dorzális gyökér-ganglinokban, a főtális autonóm mellékvese-neuronok szimpatikus ganglinokban, főtális kolinerg idegsejtek a rekeszfalban és a klórmaffin mellékvese sejtek fejlődésük közben. Míg az érző és szimpatikus idegsejtek túlélése és fejlődése függ az NGF-től, a kolinerg idegsejtek láthatólag nem igényelnek NGF-et a túléléshez, csupán a differenciálódásukhoz, vagyis fenotípusos jellemvonásaik kifejeződése kapcsolódik a neurotranszmitterhez. NGF hozzáadása a mellékvese krómaffin sejtjeihez (az idegcsúcsból származó sejtek) fejlődésük kezdeti szakaszán az idegsejt fenotípusainak kifejeződését okozza. Az NGF-re in vitro reagálónak mondott, klónos sejtek az idegcsúcs daganatokból származó, krómaffin mellékvese-sejteket (úgynevezett feokromocitoma sejtek, PC12) és emberi neuroblasztoma sejteket foglalják magukban. NGF-fel végzett kezelés után ezek a sejtek az erősen sárjadzó formájukból átmennek mitózis utáni idegsejt állapotba. Az NGF-re in vivő reagálónak talált neuronok a háti gyökér-ganglionok érző idegsejtjei, a központi idegrendszer szimpatikus és kolinerg neuronjai akár a fejlődés során, akár a felnőttkort követő károsodásokban. Ez utóbbi esetben az NGF intracerebrális adagolása elősegítette az idegsejtek túlélését és a jellegzetes fenotípusos vonások kifejeződését. Ezek a hatások összefüggésben vannak a károsodás által kiváltott viselkedési változások javulásával.
A ciliáris neuronotrófiás faktort (CNTF) először csirkeembriók szemszövetéből (Es) mutatták ki és izolálták tisztán. Ezek a szövetek a szivárványhártya érhártyájából és ciliáris testjéből, továbbá ezek pigmentáló epitáliumából származtak. Később CNIF-aktivitást találtak különféle szövetkivonatokban is, így felnőtt patkányok űlőidegeiben és ugyancsak patkányok központi idegrendszerének sebnedveiben.
A kémiai jellemzéshze a CNTF-et csirkemagzat szemen belüli szöveteiből nyerték ki tisztán (fehérjére számítva mintegy 2.104, trófiás aktivitásra nézve pedig 9% mennyiségben). SDS gélen végzett elektroforézissel móltömegét 20 400 daltonnak találták, izoelektromos pontja pedig pH 5 körül van. Ez a móltömeg és ugyancsak a tisztán negatív töltés egyértelműen megkölünbözteti a CNTF-et az egerek szubmandibuláris fehérjéjétől, a béta-NGF-től. A csirkeszemből kinyert CNTF szekvenciáját nem közölték és emlősökből származó CNTF-et sem sikerült preparatív méretekben elkülöníteni.
A CNTF biológiai aktivitásának vizsgálatát főképpen csirkeszem kivonatokból származó, félig vagy teljesen tisztított CNTF preparátumokban végezték, kizárólag in vitro. Az in vi/ro reagáló neuronok a következők voltak: Ciliáris ganglionok csirkemagzatból (Es), csirkemagzat háti gyökérganglionjainak neuronjai (Eio), újszülött egér háti gyökérganglionjainak neuron jai, Ei i csirke-ganglionok és újszülött patkány ganglionok szimpatikus neuronjaí. Azt is leírták, hogy egyik ilyen aktivitás sem volt blokkolható vagy gátolható az egerek szubmandibuláris béta-NGF-jének antitestjeivel. A CNTF in vivő hatásáról nincs adat.
Az agyvelőből származó neuronotrófiás faktor (BDNF) aktivitását patkányok C6 klónos sejtvonalából származó, kondicionált közegekben és más fajok agyvelőkivonataiban vizsgálták. A faktort tisztán felnőtt sertésagyvelőből nyerték ki.
A felnőtt sertésagyvelőből tisztán kinyert BDNF (fehérjére számítva 3.8.108, trófiás aktivitásra nézve kevesebb, mint 5% mennyiségben) erősen bázikus polipeptid (izoelektromos pontja 10,1 feletti), SDS gélelektroforézissel megállapított móltömege mintegy 12 300 dalton. Szekvenciáját nem közölték az irodalomban. A BDNF molekulát és extrakció jának eljárását a DE 3213963 Al. számú NSZK-beli szabadalmi leirás adja meg.
ABDNF biológiai aktivitásának vizsgálatát kizárólag in vitro végeztek sertésagyvelőből származó nyers kivonatban, valamint félig vagy teljesen tisztított BDNF preparátumokban. Kimutatták, hogy mind a plakoidból, mind az idegcsúcsokból származó érző neuronok túlélését, továbbá in vitro retina explantátumok neurit-kinövéseit és sejt túlélését elősegíti a BDNF (J.E. Tumer: Develop. Brain Rés., 18,251 /1985/; JE. Turner; Develop. Brain Rés., 18, 265/1985/).Noha aBDNF kémiai tulajdonságai nagyon hasonlóak a béta-NGF-éihez, immunológiai keresztreakcióját nem mutatták ki, sőt a szimpatikus neuronokra sem hat. A BDNF in vivő hatásáról semmilyen közlemény nem jelent meg.
A találmány eljárás az új, 14 000 -17 000, átlagosan mintegy 14 400 dalton móltömegű, 9,5 és 10,5 pH közötti izoelektromos pontú, az idegrendszer, különösen a központi idegrendszer neuronjai3
-3HU 202558Β ra ható neuronotrófiás faktor (SDNF) előállítására, olymódon, hogy
1) emlős-, előnyösen szarvasmarha-agyvelő szövetet homogenizálunk,
2) a kapott homogenizátumot 4-5 pH értéken le- 5 választjuk,
3) a kapott szupernatáns folyadékot dializáljuk egy 5 és 10 kilodalton molakulatömeg közötti viszszatartású dializáló membránnal,
4) a d ializál t szupernatáns folyaédkot kromatog- 10 ráfíásan frakciónáljuk egy molekulaszűrőn egy hígított pufferezett eluenssel 10 nmól/1 és 30 nmól/1 közötti koncentrációnál, a fenti l)-4) műveleti lépéseket 0 ’C és 6 ’C közötti hőmérsékleten lefolytatva; 15 és kívánt esetben a kapott neuronotóniásan aktív frakciókat kationcserélő kromatográfiával tisztítjuk.
Akár friss, akár fagyasztott (pl. -70 ’C-on) emlős agyvelőt használhatunk. Az alább bemutatott tiszti- 20 tási eljárás mindegyik lépését legcélszerűbb 0 és 6 ’C közötti hőmérsékleten végrehajtani.
Egy-egy adag előállítására a teljes agyvelőt vagy annak egy részét 6 és 7,4 közötti pH-ra beállított pufferoldat 2 vagy 4 térfogategységével homogeni- 25 záljuk, majd célszerűen sósavval 4 és 5 pH közé, előnyösen 4,5 pH-ra savanyítjuk, és néhány órán át keverjük. A kicsapódott anyagot centrifugálással (pl. 40 000 min1 fordulatszámon 40 percig) szétválasztjuk, a felülúszót semlegesítjük, hígított puffé- 30 roldat ellen dializáljuk olyan membránon, amelynek áteresztési móltömeghatára 5 és 10 kilodalton közé esik, majd az anyagot fagyasztva szárítjuk. A molekulaszitás frakcionálást úgy végezzük, hogy az állófázison a frakcionálási tartomány 5 és 150 kilo- 35 dalton között legyen. Az eluáláshoz olyan pufferoldatot használunk, amelynek koncentrációja 10 mmól/1 és 30 mmól/1 között, pH-ja 6 és 7,4 között mozog. A biológiailag aktív frakciókat összegyűjtjük, fagyasztva szárítjuk, majd kationcserélő kro- 40 matográfiás oszlopra visszük fel, és 0,1 mmól/1 és 1 mmól/1 között változó koncentrációjú, 6 és 7 közötti pH-jú ammónium-acetát pufferoldattal gradiens-elúcióval futtatjuk. A neuronotrófiás aktivitású rész az 1 mól/1 koncentráció közelében eluálódik. 45 Az aktív frakciókat ismételten összegyűjtjük, és fagyasztva szárítjuk.
