JPS63126899A - 新規なニュ−ロン栄養因子 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、哺乳動物の脳、特にウシの尾状核から得られ
る新規な巨大分子のニューロン栄養因子（ｎｅｕｒｏｎ
ｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ：　Ｓ　Ｄ　Ｎ　Ｆ　
）、およびこれを製造するための方法に関する。化学的
な見地から眺めると、この精製したニューロン栄養因子
は等電点が約１０の塩基性タンパク質であり、その分子
量は、ＳＤＳゲル電気泳動で測定するとリソチームのそ
れと類似しており、約１４，４００ダルトンである。生
物学的な見地から眺めると、この分子はインビトロで培
養物中の神経系ニューロン、特に中枢神経系ニューロン
の生存を増強することができる。ニューロン栄養因子の
上記供給源、ならびに化学的および生物学的な性質は、
既に報告され、同定されている他の巨大分子ニューロン
栄養因子のものと区別することができる。さらに、この
５ＤＮＰ分子の薬学的な応用についても検討を加え、こ
れらの薬学的応用も本発明の一部を形している。

先行技術 ａ、ニューロン栄養因子の定義および役割哺乳動物細胞
のインビボおよびインビトロでの生存および成長が、一
連の特異的な細胞外ホルモン様シグナル（成長因子とし
て知られており、その大部分はタンパク質あるいはペプ
チドである）によって調節されていることが確かめられ
ている。

生物学的には、成長因子のそれぞれがある特定の群の応
答標的細胞に作用する。

発生中および成体の両者において哺乳動物のニューロン
細胞成長および生存に関係している、巨大分子であるタ
ンパク質成長因子の研究は、現在、神経生物学研究の分
野でかなり重要なものとなっている。神経系の発生中に
、体液および細胞の微環境から直接由来する外因性のニ
ューロン栄養因子が、ニューロン細胞の生存および死を
調節することが示唆されていた［コワン等（Ｃｏｗａｎ
　ＬＭ、　ｅｔａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２２５：１２
５ｇ、１９８４）］。事実、標的由来のニューロン栄養
因子に対する成長発達中の軸索間の競合が、胚形成中に
どのニューロンが生きるかあるいは死ぬかを決定してい
ることが示唆されていた。これと同一ではないが、成体
でも同様にニューロン栄養因子が、ニューロン細胞の生
存を維持するのに、および機能的な大脳内連結を正しい
ものとするのに必須であると言われていた［バロン（Ｖ
ａｒｏｎ　Ｓ、、Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｖ。

１．１１．Ｎｏ、３．１９８５）］。従って、ニューロ
ン細胞の進行的な弱化および死（外傷、発作あるいは神
経退行疾患などの病的進行、および老化の後に起こる）
は、インビボでのニューロン栄養因子の減少あるいは阻
害を巻き込んでいることもある［バロン（上記）；アペ
ル（Ａｐｐｅｌ　Ｓ、Ｈ，、Ａｎｎ、Ｎｅｕ’ｒｏ１．
．１０：４９９，１９８１）；バロン等（Ｖａｒｏｎ　
Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｄｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、。

６：７３．１９８４）］。また、これらの研究者等は、
成体哺乳動物のニューロン栄養因子が、末梢神経系にお
ける損傷だけでなく中枢神経系における損傷の回復およ
び再生過程の本質であることをも示唆していた。事実、
動物の中枢神経系における移植および損傷実験での最新
の神経生物学的方法の応用により、適正な栄養シグナル
が利用可能であるなら、成体哺乳動物の中枢神経系にお
いてニューロンの回復が可能であるという考えか強まっ
ていた［ゲージ等（Ｇａｇｅ　Ｆ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、
Ｎａｔｕｒｅ、３０８：６３７，１９８４）］： 最近まで、その特徴がよく調べられている唯一の巨大分
子タンパク質ニューロン栄養因子は神経成長因子（Ｎ　
Ｇ　Ｆ　）だけであった［レビーモンタルチ一二等（Ｌ
ｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ、Ｒｅｖ、、４８：５３４，１９６ｇ）；
レビーモンタルチー＝（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎ
ｉ　Ｒ，、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、、５：
３４１，１９ｇ２）］。

イイントロおよびインビボで、限られた数の哺乳動物ニ
ューロン型においてのみＮＧＦが生存を刺激することが
できるという知見は、ＮＧＦが巨大分子ニューロン栄養
因子群（そのそれぞれがある一定のニューロン型の生存
を調節することができる）の１つであるにすぎないとい
う考えに導くものであった。現在のところ、これ以外に
２種類の巨大分子ニューロン栄養因子だけが精製され、
その特徴が調べられているにすぎない；すなわち、毛様
体ニューロン栄養因子（ＣＮＴＦ）［バロン（Ｖａｒｏ
ｎ　Ｓ、、Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、１１．Ｎｏ。

３．１９８５）；バロン等（Ｖａｒｏｎ　Ｓ、　ｅｔ　
ａｌ、、Ｄｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、、６：７３，１９
＋１１４）］および脳由来のニューロン栄養因子（ＢＤ
ＮＦ）［バロン（Ｖａｒｏｎ　Ｓ、、Ｄｉｓｃｕｓ＋５
ｉｏｎｓ　１ｎＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、　
Ｉｔ、Ｎｏ、３．１９８５）；バード等（Ｂａｒｄｅ　
Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｍｂｏ　Ｊ、、１：５４９．１
ｇ８２）］。これら因子について報告されている供給源
、化学的性質および生物学的活性を以下に概説する。

ｂ、ニューロン栄養因子の生物検定 インビトロでのニューロン培養システムが、組織抽出物
中のニューロン栄養活性を研究するための、ならびにニ
ューロン栄養因子の分画（フラクション化）および精製
に適する複雑な方法をモニターするための、基本的かつ
必須の手段であることがわかった。インビトロにおいて
、十分に「制限的な」培養条件下に維持された、単層の
有糸分裂後の解離ニューロン培養物は、外部から培養シ
ステムに加えた栄養的な助けを必要とし、これに応答す
ることがわかった。従って、インビトロでのニューロン
細胞の生存を促進することができる能力をモニターする
ことによって、手積製あるいは精製した粗調製物中のニ
ューロン栄養活性を効果的に評価することができる。さ
らに、特異的な二ニーロンマーカー（たとえば、特異的
な取り込みマーカーあるいは神経繊維含量の分析）を、
形態学的な基準を裏付けたり、確認したりするのに使用
する。

Ｃ１同定したニューロン栄養因子の性質既に述べたよう
に、現在までに同定されている巨大分子ニューロン栄養
因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体ニューロン栄
養因子（ＣＮＴＦ）および由来来のニューロン栄養因子
（ＢＤＮＦ）である。これらの因子のそれぞれについて
報告されている生物学的な供給源、化学的な性質および
生物学的な活性を以下に概説する。

１）神経成長因子（ＮＧＦ’） 匹椎ｌ：ＮａＦはマウスの肉腫で初めて発見され［レビ
ーモンタルチ一二等（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ
　Ｒ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｚｏｏｌ、、１１６：３２
１，１９５１）コ、次いで雄性マウスの下顎上唾液腺か
ら［バロン等（ｖａｒｏｎ　Ｓ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６：２２０
２，１９６７）コ、およびヘビ毒から［アンゲレッチ（
Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ　Ｒ，Ｈ，、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、６５：６６８，１
９７０）］均質になるまで精製された。また、その他の
比較的ＮＧＦに富む供給源が多数報告されており、これ
らにはモルモット前立腺［ハーバ−等（Ｈａｒｐｅｒ　
Ｇ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｎａｔｕｒｅ、２７９：１６０．１９７９）］およびヒ
ト胎盤［ゴールドシュタイン等（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　
Ｌ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ。

Ｒｅｓ、、３：１７５，１９７８）］が含まれる。さら
に、少量のＮ　Ｇ　Ｆが、哺乳動物の中枢神経系を含む
他の組織中に存在することが報告されている［バロン（
Ｖａｒ。

ｎ　Ｓ、、Ｄｊｓｃｕｓｓｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏ
ｓｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、Ｉｌ、Ｎｏ、３゜１９８５）
；ヘフチ等（Ｉｌｅｆｔｉ　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｅ
ｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ。

１４：５５，１９８５）］。これら可能性あるＮＧＦの
供給源と外見上の作用部位の間の生理学的な関係はさほ
ど明確ではないが、通常、ＮＧＦに応答する細胞による
神経支配を必要としている種々の末梢組織からＮ　Ｇ　
Ｆが分泌されるものと推定される。また、雄性マウスの
下顎下線から得られるＮＧＦの配列決定およびクローン
化も行なわれていた［スコツト等（Ｓｃｏｔｔ　Ｊ、　
ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３０２：５３ｇ、１９８
３）；ウルリッチ等（Ｕｌｒｉｃｈ　Ａ、ｅｔ　ａｌ、
、Ｎａｔｕｒｅ、３０３：８２１，１９８３）］。さら
に、ヒトβ−ＮＧＦ’遺伝子ら成功裏に単離され、クロ
ーン化されていた［ウルリッチ等（Ｕｌｒｉｃｈ　Ａ、
　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３０３：８２１，１９
８３；欧州特許Ｎｏ、０１２１３８８）］。

