ME00977B - Humana antitijela visokog afiniteta prema humanom nervnom faktoru rasta - Google Patents

Abstract

Humano antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, koji specifično vezuje humani nervni faktor rasta (NGF), sa KD od 5 pM ili manje, bez unakrsnog reagovanja sa neurotrofinom-3 (NT-3), i vezuje humani NGF sa KD od oko 2 do oko 10-puta većom u odnosu na onu kojom antitelo ili fragment vezuje NGF pacova i miša. Antitela su korisna u tretmanu bola, uključujući inflamatorni bol, bol nakon operativne incizije, neuropatski bol, bol frakture, bol osteoporozne frakture, post-herpesnu neuralgiju, osteoartritis, reumatoidni artritis, kancerski bol, bol koji proističe iz opekotina, bol kod zglobnog gihta, kao i bolesti, kao što su: hepatocelularni karcinom, rak dojke i ciroza jetre.

Description

Opis

Oblast tehnike

Ovaj pronalazak se odnosi na humana antitela i antigen-vezujuće fragmente humanih antitela koji se specifično vezuju za humani nervni faktor rasta (NGF), i na terapeutske postupke korišćenja ovih antitela.

Stanje srodnih oblasti

Nervni faktor rasta (NGF) je bio prvi neurotrofin koji je identifikovan, a njegova uloga u razvoju i opstanku i perifernih i centralnih neurona dobro je okarakterisana. Pokazalo se da je NGF presudni faktor opstanka i održavanja pri razvoju perifernih simpatičkih i embrionalnih senzornih neurona i bazalnih holinergičnih neurona prednjeg režnja mozga (Smeyne et al. (1994) Nature 368:246-249; Crowley et al. (1994) Cell 76:1001-1011). NGF ushodno reguliše ekspresiju neuropeptida u senzornim neuronima (Lindsay et al. (1989) Nature 337:362-364), a njegova aktivnost je posredovana preko dva različita membranski-vezana receptora, TrkA receptora i p75 opšteg neurotrofnog receptora.

NGF je povišen u sinovijalnoj tečnosti kod pacijenata koji boluju od reumatoidnog artritisa i drugih vrsta artritisa. Pokazalo se da antagonisti NGF-a sprečavaju hiperalgeziju i alodiniju na životinjskim modelima neuropatskog i hroničnog inflamatornog bola.

Anti-NGF antitela su opisana, na primer, u WO 01/78698, WO 02/096458, WO 2004/032870, US patentnim publikacijama 2005/0074821,2004/0237124 i 2004/0219144.

KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

Pronalazak se odnosi na potpuno humana antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za humani nervni faktor rasta (NGF) sa KD od 1 pM ili manje, i ne ulaze u unakrsnu reakciju sa neurotrofinom-3 (NT-3). Ova antitela su okarakterisana posredstvom vezivanja za NGF sa visokim afinitetom i visokom specifičnošću i preko sposobnosti neutralisanja aktivnosti NGF-a. U poželjnim ostvarenjima, antitelo ili njegov

fragment vezuju se sa humanim NGF-om sa 2-10 puta većim afinitetom nego sa NGF-om pacova i/ili NGF-om miša.

Antitela mogu biti pune dužine (na primer, lgG1 ili lgG4 antitelo) ili mogu sadržavati samo antigen-vezujući deo (na primer, Fab, F(ab’)2 ili scFv fragment), i mogu biti modifikovana da bi ispoljila funkcionalnost, npr., da bi se eliminisale rezidualne efektorne funkcije (Glu koja eliminiše rezidualne efektorne funkcije (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).

Pronalazak, prema tome, obezbeđuje humano antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, koji specifično vezuje humani nervni faktor rasta (NGF) sa KD od 1 pM ili manje, kako je izmereno uz pomoć površinske plazmon rezonance, pri čemu antitelo ili fragment antitela sadrži (a) region 3 teškog lanca koji određuje komplementarnost (HCDR3) i region CDR3 lakog lanca (LCDR3), pri čemu HCDR3 i LCDR3 sadrže aminokiselinske sekvence, navedene u SEQ ID NO:90, odnosno 98, i (b) HCDR1, HCDR2, LCDR1 i LCDR2, pri čemu je HCDR1 SEQ ID NO:86, HCDR2 je SEQ ID NO:88, LCDR1 je SEQ ID NO:94 i LCDR2 je SEQ ID NO:96.

U specifičnim ostvarenjima, antitelo ili njegov fragment sadrži par sekvenci HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) sa SEQ ID NO: 108/110.

Pronalazak, takođe, obezbeđuje molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju navedena anti-NGF antitela ili njihove fragmente. Rekombinantni ekspresioni vektori koji nose nukleinske kiseline pronalaska, i ćelije domaćina u koje se takvi vektori uvode, takođe su obuhvaćeni pronalaskom, budući da su to postupci proizvodnje antitela putem kultivacije ćelija domaćina pod uslovima koji omogućuju proizvodnju antitela i povraćaj proizvedenih antitela.

Pronalazak predstavlja potpuno humano antitelo ili fragment antitela, koji blokira aktivnost NGF-a sa vrednošću IC50 koja je manja od oko 10 nM, kako je izmereno in vitro testom na bazi PC 12 ćelija (opisan u nastavku). U poželjnom ostvarenju, antitelo pronalaska pokazuje IC50od oko 500 pM ili manje; čak još poželjnije, IC50 od oko 100 pM ili manje: oko 50 pM ili manje; ili oko 25 pM ili manje.

Pronalazak obezbeđuje izolovano humano antitelo, ili njegov antigen-vezujući deo, koji vezuje NGF sa Kd koja je manja od oko 1 pM, kako je utvrđeno posredstvom površinske plazmon rezonance (BIACORE™). U poželjnom ostvarenju, anti-NGF humano antitelo ili fragment antitela pronalaska vezuje se sa humanim NGF-om sa KD od oko 0.5 pM ili manjom. Antitelo ili njegov fragment, takođe se, poželjno, vezuje sa humanim NGF-om sa približno 2- puta, 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta ili 10-puta većim afinitetom nego za NGF pacova i približno 2-puta, 2.5-puta, 3-puta, 4-puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta ili 10-puta većim afinitetom nego za NGF miša.

U poželjnom ostvarenju, antitelo ili njegov fragment pokazuju visoku specifičnost za humani NGF, primera radi, ne ulazeći u unakrsne reakcije sa veoma srodnim neurotrofinom-3 (NT-3). Tako, u poželjnom ostvarenju, antitelo ili njegov fragment visokog afiniteta i velike selektivnosti pokazuju KD za humani NGF od 1.0 pM ili manje, inhibiraju vezivanje NGF-a za receptore TrkA i p75 i ne ispoljavaju unakrsnu reaktivnost sa humanim NT-3, kako je utvrđeno uz pomoć površinske plazmon rezonance. NT-3 igra presudnu ulogu u fiziološkim procesima kao što su, na primer, koordinacija motornih neurona mišića, i sledstveno tome, antitela ili fragmenti antitela koji ne pokazuju unakrsnu reaktivnost sa NT-3 obezbeđuju neočekivanu kliničku i terapeutsku prednost u odnosu na antitela iz ranije prakse. Pokazalo se da NT-3 sprečava razvijanje termalne hiperalgezije na CCI modelu neuropatskog bola (vidi, na primer, Wilson-Gerwing et al. (2005) J Neuroscience 25:758-767). Odnedavno se pokazalo da egzogeni NT-3 u značajnoj meri smanjuje ekspresiju dva natrijumska kanala za koje se čini da igraju ulogu u razvijanju neuropatskog bola (VVilson-Gervving & Verge (2006) Neuroscience 141:2075-2085). Ovi podaci ukazuju na povoljnu ulogu NT-3 u neuropatskom bolu.