A fenti eljárás a tisztítás bármelyik stádiumában megszakítható, ha a biológiailag aktív anyag már kellőképpen tiszta. 50
A találmány előnyös kiviteli módjának szemléltetésére az alábbi példát adjuk meg, de a találmány nem korlátozódik erre az esetre:
Vágóhídról kikerülő, friss szarvasmarha agyveloből jegelt állapoton kimetszük a nucleus cauda- 55 tust. Egy-egy adag előállításához mintegy 150 g caudatus szövetre van szükség (25-30 agyvelőből).
Ezt 3 térfogategység foszfáttal pufferolt 1:10 arányban hígított (pH 7,4) sóoldattal (PBS), amely 0,3 gm/cm3 fenü-metü-szulfonil-fluoridot (PMSF) 60 és 1 mmól/1 etüénglikol-bisz(béta-amino)-etil-éterΝ,Ν,Ν’,Ν’-tetraecetsavat (EGTA) tartalmaz, Polytron készülékben, 6-os beállítás mellett 60 másodpercig homogenizáljuk. Ezután sósavval 4,5 pHra savanyítjuk, 2 órán át jégen tartjuk, majd 40 000 65 «
min fordulatszámon 40 percig centrifugáljuk. A felülúszót összegyűjtjük, 7,4 pH-ra semlegesítjük, egy éjszakán át dializáljuk 1:10 arányban hígított PBS-sel (pH 7,4) 8 kilodalton áteresztési határral, végül fagyasztva szárítjuk, és aliquot részekre osztva -20 ‘C-on tároljuk. Közvetlenül használat előtt az elkülönített részeket az eredeti térfogathoz képest 1/10-nyi mennyiségű desztillált vízben újra szuszpendáljuk, és meghatározzuk a fehérje-tartalmát G.L. Peterson módszere szerint (Anal. Biochem., 83 346/1977/). Amintákat ezután a tenyésztési közeggel felhígítjuk, 1 mg/cm3 töménységű marha-szérumalbumin oldattal előzetesen telített, 0,45 mikrométer lyukméretű Millex szűrőn átszűrjük, és a kívánt mennyiségű, szűrt felülúszó frakciót szérummentes középagyi sejttenyészetekhez adjuk a neuronotrófiás aktivitás vizsgálata céljából.
x 120 cm-es, Sephadex G-150-tel (finom frakció) töltött oszlopot használunk a felülúszó komponenseinek mól tömeg szerinti szétválasztására. A fagyasztva szárított felülúszó termékeket desztüált vízben újra szuszpendáljuk, és felöntjük az oszlopra (mintegy 750 mg fehérjét 6 cm3 eluáló pufferben). Az eluáló puffer (pH 7,30) összetétele millimolaritásban a következő: 13,68 NaCl; 0,27 KC1; 0,8 Na2HPO4.7H2O; 1,5 KH2PO4.
Az oszlopot 90 cm3/h áramlási sebességgel eluáljuk, perisztaltikus szivattyú alkalmazásával. Az eluátum optikai sűrűségét folyamatosan regisztráljuk 280 nm-nél mérő UV-spektroszkóppal. Automatikusan 15 cm3-es frakciókat gyűtjünk, amelyeket fagyasztva szárítás után neuronotrófiás aktivitásra vizsgálunk. A gélszűréses kromatografálást hidegszobában, 4 ’C hőmérsékleten végezzük.
A Sephadex G-150 oszlopról eluálódó, biológiailag aktív frakciókat összegyűjtjük és fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva szárított anyag aliquot részeit 110 mm^O.l mól/1 ammónium-acetát oldatban (pH 6,45) újra szuszpendáljuk. A fehérjéket lOmm3-ben határozzuk meg. A megmaradt 100 mm-t (1,9 mg fehérje) TSK-CM-3SW ioncserélő oszlopon nagynyomású folyadékkromatográfiának vetjük alá, 0,1 mól/1 és 1 mól/1 közötti ammónium-acetát koncentrációval gradiens-elúciót hajtva végre, 6,45 pH-n, 0,5 cm3/min áramlási sebességgel. A-pufferoldat: 0,1 mól/1 ammónium-acetát 6,45 pH-η, B-pufferoldat: 1 mól/1 ammónium-acetát 6,45 pH-η. A gradiens-profil: 0-20 perc között 100% A-oldat (izokratikus), 20-40 perc között 0% A/100% B-ig lineárisan változik, 40-70 perc között 0%A/100% B (izokratikus), 70-75 perc között 100% A/0% B-ig lineárisan változik. A frakciókat fagyasztva szárítjuk, majd újra szuszpendáljuk 0,6 cm3 foszfát-pufferben (10 mmól/1 pH 5,7).
Afehérjéket 100mm-benmérjük, és a maradék anyagot használjuk biológiai vizsgálatra és SDS poliamidgél-elektroforézis vizsgálatra.
A tisztítási eljárás fő lépéseit és az elérhető tisztasági fokozat példaképpen az 1. táblázat foglalja össze fehérjére és a neuronotrófiás aktivitás százalékos kinyerésére vonatkoztatva, A fehérje és a trófiás aktivitás kinyerésének mértéke különbözteti meg a jelen eljárást a CNTF és a BDNF tisztításának egyéb módszereitől.
-4HU 202558Β
1. táblázat
A SZARVASMARHA AGYVELŐBEN LEVŐ NEURONOTRÓFIÁS FAKTOR FŐ TISZTÍTÁSI LÉPÉSEINEK ÖSSZEFOGLALÁSA
Tisztítási stádium | Összes fehérje mg | Tiszt. faktor | Fajlagos aktivitás pg/TU* | Összes TU* | TU* Kinyerés % |
Homogenizátum | 11625 | 1 | - | - | - |
Felülúszó a savas kicsapás | |||||
után | 750 | 15,5 | 6 | 125000 | 100 |
Sephadex G-150 | 14,7 | 791 | 0,3 | 49000 | 39 |
CM-HPLC | 0,361 | 32202 | 0,01 | 36100 | 29 |
*TU - trófiás egység: definíciószerűen az a fehérje-koncentráció pg/cm -ben, amely fele annyi neuron túlélését biztosítja, mint azoknak a neuronoknak a maximális száma, amelyek túlélnek az aktív anyag telítési koncentrációjának hatására. A „neuronok túlélése” az az idő, amely alatt a mesterséges kultúrába vitt neuronok életképességüket a kultúrában megtartják.
A teljes homogenizátum savas kicsapása, semlegesítése és dialízise után kapott, nyers, felülúszó frakció biológiai aktivitása tripszin-érzékeny, ami azt mutatja, hogy az aktív molekula fehérje vagy peptid természetű. Az említett, nyers, felülúszó kivonatban jelen levő, biológiailag aktív molekula a Sepbadex G-150 oszlopról olyan frakciókban eluálódik, amelyeknek a móltömege 10 000 és 30 000 dalton között mozog (1. ábra).
Az 1. ábra görbéi a szarvasmarha caudatus teljes homogenizátumából kicsapás, semlegesítés és dialízis után kapott felülúszó Sephadex G-150 oszlopon nyert tipikus elúciós profilját mutatják, a folyamatosan regisztrált optikai sűrűséget a kilodaltonban kifejezett molekulatömeggel szembeállítva. A három görbe ugyanazon minta három különböző érzékenységű mérés eredménye. Mindegyik frakció biológiai aktivitását megvizsgáltuk, miközben a fehérje-koncentráció 0,01 és 10 pg/cm3 között változott. Aktivitást az 1. ábrán vízszintes vonallal jelzett frakciókban kaptunk.
