CN102265152A - 鉴定和选择用于组合药品的药物候选物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定和挑选具有或贡献功能性作用的化学实体的方法，用于发现和开发新的组合药物，其中两种或更多种化合物的组合一起显示协同作用。所述化合物可以是例如抗体，抗生素，抗癌剂，抗AIDS剂，抗生长因子，抗病毒剂，可溶性受体，细胞因子，RNAi′s，疫苗及其混合物。所述方法包含a)提供n种样品，每种都包括化学实体，b)将所述n种样品中的2种或更多种以所有可能的组合进行混合，c)对所述混合物进行功能性测定，以便鉴定贡献所述功能性作用的化学实体。在来自步骤c)的、贡献所述功能性作用的化学实体上重复步骤a-c。

Description

鉴定和选择用于组合药品的药物候选物
发明领域
本发明涉及用于鉴定和挑选具有或贡献功能性作用的化学实体的方法。这种鉴定和挑选可用于发现和开发新的组合药物，其中两种或更多种化合物的组合共同显示协同作用一起显示协同作用，例如用于鉴定可以引起改善的疾病治疗或预防的化学实体的组合。本发明还涉及用于鉴定和挑选化学实体间的最适化学计量比以获得显示最佳功效和效能的组合药物的方法。
发明背景
人的抗体应答本质上是多克隆的。尽管迄今为止开发和商品化的大部分重组抗体产物是单克隆抗体，但是近年来已经开了新类型的多克隆抗体产物。这些是包括结合相同或不同靶的两种或更多种抗体的重组抗体组合物，可以制备为重组单克隆抗体的“混合物(cocktails)”(其中每一种是单独制备的)，或单个批次中制备的重组多克隆抗体。后一方法由Wiberg等在Biotechnol.Bioeng.94：396-405(2006)中描述。Logtenberg(Trends inBiotechnology，25(9)：390-394，2007)综述了关于抗体组合或混合物的文献，描述了抗体混合物对众多靶的协同或叠加效应，包括病毒，可溶性分子诸如毒素或生长因子，和细胞结合分子诸如HER-2以及其他癌症相关的细胞表面分子。Logtenberg没有提供有关如何设计协同抗体组合的任何指导。
Bregenholt & Haurum(Expert Opin Biol Ther.2004Mar；4(3)：387-96)教导为了在大的群体中提供针对生物战剂(biowarfare agents)诸如病毒和细菌的广泛预防，病原体特异性的多克隆抗体理论上应当包括针对指定表型的大范围的反应性以防止微生物通过识别表位的突变逃脱中和抗体。
Bregenholt等(Curr Pharm Des.2006；12(16)：2007-2015)描述了设计病毒特异性多克隆抗体药物的指导。他们总结出应当选择抗体组分以覆盖尽可能宽的中和表位范围，并保持抗体组合物尽可能近似的模拟中和人免疫应答。
WO 2007/101441公开了一种重组多克隆抗RSV抗体。具体地，公开了一种针对G和F蛋白上多个表位的抗RSV重组多克隆抗体(rpAb)。优选的，属于保守组还可能属于亚型特异组和菌株特异组的G蛋白表位被抗RSV rpAb覆盖。
WO 2006/007850公开了一种比单克隆抗RhD抗体具有潜在优势的重组多克隆抗RhesusD抗体。通过不止一种抗体覆盖每个潜在的RD表位，抗RhDrpAb组合物可用于怀有RhD(+)的RhD(-)和RhDVI女性的预防性治疗，与RhD(+)亚型无关。
WO 2007/065433公开了一种重组多克隆抗正痘病毒抗体。据称包括针对多个IMV和/或EEV颗粒蛋白和优选的还针对单个IMV/EEV蛋白上多个表位的不同抗体对多克隆抗体来说是有利的。此外，描述了具有针对正痘病毒相关调节因子的补体激活(RCA)的反应性的抗体作为抗正痘病毒rpAb的所需成分。
Devaux等(Mol.Cell.Chem.74：117-128(1987)描述了单克隆抗体用于抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)核酸酶的用途，包括对两种不同抗体的组合进行测定以检测可能的协作效应。
单克隆抗体越来越多的与例如细胞生长抑制剂，化疗剂，酪氨酸激酶抑制剂和其他抗体(例如以及
Figure BDA0000066531320000022
)用于组合疗法。对于这些治疗方式来说，需要组合疗法的合理设计以确保挑选到最优组合。
临床上可用于组合的其他化合物包括抗生素，抗癌剂，抗AIDS剂，抗生长因子，抗病毒剂，可溶性受体，RNAi′s和疫苗。
当设计组合药物时，可以针对两种不同的目标。在一种类型的组合药物中，化合物可以具有或有助于相同的功能性作用，但当组合和一起施用时它们显示协同作用。在另一类型的组合药物中，化合物可以显示不同的功能性作用，由此可以开发出能够治疗不止一种医学病症的药物。
当大量潜在药物候选物包括在混合物中时，需要合理的药物设计以确保实现协同作用，包括以下情况，其中从开始就不清楚最佳药物设计，但必须通过经验建立。对合理药物设计的需要还存在于甚至更复杂的情况下，其中例如抗体与小分子药物混合以提供组合治疗。
鉴定不同药物候选物的最佳混合物的挑战是尤其与多克隆抗体组合物相关的，其中目标是提供特异性结合特定靶抗原的不同单克隆抗体的混合物，从而尽可能的模拟其存在于人和非人动物中的自然抗体应答。一个挑战仅仅是确定特定多克隆抗体组合物中不同抗体的“最佳”数目，例如两种或三种抗体是否提供与利用五种或十种抗体获得的效果差不多一样的疗效。即使预先确定了组合物中不同抗体的大概数目，例如基于生产成本考虑，鉴定最佳组合的任务无论任何都不轻。例如，如果目标是提供包括5种抗体的多克隆组合物，而存在30种候选抗体从中选择，5种抗体的特有组合的数目是142,506，如果包括6种抗体的多克隆组合物选自36种候选抗体，特有组合的数目接近200万。
发明概述
本发明的目标是提供鉴定来自多种化学实体(通常超过10种)的两种或更多种实体的混合物的合理化法，以便鉴定具有所需功能性作用的混合物。通过这种方法鉴定的混合物可以显示有关特定功能参数的协同作用，或它们可以显示两种或更多种功能性作用，这源于以下事实：具有不同功能性作用的不同化学实体共同存在于相同药物中。
因此，本发明的第一个方面涉及一种鉴定和挑选具有或贡献功能性作用的化学实体的方法，以便提供包括至少两种显示所需功能性作用的化学实体的混合物，所述方法包括以下步骤：
a)提供n种样品，每种样品包括待测的化学实体；
b)将所述n种样品中的两种或更多种以所有可能的组合进行混合以便获得第一组待测的混合物；
c)对所述第一组混合物进行能测量功能参数的功能性测定，以便鉴定贡献功能性作用的化学实体；
d)挑选出m种样品，每种样品包括在步骤c)中贡献功能性作用的化学实体，其中m小于n；
e)将所述m种样品中的两种或更多种以所有可能的组合进行混合以便获得第二组待测的混合物；
f)对所述第二组混合物进行能测量功能参数的功能性测定，以便鉴定贡献功能性作用的化学实体；和
g)挑选具有所需功能性作用的混合物。
上述方法是独特的，因为它以合理的方式提供关于n种待测样品的所有可能混合物的信息。研究所有可能混合物的功能性作用，允许鉴定显示最佳功能性作用的混合物，从而使挑选增强其他化合物功能的化合物成为可能。
如果大量样品将被检测，上面所列的本发明基本方法可以通过包括其他的方法步骤来进一步合理化。首先，将n种样品分为亚组，随后将每个亚组的样品用于方法步骤a，b和c，以及任选的步骤d，e和f。在每组中，然后基于步骤c和任选的步骤f获得的结果挑选样品，例如基于功效或效果标准，然后将只包括这些最有效的化学实体的新混合物混合并进行检测。采用这种方式，通过制备混合物和进行功能性测定来完成的工作量被保持在最低限度。在其它情况下，可以针对包括大量化学实体的混合物，在这种情况下，首先鉴定并挑选包括更小数目的化学实体的最有效混合物，之后混合并分析这些挑选的混合物。采用这种方式，改变本发明的方法以便提供用最少的时间和努力来鉴定最有力和最高效的混合物的系统性和合理化方法。
由于本发明方法运行的系统性和合理化模式，它尤其适合于自动化，例如通过机器人。
在另一个方面，本发明涉及一种用于在包括至少2种化学实体的混合物中鉴定和挑选化学实体间最佳化学计量比的方法，所述混合物显示所需的功能性作用，该方法包括以下步骤：
aa)提供p种样品，每种样品包括所述混合物中存在的一种化学实体；
bb)将所述p种样品中的每一种稀释q次以便获得p系列样品，每个包括不同浓度的相同化学实体；
cc)将步骤aa和bb获得的2种或更多种样品以所有可能的组合进行混合以便获得待测的混合物；
dd)将所述混合物用于能够测量功能性作用的功能性测定，以便鉴定被测的功能性作用与混合物中化学实体浓度之间的关系；和
ee)挑选具有所需功能性作用的混合物。
这允许采用系统性和合理化的方式鉴定混合物中存在的化学实体之间的最佳化学计量比。
附图简述
图1显示进行本发明挑选方法以鉴定大量药物的最有效组合的一种方式的示意图。
图2显示在添加8种药物候选物的第一、第二和第三层到96孔板后，接收板布局的示意图。A)层1，B)层1+2和C)层1+2+3。用不同的灰度显示8种药物候选物。
图3显示针对包含各种抗体的混合物，A431NS细胞生长的％MAC(％代谢活性细胞)的散布点图。每个点代表6个检测孔的平均值。还显示包含单个抗体的所有混合物的中位％MAC。虚线指示不存在对A431NS细胞生长的影响的水平。
图4显示，在顶部，条形图显示具有最高功效的20种抗体混合物的SEM的平均％MAC，在底部，在最终组的包含特定抗体的所有混合物的A431NS细胞生长的％MAC的散布点图。每个点代表6个检测孔的平均值。还显示所有抗体混合物的中位％MAC。虚线指示不存在对A431NS细胞生长的影响的水平。
图5显示，在顶部，条形图显示具有最高功效的抗体20种混合物的SEM的平均％MAC。底部显示最终组中包含抗体的所有2-混合物的A431NS细胞生长的％MAC的散布点图。每个点代表6个检测孔的平均值。还显示所有抗体混合物的中位％MAC。虚线指示不存在对A431NS细胞生长的影响的水平。
发明详述
定义
本文使用的术语“化学实体”表示化合物或两种或更多种化合物的组合，在所述组合中所述两种或更多种化合物之间的化学计量比被设为定值。
本文使用的术语“将n种样品中的2种或更多种以所有可能的组合进行混合”是指产生n种样品的所有可能组合，其在每种混合物中具有预定数目的化学实体。例如，在将3种样品(即3种不同的化学实体)以所有可能的组合进行混合的情况下，产生包括3个不同部分的n种样品中任意一种的所有可能的混合物。这包括：包括3种不同样品中每种一份的混合物(即包含3种不同化学实体的混合物)，以及包括两份一种样品(一种化学实体)以及一份不同样品(不同化学实体)的混合物，和包括3份单一样品(即包含单一化学实体)的混合物。数学上组合的数目可以如下描述：
( n + k - 1 ) ! k ! ( n - 1 ) !