Pronalazak obuhvata anti-NGF antitela, koja poseduju modifikovani obrazac glikozilacije. U nekim aplikacijama, može biti od koristi modifikacija radi uklanjanja nepoželjnih položaja glikozilacije, ili antitelo, koje je bez dela fukoze, koji je prisutan na oligosaharidom lancu, da bi se, na primer, povećala funkcija celularne citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) (vidi Shield et al. (2002) JBC 277:26733). U drugim aplikacijama, može se izvesti modifikacija galaktozilacije s ciljem modifikovanja citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC).

Pronalazak prikazuje smešu koja sadrži rekombinantno humano antitelo ili njegov fragment, koji specifično vezuje NGF, i prihvatljiv nosač. U srodnom aspektu, pronalazak prikazuje smešu koja je kombinacija inhibitora NGF-a i drugog terapeutskog sredstva. U jednom ostvarenju, inhibitor NGF-a je antitelo ili njegov fragment. U poželjnom ostvarenju, drugo terapeutsko sredstvo je bilo koji pogodan terapeutski agens koji se pogodno kombinuje sa inhibitorom NGF-a.

Pronalazak se odnosi na inhibiranje aktivnosti humanog NGF-a korišćenjem anti- NGF antitela ili antigen-vezujućeg dela antitela pronalaska. Lečeni poremećaj je bilo koja bolest ili stanje koje se poboljšava, ublažava, inhibira ili prevenira posredstvom uklanjanja, inhibicije ili redukcije aktivnosti NGF-a. Određenije, pronalazak se odnosi na lečenje NGF-om posredovanog stanja ili bolesti, kao što su: inflamatorni bol, post-operativni incizioni bol, kompleksni regionalni bolni sindrom, primarni ili metastatski koštani kancerski boi, neuropatski bol, bol zbog preloma, bol zbog osteoporozne frakture, bol nastao zbog opekotina, osteoporoze, bol zbog zglobnog gihta, bolovi povezani sa krizama bolesti srpastih ćelija, i drugi nociceptični bolovi, kao i hepatocelularni karcinom, rak dojke i ciroza jetre, putem primene inhibitora NGF-a, kao što je antitelo ili fragment antitela pronalaska, kao pojedinačnog agensa, ili sa drugim terapeutskim sredstvom. U poželjnim ostvarenjima poželjno lečeni neuropatski bol je neuralgija koja se odnosi na trigeminus, post-herpesna neuralgija, fantomska bol u nepostojećem ekstremitetu, fibromijalgija, refleksna simpatička distrofija i neurogena bolna stanja. Drugo terapeutsko sredstvo može biti: inhibitor interleukina-1 (IL-1), na primer, fuzioni protein kao što je onaj koji je opisan u U.S. 6,927,044; ili antiepileptični lek, kao što je gabapentain, pregabalin, topiramat; ili triciklični antidepresiv, kao što je amitriptilin; celekoksib; antagonist citokina, kao što je antagonist protein ili antitelo prema IL-1, IL-6, IL-6R, IL-18 ili IL-18R. Drugo terapeutsko sredstvo može biti neurotrofin, na primer, NT-3.

Pronalazak isto tako obezbeđuje antitelo ili antigen-vezujući fragment, kako je prethodno opisano, za korišćenje da bi se ublažila ili sprečila NGF-om posredovana bolest ili stanje kod ljudi. NGF-om posredovano stanje ili bolest sprečava se bez značajnog narušavanja motorne koordinacije, a odabrano je od: inflamatornog bola, post-operativnog incizionog bola, neuropatskog bola, bola zbog preloma, bola zbog zglobnog gihta, post-herpesne neuralgije, bola proisteklog od opekotina, kancerskog bola, bola osteoartritisa ili reumatoidnog artritisa, išijasnog bola, bola povezanog sa krizama bolesti srpastih ćelija ili post-herpesne neuralgije.

U srodnom aspektu, pronalazak obezbeđuje korišćenje antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela, kako je prethodno opisano, u proizvodnji leka koji bi se koristio za ublažavanje ili inhibiranje NGF-om posredovane bolesti ili stanja kod ljudi, kao što su prethodno navedene.

Drugi ciljevi i prednosti će postati jasniji iz prikaza detaljnog opisa koji sledi. DETALJNI OPIS

Treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na pojedine opisane postupke i eksperimentalne uslove, budući da takvi postupci i uslovi mogu varirati. Isto tako se podrazumeva da je ovde korišćena terminologija data samo u svrhu opisivanja određenih ostvarenja, bez namere da bude ograničavajuća, dok će okvir tekućeg pronalaska biti ograničen jedino priključenim patentnim zahtevima.

Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao što ih obično razume lice uobičajene stručnosti u ovoj oblasti kome ovaj pronalazak i pripada. Premda bilo koji postupci i materijali, koji su slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani, mogu biti korišćeni pri praktičnoj primeni ili testiranju ovog pronalaska, ovde su opisani poželjni postupci i materijali.

Definicije

Naziv "human nervni faktor rasta" ili "NGF", kako je ovde korišćen, odnosi se na humani NGF koji poseduje sekvencu nukleinske kiseline, prikazanu u SEQ ID NO:1 i aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, ili njegov biološki aktivan fragment.

Naziv "antitelo", kako je ovde korišćen, određen je kako bi se odnosio na imunoglobulinske molekule, koji su sastavljeni od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac je sastavljen od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde u vidu skraćenice kao HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca je sastavljen od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac je sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde u vidu skraćenice kao LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca je sastavljen od jednog domena, CL. VH i VL regioni mogu, dalje, biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regionima koji određuju komplementarnost (CDR), koji su isprepleteni sa regionima koji su mnogo očuvaniji, a nazivaju se regionima okvira (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, koji su od amino-kraja do karboksi-kraja raspoređeni u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Naziv "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "deo antitela" ili "fragment antitela"), kako je ovde korišćen, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (npr., NGF). Pokazalo se da antigen-vezujuća funkcija antitela može biti izvršena preko fragmenata antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata, koji su obuhvaćeni izrazom "antigen-vezujući deo" antitela obuhvataju: (i) Fab fragment, monovalentni fragment, sastavljen od VL, VH, CL i CH1 domena; (ii) F(ab’)2 fragment, dvovalentni fragment, koji je sastavljen od dva Fab fragmenta, spojena disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment, sastavljen od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment, koji je sastavljen od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAt fragment (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), koji je sačinjen od VH domena; i (vi) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR). Pored toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani od strane zasebnih gena, oni se mogu spojiti korišćenjem rekombinantnih postupaka, uz pomoć sintetskog linkera koji omogućuje da budu izgrađeni kao jedan proteinski lanac u kome su VL i VH regioni spareni, kako bi obrazovali monovalentne molekule (poznati kao jednolančani Fv (scFv); vidi npr., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Utvrđeno je, isto tako, da su takva jednolačana antitela obuhvaćena unutar okvira izraza "antigen vezujući deo" antitela. Drugi oblici jednolančanih antitela, kao što su diatela, takođe su uključeni. Diatela su dvovalentna, bispecifična antitela u kojima su VH i VL domeni ekspresovani na jednom polipeptidnom lancu, ali uz korišćenje linkera koji je prekratak da bi omogućio sparivanje između dva domena na istom lancu, prisiljavajući, na taj način, domene da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i kreiraju dva položaja za vezivanje antigena (vidi npr., Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Pored toga, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo može biti deo većih imunoadhezivnih molekula, koji se obrazuju kovalentnim ili nekovalentnim povezivanjem antitela ili dela antitela sa jednim ili više drugih proteina ili peptida. Primeri takvih imunoadhezivnih molekula uključuju korišćenje streptavidinskog središnjeg regiona za izradu tetramernog scFv molekula (Kipriyanov et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) i korišćenje cisteinskog ostatka, marker peptida i C-terminalnog polihistidinskog priveska za izradu dvovalentnih i biotinilizovanih scFv molekula (Kipriyanov et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047- 1058). Delovi antitela, kao što su Fab i F(ab’)2 fragmenti, mogu biti izrađeni iz celih antitela korišćenjem konvencionalnih tehnika, kao što su papainska, odnosno pepsinska digestija celih antitela. Osim toga, antitela, delovi antitela i imunoadhezivni molekuli mogu biti dobijeni korišćenjem standardnih rekombinantnih DNK tehnika, kao što su ovde opisane.