A Sephadex G-150 oszlopról eluált, aktív frakciókban levő, biológiailag aktív molekula a TSK-CM3SW oszlopról 1 mól/1 körüli ammónium-acetát puffer koncentrációnál eluálódik (2. ábra).
A 2. ábra a Sephadex G-150 oszlopról eluált, aktív frakciók TSK-CM-3SW oszlopról nagynyomású folyadékkromatográfiával kapott, tipikus elúciós profilját mutatja. A tisztítás a leírt körülmények között történt. Mindegyik frakció biológiai aktivitását megvizsgáltuk, miközben a fehérje-koncentrációk 0,001 és 0,3 pg/cm3 között változott. A vízszintes vonal által mutatott aktivitást az 1 mól/1 körüli ammónium-acetát koncentrációknál eluálódó frakciókban kaptuk
Ez utóbbi elúciós idő hasonló a cytochrome C retenciójához, ami azt mutatja, hogy az aktív molekula izoelektromos pontja is hasonló a cytochrome Céhez, vagyis mintegy 10-10,5. Ez a tulajdonság megkülönbözteti a jelen aktív molekulát a CNTFtől, amelynek izoelektromos pontja mintegy 5.
Az SDS-PAGE (poliakrilamid) gélelektroforézishez V. Lee és mts. módszere szerint (Neuroscience, 6, 2773 /1981/) 12,5 tömeg/térfogat%-os poli(akril-amid) géltömböt használtunk és nemfolytonos puffért, amely U.K. Laemmli módszere szerint (Natúré, 227,680/1970/) SDS-t tartalmaz. A tisztítási eljárás fő lépéseiből (a teljes homogenizátum savas kicsapása utáni felülúszó kivonatának semlegesítése, dialízise és Sephadex G-150 és TSK-CM3SW oszlopon végzett tisztítása után) származó, bi25 ológiailag aktív anyagok elektroforézis képét a 3A.
ábra mutatja. Az ábrán az ezüsttel megfestett SDSPAGE gélelektroforetogramm látható, ahol az 1. és 5. csíkban BioRad standard fehérjét, a többiben csíkonként 5 pg fehérjének megfelelő mennyiségű ak30 tív anyagot futtattunk a tisztítási eljárás fő lépései után, vagyis a teljes homogenizátum savas kicsapása, semlegesítése és fagyasztva szárítása után (2. csík), a Sephadex G-150 oszlopon és a TSK-CM3SW oszlopon végzett eluálás után (3. és 4. csík).
A standard móltömeg-jelző anyagok a következők voltak: miozin (móltömeg 200 000), béta-galaktozidáz (móltömeg 116 250), foszforiláz b (móltömeg 92 500), marha szérumalbumin (móltőmeg 66 200), ovalbumin (móltőmeg 45 000), szén anhidráz (móltőmeg 31 000), szójabab tripszin inhibitor (móltömeg 21500) és lizozim (móltömeg 14 400).
Az elektroforézishez használt minta-puffer a következőket tartalmazta: 62,5 mmól/1 trisz(tri/hidroxi-metil/-amino-metán) (pH 6,8), 10 tömeg/térfo45 gat% glicerin, 2 tömeg/térfogat% SDS (nátrium-dodecil-szulfát), 2,5 mmól/1 EDTA, 2,5 mmól/1 EGTA, 0,01% brómfenolkék és 5% béta-merkapto-etanol.
A TSK-CM-3SW oszlopról eluált, biológiailag aktív anyag egyetlen sávként vándorolt, móltömege hasonló a standardként használt (BioRad), 14 400 dalton móltömegű lizoziméhoz. Ez a móltőmeg megkülönbözteti ezt az aktív molekulát a többi, már azonosított neurontrófiás faktoroktól (NGF, CNTF, BDNF). A TSK-CM-3SW oszlopról eluáló, aktív anyag SDS-PAGE gélelektroforetikus vándorlása nem hasonló az egerek állkapocs alatti mirigyéből nyert béta-NGF-éhez (3B. ábra). A 3B. ábra példát mutat be az ezüsttel megfestett SDS-PAGE elektroforetogrammra, standardként BioRad indi60 kátorokat (1. és 4. csík), mintaként pedig egér állkapocs alatti mirigyéből nyert 2,5 pg béta-NGF-et (2. csík) és 2,5 pg TSK-CM-3SW oszlopról eluált aktív anyagot (3. csík) alkalmazva. A standard fehérje ugyanaz volt, mint a 3A. ábrán
Az NGF a vándorlás során a TSK-CM-3SW osz5
-5HU 202558Β lopról eluálódó, aktív molekula mögött marad. Ismeretes, hogy a BDNF vándorlási helyzete az SDS elektroforézis során hasonló az NGF-éhez. Ez tehát azt is jelzi, hogy a TSK-CM-3SW oszlopról eluálódó, aktív molekula a BDNF-től is különbözik.
A tisztítási eljárás főbb lépései után nyert anyagok (a teljes homogenizátum savas kicsapása, semlegesítése és dialízise utáni nyers felülúszó kivonat; a G-150 oszlopról nyert eluátum; a TSK-CM-3SW oszlopról eluált anyag) biológiai aktivitását szokásosan úgy határoztuk meg, hogy megfigyeltük a hatását egérmagzatból kinyert, szérummentes tenyészeten tartott, disszociált, primer, középagyi sejtek túlélésére. Ezen túlmenően meghatároztuk a n10 ban és a C-GABA fajlagos felvételét GABAerg neuronokbán, amelyek a tenyésztési rendszerben jelen vannak. így a morfolgóiaí kritériumokat is hitelesítettük ill. megerősítettük.
Az alábbiakban ismertetjük a sejttenyészet előállításának módszereit, a sejtek túlélésének értékelését és a fajlagos anyagfelvétel paramétereit a sejttenyészet előállítási jellemzőinek fényében, valamint a tisztítási eljárás fő lépései után nyert anyagok hatásait.
1. A sejttenyészet előállítási módszere és a sejttípusok in vitro értékelésére használt immunkémiai kritériumok
13-napos egérembrió agyvelejéből steril körülmények között kivágtuk a rosztrális középagyi tegmeutumot. Az összegyűjtött agyrészeket PBS-ben mechanikusan szétoszlattuk. A PBS oldat millimoláris összetétele a következő volt: 136,8 NaCl; 2,7 KC1; 8 Na2HPO4.7H2O; 1,5 KH2PO4; glukóztartalma 6 mg/cm , marha szérumalbumin tartalma 0,1 mg/cm3,pH-ja 7,4volt.Asejteket45min'1 fordulatszámon 4 percig centrifugáltuk, a tenyésztési közegbe visszaszuszpendáltuk, átbocsátottuk 20 pm-esNytex-szűrőn, a sejteket Coulter számlálóval megszámláltuk, és 35 mm-es Falcon szövettenyésztő műanyagtálban szétterítettük.
Mindegyik tálat befedtük marhabőr-kollagénnel (Vitrogen, 100 pg fehérje), Eagle-féle tenyésztési alapközeget (BME), NaHCO3-ot és NaOH-ot használva úgy, hogy az ionerősséget és a pH-t növeljük (T. Elsdale és mts.: J. Cell. Bioi., 54,626119727).