其中n是待测的样品数目，k是每种混合物中待混合的样品数目。
因此混合物的数目取决于待测样品的数目和每种混合物中混合在一起的样品数目。如果，例如，在包括3种样品的混合物中检测4种样品，则组合的数目等于：
( 4 + 3 - 1 ) ! 3 ! ( 4 - 1 ) !
对应于20种组合。
将所述4种样品称为A，B，C和D，获得下列20种组合：
本文使用的术语“多克隆蛋白”或“多克隆”是指包括不同但同源的蛋白分子(优选的选自免疫球蛋白超家族)的蛋白组合物。因此，每种蛋白分子与组合物的其他分子同源，但还包含至少一段可变的多肽序列，其特征在于多克隆蛋白单独成员之间氨基酸序列的差异。这类多克隆蛋白的已知实例包括抗体或免疫球蛋白分子，T细胞受体和B细胞受体。多克隆蛋白可以由指定亚组的蛋白分子组成，其由常见的特征诸如共有对目标靶的结合活性所确定，例如显示对目标靶抗原的结合特异性的多克隆抗体。
术语“抗体”描述血清的功能成分，通常表示分子的集合(抗体或免疫球蛋白片段，等)或一种分子(抗体分子或免疫球蛋白分子)。抗体分子能够与特定抗原决定簇(抗原或抗原表位)结合或反应，这进而可以引起免疫作用机制的诱导。单个抗体分子通常被认为是单特异性的，抗体分子的组合物可以是单克隆的(即，由相同的抗体分子组成)或多克隆的(即，由与相同抗原或特有的不同抗原上相同或不同的表位反应的不同抗体分子组成)。组成多克隆抗体的特有和不同的抗体分子被称作“成员”。每种抗体分子具有特有的结构，这使得它特异性的结合其对应抗原，所有自然抗体分子具有由两条相同轻链和两条相同重链组成的相同的总体基本结构。抗体还总称为免疫球蛋白。本文使用的术语抗体是广义上使用的，包括完整的抗体，嵌合的，人源化的，完全人和单链抗体，以及抗体的结合片段，诸如Fab，Fab′，(Fab′)2，Fv片段或scFv片段，以及多体形式诸如二聚IgA分子或五价IgM。
术语“多克隆抗体”描述不同(多样)抗体分子的组合物，其能够与相同或不同抗原上的数种不同特异性抗原决定簇结合或反应。通常，多克隆抗体的变异性位于多克隆抗体所谓的可变区，尤其是CDR区。当多克隆抗体的成员据称结合抗原时，这表示结合的结合常数低于100nM，优选的低于10nM，甚至更优选的低于1nM。
本文使用的“2-混合物(2-mix)”或“3-混合物”表示分别包含2或3种不同化学实体(例如2或3种不同抗体)的混合物。
术语“免疫球蛋白”通常用作血液或血清中发现的抗体混合物的总称，但也可用于命名源自其他来源的抗体混合物，或可以与术语“抗体”作为同义使用。人抗体分子的类型是：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。每种类型的成员被称为具有相同的同种型。IgA和IgG同种型被进一步细分为亚型。IgA和IgG的亚型通常分别是指IgA1和IgA2，和IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。
术语“同源(cognate)VH和VL编码对”或“VH和VL序列的同源对(cognate pairs)”描述相同细胞内包含的或源自相同细胞的VH和VL编码序列的原始对。因此，同源VH和VL对表示原来存在于供体(所述细胞从其获得)中的VH和VL对。术语“从VH和VL编码对表达的抗体”表示抗体或抗体片段是从包含VH和VL编码序列的载体、质粒或类似物产生的。当同源VH和VL编码对被表达为完整抗体或其稳定片段时，它们保留在作为它们来源的细胞中原始表达的抗体的结合亲和力和特异性。同源对的组合物也被称为同源对的所有组成成分，它们可以是单独或混合的。
术语“表位”通常用于描述抗原上抗体结合的部位。抗原是刺激免疫应答的物质，例如毒素，病毒，细菌，蛋白或DNA。抗原通常具有不止一个表位，除非它非常小。结合相同抗原上不同表位的抗体可以对它们结合的抗原活性具有不同的影响，这取决于表位位置。结合抗原活性位点上表位的抗体可以完全阻断抗原的功能，而结合不同表位的另一抗体对抗原活性没有影响或几乎没有影响。但是，这类抗体仍然可以活化补体或其他效应机制从而导致抗原的清除。
“受体”是嵌入细胞的质膜或细胞质的蛋白分子，活动的信号转导(或“信号”)分子可以与其连接。与结合受体的分子被称为“配体”，其可以是蛋白，肽，神经递质，激素，药学上的药物或毒素。当存在这类结合时，受体经历构象变化，这通常起始细胞应答。但是，一些配体仅仅阻断受体但不诱导任何应答(例如拮抗剂)。配体诱导的受体变化引起生理变化，其构成配体的生物活性。“可溶性受体”是没有其跨膜区的受体。可溶性受体可以与膜结合受体一样结合其配体，但不能进行信号转导。
“协同作用”是一种术语，用于描述系统的最终结果大于其各部分总和的情况。协同作用的反面是拮抗作用，表现为组合的两种药剂的总体作用小于从它们的单独作用预测的总体作用。协同作用还可以表示：a)互相有益的结合，其中总体大于各部分的总和；b)动力学状态，其中组合作用优于单独组分作用的总和；c)由分别采用它们的部分的性能无法预测的整个系统的性能；或d)两种或更多种刺激物或药物的协同作用。在本文中，“协同作用”泛指后一定义，即在指定条件下两种或更多种药物(例如两种或更多种抗体)的组合的总体作用大于单个作用的总和。
详细说明
现在将更详细地描述本发明，关于如何进行所述方法，包括用于检测化合物的功能性测定的类型和可以在所述方法中检测的化学实体的类型。
本发明方法的说明
将本发明的方法设计为用于鉴定和挑选有助于和/或具有功能性作用的化学实体，以便获得包括具有所需功能性作用的至少2种化学实体的混合物。所述方法尤其适合于鉴定新的组合药物，尤其是重组多克隆抗体，因为它允许鉴定将2种、3种或更多种化合物组合到一个药物时存在的协同或组合作用。但是，所述方法也可用于开发包括至少两种显示所需协同作用或两种不同功能性作用的活性化合物的其他产品，例如农药或美容化合物。
本发明的方法包括至少7个步骤，即上文所列的步骤a到g。在步骤a中，提供大量样品(n种样品)。所述样品的每一种包括待测的一种化学实体。在步骤b中，将所述n种样品中的至少两种以所有可能的组合进行混合以便产生第一组待测的混合物。采用这种方法，系统地获得特定数目的混合物，以确保所有可能的混合物都被研究。在步骤c中，对第一组混合物的每一种进行能测量功能参数的功能性测定，以便鉴定贡献功能性作用的化学实体。在步骤d中，使用来自功能性测定的信息挑选大量样品(每种包括有助于所需功能性作用的化学实体)，其中在该步骤挑选出的样品数目(m)小于样品的最初数目(n)。本发明的基本方法包括4个额外步骤e-g。在步骤e中，将m种样品中的两种或更多种以所有可能的组合进行混合，以便获得第二组待测的混合物。在步骤f中，对第二组混合物进行能测量功能参数的功能性测定，以便鉴定贡献功能性作用的化学实体。然后在步骤g中使用来自该功能性测定的信息挑选具有所需功能性作用的混合物。步骤f进行的功能性测定通常与步骤c进行的功能性测定相同。但是，在这两步法中也可以进行两种不同的功能性测定。另一种选择是例如在步骤c和f中进行相同的功能性测定，但在混合、测定和挑选的其他一轮或更多轮中进行不同的功能性测定。当然还可以在任何指定的测定步骤进行两种或更多种不同的功能性测定，并且挑选基于所述两种或更多种测定而不是单次测定。
在上述方法中，检测n种不同样品的功能性作用。这n种样品可以等于待测样品的总数，或n种样品可以组成源自更大样品库的亚组，所述更大的样品库在样品被混合并用于基本方法步骤a-g之前被分为许多亚组。
更具体地，如果只检测有限数目的样品，将进行只包括上述7个步骤(即步骤a到g)的方法，因为待检测的混合物数目是足够有限的，使得无需过度负担就能将它们全部进行功能性测定。但是，如果检测大量样品，则待测混合物的所有可能组合的数目也是很大的，可能需要过量的劳动来测量功能性作用。在这种情况下为了将本发明的方法合理化，可以使用另一种系统策略来挑选感兴趣的化学实体。
因此，如果检测大量样品和/或每种混合物存在大量样品，有利的开始将待测的样品数目分成更小的亚组(每个亚组包括n种样品)，之后在将混合物用于步骤c的功能性测定之前在步骤b将每个亚组中所述n种样品中2种或更多种以所有可能的组合进行混合。
但是，由于只有每个亚组中的样品已被以所有可能的组合进行混合，使用这种方法可能检测不到最佳混合物，因为在这一点上不是所有待测样品的所有可能混合物都被混合和进行功能性测定。关于第一轮(步骤a-d)未被检测的组合的其他信息通常通过新一轮的混合获得，通过步骤e-g所述的功能性测定和挑选进行检测。在这种情况下，挑选的m种样品优选的来源于不同的亚组，以便形成新的mixtures。用于挑选样品的不同方法将在下文描述。
在挑选m种样品后，通过在步骤(e)中将所述m种样品的至少2种以所有可能的组合进行混合来形成新的混合物。采用这种方式获得新的混合物，其随后被用于步骤(f)的功能性测定，其中测量功能参数以便鉴定具有或贡献功能性作用的化学实体。
一些情况下，步骤a提供的样品数目(n种样品)是非常大的，在此情况下有益的挑选多步法中检测的样品数目，这样的话必须进行功能性测定的混合物数目被限定为最合理的方式。这最合适的通过重复方法步骤(d)，(e)和(f)来完成。采用这种方式，步骤c挑选的样品被分到亚库(sub-pools)，每个包括m种样品，对其进行方法步骤(d)，(e)和(f)。在每次重复中，挑选的样品总数被减少。技术人员将理解对来自不同库的样品进行的方法步骤可以平行或顺序进行。