Naziv "humano antitelo", kako je ovde korišćen, utvrđen je kako bi uključio antitela koja poseduju varijabilne i konstantne regione, koji su dobijeni iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. Humana antitela pronalaska mogu uključiti aminokiselinske ostatake koji nisu kodirani od strane imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije (npr., mutacije koje su uvedene posredstvom nasumične mutageneze ili mutageneze specifične u odnosu na položaj in vitro ili posredstvom somatske mutacije in vivo), na primer u CDR-ima, a posebno CDR3. Međutim, nije utvrđeno da naziv "humano antitelo", kako je ovde korišćen, obuhvata antitela u kojima su CDR sekvence, dobijene iz germinativne linije druge vrste sisara, kao što je miš, bile nanesene kao graft na sekvence humanog kostura.

Naziv "rekombinantno humano antitelo", kako je ovde korišćen, utvrđen je kako bi se uključila sva humana antitela koja su pripremljena, ekspresovana, kreirana ili izolovana na rekombinantne načine, kao što su antitela koja su ekspresovana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora, koji je transfektovan u ćeliju domaćina (opisana dalje u nastavku), antitela koja su izolovana iz biblioteke rekombinantnih, kombinatornih humanih antitela (opisana dalje u nastavku), antitela izolovana iz životinje (npr., miša), koja je transgenska za humane imunoglobulinske gene (vidi npr., Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ili antitela koja su izrađena, ekspresovana, kreirana ili izolovana bilo kojim drugim načinima, koji obuhvataju spajanje genskih sekvenci humanih imunoglobulina sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna humana antitela poseduju varijabilne i konstantne regione, dobijene iz imunoglobulinskih sekvenci humane germinativne linije. U određenim ostvarenjima, međutim, takva rekombinantna humana antitela su podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada je korišćena životinja koja je transgenska za humane Ig sekvence, in vivo somatskoj mutagenezi), tako da su aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela sekvence koje, budući da su dobijene ili su srodna VH i VL sekvenci humane germinativne linije, mogu postojati prirodno unutar repertoara humanih antitela germinativne linije in vivo.

"Izolovano antitelo", kako je ovde korišćeno, utvrđeno je da bi se odnosilo na antitelo koje je u suštini oslobođeno prisustva drugih antitela, koja poseduju različite antigene specifičnosti (npr., izolovano antitelo koje specifično vezuje NGF je suštinski oslobođeno antitela koja se specifično vezuju za druge antigene, koji nisu NGF). Izolovano antitelo, koje specifično vezuje NGF, može, međutim, ispoljavati unakrsnu reaktivnost sa drugim antigenima, kao što su molekuli NGF-a drugih vrsta. Pored toga, izolovano antitelo može biti u suštini bez prisustva drugih ćelijskih materijala i/ili hemikalija.

"Neutrališuće antitelo", kako je ovde korišćeno (ili "antitelo koje neutrališe aktivnost NGF-a"), određeno je kako bi se odnosilo na antitelo čije vezivanje za NGF dovodi do inhibicije biološke aktivnosti NGF-a. Ova inhibicija biološke aktivnosti NGF-a može biti procenjena merenjem jednog ili više indikatora biološke aktivnosti NGF-a, kao što je ćelijska aktivacija indukovana preko NGF-a i vezivanje NGF-a za NGF receptor. Ovi indikatori biološke aktivnosti NGF-a mogu se utvrditi uz pomoć jednog ili više od nekolicine standardnih in vitro ili in vivo testova, poznatih u struci (vidi primere u nastavku).

"CDR” ili region koji određuje komplementarnost jeste region hipervarijabilnosti, koji je isprepleten sa regionima koji su očuvaniji, koji se nazivaju "regioni kostura". Grupa CDR-a se može definisati kao aminokiselinska konsenzus sekvenca.

Naziv "površinska plazmon rezonanca", kako je ovde korišćen, odnosi se na optički fenomen koji omogućuje analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu, putem određivanja promena koncentracija proteina unutar biosenzornog matriksa, koristeći, na primer, BIACORE™ sistem (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švedska i Piscataway, N.J.).

Naziv "Kd", kako je ovde korišćen, utvrđen je kako bi se odnosio na konstantu ravnoteže disocijacije pojedine interakcije antitelo-antigen.

Naziv Dizolovani molekul nukleinske kiseline", kako je ovde korišćen u odnosu na nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili delove antitela (npr., VH, VL, CDR3), koji vezuju NGF, određen je kako bi se odnosio na molekul nukleinske kiseline u kome su nukleotidne sekvence koje kodiraju antitelo ili deo antitela oslobođene prisustva drugih nukleotidnih sekvenci koje kodiraju antitela ili delove antitela koji vezuju antigene koji nisu NGF, pri čemu druge sekvence mogu prirodno zaposedati nukleinsku kiselinu u humanoj genomskoj DNK. Tako, primera radi, izolovana nukleinska kiselina pronalaska koja kodira VH region anti-NGF antitela ne sadrži druge sekvence koje kodiraju druge VH regione, koji vezuju antigene koji se razlikuju od humanog NGF-a.

Naziv "epitop" obuhvata bilo koju determinantu, poželjno polipeptidnu determinantu, koja je u stanju da se specifično vezuje sa imunoglobulinom ili T-ćelijskim receptorom. U određenim ostvarenjima, determinante epitopa uključuju hemijski aktivne površinske grupacije molekula, kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosfori! grupe ili sulfonil grupe, a u određenim ostvarenjima, mogu imati specifične tro-dimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop je region antigena koji se vezuje od strane antitela. U određenim ostvarenjima, navedeno je da antitelo specifično vezuje antigen kada ono prvenstveno prepoznaje svoj ciljani antigen u kompleksnoj mešavini proteina i/ili makromolekula. U poželjnim ostvarenjima, navedeno je da antitelo specifično vezuje antigen kada je konstanta ravnoteže disocijacije manja ili jednaka 10'8 M, poželjnije kada je konstanta ravnoteže disocijacije manja ili jednaka 10‘9 M, a najpoželjnije kada je konstanta disocijacije manja ili jednaka 10'1° M.

Naziv "suštinski identitet" ili "suštinski identičan", kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, označava da, kada se optimalno poslože sa pogodnim nukleotidnim umecima ili delecijama, sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identičnost nukleotidne sekvence u najmanje oko 90%, a još poželjnije najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% nukleotidnih baza, kako je utvrđeno bilo kojim dobro-poznatim algoritmom identiteta sekvenci, kao što su FASTA, BLAST ili GAP, kako je razmotreno u nastavku.