AtenyésztőközegBMEésHam-féleF12 1:1 arányú elegye volt, kiegészítve 33 mmól/1 glukózzal, 2 mmól/1 glutaminnal, 15 mmól/1 NaHCO3-tal, 10 mmól/1 N-2-(hidroxi-etil)-piperazin-N’-2-etánszulfonsawal (HEPES), továbbá U.Di Porzio éspits. (Natúré, 288,370/1980/) javaslatára 25 pg/cm3 inzulinnal, 100 pg/cm3 transzferrinnel, 60 mmól/1 putreszcinnel, 20 mmól/1 progeszteronnal, 30 mmól/1 nátrium-szelenittel, 0,5 ep'ség/cm3 penicillin G-vel, 0,5 pg/cm3 sztreptomicinnel; tartalmazott még 30 mmól/13,3’,5’-trijód-DL-tironint (J. Puymirat és mt&: Neuroscience, 10, 801 /1983/). Általában 2 cm3, a kívánt disszociált sejtszámot tartalmazó tenyészközeget tettünk egy-egy tálba.
A sej t-típusok in vitro azonosítását közvetett immunfluoreszcenciás vizsgálattal végeztük, neurofilament fehérjék elleni, RT97 monoklonális antitest alkalmazásával (B.H. Anderton és mts.: Natúré,
298,84 /1982/), amely a neuronsejtek specifikus in vitro indikátora (P. Doherty és mts.: J. Neurochem., 42,1116 /1984/). Eszerint a tenyészeteket 7 percig -20 ’C-on metanollal rögzítettük, a rögzített tenyészeteket áteresztővé tettük 0,1 térfogat%-os Triton X-100 (poli/oxi-etilén/éter) kezeléssel PBS-ben 30 percig, majd tovább inkubáltuk 60 percig 10% fötális borjúszérumot tartalmazó PBS-ben a nemspecifikus fehérjekötő helyek blokkolása céljából. PBSben 1:500 hígítású, neurofilament elleni antitesttel inkubáltunk szobahőmérsékleten 60 percig, majd 10% fötális borjúszérumot (FCS) tartalmazó PBSsel háromszor öblítettünk. A tenyészethez ezután rodaminnal konjugált, vagy affinitású, tisztított, antíegér kecske-IgG-t adtunk 1:100 hígításban, szobahőmérsékleten 60 percig. Ismét öblítettünk háromszor 10% FCS-t tartalmazó PBS-sel, végül glicerin és PBS 1:1 arányú elegyébel fedőlemezre vittük, és rodamin epifluoreszcenciás és fáziskontraszt optikával felszerelt Zeiss IH fénymikroszkóp alatt megvizsgáltuk. A közvetlen immunfluoreszcenciához egér gliális, fibrilláris, savas fehérje (GFAB) antiszérumát használtuk (az asztrocita sejtek specifikus in vitro jelzésére), majd nagy affinitású, tisztított, rodaminnal konjugált, antíegér kecske-IgG-t vittünk be M.C. Raff és mts. (Brain Rés., 174, 283 /1979/) eljárásával.
2. A sejt-túlélés időbeli lefolyásának meghatározása a tenyészetben
A sejtek túlélését morfológiai kritériumok (vagyis a túlélő sejtek számának időbeli alakulását fáziskontraszt mikroszkóppal mérő, in vitro módszer), a DNS-tartalom biokémiai meghatározása és az egyes tálakban a túlélő dopaminerg sejtek számának időbeli alakulása alapján értékeltük. A DNStartalmat B.G. Erwin és mts. (Anal. Biochem., 110, 291/1981/) módszere alapján határoztuk meg, az egyes tálakban található dopamering sejtek számát pedig úgy mértük, hogy a specifikus dopamin-felvétel után szemmel észleltük a fluoreszkáló neuronokat glioxilsawal kiváltott fluoreszcencia (GIF) módszerével G. Bolstad és mts. (Comp. Biochem. Physiol., 62,61 /1979/) szerint. Az utóbbi esetben a sejteket katecholamin-epifluoreszcenciás és fáziskontraszt optikával felszerelt Zeiss ΙΠ fénymikroszkóppal figyeltük meg. Előre rögzített koordinátákkal a legalább a teljes terület 3%-án számoltukmeg a GIF-pozitív neuronokat.
3. A specifikus dopamin- és GABA-felvétel meghatározási módszere
A n-dopamin specifikus felvételének értékelését B. Berger és mts. (Neuroscience, 7,193 /1982/) szerint végeztük. A sejteket egyszer mostuk előmelegített PBS-sel, amely 5 mmól/1 glukózt, 1 mmól/1 CaChot, 1 mmól/1 MgSO4-ot, 0,1 mmól/1 aszkorbinsavat, 0,1 mmól/1 pargilint tartalmazott, majd 5 percig előindukáltuk a fenti oldat 0,8 cm3-ével. Szükség esetén az inkubáló oldathoz 5 mmól/1 benztropint, 5 mmól/1 dezmetüimpiramint ül. 1 mmól/1 fluoxtint is adtunk. Szokásosan 0,2 cm3 3H-dopamint hozzáadva (végső koncentráció: 50 mmól/1, fajlagos aktivitás: 22-33 Ci/mmól), az inkubálást 37 °C-on 15 percig folytattuk. Ekkor a dopamin-felvételt leállítot-6HU 202558Β tűk az ínkubáló közeg eltávolításával és négyszeri gyors öblítéssel jéghideg PBS-sel. A 3H-dopamint mindegyik tálból extraháltuk kétszer 0,5 cm3 0,4 mól/1 HC104-tal, víz és abszolút etanol 3:1 térfogatarányú elegyében, 15-15 percig. Akinyerés95% felett volt. A radioaktivitás méréséhez 10 cm3 Instagel Π-t (folyékony szcintillációs számláló közeg) adtunk hozzá, és Packard TriCarb (Model 460 C) szcintillációs számlálóval mértünk. Egyes mintákból az inkubálás és a mosások után kivontuk a sejten belüli radioaktivitást 0,5 cm3 0,4 n perklórsawal, és nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) analizáltuk (C. Kotake és mts., J. Neurosci., 2,1307 /1982/); A Shum és mts.: J. Chromatog., 228,123 /1982/). A bevitt radioaktivitásnak több, mint 95%a abban a frakcióban jelentkezett, amely a dopamin retenciós idején eluálódott.
A 14C-GABAspecifikusfelvételétA.Prochiantz és mts. (Natúré, 293,570 /1981/) módszerével értékeltük. 0,1 pmól/1 14C-GABA (225 mCi/nmól) hozzáadásával 15 percig 37 ’C-on inkubáltuk. A GABA katabolizmusát 10 pmól/1 amino-oxiecetsawal akadályoztuk meg. Szükség esetén 1 mmól/1 diamino-vajsavat is adtunk az elegyhez mint GABA-felvételi inhibitort. A mosási és extrahálási eljárások azonosak a 3H-dopamin felvételi vizsgálatoknál alkalmazottak. A GABA azonosítását vékonyrétegkromatográfiás (ILC) módszerével végeztük (R.S. Lasher: Brain Rés., 69,235 /1974/). A radioaktivitásnak több, mint 90%-a a hiteles GABÁ-val együtt vándorló foltban volt.
4. Asejttenyészet morfológiai értékelése, életképessége és biokémiai jellemzése
A tálban feltapadó, életképes sejtek több, mint 98%-a mind 4, mind 8 nap után in vitro pozitívan immunreaktív és RT97 -es monoklonális antitestekkel immuncitokémiailag festhetők voltak Sőt a tenyészetben levő sejtek kevesebb, mint 1%-a a teljes vizsgálati idő alatt immunreaktóv volt GFAP antszérumos festéssel szemben. Mindez azt mutatja, hogy a tenyészetben levő sejteknek több, mint 98%a neuronhoz tartozónak tekinthető. A tenyészetben levő dopaminerg neuronok vizuálisan meghatározott száma azt mutatja, hogy ezek a sejtek azin vitro jelenlevő teljes sejtpopulációnak mintegy 0,ΙΟ,2%-át teszik ki.