化学的性質；マウスの下顎下線から得られるＮＧＦはそ
の特徴付けが最も良く為されている種類のものである。

マウス腺からのＮＧＰは、Ｚｎ＋を含む３種の異なるサ
ブユニット（α、β、γ）の７８タンパク質複合体（分
子量約１４０．０００ダルトン）として作用する。ＮＧ
Ｆの活性は、もっばら、分子量約２５，３００ダルトン
の塩基性二量化タンパク質（ゲルＳＤＳによる電気泳動
では約１２．６５０ダルトンの分子量を示す）であり、
その等電点が約９．３である、サブユニットβ（２゜５
Ｓ　　ＮＧＦとして知られている）に関係している。

雄性マウス下顎下線からのβ−ＮＧＦの配列、およびヒ
トでの出所あるいは供給源は報告されている［スコツト
等（Ｓｃｏｔｔ　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、
３０２：５３８゜１９８３）；ウルリッチ等（Ｕｌｒｉ
ｃｈ　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３０３：８
２１，１９８３）］。

生物学的活性：マウスの下顎下線からのＮＧＦが、イン
ビトロおよびインビボでのほとんどのＮＧＦ活性の研究
に用いられていた。

ＮＧＦのインビトロでの生物学的活性の範囲は、培養物
中のクローナル細胞および一次ニューロン細胞の両者で
測定されていた。インビトロでＮＧＦに応答すると報告
された一次ニューロン細胞には、後根神経節の胎児感覚
ニューロン（経日数８〜１２日）、交感神経節の自律性
ノルアドレナリン作動性胎児ニューロン、中隔のコリン
作動性胎児ニューロンおよび発生中の副腎クロム親和性
細胞が含まれる。感覚および交感神経ニューロンはその
生存および発生についてＮＧＦに依存するが、コリン作
動性ニューロンはその生存にＮＧＦを必要とするように
は見えず、その分化、すなわち神経伝達物質に拘束され
る特徴的な表現型特性の発現に対してだけ必要とする。

発生の初期段階において副腎クロム親和性細胞（神経環
から得られる細胞）にＮＧＦを加えると、ニューロン表
現型の発現が引き起こされる。インビトロでＮＧＦに応
答すると報告されたクローナル細胞には、ヒト神経芽腫
細胞およびクロム親和性細胞腫細胞（ＰＣｌ３）として
知られている神経環腫瘍から得られるクロム親和性副腎
細胞が含まれる。ＮＧＰで処理した後、これらの細胞は
、高増殖性形態の活動から有糸分裂後のニューロン状態
に切替わる。インビボでＮＧＦに応答すると報告されて
いるニューロンには、発生中のおよび損傷後の成体の両
者における、中枢神経系のコリン作動性ニューロン、交
感神経ニューロン、および後根神経節の感覚ニューロン
が含まれる。損傷後の成体の場合、ＮＧＩ”の大脳内投
与によりニューロン細胞の生存および特徴的な表現型特
性の発現が促進された。これらの効果は、損傷誘起性の
活動変化における改善と関係している。

２）毛様体ニューロン栄養因子（ＣＮＴＦ）供給源：　
ＣＮＴＰは、色素上皮と共に虹彩の毛様体および脈絡膜
を含むひよこの目の肝組織（Ｅ８）から初めて検出され
、精製された。次いで、ラットの中枢神経系からの傷体
液および成体ラットの座骨神経を含む、様々な別の組織
抽出物においてＣＮＴＦ活性が同定された。

化学的性質：ニワトリ胎児の眼内組織から精製したＣＮ
ＴＦ（タンパク質については２Ｘ１０−’、栄養活性に
ついては９％）は、ＳＤＳゲルによる電気泳動で２０，
４００ダルトンの分子量を示し、約５の等電点を有して
いる。この分子量、そして同様にその陰性の正味電荷は
、明らかにマウスの下顎下タンパク質β−ＮＧ’ＰとＣ
ＮＴＦが別異のものであることを示している。ひよこの
目から精製されたＣＮＴＰの配列は報告されておらず、
また哺乳動物由来のＣＮＴＦの製造スケールでの精製も
報告されていない。

生物学的活性：生物学的な研究は、主として、ひよこの
目から得られる抽出物、ＣＮＴＦの半端製あるいは精製
調製物を用いて、そしてインビトロだけで行なわれてい
た。インビトロで応答するニューロンには、ニワトリ胎
児からの毛様体神経節（Ｅ６）、ニワトリ胎児後板神経
節からのニューロン（Ｅ、。）、マウス後板神経節から
の新生児期ニューロン、ならびにひよこＥ、神経節およ
びラット新生児神経節からの交感神経ニューロンが含ま
れる。これらの活性がマウス下顎下β−ＮＣＦに対する
抗体によって遮断または阻害されることがないことが報
告されていた。インビボでのＣＮＴＦの効果については
全く報告されていない。

３）由来来のニューロン栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｊｌ−
１にＣ６ラツトクローナル細胞セルライン由来の条件培
地において、および様々な種の脳油出物においてＢＤＮ
Ｆ活性が研究されていた。この因子はブタ成体の脳から
精製されていた。

化学的性質：ブタ成体の脳から精製されたＢＤＮＦ（タ
ンパク質については３．８Ｘ１０−’、栄養活性につい
ては５％以下）は、ＳＤＳゲル電気泳動で分子量が約１
２，３００ダルトンである塩基性の高い（ｐｉ＞１０．
１．）ポリペプチドである。その配列は全く報告されて
いない。ＢＤＮＦ”分子およびその抽出方法は西独特許
ＤＥ　３２１３９６３　Ａ　１に記載されている。

生物学的活性：生物学的活性についての研究（よ、ブタ
脳から得られる粗製の抽出物、半端製および精製ＢＤＮ
Ｆ調製物を用いて、もっばらインビトロで行なわれてい
た。プラコード由来の感覚ニューロンおよび神経堤由来
の感覚ニューロンの両者の生存を促進し、そしてインビ
トロでの網膜移植片の細胞生存および神経成長を促進す
ることが示されていた［ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ　Ｊ、
Ｅ、、Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、、１８
：２５１，１９８５）；ターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ　Ｊ、
Ｅ、、Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、、１８
：２６５，１９８５月。その化学的性質はβ−ＮＧＦの
ものと極めて類似しているが、免疫学的な交差反応は全
く検出されなかった。さらに、ＢＤＮＦは交感神経ニュ
ーロンには作用しない。インビボでのＢＤＮＦの効果は
全く報告されていない。

介Ｂ日の日的松上ｒ嵯ｉ、賽「、す 本発明は、神経系、特に中枢神経系のニューロンに対し
て活性な、分子量１４，４００ダルトンの新規ニューロ
ン栄養因子（ＳＤＮＦ）、およびその製造方法に関する
。

ａ、供給源および精製法 本発明の新規ニューロン栄養因子は、以下の方法（この
方法も本発明の一部を構成している）に従って得ること
ができる。用いられる方法は、哺乳動物（好ましくは、
ウシ）の脳、好ましくは尾状核を中性の条件下でホモジ
ナイズし、次いでｐＨ４〜５で酸沈澱させ、濃度範囲１
０〜３０ｍＭの希釈緩衝溶離液を用いるモレキュラーシ
ーブクロマトグラフィーによってフラクション化し：こ
の活性フラクションを０．１−ＩＭの酢酸アンモニウム
勾配緩衝液を用いるカチオン交換クロマトグラフィーで
さらに精製し、活性フラクションを集め、凍結乾燥する
ことを特徴とするものである。

新鮮な、および凍結させた（たとえば、−７０℃）ｌｌ
ｉ乳動物の脳のいずれも用いることができる。

以下に説明する精製工程をすべて０〜６℃の温度で行う
のが最良である。

各バッチの製造に対して、全編あるいは部分層を、ｐＨ
６〜７．４に希釈した２〜４倍容量の緩衝溶液中でホモ
ジナイズし、次いで好ましくは塩酸でｐＨ４〜５（好ま
しくは、４．５）に酸性化し、数時間撹拌する。沈澱物
質を遠心して分離しくたとえば、４０．００Ｏｒｐｍで
４０分間）、上清を中和し、希釈緩衝溶液に対して透析
し、凍結乾燥する。

この透析膜は５〜ｌＯキロダルトンの分子を締め出す。

分子フィルターによる分画（フラクション化）は、ｓ、
ｏ　ｏ　ｏ〜１５０，０００ダルトンの分画範囲の固定
相を用いて行う。濃度１０〜３０ｍＭおよびｐＨ６〜７
．４に希釈した緩衝溶液で試料を溶離する。生物学的に
活性なフラクションを集め、凍結乾燥し、カチオン交換
クロマトグラフィーカラムにかけ、０．１〜１Ｍおよび
ｐ［１６〜７の酢酸アンモニウム勾配緩衝液で溶離する
。ニューロン栄養活性体はほぼＩＭで溶出し、この活性
フラクションをもう一度集め、凍結乾燥する。

生物学的に活性な物質が既に十分に純粋である場合、ま
たはその他の比較的精製度の低いフラクションを用いよ
うとしている場合には、上記の方法はいずれの精製工程
においても中断することかできる。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが
、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例 新鮮なウシの脳を畜殺場から入手し、水上で尾状核を切
り出した。各バッチの製造に対して、約１５０９の足状
組織（２５〜３０ｆｌｉｌの脳）を、フェニルメチルス
ルホニルフロリド（ＰＭＳＦＸｏ。

３Ｒ９／村）およびＥＧＴＡ［エチレングリコール−ビ
ス−（β−アミノエチル）エーテル−Ｎ、Ｎ、Ｎ’。

Ｎｏ−四酢酸コ（１ｍＭ）を含有する１：１０（ｐＨ７
゜４）に希釈した３倍容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ
）中でホモジナイズし［ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ
）、セツティング６．６０秒］、塩酸でｌ）８４　、５
に酸性化し、水中で２時間保ち、次いで遠心した（４０
．００Ｏｒｐｍで４０分間）。上清を集め、中和しくｐ
Ｈ７，４）、希釈ＰＢＳ　　ｌ　：１０（ｐＨ７，４）
中で一晩透析しく８ｋＤａで締め出す）、凍結乾燥し、
分割して一２０℃に保った。使用直前に、その一部を蒸
留水を用いて最初の容量の１／１０に再懸濁し、パター
ソンの方法［Ｐｅｔｅｒｓｏｎ　Ｇ、Ｌ、、　Ａｎａｌ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、８３：３４６．１９７７］に
従ってタンパク質含量を測定する。次いで、この試料を
培養培地中に希釈し、ウシ血清アルブミン（１１９／　
３！１２）で予め飽和した０゜４５ミクロンのミレック
ス（Ｍｉｌｌｅｘ）フィルターで濾過し、この濾過した
上清フラクションの適当量を血清不含の中脳細胞培養物
に加えてニューロン栄養活性を検定した。セファデック
ス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−１５０（微細）カラム（８
ｃ＊Ｘ　１２０ｃｇ）を用い、上清成分をその分子量に
応じて分離した。凍結乾燥上清を蒸留水に再懸濁し、カ
ラムにかけた（溶出緩衝液６ｘＱ中にタンパク質的７５
０１９）。溶離緩衝液は以下の組成を有していた（ｍＭ
、　ｐＨ７、３０）：ＮａＣＱ、１３．６８；ＫＣ（！
、０．２７；ＮａｚｌｌＰＯ４・７Ｈ，０，０，８；Ｋ
ｌｌ！ＰＯ，，１，５゜ｔｌＩｒＩｌ＋ｄ！’ノブ／ｉ
−ｍイＱｎｓ／Ｊ／［１，’ｉ１７ｉ１）ＭＦｉ４ｉｊ
−７＋−’ｙムを溶離した。ＵＶモニターを用い、２８
０ｎｍで溶出液の光学密度を継続的にモニターした。１
５酎のフラクションを自動的に集め、凍結乾燥した後に
ニューロン栄養活性を試験した。ゲル濾過クロマトグラ
フィーおよびフラクションの収集は４℃の冷却室で行っ
た。

セファデックスＧ−１５０カラムから溶出した生物学的
に活性なフラクションを集め、凍結乾燥した。この凍結
乾燥物の一部を０．１ＭのＣＨ３ＣＯ０（ＮＨ）、（ｐ
Ｈ６，４５）１１０ｕ（ｌに再懸濁した。タンパク質は
このｌＯμｇで測定した。残りの１００μＱ（タンパク
質１　、９　ｍｇ）は、ＴＳＫ−ＣＭ−３ＳＷカラム（
ＨＰＬＣ用のイオン交換カラム）にかけた。（ＮＨ４）
ＣＯＯＣＨ３の勾配液（０，１−ＩＭ：ｐＨ６，４５）
を用い、０．５１／分の流速でフラクションを溶出させ
た。緩衝液Ａ：０．ＩＭの（Ｎ　Ｈ４）Ｃ００ＣＨｓ（
ＰＨ６、４５）；緩衝液Ｂ：ＩＭの（ＮＨ，）ＣＯＯＣ
Ｒ，（ｐＨ６，４５）。勾配のプロファイル：０〜２０
分、１００％Ａ１０％Ｂ（イソクラティック）：２０〜
４０分、０％Ａ／１００％Ｂ（直線）：４０〜７０分、
０％Ａ／’１００％Ｂ（イソクラティック）；７０〜７
５分、１００％Ａ１０％Ｂ（直線）。このフラクション
を凍結乾燥し、リン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５，７）
０．６ｍ（ｌに再懸濁した。

この１００μｑでタンパク質を測定し、残りは生物検定
および５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析に用いた。

第１表は、本精製法の主な工程をまとめ、精製工程を経
て得られるニューロン栄養活性体の収率（％）およびタ
ンパク質の精製度の例を挙げるものである。このタンパ
ク質および栄養活性体の収率は、本方法とＣＮＴＦおよ
びＢＤＮＦの精製に用いられる他の方法とを区別するも
のである。

ｂ、化学的特徴付は ホモジネートの全量を酸性にて沈澱させ、中和し、透析
して得られた未精製の上清分画の生物学的活性はトリプ
シン感受性であり、このことはこの活性分子がタンパク
又はペプチド的性質を有することを示唆している。

前記の未精製上清の抽出液中に存在する生物学的に活性
な分子は、分子量１０，０００から３０゜０００ダルト
ンに対応する分画としてセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ　−１５０カラムから溶出される（第１図）
。

第１図は、ホモジネートの全量を酸性にて沈澱させ、中
和し、透析して得られたウシ尾状核の上清をセファデッ
クスＧ−，１５０にかけた、生物学的に活性な分画を同
定するための典型的溶出グラフ（プロフィル）を図示し
たものである。調製物の状態は既述した。全ての分画を
、タンパク質の６度０．ＯｌからｌＯμｇ／ｍ（ｌの範
囲を用いて生物学的活性に関し、検定した。第１図に於
いて横棒（水平線）で示されている分画に活性が認めら
れた。

セファデックスＧ−１５０カラムから得られた活性分画
中に存在する生物学的に活性な分子は、ＴＳＫ−ＣＭ−
３ＳＷカラムから、濃度的ＩＭの酢酸アンモニウム緩衝
液によって溶出される（第２図）。

第２図は、セファデックスＧ−１５０カラムから得られ
た活性な溶出液をＴＳＫ−ＣＭ−３ＳＷカラムにかけて
得られた典型的なＨＰＬＣ溶出グラフ（プロフィル）を
示すものである。それらの精製条件を記載する。全分画
を、タンパク質の濃度０．００１から０．３μｇ／３１
１２の範囲を用いて生物学的活性について調査する。活
性は、約ＩＭの酢酸アンモニウムで溶出された分画に認
められた（横棒で示す）。

この溶出時間は、チトクロームＣの溶出時間と似ており
、このことは活性分子の等電点がチトクロームＣの等電
点、即ち約１０−１０．５と類似していること示してい
る。この特性により、本活性分子は、ｐｉが約５である
ＣＮＴＦと区別される。

第３図に、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｕ、に、）の方法
［ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２２７　：６８０　、　
Ｉ　９７０］に従い、１２．５％（Ｗ／　Ｖ）ポリアク
リルアミド・スラブゲルと、ＳＤＳを含有する不連続緩
衝液を用いて、リー（Ｌｅｅ）らの方法［ニューロサイ
エンス（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）６　：２７７３　
、１９８１　］によって、精製操作の主な工程によって
得られた生物学的に活性な物質（即ちホモジネートの全
量を酸性にて沈澱さけ、中和し、透析した後、セファデ
ックスＧ−１５０カラムとＴＳＫ−ＣＭ−３ＳＷカラム
にかけて得られた上清抽出物）の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動を行なった結果を示す。

詳細には、第３Ａ図は、バイオラド（Ｂ　ｉｏＲａｄ）
標準タンパク質（レーン！及び５）、精製操作の主要工
程から得られた活性物質、即ち全ホモジネートを酸性沈
澱、中和及び凍結乾燥して得られた上清抽出物（レーン
２）（レーン当たり５μｇタンパク質）、並びにセファ
デックスＧ−１５０カラムから得られた活性溶出液（レ
ーン３）及びＴＳＫ−ＣＭ−３ＳＷカラムから得られた
活性溶出液（レーン４）を銀染色して観察された５ＤＳ
−ＰＡＧＥＡＧＥゲル電気泳動例を示すものである。

標準分子量の指標物質（インジケーター）には、ミオノ
ン（分子量２００，０００）、β−ガラクトシダーゼ（
分子量１１６，２５０）、ホスホリラーゼｂ（分子１９
２．５００）、ウシ血清アルブミン（分子ｆｆ１６６．
２００）、卵白アルブミン（オバルブミン）（分子量４
５，０００）、炭酸脱水酵素（分子量３１．０００）、
大豆トリプシン阻害物質（ｓｏｙａ　ｂｅａｎ　ｔｒｙ
ｐｓｉｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ）（分子量２１，５００
）、及びリゾチーム（分子ｆｆ１１４．４００）を使用
した。

電気泳動の試料緩衝液には、６２．５ｍＭトリス［トリ
（ヒドロキシメチル）アミノメタン：＋（ｐｉ−ｒ　６
　。

８）、１０％ｗ／ｖグリセリン、２％ｗ／ｖＳＤＳ（ド
デシル硫酸ナトリウム）、２．５ｍＭ　ＥＤ’ｒＡ、２
゜５ｍＭのＥＧＴＡ、０．０１％ブロモフェノールブル
ー及び５％β−メルカプトエタノールを含（ｆさせた。

ＴＳＫ−ＣＭ−３ＳＷから得られた生物学的に活性な物
質は、標準品として使用したリゾチーム（バイオラド）
の分子量に類似した分子量を有する一重の帯（シングル
・バンド）として移動し、分子最約１４，４００ダルト
ンを有するものである。この分子量により、活性分子は
、同定されている他のニューロン栄養因子（ＮＧＦ、Ｃ
ＮＴＦｌＢＤＮＦ）と区別される。実際、ＴＳＫ−ＣＭ
−３ＳＷカラムから溶出された活性物質は、Ｓ　Ｄ　Ｓ
　−Ｐ　ＡＧＥゲル電気泳動させてもマウス唾液腺由来
のβ−ＮＧＦと同じ位置に移動しない（第３Ｂ図）。

第３Ｂ図は、標準・バイオラドインジケーター（レーン
ｌ及び４）、マウス顎下腺のβ−ＮＧＦ（レーン２）２
．５μｇ及びＴＳＫ−ＣＭ−３ＳＷカラム由来の活性物
質（レーン３）２５μｇを用いて銀染色した後の５ＤＳ
−ＰＡＧＥゲル電気泳動図を示すものである。標準タン
パク質は、第３Ａ図に於けるものと同様の物を使用した
。

ＮＧＦは、ＴＳＫ　　ＣＭ　　３ＳＷカラムから溶出さ
れた活性分子の移動位置よりも下方に移動する。ＢＤＮ
Ｆは、ＳＤＳ電気泳動ではＮＧＦの移動位置と同し位置
に移動することが知られている。

このことより、ＴＳＫ−ＣＭ−３ＳＷから溶出された活
性分子は、更にＢＤＮＰとも異なっていることを示唆し
ている。

Ｃ１生物学的活性 精製操作の主要な工程から得られた物質（ホモジネート
の全量を酸性沈澱、中和及び透析して得られた未精製の
上演抽出物、Ｇ−１５０カラム由来の溶出液、並びにＴ
ＳＫ−ＣＭ−３ＳＷカラム由来の溶出液）の生物学的活
性を、常法に従い、胎仔マウスから分離された初代中脳
細胞を血清不含培養液中で生存せしめる作用に関し、そ
れを監視（モニター）することにより確認する。更に、
形態学的な特徴を確認又は確定するために、培養系に存
在するドーパミン作動性ニューロンに於ける３Ｈ−ドー
パミンの特異的な取り込み、及びＧＡＢＡ作働性ニュー
ロンに於ける１４Ｃ−ＧＡＢＡの特異的な取り込みの測
定を行なった。

細胞培養物の調製法、細胞生存度の評価、及び特異的取
り込みパラメーター、並びに細胞培養調製物の特徴付は
及び精製操作の主要工程で得られる物質の活性について
以下に概説する。

ｉ）インビトロに於ける細胞の型（タイプ）を評価する
ための細胞培養物調製法及び免疫化学的判定基準。

吻側中脳披蓋を、１３日胎仔マウスの脳から無菌条件下
で切開した。プールした脳領域を、以下の組成を有する
ＰＢＳ中で機械的に分離した：（単位ｍＭ）ＮａＣ＋２
．１３６　、８、ＫＣＬ２．７、Ｎ、ａｔＨＰＯ，・７
Ｈｔｏ、ｓ、ＫＨ２ＰＯ，，１，５、及びグルコース含
量（６ｉｇ／ｘＮ）、及びウシ血清アルブミン（０，１
肩ｇ／　ｚＱＸｐＨ７、４）。次いで、細胞を遠心分離
（４５ｒｐｍで４分間）にかけ、培養培地に再Ｉ！！濁
させ、２０μｍナイテックス（Ｎ　ｙｔｅｘ）フィルタ
ーに通し、ウシター（ｏｕｌｔｅｒ）細胞計数器で計数
し、３５ａ＋ｍファルコン（Ｆ　ａｌｃｏｎ）組織培養
プラスチック製器にプレートした。

イオン強度とｐＨを上昇させるためにイーグルの基本培
地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｂａ５ａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｂ
ＭＥ）、ＮａＨＣ０３及びＮａＯＨを使用し、各プレー
ト皿をウシ皮膚コラーゲン［ヴトロゲン（Ｖ　ｉｔｒｏ
ｇｅｎ）。

１００μｇタンパク質コで被覆させた［エルスダル（Ｅ
ｌｓｄａｌｅ　Ｔ、）らのジャーナル・オブ・セルラー
・バイオロジー（Ｊ　、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）］。

培養培地は、グルコース（３３ｍＭ）、グルタミン（２
ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３（１５ｎＭ）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ”−２−エタンス
ルホン酸）（１０ｍＭ）、更にノ、ポルジオ（Ｄｉ　Ｐ
ｏｒｚｉｏ　Ｕ）らのネイチ＋−，２８８：３７０．＋
９８０に報告されているようなインスリン（２５μｇ／
ｚσ）、トウシスフェリン（１００μｇ／苅Ｑ）、プト
レッシン（６０μＭ）、プロゲステロン（２０μＭ）、
亜セレン酸ナトリウム（３０μＭ）、ベニンリンＧ　（
０、’５　Ｕ　／Ｉｆ２）及びストレプトマイシン（０
゜５μｇ／ｉ（りを加えたＢＭＥとバンズＦ　１２　（
Ｈａｍ’５Ｆ１２）との混合物（１＋１）からなり、更
にＴ３（３，３’、５°−トリヨード−ＤＬ−サイロニ
ン）（３０μＭ）［プイミラット（Ｐｕｙｇ＋１ｒａｔ
　Ｊ　、）ら、ニューロサイエンス１０：８０１，１９
８３］を加えたしのである。常法に従い、所望の数の分
離細胞を含（ｆする培養培地２ＭＱを各プレート皿に加
えた。

インビトロに於ける細胞の型の同定を、ドヘルティー（
Ｄｏｈｅｒｔｙ　Ｐ、）らのジャーナル・オブ・ニュー
ロケミカル、４２：１１１６．１９８４に記載のように
、神経線維（ｎｅｕｒｏｆ　ｉｌａｍｅｎｔ）タンパク
質に対するモノクローナル抗体ＲＴ９７［アンダートン
（Ａｎｄｅｒｔｏｎ　Ｂ、Ｈ，）らのネイチャー、２９
８　：８４．１９８２］、及びインビトロに於いて神経
細胞の特異的なインジケーターを利用する間接免疫蛍光
法により行なった。簡潔に言えば、培養物をメタノール
中に一２０℃で７分間固定させた。この固定した培養物
を、ＰＢＳ中、０．１％（ｙｏｌ／ｖｏｌ）のトリトン
Ｘ−１００（ポリオキシエチレン・エーテル）で３０分
間処理することにより浸透性を付与し、次いでＰＢＳを
含有する１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）と共に６０分間
インキュベートして、非特異的なタンパク結合部位を封
鎖した。ＰＢＳ中、抗神経線維抗体とのインキュベート
（希釈率１　：５００）を室温で６０分間行ない、次い
で１０％ＦＣＳを含有するＰＢＳを用いて３回洗浄した
。

抗−マウス高親和性の精製ＩｇＧ（希釈率１：１００）
を室温で６０分かけて添加し、１０％ＰＣＳを含有する
ＰＢＳで３回洗浄した後、グリセリン／ＰＢＳ（１：Ｉ
）を用いてカバーグラス処理し、ローダミン落射蛍光（
ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）及び位相差を利用す
る光学特性を備えたゼイス（Ｚｅｉｓｓ）光学顕微鏡■
によって検定した。

マウスＢＦＡＰ［グリア原線維の酸性タンパク質（Ｇｉ
ａｌ　Ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ　Ａｃ１ｄｉｃ　Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）］抗血清（インビトロに於いて標識星状細胞に
対して特異的な抗血清）、及びヤギ抗マウス高親和性精
製ローダミン接合ＩｇＧを用いて、ラッフ（ＲａｆｆＭ
。

Ｃ，）らの操作［プレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒ
ｅｓ、）コに従い、間接免疫蛍光法を行なった。

ｉｉ）培養物に於ける経時的な細胞生存評価方法。

細胞の生存を、形態学的な判定法（即ち、生存している
細胞の数をインビトロに於いて、経時的に位相差顕微鏡
を用いて観察する）によって評価し、更にプレート皿毎
に生存しているドーパミン性鋤什ｌ■均のＤ閃Ａ金右ｍ
乃ｒドその綽桑銘Ｂ！ｉ　ｒｇ＋　ｌこインビトロに於
いて生化学的に評価した。ＤＮＡ含有量は、エルウィン
（Ｅｒｗｉｎ　Ｂ、Ｇ、　）らの方法［アナリシス・バ
イオケミカル（Ａ　ｎａｉ、　Ｂ　１ｏｃｈｅＩ１１．
）］によって測定し、他方プレート皿当たりの生存ドー
パミン作動性細胞数は、特異的なドーパミンの取り込み
の後、ポルスタッド（Ｂｏｌｓｔａｄ　Ｇ、）らのコン
ブ・バイオケム・フィジオロ（Ｃｏｍｐ、　Ｂ　ｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、６２：６１，１９７９）に記
載のグリオキサル酸−誘発性蛍光法（Ｇ　Ｉ　Ｆ）に従
って、蛍光性ニューロンを観察した後に検出した。この
蛍光法を行なうため、カテコールアミン落射蛍光及び位
相差を利用した光学特性を備えているゼイス光学顕微鏡
■を用いて細胞を観察した。予め取り付けられた座標を
利用し、全表面領域の少なくとも３％に対応するＧＩＦ
陽性ニューロンの数を計数した。

山）特異的なドーパミン及びＧＡＢＡ取り込みの評価方
法。

特異的な３Ｈ−ドーパミンの取り込みを、ベルガー（Ｂ
ｅｒｇｅｒ　Ｂ、）らのニューロサイエンス７：１９３
．１９８２に記載の方法に従って評価した。

細胞を、グルコース（５ｍＭ）、ＣａＣｌ２ｔ（ｌ　ｍ
Ｍ）、ＭｇＳ　Ｏ４（１ｍＭ）、アスコルビン酸（０，
１ｍＭ）、パルギリン（０，１ｍＭ）を加えた、予め加
熱しておいたＰＢＳを用いて一回洗浄し、この同じ溶液
０゜８ｔｘ（ｌと共に５分間、前インキュベートした。

要すれば、このインキュベーション媒質に、ベンゾトロ
ピン（５μＭ）、デスメチルイミプラミン（５μＭ）又
はフルオキセチン（ｌμＭ）を加えた。次いで、常法ど
おりに３Ｈ−ドーパミン０．２ｍ１２（最終濃度５０ｎ
Ｍ、Ｓ、Ａ、（比活性）２２−３３　Ｃｉ／ｚｍｏ１）
を加え、３７℃で１５分間インキュベートを行なった。

インキュベーション混合物を取り除くことで取り込みを
停止させ、水冷ＰＢＳを用いて４回素早く洗浄した。次
いで、３Ｈ−ドーパミンを、無水エタノールを加えた０
、４Ｍ　ＨＣｆ２０．（３：Ｉ、ｖ／Ｖ）を用いて各プ
レート皿から２回抽出した（各々１５分間）。回収率は
、９５％以上であった。パラカード・トリカーブ（Ｐａ
ｃｋａｒｄ　ＴｒｉＣａｒｂ）　−シンチレーションカ
ウンター（４６０Ｃ型）を用い、インスタゲルＵ　（Ｉ
　ｎｓｔａｇｅｌ■）（液体シンチレーションカウンタ
ー用ｆｊｔ）を加えて、放射活性を測定した。インキュ
ベーションと洗浄を終えた時点で試料を分離し、細胞内
放射活性体を過塩素酸０．５ｊ＋Ｑで抽出して高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定した［コ
ンブ（Ｋｏｔａｋｅ　Ｃ，）らのジャーナル・オブ・ニ
ューロサイエンス（Ｊ、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）２：１３
０７，１９８２；シュム（Ｓｈｕｍ　Ａ、）らのジャー
ナル・オブ・クロマトグラフィー（Ｊ。

Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ、）２２８：ｌ　２３，１９８２］
。

注入した放射活性体の９５％以上は、ドーパミンの保持
時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉａ＋ｅ）に捕集された
分画と関連していた。

目Ｃ−ＧＡＢＡ０．１ｕＭ（２２５ａ＋Ｃｉ、ｎｍｏｌ
）を加え、３７℃で１５分間インキュベートすることで
、”Ｃ−ＧＡＢＡの特異的取り込みを、プロチャンズ（
Ｐ　ｒｏｃｈｉａｎｔｚ　Ａ　、）らのネイチャー、２
９３二５７０．１９８１に記載の評価法で検定した。ア
を停止させた。要すれば、ＧＡＢＡ取り込みの阻害物で
あるジアミノ酪酸（１０−’Ｍ）を加えた。３Ｈ−ドー
パミン取り込みの試験方法に於ける記載のように洗浄及
び抽出を行なった。ＧＡＢＡの同定はＴＬＣで行なった
［ラッシャ−（Ｌ　ａｓｈｅｒ　Ｒ、Ｓ、、）のプレイ
ン・リサーチ６９：２３５，１９７４コ。

放射活性体の９０％以上は、信頼できる標準ＧＡＢＡと
共に移動したスポットに関連していた。

ｉｖ）細胞培養系の形態学的評価、生命力及び生化学的
特徴。

インビトロに於ける４及び８日目の時点では、プレート
皿に存在する固着した生細胞の９８％以上は、モノクロ
ーナル抗体ＲＴ９７を用いた免疫細胞化学的染色に対し
免疫反応が陽性であった。

また、培養系の細胞の１％以下は、考慮すべきいかなる
時点に於いてもＧＦＡＰ抗血清を用いた染色に対し免疫
反応を示した。このことは、培養物中の細胞の９８％以
上が栄養性因子として分類できることを示唆している。

培養系のドーパミン作動性ニューロンの数を数えると、
このような細胞はインビトロに存在する全細胞数の約０
．１−０゜２％であることが判明した。

使用した培養系の細胞の生命力は、インビトロに於いて
４日まで変化無かった。しかし、４日から８日の間には
インビトロに於いて６０−８０％に低下した。このこと
は、形態学的観察後のみならず、各プレート皿に於ける
ドーパミン作動性細胞のＤＮＡ含有量及びその数を観察
することによっても明らかであった。このことは、本培
養に使用した条件下では、中脳ニューロン細胞の生命力
は制限され、培養系に存在する異なる型の細胞の生命力
にも顕著な変化が認められないことを示唆している（第
４図参照）。

第４図は、全ニューロン、陽性ＧＩＦニューロン及びＢ
ＺＴ−感受性ドーパミンの取り込みに於ける変化の時間
相関グラフを示すものである。中脳細胞は、濃度ｔｘｔ
ｏ”細胞／３５ｘｍプレート皿／２ｘＱ培養培地で接種
した。

第４図中の指標は以下の意味を有する：ＤＮＡ／プレー
ト皿（・−・）、ＢＺＴ−感受性ドーパミンの取り込み
（〇−〇）；Ｇ　Ｉ　Ｆ’＋細胞数／プレート皿（白柱
状グラフ）；ＢＺＴ−感受性ドーパミンの取り込み／１
０”ＧＩＦ＋細胞（中斜線の柱状グラフ）。

培養系に於ける細胞生命力の検定結果と同様に、３Ｈ−
ドーパミン及び”Ｃ−ＧＡＢＡの特異的な取り込みも、
インビトロに於いて４から８日の間に６０−８０％まで
低下した。このことは、インビトロに存在する各種の細
胞型の間にはその挙動に於いて明らかな相異が認められ
ないことを更に示唆するものであり、これらの取り込み
パラメーター（指標）がインビトロに於ける細胞生命力
のインジケーターとして適当であることを意味している
。

Ｖ）精製操作の主要工程から得られた物質の生物学的活
性。

本目的のために、精製操作の主要工程由来の凍結乾燥物
質の部分標本を使用直前に、蒸留水の１／１０容量（初
期容量）に再懸副した。このタンパク質含有量は、パタ
ーソン（Ｐ　ｅｔｅｒｓｏｎ　Ｇ　、　Ｌ　、）の方法
［アナリシス・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、）８３　：３４６　、１９７７］に従い測定
した。

次いで、試料を培養培地に希釈し、ミレックス（Ｍｉｌ
ｌｅｘ）　０　、４５ミクロンフィルターで濾過し、ウ
シ血清アルブミンに前もって飽和させた（ｌＪＩｇ／ｘ
１２）。次いで、プレートする日に、濾過した物質の適
当量を中脳細胞培養物に加えた。また、対照群である細
胞培養物には、等容量のウシ・アルブミンを加えた。

全ての培養物は、２日毎に培地を取り替えるか、あるい
は精製工程由来の物質を補い、対照群の培養物ではアル
ブミンを補った。

全ての主要な精製工程由来の物質（ホモジネートの全量
を酸性沈澱した後に得られる未精製の上清抽出物、セフ
ァデックスＧ−１５０カラムから得られる分子ｆｆ１ｌ
Ｏから３０キロダルトンの範囲で溶出する分画、並びに
ＴＳＫ−ＣＭ−３ＳＷカラムから得られる約１Ｍ酢酸ア
ンモニウムで溶出される分画）は全て、培養物中の分離
された幼若発育を増強することができる。

プレートする日（０日目）に培養培地を添加した後８日
目に於ける、この未精製の上清分画又はアルブミン（対
照群培養物）のインビトロ細胞培養物の形態学的外観を
、各々第５Ａ図及び第５Ｂ図に示す。

これらの図は、それぞれ、アルブミンｌＯμｇ／耐を対
照群培養物（第５Ａ図）に、並びに全ホモジネートを酸
性沈澱し透析して得られた上清抽出物１０μｇ／ｊ１１
２（第５Ｂ図）を、それぞれ添加した後８日目のインビ
トロ胎仔マウス中脳細胞の典型的な外観を各々示すもの
である。

この作用は、プレート皿毎のドーパミン作動性細胞の全
ＤＮＡ含有量及びその数の検定（第６図）からも明らか
であり、更にインビトロに於いて経時的にみた、３Ｈ−
ドーパミン及び”Ｃ−ＧＡＢＡの特異的な取り込みから
も明らかである。

第６図は、対照群培養物にアルブミン１０μｇ／ｆｆ＆
（白柱状グラフ）を、及びホモジネートの全量を酸性沈
澱し透析した後に得られる上清抽出物１θμｇ／ｊＩｉ
２（中斜線柱状グラフ）を添加した後８日目（インビト
ロ）のＧ　ｒ　Ｆ”″細胞（即ちＤＡドーパミン作働性
細胞）の数／プレート皿及びＤＮＡ含有含有量／プレー
トポすものである。

値は、３回の分析に於ける平均値±Ｓ、Ｅ、（平均の標
準誤差）である。第７図は、ドーパミン取り込みに対す
る上記上清の作用が濃度に依存していることを示すもの
である。この事実は、プレート皿毎のＧＡＢＡ及びＤＮ
Ａ取り込みの測定から明らかになった。

詳細には、第７図は、ウシ抽出液（ホモジネートの全量
を酸性沈澱させ、透析して得る）を様々な濃度で添加し
た時の、ＢＺＴ−感受性ドーパミンの取り込みに対する
作用を示すものである。中脳細胞は、濃度０．５ＸｌＯ
’細胞／培養培地ｌＲ１２／プール（２４ｚｘ）で接種
した。ウシ抽出液の規定量を、接種時に５０μＱとして
加えた。要すれば、タンパク質を最終濃度４０μｇ／ｍ
（ｌにするように、ウシ血清アルブミンを試料に加えた
。

詳細には、第７図は、ウシ抽出液（ホモジネートの全量
を酸性沈澱させ、透析して得る）を様々な濃度で添加し
た時の、ＢＺＴ−感受性ドーパミンの取り込みに対する
作用を示すものである。中脳細胞は、濃度０．５ｘｌＯ
８細胞／培養培地１ｍＱ／　２４　ｍｕウェルで接種し
た。ウシ抽出液の規定量を、接種時に５０ｉＣとして加
えた。要すれば、タンパク質を最終濃度４０μｇ／ｍＱ
にするように、ウシ血清アルブミンを試料に加えた。

取り込みパラメーターを４日目にインビトロで評価した
。値は、３つの試料に於ける平均±Ｓ。

Ｄ、（標準偏差）で示す。

これらの結果を総合すると、本活性物質は、各種のニュ
ーロン型、詳細には使用した培養物中に存在するニュー
ロン型の生存力及び発育を増強することができることが
分かる。

上清抽出液、セファデックス（，１５０カラムにより分
子ｆｆ１ｌＯから３０キロダルトンの範囲で溶出される
分画のプール、並びにＴＳＫ−ＣＭ−３ＳＷカラムから
約１Ｍ酢酸アンモニウムを用いて溶出される分画群を栄
養活性に関して試験した場合に於いても同様の作用が認
められるが、当該作用を得るのに必要な物質の量は異な
っていた。

詳細には、未精製の上清抽出液は、濃度的６μｇ／ｍ（
ｌで加えた場合に１／２最大（ｓｅｍｉｍａｘｉｍａｌ
）生物学的活性を示し、セファデックスＧ−１５０及び
ＴＳＫ−ＣＭ−３ＳＷカラムから得られた分画の１／２
最大活性は、それぞれ０６３μｇ／　ｍ（ｌ及びｌＯｎ
ｇ／ｉ（で検出されるものである（第１表参照）。

インビトロのニューロン細胞培養物の他の型、詳細には
胎仔マウス線状体から分離されたニューロン細胞に於け
る生物学的活性の検定により、活性分子は、神経系、特
に中枢神経系（ＣＮＳ）の異なる領域に存在する各種の
ニューロン型細胞の生存力及び発育を増強させる上で有
効であることが示唆された。更に、本活性物質は、８日
幼若雛ではなく、１２日幼若雛由来のを髄神経節ニュー
ロンのインビトロ栄養性増殖を増強させるのに有効であ
った。この効果ら、本ニューロン栄養因子がマウス唾液
腺由来のβ−ＮＧＦと区別され得るこ米のβ−ＮＣＰは
、それを各種濃度（ｌｎｇから３００　ｎｇ／１１２）
で添加しても、培養物中の、通常使用されるマウスから
分離した中脳細胞の生存力に影響を及ぼさないものであ
る。

哺乳動物の由来来のニューロン栄養因子のインビボでの
応用 本発明の別の目的は、哺乳動物の由来来のニューロン栄
養因子（ＳＤＮＦ’）をインビボで応用することに関す
る。現在では既に上記したように、ニューロン栄養因子
が、神経系の発生中だけでなくおそらく成熟した状態に
おいても、ニューロン細胞の生存およびニューロンの柔
軟性（微環境の変化に応答して神経細胞が形態機能的な
修飾を受ける　゛能力として定義される）を調節するこ
とか知られている。事実、その証拠が現在蓄積されつつ
あり、ニューロン栄養因子がおそらく以下の事柄につい
て成熟ニューロンをコントロールするであろうことが示
唆されている。

１）正常細胞の維持、機能発揮および老化［バロ−ｙ／
ｖ−，，，ぐ　　ｎ＋ｃ−＋＋＋＋ｃ＋ｃ＋＋ｍｎｃ＋
ｎ　　Ｎ６＋１ｒ／１１）／’ＩＱｌ＋＋’Ｑ　　ＩＩ
ＡＩＩｆ、Ｎｏ、３．１９８５）］−すなわち、栄養要
求の通常の変化につり合うためにはニューロン栄養因子
が十分に供給され、利用されなければならず、従ってイ
ンビボでの成熟ニューロンの異常な行動は、栄養媒介物
が十分に維持されていないことを反映しているのかもし
れない。

ｉｉ）化学的あるいは機械的に損傷を受けた細胞におけ
る回復および再生過程（バロン、上記）、特に、軸索の
損傷はニューロン細胞に対するニューロン栄養因子の供
給不足へと導き、外傷による損傷あるいは病的な損傷に
次いでニューロン細胞が死ぬことが知られており、この
細胞の死が老化過程に含まれているのかもしれない。

ｉｉｉ　）ある病的症状における退化および死（バロン
、上記）、すなわち、別個の病的症状が、不足の状態と
関係し、起こるのかもしれないし、また、効果的な栄養
維持の減退あるいは栄養要求の上昇あるいはその両者に
由来する栄養不足によるのからしれない。

上記に鑑みて、本発明は、以下に挙げる事柄に由来する
神経病的症状において、５ＤＮＦとして知られるニュー
ロン栄養因子を応用すること、特に、５ＤＮＦ分子単独
でまたはガングリオシド類（特に、ウシ脳ガングリオシ
ドの混合物、ウシ脳ガングリオンドの単一種、好ましく
はＧ　Ｍ　＋、および半合成ガングリオシド誘導体、好
ましくはガングリオシドの内部エステル誘導体）あるい
はリン脂質類（特に、ウシ脳リン脂質の混合物、ウシ脳
すン脂質の単一種、好ましくはホスファデジルセリン、
および半合成リン脂質誘導体）と組み合わせて非経口投
与すること（硬膜上、槽内、脳室内、鞘内、静脈内、筋
肉内、皮下、歯肉、舌下、直腸および鼻内投与を含むが
、これらに限定されない）に関する。

ｉ）急性、亜急性または慢性の神経系損傷；外傷による
損傷、化学的な損傷、管損傷および欠損（たとえば、発
作など）、ならびに伝染性／炎症性および腫瘍誘起損傷
を含む。

ｉｉ）神経系の老化；アルツハイ？　−（Ａｌｚｈｅｉ
ｍｅｒ）病を含む。

ｉｉｉ　）神経系の慢性神経退化疾患。

ｉｖ）神経系の、あるいは神経系に作用する慢性の免疫
学的疾患。

５ＤＮＦ分子をガングリオシド類およびリン脂質類とと
もに用いることについては、ウシ脳ガングリオシド類お
よびウシ脳リン脂質類がニューロン栄養因子に対する細
胞の応答を高める（インビトロで、および最も好ましく
はインビボで）ことが既知であることを示す証拠によっ
て裏付けられる。

次に挙げる第２表は、中脳細胞の培捉物でのウシ線条体
抽出物およびＧＭ、の効果を示すものである。

第２表 アルブミン　　　　２９．５１±５．７８　　０．５６
±０．１４アルブミン＋ＧＭ、　　　　６９．１４±３
．３８　　１．０４±０．０５線条体抽出物　　　１０
４．６８±７．６０　　２．４１±０．２７線条体抽出
物＋〇Ｍ１　１４０．５計１７．８２　　４．５６±０
１０中脳細胞（ＩＸ１０８／プレート）は、アルブミン
（１５μ９／ＩＩＩ（１）あるいは線条体抽出物（１５
μ９／ｍρ）を、単独であるいは１０−７ＭのＧ　Ｍ　
＋の存在下で含有している血清不含培地で培養した。取
込みは前記の方法に従って４日目に評価した。値は３回
の分析値の平均上標準誤差である。ウシ線条体抽出物は
前記のようにして調製した。

ａ、医薬組成物 哺乳動物の由来来の５ＤＮＦ分子を含有している医薬組
成物の製剤化（ガングリオツド類およびリン脂質類を含
まずに記載されている、またそれらを含んで記載されて
いることらある）には、ＪＩＶ者への効果的な投与に適
した薬学的に許容しうる組成物を製造するための既知の
方法が含まれ、この方法によって有効量の５ＤＮＦ分子
が薬学的に許容しうる担体と混合される。適当な担体お
よび他のタンパク質を含む配合は、たとえばｒＲｅｍｉ
ｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃ
ｉｅｎｃｅｓＪ（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃ
ｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ、、ＵＳＡ、１９８
５）などの本に記載されている。これらの担体には注入
可能な「沈猜（デポジット）製剤」が含まれる。

上記に基づくと、医薬製剤には、！またはそれ以上の薬
学的に許容しうる担体または希釈剤と組み合わせた、適
当なｐＨの緩衝媒質中に含まれ生理学的体液と等浸透性
である、５ＤＮＦの凍結乾燥粉末または５ＤＮＦ溶液が
含まれる（これらに限定されない）。以下に挙げる第３
表に、神経系疾患の治療用溶液の形態で製造される製剤
の組成を示す（これらは説明のためにだけ挙げたもので
あって、本発明を限定するものではない）。凍結乾燥調
製物の場合、マンニトールあるいはグリシン（これらに
限定されない）などの賦形剤を用いてもよく、所望のｐ
Ｈの適当な等張緩衝溶液を得るために所望量の適当な緩
衝溶液が加えられることになろう。また、同様の溶液を
、所望量の等張溶液中の５ＤＮＦ分子からなる医薬組成
物用に用いてもよく、これには、所望ｐＨ（たとえば、
中性ｐＨ）の等張医薬調製物が常時得られるように、適
当な濃度のリン酸あるいはクエン酸緩衝食塩溶液を使用
することが含まれるが、これに限定はされない。

説明のために、神経系疾患治療用の医薬組成物のいくつ
かを第４Ａ表および第４Ｂ表に示す。第４Ａ表および第
４Ｂ表に示した医薬組成物は、単一投与あたり２つのバ
イアルからなる調製物である。この第１のバイアルは、
グリシンあるいはマンニトールなどの薬学的に許容しう
る賦形剤とともに約０，０１〜５０重量％の活性物質を
含ｆｆシている。第２のバイアルは、所望量のリン酸あ
るいはクエン酸緩衝食塩溶液からなる溶媒を含有してい
る。この２つのバイアルの中身を投与直前に混合し、凍
結乾燥した７活性物質を素早く溶解して注射溶液を得る
。また、第４Ｂ表には皮下注射用の医薬組成物の例をも
示す（システムＮｏ、５）。

また、医薬製剤には、グリコ−ゼラチンあるいはその他
の種類の親油性、すなわち水溶性の自律乳化賦形剤を用
いる直腸投与用の原剤が含まれる（これに限定はされな
い）。この調製物では５ＤＮＦは全賦形剤の０．００１
−１重量％で存在する。

この原剤は適当量のサリチル酸アセチルを含んでいても
よい（これに限定はされない）。説明のために、神経系
疾患治療用の原剤調製物を第５表に挙げる。

さらに、凍結乾燥型および溶液型の両者の５ＤＮＦ医薬
調製物は、上記のように有効量のリン脂質類またはガン
グリオシド類を含んでいてもよい。

たとえば、投薬は、老化による疾患あるいは神経回復の
治療用に通常ヒトで用いられるものと同様であってよい
しくこれらに限定はされない）、投与経路に依存するこ
ともある。５ＤＮＦ医薬調製物の投与量および投与時期
は、臨床試験によって決まる所望の治療効果およびその
投与経路に依存し、たとえば、ＮＧＦなどの他のニュー
ロン栄養試薬による研究で通常用いられているものと同
様であってよい（これらに限定はされない）。

１１表注射溶液用医薬組成物の例 調製物Ｎｏ、　１−２ｍ１２のアンプル（１個あたり）
活性物質　　　　　　　　５μｇ（５００ＴＵ）塩化ナ
トリウム　　　　　１６ｍｇ クエン酸緩衝液（ｐＨ・７、 発熱物質不含の蒸留水 中、ｑ、ｂ、）　　　　　　　　　２好調製物Ｎｏ、２
−２ｍＱのアンプル（１個あたり）活性物質　　　　　
　　１００μｇ（ｔｏ、ｏｏｏＴＵ）塩化ナトリウム　
　　　　１６゜ クエン酸緩衝液（ｐＨ・７、 発熱物質不含の蒸留水 中、ｑ、ｂ、）　　　　　　　　　２ｍ（１栄養型位（
Ｔｕｔ）は第１表に定義されている。

第４Ａ表医薬組成物システムの例 システムＮｏ、　１ ａ）　２村のバイアル（１個あたり） 凍結乾燥活性物質　　　　５μｇ（５００ＴＵ）グリシ
ン　　　　　　　３０Ｒ９ ｂ）２．ｗ１２の溶媒バイアル（１個あたり）塩化ナト
リウム　　　　　１６ｍｇ クエン酸緩衝液（発熱 物質不含の蒸留水中、 ｑ、ｂ、）　　　　　　　　　　２ＭＱシステムＮｏ、
　２ ａ）２＋（のバイアル（１個あたり） 凍結乾燥活性物質−５μｇ（５００ＴＵ）マンニトール
　　　　　４０’ｍｇ ｂ）２ｘ（の溶媒バイアル（ＩＩＩＩあたり）塩化ナト
リウム　　　　　１６ｍ９ クエン酸緩衝液（発熱 物質不含の蒸留水中、 ｑ、ｂ、）　　　　　　　　　　２酎 システムＮｏ、　３ ａ）３ｍＱのバイアル（１個あたり） 凍結乾燥活性物質　　　１００μｇ（１０，０００ＴＵ
）グリシン　　　　　　　４５即 ｂ）３ｍｅの溶媒バイアル（１個あたり）塩化ナトリウ
ム　　　　　２４′ＩＮｇクエン酸緩衝液（発熱 物質不含の蒸留水中、 ｑ、ｂ、）　　　　　　　　　’　　３ｍＱ。

栄養単位（ＴＵ）は第１表に定義されている。

第４Ｂ表医薬組成物システムの例 システムＮｏ、４ ａ）３ｄのバイアル（１個あたり） 凍結乾燥活性物質　　　１（１０μｇ（１（１，０ＯＯ
ＴＵ）マンニトール　　　　　６０次９ ｂ）３ｍＱの溶媒バイアル（１個あたり）塩化ナトリウ
ム　　　　　２４ｍ９ クエン酸緩衝液（発熱 物質不含の蒸留水中、 ｑ、ｂ、）　　　　　　　　　　３ｍＱシステムＮｏ、
　５　（皮下注射剤の例）ａ）２ｍＱのバイアル（１個
あたり） 凍結乾燥活性物質　　　１０μｇ（１，０ＯＯＴＵ）グ
リシン　　　　　　　３０次９ ｂ）２ｍσの溶媒バイアル（１個あたり）塩化ナトリウ
ム　　　　　１６即 クエン酸緩衝液（発熱 物質不含の蒸留水中、 Ｑ、ｂ・）２１１Ｑ 栄養単位（ＴＵ）は第１表に定義されている。

第５表直腸経路用のｉ剤形の医薬組成物の例調製物Ｎｏ
、　１ 活性物質　　　　　　　１００μｇ（Ｉｉｌｉ、　ｎｏ
ｒｔｈ）ココアバター　　　　　　２．５ｇ 調製物Ｎｏ、　２ 活性物質　　　　　　　１００μｆ（１０，０ＯＯＴＵ
）カルボワックス （Ｃａｒｂｏｗａｘ）１５４０　　　　　１．７５９カ
ルボワツクス６０００　　　０．１５９調製物Ｎ０９３ 活性物質　　　　　　　１００μｆ（ＩＩ）、　０ＯＯ
ＴＵ）ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）６１　　　　２．１２５
ｇラノリン　　　　　　　　０．２５９ 調製物Ｎｏ、４ 活性物質　　　　　　　１００μ９（１０，０００ＴＵ
）グリセリン　　　　　　１．５ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　０．１５９ゼラチン　
　　　　　　　０．２５ｙ 栄養単位（丁Ｕ）は第１表に定義されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は透析したウシ尾状核上清のセファデックスＧ−
１５０カラムからの溶出パターンを示すグラフであり、
第２図はセファデックスＧ−１５０カラムから得られる
活性溶出物のＨＰＬＣ溶出パターンを示すグラフであり
、第３Ａ図は本発明の主な精製工程を経て得られた活性
物質および対照標準タンパク質について５ＤＳ−ＰＡＧ
Ｅゲル電気泳動を行った結果を示す写真の複写図であり
、第３Ｂ図は本発明に係る活性物質、マウス顎下線のβ
−ＮＧＦ”および対照タンパク質について５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲル電気泳動を行った結果を示す写真の複写図であ
り、第４図は全ニューロン、ＧＩＦ陽性ニューロンおよ
びＢＺＴ−感受性ドーパミンの取り込みの経時変化を示
すグラフであり、第５Ａ図および第５Ｂ図はそれぞれア
ルブミン（対照）および本発明に係る活性物質を添加し
て培養したマウス胎児の中脳細胞の８日後の結果を示す
写真の複写図であり、第６図はアルブミン（対照）およ
び本発明に係る活性物質を添加して８日後のＧＩＦ陽性
細胞数およびＤＮＡ含有量を示すグラフであり、第７図
は本発明に係る活性物質の濃度を変えたときの中脳細胞
培養液での特異的取り込みパラメーターの変化を示すグ
ラフである。 特許出願人　フィディーア・ソシエタ・ベル・アチ才二 代　理　人　弁理士　青白　葆　外１名ＦＩＧ、３Ａ ＦＩＧ、３Ｂ ←−−−−−　４ＤＮＡ（、ＩＡさ／ブを一ト）で＝−
τ−丁り）ご〒−２（［“：にＪ：５：　−之二゛二、
し、）ＦＩＧ、５Ａ ＦＩＧ、５Ｂ （〕 り１照詳乏（ｚ） 手続補正書坊式） ％式％ １、事件の表示 昭和６２年特許願第　１９８９８６　　号３、　補正を
する者 事件との関係　特許出願人 住所　イタリア国３５０３１アバーノ・テルメ、ヴイア
・ポンチ・デラ・ファツジリカ３フフ番名称　フィディ
ーア・ソシェタ・ベル・アチオニ４、代理人 住所　〒５４０　大阪府大阪市東区域見２丁目１番６１
号図面 雪代ｌ′へ　　　４１’− ７、補正の内容 明細書および図面を以下の様に補正致します。 （イ）明細書の「図面の簡単な説明」の欄の補正 ■）５９頁９行、「結果を示す写真の複写図であり、」
を［結果の模写図であり、］に訂正する。 ２）５９頁１２行〜１３行、「結果を示す写真の複写図
であり、」を「結果の模写図であり、」に訂正する。 ３）５９頁下３行〜下２行、［結果を示す写真の複写図
であり、」を「結果の模写図であり、」・に訂正する。 （ロ）図面の補正 別紙の通り、適正な用紙を用いて十分に濃厚な黒色で鮮
明に描いた第３　（ＡおよびＢ）図および第５　（Ａお
よびＢ）図（内容に変更なし）を提出致します。 以上

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）分子量約１４，４００ダルトンの塩基性タンパク
   質であるニューロン栄養因子を製造するための方法であ
   って、（ａ）哺乳動物の脳組織をホモジナイズする工程
   、（ｂ）このようにして調製したホモジネートを酸で沈
   澱させる工程、（ｃ）得られた上清を５〜１０キロダル
   トンの分子量制限を有する透析膜で透析する工程、およ
   び（ｄ）透析した上清をクロマトグラフィーで分画して
   上清成分をその分子量に応じて分離する工程からなる方
   法。
2. （２）（ｅ）得られたニューロン栄養的に活性なフラク
   ションを、酢酸アンモニウムの勾配緩衝液を用いるカチ
   オン交換クロマトグラフィーで精製する工程をさらに含
   有している第（１）項記載の方法。
3. （３）哺乳動物の脳組織がウシの脳組織である第（１）
   項または第（２）項に記載の方法。
4. （４）ウシ脳からの尾状核を該工程にかける第（１）項
   または第（２）項に記載の方法。
5. （５）工程（ｂ）をｐＨ４〜５で行う第（１）項記載の
   方法。
6. （６）クロマトグラフィーで分画する工程（ｄ）を、１
   ０〜３０ｎＭの濃度の希釈緩衝溶離液を用いるモレキュ
   ラーシーブで行う第（１）項記載の方法。
7. （７）分画を、５，０００〜１５０，０００ダルトンの
   分画範囲を有する固定相を用いて行う第（６）項記載の
   方法。
8. （８）ニューロン栄養的に活性なフラクションを、濃度
   ０．１〜１ＭおよびｐＨ６〜７の酢酸アンモニウム勾配
   緩衝液を用いてカチオン交換クロマトグラフィーカラム
   から溶離する第（２）項記載の方法。
9. （９）各工程を０〜６℃の温度で行う第（１）項または
   第（２）項に記載の方法。
10. （１０）ニューロン栄養的に活性なフラクションをいっ
    しょにして集め、凍結乾燥する第（１）項または第（２
    ）項に記載の方法。
11. （１１）分子量約１４，４００ダルトンの塩基性タンパ
    ク質であるニューロン栄養因子。
12. （１２）等電点が約１０である第（１１）項記載のニュ
    ーロン栄養因子。
13. （１３）比活性が少なくとも約０．０１ｍｇ／栄養単位
    である第（１１）項記載のニューロン栄養因子［ここで
    、栄養単位とは、活性物質の飽和濃度に応答して生存す
    るニューロンの最大数の半数が生存するように作用する
    タンパク質濃度（μｇ／ｍｌ）である］。
14. （１４）ニューロン栄養活性を有し、約１４．４００ダ
    ルトンの分子量を有する、哺乳動物の脳の尾状核から得
    られる塩基性タンパク質であるニューロン栄養因子。
15. （１５）等電点が約１０である第（１４）項記載のニュ
    ーロン栄養因子。
16. （１６）第（１）項記載の方法で製造したニューロン栄
    養因子。
17. （１７）クロマトグラフィーによる分画をセファデック
    スＧ−１５０で行った場合、第１図中の濃い横棒で示さ
    れるフラクションである第（１６）項記載のニューロン
    栄養因子。
18. （１８）第（２）項記載の方法で製造したニューロン栄
    養因子。
19. （１９）第２図中の濃い横棒で示されるフラクションで
    ある第（１８）項記載のニューロン栄養因子。
20. （２０）ニューロン細胞の分化および生存を増強しうる
    、第（１）項または第（２）項記載の方法で製造したニ
    ューロン栄養因子。
21. （２１）ニューロン栄養的に活性な量の第（１１）項記
    載のニューロン栄養因子、および薬学的に許容しうる賦
    形剤あるいは希釈担体を含有している医薬組成物。
22. （２２）ニューロン栄養的に活性な量の第（１４）項ま
    たは第（１５）項記載のニューロン栄養因子、および薬
    学的に許容しうる賦形剤あるいは希釈担体を含有してい
    る医薬組成物。
23. （２３）第（１）項または第（２）項記載の方法に従っ
    て製造した、ニューロン栄養的に活性な量のニューロン
    栄養因子、および薬学的に許容しうる賦形剤あるいは希
    釈担体を含有している医薬組成物。
24. （２４）少なくとも１種のガングリオシドまたは少なく
    とも１種のリン脂質をさらに含有している第（２１）項
    〜第（２３）項のいずれかに記載の医薬組成物。