Kada se primenjuje na polipeptide, izraz "suštinska sličnost" ili "suštinski sličan" znači da dve peptidne sekvence, kada se optimalno poslože, kao na primer pomoću programa GAP ili BESTFIT, koristeći zadate težine šupljina, dele najmanje 90% identiteta sekvence, a čak još poželjnije najmanje 95%, 98% ili 99% identiteta sekvenci. Poželjno, pozicije ostataka koji nisu identični razlikuju se prema konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama. "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupa) sa sličnim hemijskim karakteristikama (npr., naelektrisanje ili hidrofobičnost). Uopšteno, konzervativna aminokiselinska supstitucija neće suštinski izmeniti funkcionalne karakteristike proteina. U slučajevima kada se dve ili više aminokiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge po konzervativnim supstitucijama, procenat ili stepen sličnosti može biti podešen naviše da bi se korigovala konzervativna priroda supstitucije. Načini izvođenja ovog podešavanja dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Vidi, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim karakteristikama obuhvataju 1) alifatske bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatsko- hidroksilne bočne lance: serine i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazične bočne lance: lizin, arginin i histidin; 6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promena koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 log- verovatnoća matriksu, koji su izložili Gonnet i saradnici (1992) Science 256: 1443 45. "Umereno konzervativna" zamena je bilo koja izmena koja ima vrednost koja nije negativna u PAM250 log- verovatnoća matriksu.

Sličnost sekvenci za polipeptide obično se utvrđuje korišćenjem softvera za analizu sekvenci. Softver za analizu proteina slaže slične sekvence korišćenjem merenja sličnosti, koje se pripisuju raznim supstitucijama, delecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne aminokiselinske supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe, kao što su GAP i BESTFIT, koji se mogu koristiti sa zadatim parametrima, da bi se utvrdila homolognost sekvenci ili identitet sekvenci između blisko srodnih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog muteina. Vidi, npr., GCG verzija 6.1. Polipeptidne sekvence, takođe, mogu biti upoređene korišćenjem FASTA programa sa zadatim ili preporučenim parametrima; program u GCG verzija 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnavanja i pruža procenat identičnosti sekvenci regiona najboljeg preklapanja između ispitivanih i pretraženih sekvenci (Pearson (2000) supra). Drugi poželjan algoritam kada se sekvenca pronalaska upoređuje sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama jeste kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, uz korišćenje zadatih parametara. Vidi, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 i Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.

Izrada humanih antitela

Postupci za proizvodnju humanih antitela obuhvataju, na primer, VELOCIMMUNE™, XENOMOUSE™ tehnologiju (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21), "minilokus" pristup i izloženost faga. VELOCIMMUNE™ tehnologija (US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals) obuhvata postupak proizvodnje potpuno humanog antitela visoke specifičnosti prema odabranom antigenu. Ova tehnologija uključuje stvaranje transgenskog miša, koji poseduje genom, koji sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca čoveka, koji su operativno povezani na endogene lokuse konstantnog regiona miša, tako da miš, u odgovoru na antigenu stimulaciju, proizvodi antitelo koje sadrži humani varijabilni region i mišji konstantni region. DNK, koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela, izoluje se i operativno povezuje na DNK, koja kodira konstantne regione humanih teških i lakih lanaca. DNK se, nakon toga, ekspresuje u ćeliji koja je u stanju da ekspresuje potpuno humano antitelo. U specifičnom ostvarenju, ćelija je CHO ćelija.

Antitela mogu biti terapeutski korisna u blokadi interakcije ligand-receptor ili inhibiciji interakcije receptorske komponente, pre nego u uništavanju ćelija putem fiksacije komplementa i učestvovanja u komplement-zavisnoj citotoksičnosti (CDC), ili uništavanju ćelija posredstvom antitelo-zavisne ćelijski-posredovane citotoksičnosti (ADCC). Konstantni region antitela je, tako, od značaja za sposobnost antitela da fiksira komplement i posreduje u ćelijski zavisnoj citotoksičnosti. Stoga se izotip antitela može odabrati na osnovu toga da li je poželjno da antitelo posreduje u citotoksičnosti.

Humani imunoglobulini mogu postojati u dva oblika koja su povezana sa heterogenošću zgloba. U jednom obliku, imunoglobulinski molekul sadrži stabilnu četvoro- lančanu konstrukciju od približno 150-160 kDa, u kojoj se dimeri drže zajedno uz pomoć unutarlančane disulfidne veze teškog lanca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani preko unutar-lančanih disulfidnih veza, i obrazovan je molekul od približno 75-80 kDa, koji je sastavljen od kovalentno kuplovanog lakog i teškog lanca (polu-antitelo). Ovi oblici su bili izuzetno teški za razdvajanje, čak i nakon afinitetnog prečišćavanja.

Učestalost pojavljivanja drugog oblika u raznim izotipovima intaktnog IgG, posledica je, ali bez ograničavanja na njih, strukturnih razlika povezanih sa zglobnim regiona izotipa antitela. Pojedinačna aminokiselinske supstitucija u zglobnom regionu zgloba humanog lgG4 može značajno smanjiti pojavu drugog oblika (Angal et al. (1993) Molecular lmmunology 30:105) do nivoa koji se obično zapažaju kada se koristi zglob humanog lgG1. Tekući pronalazak obuhvata antitela koja poseduju jednu ili više mutacija u zglobu, CH2 ili CH3 regionu, što može biti poželjno, na primer, u proizvodnji, da bi se poboljšao prinos željenog oblika antitela.

Antitela pronalaska poželjno se izrađuju korišćenjem VELOCIMMUNE™ tehnologije. Izvršeno je stimulisanje transgenskog miša u kome su varijabilni regioni teškog i lakog lanca endogenih imunoglobulina zamenjeni odgovarajućim humanim varijabilnim regionima, sa antigenom od značaja, a iz miševa su su dobijene limfatične ćelije (kao što su B-ćelije) koje ekspresuju antitela. Limfatične ćelije se mogu spojiti sa ćelijskim nizom mijeloma, da bi se izradile obesmrćene ćelijske linije hibridoma, a takvi ćelijski nizovi hidridoma su ispitani i odabrani, da bi se identifikovale ćelijske linije hibridoma, koje proizvode antitela koja su specifična za antigen od značaja. DNK, koja kodira varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca može biti izolovana i povezana na željene izotipske konstantne regione teškog lanca i lakog lanca. Takav protein antitela može biti proizveden u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK, koja kodira antigen-specifična himerična antitela ili varijabilne domene lakih i teških lanaca može biti izolovana direktno iz antigen-specifičnih limfocita.

Uopšteno, antitela ovog pronalaska imaju veoma jake afinitete, posedujući obično KD od oko 10'10 sve do oko 10'12 M ili veću, na primer, najmanje110'10 M, najmanje 10‘11 M ili najmanje 1012 M, kada se mere posredstvom vezivanja za antigen, koji je imobilisan na čvrstoj fazi ili je u fazi rastvora.

U početku se izdvajaju himerična antitela visokog afiniteta, koja poseduju humani varijabilni region i mišji konstantni region. Kako je u nastavku opisano, izvršena je karakterizacija i odabiranje antitela prema željenim karakteristikama, koje uključuju afinitet, selektivnost, epitop, itd.. Mišji konstantni regioni su zamenjeni željenim humanim konstantnim regionima, da bi se proizvelo potpuno humano antitelo pronalaska, na primer, lgG1 ili lgG4 divljeg tipa ili modifikovani (na primer, SEQ ID NO:541, 542 ili 543). Dok odabrani konstantni region može varirati prema specifičnoj nameni, karakteristike vezivanja antigena sa visokim afinitetom i ciljane specifičnosti nalaze se u varijabilnom regionu.