A vizsgált tenyészeben levő sejtek életképessége 4 napig nem változott in vitro. A 4. és 8. nap között azonban az életképesség 60-80%-ka csökkent. Ez nemcsak a morfológiai vizsgálatból tűnt ki, hanem az azt követő DNS-tartalom vizsgálatból és a dopaminerg sejtek tálankénti számából is. Ez azt mutatja, hogy a középagyi idegsejtek életképessége az alkalmazott tenyésztési körülmények között korlátozott, és a tenyészetben jelenlevő, különböző típusú sejtek életképessége között nincs érzékelhető különbség (lásd 4. ábra).
A 4. ábra diagramja az összes neuronok, a GIFpozitív neuronok számának és a BZT-érzékeny dopamin-felvétel időfüggését mutatja. A tenyésztési közeget 1.10 sejt/2cm3 tenyésztő közeg 35 mm-es tálban mennyiségű középagyi sejttel oltottuk be.
A 4. ábra jelzései a következők: DNS-tartalom tálanként (.-.); BZT érzékeny dopamin-felvétel (o12
o); GIF-pozitív sejtek száma tálanként (üres hisztogram); BZT-érzékeny dopamin-felvétel 1000 GIF-pozitív sejtre számítva (vonalkázott hisztogram).
A sejtek életképességének meghatározásához hasonlóan a 3H-dopamin és a 14C-GABA specifikus felvétele is csökkent a tenyészetben 60-80%kal a 4. és 8. nap között in vitro. Ez is arra utal, hogy nincs látható különbség a jelenlevő, különböző típusú sejtek in vitro viselkedése között, és igazolja, hogy ezek a felvételi paraméterek megfelelően jelzik a sejtek in vitro életképességét.
5. A tisztítási eljárás fő lépései után kapott anyagok biológiai aktivitása
Ennek meghatározására a tisztítás fő lépéséből származó, fagyasztva szárított anyag aliquot részeit közvetlenül a használat előtt az eredeti térfogathoz képest 1/10-nyi desztillált vízben újra szuszpenzáltuk. A fehérjetartalmat G.L. Peterson (Anal. Biochem., 83, 346119ΊΊΙ) szerint határoztuk meg. A mintákat ezután a tenyésztő közeggel felhígítottuk 0,45 pm-es Millex szűrőn átszűrtük, és 1 mg/cm3 marha szérumalbuminnal telítettük. A leszűrt anyag kívánt mennyiségét a felkenés napján hozzáadtuk a középagyi sejtek tenyészetéhez. Azonos mennyiségű marha szérumalbumint adtunk a kontroll sejttenyészetekhez is. A közeget kétnaponként cseréltük, vagy a tisztítási lépésből származó anyagot (ill. a kontroll tenyészetek esetés az albumint) utánpótoltuk. Mindegyik fő tisztítási lépés utáni anyag - a nyers felülúszó kivonat a teljes homogenizátum savas kicsapása után, a Sephadex G-l 50 oszlopról eluálódó, 10 és 30 kilodalton közötti móltömegű frakció és a TSK-CM-3SW oszlopról az 1 mól/1 ammónium-acetáttal eluálódó frakció nölveni tudta a tenyészetben levő, disszociált, fötális, középagyi idegsejtek életképességét, vagyis túlélését és fejlődését. A nyers felülúszó frakció ill. az albumin (kontroli-tenyészet) morfológiai megjelenését mutatja az 5A. és 5B. ábra a felkeoés napján (0. nap) hozzáadott tenyésztési közeggel in vitro végzett sejttenyésztés 8. napján. Az ábrák az egér fötális, középagyi sejtjeinek tipikus képét mutatják in vitro, 8 nappal azután, hogy hozzáadtunk 10 pg/cm3 albumint a kontroli-tenyészethez (5A. ábra) és 10 pg/cm3 felülúszó kivonatot a teljes homogenizátum savas kicsapása és dialízise utáni lépésből (5B. ábra).
Ez a hatás bebizonyosodott az össz-DNS tartalom meghatározása, az egyes tálakban talált dopaminerg sejtek száma (6. ábra), a 3H-dopamin és a I4C-GABA specifikus in vitro felvételének időfüggése alapján is.
A 6. ábra a GIF-pozitív (azaz dopaminerg) sejtek számának és a tálankénti DNS-tarülomnak az értékelését mutatja az in vitro sejttenyésztés nyolcadik napján, 10 pg/cm3 albumin (kontroli-tenyészet, üres hisztrogramm) ill. a teljes homogenizátum savas kicsapása és dialízise utáni felülúszó 10 p/cmének (vonalkázott hisztogramm) hozzáadása után. Az értékek három analízis középértékeit és (±) a középérték standard hibáját adják meg. A 7. ábra azt mutatja, hogy a fenti felülúszó hatása a dopamin-felvételre koncentrációfüggő. Ugyanezt észiel7
-7HU 202558Β tűk a tálankénti GABA- és DNS-felvétel meghatározáskor is.
A 7. ábra különösen jellegzetesen mutatja a teljes homogenizátum savas kicsapása és dialízise után nyert marhakivonat különböző hozzáadott koncentrációinak hatását a BZT-érzékeny dopaminfelvételre. A középagyi sejtek oltási sűrűsége 0,5.10° sejt/lcm3 tenyészközeg (24 mm-es tálban). A feltüntetett mennyiségű marhakivonatot a kikenés időpontjában adagoltuk be 50 mm3térfogatban. Szükség esetén a mintákat marha szérumalbuminnal is kiegészítettük úgy, hogy a végső fehér jekoncentráció 40 μg/cm3 legyen. A felvételi paramétereket az in vitro tenyésztés negyedik napján értékeltük. Aközölt adatok három minta középértékei ± standard deviációval. Mindezek az eredmények együttesen azt mutatják, hogy az aktív anyag növelni tudja különböző típusú neuronok in vitro túlélését és fejlődését, azokét mindenesetre, amelyek a használt tenyészetekben jelen voltak. Noha hasonló hatásokat akkor is kimutattunk, amikor a felülúszó kivonatok, a Sephadex G-150 oszlopról eluálódó, 10 és 30 kilodalton között gyűjtött frakciók és aTSK-CM-3SW oszlopról móVl ammónium-acetátnál eluálódó frakció-csoport trófiás aktivitását vizsgáltuk, de az ehhez a hatáshoz szükséges anyagmennyiség különböző volt. Konkrétén: míg a nyers felülúszó kivonat mintegy 6 μg/cm3 koncentrációban mutatta a maximális biológiai hatás félértékét in vitro, a Sephadex G-150 ill. a TSK-CM-3SW oszlopokról nyert frakciókkal ugyanezt a félértéket 0,3 pg/ctn ill. 10 ng/cm3 szinten lehetett elérni (lásd 1. táblázat).
Más típusú idegsejtek, elsősorban egér fötális striatumából származó, disszociált idegsejtek biológiai aktivitásának in vitro vizsgálata azt mutatta, hogy az aktív molekula hatásosan növeli az idegrendszer, különösképpen a központi idegrendszer különböző területein jelenlevő, különféle típusú neuronok túlélését és fejlődését. Sőt az aktív anyag hatásosan növelte 12-napos csirkeembriók dorzális gyökér ganglion neuronjainak in vitro neurit-növekedését, de a 8-napos embrióét nem. Ez az effektus is azt mutatta, hogy ez a neuronotrófiás faktor különbözik az egér nyálmirigyekből nyert béta-NGFtől.- Az egér nyálmirigyekből származó bété-NGF különböző koncentrációinak (1 ng/cm-től 300ng/cm-ig) hozzáadása valóban nem befolyásolta a tenyészetben a szokásosan használt, egérből származó, dosszociált, középagyi sejtek túlélését.