本发明的方法包括检测包含2种样品的混合物。但是，优选的通过在步骤b将n种样品中的3种，或任选的超过3种以所有可能的组合进行混合来进行所述方法。还优选在步骤(e)混合m种样品中的3种，或任选的超过3种。技术人员应承认，通过混合超过3种样品(例如4，5，6或7种样品或甚至8，9，10或更多种样品)获得的混合物也属于本发明方法的范围内。
一些情况下，目标可以是鉴定包括相对较多数目的不同化学实体的混合物。这类混合物的实例是设计为包含例如5-15种不同单个抗体的重组多克隆抗体。在此情况下，所述方法被合理化，通过开始只检测包括少量不同化学实体(例如3种不同的抗体或其他待测的化学实体)的混合物，随后形成新的混合物(通过混合两种或更多种所选混合物)用于步骤e-g的检测和挑选，然后将新的混合物用于功能性测定。因此，为了第二轮的混合、检测和挑选，基于初始功能性测定(步骤c)挑选的例如3种不同化学实体的混合物被认为是将在步骤e中混合的“样品”，这样的话用于步骤f的功能性测定的样品将包含比步骤c测定的初始混合物更多数目的不同化学实体。本发明基本方法的这种变化可以定义为步骤c之后的下列步骤：
d1)挑选具有所需功能性作用的m1混合物；
e1)将步骤d1中挑选的所述m1混合物中的2，3，4或5种以所有可能的组合进行混合；
f1)对步骤e1的所述混合物进行能测量功能参数的功能性测定，以便鉴定贡献功能性作用的混合物；和
g1)从步骤e1的混合物中挑选出具有所需功能性作用的第二混合物。
因此步骤a-g描述的本发明基本方法可以根据需要变化，例如，根据待测样品的总数(n)以及最终混合物中希望的不同化学实体的数目。应理解所述基本方法包括至少两轮的混合、测定和挑选，即一轮包括步骤b，c和d，另一轮包括步骤e，f和g。但是，根据情况可以将这两轮中的一个或两个重复一次或更多次。
如果目标是包括非常多数目的化学实体的混合物(例如包含高达约25个不同单个抗体的重组多克隆抗体)，则所述方法可以包括额外的3个方法步骤，即步骤h，i和j。在步骤h中，将步骤g1获得的所选混合物中的2，3，4或5种混合，在后续的步骤i中，对所述混合物进行能测量功能参数的功能性测定以便鉴定具有功能性作用的混合物。在最后一步(步骤j)，挑选具有所需功能性作用的第三混合物。
通过包括上文所列类型的基本程序的其他步骤或其他轮来扩展所述方法在普通技术人员的能力范围内。
为了进行包括具有或贡献功能性作用的化学实体的样品的合适鉴定，优选的只比较其中被研究的任何化学实体只出现一次的样品。例如，就抗体3-混合物而言，希望只比较包含3种不同抗体的样品(即排除包含两份一种抗体和一份另一抗体，或三份单个抗体的样品)。如将在后面讨论的，本发明还提供一种鉴定化学实体之间最佳化学计量比的方法，由此以便排除由于化学实体存在的不同浓度对功能性作用的任何作用，希望只是比较不同化学实体浓度相同的混合物。利用这种方法，优选的任何化学实体在混合物(其分别在步骤e1和步骤h中制备)中只出现一次。
当挑选包括具有或贡献功能性作用的化学实体的样品时，可以使用许多不同的方法。在一种方法中，通过将包括化学实体A的混合物的功能性作用与至少一种不包括化学实体A的混合物的功能性作用进行比较，鉴定化学实体A是否具有或贡献功能性作用。例如，就包含3种化学实体的混合物来说，通过将包括化学实体A和/或化学实体B的3种样品以所有可能的组合进行混合，并将包括例如一份化学实体A和两份化学实体B以及两份化学实体A和一份化学实体B的混合物的功能性作用与包括三份化学实体B的混合物的功能性作用进行比较，鉴定化学实体A是否具有或贡献功能性作用。
在另一个方法中，通过将包括化学实体A以及其他化学实体的混合物的功能性作用与只包括化学实体A的混合物的功能性作用进行比较，鉴定化学实体A是否具有或贡献功能性作用。
在另一方法中，通过将包括化学实体A的混合物的功能性作用与参照值进行比较，来鉴定化学实体A是否具有或贡献功能性作用。优选的，这种参照值是预先确定的值。经鉴定的包括化学实体A的混合物的功能性作用必须比预先确定的值更高，相等或更低，以便化学实体A被确定为具有或贡献功能性作用。一些情况下，参照值可以是一个区间，经鉴定的包括化学实体A的混合物的功能性作用必须位于该区间，以便化学实体A被确定为具有或贡献功能性作用。在其它情况下，参照值可以是进行分析测定时测得的任意参数的平均值，诸如将混合物进行功能性测定时测量的所有值的平均值。
鉴定具有或贡献功能性作用的化学实体的一个优选方法是鉴定在具有功能性作用的混合物中最常出现的化学实体。通过确定显示最高功效和效力的混合物的化学成分和鉴定所述混合物中最常出现的化学实体，可以获得某一化学实体是否和如何贡献功能性作用的充分指示。这种方法用于下文的实施例3，其中功能性测定的结果显示在20种最有效混合物的19种中都发现了抗体992(参见图4)，因此可以总结出这种抗体与其他抗EGFR抗体结合表现非常好。
待测样品的数目可以显著变化，这取决于寻找的组合药物的类型，也就是说待研究的化学实体是否具有相同类型(例如抗体)或化学实体是否具有不同类型(例如与小分子药物组合的抗体)。优选的，n是值为3或更大的整数，例如3到1440，优选的3到360，诸如3到120，或甚至更优选的3到24，诸如3到12。
根据起始样品的数目，步骤(d)中挑选样品的数目(m种样品)也可以有很大差异。但是，优选的m是值为3或更大的整数，例如3到720，优选的3到360，诸如3到120，或甚至更优选的3到24，诸如3到12。
在本发明中，化学实体或化学实体混合物的功能性作用在功能性测定中进行鉴定，通过测量与不存在所述化学实体时的参数相比，由于化学实体的存在而发生改变的功能参数。被测量的所述功能参数可以是，例如，以下任意一种：
●物理作用的应用-这可以是例如荧光或发光的发射，或光或其他电磁辐射的吸收；
●与配体或抗原的结合-典型实例是受体分子或抗体的结合；
●催化活性的应用，诸如酶活性；
●对催化活性的易感性，诸如酶活性；
●药剂穿过生物膜的改变输送的促进；
●胞内小室中药剂改变移位的促进；
●对真核细胞群中至少一种基因表达的影响-即可以测定化合物作为表达调节因子(例如对转录水平)的功能；
●对真核细胞群生长或代谢的影响-在筛选编码生长调节剂突变形式的文库的情况下是方便的；
●对靶细胞的影响-例如可以检测化合物对增殖，抗增殖，分化，凋亡，代谢或药物敏感性的作用，当筛选例如可以用做抗癌药物的表达产物所有这些都是合适的；
●对病原体的影响-可以测定病毒中和，与病毒的结合或病毒的杀伤，以及还可以测定与细菌的结合，细菌的杀伤，吞噬，ADCC，CDC，等；
●对继发性免疫作用的影响；
●对待表达、制备或配制的化合物的影响；
●对稳定性的影响。
术语“所需的功能性作用”是指功能参数的任何所需改变。功能参数的所需改变显然取决于被测定的化学实体的性质以及预期的体外或体内作用。通常，所需的功能性作用是表明所述化学实体能够提供针对特定病症的改善药物的功能性作用。例如，如果待测化学实体被用作抗AIDS剂，所需的功能性作用可以是增加的对HIV的结合或中和或增加的对HIV感染细胞的杀伤。
当开发新的药物和药物组合时，可以寻找具有协同作用的新制剂或寻找具有不止一种功能性作用的新制剂。例如，开发一方面治疗癌症另一方面降低化疗的药物是令人感兴趣的。作为另一个实例，同时抗击不止一种病毒的流感疫苗也是令人感兴趣的。
在这类情况下，可以采用如下方式改变本发明的方法：将待测混合物用于两种或更多种功能性测定(其中每种功能性测定能够测量一种功能参数)，以便独立的测量每种混合物的两种或更多种功能参数。这些测定可以是平行或连续进行的。待检查的功能参数可以是例如对真核细胞群生长或代谢的影响或对靶细胞的影响。
可以使用进行本发明方法的任何方式。但是，考虑到待制备的混合物的数目以及进行功能性测定数目，优选的所述操作方式包括某些类型的自动化。因此，在一种操作方式中，在多孔板中进行所述方法。这些板在任何实验室中都是标准设备，任何本领域技术人员都清楚如何使用这类板进行实验。优选的，利用自动化液体处理来混合所述混合物，因为这将减轻需要完成以便制备待研究的混合物的工作量。功能性测定还可以使用本领域已知的装置和方法通过机器人来进行。
本发明的另一个方面提供在包括至少2种化学实体的混合物中鉴定和挑选化学实体之间最佳化学计量比的方法，以获得所需的功能性作用。这种方法有助于发现组合药物中的最佳浓度水平。例如，大家都知道当两种或更多种抗体存在于相同混合物中时，很可能存在对特定靶标的结合竞争。这种竞争部分取决于混合物中存在的不同抗体的浓度，这样的话特异性抗体的浓度越高，所述抗体就越有可能成功地竞争结合靶。因此，为了实现组合药物的最佳协同作用，每种化学实体的浓度以及不同实体之间的化学计量比优选的被优化。
本发明用于鉴定和挑选混合物中化学实体之间最佳化学计量比的方法包括至少5个步骤。第一步，步骤aa，提供p种样品，每种包括混合物中存在的一种化学实体。其次，步骤bb，将所述p种样品的每一种稀释q次，以便获得p系列样品，每种包括相同的化学实体，但浓度不同。此后，在步骤cc，将步骤aa和bb获得的2种或更多种样品以所有可能的组合进行混合以便获得待测混合物，然后在步骤dd，将步骤cc获得的混合物用于能够测量功能性作用的功能性测定，以便鉴定测得的功能性作用与混合物中化学实体浓度之间的关系。在最后一步(步骤ee)，挑选具有所需功能性作用的混合物。
步骤aa提供的样品数目对应于待研究的混合物中存在的不同化学实体的数目。因此，如果针对的是包括3种不同化学实体的组合药物，则p等于3。但是，优选的，p是整数，具有2或更大的值，更优选的具有2到24的值，甚至更优选的2到12。
原则上，在步骤bb，样品可以稀释为本领域已知的任意合适的倍数。但是，优选的，样品稀释的倍数为2，5，10，20，50或100。任何样品都可以被稀释数次以便获得一系列样品，其中每个样品具有不同的浓度。优选的方法是其中样品被稀释1，2，3，4或5次。
仍在本发明的另一个方面，经本发明方法鉴定为最佳的混合物可以被用做药物或用于药物的制备。但是，如上所述，经本发明方法挑选和鉴定的混合物并不只适合于药物，还适合于包括两种或更多种化合物的其他产品诸如农业或美容产品。
可以根据本发明挑选的化合物的实例
通常，当给人和动物体施用时已知具有有益作用的任何化合物对利用本发明的方法进行检测都是有意义的。但是，不是已知具有任何有益作用(例如药学作用)的化合物也可以被检测，以便发现未知的作用或可能的协同作用(这在与一种或更多种其他化合物结合检测时可以显示)。
在本发明的方法中，待测的任意化学实体中包括的化合物可以是任何感兴趣的化合物，用于治疗或预防任何医学病症，或用于医学病症的减轻，或简单的用于人或动物的良好状态。但是，优选的，利用本发明方法检测的化合物选自抗体，抗生素，抗癌剂，抗AIDS剂，抗生长因子，抗病毒剂，生物制剂(包括例如可溶性受体，细胞因子和其他蛋白)，RNAi′s，疫苗及其混合物。
如果待测化学实体中包括的化合物是抗体，接受功能性测定的混合物可以是两种或更多种抗体的组合，或其中至少一种抗体与一种或更多种其他化合物(例如选自抗生素，抗病毒剂，抗癌剂，抗自身免疫病剂和RNAi′s)结合的组合。优选的，待测化学实体中包括的化合物是抗体，和更优选的，待测化学实体中包括的化合物是单克隆抗体。本发明尤其适合于检测单克隆抗体的多种组合，以便鉴定单克隆抗体(制备为重组多克隆抗体或单克隆抗体的混合物)的最佳组合。
抗体
可用于本发明方法的一组化合物包括抗体及其特异性识别和结合表位的功能等同物。
抗体或其功能等同物可以是本领域已知的任何抗体，例如源自哺乳动物的单克隆抗体或合成抗体，诸如单链抗体或包括抗体片段的杂合物。此外，抗体的功能等同物可以是抗体片段，尤其是表位结合片段。此外，抗体或其功能等同物可以是模拟抗体的小分子。天然存在的抗体是由重链和轻链组成的免疫球蛋白分子。在本发明优选的实施方案中，单个抗体是单克隆抗体，本发明用于鉴定适用于重组抗体“混合物”或重组多克隆抗体的单克隆抗体的混合物。
本发明的抗体还可以是双特异性抗体，即特异性识别两个不同表位的抗体。双特异性抗体通常由单克隆抗体起始制备，或利用重组技术制备。本发明的抗体也可以是三特异性抗体。
在一个优选的实施方案中，抗体的功能等同物可以是抗体的片段，优选的是抗原结合片段或可变区。可用于本发明的抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)2和Fv片段。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab片段，每个都具有单一的抗原结合位点和残余“Fc”片段。胃蛋白酶处理产生F(ab′)2片段，其具有能够交联抗原的两个抗原结合片段和残余其他片段(称为pFc′)。这类片段也可以重组产生，通过将重链和轻链编码区的相关部分插入表达载体。其他片段可以包括双抗体，线性抗体，单链抗体分子，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文使用的，关于抗体的“功能性片段”表示Fv，F(ab)和F(ab′)2片段。优选的抗体片段保留一些或基本全部的抗体结合其抗原的能力。
在一个实施方案中，抗体是单链抗体，被定义为包含轻链可变区和重链可变区的基因工程分子，通过合适的多肽接头连结为遗传融合的单链分子。这类单链抗体也被称为“单链Fv”或“scFv”抗体片段。通常，Fv多肽还包括VH和VL结构域之间的多肽连接子，其使scFv能够形成抗原结合所需的结构。使用合适的接头，也可以制备单链Fab片段。
可变重链和可变轻链编码对的分离和挑选
抗体可以通过各种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein的标准体细胞杂交技术，Nature 256：495(1975)。可以使用产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化，或利用人抗体基因文库的噬菌体展示技术。用于分离适于制备为单克隆或多克隆抗体的完全人抗体的优选方法是SymplexTM技术(Meijer et al.，J Mol Biol.2006 May5；358(3)：764-72；和WO 2005/042774)，其能够产生具有高复杂性和多样性的抗体所有组成成分，同时维持原始的重链和轻链对，并避免杂交瘤技术必需的细胞培养步骤。
产生抗体的过程包括从合适的来源分离编码可变重链(VH)和可变轻链(VL)的序列，从而产生VH和VL编码对的所有组成成分。通常，用于获得VH和VL编码序列的合适来源是包含淋巴细胞的细胞组分诸如血液，脾或骨髓样品，它们来自以合适的免疫应答对相关靶标作出反应的一个或更多个个体。优选的，从含有人免疫球蛋白基因的人或转基因动物(对相关靶标作出反应)收集包含淋巴细胞的组分。收集的包含淋巴细胞的细胞组分可以被进一步富集，以获得特定的淋巴细胞群，例如B淋巴细胞。优选的，富集使用磁珠细胞分选(MACS)和/或荧光激活的细胞分选(FACS)进行，利用谱系特异性细胞表面标记物蛋白，例如针对B细胞和/或浆细胞的。优选的，针对B细胞和/或浆细胞富集包含淋巴细胞的细胞组分。甚至更优选的，从血液分离具有高CD19和CD38表达和中等CD45表达的细胞。这些细胞有时被称为循环浆细胞，早期浆细胞或血浆未成熟细胞(plasma blasts)，在本申请中为了简单起见称为asplasma细胞。
通常，VH和VL编码序列的分离可以采用任何方式进行，其中VH和VL编码序列被组合到载体中以产生VH和VL编码序列对的文库。按照典型方式，VH和VL编码序列被随机组合到载体中以产生VH和VL编码序列对的组合文库。VH和VL编码序列的分离可以例如通过噬菌体展示和杂交瘤技术进行，包括使用转基因动物(进一步参见下文)。
在本发明中，优选保持重链和轻链的原始对以维持供体(无论其是人还是动物)中天然免疫应答产生的抗体的功效和亲和力。这包括保持供体中原始存在的VH和VL对，从而产生序列对的所有组成成分，其中每对编码可变重链(VH)和可变轻链(VL)，它们对应于供体(序列从其分离)产生的抗体中原始存在的VH和VL对。这还称为VH和VL编码序列的同源对，抗体被称为同源抗体。在优选的实施方案中，本发明的VH和VL编码对(组合或同源的)，获自人供体，因此序列是完全人的。可选的，VH和VL编码对可以获自能够产生人抗体的转基因动物，例如使用
Figure BDA0000066531320000171
技术(Medarex)或
Figure BDA0000066531320000172
技术(Abgenix/Amgen)。
存在数种产生VH和VL编码序列的同源对的方法。一种方法包括VH和VL编码序列(来自从包含淋巴细胞的细胞组分分选出的单细胞)的扩增和分离。VH和VL编码序列可以单独扩增，并在第二步配对，或它们可以在扩增期间配对(Coronella et al.2000 Nucleic Acids Res.28：E85；Babcook et al1996 PNAS 93：7843-7848)。选择性的方法涉及VH和VL编码序列的细胞内扩增和配对(Embleton et al.1992.Nucleic Acids Res.20：3831-3837；Chapal etal.1997 BioTechniques 23：518-524)。
为了获得类似供体中VH和VL序列对的多样性的VH和VL编码序列对的所有组成成分，利用VH和VL对尽可能少的不规则(scrambling)的高通量方法(随机组合)是优选的，例如描述于Meijer等(J Mol Biol.2006 May5；358(3)：764-72)和WO 2005/042774(在此引入作为参考)。
优选的，VH和VL编码对的所有组成成分(其中成员对反映利用靶攻击时引起体液免疫应答的基因对)根据包括下列步骤的方法产生：i)提供包含淋巴细胞的细胞组分，其来自对相关靶作出反应的一个或更多个供体；ii)任选的从所述细胞组分富集B细胞或浆细胞；iii)通过将来自所述细胞组分的细胞逐一分配到多个管中，获得分离的单细胞群；iv)利用源自所述分离单细胞的模板，通过多重重叠延伸RT-PCR方法扩增和实现VH和VL编码对的连接，和v)任选的进行连接的VH和VL编码对的巢式PCR。在进行本发明的方法之前，分离的同源VH和VL编码对优选的用于如下所述的筛选步骤。
一旦产生VH和VL序列对，就进行筛选步骤以鉴定编码具有对相关靶的结合反应性的VH和VL对的序列。针对靶标的结合剂的筛选通常利用免疫检测测定(诸如FACS，ELISA，FLISA和/或免疫印迹测定)进行。
在筛选中挑选出的VH和VL对编码序列通常进行测序，并针对可变区的多样性进行分析。尤其是，CDR区的多样性是令人感兴趣的，并且VH和VL家族表现也是令人感兴趣的。基于这些分析，挑选编码VH和VL对的序列，其代表从一个或更多个供体分离的试剂-结合抗体的整体多样性。优选的，挑选在全部CDR区(CDRH1，CDRH2，CDRH3以及CDRL1，CDRL2和CDRL3)都具有差异的序列。如果存在具有一个或更多个相同或非常类似的CDR区(其属于不同的VH或VL)的序列，这些序列也被挑选。VH和VL序列对的挑选还可以基于可变重链CDR3区的多样性。在序列的引发和扩增期间，突变可以存在于可变区的骨架区。优选的，这类错误被校正以确保序列完全对应于供体的那些序列，例如这样的话序列在所有保守区(诸如可变区的骨架区)是完全人的。
当确保挑选的编码VH和VL对的序列集合的整体多样性高度代表在基因水平观察到的针对不同靶攻击的体液免疫的多样性时，可以预期对于受攻击的供体中产生的抗体特异性来说，从挑选的VH和VL集合表达的抗体的整体特异性也将是代表性的。
使用转基因动物和杂交瘤产生的抗体
在一个实施方案中，利用转基因或转染色体动物(携带人免疫系统的一部分)而不是小鼠系统产生单克隆抗体。这些包括转基因和转染色体小鼠诸如
Figure BDA0000066531320000191
小鼠，和KM小鼠，它们在本文中总称为“转基因小鼠。”
HuMAb-小鼠
Figure BDA0000066531320000193
包含人免疫球蛋白基因微基因座(miniloci)(其编码未重新排列的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列)，以及灭活内源μ和κ链基因座的靶突变(Lonberg，N.et al.(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，小鼠显示小鼠IgM或κ的表达降低，并且作为对免疫的应答，导入的人重链和轻链转基因经历类型转换和体细胞突变以产生高亲和力的人IgG，κ单克隆抗体(Lonberg，N.et al.(1994)，上文；综述于Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，and Harding，F.and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546)。
Figure BDA0000066531320000194
小鼠的制备详细描述于Taylor，L.et al.(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.et al.(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon et al.(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg et al.，(1994)Nature 368(6474)：856-859；Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Taylor，L.et al.(1994)International Immunology 6：579-591；Lonberg，N.and Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93；Harding，F.and Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546；Fishwild，D.et al.(1996)Nature Biotechnology14：845-851。还可参见Lonberg和Kay的US Nos.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；and 5,770,429；以及Surani等的US 5,545,807；WO 98/24884，WO 94/25585，WO 93/1227，WO 92/22645，WO 92/03918和WO 01/09187。
KM小鼠包含人重链转染色体和人kappa轻链转基因。内源小鼠重链和轻链基因在KM小鼠中也已被破坏，这样的话小鼠的免疫导致人免疫球蛋白而不是小鼠免疫球蛋白的产生。KM小鼠的构建以及它们用于产生人免疫球蛋白详述于WO 02/43478。
为了产生人单克隆抗体，可以用抗原的富集制品和/或表达抗原的细胞免疫包含人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体小鼠(例如，HCO12，HCO7或KM小鼠)，例如，描述于Lonberg et al.(1994)，上文；Fishwild et al.(1996)，上文，和WO 98/24884。可选的，小鼠可以用编码抗原的DNA免疫。优选的，在第一次输注时小鼠应达到6-16周龄。例如，可以使用抗原的富集制品(5-50μg)腹腔内免疫
Figure BDA0000066531320000201
小鼠。当使用抗原的纯化或富集制品免疫不产生抗体时，小鼠还可以用表达抗原的细胞(例如，细胞系)进行免疫，以促进免疫应答。
为了制备产生单克隆抗体的杂交瘤，可以分离来自免疫小鼠的脾细胞和淋巴结细胞，并将其与合适的永生化细胞系(诸如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。然后针对抗原特异性抗体的产生对获得的杂交瘤进行筛选。例如，利用50％PEG(w/v)将来自免疫小鼠脾淋巴细胞的单细胞悬液与SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1581)融合。将细胞按照大约1×105每孔种于平底微量滴定板中，然后在选择性培养基中温育两周，所述选择性培养基除了常规试剂外还包含10％胎儿Clone Serum，5-10％ origen杂交瘤克隆因子(IGEN)和1×HAT(Sigma)。在大约两周后，在用HT替换HAT的培养基中培养细胞。然后通过针对包含人kappa-轻链的抗体的ELISA和FACS分析筛选单个孔。一旦存在大范围的杂交瘤生长，通常在10-14天后观察培养基。抗体分泌杂交瘤可以重新种板和筛选，如果仍然对人IgG显示阳性，则可以通过有限稀释法将单克隆抗体亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆以在组织培养基中产生抗体进行表征。
本发明的人抗体还可以在宿主细胞转染瘤中产生，利用例如本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的结合，参见例如Morrison，S.(1985)Science 229：1202。
在一个具体的实施方案中，有兴趣使用本发明的方法以便鉴定以下物质的有益组合：a)一种或更多种单克隆抗体，优选的至少两种单克隆抗体，和b)与a)的一种或更多种单克隆抗体结合提供协同或另外有益的功能性作用的至少一种其他治疗剂。例如，当抗体用于预防或治疗细菌感染时，可以有益的鉴定两种或更多种单克隆抗体以及至少一种非抗体抗细菌剂(参见例如下文有关抗生素的内容)的最佳组合。类似地，当抗体用于预防或治疗癌症或肿瘤生长时，可以有益的鉴定两种或更多种这类抗癌单克隆抗体以及至少一种非抗体抗癌剂(参见下文有关抗癌剂的内容)的最佳组合。当抗体是针对AIDS或另一种病毒病的预防或治疗时同样适用，在这种情况下可以有益的分别鉴定两种或更多种这类抗HIV或其他抗病毒单克隆抗体以及至少一种非抗体抗HIV剂或抗病毒剂(参见下文有关抗HIV剂和其他抗病毒剂的内容)的最佳组合。本领域技术人员将清楚，这一相同的方法，即将一种或更多种单克隆抗体(和优选的至少两种单克隆抗体)与至少一种非抗体药剂(其与所述抗体针对相同病症的预防或治疗(或任选的针对相关病症))结合，同样可用于其他适应症，例如作为针对自身免疫病的单克隆抗体以及针对相同自身免疫病的已知或新的非抗体药剂的组合。
抗生素
抗生素可以被定义为杀死或终止微生物(包括细菌和真菌)生长的分子。杀死细菌的抗生素也被称为杀菌剂，而终止细菌生长的抗生素也被称为抑菌剂。
当整合入组合药物时有兴趣检测它们功能性作用的抗生素包括β-内酰胺抗生素，诸如青霉素(例如羟氨苄青霉素)，头孢菌素类(cehalosporins)，碳青霉烯类，单内酰环类(monobactams)，等等，四环素类，诸如四环素，大环内脂类抗菌素，诸如霉素，氨基糖苷类，诸如庆大霉素，托普霉素和氨基丁卡霉素，喹诺酮，诸如环丙沙星，环肽，诸如万古霉素，链阳性菌素和多粘菌素，林可酰胺类(lincosamides)，诸如氯林肯霉素，oxazolidinoes，诸如利奈唑胺，和磺胺抗生素，诸如磺胺异恶唑。
抗癌剂
抗癌剂(亦称为化疗药物)可以被定义为破坏有丝分裂(细胞分裂)从而有效针对快速分裂细胞的药物。因为这些药物造成对细胞的破坏，它们也被称为细胞毒的。这些药物中的一些引起细胞经历凋亡，所谓的“程序性细胞死亡”。
当用于需要其的人的治疗时，已知这些药物经常与其他癌症治疗(诸如放疗或手术)联用。可选的，可以用大量不同的药物同时治疗患者。药物的机制和副作用各不相同，但联合使用的最大优点是出现针对任一种所述抗癌剂抗性的机会被降到最低。因此，当用作组合药物时检测抗癌剂的协同作用是高度相关的，就像上文讨论的检测一种或更多种这类药剂以及一种或更多种单克隆抗体一样。
大多数抗癌剂可以被分为烷化剂，抗代谢物，抗肿瘤抗生素，植物碱，拓扑异构酶抑制剂和其他抗肿瘤剂。所有这些药物在某种程度上影响细胞分裂或DNA合成和功能。此外，还开发出不直接干扰DNA的药剂。这些包括单克隆抗体和酪氨酸激酶抑制剂，例如伊马替尼去铁胺，其直接针对某些癌症类型(慢性粒性白血病，胃肠基质瘤)的分子异常。此外，调节肿瘤细胞性能但不直接攻击所述细胞的药物也被称为抗癌剂。激素属于这种类型。
烷化剂具有在细胞所在条件下将烷基添加到许多带负电基团上的能力。顺铂，卡铂和奥沙利铂是烷化剂的实例。属于该组的其他药剂包括氮芥，环磷酰胺和苯丁酸氮芥，其通过化学修饰细胞DNA起作用。
抗代谢物模拟嘌呤(硫唑嘌呤，巯基嘌呤)或嘧啶，它们阻止这些物质在细胞周期的“S”期整合入DNA，终止正常的发育和分裂。它们还影响RNA合成。
抗肿瘤抗生素(亦称为抗肿瘤药和细胞毒抗生素)是抑制和抗击肿瘤发展的药物。蒽环类(其属于该组)是也可用做抗生素的抗癌剂家族。蒽环类通过破坏DNA结构并终止其功能来阻止细胞分裂。它们通过插入DNA小沟内的碱基对或通过造成DNA中核糖的自由基破坏来发挥作用。作为蒽环类实例提及的是：柔红霉素，多柔比星，表柔比星和伊达比星。属于抗肿瘤抗生素组的药物的其他实例包括抗霉素，博来霉素，普卡霉素和丝裂霉素。
植物碱来源于植物，通过阻止微管功能来阻断细胞分裂。微管对于细胞分裂来说是重要的，没有它们细胞分裂就无法发生。植物碱的主要实例包括长春花生物碱，诸如长春新碱，长春碱，长春瑞滨和长春地辛，和紫杉烷，诸如紫杉醇和紫杉萜。
拓扑异构酶抑制剂是重要的酶，其维持DNA的拓扑结构。I和II型拓扑异构酶的抑制通过扰乱正确的DNA超螺旋来干扰DNA的转录和复制。I型拓扑异构酶抑制剂的实例包括喜树碱，诸如依立替康和托泊替康，而II型拓扑异构酶抑制剂的实例包括安吖啶，鬼臼亚乙苷，鬼臼亚乙苷磷酸盐和鬼臼噻吩甙。
抗AIDS剂
抗AIDS或抗HIV剂，亦称为抗逆转录病毒药物，被设计用于治疗逆转录病毒(主要是HIV)的感染。当组合使用数种这类药物(通常3或4种)，所述方法已知为高效的抗逆转录病毒疗法，或HAART。因此，组合药物疗法是HIV和AIDS治疗中公知的方法。因此这类药剂与利用本发明方法对单独的这类或结合上述一种或更多种单克隆抗体的检测非常相关。
通过药物抑制的逆转录病毒生活周期的阶段将抗AIDS剂大致分类。一类抗AIDS剂是核苷和核苷酸逆转录酶抑制剂(NRTI)，其通过掺入新合成的病毒DNA抑制逆转录并阻止其进一步延伸。叠氮胸苷，拉米夫定，恩曲他滨(emtricitabine)，阿巴卡韦(abacavir)，富马酸替诺福韦酯(tenofovir disoproxilfumarate)和司他夫定(stavudine)是属于该组药剂的实例。
另一类抗AIDS剂是非核苷逆转录抑制剂(nNRTI)，其通过结合酶并干扰其功能直接抑制逆转录酶。依曲韦林(etravirine)，地拉韦定(delavirdine)和依法韦仑(efavirenz)，奈韦拉平(nevirapine)是这类药剂的实例。
蛋白酶抑制剂(PIs)是另一类抗AIDS剂，其通过抑制蛋白酶(其是HIV用于切割新生蛋白用于新病毒体最后组装的酶)的活性靶向病毒组装。安瑞那韦(amprenavir)，替拉那韦(tipranavir)，印地那韦，沙奎那韦，福沙那韦(fosamprenavir)，利托那韦，地瑞拉韦(darunavir)，阿扎那韦(atazanavir)和奈非那韦(nelfinavir)是属于该组的药剂的实例。
另一类型是整合酶抑制剂，其抑制整合酶(负责病毒DNA整合入感染细胞的DNA)。有数种整合酶抑制剂目前处于临床试验阶段。雷特格韦(raltegravir)是第一个得到FDA许可(2007年10月)的这类药剂。
进入抑制剂(或融合抑制剂)包括另一类抗AIDS剂。这些药剂通过封闭数种靶之一干扰HIV-1与宿主细胞的结合、融合和进入。马拉维若(maraviroc)和恩夫韦地(enfuvirtide)是现有的两种这类药剂。
另一类型是成熟抑制剂。这类药剂抑制gag过程(其中病毒衣壳多蛋白被切割)的最后一步，从而阻断多蛋白转化为成熟的衣壳蛋白(p24)。因为这些病毒颗粒具有缺陷型核，释放的病毒粒子主要由非感染性颗粒组成。Bevirimat和vivecon属于这组药剂。
协同增强子存在于该技术领域也是公知的。协同增强子单独不具有抗逆转录病毒特性，或对于单一疗法来说是不充分或不实用的，但它们与抗逆转录病毒药物联用时，它们增强所述药物中的一种或更多种的作用(通常通过改变抗逆转录病毒的代谢)。因此，当使用术语“抗AIDS剂”时，它应被理解为包括这些协同增强子。
抗生长因子
以肿瘤分泌的生长因子作为靶标的药剂可用于抗击血管发生，从而降低肿瘤生长。这类药剂的实例是bevacizumab(Avastin)，其作为针对血管内皮生长因子(VEGF)的信号阻断血管发生抑制剂提供。其他参与肿瘤血管发生的生长因子包括成纤维细胞生长因子(FGFs)和表皮生长因子(EGF)。
抗病毒剂
抗病毒剂被定义为具有刺激细胞抵御病毒的能力的物质。抗病毒剂可以例如减少细胞DNA合成，从而使细胞更加耐受病毒基因，增强细胞免疫应答或抑制病毒复制。抗病毒药物只可用于治疗一些病毒疾病，因为病毒复制与待治疗机体的细胞密切相关，使得任何显著干扰病毒复制的药物有可能对待治疗的机体造成毒性。
抗病毒剂可以被分成两组：核苷类似物和干扰素。抗AIDS剂在上文单独描述。
核苷类似物是类似核苷的合成化合物，但具有不完整或异常的脱氧核糖或核糖基团。这些化合物在感染细胞内被磷酸化为三磷酸盐形式。利用这种方式，药物与正常核苷酸竞争掺入病毒DNA或RNA。掺入生长核酸链导致与病毒聚合酶的不可逆结合以及链终止。核苷类似物的实例是无环鸟苷，丙氧鸟苷(gancyclovir)，碘苷，三氮唑核苷，双脱氧肌苷(dideoxyinosine)，双脱氧胞苷(dideoxycytidine)和叠氮胸苷。
干扰素可以被分为3类，即alpha-，beta-和gamma-干扰素。alpha-和beta-干扰素是病毒感染细胞分泌的细胞因子。它们结合相邻细胞的特异性受体，保护它们免受病毒感染。它们构成对病毒入侵的速发保护性宿主应答的一部分。除了这些直接的抗病毒作用以外，alpha-和beta-干扰素还增强感染细胞表面上I型和II型MHC分子的表达，从而增强病毒抗原对特异性免疫细胞的呈递。重组alpha-和beta-干扰素已有提供，可用于慢性乙肝和丙肝病毒感染的治疗。Gamma-干扰素(亦称为免疫干扰素)是TH1 CD4细胞分泌的细胞因子。它的功能是增强特异性T细胞介导的免疫应答。
可溶性受体
术语“受体”在本文中的使用是根据受体-配体结合背景下该术语的通常含义，不应理解为包括抗体。术语“可溶性”将受体与它们的细胞膜结合对应物区分，就像在细胞因子受体领域理解的一样。可溶性受体包括胞外(配体结合)结构域，但不含造成受体保留在细胞表面的跨膜区。可溶性受体同样通常不含胞内(细胞质)结构域。
已知存在一些受体天然存在的可溶性形式。例如，已知多种激素天然存在可溶性受体；例如，胰岛素受体，IL-2受体，胰岛素样生长因子(IGF-II)受体，EGF受体，血小板衍生生长因子(PDGF)受体，和Fc受体。这些可溶性或截短的受体看起来与它们的膜结合对应物具有类似的结合特性。可以通过重组表达将可溶性受体与其他多肽(例如Fc受体)和配体连接。
信号转导途径的异常(采用低活化(例如缺乏配体)或过活化(例如过多配体)的形式)是病理性疾病和病症(诸如关节炎，癌症，AIDS和糖尿病)的根本原因。治疗这些使人虚弱的疾病的现有策略之一包括使用受体诱饵(decoys)，诸如只由胞外配体-结合结构域组成的可溶性受体，以拦截配体从而克服受体的过活化。这种策略的实例是
Figure BDA0000066531320000251
的产生，Immunex/Amgen的二聚体可溶性TNF-alpha受体-免疫球蛋白(IgG)融合蛋白。细胞因子的TNF家族是主要促炎信号之一，由机体响应感染或组织损伤而产生。但是，这些细胞因子的异常产生(例如在没有感染或组织损伤的情况下)，已被证明是引起疾病诸如关节炎和银屑病的根本原因之一。因此，将可溶性TNF-alpha受体与免疫球蛋白G1的Fc区(其能够通过二硫键自发二聚化)融合，允许分泌二聚体可溶性TNF-alpha受体。与单体可溶性受体相比，二聚体TNF-alpha受体II-Fc融合对同型三聚配体具有大大增加的亲和力。这为其在治疗类风湿性关节炎(RA)(组成性提高的TNF-alpha在该自身免疫病中起着重要致病作用)中的临床应用提供分子基础。
由于它们在许多疾病发病机理中的重要相关性，细胞因子构成生物疗法的另一类靶标。细胞因子受体的可溶性形式参与细胞因子活性内源调节的发现激发了它们作为免疫治疗剂的潜在应用的强烈关注。
RNAi’s
RNA干扰(RNAi)是在翻译阶段或通过阻止特定基因转录来抑制基因表达的机制。RNAi靶包括来自病毒和转座子的RNA(对一些形式的先天性免疫应答是重要的)，它们还在调节发育和基因组维持方面起作用。RNAi途径由切酶(其将长的dsRNA分子切为20-25个碱基对的短片段)起始。然后将每个片段的两条链之一(称为指导链)掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，并与互补序列配对。该识别事件研究最彻底的结果是转录后基因沉默。这在指导链与mRNA分子特异性配对并诱导argonaute(RISC复合物的催化组分)的切割时发生。另一个结果是基因-组蛋白修饰和DNA甲基化-的后生转变，影响基因转录的程度。
RNA干扰是针对病毒和其他外源遗传物质的免疫应答的重要部分，特别是在植物中，它还能预防转座子的自体繁殖。通常，动物比植物表达更少的切酶变体。在一些动物RNAi已经显示产生抗病毒应答。
RNA干扰途径经常用于实验生物学，以在细胞培养物和体内模型生物体中研究基因的功能。利用与感兴趣的基因互补的序列合成双链RNA，并将其到导入细胞或生物体，在那里它被识别为外源遗传物质并活化RNAi途径。使用这种机制，研究人员可以造成靶基因表达的显著降低。对这种降低作用的研究可以显示基因产物的生理作用。因为RNAi不能完全消除基因的表达，这种技术有时被称为“敲低(knockdown)”，以将其与“敲除(knockout)”方法(其中基因表达被完全消除)区分。
可以在治疗中使用RNA干扰。尽管由于干扰素应答很难将长dsRNA链引入哺乳动物细胞，短干扰RNA模拟物的使用已经是更成功的。进入临床试验的第一次应用是黄斑变性和呼吸道合胞病毒的治疗，还显示RNAi在小鼠模型中诱导的肝功能衰竭的逆转方面是有效的。
其他建议的临床用途涉及抗病毒疗法，包括癌细胞中病毒基因表达的抑制，HIV的宿主受体和共同受体(coreceptors)的敲低，甲肝和乙肝基因的沉默，流感基因表达的沉默，和囊虫病毒复制的抑制。还建议对神经变性疾病的有效治疗，应特别关注多聚谷氨酰胺疾病诸如亨廷顿氏病。RNA干扰还经常被认为是治疗癌症的有希望的方法，通过沉默在肿瘤细胞中差异上调的基因或参与细胞分裂的基因。RNAi用于临床应用的关键研究领域是开发安全的输送方法，迄今为止其主要包括类似于供基因治疗的病毒载体系统。
疫苗
疫苗是用于建立或改善对特定疾病的免疫的生物制品。疫苗可以预防性的(例如预防或改善任何天然或“野生”病原体将来感染的影响)或治疗性的(例如用于治疗医学病症诸如癌症的疫苗)。疫苗可以由死的或灭活的生物体或源自它们的纯化产物制备。存在4种类型的传统疫苗。
一种类型是包含杀死的微生物的疫苗。这些是已经用化学或者热灭活的之前有毒力的微生物。实例是抗流感，霍乱，腺鼠疫和甲肝的疫苗。
另一种类型是包含活的、减毒病毒微生物的疫苗。这些是在使它们的有毒特性无效的条件下培养的活微生物，或与危险微生物密切相关，但自身危险性较低并产生广泛免疫应答的活微生物。它们通常引起更持久的免疫应答，对于健康成人来说是优选的类型。实例包括黄热病、囊虫、风疹和汗毒。活的肺结核疫苗不是传染性菌株，但相关菌株称作“BCG”；它在美国使用的非常频繁。
第三种类型的疫苗是类毒素。类毒素是一种细菌毒素(通常是外毒素)，已经通过化学(福尔马林)或热处理将其毒性减弱或抑制，而其他特性(通常是免疫原性)被维持。类毒素可用作疫苗，因为它们诱导针对原始毒素的免疫应答或增加针对另一抗原的应答。例如，破伤风类毒素来源于引起破伤风的破伤风杆菌(Clostridium tetani)产生的破伤风痉挛毒素。破伤风类毒素用于开发富含血浆的疫苗。
第四种类型的疫苗被称作亚单位。并不是向免疫系统引入灭活或减毒的微生物(其将构成“整体试剂(whole-agent)”疫苗)，其片段可以产生免疫应答。实例包括抗HBV的亚单位疫苗，其仅仅由病毒的表面蛋白(在酵母中产生)组成，和抗人乳头瘤病毒(HPV)的病毒样粒子(VLP)疫苗，其由病毒主要衣壳蛋白组成。
大量的创新疫苗也在开发和使用。这些包括偶联物，重组载体和DNA接种。偶联技术利用以下事实，一些细菌具有免疫原性很差的多糖外包被。通过将这些外包被与蛋白(例如毒素)连接，可以引导免疫系统识别多糖，就像它是蛋白抗原一样。这种方法被用于流感嗜血杆菌B疫苗。在重组载体技术中，一种微生物的生理特性与另一微生物的DNA结合，从而可以产生抗具有复杂感染过程的疾病的免疫性。DNA接种是从感染物的DNA产生的新型疫苗。它通过将病毒或细菌的DNA插入(和表达，触发免疫系统识别)到人或动物细胞起作用。识别表达蛋白的免疫系统的一些细胞将引发抗这些蛋白以及表达它们的细胞的攻击。因为这些细胞存活较长时间，如果后来遇到通常表达这些蛋白病原体，它们将立刻被免疫系统攻击。DNA疫苗的一个优点是它们非常便于生产和保存。
实施例
实施例1
为了能够挑选具有最高功效和效力的组合药物，必须能够以高通量方式筛选大量组合。这类任务是不平常的，因为40种药物候选物按照10种的组合可以组合出超过8亿种方式。最感兴趣的混合物是称为“特有组合”的混合物，它们是不包含重叠药物候选物的混合物。在r种药物候选物的混合物中n种药物候选物的特有组合(UC)的数目利用下列等式计算：
UC = n ! ( n - r ) ! * r !
该函数描述抛物线。对于非常大数目的待测组合的一种解决方案是分为药物候选物组并且在更小的混合物中对其进行检测。一旦鉴定出这些更小混合物的最佳组合，它们可以组合产生更大的组合，然后对其进行检测。挑选方法的概要可以参加图1。
方法
将大量具有作为单一药物的已知活性的药物候选物分到最多32个的组，然后在1种、2种或更多种功能性测定中检测这些药物候选物的所有可能3-混合物的活性。在每组中，挑选对混合物的活性贡献最大的药物候选物，必要时分为一组或更多组，再次检测所有可能的3-混合物(图1)。重复该方案直至挑选的药物候选物数目是12或更少。然后检测12种药物候选物中所有可能的2-和3-混合物，并对这些组合中20种最有效的进行滴定。然后挑选最有效的2和3-混合物作为先导候选物。然后挑选最有效的特有2-和3-混合物(不包含重叠的药物候选物)，并作为单一药物处理。然后检测这些预定药物组合的所有可能2-和3-混合物，并对这些混合物组合中20种最有效的进行滴定。滴定后挑选药物候选物中最有效的4，5，6，7，8或9种混合物作为先导候选物。最后，可以采用大量测定比较先导候选物以确定最佳药物组合。
实施例2
实施例2描述以高通量方式产生最多32种药物候选物的2，3，4和5混合物的方式。
方法
将所选数目的药物候选物分到最多8个的组用于96孔板，最多16个用于384孔板和最多32个用于1536孔板。然后将药物候选物稀释到合适的浓度并转移到源板(饲喂板(feeder plates))，这样的话第一块源板包含每孔具有一种药物候选物的列。第二块源板包含每孔具有一种药物候选物的列。使用自动移液系统诸如
Figure BDA0000066531320000291
3000实验室自动化工作站(Beckman Coulter)将规定体积的药物候选物从源板的第一列转移到8块96孔板，16块384孔板或32块1536孔板的所有列。添加下一层药物候选物，通过将类似体积的药物候选物从第二源板的列转移到接收板(目标板)的相应列。
添加第三层，通过将类似体积的第二源板第一列的内容物转移到第一接收板的所有列，然后将第二源板第二列的内容物转移到第二接收板的所有列。添加8种药物候选物的第一、第二和第三层到96孔板后，接收板布局的示意图显示于图2。A)层1，B)层1+2和C)层1+2+3。用不同的灰度显示8种药物候选物。
可以添加第四或第五层药物候选物，通过重复最后一次的方法，接收板数目增加的倍数为用于4层的药物候选物的数目再乘以用于5层的药物候选物的数目。就96孔板中8种药物候选物来说，对于4层指定64块板，对于5层指定512块板。
结果
在这类基质样模式中产生药物候选物的混合物具有数种明显的优点。一种优点是在接收板上位于不同位点的多孔(该情况下是6个)中产生所有特有的混合物(图2)。这对药物候选物混合物的功能测试是最适的，因为板间和板内的变异以及潜在的生物变异被均衡。还产生包含2/3的一种药物候选物和1/3的第二药物候选物的混合物。将这些置于不同的板中，并重复3次。这些混合物，称为偏倚混合物，可以提供关于单个药物候选物对组合的贡献的有用信息。
实施例3
本实施例说明实施例1和2描述的方法，通过将23种抗体分到12种抗体的组，然后按照384孔模式采用标准活性测定检测3种抗体的所有组合。挑选出所述23种中12种最有效的抗体，再次检测3种抗体的所有可能组合。
方法
经证实结合人EGF受体(EGFR)的23种抗体，编号为1024，1030，1183，1194，1211，1214，1242，1254，1255，1257，1260，1261，1277，1284，1305，1308，1317，1320，1449，1564，1565和1566，被挑选用于筛选。将每种抗体用1×PBS稀释到40μg/ml的浓度，然后添加到96孔源板中。在每一组中，使用2000实验室自动化工作站(Beckman Coulter)将2μl 12种抗体添加到12块384孔板的孔(包含30μl培养基)中，这样的话A行包含2μl第一种抗体，B行2μl第二种抗体等等直至全部12块板的所有12行都包含抗体。然后添加下一层抗体；这次将第一种抗体添加到第1列，第二种抗体到第2列等等，直至所有12块板的所有孔都包含两种抗体。然后添加第三层，通过将2μl抗体1移液到板1的所有孔，2μl抗体2到板2的所有孔等等，直至所有孔都包含6μl体积的3种抗体。每孔的最终抗体浓度是4μg/ml。
然后向包含抗体的所有孔以及不含抗体的两列(用做阴性对照)添加包含500个A431NS细胞的30μl培养基。然后将板在37℃的湿润培养箱中温育3天，随后向所有板的孔中添加8μl用1×PBS按1∶1稀释的细胞增殖剂WST-1。此后将板在37℃温育1小时。然后将板转移到摇床，再温育1小时。在ELISA读数器上测量450和620nm(参考波长)处的吸光度。代谢活性细胞(MAC)的量如下计算为未处理对照的百分比：
Figure BDA0000066531320000302
假定代谢活性与活细胞的数目有关。
结果
将23种抗体分为两个随机组，每组12种抗体，这样的话组1包含抗体992，1024，1030，1211，1214，1254，1255，1260，1261，1277，1284和1320，而组2包含抗体1183，1194，1242，1255，1257，1305，1308，1317，1449，1564，1565和1566。因为奇数的原因，两组都包含抗体1255。如上所述产生每组内抗体所有可能的3-混合物，检测其对细胞生长的影响。计算12种单克隆抗体，220种特有的抗体混合物和132种偏倚(skewed)混合物的％MAC。然后按照它们对细胞生长的影响将混合物分级。为了能够挑选对混合物功效贡献最大的抗体，针对抗体绘制包含特定抗体的混合物的％MAC，并计算中位％MAC。包含组1和组2抗体的混合物的％MAC的散布点图可以参见图3。很明显组1抗体992，1024，1030，1254，1261和1320是混合物中最有效的，而抗体1257，1308，1449，1564，1565和1566是组2混合物中最有效的。与组2抗体的混合物相比，组1抗体表现的更有效，尽管组之间不能直接比较，因为它们来自于不同的实验。从每组挑选6种抗体用于最终组。这些抗体是992，1024，1030，1257，1261，1284，1308，1320，1449，1564，1565和1566。20种最有效混合物的％MAC值以及第二轮筛选结果的散布点图显示于图4。最高效的两种混合物是992+1308+1566和992+1308+1320。实际上，19种最高效的混合物包含抗体992，表明该抗体与其他抗EGFR抗体结合表现良好。尽管抗体992自身是相当高效的，发现其被其他抗体增强。
实施例4
本实施例描述按照类似的活性测定对实施例3中挑选的12种抗体的所有可能2-混合物的检测。
方法
发现对3-混合物的功效贡献最大的12种抗体，即992，1024，1030，1257，1261，1284，1308，1320，1449，1564，1565和1566，检测其所有可能的2-混合物。将每种抗体用1xPBS稀释到40μg/ml的浓度，然后添加到96孔源板中。在每一组中，使用3000实验室自动化工作站(Beckman Coulter)将3μl 12种抗体添加到一块384孔板的孔(包含30μl培养基)中，这样的话A行包含3μl第一种抗体，B行3μl第二种抗体等等直至所有12行都包含抗体。然后添加下一层抗体，这次将第一种抗体添加到第1列，第二种抗体到第2列等等，直至所有12块板的所有孔都包含总体积6μl的两种抗体。每孔的最终抗体浓度是4μg/ml。
然后向包含抗体的所有孔以及不含抗体的两列(用做阴性对照)添加包含500个A431NS细胞的30μl培养基。然后将板在37℃的湿润培养箱中温育3天，随后向所有板的孔中添加8μl用1×PBS按1∶1稀释的细胞增殖剂WST-1。此后将板在37℃温育1小时。然后将板转移到摇床，再温育1小时。在ELISA读数器上测量450和620nm(参考波长)处的吸光度。如上所述计算代谢活性细胞(MAC)的量。
结果
计算12种单克隆抗体和66种特有抗体混合物的％MAC。然后按照它们对细胞生长的影响将混合物分级，具有最高功效的20种混合物显示于图5(顶部)。抗体992和1024的组合具有最高功效。混合物％MAC的散布点图可以参见图5(底部)。此外，很明显抗体992结合其他抗体表现良好。
所有此处引用的专利和非专利文献均在此完整引入作为参考。

Claims (28)

1.一种鉴定和挑选具有或贡献功能性作用的化学实体的方法，以便提供包括至少2种显示所需功能性作用的化学实体的混合物，所述方法包括以下步骤：
a)提供n种样品，每种样品包括待测的化学实体，
b)将所述n种样品中的2种或更多种以所有可能的组合进行混合以便获得第一组待测的混合物，
c)对所述第一组混合物进行能测量功能参数的功能性测定，以便鉴定贡献功能性作用的化学实体，
d)挑选出m种样品，每种样品包括在步骤c)中贡献功能性作用的化学实体，其中m小于n；
e)将所述m种样品中的两种或更多种以所有可能的组合进行混合以便获得第二组待测的混合物；
f)对所述第二组混合物进行能测量功能参数的功能性测定，以便鉴定贡献功能性作用的化学实体；和
g)挑选具有所需功能性作用的混合物。
2.权利要求1的方法，其中对各包含m种所选样品的单独亚库(sub-pools)重复步骤d、e和f。
3.权利要求2的方法，其中步骤d、e和f被重复1，2，3，4，5，6，7，8，9或10次，并且所述步骤是平行地或顺序地重复的。
4.权利要求1到3中任意一项的方法，其中，通过在步骤b中混合所述n种样品中的3种来鉴定和挑选含3种化学实体的混合物。
5.权利要求2或3中任意一项的方法，其中通过在步骤b中混合所述n种样品中的3种来鉴定和挑选含3种化学实体的混合物，并且在步骤(e)中混合所述m种样品中的3种。
6.权利要求1到5中任意一项的方法，所述方法包括以下步骤：
d1)挑选具有所需功能性作用的m1混合物；
e1)将步骤d1中挑选的所述m1混合物中的2，3，4或5种以所有可能的组合进行混合；
f1)对步骤e1的所述混合物进行能测量功能参数的功能性测定，以便鉴定贡献功能性作用的混合物；和
g1)从步骤e1的混合物中挑选出具有所需功能性作用的第二混合物。
7.权利要求6的方法，所述方法还包括以下步骤：
h)将步骤g1获得的2，3，4或5种所选混合物混合，
i)对所述混合物进行能测量功能参数的功能性测定，以便鉴定贡献功能性作用的混合物，和
j)挑选具有所需功能性作用的第三混合物。
8.权利要求6或7的方法，其中任何化学实体只在步骤e1混合的任一种混合物中出现一次。
9.权利要求8的方法，其中任何化学实体只在步骤h混合的任意混合物中出现一次。
10.权利要求1到9中任意一项的方法，其中通过将包括所述化学实体的混合物的功能性作用与不包括所述化学实体的一种或更多种混合物的功能性作用进行比较，以鉴定特定的化学实体是否贡献功能性作用。
11.权利要求1到9中任意一项的方法，其中通过将包括所述化学实体和其他化学实体的混合物的功能性作用与只包括所述化学实体的混合物的功能性作用进行比较，以鉴定特定的化学实体是否贡献功能性作用。
12.权利要求1到9中任意一项的方法，其中通过将包括所述化学实体的混合物的功能性作用与参照值进行比较，以鉴定特定的化学实体是否贡献功能性作用。
13.权利要求12的方法，其中所述参照值是预定值，经鉴定的包括所述化学实体的混合物的功能性作用必须高于、等于或小于所述预定值以确认所述化学实体贡献功能性作用，或所述参照值是一个区间，经鉴定的包括所述化学实体的混合物的功能性作用必须位于所述区间内以确认所述化学实体贡献功能性作用。
14.权利要求1到9中任意一项的方法，其中通过鉴定在具有功能性作用的混合物中最常出现的化学实体，以鉴定贡献功能性作用的化学实体。
15.权利要求1到14中任意一项的方法，其中n是3以上的整数，优选的具有3到1440之间的值，更优选的3到360，甚至更优选的3到120，甚至更优选的3到24，和特别优选的3到12。
16.权利要求1到15中任意一项的方法，其中m是整数，具有3或更大的值，优选的具有3到720的值，更优选的3到360，甚至更优选的3到120，甚至更优选的3到24，和特别优选的3到12。
17.权利要求1到16中任意一项的方法，其中任一种待测化学实体中包括的化合物选自抗体，抗生素，抗癌剂，抗AIDS剂，抗生长因子，抗病毒剂，可溶性受体，细胞因子，RNAi′s，疫苗及其混合物。
18.权利要求17的方法，其中待测化学实体中包括的化合物是两种或更多种抗体的组合；或一种或更多种抗体组合至少一种非抗体化合物，例如所述非抗体化合物选自抗生素，抗病毒剂，抗癌剂，抗自身免疫病剂和RNAi′s。
19.权利要求17或18的方法，其中待测化学实体中包括的化合物是单克隆抗体。
20.权利要求19的方法，其中待测化学实体中含有的化合物包括：a)一种或更多种单克隆抗体，和b)至少一种其他治疗剂，其与a)的一种或更多种抗体一起提供所需功能性作用。
21.权利要求1到20中任意一项的方法，其中待检测的功能参数选自生理作用的发挥，与配体的结合，催化活性的发挥，对催化活性的易感性，药剂的跨生物膜运送的变化的促进，药剂向胞内小室中的移位的变化的促进，对真核细胞群中至少一种基因的表达的影响，对真核细胞群中生长或代谢的影响，对靶细胞的影响，对病原体的影响，对继发性免疫作用的影响，对待表达、制备或配制的化合物的功能的影响，和对稳定性的影响。
22.权利要求21的方法，其中将待测混合物用于能够测量功能参数的两种或更多种功能性测定，以便独立的测量每种混合物的两种或更多种功能参数。
23.权利要求21或22的方法，其中所述功能参数是对真核细胞群的生长或代谢的影响，对靶细胞的影响或所述化合物对靶细胞的影响。
24.权利要求1到23中任意一项的方法，其中所述方法在多孔板中进行和/或利用自动化移液管和/或利用机器人进行。
25.一种用于在包括至少2种化学实体的混合物中鉴定和挑选化学实体间最佳化学计量比的方法，所述混合物显示所需的功能性作用，该方法包括以下步骤：
aa)提供p种样品，每种样品包括所述混合物中存在的一种化学实体，
bb)将所述p种样品中的每一种稀释q次以便获得p系列样品，每个包括不同浓度的相同化学实体，
cc)将步骤aa和bb获得的2种或更多种样品以所有可能的组合进行混合以便获得待测的混合物；
dd)将所述混合物用于能够测量功能性作用的功能性测定，以便鉴定被测的功能性作用与混合物中化学实体浓度之间的关系，和
ee)挑选具有所需功能性作用的混合物。
26.权利要求25的方法，其中在步骤bb中将样品稀释2，5，10，20，50或100倍。
27.权利要求25或26的方法，其中p是2以上的整数，更优选的具有2到24之间的值，甚至更优选的2到12。
28.权利要求25到27中任意一项的方法，其中q是整数，具有1，2，3，4或5的值。
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