Mapiranje epitopa i srodne tehnolofije

Da bi se ispitala antitela koja se vezuju za određeni epitop (npr., ona koja blokiraju vezivanje IgE na njegov visoko afinitetni receptor), može se izvesti rutinski test unakrsnog blokiranja, kao što je onaj koji su opisali Harlovv i Lane (1990) supra. Drugi postupci obuhvataju alaninsko skeniranje mutanata, peptidne blotove (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443- 63), ili analizu peptidnog cepanja. Pored toga, mogu se koristiti postupci, kao što je ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496).

Naziv "epitop" se odnosi na položaj na antigenu na koji odgovaraju B i/ili T ćelije. B- ćelijski epitopi mogu biti obrazovani iz susednih aminokiselina ili iz aminokiselina koje nisu susedne, koje se redaju tercijarnim savijanjem proteina. Epitopi, koji se obrazuju iz susednih aminokiselina, obično se održavaju kada se izlože denaturirajućim rastvaračima, dok se epitopi, koji se formiraju tercijarnim nadiranjem, obično gube tretmanom sa denaturirajućim rastvaračima. Epitop uobičajeno uključuje najmanje 3, još češće, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.

Modifikaciono-asistirano profiliranje (MAP), takođe poznato kao profiliranje antitela na osnovu strukture antigena (ASAP) jeste postupak koji vrši kategorizaciju velikog broja monoklonskih antitela (mAt), koja su usmerena prema istom antigenu, prema sličnostima profila vezivanja svakog antitela za hemijski ili enzimski modifikovane antigene površine (US 2004/0101920). Svaka kategorija može odražavati jedinstveni epitop, koji se ili jasno razlikuje ili se delimično preklapa sa epitopom koji je predstavljen u drugoj kategoriji. Ova tehnologija omogućuje brzo odvajanje genetski identičnih antitela, tako da ta karakterizacija može biti fokusirana na genetski zasebna antitela. Kada se primenjuje na ispitivanje hibridoma, MAP može olakšati identifikovanje retkih klonove hibridoma, koji proizvode mAt, koja poseduje željene karakteristike. MAP može biti korišćen za sortiranje anti-NGF antitela pronalaska u grupe antitela koja se vezuju za različite epitope.

Imunokonjugati

Pronalazak obuhvata humano anti-NGF monoklonsko antitelo, koje je konjugovano na terapeutski deo ("imunokonjugat"), kao što je citotoksin, hemoterapeutski lek, imunosupresivno sredstvo ili radioizotop. Citotoksična sredstva uključuju bilo koji agens koji je štetan za ćelije. Primeri pogodnih citotoksičnih sredstava i hemoterapeutskih agenasa za obrazovanje imunokonjugata poznati su u ovoj oblasti, vidi, na primer, WO 05/103081).

Bispecifičnosti

Antitela ovog pronalaska mogu biti monospecifična, bispecifična ili multispecifična. Multispecifična antitela mogu biti specifična za različite epitope jednog ciljanog polipeptida ili mogu sadržavati antigen-vezujuće domene, koji su specifični za više od jednog ciljanog polipeptida. Vidi, npr., Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69. Humana anti-NGF antitela mogu biti povezana ili ko-ekspresovana sa drugim funkcionalnim molekulom, npr., drugim peptidom ili proteinom. Na primer, antitelo ili njegov fragment može biti funkcionalno povezan (npr., posredstvom hemijskog kuplovanja, genetske fuzije, ne-kovalentnog povezivanja ili na drugi način) na jedan ili više drugih molekulskih entiteta, kao što su drugo antitelo ili fragment antitela, da bi se proizvelo bispecifično ili muitispecifično antiteio sa drugom specifičnošću vezivanja.

Terapeutska primena i formulacije

Pronalazak obezbeđuje terapeutske smeše koje sadrže anti-NGF antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente ovog pronalaska. Primena terapeutskih smeša u skladu sa pronalaskom biće izvršena sa pogodnim nosačima, ekscipijentima i drugim sredstvima, koja se ugrađuju u formulacije, da bi se obezbedio poboljšani transfer, oslobađanje, podnošenje i slično. Mnoštvo pogodnih formulacija može se naći u zbirci, poznatoj svim farmaceuskim hemičarima: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je LIPOFECTIN™), konjugate DNK, anhidrovane apsorptivne paste, emulzije ulje u vodi i emulzije voda u ulju, emulzije karbovoskova (polietilen glikoli raznih molekulskih težina), polu-čvrste gelove i polu-čvrste mešavine koje sadrže karbovosak. Vidi, takođe, Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.

Doza može varirati u zavisnosti od starosti i veličine ispitanika kome se primenjuje, ciljane bolesti, stanja, puta primene i sličnog. Kada se antitelo ovog pronalaska koristi za lečenje raznih stanja i bolesti, povezanih sa NGF, uključujući inflamatorni bol, neuropatski i/ili nociceptivni bol, hepatocelularni karcinom, rak dojke, cirozu jetre i slično, kod odraslog pacijenta, pogodno je da se antitelo ovog pronalaska primenjuje intravenski, uobičajeno u pojedinačnoj dozi od oko 0.01 do oko 20 mg/kg telesne težine, još poželjnije oko 0.02 do oko 7, oko 0.03 do oko 5 ili oko 0.05 do oko 3 mg/kg telesne težine, poželjno oko 0.1 do približno 10 mg/kg telesne težine, a još poželjnije oko 0.1 do oko 5 mg/kg telesne težine. U zavisnosti od ozbiljnosti stanja, učestalost i trajanje tretmana može se podešavati.

Poznati su razni sistemi oslobađanja, koji se mogu koristiti za primenu farmaceutske smeše pronalaska, npr., inkapsuliranje u liposomima, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije koje su u stanju da ekspresuju mutant viruse, receptorom posredovana endocitoza (vidi, npr., Wu et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Postupci unošenja uključuju, ali bez ograničavanja na njih, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenske, supkutane, intranazalne, epiduralne i oralne puteve. Smeša se može primenjivati bilo kojim pogodnim putem, na primer, putem infuzije ili bolus injekcije, posredstvom apsorpcije preko epitelnih ili mukokutanih podloga (npr., oralna mukoza, rektalna i intestinalna mukoza, itd.), a mogu se primenjivati zajedno sa drugim biološki aktivnim sredstvima. Primena može biti sistemska ili lokalna.

Farmaceutska smeša se, isto tako, može oslobađati u vezikuli, posebno liposomu (vidi Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) u Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez Berestein i Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365; Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; vidi uopšteno na istom mestu.

U određenim situacijama, farmaceutska smeša se može oslobađati putem sistema kontrolisanog oslobađanja. U jednom ostvarenju, može biti korišćena pumpa (vidi Langer, supra; Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201). U drugom ostvarenju, mogu se koristiti polimerni materijali (vidi Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974). U jednom drugom ostvarenju, sistem kontrolisanog oslobađanja može biti postavljen u blizini mesta ciljanog delovanja smeše, čime se zahteva samo frakcija sistemske doze (vidi, npr., Goodson, u Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138, 1984). Drugi sistemi kontrolisanog oslobađanja razmotreni su u prikazu Langera (1990) Science 249:1527-1533.

Injekcioni preparati mogu uključiti dozne oblike za intravenske, supkutane, intrakutane i intramuskularne injekcije, kapajuće infuzije, itd.. Ovi injekcioni preparati mogu biti pripremljeni opštepoznatim postupcima. Na primer, injekcioni preparati se mogu izraditi, npr., rastvaranjem, suspendovanjem ili emulgovanjem prethodno opisanog antitela ili njegove soli u sterilnom vodenom medijumu ili u uljnom medijumu, koji se uobičajeno koristi za injekcije. Kao vodeni medijum za injekcije koristi se, primera radi, fiziološki slani rastvor, izotonični rastvor koji sadrži glukozu i druga pomoćne sredstva, itd., koji mogu biti upotrebljeni u kombinaciji sa pogodnim agensom za solubilizaciju, kao što je alkohol (npr., etanol), polialkohol (npr., propilen glikol, polietilen glikol), ne-jonski surfaktant [npr., polisorbat 80, HCO-50 (polioksietilenski (50 mol) adukt hidrogenizovanog ricinusovog ulja)], itd.. Kao uljni medijum koristi se npr., susamovo ulje, sojino ulje, itd., koji se mogu koristiti u kombinaciji sa sredstvom za solubilizaciju, kao što je benzil benzoat, benzil alkohol, itd.. Tako pripremljena injekcija poželjno se puni u pogodnu ampulu.

Pogodno, farmaceutske smeše za oralno ili pare'nteralno korišćenje, koje su prethodno opisane, izrađuju se u doznim oblicima sa jedinicom doze, koja je pogodna za podešavanje doze aktivnih sastojaka. Takvi dozni oblici u jedinici doze obuhvataju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd.. Količina sadržanog antitela je obično oko 5 do 500 mg po doznom obliku u jedinici doze; u obliku injekcije, poželjno je da je antitelo sadržano u količini od oko 5 do 100 mg i od oko 10 do 250 mg za druge dozne oblike.

Pojedinačne i kombinovane terapije. Pronalazak obezbeđuje terapeutske postupke u kojima su antitelo ili fragment antitela pronalaska od koristi za lečenje bola, povezanog sa brojnim stanjima, koja uključuju NGF. Anti-NGF antitela ili fragmenti antitela pronalaska su posebno korisni za tretman bola, proisteklog iz bilo kog stanja, povezanog sa neurogenim, neuropatskim ili nociceptivnim bolom. U poželjnim ostvarenjima, poželjno lečeni neuropatski bol je neuralgija koja se odnosi na trigeminus, post-herpesna neuralgija, fantomski bol u nepostojećem ekstremitetu, fibromijalgija, refleksna simpatička distrofija i neurogena bolna stanja. U drugim poželjnim ostvarenjima, poželjno se leče kancerski bol, posebno koštani kancerski bol, bol osteoartritisa ili reumatoidnog artritisa, bol donjeg dela leđa, post-operativni incizioni bol, bol zbog preloma, bol zbog osteoporozne frakture, osteoporoza, bol zbog zglobnog gihta, dijabetesna neuropatija, išijas, bolovi povezani sa krizama bolesti srpastih ćelija, migrena i drugi neuropatski i/ili nociceptivni bol.

Ostale indikacije uključuju, na primer, lečenje raka dojke (Adriaenssens et al. (2008) Cancer Res 58:346-51). U specifičnim ostvarenjima terapeutskih postupaka pronalaska, ispitanik koji pati od bola u zglobu povezanog sa gihtom, lečen je kombinacijom antitela ili fragmenta antitela pronalaska i, opciono, sa drugim terapeutskim sredstvom. U jednom ostvarenju, drugo terapeutsko sredstvo je poželjno antagonist interleukina-1 (IL-1), kao što je rilonacept ("IL-1 trap"; Regeneron). Pogodna druga terapeutska sredstva mogu biti jedan ili više agenasa, odabranih iz grupe, koju sačinjavaju: rilonacept, anakinra (KINERET®, Amgen), rekombinantni, neglikozilovani oblik antagonista humanog IL-1 receptora (IL1 Ra), anti-IL-18 lek, kao što je IL-18BP ili derivat, IL-18 trap, ili antitelo, kao što je anti-IL-18, anti-IL-18R1, anti-IL- 18Racp, anti-IL-6 i/ili anti-IL6Ra antitelo. Ostale ko-terapije, koje se mogu kombinovati sa NGF antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, samim ili u kombinaciji sa antagonistom IL-1, obuhvataju malu dozu kolhina, aspirina ili drugih NSAlL-a, steroide, kao što je prednizolon, metotreksat, malu dozu ciklosporina A, inhibitore TNF, kao što je ENBREL® ili HUMIRA®, druge inflamatorne inhibitore, kao što su inhibitori kaspaze-1, p38, IKK1/2, CTLA-4lg, itd., i/ili ko- terapije, kao što su inhibitori sinteze mokraćne kiseline, da bi se sprečilo akumuliranje mokraćne kiseline u organizmu, na primer, alopurinol, promoteri ekskrecije mokraćne kiseline, da bi se ubrzala rapidna ekskrecija mokraćne kiseline, akumulirane u organizmu, na primer, probenecid, sulfinpirazon i/ili benzbromaron su primeri sredstava za poticanje ekskrecije mokraćne kiseline;

kortikosteroide; ne-steroidne antiinflamatorne lekove (NSAlL-i), anti-epileptične lekove, kao što je topiramat; gabapentin, pregabablin; celekoksib; iii neurotrofin, kao što je NT-3.

PRIMERI

Primeri koji slede dati su stoga da bi se licu uobičajene stručnosti u ovoj oblasti pružilo potpuno izlaganje i opis kako da se izrade i koriste postupci i smeše pronalaska, i nije im namera da ograničavaju okvir onog što pronalazači smatraju kao svoj pronalazak. Učinjeni su napori da se obezbedi tačnost u odnosu na korišćene brojčane vrednosti (npr., količine, temperatura, itd.), ali bi se trebalo računati sa nekim eksperimentalnim greškama i odstupanjima. Ukoliko nije drugačije naznačeno, delovi su delovi po težini, molekulska težina je srednja molekulska težina, temperatura je u stupnjevima Celzijusa, a pritisak je atmosferski ili blizu atmosferskog pritiska. Statističke analize su izvedene prema mešanim Factorial ANOVA testovima sa Bondferroni post hoc ili Turkey HSD post hoc testovima.

Primer 1. Imunizacija i proizvodnja antitela

Imunizacija glodara vršena je bilo kojim postupcima, koji su poznati u struci (vidi, na primer, Harlovv i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual: Cold Spring Harbor Press, New York; Malik i Lillehoj, Antibody techniques: Academic Press, San Diego). U poželjnom ostvarenju, humani NGF protein se primenjuje direktno miševima koji imaju lokuse DNK, koji kodiraju i varijabilni region teškog lanca humanog Ig i varijabilni region kapa lakog lanca (VELOCIMMUNE™, Regeneron; US 6,596,541), sa adjuvansom, da bi se stimulisao imuni odgovor. Takav adjuvans uključuje kompletni i nekompletni Freundov adjuvans, adjuvantni sistem MPL+TDM (Sigma) ili RIBI (muramil dipeptidi) (vidi O’Hagan, Vaccine Adjuvant, Human Press, 2000, Totavva, NJ). Takav adjuvans može sprečiti brzu disperziju polipeptida sekvestracijom antigena u lokalnom depou, i može da sadrži faktore koji mogu stimulisati imuni odgovor domaćina. U jednom ostvarenju, NGF se primenjuje indirektno kao DNK plazmid, koji sadrži NGF gen i ekspresuje NGF, koristeći ekspresionu mašineriju celularnih proteina domaćina, da bi se polipeptid antigena proizveo irt vivo. U oba pristupa, da bi se postigli optimalni anti-antigeni odgovori, miševima su davane "boost" injekcije svake 3~4 nedelje, a uzorci seruma su sakupljani 10 dana nakon svake injekcije. Imuni odgovor antitelima je praćen korišćenjem standardnih ELISA postupaka sa direktnim vezivanjem antigena. "Post-boost" uzorci seruma u serijskim 3-strukim razblaženjima postavljeni su na ploče obložene sa NGF- om. Titar seruma se definiše kao razblaženje uzorka seruma, kojim se dobija signal, koji je dvostruko veći od pozadinskog signala u testu. Životinje sa optimalnim odgovorima primaju završnu "boost" dozu putem intravenskih i intra-peritonealnih injekcija, bez adjuvansa 3~4 dana pre žrtvovanja životinje. Skupljeni splenociti su obrađeni kao što je u nastavku opisano, da bi se dobila antigen-specifična monoklonska antitela.