A találmány másik tárgya az emlős agyvelőből származó neuronotrófiás faktor (SDNF) in vivő alkalmazása, vagyis ezt a faktort tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása. Amint az előzőekben tárgyaltuk, ismeretes, hogy a neuronotrófiás faktorok nemcsak az idegrendszer fejlődése során szabályozzák az idegsejtek túlélését és a neuronok alkalmazkodóképességét (amelyet az idegsejt azon képességével definiálnak, morfológiai-funkcionális módosulást szenved a mikrokörnyezet megváltozásának hatására), hanem feltehetőleg felnőtt állapotban is. Valóban gyűlnek a bizonyítékok, amelyek arra utalnak, hogy a neuronotrófiás faktorok alighanem szabályozzák a felnőtt neuronokat is a következő funkciókban:
I. A normális sejtek fennmaradásában, funkcionális teljesítőképességében és öregedésében (S. Varon: Discussions in Neuroscience, Vol. Π, No. 3, 1985), vagyis a neuronotrófiás faktoroknak kellő mennyiségben kell rendelkezésre állniok és használhatóknak lenniük a trófiás szükségletek normális kielégítésére, következésképpen a felnőtt neuronok rendellenes in vivő működése a trófiás anyag nem kielégítő előfordulását tükrözheti.
Π. A kémiailag vagy mechanikusan károsodott sejtek megjavulásában és regenerálódást folyamataiban (s. Varon: ugyanott), különösen az idegnyúlvány-károsodások vezetnek az idegsejtek hiányos neuronotrófiás faktor-ellátásához, és ismeretes az idegsejtek pusztulása sérülése vagy kóros károsodások következtében, de lehetségesek az öregedési folyamatok során is.
ΙΠ. Elfajulásban és elpusztulásban bizonyos patológiás körülmények között (S. Varon: ugyanott), vagyis különböző kóros esetek kapcsolatban lehetnek károsodást helyzetekkel, és okozói vagy következményei lehetnek olyan trófiás hiányoknak, amelyek vagy egy hatásos trófiás anyag csökkent mennyiségéből, vagy a trófiás szükséglet megnövekedéséből, esetleg mindkettőből adódnak.
A fentiek figyelembe vételével a találmány az SDNF-nek nevezett neuronotrófiás faktor alábbi alkalmazásaira is vonatkozik, nevezetesen az SDNF molekula parenterális alkalmazására (beleértve, de nem kizárólag peridurális, intraciszternális, intraventrikuláris, intratekális, intravénás, intramuszkuláris, szubkután, gingivális, szublingvális, rektális és nazális bevitelt) akár önmagában, akár gangliozidokkal egybekapcsolva (különösen marha agyvelő gangliozidjainak keverékeivel, marha agyvelőből származó egyedi gangliozid fajtákkal, célszeren GMi-gyel, félig szintetikus gangliozid-származékokkal, célszerűen gangliozid belső észterek szrámazékaival) vagy foszfolipidekkel együtt (különösen marha agyvelő foszfolipidjeinek keverékeivel, egyedi marha agyvelő foszfolipidekkel, célszerűen foszfatidil-szerinnel és félig szintetikus foszfolipid származékokkal) az alábbi eredetű neuropatológiás körülmények között:
l. Az idegrendszer heveny, félheveny vagy krónikus károsodása, beleértve a sériiléses károsodást, a kémiai károsodásokat, a vazális károsodásokat vagy hiányokat (pl. hűdés), a fertőzéses/gyulladásos és daganat-keltette károsodásokat is.
Π. Az idegrendszer elöregedése, ideértve az Alzheimer-kórt is.
m. Az idegrendszer krónikus ideg-elfajulásos betegségei.
IV. Idegrendszeri vagy az idegrendszert befolyásoló, krónikus immunológiai betegségek.
Az SDNF molekula felhasználásának kapcsolódását a gangiliozidokkal és a foszfolipidekkel bizonyítékok támasztják alá. Ezek arra mutatnak, hogy mint ismeretes, a marha agyvelő gangliozidjai és foszfolipidjei erősítik a neuronotrófiás faktorok sejteken jelentkező hatását in vitro és nagy valószínűséggel in vivő is.
A 2. táblázat a GMi és a szarvasmarha striatum kivonatának hatását ismerteti a középagyi sejtek tenyészetére.
-8HU 202558Β
2. táblázat
15 | ||
Anyag | 2. táblázat | |
BZT-érzékeny 3H-DAfelvétele 15 perc alatt fmól/tál | DABA-érzékeny 14c-gaba felvétele 15 perc alatt pmól/tál | |
Albumin Albumin | 29,51 ±5,78 | 0,56 ±0,14 |
+gmi Striatum | 69,14 ±3,38 | 1,04 ±0,05 |
kivonat | 104,68 ±7,60 | 2,41 ±0,27 |
Striatum kivonat | ||
+GMi | 140,58 ±17,82 | 4,56 ±0,10 |
Aközépagyi sejteket (tálanként 1,106-t) szérummentes közegben tenyésztettük, amely 15 pg/cm3 albumint vagy 15 pg/crn3 striatum kivonatot tartalmazott, egymagában vagy 10’7 mól/1 GMi jelenlétében. A felvételeket a 16. oldalon leírtak szerint a negyedik napon értékeltük. Az adatok háromanalízis középértékei és standard deviációi.
A szarvasmarha striatum kivonatokat a 14.oldalon leírtak szerint preparáltuk.
Az emlősállat!, előnyösen szarvasmarha agyvelő-szövetből származó SDNF hatóanyagot szokásos vivőanyagok és kívánt esetben gangliozidok és/vagy foszfolipidek kíséretében tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása ismert módszerekkel történhet. Az SDNF hatóanyag kívánt mennyiségét valamely gyógyszerészeti elfogadható vivőanyaghoz adagoljuk és összekeverjük Az alkalmas vivőanyagok és összeállításuk, beleértve más fehérjék alkalmazását is, például a Remington-féle gyógyszertani könyvben (Remington’s Pharmaceutical Scienves, Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA 1985) megtalálhatók Ide tartoznak az injekcióra alkalmas „üledékes készítmények” is. Ezen az alapon a gyógyszerészeti készítmények többnyire, de nem kizárólag SDNF oldatokat vagy az SDNF fagyasztva szárított porát tartalmazzák egy vagy több, gyógyszerészetileg elfogadott hordozó- vagy hígítóanyaggal kombinálva, olyan közegben, amely a megfelelő pH-ra van pufferolva és izoozmotikus a fiziológiai folyadékokkal. A készítmények lehetséges összetételeit, nem kizáró jelleggel, az alábbiakban az 1. példa illusztrálja majd. Ezek oldat formájában készülhetnek az idegrendszeri rendellenességek kezelésére. A fagyasztva szárított készítményekhez hordozó közeget, így - bár nem kizárólag - mannitolt vagy glicint, majd megfelelő térfogatú, alkalmas, pufferolt oldatokat alkalmazhatunk úgy, hogy kívánt pHjú, megfelelően pufferolt, izotóniás oldatokat nyerjünk. Hasonló oldatokat használhatunk az SDNF molekula gyógyászati készítményeihez is, kívánt térfogatban és izotóniásan, így megfelelő koncentrációban foszfát vagy citrát pufferolt sóoldatait de nem kizárólag ezeket -, oly módon, hogy az izotóniás gyógyászati készítmények mindenkor a kívánt pH-η, például semleges pH-η legyenek.
Ugyancsak illusztrálásképpen, a 2. és 3. példa néhány lehetséges gyógyászati készítményt mutat be idegrendszeri rendellenességek kezelésére. Az ezekben a példákban szereplő gyógyászati készítmények úgy vannak kiszerelve, hogy egy dózishoz két ampulla szükséges. Az első ampulla az aktív anyagot olyan töménységben tartalmazza, hogy 0,01 és 50 tömeg% között legyen, olyan gyógyászatilag elfogadott hordozóanyaggal kiegészítve, mint pl. glícin vagy mannitol. A második ampulla kívánt térfogatú, foszfáttal vagy citráttal pufferolt sóoldatból készült oldószert tartalmaz. A két ampulla tartalmát közvetlenül a beadás előtt keverjük össze, amikor is a fagyasztva szárított aktív anyag gyorsan feloldódik, és befecskendezhető oldatot ad. A 3. példa szubkután injekcióra alkalmas gyógyászati készítmények egy esetét is bemutatja (3B. példa).
