KR20110081284A

KR20110081284A - 조합 약물 제품에 대한 약물 후보물질의 동정방법 및 선택방법

Info

Publication number: KR20110081284A
Application number: KR1020117010325A
Authority: KR
Inventors: 미켈 반달 페데르센; 퍼-요한 메이저; 알란 젠센
Original assignee: 심포젠 에이/에스
Priority date: 2008-10-06
Filing date: 2009-10-06
Publication date: 2011-07-13
Also published as: BRPI0920032A2; AU2009301505A1; MX2011003480A; CA2739476A1; EP2335068A1; RU2011118376A; CN102265152A; WO2010040356A1; US20110224094A1; NZ592013A; EP2335068A4; IL211668A0; ZA201102178B; JP2012504770A

Abstract

새로운 조합 약물의 개발에서 기능적 효과에 기여하는 화학 물질을 동정하고 선택하는 방법이 제공된다. 둘 이상의 화합물의 조합은 상승 효과를 나타낸다. 상기 화합물은 항체, 항생제, 항암제, 항에이즈제, 항-성장 인자, 항바이러스제, 용해성 수용체, 사이토카인, RNAi의 화합물, 백신 및 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 방법은 a) 화학 물질을 각각 포함하는 n개의 샘플을 제공하는 단계; b) 상기 n개의 샘플 중 둘 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합하는 단계; c) 이 혼합물을 기능 분석으로 처리하여, 기능적 효과에 기여하는 화학 물질을 동정하는 단계를 포함한다. 단계 a 내지 c는 기능적 효과에 기여하는 단계 c로부터의 화학 물질 상에서 반복한다.

Description

조합 약물 제품에 대한 약물 후보물질의 동정방법 및 선택방법{METHOD FOR IDENTIFYING AND SELECTING DRUG CANDIDATES FOR COMBINATORIAL DRUG PRODUCTS}

본 발명은 기능적 효과를 지니거나 이에 기여하는 화학 물질(chemical entity)을 동정하고 선택하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 질환의 개선된 치료 또는 예방을 야기할 수 있는 화학 물질의 조합을 동정하기 위하여, 이러한 동정 및 선택은 새로운 조합 약물의 발견 및 개발에 유용하며, 여기에서, 둘 이상의 화합물의 조합은 함께 상승 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명은 화학 물질 간의 최적의 화학량론비(stoichiometric ratio)를 동정하고 선택하여, 최적의 성능 및 효능을 나타내는 조합 약물을 수득하는 방법에 관한 것이다.

인간 항체 반응은 천연의 폴리클로날(polyclonal)에 의한 것이다. 지금까지 개발되고 상품화된 대부분의 모든 재조합 항체 제품은 모노클로날 항체이지만, 최근에 새로운 부류의 폴리클로날 항체 제품도 또한 개발되었다. 이들은 동일하거나 상이한 표적과 결합하는 둘 이상의 별개의 항체를 포함하는 재조합 항체 조성물이며, 각각 별개로 제조되는 재조합 모노클로날 항체의 "칵테일(cocktail)", 또는 단일 뱃치(batch)에서 제조되는 재조합 폴리클로날 항체 중 어느 하나로 제조될 수 있다. 후자의 접근법은 문헌[Wiberg et al. in Biotechnol. Bioeng. 94:396-405 (2006)]에 기재되어 있다. 록텐베르크(문헌[Trends in Biotechnology, 25(9): 390-394, 2007])는 항체 조합 또는 칵테일에 관한 문헌을 검토하고, 바이러스, 용해성 분자, 이를 테면 독소 또는 성장 인자 및 세포-결합 분자, 이를 테면 HER-2 및 다른 암-관련 세포 표면 분자를 비롯한 수많은 표적 상에서의 항체 칵테일의 상승 또는 상가(additive) 효과의 예를 기재하였다. 록텐베르크는 상승적인 항체 조합을 설계하는 방법에 대해서는 어떤 지침도 제공하지 않았다.

브레겐홀트 및 하우룸(문헌[Expert Opin Biol Ther. 2004 Mar;4(3):387-96])은 많은 개체군에서 바이러스 및 박테리아와 같은 생물전쟁 물질(biowarfare agent)에 대한 광범위한 보호를 제공하기 위하여, 병원체-특이적 폴리클로날 항체가 이상적으로 주어진 표현형에 대하여 광범위한 반응성을 포함하여, 미생물이 인식되는 에피토프(epitope) 내의 돌연변이를 통해 중화 항체를 피하는 것을 막아야 함을 교시하였다.

브레겐홀트 등(문헌[Curr Pharm Des. 2006; 12(16):2007-2015])은 바이러스-특이적 폴리클로날 항체 약물을 설계하기 위한 지침을 기재하였다. 이들은 항체 조성물을 중화 인간 면역 반응과 가능한 한 밀접히 유사하게 유지하면서, 항체 레퍼토리(antibody repertoire)가 가능한 한 넓은 범위의 중화 에피토프를 커버하도록 선택되어야 하는 것으로 결론지었다.

제WO 2007/101441호에서는 재조합 폴리클로날 항-RSV 항체가 개시되어 있다. 특히, G 및 F 단백질 둘 모두 상의 다수의 에피토프에 대하여 유도되는 항-RSV 재조합 폴리클로날 항체(rpAb)가 개시되어 있다. 바람직하게는, 보존된 그룹 및 잠재적으로 서브타입(subtype)-특이적 그룹 및 스트레인(strain)-특이적 그룹에 속하는 G 단백질 에피토프는 항-RSV rpAb에 의해 커버된다.

제WO 2006/007850호에서는 모노클로날 항-RhD 항체에 대하여 잠재적 이점을 갖는 재조합 폴리클로날 항-RhesusD 항체가 개시되어 있다. 1개 초과의 항체에 의한 모든 유력한 RD 에피토프의 커버에 의하여, 항-RhD rpAb 조성물은 RhD(+) 서브타입과 상관없이, RhD(+) 아이를 임신한 RhD(-) 및 RhDVI 여성 둘 모두의 예방적 치료에 사용할 수 있다.

제WO 2007/065433호에서는 재조합 폴리클로날 항-오르토폭스바이러스(orthopoxvirus) 항체가 개시되어 있다. 폴리클로날 항체가 다수의 IMV 및/또는 EEV 입자 단백질에 대하여, 및 바람직하게는 또한, 개별 IMV/EEV 단백질 상의 다수의 에피토프에 대하여 유도되는 별개의 항체를 포함하는 것이 유익하다고 명시되어 있다. 또한, 항-오르토폭스바이러스 rpAb의 요망되는 성분으로서, 오르토폭스바이러스 관련 보체 활성화의 조절제(RCA)에 대하여 반응성을 갖는 항체가 기재되어 있다.

드보 등(문헌[Mol. Cell. Chem. 74: 117-128 (1987)])은 가능한 협동 효과에 대해 시험하기 위하여 2개의 상이한 항체의 조합에서 수행되는 분석을 포함하는, 스타필로콕커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 뉴클레아제의 억제를 위한 모노클로날 항체의 용도를 기재하였다.

모노클로날 항체는 세포증식억제제(cytostatic agent), 화학요법제, 티로신 키나아제 억제제 및 다른 항체(예를 들어, 아바스틴(Avastin)®과 함께 헤르셉틴(Herceptin)®)와 함께 조합 요법에 점점 더 많이 사용되고 있다. 이들 치료 요법을 위하여, 최적의 조합이 선택되는 것을 보장하도록 합리적인(rational) 조합 요법의 설계가 필요하다.

임상적으로 조합하여 사용되는 다른 화합물에는 항생제, 항암제, 항-에이즈제, 항-성장 인자, 항바이러스제, 용해성 수용체, RNAi의 화합물 및 백신이 포함된다.

조합 약물을 설계할 때, 2개의 상이한 목표를 목적으로 할 수 있다. 한 유형의 조합 약물에서, 화합물은 동일한 기능적 효과를 지니거나, 이에 기여할 수 있으나, 함께 조합하여 투여하는 경우, 이들은 상승 효과를 나타낸다. 또 다른 유형의 조합 약물에서, 화합물은 상이한 기능적 효과를 나타낼 수 있으며, 이에 따라, 1개 초과의 의학적 증상을 치료할 수 있는 1개의 약물을 개발할 수 있다.

최적의 약물 설계가 시초부터 명백하지 않으나, 실험적으로 확립되어야 하는 경우를 비롯하여, 다수의 잠재적인 약물 후보물질이 혼합물 내로 포함되는 경우, 상승이 달성될 것을 보장할 합리적인 약물 설계가 필요하다. 또한, 심지어 더 복잡한 경우, 예를 들어 조합 치료를 제공하도록 항체가 소분자 약물과 혼합되는 경우에, 합리적인 약물 설계에 대한 요구가 존재한다.

상이한 약물 후보물질의 최적의 혼합물을 동정하려는 시도는 특히 폴리클로날 항체 조성물에 적절하며, 이 목적은 특정 표적 항원과 특이적으로 결합하는 상이한 모노클로날 항체의 혼합물을 제공하여, 인간 및 비-인간 동물에 존재하는 것과 같은 자연 항체 반응을 가능한 한 가장 넓은 범위로 모방하려는 것이다. 한 시도는 단지 특정 폴리클로날 항체 조성물 중의 상이한 항체의 "최적의" 수를 결정하는 것, 예를 들어, 2종 또는 3종의 항체가 대략 5종 또는 10종의 항체로 수득되는 효과만큼 우수한 치료적 효과를 제공할 것인지를 결정하는 것이다. 조성물 중의 상이한 항체의 대략적인 수가 예를 들어 제조 비용 고려 사항에 기초하여 미리 결정될지라도, 최적의 조합을 동정하는 일은 간단하지 않다. 예를 들어, 목적이 5종의 항체를 포함하는 폴리클로날 조성물을 제공하는 것이고, 30종의 후보물질 항체가 있고, 이들로부터 선택된다면, 5종의 항체의 독특한 조합의 수는 142,506개이며, 6종의 항체를 포함하는 폴리클로날 조성물이 36종의 후보물질 항체로부터 선택된다면, 독특한 조합의 수는 거의 2백만 개이다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 요망되는 기능적 효과를 갖는 혼합물을 동정하기 위하여, 전형적으로 10개 초과의 다수의 화학 물질로부터 2개 이상의 물질의 혼합물을 평가하기 위한 합리적인 방법을 제공하는 것이다. 본 방법에 의해 동정한 혼합물은 하나의 특정 기능적 파라미터에 관하여 상승 효과를 나타낼 수 있거나, 또는 이들은 상이한 기능적 효과를 지니는 상이한 화학 물질이 동일한 약물에 함께 존재하는 점에서 야기되는 둘 이상의 기능적 효과를 나타낼 수 있다.

따라서, 본 발명의 제1면은

a) 시험할 화학 물질을 각각 포함하는 n개의 샘플을 제공하는 단계;

b) 상기 n개의 샘플 중 둘 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합하여, 시험할 제 1 세트의 혼합물을 수득하는 단계;

c) 상기 제1 세트의 혼합물을 기능적 파라미터를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 기능적 효과에 기여하는 화학 물질을 동정하는 단계;

d) 단계 c)에서 기능적 효과에 기여하는 화학 물질을 각각 포함하는 m개의 샘플을 선택하는 단계로서, m이 n 미만인 단계;

e) 상기 m개의 샘플 중 둘 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합하여, 시험할 제2 세트의 혼합물을 수득하는 단계;

f) 상기 제2 세트의 혼합물을 기능적 파라미터를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 기능적 효과에 기여하는 화학 물질을 동정하는 단계; 및

g) 요망되는 기능적 효과를 지니는 혼합물을 선택하는 단계를 포함하여, 요망되는 기능적 효과를 나타내는 2개 이상의 화학 물질을 포함하는 혼합물을 제공하기 위하여, 기능적 효과를 지니거나 이에 기여하는 화학 물질을 동정하고 선택하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 시험할 n개의 샘플의 모든 가능한 혼합물에 대한 정보를 합리적인 방식으로 제공한다는 점에서 독특하다. 모든 가능한 혼합물을 기능적 효과에 관하여 조사하여, 최적의 기능적 효과를 나타내는 혼합물을 동정하게 하고, 또한, 다른 화합물의 기능을 증진시키는 화합물을 선택하는 것을 가능하게 한다.

다수의 샘플을 시험해야 하는 경우, 상기에 약술된 바와 같은 본 발명의 기본 방법은 추가의 방법 단계를 포함함으로써, 추가로 합리화할 수 있다. 먼저, n개의 샘플을 하위그룹(subgroup)으로 나누고, 그 후에, 각 하위그룹 내의 샘플을 방법 단계 a, b 및 c 및 임의로 또한 단계 d, e 및 f로 처리한다. 그 다음, 각 그룹 내에서, 샘플을 단계 c 및 임의로 단계 f에서 수득한 결과를 기초로, 예를 들어 성능 또는 효능 기준에 기초하여 선택한 다음, 오직 이들 가장 유력한 화학 물질만을 포함하는 새로운 혼합물을 혼합하고 시험한다. 이러한 방식으로, 혼합물을 제조하고 기능 분석을 수행함에 의해 수행해야 하는 작업량을 최소로 유지한다. 다른 경우에는, 상당한 수의 화학 물질을 포함하는 혼합물이 목적일 수 있으며, 이러한 경우에, 더 적은 수의 화학 물질을 포함하는 가장 유력한 혼합물을 먼저 동정하고 선택한 후에, 이들 선택된 혼합물을 혼합하고 분석한다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따른 방법은 최소한의 시간과 노력으로 가장 유력하고 유효한 혼합물을 동정하기 위한 체계적이며 합리적인 방법을 제공하도록 변형된다.

본 발명의 방법의 체계적이며 합리적인 운용 방식 때문에, 예를 들어 로봇 공학에 의한 자동화에 아주 적당하다.

또 다른 면에서, 본 발명은

aa) 혼합물 중에 존재하는 하나의 화학 물질을 각각 포함하는 p개의 샘플을 제공하는 단계,

bb) 상기 p개의 샘플을 각각 q배로 희석하여, 각각 동일한 화학 물질을 상이한 농도로 포함하는 p개의 샘플의 시리즈를 수득하는 단계,

cc) 단계 aa 및 bb에서 수득한 샘플 중 둘 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합하여, 시험할 혼합물을 수득하는 단계,

dd) 상기 혼합물을 기능적 효과를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 혼합물 중의 화학 물질의 측정된 기능적 효과와 농도 간의 관계를 동정하는 단계 및

ee) 요망되는 기능적 효과를 지니는 혼합물을 선택하는 단계를 포함하여, 2개 이상의 화학 물질을 포함하며 요망되는 기능적 효과를 나타내는 혼합물 중에서 화학 물질 간의 최적의 화학량론비를 동정하고 선택하는 방법에 관한 것이다.

이는 혼합물 중에 존재하는 화학 물질 간의 최적의 화학량론비를 체계적이며 합리적인 방식으로 동정하게 한다.

도 1은 일련의 약물의 가장 유력한 조합을 동정하기 위한 본 발명에 따른 선택방법을 수행하는 하나의 방식의 계통도를 나타낸 것이다.
도 2는 8개 약물 후보물질의 제1, 제2 및 제3층의 96 웰 플레이트로의 첨가 후에, 리시버(receiver) 플레이트의 배치(layout)의 개략도를 나타낸 것이다. A) 1층, B) 1+2층 및 C) 1+2+3층. 8개 약물 후보물질을 상이한 회색 명암으로 나타내었다.
도 3은 다양한 항체를 함유하는 혼합물에 대한 A431NS 세포 성장의 MAC%(대사 활성 세포%)의 산포도를 나타낸 것이다. 각 점은 6개의 시험 웰의 평균을 나타낸다. 또한, 개별 항체를 함유하는 모든 혼합물에 대한 중간 MAC%도 나타내었다. 점선은 A431NS 세포 성장에 효과가 없는 수준을 나타낸다.
도 4는 상부에서는, 가장 높은 효능을 갖는 20개의 항체 혼합물의 평균 MAC%를 SEM과 함께 보여주는 막대 그래프를 나타낸 것이며, 하부에서는 최종 그룹 내의 특정 항체를 함유하는 모든 혼합물에 대한 A431NS 세포 성장의 MAC%의 산포도를 나타낸 것이다. 각 점은 6개의 시험 웰의 평균을 나타낸 것이다. 또한, 모든 항체 혼합물에 대한 중간 MAC%도 나타내었다. 점선은 A431NS 세포 성장에 효과가 없는 수준을 나타낸다.
도 5는 상부에서, 가장 높은 효능을 갖는 20개의 항체 혼합물의 평균 MAC%를 SEM과 함께 보여주는 막대 그래프를 나타낸 것이다. 하부에는 최종 그룹 내의 항체를 함유하는 모든 2-믹스(2-mix)에 대한 A431NS 세포 성장의 MAC%의 산포도를 나타낸 것이다. 각 점은 6개의 시험 웰의 평균을 나타낸 것이다. 또한, 모든 항체 혼합물에 대한 중간 MAC%도 나타내었다. 점선은 A431NS 세포 성장에 효과가 없는 수준을 나타낸다.

정의

본 명세서에서 사용되는 용어 "화학 물질"은 하나의 화합물 또는 둘 이상의 화합물의 조합을 의미하며, 이 조합에서 상기 둘 이상의 화합물 간의 화학량론비는 일정한 값으로 고정된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "n개의 샘플 중 둘 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합하는 것"은 각 혼합물 내에 사전-결정된 수의 화학 물질을 갖는 n개의 샘플의 모든 가능한 조합을 생성하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 3개의 샘플(즉, 3개의 상이한 화학 물질)이 모든 가능한 조합으로 혼합되는 경우에, 상이한 3 파트의 n개의 샘플 중 임의의 것을 포함하는 모든 가능한 혼합물이 생성된다. 이는 1 파트의 3개의 상이한 샘플 각각을 포함하는 혼합물(즉, 3개의 상이한 화학 물질을 함유하는 혼합물)뿐 아니라, 2 파트의 하나의 샘플(하나의 화학 물질)을 1 파트의 상이한 샘플(상이한 화학 물질)과 함께 포함하는 혼합물 및 3 파트의 단일의 샘플(즉, 단일의 화학 물질을 함유하는)을 포함하는 혼합물을 포함한다. 수학적으로, 조합의 수는 다음과 같이 기재할 수 있다:

여기에서, n은 시험할 샘플의 수이며, k는 각 혼합물 중에 혼합될 샘플의 수이다.

따라서, 혼합물의 수는 시험할 샘플의 수 및 각 혼합물 중에 함께 혼합될 샘플의 수에 따라 달라진다. 예를 들어, 3개의 샘플을 포함하는 혼합물에서 4개의 샘플이 시험된다면, 조합수는 다음과 같고, 이는 20개의 조합에 상응한다:

상기 샘플을 A, B, C 및 D로 표기하여, 하기의 20개의 조합이 수득된다:

A+A+A B+B+B C+C+C D+D+D

A+A+B B+B+C C+C+D

A+A+C B+B+D C+D+D

A+A+D B+C+C

A+B+B B+C+D

A+B+C B+D+D

A+B+D

A+C+C

A+C+D

A+D+D

본 명세서에 사용되는 용어 "폴리클로날 단백질" 또는 "폴리클론성(polyclonality)"은 바람직하게는 면역글로불린 슈퍼패밀리로부터 선택된 상이하나 상동성인 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물을 의미한다. 따라서, 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자와 상동성일 뿐 아니라 폴리클로날 단백질의 개별 구성원 간의 아미노산 서열의 상이함을 특징으로 하는 가변성 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치(stretch)를 함유한다. 이러한 폴리클로날 단백질의 공지된 예로는 항체 또는 면역글로불린 분자, T 세포 수용체 및 B 세포 수용체가 포함된다. 폴리클로날 단백질은 정의된 서브세트(subset)의 단백질 분자로 이루어질 수 있으며, 이러한 단백질 분자는 예를 들어, 원하는 표적 항원에 대한 폴리클로날 항체와 같이, 원하는 표적에 대한 공유된 결합 활성과 같은 공통의 특성에 의해 정의된다.

"항체"란 용어는 혈청의 기능적 성분을 나타내고, 종종 분자(항체 또는 면역글로불린, 단편 등)의 집합체(collection) 또는 하나의 분자(항체 분자 또는 면역글로불린 분자)로 지칭된다. 항체 분자는 특정 항원 결정인자(항원 또는 항원 에피토프)에 결합하거나 이와 반응할 수 있고, 이는 결과적으로 면역학적 이펙터(effector) 메커니즘을 유도시킬 수 있다. 개별 항체 분자는 통상적으로 단일특이적(monospecific)인 것으로 간주되고, 항체 분자의 조성물은 모노클로날(즉, 동일한 항체 분자로 구성됨) 또는 폴리클로날(즉, 동일한 항원 또는 별개의 상이한 항원 상의 동일하거나 상이한 에피토프와 반응하는 상이한 항체 분자로 구성됨)일 수 있다.

폴리클로날 항체를 구성하는 별개의 상이한 항체 분자를 "구성원"으로 명명할 수 있다. 각 항체 분자는 이것이 이의 상응하는 항원에 특이적으로 결합될 수 있게 하는 독특한 구조를 지니며, 모든 천연 항체 분자는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄의 동일한 전체 기본 구조를 지닌다. 항체는 총괄하여 면역글로불린으로도 공지되어 있다. 본 명세서에서 사용된 항체라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 본래의 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 완전한 사람 및 단쇄 항체뿐만 아니라 항체의 결합 단편, 예컨대 Fab, Fab', (Fab')₂, Fv 단편 또는 scFv 단편, 및 다합체 형태, 예컨대 이합체 IgA 분자 또는 5가 IgM을 포함한다.

"폴리클로날 항체"라는 용어는 동일하거나 상이한 항원 상에서 수 개의 상이한 특이적 항원성 결정인자에 결합하거나 이와 반응할 수 있는 상이한(다양한) 항체 분자의 조성물을 나타낸다. 일반적으로, 폴리클로날 항체의 가변성은 폴리클로날 항체의 소위 가변 영역, 특히 CDR 영역에 위치한다. 폴리클로날 항체의 구성원이 항원에 결합하는 것으로 언급되는 경우, 이것은 결합 상수가 100 nM 미만, 바람직하게는 10 nM 미만, 더욱 바람직하게는 1 nM 미만인 결합을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "2-믹스" 또는 "3-믹스"는 각각 2 또는 3개의 상이한 화학 물질, 예를 들어, 2 또는 3개의 상이한 항체를 함유하는 혼합물을 지칭한다.

"면역글로불린"이라는 용어는 보통 혈액 또는 혈청 중에서 관찰되는 항체의 혼합물의 집합적 명칭으로 사용되나, 또한 다른 공급원으로부터 유래된 항체의 혼합물을 지칭하는 데 사용되거나, 용어 "항체"와 동의어로 사용될 수도 있다. 인간 항체 분자의 부류에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있다. 각 부류의 구성원은 동일한 아이소타입(isotype)인 것으로 불리운다. IgA 및 IgG 아이소타입은 추가로 서브타입(subtype)으로 세분된다. IgA 및 IgG의 서브타입은 통상적으로 각각 IgA1 및 IgA2, 및 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 지칭한다.

"동족체(cognate) VH 및 VL 코딩 쌍" 또는 "VH 및 VL 서열의 동족체 쌍"이라는 용어는 동일한 세포내에 함유되어 있거나 이로부터 유래된 VH 및 VL 코딩 서열의 본래 쌍을 나타낸다. 따라서, 동족체 VH 및 VL 쌍은 세포가 유래된 공여체에 원래 존재하는 VH 및 VL 페어링(pairing)을 나타낸다. "VH 및 VL 코딩 쌍으로부터 발현된 항체"라는 용어는 항체 또는 항체 단편이 VH 및 VL 코딩 서열을 함유하는 벡터, 플라스미드 또는 유사한 것들로부터 생성됨을 나타낸다. 동족체 VH 및 VL 코딩 쌍이 완전한 항체로서 또는 이의 안정한 단편으로서 발현될 때, 이들은 이들이 유래된 세포로부터 원래 발현되는 항체의 결합 친화력 및 특이성을 보존한다. 동족체 쌍의 조성물이 동족체 쌍의 레퍼토리로도 불리며, 개별적으로 유지되거나 푸울링(pooled)될 수 있다.

용어 "에피토프"는 통상 항체가 결합할 항원 상의 부위를 기재하는 데 사용된다. 항원은 면역 반응을 자극하는 물질, 예를 들어 독소, 바이러스, 박테리아, 단백질 또는 DNA이다. 항원은 이것이 매우 작지 않은 한, 종종 1개 초과의 에피토프를 갖는다. 동일한 항원 상의 상이한 에피토프로의 항체 결합은 에피토프의 위치에 의존적으로, 이들이 결합하는 항원의 활성에 다양한 효과를 가질 수 있다. 항원의 활성 부위 내의 에피토프로의 항체 결합은 항원의 기능을 완전히 차단할 수 있는 반면, 상이한 에피토프에서의 또 다른 항체 결합은 항원의 활성에 영향을 갖지 않거나, 영향이 거의 없을 수 있다. 그러나, 이러한 항체는 여전히 보체(complement) 또는 다른 이펙터 메커니즘을 활성화시켜, 이에 의해 항원의 제거를 야기할 수 있다.

"수용체"는 세포의 원형질막 또는 세포질 중 어느 하나에 매립된 단백질 분자이며, 여기에 유동성 신호전달(또는 "신호") 분자가 부착할 수 있다. 수용체에 결합하는 분자는 "리간드"로 불리우며, 단백질, 펩티드, 신경전달물질, 호르몬, 약제학적 약물 또는 독소일 수 있다. 이러한 결합이 발생하는 경우, 수용체는 형태 변화를 겪고, 이는 대개 세포 반응을 개시한다. 그러나, 일부 리간드는 어떤 반응도 유도하지 않고, 단지 수용체만을 차단한다(예를 들어, 길항제). 수용체에서의 리간드-유도된 변화는 리간드의 생물학적 활성을 구성하는 생리학적 변화를 야기한다. "용해성 수용체"는 이의 막횡단(transmembrane) 영역이 없는 수용체이다. 용해성 수용체는 막 결합 수용체와 동일한 방식으로 이의 리간드와 결합할 수 있으나, 신호를 전달할 수 없다.

"상승"은 한 시스템의 최종 결과가 이의 부분의 합보다 더 큰 상황을 기재하는 데 사용되는 용어이다. 상승의 반대어는 길항이며, 길항은 조합된 2개 제제가 이들의 개별 효과로부터 예측되는 것 미만의 전반적인 효과를 갖는 현상이다. 또한, 상승은 다음을 의미할 수 있다: a) 전체가 부분의 합보다 더 큰, 서로 유익한 결합; b) 합한 작용이 개별 성분 작용의 합보다 유리한 역학적 상태; c) 따로 얻은 그들의 부분의 거동으로 예측되지 않는 전체 시스템의 거동; 또는 d) 둘 이상의 자극 또는 약물의 협동 작용. 본 문맥에서, "상승"은 일반적으로 후자의 정의, 즉, 둘 이상의 약물, 예를 들어 둘 이상의 항체의 조합의 전체 효과가 주어진 조건에서 개별 효과의 합보다 더 큰 경우를 말한다.

상세한 설명

본 발명은 이제 화합물을 시험하는 데 사용할 수 있는 기능 분석의 유형 및 본 방법에서 시험할 수 있는 화학 물질의 유형을 비롯하여, 본 방법을 어떻게 수행하는지에 관하여 더욱 상세히 기재될 것이다.

본 발명의 방법의 설명

본 발명에 따른 방법은 기능적 효과에 기여하고/거나 이를 지니는 화학 물질을 동정하고 선택하여, 요망되는 기능적 효과를 지니는 2개 이상의 화학 물질을 포함하는 혼합물을 수득하도록 고안된다. 본 방법은 이것이 2개, 3개, 또는 그 이상의 화합물이 한 약물에서 조합되는 경우, 존재할 수 있는 상승 또는 조합 효과의 동정을 가능하게 하기 때문에, 새로운 조합 약물, 특히 재조합 폴리클로날 항체를 동정하는 데 특히 적합하다. 그러나, 본 방법은 요망되는 상승 효과 또는 예를 들어, 농업 화학물질 또는 화장품 화합물의 경우에, 2개의 상이한 기능적 효과 중 어느 하나를 나타내는 2개 이상의 활성 화합물을 포함하는 다른 제품의 개발에서도 또한 용도를 찾을 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 이른바, 상술된 단계 a 내지 g의 7개 이상의 단계를 포함한다. 단계 a에서, 소정의 수의 샘플(n개의 샘플)을 제공한다. 상기 샘플은 각각 시험할 하나의 화학 물질을 포함한다. 단계 b에서, 상기 n개의 샘플 중 2개 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합하여 시험할 제1 세트의 혼합물을 야기한다. 이러한 방식으로, 혼합물의 특정 수가 체계적으로 수득되며, 이는 모드 가능한 혼합물을 조사하는 것을 보장한다. 단계 c에서는, 제1 세트의 혼합물을 각각 기능적 파라미터를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 기능적 효과에 기여하는 화학 물질을 동정한다. 단계 d에서는, 기능 분석으로부터의 정보를 사용하여, 요망되는 기능적 효과에 기여하는 화학 물질을 각각 포함하는 소정의 수의 샘플을 선택하고, 여기에서 이 단계에서 선택되는 샘플의 수(m)는 원래 샘플의 수(n)보다 더 작다. 본 발명의 기본 방법은 4개의 추가의 단계 e 내지 g를 포함한다. 단계 e에서, m개의 샘플 중 둘 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합하여, 시험할 제2 세트의 혼합물을 수득한다. 단계 f에서는, 제2 세트의 혼합물을 기능적 파라미터를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 기능적 효과에 기여하는 화학 물질을 동정한다. 그 다음, 단계 g에서, 기능 분석으로부터의 정보를 사용하여, 요망되는 기능적 효과를 지니는 혼합물을 선택한다. 단계 f에서 수행되는 기능 분석은 전형적으로, 단계 c에서 수행되는 기능 분석과 동일할 것이다. 그러나, 이들 두 단계에서, 2개의 상이한 기능 분석을 수행하는 것도 또한 가능하다. 또 다른 대안은 단계 c 및 f에서는 동일한 기능 분석을 수행하나, 하나 이상의 추가의 라운드(round)의 혼합, 분석 및 선택에서 상이한 기능 분석을 수행하는 것일 것이다. 물론, 임의의 주어진 분석 단계에서 둘 이상의 상이한 기능 분석을 수행하고, 오히려 단일 분석보다는 이들 둘 이상의 분석에서의 선택을 기초로 하는 것도 또한 가능하다.

상술된 방법에서, n개의 상이한 샘플을 기능적 효과에 관하여 시험한다. 이들 n개의 샘플은 시험할 샘플의 총수와 같거나, n개의 샘플은 샘플을 혼합하고, 기본 단계 a 내지 g로 처리하기 이전에, 소정의 수의 서브-그룹으로 세분되는 더 큰 샘플의 푸울에서 기원하는 서브-그룹을 구성할 수 있다.

더욱 자세하게, 오직 제한된 수의 샘플만을 시험하는 경우, 이들 모두를 과도한 부담 없이 기능 분석으로 처리하도록, 시험할 혼합물의 수가 충분히 제한되기 때문에, 오직 상술된 7개의 단계, 즉 단계 a 내지 g만을 포함하는 방법을 수행한다. 그러나, 만약 다수의 샘플을 시험해야 한다면, 시험할 혼합물의 모든 가능한 조합의 수도 또한 클 것이며, 기능적 효과를 측정하는 데 과도한 작업량이 필요할 수 있다. 이러한 경우에 본 발명의 방법을 합리화하기 위하여, 또 다른 체계적인 전략을 사용하여, 대상의 화학 물질을 선택할 수 있다.

따라서, 다수의 샘플을 시험하는 경우 및/또는 각 혼합물 내에 다수의 샘플이 있는 경우에, 먼저 시험할 샘플의 수를 각각 n개의 샘플을 포함하는 더 작은 서브그룹으로 세분한 다음, 단계 c에서 혼합물을 기능 분석으로 처리하기 전에, 단계 b에서 각 서브그룹 내의 상기 n개의 샘플 중 둘 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합하는 것이 유익할 수 있다.

그러나, 오직 각 서브그룹 내의 샘플만이 모든 가능한 조합으로 혼합될 것이라는 사실 때문에, 이때, 시험할 모든 샘플의 모든 가능한 혼합물이 혼합되고 기능 분석으로 처리되지 않으므로, 이러한 방법을 사용하여 가장 최적의 혼합물을 시험할 수 없을 수 있다. 제1 라운드(단계 a 내지 d)에서 시험하지 않은 조합에 대한 추가의 정보는 전형적으로 단계 e 내지 g에 기재된 바와 같은 새로운 라운드의 혼합, 기능 분석 및 선택에 의한 시험 수단에 의해 수득될 것이다. 이러한 경우에, 선택되는 m개의 샘플은 바람직하게는 새로운 혼합물이 형성되도록 상이한 서브그룹으로부터 기원한다. 샘플을 선택하는 상이한 방법이 후술될 것이다.

m개의 샘플을 선택한 후에, 단계 (e)에서 상기 m개의 샘플 중 둘 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합함으로써 새로운 혼합물을 형성한다. 이러한 방식으로 새로운 혼합물을 수득하며, 이후에 단계 (f)에서 기능 분석으로 처리하고, 여기에서 기능적 효과를 지니거나, 이에 기여하는 화학 물질을 동정하도록, 기능적 파라미터를 측정한다.

일부 경우에, 단계 a를 위해 제공되는 샘플의 수(n개의 샘플)가 매우 크며, 이러한 경우에, 다수의 단계에서 시험할 샘플의 수를 선택하여, 기능 분석을 수행하여야 하는 혼합물의 수를 가장 합리적인 방식으로 제한하는 것이 유익할 수 있다. 이는 방법 단계 (d), (e) 및 (f)를 반복함으로써 가장 적절하게 행해진다. 이러한 방식으로, 단계 c에서 선택된 샘플을 서브-푸울로 세분하고, 서브-푸울 각각은 m개의 샘플을 포함하며, 이에 대하여 방법 단계 (d), (e) 및 (f)를 수행한다. 각각의 반복에서, 선택되는 샘플의 총수가 감소한다. 숙련자는 상이한 푸울로부터의 샘플 상에 수행되는 방법 단계를 병행하여 또는 순차적으로 수행할 수 있음을 인식할 것이다.

본 발명의 방법은 2개의 샘플을 함유하는 혼합물을 시험하는 단계를 포함한다. 그러나, 이 방법은 바람직하게는 단계 b에서 n개의 샘플 중 3개 또는 임의로 3개 초과를 모든 가능한 조합으로 혼합함으로써 수행된다. 또한, 단계 (e)에서 m개의 샘플 중 3개 또는 임의로 3개 초과를 혼합하는 것이 바람직하다. 숙련자는 3개의 샘플, 예를 들어 4개, 5개, 6개 또는 7개의 샘플, 또는 심지어는 8개, 9개, 10개, 또는 그 이상의 샘플을 혼합함으로써 수득되는 혼합물도 또한 본 발명의 방법의 범주 내에 있음을 인지할 것이다.

일부 경우에, 목적은 상대적으로 다수의 상이한 화학 물질을 포함하는 혼합물을 동정하는 것일 수 있다. 이러한 혼합물의 예에는 예를 들어, 5개 내지 15개의 상이한 개별 항체를 함유하도록 고안된 재조합 폴리클로날 항체가 있다. 이러한 경우에, 이 방법은 오직 소수의 상이한 화학 물질, 예를 들어 3개의 상이한 항체 또는 시험할 다른 화학 물질만을 포함하는 혼합물을 먼저 시험한 다음, 이어서, 단계 e 내지 g에서 선택된 혼합물 중 둘 이상을 혼합한 다음, 새로운 혼합물을 기능 분석으로 처리함으로써, 시험 및 선택을 위한 새로운 혼합물을 형성하여 합리화시킬 수 있다. 따라서, 제2 라운드의 혼합, 시험 및 선택을 위하여, 처음의 기능 분석(단계 c)을 기준으로 선택되는 예를 들어 3개의 상이한 화학 물질의 혼합물은 단계 e에서 혼합되어야 하는 "샘플"로 간주될 수 있으며, 이로써 단계 f에서 기능 분석으로 처리되는 샘플이 단계 c에서 분석되는 원래 혼합물보다 더 많은 수의 상이한 화학 물질을 함유할 것이다. 본 발명의 기본 방법의 이러한 변형은 단계 c에 이은 하기의 단계에 의해 정의될 수 있다:

d1) 요망되는 기능적 효과를 지니는 m1개의 혼합물을 선택하는 단계;

e1) 단계 d1에서 선택되는 상기 m1개의 혼합물 중 2개, 3개, 4개 또는 5개를 모든 가능한 조합으로 혼합하는 단계;

f1) 단계 e1의 상기 혼합물을 기능적 파라미터를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 기능적 효과에 기여하는 혼합물을 동정하는 단계; 및

g1) 단계 e1의 혼합물로부터 요망되는 기능적 효과를 지니는 제2 혼합물을 선택하는 단계.

따라서, 단계 a 내지 g에 기재된 본 발명의 기본 방법은 필요에 따라, 예를 들어, 시험할 샘플의 총수(n) 및 최종 혼합물 중의 요망되는 상이한 화학 물질의 수에 따라 달라질 수 있다. 기본 방법이 둘 이상의 라운드의 혼합, 분석 및 선택, 즉, 단계 b, c 및 d를 포함하는 제1 라운드 및 단계 e, f 및 g를 포함하는 또 다른 라운드를 포함한다는 것이 이해될 것이다. 그러나, 환경에 따라, 이들 라운드 중 하나 또는 둘 모두를 1회 이상 반복할 수 있다.

매우 많은 수의 화학 물질을 포함하는 혼합물이 예를 들어, 약 25개 이하의 상이한 개별 항체를 함유하는 재조합 폴리클로날 항체를 목적으로 한다면, 방법은 3개 이상의 방법 단계, 즉 단계 h, i 및 j를 포함할 수 있다. 단계 h에서는, 단계 g1에서 수득되는 선택된 혼합물 중 2개, 3개, 4개 또는 5개를 혼합하고, 이후의 단계 i에서, 상기 혼합물을 기능적 파라미터를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 기능적 효과를 지니는 혼합물을 동정한다. 마지막 단계인 단계 j에서는, 요망되는 기능적 효과를 지니는 제3 혼합물을 선택한다.

상술된 기본 유형의 절차의 추가의 단계 또는 추가의 라운드를 포함함으로써 본 방법을 확장하는 것이 숙련자의 기술 내에 있을 것이다.

기능적 효과를 지니거나 이에 기여하는 화학 물질을 포함하는 샘플의 적합한 동정을 수행하기 위하여, 오직 조사하는 화학 물질 중 임의의 것이 오직 1번만 나타나는 샘플만을 비교하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 항체 3-믹스의 경우, 오직 3개 상이한 항체(즉, 2 파트의 하나의 항체 및 1 파트의 또 다른 항체, 또는 3 파트의 단일 항체를 함유하는 샘플은 배제)를 함유하는 샘플만을 비교하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 본 발명은 후술되는 바와 같이, 화학 물질 간의 최적의 화학량론비를 동정할 수 있는 방법을 제공하며, 이에 따라 상이한 농도로 존재하는 화학 물질에 기인한 기능적 효과로의 어떤 원인 제공도 배제하기 위하여, 오직 상이한 화학 물질의 농도가 동일한 혼합물만을 비교하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 접근법을 사용하여, 단계 e1 및 단계 h에서 각각 제조된 혼합물 중에 임의의 화학 물질이 오직 한번 나타나는 것이 바람직하다.

기능적 효과를 지니거나 이에 기여하는 화학 물질을 포함하는 샘플을 선택하는 경우, 많은 상이한 접근법을 사용할 수 있다. 한 접근법에서, 화학 물질 A를 포함하는 혼합물의 기능적 효과를 화학 물질 A를 포함하지 않는 1개 이상의 혼합물의 기능적 효과와 비교함으로써, 화학 물질 A가 기능적 효과를 지니거나 이에 기여하는지에 관한 동정을 수행한다. 예를 들어, 3개의 화학 물질을 함유하는 혼합물의 경우에, 화학 물질 A 및/또는 화학 물질 B를 포함하는 3개의 샘플을 모든 가능한 조합으로 혼합하고, 예를 들어, 1 파트의 화학 물질 A 및 2 파트의 화학 물질 B, 및 2 파트의 화학 물질 A 및 1 파트의 화학 물질 B를 포함하는 혼합물의 기능적 효과를 3 파트의 화학 물질 B를 포함하는 혼합물의 기능적 효과와 비교함으로써, 화학 물질 A가 기능적 효과를 지니거나 이에 기여하는지에 관한 동정을 수행할 수 있다.

또 다른 접근법에서, 다른 화학 물질과 함께 화학 물질 A를 포함하는 혼합물의 기능적 효과를 오직 화학 물질 A만을 포함하는 혼합물의 기능적 효과와 비교함으로써, 화학 물질 A가 기능적 효과를 지니거나 이에 기여하는지에 관한 동정을 수행한다.

또 다른 접근법에서, 화학 물질 A를 포함하는 혼합물의 기능적 효과를 참고치와 비교함으로써, 화학 물질 A가 기능적 효과를 지니는지에 관한 동정을 수행한다. 바람직하게는, 이러한 참고치는 사전결정된 값이다. 화학 물질 A가 기능적 효과를 지니거나 이에 기여하는 것으로 정의하기 위하여, 화학 물질 A를 포함하는 혼합물의 동정된 기능적 효과는 사전결정된 값보다 크거나, 이와 같거나, 이것보다 작아야 한다. 일부 경우에, 참고치는 한 구간(interval)일 수 있으며, 화학 물질 A가 기능적 효과를 지니거나 이에 기여하는 것으로 정의하기 위하여, 화학 물질 A를 포함하는 혼합물의 동정된 기능적 효과가 상기 구간 내에 있어야 한다. 다른 경우에, 참고치는 분석을 수행함으로써 측정되는 임의의 파라미터의 평균치, 이를 테면 혼합물을 기능 분석으로 처리할 때 측정되는 모든 값의 평균치일 수 있다.

기능적 효과를 지니거나 이에 기여하는 화학 물질을 동정하기 위한 하나의 바람직한 접근법은 기능적 효과를 지니는 혼합물 중에 가장 빈번하게 나타나는 화학 물질을 동정하는 것이다. 가장 높은 성능 및 효능을 나타내는 혼합물의 화학적 조성물을 확립하고, 그들 혼합물 중에 가장 빈번하게 나타나는 화학 물질을 동정함으로써, 특정 화학 물질이 기능적 효과에 기여하는지, 그리고 얼마나 자주 기여하는지에 관한 우수한 지표를 수득할 수 있다. 이러한 접근법은 하기 실시예 3에서 사용하였으며, 여기에서 기능 분석의 결과는 항체 992가 가장 효율적인 혼합물 20개 중 19개에서 관찰되었고(도 4 참고), 이에 따라 이 항체가 다른 항-EGFR 항체와 조합하여, 매우 잘 작동하는 것으로 결론지을 수 있다.

시험할 샘플의 수는 검색하는 조합 약물의 유형에 따라, 즉, 시험할 화학 물질이 동일한 유형(예를 들어, 항체)의 것인지 또는 화학 물질이 상이한 유형(예를 들어, 소분자 약물과 조합한 항체)의 것인지에 따라 현저하게 달라질 수 있다. 바람직하게는 n은 3 이상의 값, 예를 들어, 3 내지 1440, 바람직하게는 3 내지 360, 이를 테면 3 내지 120, 또는 더더욱 바람직하게는 3 내지 24, 이를 테면 3 내지 12의 값을 갖는 정수이다.

또한, 출발 샘플의 수에 따라, 단계 d에서 선택되는 샘플의 수(m개의 샘플)도 현저하게 달라질 수 있다. 그러나, m이 3 이상, 이를 테면 3 내지 720, 바람직하게는 3 내지 360, 이를 테면 3 내지 120, 또는 더욱 바람직하게는 3 내지 24, 이를 테면 3 내지 12의 값을 갖는 정수인 것이 바람직하다.

본 발명에서, 화학 물질의 존재에 기인하여 변경될 수 있는 기능적 파라미터를 상기 화학 물질의 부재 하에서의 파라미터와 비교하여 측정함으로써, 화학 물질 또는 화학 물질의 혼합물의 기능적 효과를 기능 분석으로 동정한다. 예를 들어, 이러한 측정할 기능적 파라미터는 다음 중 임의의 것일 수 있다:

· 물리적 효과의 발휘(exertion) - 이는 예를 들어, 형광 또는 발광의 방출, 또는 광 또는 기타 전자기 방사선의 흡수일 수 있다;

· 리간드 또는 항원으로의 결합 - 전형적인 예는 수용체 분자 또는 항체의 결합이다;

· 촉매 활성, 이를 테면 효소 활성의 발휘;

· 촉매 활성, 이를 테면 효소 활성에 대한 감수성;

· 생물학적 막을 가로지르는 제제의 변경된 수송 촉진;

· 세포내 구획 내에서 제제의 변경된 전좌(translocation) 촉진;

· 진핵 세포의 개체군에서 1개 이상의 유전자의 발현 상의 영향 - 즉, 발현 조절제(예를 들어, 전사 수준에서)로서의 화합물의 기능을 분석할 수 있다;

· 진핵 세포의 개체군의 성장 또는 대사 상의 영향 - 돌연변이화 버젼의 성장 조절제를 엔코딩하는 라이브러리를 스크리닝하는 경우에 편리함;

· 표적 세포 상의 영향 - 예를 들어, 증식, 항-증식, 분화, 아폽토시스(apoptosis), 대사 또는 약물 민감성에 대한 화합물의 효과를 시험하는 것이 가능하며, 이들 모두는 발현 생성물에 대한 스크리닝이 예를 들어, 항암 약물로서의 기능일 수 있는 발현 생성물에 대한 스크리닝의 경우, 적절할 수 있다;

· 병원성 물질(pathogenic agent) 상의 영향 - 바이러스 중화, 바이러스에 대한 결합 또는 바이러스의 사멸에 대하여 분석하는 것이 가능하며, 이와 같이, 박테리아에 대한 결합, 박테리아의 사멸, 식균 작용, ADCC, CDC 등에 대하여 분석하는 것이 가능하다;

· 2차 면역 효과상의 영향;

· 발현, 제조 또는 제제화되는 화합물의 능력상의 영향;

· 안정성 상의 영향.

"요망되는 기능적 효과"라는 용어는 임의의 요망되는 기능적 파라미터의 변경을 지칭한다. 요망되는 기능적 파라미터의 변경은 분석하는 화학 물질의 성질 및 의도한 시험관 내 또는 생체 내 효과에 따라 명백히 달라질 것이다. 전형적으로, 요망되는 기능적 효과는 문제의 화학 물질이 특정 증상에 대한 개선된 약제를 제공할 수 있음을 나타내는 것일 것이다. 예를 들어, 시험할 화학 물질이 항에이즈제로 사용된다면, 요망되는 기능적 효과는 HIV에 대한 결합 또는 HIV의 중화 증가, 또는 HIV-감염 세포의 사멸 증가일 수 있다.

새로운 약물 또는 약물 조합을 개발하는 경우, 상승 효과를 지니는 새로운 제제를 찾거나, 1개 초과의 기능적 효과를 지니는 새로운 제제를 찾을 수 있다. 예를 들어, 한편으로는 암을 치료하고, 다른 한편으로는 화학요법의 부작용을 감소시키는 약물을 개발하는 것이 대상이 될 수 있다. 또 다른 예로서, 1개 초과의 바이러스를 동시에 방해(combat)할 수 있는 인플루엔자 백신이 대상이 될 수 있다.

이러한 경우에, 본 발명에 따른 방법은 시험할 혼합물을 둘 이상의 기능 분석으로 처리하고, 여기에서, 각각의 기능 분석은 기능적 파라미터를 측정할 수 있어, 각각의 혼합물의 둘 이상의 기능적 파라미터를 독립적으로 측정하는 방식으로 변경될 수 있다. 이들 분석은 병행하여 또는 연속으로 수행할 수 있다. 시험할 기능적 파라미터는 예를 들어, 진핵 세포의 개체군의 성장 또는 대사상의 영향 또는 표적 세포 상의 영향일 수 있다.

본 발명에 따른 방법을 수행하는 임의의 방식을 사용할 수 있다. 그러나, 제조되는 혼합물의 수와 수행되는 기능 분석의 수의 면에서, 수행 방식에 일종의 자동화가 포함되는 것이 바람직하다. 따라서, 한 수행 방식에서, 방법은 멀티웰(multiwell) 플레이트에서 수행한다. 이들 플레이트는 임의의 실험실에서의 표준 장비이며, 어떤 당업자도 이들 플레이트를 사용하여 실험을 수행하는 방법을 알 것이다. 바람직하게는, 자동화된 액체 핸들링(handling)을 사용하여 혼합물을 혼합하며, 이는 조사할 혼합물을 제조하기 위하여 수행할 필요가 있는 작업량을 감소시킬 것이기 때문이다. 또한, 당업계에 공지된 장비 및 방법을 사용하여 로봇공학의 수단에 의해 기능 분석을 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 면은 둘 이상의 화학 물질을 포함하는 혼합물 중에서 화학 물질 간의 최적의 화학량론비를 동정하고 선택하여, 요망되는 기능적 효과를 수득하는 방법을 제공한다. 이 방법은 조합 약물에서 최적의 농도 수준을 찾는 데 도움이 된다. 예를 들어, 둘 이상의 항체가 동일한 혼합물 중에 존재하는 경우, 특정 표적으로의 결합에 대한 경쟁이 아마도 발생할 것임이 잘 알려져 있다. 이러한 경쟁은 혼합물 중에 존재하는 상이한 항체의 농도에 부분적으로 의존적이어서, 특정 항체의 농도가 더 높으면, 아마도 상기 항체가 표적으로의 결합을 위해 성공적으로 경쟁할 것이다. 따라서, 조합 약물의 최적의 상승 효과를 달성하기 위하여, 각 화학 물질의 농도뿐 아니라 상이한 화학 물질 간의 화학량론비를 바람직하게 최적화한다.

혼합물 중의 화학 물질 간의 최적의 화학량론비를 동정하고 확인하기 위한 본 발명에 따른 방법은 5개 이상의 단계를 포함한다. 제1 단계인 단계 aa에서, 혼합물 중에 존재하는 하나의 화학 물질을 각각 포함하는 p개의 샘플을 제공한다. 단계 bb에서, 상기 p개의 샘플을 각각 q배 희석하여, 각각 동일한 화학 물질을 포함하나, 이를 상이한 농도로 포함하는 p개의 샘플의 시리즈를 수득한다. 이후에, 단계 cc에서는, 단계 aa 및 bb에서 수득한 샘플 중 둘 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합하여, 시험할 혼합물을 수득한 다음, 단계 dd에서는, 단계 cc에서 수득한 혼합물을 기능적 효과를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 측정한 기능적 효과와 혼합물 중의 화학 물질의 농도 사이의 관계를 동정한다. 마지막 단계인 단계 ee에서는, 요망되는 기능적 효과를 지니는 혼합물을 선택한다.

단계 aa에서 제공되는 샘플의 수는 조사할 혼합물 중에 존재하는 상이한 화학 물질의 수에 상응한다. 따라서, 3개의 상이한 화학 물질을 포함하는 조합 약물을 목적으로 한다면, p는 3이다. 그러나, p는 바람직하게는 2 이상의 값, 더욱 바람직하게는 2 내지 24, 더더욱 바람직하게는 2 내지 12의 값을 갖는 정수이다.

원칙적으로, 단계 bb에서, 샘플을 해당 분야에 공지된 임의의 적합한 배율(factor)로 희석할 수 있다. 그러나, 샘플은 바람직하게는 배율 2, 5, 10, 20, 50 또는 100으로 희석할 수 있다. 임의의 샘플을 다수의 배수로 희석하여, 각각의 샘플이 상이한 농도를 갖는 일련의 샘플을 수득할 수 있다. 바람직한 방법은 샘플이 1, 2, 3, 4 또는 5회 희석되는 방법이다.

본 발명의 또 다른 면에서, 본 발명의 방법에 따라 최적으로 동정된 혼합물은 약제로서 또는 약제의 제조를 위하여 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명의 방법에 따라 선택되고 동정된 혼합물은 상술된 바와 같이, 약물뿐만 아니라, 농업 또는 화장 제품과 같은 둘 이상의 화합물을 포함하는 다른 제품에 적합할 수 있다.

본 발명에 따라 선택할 수 있는 화합물의 예

일반적으로, 인간 및 동물 신체에 투여되는 경우 유익한 효과를 갖는 것으로 알려져 있는 임의의 화합물은 본 발명에 따른 방법에서 시험하기 위한 대상이 될 것이다. 그러나, 임의의 유익한 효과, 예를 들어 약제학적 효과를 지니는 것으로 알려져 있는 않은 화합물도 또한 시험하여, 알려지지 않은 효과 또는 아마도, 하나 이상의 다른 화합물과 조합하여 시험하는 경우에 드러날 수 있는 상승 효과를 발견할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서, 시험할 화학 물질 중 임의의 것에 포함되는 화합물은 임의의 의학적 증상의 치료 또는 예방을 위한, 또는 의학적 증상의 완화 또는 단순히 인간 또는 동물의 웰-빙(well-being)을 위한 대상이 되는 임의의 화합물일 수 있다. 그러나, 바람직하게는 본 발명에 따른 방법에서 시험할 화합물이 항체, 항생제, 항암제, 항에이즈제, 항-성장 인자, 항바이러스제, 생물학적 물질(예를 들어, 용해성 수용체, 사이토카인 및 다른 단백질 포함), RNAi의 화합물, 백신 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

시험할 화학 물질에 포함되는 화합물이 항체인 경우에, 기능 분석으로 처리되는 혼합물은 둘 이상의 항체의 조합물, 또는 1개 이상의 항체가 예를 들어, 항생제, 항바이러스제, 항암제, 항-자가면역 질환 제제 및 RNAi의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다른 화합물과 조합되는 조합물일 수 있다. 바람직하게는, 시험할 화학 물질에 포함되는 화합물은 항체이며, 더욱 바람직하게는 시험할 화학 물질에 포함되는 화합물은 모노클로날 항체이다. 본 발명은 재조합 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 칵테일로 생성될 수 있는 모노클로날 항체의 최적의 조합을 동정하기 위하여, 수많은 모노클로날 항체의 조합을 시험하는 것이 특히 적합하다.

항체

본 발명의 방법에 사용할 수 있는 화합물의 한 그룹에는 에피토프를 특이적으로 인식하고 결합하는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 포함된다.

항체 또는 이의 기능적 등가물은 해당 분야에 알려져 있는 임의의 항체, 예를 들어, 포유동물로부터 유래된 모노클로날 항체 또는 합성 항체, 이를 테면 단쇄 항체 또는 항체 단편을 포함하는 혼성물(hybrid)일 수 있다. 또한, 항체의 기능적 등가물은 항체 단편, 특히 에피토프 결합 단편일 수 있다. 또한, 항체 또는 이의 기능적 등가물은 항체를 모방하는 소분자일 수 있다. 자연 발생 항체는 중쇄 및 경쇄로 이루어진 면역글로불린 분자이다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 개별 항체는 모노클로날 항체이고, 본 발명은 재조합 항체 "칵테일" 또는 재조합 폴리클로날 항체에서 사용하기에 적합한 모노클로날 항체의 혼합물을 동정하는 데 사용한다.

또한, 본 발명에 따른 항체는 2중특이적 항체, 즉, 특히 2개의 상이한 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체일 수 있다. 2중특이적 항체는 일반적으로, 모노클로날 항체로부터 출발하여, 또는 재조합 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 3중특이적 항체일 수도 있다.

바람직한 일 실시형태에 있어서, 항체의 기능적 등가물은 항체의 단편, 바람직하게는 항체 결합 단편 또는 가변 영역일 수 있다. 본 발명에 유용한 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편이 포함된다. 항체의 파파인(papain) 절단으로, 각각이 단일 항원 결합 부위를 갖는, Fab 단편으로 불리우는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 잔류 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신(pepsin) 처리로, 항원과 교차결합할 수 있는 2개의 항원 결합 단편을 갖는 F(ab')₂ 단편 및 다른 잔류 단편(이는 pFc'로 명명)이 제공된다. 또한, 중쇄 및 경쇄 코딩 영역의 관련 부분을 발현 벡터내에 삽입함으로써, 이들 단편을 재조합적으로 생성할 수 있다. 추가의 단편에는, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이적 항체가 포함될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 항체에 관한 "기능적 단편"은 Fv, F(ab) 및 F(ab')₂ 단편을 지칭한다. 바람직한 항체 단편은 항체의 그의 항원과의 선택적인 결합 능력의 일부 또는 본질적으로 모두를 유지한다.

일 실시형태에서, 항체는 유전자적으로 융합된 단쇄 분자로서, 적합한 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전자적으로 조작된 분자로 정의되는, 단쇄 항체이다. 또한, 이러한 단쇄 항체는 "단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편으로 지칭된다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 요망되는 구조를 형성하도록 보장하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. 또한, 적절한 링커를 사용하여, 단쇄 Fab 단편을 제조할 수 있다.

가변 중쇄 및 가변 경쇄 코딩 쌍의 단리 및 선택

통상의 모노클로날 항체 방법, 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)]의 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 항체를 생성할 수 있다. 모노클로날 항체를 생성하기 위한 다른 기술, 예를 들어 B-림프구의 바이러스 또는 종양원성 형질전환 또는 인간 항체 유전자의 라이브러리를 이용하는 파지 디스플레이 기술을 사용할 수 있다. 모노클로날 또는 폴리클로날 항체로 제조하기에 적합한 인간 항체를 완전히 단리하는 하나의 바람직한 방법은 심플렉스(Symplex™) 기술이며(문헌[Meijer et al., J MoI Biol. 2006 May 5;358(3):764-72]; 및 제WO 2005/042774호), 이는 원래의 중쇄 및 경쇄 페어링(pairing)을 유지하고, 하이브리도마(hybridoma) 기술에 필요한 세포 배양 단계를 피하면서, 높은 복잡성(complexity) 및 다양성을 갖는 항체 레퍼토리를 생성할 수 있다.

항체의 생성 과정은 적합한 공급원으로부터 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL)를 코딩하는 서열을 단리시켜, VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 생성하는 것을 포함한다. 일반적으로, VH 및 VL 코딩 서열을 수득하기에 적합한 공급원은 적합한 면역 반응으로 관련 표적에 반응한 적이 있는 하나 이상의 개체로부터의 혈액, 비장, 또는 골수 샘플과 같은 림프구 함유 세포 분획이다. 바람직하게는, 림프구 함유 분획은 인간 또는 관련 표적에 반응하는 인간 면역글로불린 유전자를 지니는 트랜스제닉(transgenic) 동물로부터 수집된다. 수집된 림프구 함유 세포 분획은 특정 림프구 개체군, 예컨대 B 림프구를 수득하기 위해 추가로 농축될 수 있다. 바람직하게는, 농축은 예를 들어, B 세포 및/또는 혈장 세포에 대한 계통-특이적인 세포 표면 마커 단백질을 이용하여, 자기 비드 세포 분류(MACS) 및/또는 형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 이용하여 수행한다. 바람직하게는, 림프구 함유 세포 분획은 B 세포 및/또는 혈장 세포에 대해 농축된다. 더욱 바람직하게는, 높은 CD19 및 CD38의 발현 및 중간의 CD45의 발현을 지니는 세포를 혈액으로부터 단리한다. 이들 세포는 종종 순환 혈장 세포, 조기 혈장 세포 또는 혈장 모세포라고 불리우며, 본 출원서에서는 단순화를 위하여 혈장 세포로 지칭한다.

일반적으로, VH 및 VL 코딩 서열의 단리는 임의의 방식으로 수행될 수 있고, 여기에서 VH 및 VL 코딩 서열이 벡터에 조합되어, VH 및 VL 코딩 서열 쌍의 라이브러리를 생성한다. 종래의 방식에서, VH 및 VL 코딩 서열은 벡터 내에서 무작위로 조합되어, VH 및 VL 코딩 서열 쌍의 조합 라이브러리를 생성한다. VH 및 VL 코딩 서열의 단리는 예를 들어, 트랜스제닉 동물의 사용을 포함하여, 파지 디스플레이 및 하이브리도마 기술에 의해 수행할 수 있다(하기 참고).

본 발명에서, 중쇄 및 경쇄의 원래의 페어링을 유지하여, 공여체(이것이 인간이든지 동물이든지) 내에서 자연 면역 반응에 의해 생성되는 항체의 성능 및 친화력을 유지하도록 하는 것이 바람직하다. 이는 공여체에 원래 존재하는 VH 및 VL 페어링을 유지시켜, 각 쌍이 서열이 단리되는 공여체에 의해 생성된 항체에 원래 존재하는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 쌍에 상응하는 VH 및 VL를 엔코딩하는 서열 쌍의 레퍼토리를 생성하는 것을 포함한다. 또한, 이것은 VH 및 VL 엔코딩 서열의 동족체 쌍으로도 불리며 항체는 동족체 항체라고 불린다. 바람직한 일 실시형태에서, 조합이거나 동족체인 본 발명의 VH 및 VL 코딩 쌍이 인간 공여체로부터 수득되며, 따라서 서열은 완전히 인간이다. 대안적으로, VH 및 VL 코딩 쌍은 예를 들어, HuMAb-Mouse® 기술(Medarex) 또는 XenoMouse® 기술(Abgenix/Amgen)을 사용하여, 인간 항체를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물로부터 수득할 수 있다.

VH 및 VL 엔코딩 서열의 동족체 쌍을 생성하기 위한 여러 상이한 접근법이 있다. 한 접근법은 림프구-함유 세포 분획으로부터 분류된 단일 세포로부터 VH 및 VL 엔코딩 서열을 증폭시키고 단리하는 것을 포함한다. VH 및 VL 엔코딩 서열은 따로 증폭되고 두번째 단계에서 페어링될 수 있거나 이들은 증폭 중에 페어링될 수 있다 (문헌[Coronella et al. 2000. Nucleic Acids Res. 28: E85; Babcook et al 1996. PNAS 93: 7843-7848). 대안적인 접근법은 VH 및 VL 엔코딩 서열을 세포내(in-cell) 증폭하고 페어링하는 것을 포함한다(문헌[Embleton et al. 1992. Nucleic Acids Res. 20: 3831-3837; Chapal et al. 1997. BioTechniques 23: 518-524).

공여체에서의 VH 및 VL 서열 쌍의 다양성과 닮은 VH 및 VL 엔코딩 서열 쌍의 레퍼토리를 수득하기 위해, 예를 들어, 문헌[Meijer et al(J MoI Biol. 2006 May 5;358(3):764-72) 및 제WO 2005/042774호](본 명세서에 참고로 포함됨)에 기재된 바와 같이, VH 및 VL 쌍을 가능한 한 거의 스크램블링(scrambling)(무작위적 조합)하지 않는 고-처리율 방법이 바람직하다.

바람직하게는, 구성원 쌍이 표적으로의 접종(challenge) 시에, 체액성 면역 반응을 담당하는 유전자 쌍을 반영하는 VH 및 VL 코딩 쌍의 레퍼토리를 하기 단계를 포함하는 방법에 따라 생성한다: i) 관련 표적에 대해 반응한 적이 있는 하나 이상의 공여체로부터 림프구-함유 세포 분획을 제공하는 단계; ii) 임의로, 상기 세포 분획으로부터 B 세포 또는 혈장 세포를 농축시키는 단계; iii) 상기 세포 분획으로부터의 세포를 개별적으로 다수의 용기로 분배시킴으로써, 단리된 단일 세포의 개체군을 수득하는 단계; iv) 멀티플렉스 중첩 연장 RT-PCR 절차로, 상기 단리된 단일 세포로부터 유래된 주형을 이용하여 VH 및 VL 코딩 쌍을 증폭하고 VH 및 VL 코딩 쌍의 연결을 달성시키는 단계; 및 v) 임의로, 연결된 VH 및 VL 코딩 쌍의 네스티드(nested) PCR을 수행하는 단계. 본 발명의 방법을 수행하기 전에, 단리된 동족체 VH 및 VL 코딩 쌍은 바람직하게 후술되는 스크리닝 절차로 처리한다.

일단 VH 및 VL 서열 쌍이 생성되면, 관련 항체에 대한 결합 반응성을 갖는 VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 서열을 동정하기 위한, 스크니링 절차를 수행한다. 표적에 대한 결합제의 스크리닝은 일반적으로 FACS, ELISA, FLISA 및/또는 면역돗트(immunodot) 분석과 같은 면역검출 분석으로 수행한다.

스크리닝에서 선택되는 VH 및 VL 쌍 엔코딩 서열은 일반적으로 시퀀싱(sequencing)으로 처리하고, 가변 영역의 다양성에 관하여 분석한다. 특히, CDR 영역 내의 다양성이 관심 대상이나, VH 및 VL 패밀리 대표도 또한 관심 대상이다. 이들 분석에 기초하여, 하나 이상의 공여체로부터 단리된 제제-결합 항체의 전체적인 다양성을 나타내는 VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 서열을 선택한다. 바람직하게, 모든 CDR 영역(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3) 내에서 차이가 있는 서열을 선택한다. 만약 상이한 VH 또는 VL 패밀리에 속하는 하나 이상의 동일하거나 매우 유사한 CDR 영역을 갖는 서열이 있다면, 이들도 또한 선택한다. 또한, 가변 중쇄의 CDR3 영역의 다양성에 기초하여, VH 및 VL 서열 쌍의 선택을 수행할 수 있다. 서열의 프라이밍(priming) 및 증폭 중에, 가변 영역의 프레임워크(framework) 영역 내에서 돌연변이가 발생할 수 있다. 바람직하게, 이러한 오류를 수정하여, 서열이 공여자의 서열에 완전히 상응하게 보장하며, 예를 들어, 서열이 가변 영역의 프레임워크 영역과 같은 모든 보존된 영역 내에서 완전히 인간이게 한다.

VH 및 VL 쌍을 엔코딩하는 선택된 서열의 집합체의 전체적인 다양성이 상이한 표적으로의 접종에 대한 체액성 반응에서 유전자 수준에서 관찰되는 다양성을 잘 나타내는 것으로 보장되는 경우, 선택된 VH 및 VL 코딩 쌍의 집합체로부터 발현되는 항체의 전체적인 특이성도 또한 접종된 공여체에서 생성된 항체의 특이성에 대해 나타낼 것으로, 예상된다.

트랜스제닉 동물 및 하이브리도마를 사용하여 생성되는 항체

일 실시형태에서, 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역 시스템의 부분을 지니는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모좀(transchromosomal) 동물을 사용하여 생성할 수 있다. 이들에는 트랜스제닉 및 트랜스크로모좀 마우스, 이를 테면 HuMAb® 마우스, XenoMouse® 및 KM 마우스가 포함되며, 이는 본 명세서에서 총괄적으로 "트랜스제닉 마우스"로 지칭한다.

HuMAb-마우스®는 내인성 μ 및 κ 쇄 유전자좌를 불활성화시키는 표적화 돌연변이와 함께, 재배열되지 않는 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열을 엔코딩하는 인간 면역글로불린 유전자 미니좌(miniloci)를 함유한다(문헌[Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474):856-859]). 따라서, 상기 마우스는 마우스 IgM 또는 κ의 발현 감소를 나타내고, 면역화에 대한 반응시에 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자(transgene)에서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나서 고친화도 인간 IgG, κ 모노클로날 항체를 생성한다(상기 문헌[Lonberg, N. et al. (1994)]; 문헌[Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]에서 검토; 문헌[Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93] 및 문헌[Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764: 536-546]). HuMAb® 마우스의 제조가 문헌[Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295]; 문헌[Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5:647-656]; 문헌[Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920]; 문헌[Lonberg et al., (1994) Nature 368(6474):856-859]; 문헌[Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]; 문헌[Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591]; 문헌[Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93]; 문헌[Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci 764: 536-546]; 문헌[Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851]에 상세히 기재되어 있다. 또한, 미국 특허 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,789,650호; 제5,877,397호; 제5,661,016호; 제5,814,318호; 제5,874,299호; 및 제5,770,429호(Lonberg and Kay (상기 문헌 모두))뿐 아니라, 미국 특허 제5,545,807호(Surani et al); PCT 공개 제WO 98/24884호, 제WO 94/25585호, 제WO 93/1227호, 제WO 92/22645호, 제WO 92/03918호 및 제WO 01/09187호를 참조한다.

KM 마우스는 인간 중쇄 트랜스크로모좀 및 인간 카파 경쇄 트랜스유전자를 포함한다. 또한, 내인성 마우스 중쇄 및 경쇄 유전자는 KM 마우스에서는 파괴되어, 마우스의 면역화시 마우스 면역글로불린보다는 인간 면역글로불린의 생성을 야기한다. KM 마우스의 구축 및 인간 면역글로불린을 증가시키기 위한 그의 이용은 제WO 02/43478호에 상세하게 기재되어 있다.

인간 모노클로날 항체를 생성하기 위해, 예를 들어 상기 문헌 [Lonberg, N. et al. (1994)]; 상기 문헌[Fishwild, et al. (1996)] 및 제WO 98/24884호에 기재된 바와 같이, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 트랜스제닉 또는 트랜스크로모좀 마우스(예를 들어 HCO12, HCO7 또는 KM 마우스)를 농축된 항원 및/또는 항원을 발현하는 세포의 제제로 면역화시킬 수 있다. 별법으로, 마우스는 항원을 엔코딩하는 DNA로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 첫 주입시 마우스는 6-16주령일 것이다. 예를 들어, 항원의 농축된 제제(5-50 ㎍)를 사용하여 HuMAb® 마우스를 복강내로 면역화시킬 수 있다. 정제 또는 농축된 항원 제제를 사용한 면역화가 항체를 생성시키지 않을 경우, 마우스를 항원을 발현하는 세포, 예를 들어 세포주로 면역화시켜 면역 반응을 촉진시킬 수도 있다.

모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 생성하기 위해, 면역화된 마우스로부터 비장 세포 및 림프절 세포를 단리하고 적절한 불멸화된 세포주, 예를 들어 마우스 골수종 세포주와 융합시킬 수 있다. 그 다음, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG (w/v)로 SP2/0 미분비 마우스 골수종 세포(ATCC, CRL 1581)와 융합시킬 수 있다. 웰 당 약 1 x 10⁵으로 세포를 편평 바닥 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅한 후, 통상의 시약 이외에 10% 태아 클론 혈청, 5-10% 오리겐(origen) 하이브리도마 클로닝 인자(IGEN) 및 1X HAT(SIGMA)를 함유하는 선별 배지에서 2주 동안 인큐베이션한다. 약 2주 후, HAT를 HT로 바꾼 배지에서 세포를 배양할 수 있다. 이어서, 각각의 웰을 ELISA로 인간 카파-경쇄 함유 항체에 대해, 그리고 FACS 분석으로 스크리닝할 수 있다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상 10-14일 후 배지를 관찰할 수 있다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하여 다시 스크리닝하고, 인간 IgG에 대해 여전히 양성이면 모노클로날 항체를 한계 희석법으로 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 다음, 안정한 서브클론을 시험관 내에서 배양하여 특성화를 위하여 조직 배양 배지 내에서 항체를 생산할 수 있다.

또한, 본 발명의 인간 항체는 예를 들어, 문헌[Morrison, S. (1985) Science 229:1202]에 잘 알려진 바와 같은 재조합 DNA 기술 및 유전자 트랜스펙션(transfection) 방법의 조합을 사용하여, 숙주 세포 트랜스펙토마(transfectoma)에서 생산할 수 있다.

특정 실시형태에서, a) 하나 이상의 모노클로날 항체, 바람직하게는 둘 이상의 모노클로날 항체 및 b) a)의 하나 이상의 항체와 조합하여, 상승 또는 다르게는 유익한 기능적 효과를 제공하는 하나 이상의 추가의 치료제의 유익한 조합을 동정하기 위하여, 본 발명의 방법을 사용하는 것이 관심 대상일 수 있다. 예를 들어, 항체가 박테리아 감염을 예방하거나 치료하기 위한 것인 경우, 하나 이상의 비-항체 항박테리아제(예를 들어, 항생제에 관하여 하기 참조)와 함께 둘 이상의 모노클로날 항체의 최적의 조합을 동정하는 것이 유익할 수 있다. 유사하게, 항체가 암 또는 종양 성장의 예방 또는 치료를 위한 것인 경우, 하나 이상의 비-항체 항암제(예를 들어, 항암제에 관하여 하기 참조)와 함께 둘 이상의 이러한 항암 모노클로날 항체의 최적의 조합을 동정하는 것이 유익할 수 있다. 항체가 에이즈 또는 다른 바이러스 질환의 예방 또는 치료를 지향하는 경우, 동일한 것이 적용되며, 이 경우에, 각각 하나 이상의 비-항체 항-HIV 제제 또는 항바이러스제(항-HIV 및 다른 항바이러스제에 관하여 하기 참조)와 함께 둘 이상의 이러한 항-HIV 또는 다른 항바이러스 모노클로날 항체의 최적의 조합을 동정하는 것이 유익할 수 있다. 동일한 접근법, 즉 하나 이상의 모노클로날 항체 및 바람직하게는 둘 이상의 모노클로날 항체를 이 항체와 동일한 증상의 예방 또는 치료에 대해 지향된(또는 임의로 관련 증상에 대해 지향된) 하나 이상의 비-항체 제제와 조합하는 것이 예를 들어, 동일한 자가면역 질환에 대해 지향된 공지의 또는 신규의 비-항체 제제와 함께, 자가면역 질환에 대해 지향된 모노클로날 항체의 조합물과 같이 다른 징후에서도 또한 사용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

항생제

항생제는 박테리아와 진균 둘 모두를 비롯한 미생물을 사멸시키거나 이의 성장을 중지시키는 분자로 정의할 수 있다. 또한, 박테리아를 사멸시키는 항생제는 살균제로 지칭하는 한편, 박테리아의 성장을 중지시키는 항생제는 정균제(bacteriostatic)로 지칭한다.

조합 약물로 혼입되는 경우, 이들의 기능적 효과에 대하여 시험하는 데 관심 대상일 수 있는 항생제에는 페니실린(예를 들어, 아목시실린), 세팔로스포린, 카바페넴, 모노박탐 등과 같은 β-락탐 항생제, 테트라사이클린과 같은 테트라사이클린류, 에리트로마이신과 같은 마크롤라이드 항생제, 젠타마이신, 토브라마이신 및 아미카신과 같은 아미노글리코시드, 시프로플록사신과 같은 퀴놀론, 반코마이신, 스트렙토그라민 및 폴리믹신과 같은 사이클릭 펩티드, 클린다마이신과 같은 린코사미드, 리네졸리드와 같은 옥사졸리디노, 술피속사졸과 같은 술파(sulfa) 항생제가 포함된다.

항암제

항암제(화학치료 약물로도 알려져 있음)는 유사분열(세포 분열)을 손상시켜, 효과적으로 빠르게 분열하는 세포를 표적으로 하는 약물로 정의할 수 있다. 이들 약물이 세포에 대한 손상을 야기함에 따라, 이들은 또한 세포독성으로 명명된다. 이들 약물 중 일부는 세포가 아폽토시스, 소위 "세포예정사"를 겪도록 야기한다.

암의 치료를 필요로 하는 인간의 치료에서 사용하는 경우, 이들 약물을 자주 다른 암 치료, 이를 테면 방사선 요법 또는 외과술과 조합하여 사용하는 것이 잘 알려져 있다. 대안적으로, 동시에 다수의 상이한 약물로 환자를 치료할 수 있다. 약물은 그 메카니즘과 부작용이 다르나, 조합 투여의 가장 큰 이점은 상기 항암제 중 임의의 하나를 향한 내성이 발생할 기회가 최소화된다는 점이다. 따라서, 조합 약물로 사용하는 경우, 상승 효과에 대해 항암제를 시험하는 것은 상술된 바와 같이 하나 이상의 모노클로날 항체와 함께, 하나 이상의 이러한 제제를 시험하는 것처럼 매우 유의미하다.

항암제의 대부분은 알킬화제, 항대사물질, 항종양 항생제, 식물 알칼로이드, 토포아이소머라제(topoisomerase) 억제제 및 다른 항종양제로 나눌 수 있다. 이들 약물 모두는 세포 분열, 또는 DNA 합성 및 기능에 어느 정도 영향을 미친다. 또한, DNA를 직접적으로 간섭하지 않는 제제를 개발하였다. 이들에는 모노클로날 항체 및 티로신 키나아제 억제제, 예를 들어 특정 유형의 암(만성 골수성 백혈병, 위장관 기질 종양)에서는 분자 이상을 직접적으로 표적으로 하는 이마티니브 메실레이트가 포함된다. 또한, 종양 세포를 직접적으로 공격하지 않고, 종양 세포 거동을 조절하는 약물도 항암제로 명명하였다. 호르몬이 이러한 분류에 속한다.

알킬화제는 세포 내에 존재하는 조건 하에서 많은 음전성(electronegative) 기에 알킬기를 부가하는 능력을 갖는다. 시스플라틴, 카보플라틴 및 옥살리플라틴이 알킬화제의 예이다. 또한, 이 그룹에 속하는 다른 제제에는 메클로레타민, 사이클로포스파미드 및 클로람부실이 포함되며, 이는 세포의 DNA를 화학적으로 변형시킴으로써 작동한다.

항대사물질은 퓨린(아조티오프린, 머캅토퓨린) 또는 피리미딘으로 가장하고, 항대사물질은 이들 물질이 세포 주기의 "S" 단계 중에 DNA내로 혼합되는 것을 막아, 정상 발생 및 분열을 중지시킨다. 또한, 이들은 RNA 합성에 영향을 미친다.

항종양 항생제(항신생물제(antineoplastic) 및 세포독성 항생제로도 알려져 있음)는 종양의 발생을 억제하고 방해하는 약물이다. 이러한 그룹에 속하는 안트라사이클린은 항암제의 패밀리이며, 항생제로도 작용한다. 안트라사이클린은 DNA의 구조를 파괴하고, 그 기능을 종결시킴으로써 세포 분열을 방지하도록 작용한다. 이들은 DNA 마이너 그루브(minor groove) 내의 염기쌍 내로 개재됨으로써, 또는 DNA 내의 리보오스의 자유 라디칼 손상을 야기함으로써 작용한다. 안트라사이클린의 예로서 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신 및 아이다루비신을 언급할 수 있다. 항종양 항생제의 그룹에 속하는 약물의 다른 예에는 안티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신 및 미토마이신이 포함된다.

식물 알칼로이드는 식물로부터 유래되며, 미세소관 기능을 막음으로써 세포 분열을 차단한다. 미세소관은 세포 분열에 필수적이며, 이들 없이는 세포 분열이 발생할 수 없다. 식물 알칼로이드의 주요한 예에는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 및 빈데신과 같은 일일초(vinca) 알칼로이드, 및 파클리탈셀 및 도세탁셀과 같은 탁산이 포함된다.

토포아이소머라제 억제제는 DNA의 위상 기하학(topology)을 유지하는데 필수적인 효소이다. I형 및 II형 토포아이소머라제의 억제는 적절한 DNA 슈퍼코일링(supercoiling)을 틀어지게 함으로써, DNA의 전사 및 복제 둘 모두를 간섭한다. I형 토포아이소머라제 억제제의 예에는 이리노테칸 및 토포테칸과 같은 캄프토테신이 포함되며, II형 토포아이소머라제 억제제의 예에는 암사크린, 에토포시드, 에토포시드 포스페이트 및 테니포시드가 포함된다.

항에이즈제

항레트로바이러스 약물로도 알려져 있는 항에이즈제 또는 항-HIV 제제는 레트로바이러스, 주로 HIV에 의한 감염의 치료를 위해 고안되었다. 몇몇의 이러한 약물(전형적으로 3개 또는 4개)을 조합하여 사용하는 경우, 이러한 접근법은 고도로 활성인 항레트로바이러스 요법 또는 HAART로 알려져 있다. 따라서, 조합 약물 요법은 HIV 및 에이즈의 치료에서 잘 알려져 있는 접근법이다. 따라서, 이러한 부류의 제제는 본 발명에 따른 방법에서 이러한 부류 단독으로 또는 상술된 바와 같은 하나 이상의 모노클로날 항체와 조합하여, 시험하기에 매우 유의미하다.

항에이즈제는 약물이 억제하는 레트로바이러스 라이프-사이클(life-cycle)의 단계에 의해 대략적으로 분류된다. 항에이즈제의 한 부류는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 역전사효소 억제제(NRTI)이며, 이 역전사효소 억제제는 새로 합성된 바이러스 DNA 내로 혼입하여, 그의 추가의 신장을 방지함으로써 역전사를 억제한다. 지도부딘, 라미부딘, 엠트리시타빈, 아바카비르, 테노포비르, 다이소프록실 푸마레이트 및 스타부딘이 이러한 그룹에 속하는 제제의 예이다.

항에이즈제의 또 다른 부류는 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제(nNRTI)이며, 이는 효소에 결합하고, 그 기능을 간섭함으로써 역전사효소를 직접적으로 억제한다. 에트라비린, 델라비르딘 및 에파비렌즈 네비라핀이 이러한 부류 내의 제제의 예이다.

프로테아제 억제제(PI)는 새로운 바이론(viron)의 최종 어셈블리를 위하여 발생기의 단백질을 절단하기 위하여 HIV가 사용하는 효소인 프로테아제의 활성을 억제함으로써 바이러스 어셈블리(assembly)를 표적으로 하는 또 다른 부류의 항에이즈제이다. 암프레나비르, 티프라나비르, 인디나비르, 사퀴나비르, 포삼프레나비르, 리토나비르, 다루나비르, 아타자나비르 및 넬피나비르는 이러한 그룹에 속하는 제제의 예이다.

또 다른 부류는 인테그라제 억제제이며, 이는 바이러스 DNA의 감염된 세포의 DNA 내로의 도입을 담당하는 효소 인테그라제를 억제한다. 현재 임상 실험 중인 인테그라제 억제제가 몇몇 있다. 랄테그라비르는 2007년 10월에 FDA 승인을 받은 첫번째 제제이다.

유입(entry) 억제제(또는 융합 억제제)는 또 다른 부류의 항에이즈제를 포함한다. 이들 제제는 몇몇 표적 중 하나를 차단함으로써 숙주 세포로의 HIV-1의 결합, 융합 및 유입을 간섭한다. 마라비로크 및 엔푸비르티드는 이러한 부류에서 현재 이용가능한 2종의 제제이다.

또 다른 부류는 성숙 억제제이다. 이러한 부류의 제제는 gag 처리의 마지막 단계를 억제하며, 여기에서 바이러스 캡시드 폴리프로테인을 절단하여, 폴리프로테인의 성숙 캡시드 단백질(p24)로의 전환을 차단한다. 이들 바이러스 입자가 결함이 있는 코어(core)를 갖기 때문에, 방출되는 비리온(virion)은 주로 비감염성 입자로 구성된다. 베비리마트 및 비베콘은 이러한 그룹의 제제에 속한다.

또한, 상승적 인핸서가 이러한 기술 분야 내에 존재하는 것이 잘 알려져 있다. 상승적 인핸서는 단독으로 항레트로바이러스 특성을 지니지 않거나, 단일요법에 부적절하거나 실행할 수 없으나, 이들이 항레트로바이러스 약물과 동시에 사용되는 경우, 이들은 하나 이상의 이들 약물의 효과를 증진시킨다(종종 항레트로바이러스의 대사를 변경시킴으로써). 따라서, 용어 "항에이즈제"가 사용되는 경우, 이들 상승적 인핸서를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

항-성장인자

종양에 의해 분비되는 성장 인자를 표적으로 하는 제제는 혈관신생을 방지하여, 이에 따라 종양 성장을 감소시키도록 사용할 수 있다. 이러한 제제의 예는 베바시주마브(Avastin)이며, 이는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 대해 지향된 신호-차단 혈관신생 억제제로서 이용가능하다. 종양 혈관신생에 속하는 다른 성장 인자에는 섬유모세포 성장 인자(FGF) 및 상피 성장 인자(EGF)가 포함된다.

항바이러스제

항바이러스제는 바이러스에 대한 세포 방어를 자극하는 능력을 갖는 물질로 정의된다. 항바이러스제는 예를 들어, 세포 DNA 합성을 감소시켜, 세포가 바이러스 유전자에 더 내성이게 만들고, 세포 면역 반응을 증진시키거나 바이러스 복제를 억제할 수 있다. 항바이러스 약물은 오직 소수의 바이러스 질환만을 치료하는데 이용가능한데, 이는 바이러스 복제가 치료할 신체 내의 세포와 매우 친밀히 관련되어, 바이러스 복제를 상당히 간섭하는 임의의 약물은 아마도 치료할 신체에 독성이 있을 것이기 때문이다.

항바이러스제는 뉴클레오시드 유사체 및 인터페론의 두 그룹으로 나눌 수 있다. 항에이즈제는 상기에 따로 기재하였다.

뉴클레오시드 유사체는 뉴클레오시드와 유사하나 불완전하거나 비정상인 데옥시-리보오스 또는 리보오스기를 갖는 합성 화합물이다. 이들 화합물은 감염된 세포 내에서 3인산염 형태로 인산화된다. 이러한 방식으로, 약물은 바이러스 DNA 또는 RNA내로의 혼입을 위해 정상 뉴클레오티드와 경쟁한다. 성장 중인 핵산 사슬 내로의 혼입은 바이러스 폴리머라제(polymerase)와의 비가역적인 회합 및 사슬 종결을 야기한다. 뉴클레오시드 유사체의 예에는 아시클로비르, 간시클로비르, 아이독수리딘, 리바비린, 다이데옥시이노신, 다이데옥시시티딘 및 지도부딘이 있다.

인터페론은 3가지 부류, 즉 알파-, 베타- 및 감마-인터페론으로 나뉠 수 있다. 알파- 및 베타-인터페론은 바이러스 감염 세포에 의해 분비되는 사이토카인이다. 이들은 인접 세포 상의 특정 수용체에 결합하고, 바이러스에 감염되는 것으로부터 이들을 보호한다. 이들은 바이러스에 의한 침습에 대한 숙주의 즉각적 보호 반응의 부분을 형성한다. 이들 직접적인 항바이러스 효과 외에, 알파- 및 베타-인터페론은 또한 감염된 세포의 표면상의 부류 I 및 부류 II MHC 분자의 발현을 증진시켜, 바이러스 항원의 특정 면역 세포로의 제시를 증진시킨다. 재조합 알파- 및 베타-인터페론이 이용가능하며, 만성 B형 및 C형 간염 바이러스 감염의 치료에 사용할 수 있다. 감마-인터페론(면역 인터페론으로도 공지됨)은 TH1 CD4 세포에 의해 분비되는 사이토카인이다. 이의 기능은 특이적인 T 세포 매개의 면역 반응을 증진시키는 것이다.

용해성 수용체

용어 "수용체"는 수용체-리간드 결합의 문맥에서 용어의 통상적인 의미에 따라 본 명세서에서 사용되며, 항체를 포함하는 것으로 해석되지 않는다. 용어 "용해성"은 사이토카인 수용체의 분야에서 이해되는 바와 같이, 수용체를 이들의 세포 막-결합 대응물(counterpart)로부터 구별 짓는다. 용해성 수용체는 세포외(리간드 결합) 도메인을 포함하나, 세포 표면상의 수용체의 보유를 야기하는 막횡단 영역이 결여되어 있다. 또한, 용해성 수용체는 일반적으로 세포내(세포질) 도메인이 결여되어 있다.

특정 수용체의 자연 발생 용해성 형태가 존재하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 다양한 호르몬에 대한 용해성 수용체가 자연 발생하는 것으로 알려져 있다: 예를 들어, 인슐린 수용체, IL-2 수용체, 인슐린-유사 성장 인자(IGF-II) 수용체, EGF 수용체, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF) 수용체 및 Fc 수용체. 이들 용해성 또는 절단형(truncated) 수용체는 이들의 막-결합 대응물의 결합 특성과 유사한 결합 특성을 갖는 것으로 보인다. 용해성 수용체는 다른 폴리펩티드, 예를 들어 Fc 수용체 및 리간드로의 재조합 발현을 통해 라이게이션될(ligated) 수 있다.

저-활성화(예를 들어, 리간드의 결여) 또는 과-활성화(예를 들어, 너무 많은 리간드) 형태의 신호 전달 경로에서의 비정상은 관절염, 암, 에이즈 및 당뇨병과 같은 병리학적 증상 및 질환의 근원적인 원인이다. 이들 소모성(debilitating) 질환을 치료하기 위한 현행의 전략 중 하나는 리간드를 방해하여, 수용체의 과-활성화를 극복하기 위하여, 오직 세포외 리간드-결합 도메인만으로 구성된 용해성 수용체와 같은 수용체 디코이(decoy)를 사용하는 것을 포함한다. 이러한 전략의 일 예는 Immunex/Amgen에 의한 이량체의 용해성 TNF-알파 수용체-면역글로불린(IgG) 융합 단백질인 Enbrel®의 생성이다. 사이토카인의 TNF 패밀리는 감염 또는 조직 손상에 대한 반응으로 신체에서 생성되는 주요 전-염증성 신호 중 하나이다. 그러나, 예를 들어, 감염 또는 조직 손상의 부재 하에서의 이들 사이토카인의 비정상적 생성은 관절염 및 건선과 같은 질환의 근원적인 원인 중 하나인 것으로 보인다. 따라서, 용해성 TNF-알파 수용체를 이황화 결합을 통하여 자발적으로 이량체화할 수 있는 면역글로불린 G1의 Fc 영역과 융합하여, 이량체의 용해성 TNF-알파 수용체가 분비되게 한다. 단량체의 용해성 수용체와 비교하여, 이량체의 TNF-알파 수용체 II-Fc 융합은 호모-삼량체(homo-trimeric)의 리간드에 대한 매우 증가된 친화력을 갖게 한다. 이는 구성적으로 상승된 TNF-알파가 중요한 원인이 되는 역할을 수행하는 류마티스성 관절염(RA), 자가면역 질환의 치료에서 이의 임상적 용도에 대한 분자적 근거를 제공한다.

많은 질환의 발병에서 사이토카인이 근본적으로 수반되기 때문에, 사이토카인은 생물치료적 접근법을 위한 또 다른 부류의 표적을 구성한다. 사이토카인 수용체의 용해성 형태가 사이토카인 활성의 내생적인 조절에 수반된다는 발표는 면역치료제로서의 유력한 이들의 적용에 상당한 관심을 촉구시켰다.

RNAi 의 화합물

RNA 간섭(RNAi)는 번역 단계에서, 또는 특정 유전자의 전사를 방해함으로써, 유전자 발현을 억제하는 메커니즘이다. RNAi 표적에는 바이러스 및 트랜스포존(transposon)(선천적 면역 반응의 일부 형태에 중요함)으로부터의 RNA가 포함되며, 이들은 또한 발생 및 게놈 유지를 조절하는데 역할을 수행한다. RNAi 경로는 효소 다이서(dicer)에 의해 개시되며, 이 효소는 긴 dsRNA 분자를 짧은 20 내지 25개 염기쌍의 단편으로 절단한다. 그 다음, 가이드(guide) 가닥으로 알려져 있는 각 단편의 두 가닥 중 하나는 RNA-유도성 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex; RISC)내로 혼입되고, 상보성 서열과 쌍을 이룬다. 이러한 인식 사건의 가장 잘 연구된 결과는 전사-후 유전자 침묵이다. 이는 가이드 가닥이 mRNA 분자와 특이적으로 쌍을 이루고, RISC 복합체의 촉매 구성성분인 아고너트(argonaute)에 의한 절단을 유도하는 경우 발생한다. 또 다른 결과는 유전자에 대한 후생학적(epigenetic) 변화 - 히스톤 변형 및 DNA 메틸화 -이며, 유전자가 전사되는 정도에 영향을 미친다.

RNA 간섭은 바이러스 및 다른 외래 유전자 물질에 대한 면역 반응의 필수적인 부분이며, 특히 식물에서, RNA 간섭은 또한 트랜스포존에 의한 자가-전달(self-propagation)을 방지할 수 있다. 일반적으로, 동물은 식물보다 더 적은 다이서 효소의 변이체를 발현한다. 일부 동물에서 RNAi는 항바이러스 반응을 생성하는 것으로 보인다.

세포 배양물 및 모델 유기체 내의 생체 내에서 유전자의 기능을 연구하기 위하여, 종종 실험 생물학에서 RNA 간섭 경로를 활용한다. 이중 가닥 RNA를 관심대상 유전자에 상보적인 서열로 합성하며, 세포 또는 유기체 내로 도입하고, 여기에서 이는 외인성 유전자 물질로 인식되고, RNAi 경로를 활성화시킨다. 이러한 메커니즘을 사용하여, 연구자는 표적화된 유전자의 발현의 급격한 감소를 야기할 수 있다. 이러한 감소의 효과를 연구하면, 유전자 산물의 생리학적 효과를 나타낼 수 있다. RNAi가 유전자의 발현을 완전히 없앨 수 없기 때문에, 유전자의 발현이 완전히 제거되는 "녹아웃(knockout)" 절차와 이러한 기술을 구별 짓기 위하여, 이러한 기술은 때때로 "녹다운(knockdown)"으로 지칭한다.

치료법에서 RNA 간섭을 활용하는 것이 가능할 수 있다. 인터페론 반응 때문에, 긴 dsRNA 가닥을 포유동물 세포내로 도입하는 것이 어렵지만, 모방하는 짧은 간섭 RNA의 사용은 더 성공적이다. 황반 변성 및 호흡기 세포융합 바이러스의 치료에 있는 임상 실험에 도달한 첫번째 적용 중에, RNAi는 마우스 모델에서 유도된 간기능부전(liver failure)의 역행에 효과적인 것으로 나타났다.

다른 제안된 임상적 용도는 암 세포에서 바이러스 유전자 발현의 억제, HIV에 대한 숙주 수용체 및 보조수용체(coreceptor)의 녹다운, A형 간염 및 B형 간염 유전자의 침묵, 인플루엔자 유전자 발현의 침묵 및 홍역 바이러스 복제의 억제를 비롯한 항바이러스 요법에 관한 것이다. 또한, 헌팅톤병과 같은 폴리글루타민 질환에 대한 특별한 관심을 가지고, 신경변성 질환에 대한 유력한 치료가 제안되었다. 또한, RNA 간섭은 종종 종양 세포에서 상이하게 상향조절되는 유전자 또는 세포 분열에 수반되는 유전자를 침묵시킴으로써 암을 치료하는 유망한 방법으로 보인다. 임상 적용을 위해 RNAi를 사용하는 주요 연구 영역은 안전한 전달 방법의 개발이며, 이는 현재까지 주로 유전자 요법에 대해 제시된 것과 유사한 바이러스 벡터 시스템을 포함한다.

백신

백신은 특정 질환에 대한 면역성을 확립하거나 개선하는 데 사용되는 생물학적 제제이다. 백신은 예방적(예를 들어, 임의의 천연 또는 "야생형" 병원체에 의한 장래의 감염의 영향을 방지하거나 완화하기 위한) 또는 치료적(예를 들어, 암과 같은 의학적 증상의 치료에 사용하기 위한 백신)일 수 있다. 백신은 사멸 또는 불활성화 유기체 또는 이들로부터 유래된 정제된 생성물로 만들 수 있다. 4가지 유형의 통상적인 백신이 있다.

한 유형은 사멸한 미생물을 함유하는 백신이다. 이들은 이전에 치명적인 미생물이며, 이는 화학물질 또는 열로 사멸한다. 예에는 독감, 콜레라, 선 페스트(bubonic plague) 및 A형 간염에 대한 백신이 있다.

또 다른 유형은 살아있는 약독화된(attenuated) 바이러스 미생물을 함유하는 백신이다. 이들은 그들의 치명적인 특성을 불가능하게 하는 조건 하에서 배양되는 생미생물 또는 위험한 미생물과 밀접하게 관련되나, 그들 자체가 덜 위험하며, 광범위한 면역 반응을 생성하는 살아있는 미생물이다. 이들은 전형적으로 더 오래가는 면역 반응을 유발하며, 건강한 성인에게 바람직한 유형이다. 예에는 황열, 홍역, 풍진 및 볼거리가 포함된다. 결핵 생백신은 전염성 스트레인(strain)이 아니고, "BCG"로 지칭되는 관련 스트레인이고; 이는 미국에서 매우 자주 사용한다.

백신의 세 번째 유형은 톡소이드이다. 톡소이드는 극 독성이 화학물질(포르말린) 또는 열 처리에 의해 약독화되거나 저해되고, 다른 특성, 전형적으로 면역원성은 유지된 박테리아 독소(보통 외독소)이다. 톡소이드는 이들이 원래 독소에 대한 면역 반응을 유도하거나 또 다른 항원에 대한 반응을 증가시키기 때문에 백신으로 유용하다. 예를 들어, 파상풍 톡소이드는 파상풍을 유발하는 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani)에 의해 생성되는 파상균 강직 독소(tetanospasmin)로부터 유래한다. 파상풍 톡소이드는 혈장 농축 백신(plasma rich vaccine)의 개발에 사용된다.

백신의 네 번째 유형은 서브유닛으로 지칭된다. 불활성화되거나 약독화된 미생물("완전한-제제(whole-agent)" 백신을 구성할 것임)을 면역계에 도입하기보다는, 그 단편이 면역 반응을 생성할 수 있다. 예에는 오직 바이러스의 표면 단백질만으로 구성된(효모 내에서 생성) HBV에 대한 서브유닛 백신 및 바이러스 주요 캡시드 단백질(major capsid protein)로 이루어진 인간 파필로마바이러스(HPV)에 대한 바이러스-유사 입자(VLP) 백신이 포함된다.

또한, 수많은 획기적인 백신이 개발 및 이용 중에 있다. 이들에는, 컨쥬게이트(conjugate), 재조합 벡터 및 DMA 백신접종이 포함된다. 컨쥬게이트 기술은 특정 박테리아가 불충분하게 면역원성인 다당류 아우터 코트를 갖는 사실을 이용하며, 면역계는 다당류가 단백질 항원인 것처럼 다당류를 인지하도록 야기할 수 있다. 이러한 접근법은 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) B 백신에 사용된다. 재조합 벡터 기술에서, 하나의 미생물의 생리 및 또 다른 미생물의 DNA를 합하여, 이에 의해 복합 감염 경로를 갖는 질환에 대하여 면역원성을 생성할 수 있다. DNA 백신 접종은 감염 물질의 DNA로부터 생성되는 새로운 유형의 백신이다. 이는 바이러스 또는 박테리아 DNA의 인간 또는 동물 세포 내로의 삽입(및 발현, 면역계 인식의 촉발)에 의해 작동한다. 발현되는 단백질을 인식하는 면역계의 일부 세포는 이들 단백질 및 이들 단백질을 발현하는 세포에 대한 공격을 시작할 것이다. 이들 세포가 장기간 생존하기 때문에, 보통 이들 단백질을 발현하는 병원체가 나중에 유입되면, 이들은 면역계에 의해 즉각 공격당할 것이다. DNA 백신의 하나의 이점은 DNA 백신이 생산하고 보관하기 매우 쉽다는 점이다.

실시예

실시예 1

가장 높은 성능과 효능을 갖는 조합 약물을 선택할 수 있도록, 고-처리율 방식으로 다수의 조합을 스크리닝할 수 있는 것이 필요하다. 40개의 약물 후보물질이 10개의 조합으로, 8억 개 초과의 방법으로 조합될 수 있음에 따라, 이러한 업무는 간단하지 않다. 가장 흥미로운 혼합물은 "독특한 조합"으로 명명된 것이며, 이는 중첩하는 약물 후보물질을 함유하지 않는 혼합물이다. r개의 약물 후보 물질의 혼합물 중에 n개의 약물 후보물질의 수의 독특한 조합(UC)의 수는 하기의 식으로부터 계산할 수 있다:

이러한 함수는 포물선 곡선을 만든다. 시험하기 위한 매우 많은 수의 조합에 대한 한 해결책은 약물 후보물질의 그룹으로 나누고, 이들을 더 적은 혼합물 내에서 시험하는 것이다. 일단 이들 더 적은 혼합물의 최적의 조합이 동정되면, 이들을 조합하여 시험할 수 있는 더 큰 조합을 생성할 수 있다. 선택 과정의 개요는 도 1로 나타낼 수 있다.

방법

단일 약물로서 공지의 활성을 갖는 일련의 약물 후보물질을 32개 이하의 그룹으로 나눈 다음, 이들 약물 후보물질의 모든 가능한 3-믹스를 하나, 둘 또는 그 이상의 기능 분석으로 활성에 대하여 시험하였다. 각 그룹에서, 혼합물의 활성에 최대로 기여하는 약물 후보물질을 선택하고, 필요에 따라, 하나 이상의 그룹으로 나누고, 모든 가능한 3-믹스로 다시 시험하였다(도 1), 선택되는 약물 후보물질의 수가 12개 이하일 때까지 이러한 과정을 반복하였다. 그 다음, 12개의 약물 후보물질을 모든 가능한 2- 및 3-믹스로 시험하고, 이들 중 가장 효율적인 20개의 조합에서 측정을 수행하였다. 그 다음, 가장 유력한 2 및 3-믹스를 리드(lead) 후보물질로 선택할 수 있다. 그 다음, 가장 유력하고 독특한 2- 및 3-믹스(중첩하는 약물 후보물질을 함유하지 않음)를 선택하고, 단일 약물로서 처리한다. 그 다음, 이들 사전결정된 약물 조합의 모든 가능한 2- 및 3-믹스를 시험하고, 이들 조합 중 가장 효율적인 20개의 혼합물에서 측정을 수행하였다. 측정 후에, 약물 후보물질의 가장 유력한 4, 5, 6, 7, 8 또는 9 믹스를 리드 후보물질로 선택할 수 있다. 마지막으로, 리드 후보물질은 가장 최적의 약물 조합을 결정하기 위하여 일련의 분석에서 비교할 수 있다.

실시예 2

실시예 2는 고 처리율 방식으로 32개 이하의 약물 후보물질의 2, 3, 4 및 5 믹스를 생성하는 방법을 기재한 것이다.

방법

선택된 수의 약물 후보물질을 96 웰 플레이트에 대해서는 8개 이하, 384 웰 플레이트에 대해서는 16개 이하 및 1536 웰 플레이트에 대해서는 32개 이하의 그룹으로 나눈다. 그 다음, 약물 후보물질을 적절한 농도로 희석하고, 공급원 플레이트(피더(feeder) 플레이트)로 전달하여, 제1 공급원 플레이트가 각 웰 내에 하나의 약물 후보물질을 갖는 열(column)을 함유하도록 한다. 제2 공급원 플레이트는 각각 하나의 약물 후보물질을 갖는 열을 함유한다. 자동화 피펫팅(pipetting) 시스템, 이를 테면 Biomek® 3000 실험실 자동화 워크스테이션(workstation)(Beckman Coulter)을 사용하여, 공급원 플레이트의 제1 열로부터 96 웰 플레이트 내의 모든 8개의 열, 384 웰 플레이트 내의 16개의 열 또는 1536 웰 플레이트 내의 32개의 열로, 특정 부피의 약물 후보물질을 전달하였다. 제2 공급원 플레이트의 열로부터 유사한 부피의 약물 후보물질을 리시버 플레이트(목적지 플레이트) 상의 상응하는 컬럼으로 전달함으로써, 약물 후보물질의 다음 층을 첨가하였다.

제2 공급원 플레이트의 제1 열의 유사한 부피의 내용물을 제1 리시버 플레이트의 모든 열로 전달한 다음, 제2 공급원 플레이트의 제2 열의 내용물을 제2 리시버 플레이트의 모든 열로 전달함으로써, 제3층을 가하였다. 8개 약물 후보물질의 제1층, 제2층 및 제3층을 96웰 플레이트에 가한 후에, 리시버 플레이트의 배치의 개략도를 도 2에 나타내었다. A) 1층, B) 1+2층 및 C) 1+2+3층. 8개 약물 후보물질을 상이한 회색 명암으로 나타내었다.

리시버 플레이트의 수를 4층을 위한 약물 후보물질의 수의 인자 및 다시 5층을 위한 약물 후보물질의 수의 인자에 의해 증가시키면서, 마지막 과정을 반복함으로써 제4층 또는 제5층의 약물 후보물질을 가할 수 있다. 96 웰 플레이트 내의 8개의 약물 후보물질의 경우에, 이는 4층을 위하여 64개 플레이트 및 5층을 위하여 512개 플레이트를 제공한다.

결과

이러한 유형의 매트릭스-유사 형식으로 약물 후보물질의 혼합물을 생성하는 것의 몇 가지의 명백한 이점이 있다. 한 가지 이점은 리시버 플레이트 상의 상이한 위치에 배치되는 다중의 웰(이 경우에는 6개) 내에서 모든 독특한 혼합물이 생성된다는 점이다. 이는 플레이트-사이 및 플레이트-내의 변이뿐 아니라 잠재적인 생물학적 변이를 동등하게 하기 때문에, 약물 후보물질 혼합물의 기능 시험에 최적이다. 또한, 2/3의 한 약물 후보물질 및 1/3의 제2의 약물 후보물질을 함유하는 혼합물을 생성한다. 이들은 또한 상이한 플레이트 상에 배치하고, 3벌로 관찰하였다. 편향된(skewed) 혼합물로 지칭되는 이들 혼합물을 조합되는 개별 약물 후보물질의 기여에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다.

실시예 3

본 실시예는 23개 항체를 12개 항체의 그룹으로 나눈 다음, 384 웰 형식의 표준 생존력 분석으로 3개 항체의 모든 조합을 시험함으로써, 실시예 1 및 2에 기재된 과정을 나타낸 것이다. 23개 중 12개의 가장 유효한 항체를 3개 항체의 모든 가능한 조합으로 다시 선택하고 시험하였다.

방법

인간 EGF 수용체(EGFR)에 대한 결합을 확인한 23개의 항체를 992, 1024, 1030, 1183, 1194, 1211, 1214, 1242, 1254, 1255, 1257, 1260, 1261, 1277, 1284, 1305, 1308, 1317, 1320, 1449, 1564, 1565 및 1566으로 지정하고, 스크리닝을 위해 선택하였다. 각각의 항체를 1xPBS 중에 40 ㎍/㎖의 농도로 희석하고, 96-웰 공급원 플레이트에 첨가하였다. 각 그룹에서, Biomek® 3000 실험실 자동화 워크스테이션(Beckman Coulter)을 사용하여, 30 ㎕의 배지를 함유하는 12개의 384 웰 플레이트 내의 웰에 2 ㎕의 23개 항체를 첨가하여, 모든 12개 플레이트 상의 모든 12개 줄이 항체를 함유할 때까지 A행이 2 ㎕의 제1 항체를 함유하고, B행이 2 ㎕의 제2 항체를 함유하는 등으로 되게 하였다. 그 다음, 다음 층의 항체를 첨가하고; 이 때, 모든 12개 플레이트 상의 모든 웰이 2개의 항체를 함유할 때까지 제1 항체를 1열에 첨가하고, 제2 항체를 2열에 첨가하는 등으로 하였다. 그 다음, 모든 웰이 6 ㎕ 부피로 3개의 항체를 함유할 때까지, 2 ㎕의 항체 1을 플레이트 1의 모든 웰에 피펫팅하고, 2 ㎕의 항체 2를 플레이트 2 상의 모든 웰에 첨가하는 등으로 하여, 제3층을 첨가하였다. 각 웰 내의 최종 항체 농도는 4 ㎍/㎖이었다.

그 다음, 500 A431NS 세포를 함유하는 30 ㎕의 배지를 항체를 함유하는 모든 웰뿐 아니라, 음성 대조군으로 기능하는 항체가 없는 2개의 열에 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 37 ℃에서 가습 인큐베이터 내에서 3일 동안 인큐베이션하고, 그 후 1xPBS 중에 1:1로 희석한 8 ㎕의 세포 증식 시약 WST-1을 모든 플레이트 상의 웰에 첨가하였다. 이후에, 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 회전식 진탕기로 옮기고 또 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 판독기 상에서 450 및 620 nm(참조 파장)에서 흡광도를 측정하였다. 대사 활성 세포(MAC)의 양을 다음과 같이 미처리 대조군의 백분율로 계산하였다:

대사 활성은 생존가능한 세포의 수와 관련이 있는 것으로 예상된다.

결과

23개의 항체를 12개의 무작위 그룹으로 나누어, 그룹 1이 항체 992, 1024, 1030, 1211, 1214, 1254, 1255, 1260, 1261, 1277, 1284 및 1320을 함유하고, 그룹 2가 항체 1183, 1194, 1242, 1255, 1257, 1305, 1308, 1317, 1449, 1564, 1565 및 1566을 함유하게 하였다. 홀수이기 때문에, 항체 1255를 두 그룹 모두에 포함시켰다. 각 그룹 내에서 모든 가능한 3-믹스의 항체를 상술한 바와 같이 생성하고, 세포 성장에 대한 효과에 대하여 시험하였다. 12개의 모노클로날 항체, 220개의 독특한 항체 혼합물 및 132개의 편향된 혼합물에 대하여 MAC%를 계산하였다. 그 다음, 혼합물을 세포 성장에 대한 이들의 효과에 따라 평가하였다. 혼합물의 효능에 가장 기여하는 항체를 선택할 수 있도록, 특정 항체를 함유하는 혼합물에 대한 MAC%를 항체에 대하여 플롯팅(plotted)하고, 중간 MAC%를 계산하였다. 그룹 1 및 그룹 2 내의 항체를 함유하는 혼합물에 대한 MAC%의 산포도는 도 3에서 볼 수 있다. 그룹 1 항체 992, 1024, 1030, 1254, 1261 및 1320이 혼합물 중에서 가장 효율적이며, 항체 1257, 1308, 1449, 1564, 1565 및 1566이 그룹 2 내의 혼합물 중에 가장 유력한 것이 분명하다. 또한, 이들 그룹은 상이한 실험에 있기 때문에, 직접적으로 비교할 수 없지만. 그룹 1 내의 항체는 그룹 2 내의 항체의 혼합물에 비해 더 유력한 것으로 보인다. 각 그룹으로부터의 6개의 항체를 최종 그룹을 위해 선택하였다. 이들은 992, 1024, 1030, 1257, 1261, 1284, 1308, 1320, 1449, 1564, 1565 및 1566이었다. 20개의 가장 유력한 혼합물의 MAC% 값뿐 아니라 제2 라운드의 스크리닝의 결과를 도 4에 나타내었다. 가장 높은 효능을 갖는 2가지 항체는 992+1308+1566 및 992+1308+1320이었다. 사실상 가장 높은 효능을 갖는 혼합물 중 19개는 항체 992를 함유하였으며, 이는 이 항체가 다른 항 EGFR 항체와 조합하여 잘 작용하는 것을 보여준다. 항체 992가 그 자신은 비교적 높은 효능을 갖지만, 이는 다른 항체에 의해 증가되는 것으로 보인다.

실시예 4

본 실시예는 유사한 생존력 분석에서 실시예 3에서 선택된 12개 항체의 모든 가능한 2-믹스의 시험을 기재한 것이다.

방법

2-믹스의 효능에 가장 기여하는 것으로 관찰된 12개의 항체, 즉 992, 1024, 1030, 1257, 1261, 1284, 1308, 1320, 1449, 1564, 1565 및 1566을 모든 가능한 2-믹스로 시험하였다. 각각의 항체를 1xPBS 중에 40 ㎍/㎖의 농도로 희석하고, 96-웰 플레이트에 가하였다. 각 그룹 내에서, Biomek® 3000 실험실 자동화 워크스테이션(Beckman Coulter)을 사용하여, 30 ㎕의 배지를 함유하는 1개의 384 웰 플레이트 내의 웰에 3 ㎕의 12개 항체를 첨가하여, 모든 12개가 항체를 함유할 때까지 A행이 3 ㎕의 제1 항체를 함유하고, B행이 3 ㎕의 제2 항체를 함유하는 등으로 되게 하였다. 그 다음, 다음 층의 항체를 첨가하고, 이때, 모든 12개 플레이트 상의 모든 웰이 총 6 ㎕ 부피의 2개의 항체를 함유할 때까지 제1 항체를 1열에 첨가하고, 제2 항체를 2열에 첨가하는 등으로 하였다. 각 웰 내의 최종 항체 농도는 4 ㎍/㎖이었다.

그 다음, 500 A431NS 세포를 함유하는 30 ㎕의 배지를 항체를 함유하는 모든 웰뿐 아니라, 음성 대조군으로 기능하는 항체가 없는 2개의 열에 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 37 ℃에서 가습 인큐베이터 내에서 3일 동안 인큐베이션하고, 그 후 1xPBS 중에 1:1로 희석한 8 ㎕의 세포 증식 시약 WST-1을 모든 플레이트 상의 웰에 첨가하였다. 이후에, 플레이트를 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 회전식 진탕기로 옮기고 또 1시간 동안 인큐베이션하였다. ELISA 판독기 상에서 450 및 620 nm(참조 파장)에서 흡광도를 측정하였다. 대사 활성 세포(MAC)의 양을 상술된 바와 같이 미처리 대조군의 백분율로 계산하였다.

결과

MAC%를 12개의 모노클로날 항체 및 66개의 독특한 항체 혼합물에 대하여 계산하였다. 그 다음, 혼합물을 세포 성장에 대한 이들의 효과에 따라 평가하고, 가장 높은 효능을 갖는 20개의 혼합물을 도 5(상부)에 나타내었다. 항체 992 및 1024의 조합이 가장 높은 효능을 가졌다. 혼합물에 대한 MAC%의 산포도를 도 5(하부)에 나타내었다. 다시, 항체 992가 다른 항체와 조합하여 최적으로 수행되는 것이 분명하다.

본 명세서에 기재된 모든 특허 및 비특허 참고문헌은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.

Claims

a) 시험할 화학 물질(chemical entity)을 각각 포함하는 n개의 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 n개의 샘플 중 둘 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합하여, 시험할 제 1 세트의 혼합물을 수득하는 단계;
c) 상기 제1 세트의 혼합물을 기능적 파라미터(parameter)를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 기능적 효과에 기여하는 화학 물질을 동정하는 단계;
d) 단계 c)에서 기능적 효과에 기여하는 화학 물질을 각각 포함하는 m개의 샘플을 선택하는 단계로서, m이 n 미만인 단계;
e) 상기 m개의 샘플 중 둘 이상을 모든 가능한 조합으로 혼합하여, 시험할 제2 세트의 혼합물을 수득하는 단계;
f) 상기 제2 세트의 혼합물을 기능적 파라미터를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 기능적 효과에 기여하는 화학 물질을 동정하는 단계; 및
g) 요망되는 기능적 효과를 지니는 혼합물을 선택하는 단계를 포함하여, 요망되는 기능적 효과를 나타내는 2개 이상의 화학 물질을 포함하는 혼합물을 제공하기 위하여, 기능적 효과를 지니거나 이에 기여하는 화학 물질을 동정하고 선택하는 방법.
제1항에 있어서, 단계 d, e 및 f를 m개의 선택된 샘플을 각각 포함하는 별개의 서브-푸울(sub-pool) 상에서 반복하는 방법.
제2항에 있어서, 단계 d, e 및 f를 병행하여 또는 순차적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 반복하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b에서의 상기 n개의 샘플 중 3개를 혼합함으로써 3개의 화학 물질을 포함하는 혼합물을 동정하고 선택하는 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 단계 b에서의 상기 n개의 샘플 중 3개를 혼합함으로써 3개의 화학 물질을 포함하는 혼합물을 동정하고 선택하며, 단계 e에서 상기 m개의 샘플 중 3개를 혼합하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 단계를 포함하는 방법:
d1) 요망되는 기능적 효과를 지니는 m1개의 혼합물을 선택하는 단계;
e1) 단계 d1에서 선택되는 상기 m1개의 혼합물 중 2개, 3개, 4개 또는 5개를 모든 가능한 조합으로 혼합하는 단계;
f1) 단계 e1의 상기 혼합물을 기능적 파라미터를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 기능적 효과에 기여하는 혼합물을 동정하는 단계; 및
g1) 단계 e1의 혼합물로부터 요망되는 기능적 효과를 지니는 제2 혼합물을 선택하는 단계.
제6항에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:
h) 단계 g1에서 수득되는 선택된 혼합물 중 2개, 3개, 4개 또는 5개를 혼합하는 단계,
i) 상기 혼합물을 기능적 파라미터를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 기능적 효과에 기여하는 혼합물을 동정하는 단계 및
j) 요망되는 기능적 효과를 지니는 제3 혼합물을 선택하는 단계.
제6항 또는 제7항에 있어서, 임의의 화학 물질이 단계 e1에서 혼합되는 상기 혼합물 중 임의의 것에 오직 한 번만 나타나는 방법.
제8항에 있어서, 임의의 화학 물질이 단계 h에서 혼합되는 상기 혼합물 중 임의의 것에 오직 한 번만 나타나는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 화학 물질을 포함하는 혼합물의 기능적 효과를 상기 특정 화학 물질을 포함하지 않는 하나 이상의 혼합물의 기능적 효과와 비교함으로써, 상기 특정 화학 물질이 기능적 효과에 기여하는지에 관한 동정을 수행하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 화학 물질 및 다른 화학 물질을 포함하는 혼합물의 기능적 효과를 오직 상기 특정 화학 물질만을 포함하는 혼합물의 기능적 효과와 비교함으로써, 상기 특정 화학 물질이 기능적 효과에 기여하는지에 관한 동정을 수행하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 특정 화학 물질을 포함하는 혼합물의 기능적 효과를 참고치와 비교함으로써, 상기 특정 화학 물질이 기능적 효과에 기여하는지에 관한 동정을 수행하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 참고치가 사전결정된 값이며, 상기 특정 화학 물질이 기능적 효과에 기여하기 위하여 상기 특정 화학 물질을 포함하는 혼합물의 동정된 기능적 효과는 상기 사전결정된 값보다 크거나, 이와 같거나, 이것보다 작아야 하거나, 또는 상기 참고치가 한 구간(interval)이며, 상기 특정 화학 물질이 기능적 효과에 기여하기 위하여 상기 특정 화학 물질을 포함하는 혼합물의 동정된 기능적 효과가 상기 구간 내에 있어야 하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 효과를 지니는 혼합물 중에 가장 빈번하게 나타나는 화학 물질을 동정함으로써, 기능적 효과에 기여하는 화학 물질의 동정을 수행하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, n이 3 이상의 값, 바람직하게는 3 내지 1440, 더욱 바람직하게는 3 내지 360, 보다 바람직하게는 3 내지 120, 더더욱 바람직하게는 3 내지 24, 특히 바람직하게는 3 내지 12의 값을 갖는 정수인 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, m이 3 이상의 값, 바람직하게는 3 내지 720, 더욱 바람직하게는 3 내지 360, 보다 바람직하게는 3 내지 120, 더더욱 바람직하게는 3 내지 24, 특히 바람직하게는 3 내지 12의 값을 갖는 정수인 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 시험할 상기 화학 물질 중 임의의 것에 포함되는 화합물이 항체, 항생제, 항암제, 항에이즈제, 항-성장 인자, 항바이러스제, 용해성 수용체, 사이토카인, RNAi의 화합물, 백신 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제17항에 있어서, 시험할 상기 화학 물질에 포함되는 상기 화합물이 둘 이상의 항체의 조합; 또는 항생제, 항바이러스제, 항암제, 항-자가면역 질환 제제 및 RNAi의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 비-항체 화합물과 조합된 하나 이상의 항체인 방법.
제17항 또는 제18항에 있어서, 시험할 상기 화학 물질에 포함되는 상기 화합물이 모노클로날(monoclonal) 항체인 방법.
제19항에 있어서, 시험할 상기 화학 물질에 포함되는 상기 화합물이 a) 하나 이상의 모노클로날 항체 및 b) a)의 하나 이상의 항체와 조합하여 요망되는 기능적 효과를 제공하는 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정할 기능적 파라미터가 물리적 효과의 발휘(exertion), 리간드로의 결합, 촉매 활성의 발휘, 촉매 활성에 대한 감수성, 생물학적 막을 가로지르는 제제의 변경된 수송 촉진, 세포내 구획 내에서 제제의 변경된 전좌(translocation) 촉진, 진핵 세포의 개체군에서 1개 이상의 유전자의 발현 상의 영향, 진핵 세포의 개체군의 성장 또는 대사 상의 영향, 표적 세포 상의 영향, 병원성 물질(pathogenic agent) 상의 영향, 2차 면역 효과상의 영향, 발현, 제조 또는 제제화되는 화합물의 능력상의 영향, 안정성 상의 영향으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제21항에 있어서, 상기 시험할 혼합물을 기능적 파라미터를 측정할 수 있는 둘 이상의 기능 분석으로 처리하여, 각 혼합물의 둘 이상의 기능적 파라미터를 독립적으로 측정하는 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 기능적 파라미터가 진핵 세포의 개체군의 성장 또는 대사에 대한 영향, 표적 세포 상에서의 영향, 또는 표적 세포 상에서의 화합물의 영향인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 멀티웰(multiwell) 플레이트에서 및/또는 자동화 피펫팅(pipetting)을 사용하여 및/또는 로봇공학(robotics)을 사용하여 수행하는 방법.
aa) 혼합물 중에 존재하는 하나의 화학 물질을 각각 포함하는 p개의 샘플을 제공하는 단계,
bb) 상기 p개의 샘플을 각각 q배로 희석하여, 각각 동일한 화학 물질을 상이한 농도로 포함하는 p개의 샘플의 시리즈를 수득하는 단계,
cc) 단계 aa 및 bb에서 수득한 2개 이상의 샘플을 모든 가능한 조합으로 혼합하여, 시험할 혼합물을 수득하는 단계,
dd) 상기 혼합물을 기능적 효과를 측정할 수 있는 기능 분석으로 처리하여, 혼합물 중의 화학 물질의 측정된 기능적 효과와 농도 간의 관계를 동정하는 단계 및
ee) 요망되는 기능적 효과를 지니는 혼합물을 선택하는 단계를 포함하여, 2개 이상의 화학 물질을 포함하며 요망되는 기능적 효과를 나타내는 혼합물 중에서 화학 물질 간의 최적의 화학량론비를 동정하고 선택하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 샘플을 단계 bb에서 배율(factor) 2, 5, 10, 20, 50 또는 100으로 희석하는 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서, p가 2 이상의 값, 더욱 바람직하게는 2 내지 24, 더더욱 바람직하게는 2 내지 12의 값을 갖는 정수인 방법.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, q가 1, 2, 3, 4 또는 5의 값을 갖는 정수인 방법.