Primer 2. Izolovanje monoklonskog antitela

U jednom ostvarenju, B ćelije koje ekspresuju antitelo spojene su sa ćelijama mišjeg mijeloma, da bi se obrazovale ćelije hibridoma. Hibridne ćelije su postavljene na ploče sa 96 reakcionih čašica, pod HAT selekcijom i ostavljene su da rastu tokom 10 do 20 dana. Kondicionirani medijumi iz reakcionih čašica sa rastućim ćelijama hibridoma ispitani su na antigeno vezivanje i aktivnosti blokiranja receptora, kao što je opisano u nastavku. Ćelije hibridoma koje ekspresuju antitela od značaja sub-klonirane su na pojedinačne ćelije korišćenjem protočne citometrije, a geni VH i VL iz hibridoma ćelija klonova su klonirani i sekvencirani. Proteini antitela su, isto tako prečišćeni iz kultura antigen specifičnih hibridoma koristeći medijum bez IgG (Invitrogen) i okarakterisani su kao što je opisano u nastavku.

U drugom ostvarenju, antigen specifična antitela su izolovana direktno iz antigen- pozitivnih B ćelija, bez potrebe da se učine besmrtnim sa specifičnim ćelijama mijeloma, i razvijena je domaćinska CHO ćelija koja proizvodi stabilno rekombinantno antitelo, kao što je opisano u USSN 11/809,482 (US patentna publikacija No. 2007/0280945).

Primer 3. Primarni skrining vezivanja antigena i blokiranja receptora

Da bi se identifikovali hibridomi koji proizvode antigen-specifično antitelo, uzeti su uzorci kondicioniranih medijuma iz ploča za kultivaciju sa 96 reakcionih čašica 10 do 20 dana nakon fuzije, a specifičnost vezivanja antigena utvrđena je korišćenjem ELISA testa direktnog vezivanja sa visokim protokom. Ukratko, kondicionirani medijumi sa razblaženjima od 1:10 i 1:100 ostavljeni su da se izvrši vezivanje za MAXISORB™ ploče presvučene rekombinantnim NGF proteinom (Nunc) u koncentraciji od 100 ng po reakcionoj čašici. Antitela, vezana na ploču, detektovana su korišćenjem kozjeg anti-mišjeg IgG Fcy specifičnog poliklonskog antitela konjugovanog sa HRP-om (Jackson Immuno Lab). Reakcije na pločama su razvijene korišćenjem TMB supstrata (BD Pharmigen) i beležena je optička gustina OD450 nm- Paralelno, uzorci sa istim razblaženjima postavljeni su na ploče presvučene streptavidinom sa biotinom obeleženim NGF-om, i detektovana su antitela vezana na ploču. Reakcione čašice koje pokazuju aktivnost vezivanja za jednu od ploča odabrane su za širenje ćelijske kulture i krio- prezervaciju, a supernatanti koji sadrže antitelo korišćeni su za dalje ispitivanje, da bi se dobio profil specifičnosti, afiniteta i funkcionalnosti.

Pored skrininga direktnog vezivanja antigena, takođe je korišćeno funkcionalno skriniranje, da bi se identifikovali klonovi koji sekretuju antitelo sa željenim karakteristikama. Maxisorb ploče su presvučena sa 100 ng po reakcionoj čašici rekombinantnog humanog TrkA- hFc, preko noći, na 4°C. Kondicionirani medijumi sa razblaženjima 1:2 i 1:10 ostavljeni su da bi se izvršilo vezivanje sa 2 ng/ml biotin-NGF-a u rastvoru, tokom 1 sata pre prenošenja na ploče obložene sa TrkA-hFc da bi se izvelo merenje biotin-NGF-a vezanog za ploču. Biotin-NGF vezan za ploču detektovan je korišćenjem HRP-a konjugovanog sa streptavidinom (Pierce), a reakcija je razvijena korišćenjem TMB supstrata (BD Pharmingen) i zabeležena je optička gustina. Hibridomi, u kojima su medijumi za kultivaciju sprečavali vezivanje biotin NGF-a za TrkA-hFc identifikovani su kao potencijalni blokatori i dalje su karakterisani.

Slična in vitro ispitivanja su primenjena na ploču sa 96 reakcionih čašica sa kondicioniranim medijumom iz CHO ćelija, koje su transfektovane sa potpuno humanim IgG, koji sadrži V gene, koji su izolovani direktno iz antigen-pozitivnih B ćelija. Pored toga, uzorci su ispitani na aktivnost vezivanja NGF-a, korišćenjem LUMINEX™ zrnaca, presvučenih antigenom, na kojima je antigen-specifično vezano antitelo detektovano korišćenjem PE-konjugovanih kozjih anti-humanih IgG FcY-specifičnih poliklonskih antitela. Antitela koja vezuju antigen podvrgnuta su merenju afiniteta korišćenjem BIACORE™. Ukratko, antitela iz supernatanata sirove kulture su vezana na površinu hFc specifičnog poliklonskog antitela kuplovanog sa aminom. Praćeno je vezivanje antigena u pojedinačnoj koncentraciji. Model 1:1 bimolekularne interakcije korišćen je za podešavanje senzograma vezivanja, da bi se utvrdili afiniteti vezivanja antigena (Ko), koristeći konstante kinetičke brzine ka i kd za svaku interakciju antitela pod identičnim uslovima. Specifično, kozja anti-humana IgG FcY-specifična poliklonska antitela su kovalentno kuplovana na površine CM-5 čipa, a CHO supernatanti koji sadrže antitelo su injicirani brzinom 1 ^l/min tokom 5 minuta, nakon čega je sledilo ispiranje puferom. Humani NGF (25 nM) je injiciran tokom 3 minuta, da bi se omogućilo da se NGF vezuje na imobilisanu površinu humanog antitela. Odmah nakon injiciranja NGF-a, na površine je injiciran pufer brzinom 100 nl/min tokom ~ 10 minuta i beleženo je opadanje RU signala. Površine su regenerisane, kako bi se odstranilo vezano antitelo i NGF, a ciklus je ponovljen sa narednim uzorkom CHO supernatanta.

Primer 4. Određivanje afiniteta vezivanja antigena

Antigen-vezujući afiniteti antitela za humani NGF određeni su uz pomoć površinske kinetike, koristeći biosenzorski test površinske plazmon rezonance u realnom vremenu (BIACORE™). Antitela su prihvaćena na površini kozjih, anti-humanih ili anti-mišjih IgG poliklonskih antitela, koja je obrazovana direktnim aminskim kuplovanjem prihvaćenog antitela na BIACORE™ čip. Razne koncentracije humanog NGF su injicirane preko površina pričvršćenog antitela, dok je vezanost antigena za antitelo i disocijacija vezanog kompleksa praćena u realnom vremenu. Kinetička analiza je izvršena da bi se dobila konstanta ravnoteže disocijacije (KD) i konstanta brzine disocijacije, a ova poslednja je korišćena za izračunavanje ti/2 disocijacije kompleksa antigen/antitelo (Tabela 1). Kao kontrola je korišćeno humanizovano anti-humano NGF monoklonsko antitelo E3 ("RN624") (tanezumab; CAS registarski broj 880266-57-9; US patentna publikacija 2004/0237124).

Antigen-vezujući afiniteti odabranih prečišćenih antitela za NGF, takođe su utvrđeni uz pomoć površinske kinetike, koristeći biosenzorski test površinske plazmon rezonance u realnom vremenu (BIACORE™), kako je prethodno opisan. Zbog praktičnosti, antitelo 301272- 3H10-A10 je preimenovano u "REGN261" (HCVR/LCVR SEQ ID NO-i:84/92 i hlgG1 SEQ ID NO:541); 301272-6E07-D10 je preimenovano u "REGN263" (HCVR/LCVR SEQ ID

NO:208/216 i hlgG1 SEQ ID NO:541). Testirana dobijena antitela su uključivala: REGN472 (HCVR/LCVR SEQ ID N0:100/102 i hlgG1 SEQ ID NO:541), REGN474 (HCVR/LCVR SEQ ID NO: 100/102 i mutant hlgG4 SEQ ID NO:543), REGN475 (HCVR/LCVR SEQ ID NO:108/110 i mutant hlgG4 SEQ ID NO:543), REGN476 (HCVR/LCVR SEQ ID NO:224/226 i mutant hlgG4 SEQ ID NO:543) i REGN477 (HCVR/LCVR SEQ ID NO:232/234 i mutant hlgG4 SEQ ID NO:543).

Primer 5. Unakrsna reaktivnost sa neurotrofinom-3 (NT-3)

NGF i NT-3 pripadaju familiji nervnih faktora rasta i predstavljaju male, bazne, sekretome proteine, koji omogućuju preživljavanje specifičnih populacija neurona. Premda ova dva neurotrofina dele iste aminokiselinske identitete, biološke funkcije im mogu varirati (Barde et al. 1990 Prog Growth Factor Res 2(4):237-48).

Anti-NGF antitelima je ispitana unakrsna reaktivnost vezivanja sa humanim NT-3. Ukratko, kozje anti-humano IgG poliklonsko antitelo je hemijski vezano na CM5 čip. Anti-NGF monoklonska antitela su injicirana, uz formiranje površine od oko 50 do 900 RU imobiliziranih antitela posredstvom interakcije sa poliklonskim antitelima kuplovanim na čip. Preko površine je injiciran protein NGF ili NT-3 u koncentraciji od 20 nM, nakon čega je sledilo ispiranje puferom, da bi se omogućilo da vezani ligand disocira. I faza vezivanja i faza disocijacije su praćene, a podaci su analizirani. Rezultati su prikazani u Tabeli 3 (NB = nije zapažena aktivnost vezivanja). Za razliku od kontrolnog antitela (RN624), sva testirana antitela su pokazivala nedetektibilno vezivanje za NT-3, čime se ukazuje na visok stepen antigene specifičnosti u odnosu na kontrolno antitelo.

Claims (15)

1.Humano antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela, koji specifično vezuje humani nervni faktor rasta (NGF) sa KD od 1 pM ili manje, kako je izmereno uz pomoć površinske plazmon rezonance, pri čemu antitelo ili fragment antitela sadrži (a)region koji određuje komplementarnost teškog lanca 3 (HCDR3) i CDR3 lakog lanca (LCDR3), pri čemu HCDR3 i LCDR3 sadrže aminikiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:90, odnosno 98, i (b)HCDR1, HCDR2, LCDR1 i LCDR2, pri čemu: HCDR1 je SEQ ID NO:86, HCDR2 je SEQ ID NO:88, LCDR1 je SEQ ID NO:94 i LCDR2 je SEQ ID NO:96.

2.Humano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, koji specifično vezuje humani NGF sa Kd od 0.5 pM ili manje.

3.Humano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu navedeno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadrži varijabilni region teškog lanca (HCVR) i varijabilni region lakog lanca (LCVR), pri čemu HCVR i LCVR sadrže aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:108, odnosno 110.

4.Humano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema zahtevu 1, 2 ili 3, koji vezuje humani NGF sa Kd koja je približno 2 do približno 10-puta veća nego kada antitelo ili fragment vezuje NGF pacova i miša.

5.Molekul nukleinske kiseline, koji kodira humano antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4.

6.Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu iz zahteva 5.

7.Postupak proizvodnje antitela prema humanom NGF-u ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela koji obuhvata korake uvođenja ekspresionog vektora iz zahteva 6 u izolovanu ćeliju domaćina, uzgoj ćelije pod uslovima koji omogućuju proizvodnju antitela ili fragmenta antitela, i dobijanje tako proizvedenog antitela ili fragmenta antitela, pri čemu je poželjno ćelija domaćina ćelija E. coli, CHO ćelija ili COS ćelija.

8.Farmaceutska smeša koja sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 4 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

9.Farmaceutska smeša prema zahtevu 8 koja dalje sadrži drugo terapeutsko sredstvo odabrano od: inhibitora interleukina-1 (IL-1), antiepileptičnog leka, antagonista citokina i neurotrofina.

10.Antitelo ili antigen-vezujući fragment antitetla prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za korišćenje u postupku ublažavanja ili inhibiranja NGF-om posredovane bolesti ili stanja kod čoveka, koje su odabrane od: inflamatornog bola, post-operativnog incizionog bola, neuropatskog bola, bola zbog preloma, bola zbog zglobnog gihta, post-herpesne neuralgije, bola proisteklog od opekotina, kancerskog bola, bola osteoartritisa ili reumatoidnog artritisa, išijasnog bola, bola povezanog sa krizama bolesti srpastih ćelija ili post-herpesne neuralgije.

11.Korišćenje antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 4 u proizvodnji leka za korišćenje u postupku ublažavanja ili inhibiranja NGF-om posredovane bolesti ili stanja kod čoveka, koje su odabrane od: inflamatornog bola, post-operativnog incizionog bola, neuropatskog bola, bola zbog preloma, bola zbog zglobnog gihta, post- herpesne neuralgije, bola proisteklog od opekotina, kancerskog bola, bola osteoartritisa ili reumatoidnog artritisa, išijasnog bola, bola povezanog sa krizama bolesti srpastih ćelija ili post- herpesne neuralgije.

12.Antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 4 za korišćenje prema zahtevu 10, pri čemu navedeni postupak obuhvata primenu prvog i drugog terapeutskog sredstva humanom ispitaniku kome je to potrebno, pri čemu je prvo terapeutsko sredstvo navedeno antitelo ili antigen-vezujući fragment, i pri čemu je poželjno drugo terapeutsko sredstvo: inhibitor interleukina-1 (IL-1), antiepileptični lek, antagonist citokina ili neurotrofin.

13.Korišćenje prema zahtevu 11 navedenog antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta iz bilo kog od zahteva 1 do 4, pri čemu navedeni postupak obuhvata primenu prvog i drugog terapeutskog sredstva humanom ispitaniku kome je to potrebno, pri čemu je prvo terapeutsko sredstvo navedeno antitelo ili antigen-vezujući fragment, i pri čemu je poželjno drugo terapeutsko sredstvo: inhibitor interleukina-1 (IL-1), antiepileptični lek, antagonist citokina ili neurotrofin.

14.Antitelo ili antigen vezujući fragment iz bilo kog od zahteva 1 do 4 za korišćenje prema zahtevu 10 ili 12, pri čemu su stanje ili bolest, koji su posredovani NGF-om, inhibirani bez značajnog narušavanja motorne koordinacije.

15.Korišćenje prema zahtevu 11 ili 13 navedenog antitela ili antigen vezujućeg fragmenta iz bilo kog od zahteva 1 do 4, pri čemu su stanje ili bolest, posredovani NGF-om, inhibirani bez značajnog narušavanja motorne koordinacije.