A gyógyászati készítmények magukban foglalják - de nem kizárólagos joggal - a végbélkúpokat is, lipofü, mégis vízoldható, gliko-zselatint vagy mástípusú önemulgeáló hordozóanyaggal. Ezekben a készítményekben az SDNF jelenlevő mennyisége 0,001 és 1 tömeg% között változhat a teljes hordozóanyag mennyiségre vonatkoztatva. A végbélkúp nem korlátozó érvénnyel - megfelelő mennyiségű acetü-szalicüátot is tartalmazhat. A 4. példa, csupán illusztrációképpen, felsorolt néhány lehetséges végbélkúp készítményt idegrendszeri rendellenességek kezelésére.
Ezen túlmenően az SDNF gyógyászati készítményei, mind fagyasztva szárított formában, mind oldatban, foszfolipideket vagy gangliozidokat is tartalmazhatnak, amint azt f entebb, a hatásos adagolásoknál tárgyaltuk Az adagolás például (bár nem kizárólag) hasonló lehet, mint az embernél általában alkalmazott mennyiség az idegműködés helyreállítására van öregkori panaszok elleni kezelésre, de függ a beadás módjától. Az SDNF gyógyászati készítményeinek adagolása és beadásának időzítése függ a megkívánt hatástól (amelyet klinikai kísérletekben határoznak meg) és a beadás módjától. Például az adagolás és a beadás időzítése hasonló lehet (bár nem szükségképpen az) a többi neuronotrófiás faktor, így az NGF szokásosan használt alkalmazásához.
1. példa
Injekciós oldatként alkalmazható, gyógyászati készítmények
1. Készítmény: Egy-egy 2 cm3-es ampulla tartalma:
Aktív anyag 5 μ (500 TU)
Nátrium-klorid 16 mg
Citrát puffer, pH-7 2 cm3 pirogénmentes desztillált vízben
2. Készítmény: Egy-egy 2 cm -es ampulla tartalma:
Aktív anyag 100 pg (10 000 TU)
Nátrium-klorid 16 mg
Citrát puffer, pH - 7 2 cm3 pirogénmentes desztillált vízben
TU - trófiás egység (definícióját 1. az 1. táblázat alatt).
2. példa
Gyógyászati készítmény rendszerek
-9HU 202558Β
2A. példa
a) Egy-egy 2 cm3-es ampulla tartalma:
Fagyasztva szárított aktív anyag 5 μg (500 TU)
Glicin 30 mg 3 5
b) Egy-egy 2 cm -es oldószeres ampulla tartalma:
Nátrium-klorid 16 mg
Citrát puffer pirogénmentes desztillált vízben 2 cm3 10
2B.példaa) Egy-egy 2 cm -es ampulla tartalma:
Fagyasztva szárított aktív anyag 5 μg (500 TU)
Mannitol 40 mg
b) Egy-egy 2 cm3-es oldószeres ampulla tartalma: Nátrium-klorid 16 mg 15
Citrát puffer pirogénmentes desztillált vízben 2 cm3
4D. készítmény
Aktív anyag 100 μg (10 000 TU)
Glicerin 1,5 g
Víz 0,75 g
Zselatin 0,25 g
TU - trófiás egység definícióját lásd az 1. táblázat alatt)
2C. példa
a) Egy-egy 3 cm3-es ampulla tartalma:
Fagyasztva szárított aktív anyag 100 μg (10 000 TU)
Glicin 45 mg
b) Egy-egy 3 cm3-es oldószeres ampulla tartalma:
Nátrium-klorid 24 mg
Citrát puffer pirogénmentes desztillált vízben 3 cm3
TU - trófiás egység (definícióját lásd az 1. táblázat alatt)
5. példa
Gyógyászati készítmény rendszerek
3A. példaa) Egy-egy 3 cm3-es ampulla tartalma: Fagyasztva szárított aktív anyag 100 μg (10000 TU)
Mannitol 60 mg
b) Egy-egy 3 cm3-es oldószeres ampulla tartalma: Nátrium-klorid 24 mg
Citrát puffer pirogénmentes desztillált vízben 3 cm3
3B. példa (szubkután injekció)
a) Egy-egy 2 cm3-es ampulla tartalma:
Fagyasztva szárított aktív anyag 10 μΐ (1000 TU) Glicin 30 mg
b) Egy-egy 2 cm3-es oldószeres ampulla tartalma:
Nátrium-klorid 16 mg
Citrát puffer pirogénmentes desztillált vízben 2 cm3
TU - trófiás egység (definícióját lásd az 1. táblázat
Claims (9)
1) emlős-, előnyösen szarvasmarha-agyvelő szövetet homogenizálunk vizes közegben,
1. Eljárás 14000-17000 dalton móltömegű 0,510,5 pH izoelektromos pontú, legalább 0,01 mg/trófiás egység fajlagos aktivitású neuronotrófiás faktor előállítására, azzal jellemezve, hogy
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kationcserélő kromatográfiás tisztítási műveletet ammónium-acetát puffer gradiensével végezzük.
2) a kapott homogenízátumot 4-5 pH-értéken leválasztjuk,
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként szarvasmarha agyvelő szövetet alkalmazunk.
3) a kapott szupematáns folyadékot egy 5 és 10 kilodalton molekulatömeg közötti visszatartású dializáló membránnal dializáljuk,
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kiindulási anyagként szarvasmarha agyvelő nuvleus caudatusait alkalmazzuk.
4) dializált szupematáns folyadékot egy az állófázison 5 és 150 kilodalton közötti frakcionálási tartományú molekulaszűrőn 10-30 mmól/1 koncentráción hígított állapotban 6-7,4 pH-értékű pufferoldattal kroamtográfiásan frakcionáljuk, a fenti l)-4) műveleti lépéseket 0 ’C és 6 ’C közötti hőmérsékleten lefolytatva, és kívánt esetben a kapott neuronotrófiásan aktív frakciókat kationcserélő kromatográfiával tisztítjuk és/vagy egyesítjük és fagyasztva szárítjuk,
5. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gradiens-elűciót 0,1 mól/1 és 1 mól/1 közötti koncentráció-tartományban, 6 és 7 közötti pH értéken végezzük.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a neuronotrófiásan aktív frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk.
7. Eljárás idegkórtani esetek, különösen sériiléses károsodások, kémai károsodások, ér-elégtelenség, fertőzés okozta károsodások, idegrendszeri gyulladás vagy daganat okozta károsodások, továbbá az idegrendszer elöregedése, krónikus ideg-elfajulásos betegségek vagy az idegrendszert befolyásoló krónikus immunbetegségek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított neuronotrófiás faktort gyógyászatilag elfogadott hordozóanyaggal vagy hígítószerrel és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyaggal és kívánt esetben más, nem szinergetikus gyógyhatású anyaggal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezlQ
-10HU 202558Β ve, hogy a neuronotrófiás faktort a hordozóanyag és segédanyag együttes tömegére számítva 0,001-1 tömeg% mennyiségben alkalmazzuk,
9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyászati készítményhez még 5 legalább egyfajta, a neuronotrófiás faktor hatását nem szinergetikusan, a sejtek hatóanyag iránti érzékenységének növelése útján fokozó gangliozidot vagy legalább egyfajta foszfolipoidet is keverünk.
-11HU 202 558 B
Int. Cl5: C 07 K15/06, A 61K 37/02
A> szarvasmarha caudafus diatizalt {ctú tőszójának ctóciös
-12A Scphadcx G-150 oszlopról kapo-H, akliv eluáfum nagynyomású folyadckkromofografiás profilja.
, HU202 558 B Int. a5: C 07 K15/06, A61K37/02
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT48370/86A IT1196572B (it) | 1986-08-07 | 1986-08-07 | Purificazione,caratterizzazione e applicazioni di un nuovo fattore neurotrofico derivato da cervello di mammifero (sdnf) |
IT8648782A IT1214764B (it) | 1986-12-23 | 1986-12-23 | Purificazione,caratterizzazione e applicazione di un fattore neuronotrofico derivato da cervello di mammifero (sdnf) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT45083A HUT45083A (en) | 1988-05-30 |
HU202558B true HU202558B (en) | 1991-03-28 |
Family
ID=26329307
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU873594A HU202558B (en) | 1986-08-07 | 1987-08-07 | Process for isolating neuronotrophic factor and for producing pharmaceutical composition containing them |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0258111A3 (hu) |
KR (1) | KR880002533A (hu) |
CN (1) | CN87105478A (hu) |
AR (1) | AR243203A1 (hu) |
DK (1) | DK410887A (hu) |
FI (1) | FI873415A (hu) |
HU (1) | HU202558B (hu) |
IL (1) | IL83398A0 (hu) |
NO (1) | NO873285L (hu) |
NZ (1) | NZ221313A (hu) |
PH (1) | PH23838A (hu) |
PL (1) | PL151701B1 (hu) |
PT (1) | PT85498B (hu) |
YU (1) | YU149087A (hu) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1219839B (it) * | 1988-02-08 | 1990-05-24 | Fidia Farmaceutici | Purificazione,caratterizazione e applicazione di un fattore neuronotrofico derivato da cervello di nammifero |
US5218094A (en) * | 1986-08-07 | 1993-06-08 | Fidia, S.P.A. | Neuronotrophic factor derived from mammalian brain tissue |
IT1219874B (it) * | 1988-03-18 | 1990-05-24 | Fidia Farmaceutici | Utilizzazione del fattore di crescita nervoso umano e sue composizioni farmaceutiche |
US5073543A (en) * | 1988-07-21 | 1991-12-17 | G. D. Searle & Co. | Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle |
CN1055094C (zh) * | 1997-07-04 | 2000-08-02 | 安玉会 | 牛脑神经肽ff的制备方法 |
ES2322882B1 (es) * | 2006-10-25 | 2010-04-22 | Lipotec Sa | Peptidos inhibidores de la exocitosis neuronal. |
RU2727154C1 (ru) * | 2019-09-17 | 2020-07-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Композиция полипептидов, обладающая свойством нормализовать функции головного мозга |
RU2727167C1 (ru) * | 2019-09-17 | 2020-07-21 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Герофарм" | Композиция полипептидов, обладающая свойством нормализовать функции головного мозга |
CN113214379A (zh) * | 2021-04-07 | 2021-08-06 | 云南龙凤谷生物药业有限公司 | 一种眼镜蛇毒神经生长因子的制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL67313A0 (en) * | 1981-12-22 | 1983-03-31 | Baylor College Medicine | Pharmaceutical compositions comprising neurotropic factors for treating amyotrophic lateral sclerosis,parkinson disease and alzheimer disease and methods for diagnosing these diseases |
-
1987
- 1987-07-31 IL IL83398A patent/IL83398A0/xx unknown
- 1987-07-31 EP EP87401795A patent/EP0258111A3/en not_active Withdrawn
- 1987-08-03 NZ NZ221313A patent/NZ221313A/en unknown
- 1987-08-04 PH PH35621A patent/PH23838A/en unknown
- 1987-08-06 DK DK410887A patent/DK410887A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-08-06 FI FI873415A patent/FI873415A/fi not_active Application Discontinuation
- 1987-08-06 PT PT85498A patent/PT85498B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-08-06 NO NO873285A patent/NO873285L/no unknown
- 1987-08-07 KR KR1019870008687A patent/KR880002533A/ko not_active Application Discontinuation
- 1987-08-07 HU HU873594A patent/HU202558B/hu not_active IP Right Cessation
- 1987-08-07 YU YU01490/87A patent/YU149087A/xx unknown
- 1987-08-07 AR AR87308375A patent/AR243203A1/es active
- 1987-08-07 CN CN198787105478A patent/CN87105478A/zh active Pending
- 1987-08-07 PL PL1987267240A patent/PL151701B1/pl unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO873285D0 (no) | 1987-08-06 |
CN87105478A (zh) | 1988-02-17 |
EP0258111A2 (en) | 1988-03-02 |
AU602925B2 (en) | 1990-11-01 |
PT85498A (en) | 1987-09-01 |
DK410887A (da) | 1988-02-08 |
FI873415A0 (fi) | 1987-08-06 |
NZ221313A (en) | 1990-04-26 |
DK410887D0 (da) | 1987-08-06 |
PL267240A1 (en) | 1988-07-21 |
AR243203A1 (es) | 1993-07-30 |
IL83398A0 (en) | 1987-12-31 |
PL151701B1 (en) | 1990-09-28 |
PT85498B (pt) | 1990-06-29 |
HUT45083A (en) | 1988-05-30 |
YU149087A (en) | 1988-10-31 |
PH23838A (en) | 1989-11-23 |
AU7661687A (en) | 1988-02-11 |
KR880002533A (ko) | 1988-05-09 |
FI873415A (fi) | 1988-02-08 |
EP0258111A3 (en) | 1989-01-25 |
NO873285L (no) | 1988-02-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Trelstad et al. | Isolation of two distinct collagens from chick cartilage | |
Lin et al. | Netrin-1 and slit-2 regulate and direct neurite growth of ventral midbrain dopaminergic neurons | |
JP4222629B2 (ja) | ニュールツリンおよび関連成長因子 | |
CA2071912C (en) | Use of a bone morphogenetic protein in synergistic combination with tgf-beta for bone repair | |
CA2250075C (en) | Methods for diagnosing and treating alzheimer's disease | |
Molitoris et al. | Cellular ATP depletion induces disruption of the spectrin cytoskeletal network | |
US6262024B1 (en) | Neuron regulatory factor for promoting neuron survival | |
JP2010150272A (ja) | 環状プロサポシン由来のペプチドおよびその使用 | |
JP3285862B2 (ja) | 活性依存性神経栄養因子 | |
JPH10509717A (ja) | 細胞連絡のモジュレーターとしてのニューレグリンの使用 | |
CA2116560C (en) | Morphogenic protein screening method | |
HU202558B (en) | Process for isolating neuronotrophic factor and for producing pharmaceutical composition containing them | |
US5218094A (en) | Neuronotrophic factor derived from mammalian brain tissue | |
Virsolvy-Vergine et al. | Endosulfine, endogenous ligand for the sulphonylurea receptor: isolation from porcine brain and partial structural determination of the α form | |
DE69732350T2 (de) | Persephin und verwandte wachstumsfaktoren | |
US8716216B2 (en) | Human immunosuppressive protein | |
JP2004528835A (ja) | ドーパミン作動性ニューロン生存促進因子およびその用途 | |
ES2259458T3 (es) | Persefina humana. | |
Burgess et al. | Intestinal crypt stem cells possess high levels of cytoskeletal-associated phosphotyrosine-containing proteins and tyrosine kinase activity relative to differentiated enterocytes. | |
US20040077545A1 (en) | Synthetic peptide for neurological disorders | |
EP0327769A2 (en) | Novel neuronotrophic factor | |
WO1992011026A1 (en) | Neuronal cholinergic differentiation factor | |
DE69821025T2 (de) | Wachstumsfördernde peptide für nierenepithelzellen | |
JPS63126899A (ja) | 新規なニュ−ロン栄養因子 | |
JP2004182616A (ja) | 新規な神経伝達機能異常疾患改善剤 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |