CN108883151A - 抗瓜氨酸化hla多肽抗体以及其用途 - Google Patents

抗瓜氨酸化hla多肽抗体以及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于治疗人受试者中自身免疫疾病的方法，所述自身免疫疾病由所述受试者中存在瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA介导，所述方法包括施用治疗有效量的特异性结合瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA的抗体或其特异性结合片段。本发明的其他方面包括特异性结合人瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA的抗体或其特异性结合片段。

Description

抗瓜氨酸化HLA多肽抗体以及其用途
相关专利申请的交叉参考
本PCT国际专利申请要求2016年2月10日提交的美国临时申请号62/293,621的权益，其公开内容通过引用整体并入本申请。
技术领域
本发明总体涉及包含抗瓜氨酸化HLA-DR4抗体或其特异性结合片段的组合物，以及使用所述组合物治疗人类受试者的自身免疫疾病的方法。
背景技术
MHC II类分子是由免疫系统的抗原呈递细胞表达的细胞表面受体家族，包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和B淋巴细胞(B细胞)。MHC II类分子的功能是在称为“抗原呈递”的过程中向T淋巴细胞(T细胞)展示小的潜在抗原性肽。T细胞使用它们的T细胞受体来检查MHC II类和肽的组合，以确定所展示的肽是否是宿主蛋白质组的正常组分(自身)并且因此可以忽略，或者确定在此上下文中展示的肽是否是“外源的”(非自身)。识别由MHC II类展示的外源肽会引发免疫应答；T细胞通过增殖和产生细胞因子应答，并将信号发送回遇到外源肽的抗原呈递细胞。
当抗原少量存在时，最有效的抗原呈递细胞是B细胞。每个B细胞表达独特的高亲和力细胞表面受体，所述细胞表面受体是抗体的表面结合形式。使用这种高亲和力受体，B细胞能够以极低的浓度捕获抗原。将捕获的抗原吞噬，加工成肽，并使肽可用于MHC II类分子以展示给T细胞。如果T细胞识别由B细胞MHC II类展示的肽，则其指示B细胞增殖并分化成产生抗体的细胞。由此产生的抗体共享捕获完整抗原的原始B细胞表面受体的高亲和力抗原结合能力。
个别MHC II类分子结合肽并将其展示给T细胞的能力是有限的；并非所有可能的肽都能展示出来。因此，自然界为每个个体提供了多达六种不同的MHC II类分子，每种分子能够结合并展示略微不同的肽，从而扩展了总肽结合能力的广度。在物种水平上，人类具有产生数十种不同MHC II类分子的遗传能力。由于物种内可能的MHC II类分子的巨大多样性，加上每个个体最多表达六种不同形式的事实，两个个体表达相同组的六个MHC II类分子的是不太可能的。这是组织移植排斥的基础。来自组织供体的MHC II类分子似乎对组织接受者的T细胞是外源的。这种“外源”识别事件甚至可以在肽不与供体(同种异体)MHC II类分子结合的情况下发生；单独识别空(无肽)MHC II类足以激活失配接受者中的大部分T细胞(同种异体反应)(1)。
通常认为人类类风湿性关节炎(RA)是自身免疫疾病。长期以来人们认识到，大部分罹患RA的患者表达一种类型的MHC II类HLA-DR4。HLA-DR4是HLA-DR血清型；它包含多个共享类似结构的DRB1*04基因产物。HLA-DR4血清型的成员包括但不限于DRB1*0401、DRB1*0402、DRB1*0403、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0406、DRB1*0407、DRB1*0408、DRB1*0409、DRB1*0410、DRB1*0411、DRB1*0412和DRB1*0413。除HLA-DR4外的其他MHC II类血清型(HLA-DR1和HLA-DR14)较不经常在RA患者中表达。随着DNA测序技术的出现，人们发现HLA-DR4(DRB1*0401)β链中的5个氨基酸段(70-74)是HLA-DR4中与RA易感性最强烈相关的区域。在大部分情况下，五个氨基酸序列是谷氨酰胺-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-丙氨酸(QKRAA)，如同其在DRB1*0401中。在一些情况下，氨基酸序列略有不同，QRRAA(在DRB1*0404、DRB1*0101和DRB1*0405)或RRRAA(在DRB1*1001中)。在每种情况下，在位置71处存在带正电荷的氨基酸(K或R)，并且在位置72处存在带正电荷的R。不共享这5个氨基酸段的表达的DRB1*04等位基因与RA易感性无关。该“共享表位”(SE)似乎是几乎所有人RA患者中的共同因子。呈最基本形式的共享表位假设提出这五种常见氨基酸以某种方式使得独特的肽能够结合RA患者中的MHC II类分子，并且该肽-MHC组合对于T细胞似乎是外源的。这种促关节炎肽的鉴定尚未确定。
RA患者中免疫应答的另一个独特特征是产生抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACPA)。这些抗体在约70％的RA患者中发现，并且在其他疾病或健康个体中很少发现。ACPA的存在已成为RA的可靠诊断工具。瓜氨酸化是精氨酸(R)酶促转化(脱亚胺化)成另一种氨基酸瓜氨酸(Cit)。蛋白质或肽的瓜氨酸化由肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD)家族成员PAD1、PAD2、PAD3和PAD4介导。已经鉴定了几种被ACPA结合的天然存在的瓜氨酸化蛋白质，包括瓜氨酸化纤维蛋白原和波形蛋白。目前尚不清楚ACPA是否参与RA的病理学。这些抗体的存在已经在疾病发作前长达10年的库存血浆样品中发现，表明它们不是直接致病的。
已发表多种遗传关联研究，用于寻找与RA相关的基因或基因突变。到目前为止，最强的遗传关联在于HLA-DR4β链(DRB1*0401)或其他含有共享表位的MHC II类基因。在多项研究中，少数其他基因已被关联，包括编码PAD4(PADI4)的基因。因此，在RA患者中，疾病与以下存在强的相关性：1)特定的MHC II类分子，2)瓜氨酸化蛋白质的酶，和3)抗瓜氨酸化蛋白质抗体的产生。这些观察结果导致产生了近十年来一直是激烈研究焦点的假设。该假设提出，失调的PAD4瓜氨酸化了细胞外蛋白(例如纤维蛋白原或波形蛋白)，其通常不被免疫系统识别为外源的。瓜氨酸化蛋白质被表达表面受体的B细胞捕获(所述表面受体识别瓜氨酸化蛋白质)，被摄取并加工成肽。一些加工的肽一旦表达精氨酸则含有瓜氨酸残基，并且带电荷的氨基酸的这种损失允许修饰的肽结合HLA-DR4，其中未修饰的肽将不能结合。将瓜氨酸化肽呈递给识别该组合为外源的T细胞，并指导抗原呈递B细胞产生抗瓜氨酸化蛋白质抗体。
已经发表了几项研究，证明一些瓜氨酸化肽可以比天然的未瓜氨酸化肽更好地结合HLA-DR4。其他研究报道，源自瓜氨酸化波形蛋白或纤维蛋白原的肽当由HLA-DR4呈递时可引起T细胞产生细胞因子或比响应未修饰的肽稍微增殖更多T细胞。一个实验室已经报道，经工程化以表达人HLA-DR4的小鼠当用瓜氨酸化人纤维蛋白原免疫时可以发生关节炎，但是其他实验室已经报道无法再现这些发现。尽管多年来进行了大量工作，但尚未鉴定出当由HLA-DR4呈递时可在人或小鼠中引起关节炎或在T细胞中产生强烈的增殖反应的特异性肽。因此，原始肽呈递假说尚未得到证实。
在缺乏强烈支持HLA-DR4共享表位的肽呈递作用的数据的情况下，已经提出了替代假设。Holoshitz等已经定义了共享表位的替代功能，其与肽呈递给T细胞无关。其报道共享表位可以直接结合钙网织蛋白(一种先天免疫的强效介质)，并假设这种相互作用本身就是促炎症、激活信号转导和一氧化氮生成。这种提出的共享表位的作用不仅与肽呈递给T细胞无关，而且还与瓜氨酸化、PAD4和ACAP无关。
发明内容
在第一方面，本发明提供了治疗由具有至少一个瓜氨酸化表位的HLA-DR4的存在介导的人受试者的自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎)的方法：受试者中的QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的抗体或其特异性结合片段，所述抗体或其特异性结合片段特异性结合瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA。
在第二个相关方面，本发明提供了抗体或其特异性结合片段，其特异性结合HLA-DR4受体蛋白质序列中存在的人瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA。特异性结合人瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA的抗体或其特异性结合片段基本上不结合HLA-DR4受体蛋白质序列中存在的QKRAA、QRRAA或RRRAA肽序列。
附图说明
图1描绘了用于呈递B细胞上HLA-DR4受体的瓜氨酸化共享表位以激活T细胞以在RA患者中生成自身免疫应答的所提出机制的示意图。
图2A描绘了针对各种抗原的分离的抗MHC II类肽(EQKCitAA)单克隆抗体的ELISA结合结果：MHC II类肽(EQKRAA)、瓜氨酸化MHC II类肽(EQKCitAA)、烯醇化酶、瓜氨酸化烯醇化酶、H3蛋白和瓜氨酸化H3蛋白。
图2B描绘了针对各种抗原的分离的抗MHC II类肽(EQKCitAA)单克隆抗体的ELISA结合结果：MHC II类肽(EQKRAA)、瓜氨酸化MHC II类肽(EQKCitAA)、H3肽(1-21)和瓜氨酸化H3肽(Cit R 2+8+17)。
具体实施方式
定义：
出于本公开的目的，除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见，例如Singleton等，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology，第2版，J.Wiley&Sons(New York,N.Y.1994)；Sambrook等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborPress(Cold Spring Harbor,N.Y.1989)。这些参考文献通过引用整体并入本公开中。
本文提及的所有出版物和参考文献均通过引用并入。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权借助在先发明而先于此类公开。
必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一(a、an)”和“所述”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。
包括过渡短语“由......组成”或“基本上由......组成”的实施方案仅包括所列举的组分和非活性成分。
本文所用的术语“约”意指加或减其使用数的数值的10％。因此，约50％意指在45％-55％的范围内。
“任选的”或“任选地”可以被认为意指随后描述的结构、事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括事件发生的情况和事件不发生的情况。
本文所用的术语“表位”是指分子的集体特征，例如一级结构和电荷，它们通过抗体的抗原结合位点(称为互补位)一起形成抗原结合的抗原区域。表位可以定义为在蛋白质的一级序列中靠近在一起的一组氨基酸残基，或者在一级序列中充分分开、但是由于蛋白质天然折叠成其天然、完全功能的形状而结合在一起的一组氨基酸残基。由在一级序列中靠近在一起的残基组成的表位称为邻近的、连续的、顺序的或线性的表位，而由一级序列中分开的残基组成的表位相反称为不连续的、构象的或“组装的”表位。
表位存在于自然界中，并且可以由人进行定位、分离、纯化或以其他方式制备/衍生。例如，表位可以通过从天然资源中分离来制备，或者其可以根据本领域的标准方案合成。这些方法之一是使用蛋白质抗原的合成片段(肽)，其可以与整个抗原的同源部分足够相似以允许抗体结合。抗体对表位的亲和力必须使得抗体/肽复合物在免疫测定条件下不会显著解离。这种情况发生在线性表位上，因此允许使用肽来定义那些表位，并使用氨基酸和氨基酸模拟物来定义个别表位。衍生/制备的表位可以是天然表位的类似物。贯穿本公开，术语表位和半抗原通常可互换使用。
术语“特异性结合分子”在本文中用于表示能够特异性结合的分子，优选小分子。在这方面的特异性结合意指分子能够结合选定的靶分子，而在相同条件下其不会结合另一非相关的靶分子。例如，据称结合分子在结合血清白蛋白时特异性结合血清白蛋白，并且与血清中发现的另一种蛋白质或优选任何其他蛋白质结合较少或根本不结合。本发明中本文使用的优选的特异性结合分子包括与瓜氨酸化表位QKCitAA或瓜氨酸化表位QRCitAA结合或者可以与瓜氨酸化表位RRCitAA结合的特异性结合剂，例如抗体或其抗体片段。
在该上下文中，术语“与瓜氨酸化表位特异性反应”或“与瓜氨酸化表位反应”或“与瓜氨酸表位反应”意指特异性结合分子或抗体与诸如含有瓜氨酸残基的肽的结构反应，例如，瓜氨酸化表位QKCitAA，或瓜氨酸化表位QRCitAA，或瓜氨酸化表位RRCitAA，而抗体或其抗体片段与含有精氨酸残基而不是瓜氨酸残基的相同结构反应较少或优选完全不反应。术语“肽”应解释为能够在与本文所述的特异性结合分子的免疫反应性的正确背景下、优选在与其在人体或动物体中出现的相同的背景下、优选在天然多肽的背景下呈递瓜氨酸残基的结构。
“特异性结合分子”可以是包括DNA、RNA、肽、蛋白质结构域、全蛋白质或它们的组合或其部分的分子，优选小分子，其能够特异性结合靶化合物。特异性结合分子的优选实例是肽或抗体或其抗体结合片段。
天然抗体(也称为免疫球蛋白)是可以在脊椎动物的血液或其他体液中发现的γ球蛋白，并且被免疫系统用于识别和中和外源物体，例如细菌和病毒。
天然抗体通常由基本结构单元制成-每个基本结构单元具有两条大的重链和两条小的轻链，例如，具有一个单元的单体，具有两个单元的二聚体或具有五个单元的五聚体。抗体由称为B细胞的白细胞产生。存在几种不同类型的重链，从而产生不同种类的抗体。可以基于抗体具有何种重链将抗体分组成不同的同种型。在哺乳动物中已知五种不同的抗体同种型，其起着不同的作用，并且有助于针对其遇到的每种不同类型的外来物体引导适当的免疫应答。一些动物物种如骆驼科动物(例如羊驼)和鲨鱼可能具有异常的抗体结构。
尽管所有抗体的一般结构非常相似，但蛋白质尖端的小区域变化极大，从而允许存在数百万具有略微不同尖端结构的抗体。该区域被称为超变区。这些变体中的每一种都可以结合不同的靶标，称为抗原。抗体的这种巨大多样性使免疫系统能够识别同样多样的抗原。
抗体识别的抗原的独特部分称为表位。这些表位以高度特异性的相互作用与它们的抗体结合，使得抗体仅在构成生物体的数百万种不同分子中间鉴定和结合其独特的抗原。抗体识别抗原将其标记为免疫系统的其他部分的攻击。抗体还可以直接中和靶标，例如，通过结合其需要以引起感染的病原体的一部分。
通过编码不同抗原结合位点(或互补位)的一组基因区段的随机组合、随后在抗体基因的该区域中随机突变(这产生进一步的多样性)产生大的且多样化的抗体群体。抗体基因也在称为类别转换的过程中重新组织，所述过程将重链的碱基改变为另一碱基，从而产生保留抗原特异性可变区的抗体的不同同种型。这允许单个抗体通过免疫系统的几个不同部分用于几种不同的同种型。
野生型抗体通常由两对相同的多肽链组成，每对具有一条轻链和一条重链。重链和轻链中的每一种由两个不同的区域(称为可变区和恒定区)构成。因此，存在可变重链(VH)、恒定重链(CH)、可变轻链(VL)和恒定轻链(CL)。抗体的可变区(VH和VL)含有分子的抗原结合序列，并且因此确定抗体对其靶抗原具有特异性。在可变区中，重链和轻链的每个可变结构域的三个环形成抗原结合位点。三个环中的每一个被称为互补决定区或“CDR”。存在6个CDR，每条重链3个并且每条轻链3个，命名为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。CDR之外和之间的可变区称为框架区。
抗体可选自由以下组成的组：单链抗体、单链可变片段(scFv)、片段抗原结合区(Fab)、重组抗体、单克隆抗体、包含天然抗体或适体的抗原结合结构域的融合蛋白、单结构域抗体(sdab)(也称为VHH抗体)、纳米抗体(骆驼科动物源单结构域抗体)、鲨鱼IgNAR源单结构域抗体片段(称为VNAR)、抗运载蛋白、适体(DNA或RNA)和其活性成分或片段。
在另一个实施方案中，抗体是包含天然抗体或适体(例如呈DNA或RNA形式的适体)的抗原结合结构域的融合蛋白。
在抗体或其他特异性结合分子的上下文中，术语“或其部分”或“其特异性结合片段”意指构成抗体或特异性结合分子的特异性结合位点的抗体或特异性结合分子的部分，并且可以解释为仍然能够与和整个抗体或特异性结合分子相同的表位反应的抗体或特异性结合分子的一部分。
人抗体或其特异性结合片段是本公开的优选实施方案。优选地，可以有利地使用具有IgG1重链和λ或κ轻链的IgG1(例如，IgG1)抗体。然而，本公开还涵盖其他人抗体同种型，包括IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE与κ或λ轻链的组合。而且，各种同种型的所有动物源抗体均可用于本公开中。抗体可以是完整大小的抗体或抗体的抗原结合片段，包括Fab、F(ab')2、单链Fv片段或单结构域VHH、VH或VL单结构域。
术语“与瓜氨酸化HLA-DR4表位反应的特异性结合分子”应解释为在较大结构例如HLA-DR4多肽或其部分的背景下与瓜氨酸残基特异性反应的特异性结合分子。
“分离的”是指其中根据本发明的抗体、编码此类抗体的核酸和宿主细胞优选所呈的状态。关于抗体和核酸，“分离的”意指抗体和核酸通常不含或基本上不含与它们天然相关的物质，例如在其天然环境中或在其制备环境中(例如细胞培养)(例如当所述制备是通过重组DNA技术时)发现其的其他多肽或核酸。当应用于宿主细胞时，“分离的”是指宿主细胞从它们起源的生物体中分离，例如细胞培养物中的细胞。抗体、核酸和宿主细胞可以与稀释剂或佐剂一起配制，并且仍然为了实际目的而分离。
“氨基酸修饰”是指多肽序列中的氨基酸残基取代、插入和缺失。“取代”是指用另一个氨基酸残基取代多肽序列中特定位置的氨基酸残基。“插入”是指在多肽序列中特定位置的两个预先存在的氨基酸残基之间添加氨基酸残基。“缺失”是指在多肽序列中特定位置去除氨基酸残基。
在各种实施方案中，本公开提供共享表位的新作用，其不需要由HLA-DR4呈递瓜氨酸化肽，但与PAD4和ACAP相关。
A.抗瓜氨酸化共享表位抗体
本公开鉴定了共享表位的新作用，其不需要由HLA-DR4呈递瓜氨酸化肽，但与PAD4和ACAP相关。其利用了以下观察结果：1)PAD4是自动瓜氨酸化的，2)RA患者的亚组制成识别PAD4的抗体，3)共享表位序列QKRAA含有可以瓜氨酸化的精氨酸残基。本公开提出，具有能够识别瓜氨酸化PAD4、未瓜氨酸化PAD4或在被PAD4瓜氨酸化的过程中的蛋白质的细胞表面受体的B细胞可以直接或间接地捕获细胞表面上的PAD4。捕获的PAD4保持酶活性并且在B细胞表面上或在吞噬体内瓜氨酸化共享表位QKRAA、QRRAA或RRRAA处的邻近HLA-DR4分子。共享表位的72位的精氨酸是瓜氨酸化残基之一。如此修饰，瓜氨酸化HLA-DR4似乎以同种异体反应的方式对T细胞呈现外源性。可选地，瓜氨酸化HLA-DR4可以向T细胞呈递独特肽，如果HLA-DR4未被瓜氨酸化则不会呈递。在任一种情况下，响应的T细胞将指示B细胞产生与表面受体具有相同结合特异性的抗体，包括抗PAD4、抗瓜氨酸化PAD4或其他瓜氨酸化蛋白质。
对这种新机制的认识鼓舞了用于治疗或预防RA的新药剂的开发，所述新药剂包括但不限于细胞溶解性治疗性抗体、抗体的共享表位结合片段或结合瓜氨酸化共享表位并破坏表达瓜氨酸化MHC II类分子的细胞并阻止T细胞激活的抗体样生物分子。
如图1所示，部分B-D描绘了共享表位QKRAA直接瓜氨酸化成QKCitAA。尽管未示出，但共享表位还可以包括QRRAA或RRRAA，其可以通过PAD瓜氨酸化以产生T细胞反应性表位QRCitAA和RRCitAA。在如图1的部分B所示的示例性实施方案中，对瓜氨酸化蛋白质具有特异性的B细胞表面免疫球蛋白(Y)结合自动瓜氨酸化PAD。在附近的HLA-DR4分子上，PAD酶将共享表位QKRAA瓜氨酸化为QKCitAA(HLA-DR4(H)上的小圆圈)。瓜氨酸化HLA-DR4分子被T细胞受体(W)直接识别，有或没有另外的结合肽。T细胞指示B细胞产生抗瓜氨酸化蛋白抗体(ACAP)。
在图1的部分C中，对IgG具有特异性的B细胞表面免疫球蛋白(Y)结合具有结合的PAD的抗体。结合的PAD瓜氨酸化附近HLA-DR4分子(H)上的共享表位序列。瓜氨酸化HLA-DR4分子被T细胞受体(W)直接识别，有或没有另外的结合肽。T细胞指示B细胞产生抗IgG抗体(类风湿因子)。
在图1的部分D中，对PAD具有特异性的B细胞表面免疫球蛋白(Y)结合PAD。在邻近的HLA-DR4分子(H)上，B细胞结合的PAD将HLA-DR4(H)中的共享表位QKRAA瓜氨酸化成QKCitAA氨基酸序列。瓜氨酸化HLA-DR4分子被T细胞受体(W)直接识别，有或没有另外的结合肽。T细胞指示B细胞产生抗PAD抗体。如本文所用，示例性PAD可包括PAD4或PAD2或它们的组合。
不希望受限于任何特定理论，据信具有能够识别或结合瓜氨酸化PAD4、未瓜氨酸化PAD4或在被PAD4瓜氨酸化的过程中的蛋白质的细胞表面受体的B细胞可以直接或间接地捕获B细胞表面上的PAD4。捕获的PAD4保持酶活性并且在B细胞表面上或在B细胞吞噬体内瓜氨酸化邻近HLA-DR4分子。HLA-DR4的共享表位的72位的精氨酸是瓜氨酸化残基之一。如此修饰，瓜氨酸化HLA-DR4受体似乎以同种异体反应的方式对T细胞呈现外源性。可选地，瓜氨酸化HLA-DR4可以向T细胞呈递独特肽，如果HLA-DR4未被瓜氨酸化则不会呈递给T细胞。在任何一种情况下，响应的T细胞将指示B细胞产生与表面受体具有相同结合特异性的抗体，包括PAD4、瓜氨酸化PAD4或其他瓜氨酸化蛋白，此外还会被激活并释放促炎细胞因子，例如TNF-α。
对这种新机制的认识鼓舞了用于治疗或预防RA的新药剂的开发，所述新药剂包括但不限于细胞溶解性治疗性抗体、其抗原结合片段或结合瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA并破坏表达瓜氨酸化MHC II类分子的细胞的抗体样生物分子。抗体或抗体样生物分子与抗原呈递细胞(例如B细胞)上存在的瓜氨酸化共享表位的结合能够通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)机制和补体依赖性细胞毒性(CDC)等其他机制消除这些细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了包含哺乳动物抗体的有用治疗组合物，所述哺乳动物抗体对瓜氨酸化表位QKCitAA或瓜氨酸化表位QRCitAA或瓜氨酸化表位RRCitAA具有特异性并且以高亲和力结合瓜氨酸化表位QKCitAA或瓜氨酸化表位QRCitAA或瓜氨酸化表位RRCitAA。如本文所用，氨基酸序列称为瓜氨酸化共享表位，其中预瓜氨酸化表位是QKRAA、QRRAA或RRRAA，并且预瓜氨酸化表位中的精氨酸残基之一由酶肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD)通过将精氨酸脱亚胺化为瓜氨酸(“Cit”)起作用。
肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD；EC 3.5.3.15)酶催化蛋白质中精氨酸残基转化为瓜氨酸残基。瓜氨酸不存在tRNA；蛋白质中瓜氨酸残基的存在完全是转译后修饰的结果。在哺乳动物(人、小鼠和大鼠)中，已经鉴定了五种PAD同种型(PAD1-PAD6；“PAD4”和“PAD5”用于相同的同种型)，每种都由不同的基因编码(Vossenaar等，Bioessays 25,1106-1118,2003)。所有这些酶的活性都强烈依赖于Ca2+的存在，并且不能将游离L-精氨酸转化为游离L-瓜氨酸。游离L-精氨酸可以通过真核生物中的一氧化氮合酶(EC 1.14.13.39)或细菌中的精氨酸脱亚胺酶(EC 3.5.3.6)转化为游离L-瓜氨酸。这些酶不依赖于Ca2+。
本领域已知制备哺乳动物抗体或其片段的方法，所述哺乳动物抗体或其片段对瓜氨酸化表位QKCitAA或瓜氨酸化表位QRCitAA或瓜氨酸化表位RRCitAA具有特异性并且以高亲和力结合瓜氨酸化表位QKCitAA或瓜氨酸化表位QRCitAA或瓜氨酸化表位RRCitAA。在一些实施方案中，用于制备单克隆抗体的细胞融合方法可以用于本发明的方法中，例如美国专利号5,916,771中公开的那些方法，所述案件的全部内容通过引用并入本文。简而言之，根据该方法，将编码所需重链(或重链的片段)的DNA导入第一哺乳动物宿主细胞，同时将编码所需轻链(或轻链的片段)的DNA导入第二哺乳动物宿主细胞。然后通过细胞融合将第一转化的宿主细胞和第二转化的宿主细胞组合以形成第三细胞。在第一细胞和第二细胞融合之前，可以选择具有特别需要的特征(例如高水平的表达)的转化的细胞。融合后，所得杂交细胞含有并表达编码所需重链的DNA和编码所需轻链的DNA二者，从而导致产生多聚体抗体。在某些实施方案中，单克隆抗体通过标准技术产生。在某些实施方案中，单克隆抗体通过本领域熟知的基于杂交瘤的方法产生。在各种实施方案中，用于从HLA-DR4的序列产生针对表位QKCitAA的小鼠单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的，例如，在某些此类实施方案中，用免疫原免疫合适的动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、猴或其他哺乳动物)，以产生分泌抗体的细胞。在各种实施方案中，免疫原可以是瓜氨酸化表位QKCitAA或瓜氨酸化表位QRCitAA或瓜氨酸化表位RRCitAA，或者它可以是与多肽或蛋白质连接或融合的瓜氨酸化表位之一。在这些实施方案中，筛选过程将产生表达与瓜氨酸化表位QKCitAA、而非缀合的多肽或蛋白质结合的单克隆抗体的杂交瘤。
在某些实施方案中，分泌抗体的细胞是B细胞，例如淋巴细胞或脾细胞。在某些实施方案中，在体外免疫淋巴细胞(例如人淋巴细胞)以生成分泌抗体的细胞。参见，例如，Borreback等，(1988)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85:3995-3999。
在某些实施方案中，将分泌抗体的细胞与“永生化”细胞系(例如髓样细胞系)融合，以产生杂交瘤细胞。在某些实施方案中，例如通过ELISA鉴定产生所需抗体的杂交瘤细胞。在某些实施方案中，然后可以使用标准方法亚克隆和培养所述细胞。在某些实施方案中，还可以在合适的动物宿主体内使所述细胞生长为腹水肿瘤。在某些实施方案中，使用标准分离程序(例如亲和色谱)从杂交瘤培养基、血清或腹水中分离单克隆抗体。根据某些实施方案产生杂交瘤和纯化单克隆抗体的指南提供于以下中：例如，Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual，第8章(Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,N.Y.)。
在某些实施方案中，通过用免疫原免疫遗传改变的小鼠来产生小鼠单克隆抗体。在某些此类实施方案中，小鼠是HLA-DR4缺陷型小鼠。在某些此类实施方案中，小鼠是缺失编码人HLA-DR4的基因的全部或一部分的“敲除”小鼠。在某些实施方案中，用瓜氨酸化表位QKCitAA或瓜氨酸化表位QRCitAA或瓜氨酸化表位RRCitAA单独或当与多肽或蛋白质缀合时免疫此类敲除小鼠。
在某些实施方案中，在能够产生人抗体的转基因动物(例如小鼠)中产生人单克隆抗体。参见，例如，美国专利号6,075,181 A和6,114,598 A；以及WO 98/24893 A2。例如，在某些实施方案中，将人免疫球蛋白基因(例如，使用酵母人工染色体、人染色体片段或种系整合)引入其中内源Ig基因已经不活化的小鼠中。参见，例如，Jakobovits等(1993)Nature362:255-258；Tomizuka等(2000)Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 97:722-727；以及Mendez等(1997)Nat.Genet.15:146-156(描述转基因小鼠的XenoMouse II.RTM.系)。
在某些实施方案中，用免疫原免疫此类转基因小鼠。在某些此类实施方案中，从表达抗体的小鼠获得淋巴细胞(例如B细胞)。在某些此类实施方案中，将所述回收的细胞与“永生化”细胞系(例如髓样细胞系)融合，以产生杂交瘤细胞。在某些此类实施方案中，筛选和选择杂交瘤细胞以鉴定产生对目标抗原具有特异性的抗体的那些细胞。适用于产生人单克隆抗体的某些示例性方法和转基因小鼠描述于以下中：例如Green(1999)J.Immunol.Methods 231:11-23；以及WO 98/24893。在某些实施方案中，针对瓜氨酸化表位QKCitAA或瓜氨酸化表位QRCitAA或瓜氨酸化表位RRCitAA的人单克隆抗体适合用作治疗性抗体或其片段，用于治疗自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎。
基于噬菌体和酵母展示的方法
在某些实施方案中，使用基于展示的方法(例如下文描述的任何方法)产生人单克隆抗体。
在某些实施方案中，使用噬菌体展示技术产生单克隆抗体。某些示例性抗体噬菌体展示方法是本领域技术人员已知的，并且描述于以下中，例如Hoogenboom,Overview ofAntibody Phage-Display Technology and Its Applications，来自Methods inMolecular Biology:：Antibody Phage Display:Methods and Protocols(2002)178:1-37(O'Brien和Aitken编辑，Human Press,Totowa,N.J.)。例如，在某些实施方案中，抗体文库展示在丝状噬菌体(例如非溶解性丝状噬菌体fd或M13)的表面上。在某些实施方案中，抗体是抗体片段，例如scFv、Fab、具有工程化分子间二硫键以稳定VH-VL对的Fv和双抗体。在某些实施方案中，然后可以选择具有所需结合特异性的抗体。抗体噬菌体展示方法的某些示例性实施方案在下面进一步详细描述。
在某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的某些方法制备抗体噬菌体展示文库。参见，例如，Hoogenboom,Overview of Antibody Phage-Display Technology andIts Applications，来自Methods in Molecular Biology:Antibody Phage Display:Methods and Protocols(2002)178:1-37(O'Brien和Aitken编辑，Human Press,Totowa,N.J.)。在某些实施方案中，通过PCR扩增源自分泌抗体的细胞的mRNA的基因组DNA或cDNA来制备可变基因库。例如，在某些实施方案中，由表达针对瓜氨酸化表位QKCitAA的抗体的B细胞的mRNA制备cDNA。在某些实施方案中，例如通过PCR扩增编码重链和轻链可变区的cDNA。
在某些实施方案中，将重链cDNA和轻链cDNA克隆到合适的载体中。在某些实施方案中，在克隆过程中随机组合重链cDNA与轻链cDNA，从而产生编码不同scFv或Fab的cDNA文库的组装。在某些实施方案中，在克隆到合适的载体中之前接合重链cDNA和轻链cDNA。在某些实施方案中，通过逐步克隆到合适的载体中接合重链cDNA和轻链cDNA。
在某些实施方案中，将cDNA克隆到噬菌体展示载体(例如噬菌粒载体)中。某些示例性噬菌粒载体(例如pCES1)是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，编码重链和轻链的cDNA存在于同一载体上。例如，在某些实施方案中，将编码scFv的cDNA与基因III的全部或部分框内克隆，所述基因III编码次要噬菌体外壳蛋白丸。在某些此类实施方案中，噬菌粒指导scFv-pIII融合物在噬菌体表面上的表达。可选地，在某些实施方案中，将编码重链(或轻链)的cDNA与基因III的全部或部分框内克隆，并将编码轻链(或重链)的cDNA克隆到同一载体中信号序列的下游。信号序列指导轻链(或重链)表达至宿主细胞的周质中，其中重链和轻链组装成Fab片段。可选地，在某些实施方案中，编码重链的cDNA和编码轻链的cDNA存在于分开的载体上。在某些此类实施方案中，分别克隆重链和轻链cDNA，一个克隆到噬菌粒中，并且另一个克隆到噬菌体载体中，其都含有在宿主细胞中体内重组的信号。将重组噬菌粒或噬菌体载体引入合适的细菌宿主(例如大肠杆菌)中。在使用噬菌粒的某些实施方案中，用辅助噬菌体感染宿主以提供噬菌体结构蛋白，从而允许携带抗体-丸融合蛋白的噬菌体颗粒在噬菌体表面上表现。
在各种示例性实施方案中，使用在体外重排的可变基因库构建“合成”抗体文库。例如，在某些实施方案中，使用PCR随机组合编码重链或轻链的各个基因区段(分别为V-D-J或V-J)。在某些此类实施方案中，可以通过例如易错PCR将额外序列多样性引入CDR以及可能FR中。在某些此类实施方案中，将额外序列多样性引入CDR3(例如重链的H3)中。
在某些实施方案中，使用来自未免疫动物的核酸如上所述构建“幼稚”或“通用”噬菌体展示文库。在某些实施方案中，未免疫动物是人。在某些实施方案中，使用来自免疫动物的核酸如上所述构建“免疫的”噬菌体展示文库。在某些实施方案中，免疫动物是人、大鼠、小鼠、仓鼠或猴。在某些此类实施方案中，用下述任何免疫原免疫动物。
在某些实施方案中，通过连续淘选步骤实现从噬菌体展示文库中选择具有所需结合特异性的抗体。在淘选的某些实施方案中，将文库噬菌体制剂暴露于抗原。在某些此类实施方案中，洗涤噬菌体-抗原复合物，并丢弃未结合的噬菌体。在某些此类实施方案中，回收结合的噬菌体，并且随后通过感染大肠杆菌进行扩增。在某些此类实施方案中，可以通过挑选单个噬菌斑来克隆产生单克隆抗体的噬菌体。在某些实施方案中，重复上述过程。
在某些实施方案中，用于淘选的抗原是下文描述的任何免疫原。在某些实施方案中，将抗原固定在固体支持物上以允许通过亲和色谱纯化结合抗原的噬菌体。在某些实施方案中，生物素化抗原，从而允许使用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠分离结合的噬菌体与未结合的噬菌体。在某些实施方案中，可以将抗原固定在细胞上(用于直接淘选)，固定在组织冷冻切片中或固定在膜(例如尼龙或硝酸纤维素膜)上。本领域技术人员可以常规地确定某些淘选程序的其他变化。
在某些实施方案中，酵母展示系统用于产生单克隆抗体。在某些此类系统中，抗体表达为与酵母AGA2蛋白的全部或部分的融合蛋白，其在酵母细胞壁的表面上展示。在某些此类实施方案中，然后可以通过将细胞暴露于荧光标记的抗原来鉴定表达具有所需结合特异性的抗体的酵母细胞。在某些此类实施方案中，然后可以通过流式细胞术分离结合抗原的酵母细胞。参见，例如，Boder等(1997)Nat.Biotechnol.15:553-557。
在某些实施方案中，通过重组技术产生单克隆抗体。参见，例如，美国专利号4,816,567。在某些此类实施方案中，使编码单克隆抗体链的核酸在合适的宿主细胞中克隆并表达。例如，在某些实施方案中，可以使用标准方法从表达所需抗体的细胞(例如成熟B细胞或杂交瘤细胞)制备RNA。在某些实施方案中，然后可以使用标准方法使用RNA制备cDNA。在某些实施方案中，使用特异性寡核苷酸引物例如通过PCR使编码重链或轻链多肽的cDNA扩增。在某些实施方案中，将cDNA克隆到合适的表达载体中。在某些实施方案中，然后将表达载体转化或转染到合适的宿主细胞(例如未内源产生抗体的宿主细胞)中。某些示例性宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和骨髓瘤细胞。在某些实施方案中，其中重链和轻链在同一宿主中共表达，可以分离重构的抗体。
在某些实施方案中，可以修饰编码重链或轻链的cDNA。例如，在某些实施方案中，可以用人重链或轻链的恒定区替代小鼠重链或轻链的恒定区。以这种方式，在某些实施方案中，可以产生嵌合抗体，其具有人抗体恒定区但保留小鼠抗体的结合特异性。
在某些实施方案中，重组抗体可以在某些细胞系中表达。在某些实施方案中，编码特定抗体的序列可用于转化合适的哺乳动物宿主细胞。根据某些实施方案，转化可以通过用于将多核苷酸引入宿主细胞的任何已知方法进行。某些示例性方法包括但不限于将多核苷酸包装在病毒中(或包装至病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞并使用本领域已知的某些转染方法，如美国专利号4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455中所例示。在某些实施方案中，所用的转化方法可取决于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的某些示例性方法是本领域已知的，并且包括但不限于葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封在脂质体中以及将DNA直接显微注射到细胞核中。
可用作表达宿主的某些示例性哺乳动物细胞系是本领域已知的，并且包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如HepG2)和许多其他细胞系。在某些实施方案中，可通过确定哪些细胞系产生高水平的特异性结合瓜氨酸化表位QKCitAA或瓜氨酸化表位QRCitAA或瓜氨酸化表位RRCitAA的抗体来选择细胞系。
在各种实施方案中，结合瓜氨酸化HLA-DR4表位的抗体是人源化抗体。本文所用的术语“人源化抗体”是指包含人框架区和来自非人(通常是小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一个或多个CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为“供体”，并且提供框架的人免疫球蛋白称为“受体”。不需要存在恒定区，但如果其存在，则其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90％、优选约95％或更多相同。因此，除了可能的CDR之外，人源化免疫球蛋白的所有部分基本上与天然人免疫球蛋白序列的相应部分相同。
“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。例如，由于例如嵌合抗体的整个可变区是非人的，所以人源化抗体将不涵盖典型的嵌合抗体。有人说，因为预期所得的人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原，所以通过“人源化”过程，供体抗体已被“人源化”。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者的超变区残基被来自非人物种(供体抗体)(例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的具有所需特异性、亲和力和能力的超变区残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。
此外，人源化抗体可包含在接受者抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部超变区对应于非人免疫球蛋白的超变区，并且全部或基本上全部FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)、通常免疫特异性结合FcγRIIB多肽的人免疫球蛋白的至少一部分，其通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加(即，突变)而被改变。在一些实施方案中，人源化抗体是衍生物。这种人源化抗体包含一个或多个非人CDR中的氨基酸残基取代、缺失或添加。与非衍生的人源化抗体相比，人源化抗体衍生物可具有基本上相同的结合、更好的结合或更差的结合。在具体的实施方案中，CDR的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸残基已被取代、缺失或添加(即突变)。关于人源化抗体的进一步细节，参见欧洲专利号EP 239,400、EP 592,106和EP 519,596；国际公开号WO 91/09967和WO 93/17105；美国专利号5,225,539、5,530,101、5,565,332、5,585,089、5,766,886和6,407,213。
本文所用的术语“超变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自“超变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917)。
本文所用的术语“单链Fv”或“scFv”是指抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽还包含VH结构域与VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。有关sFv的综述，参见THEPHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES中的Pluckthun，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag,New York，第269-315页(1994)。在具体的实施方案中，scFv包括双特异性scFv和人源化scFv。
B.治疗方法
因此，本公开因此涉及与HLA-DR4分子上存在的瓜氨酸化共享表位结合的特异性结合分子，其用于治疗或预防瓜氨酸-HLR-DR4相关的自身免疫疾病，所述自身免疫疾病可包括例如炎症性关节炎、多发性硬化症、1型糖尿病、莱姆病(lyme disease)诱发的关节炎、类风湿性关节炎、肼苯哒嗪诱发的女性全身性红斑狼疮、妊娠性类天疱疮、落叶型天疱疮、梗阻性肥厚型心肌病、牛皮癣关节炎、牛皮癣、IgA肾病、‘共同综合症’-全身性硬化症/类风湿性关节炎和风湿性多肌痛。在一些实施方案中，与本发明的HLA-DR4分子上存在的瓜氨酸化共享表位结合的特异性结合分子，用于治疗或预防瓜氨酸-HLR-DR4相关的自身免疫疾病，例如抗体，用于治疗类风湿关节炎。
在一些实施方案中，使用本发明的方法可治疗的疾病和病症可包括：炎症性关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎和牛皮癣。因此，本公开涉及特异性结合分子，例如，特异性结合HLA-DR4分子上的瓜氨酸化共享表位的抗体或所述抗体的特异性结合片段，其用于治疗或预防选自由以下组成的组的疾病：关节炎、炎症性关节炎、类风湿性关节炎、牛皮癣关节炎和牛皮癣。本公开特别涉及具有高亲和力并特异性结合瓜氨酸化HLA-DR4共享表位(例如，QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA)的特异性结合分子(例如抗体或所述抗体的特异性结合片段)，其用于治疗和/或预防自身免疫疾病。这些自身免疫疾病完全或部分由抗原呈递细胞(例如B细胞)上存在的HLA-DR4受体上存在的瓜氨酸化表位QKCitAA或瓜氨酸化表位QRCitAA或瓜氨酸化表位RRCitAA介导。带有由抗原呈递细胞(例如B细胞)呈递的瓜氨酸化共享表位QKCitAA或瓜氨酸化表位QRCitAA或瓜氨酸化表位RRCitAA的HLA-DR4分子被T细胞识别为外源的，从而引起T细胞活化和致病性免疫应答的启动。
不希望受任何具体理论的束缚，据信施用与瓜氨酸化HLA-DR4共享表位反应的特异性结合分子(例如抗体或所述抗体的特异性结合片段)可引起特异性结合分子与抗原呈递细胞(例如，将瓜氨酸化HLA-DR4共享表位呈递给T细胞的B细胞)结合。以这种方式，本发明的抗体或所述抗体的特异性结合片段可用于结合HLA-DR4分子上存在的瓜氨酸化共享表位，并防止患者的T细胞对具有瓜氨酸化HLA-DR4表位的外来HLA-DR4起反应。随后可以通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)机制和补体依赖性细胞毒性(CDC)等消除这些抗原呈递细胞(例如B细胞)。
当用于治疗人时，抗体或其抗体片段优选主要由人抗体序列组成，即它是人源化的，以便不产生针对本发明的抗体或其特异性结合片段的抗体。
对于治疗用途，抗体或其特异性结合片段在施用于人患者后合适地是稳定的。例如，它应该具有较长的人体半衰期，并且在施用后短时间内不会被蛋白酶分解。合适的是，抗体的半衰期为数周而非数天。
在一些实施方案中，如上概述的具有瓜氨酸-HLR-DR4相关的自身免疫疾病或怀疑患有瓜氨酸-HLR-DR4相关的自身免疫疾病的受试者可用药物组合物治疗，所述药物组合物包含有效量的特异性结合分子(例如，特异性结合本公开的瓜氨酸化HLA-DR4共享表位(例如QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA)的抗体或其特异性结合片段和药学上可接受的赋形剂。在各种实施方案中，特异性结合分子是特异性结合瓜氨酸化共享表位(例如QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA)的抗体或其片段，例如，特异性结合瓜氨酸化HLA-DR4表位(例如具有氨基酸序列QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA的瓜氨酸化共享表位)的多克隆或单克隆抗体或嵌合抗体或人源化抗体或完全人抗体。如本文所用，“药学上可接受的载剂”或“药学上可接受的赋形剂”包括当与活性成分组合时允许所述成分保留生物活性并且不与受试者的免疫系统反应的任何材料，并且可以包括任何和所有溶剂、稀释剂、载剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等，其在生理上相容，无毒，并且不干扰活性抗瓜氨酸化共享表位抗体或其抗原结合片段的作用机制。优选地，药学上可接受的赋形剂适用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。根据施用途径，活性组分(即特异性结合分子)可以包被在材料中以保护特异性结合分子免受可能使特异性结合分子不活化的酸和其他蛋白酶的作用。
根据本发明使用的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段的配制剂可以冻干的药学上可接受的配制剂、溶液和/或悬浮液的形式通过以下方式来制备用于储存：将具有所需纯度的抗体或其抗原结合片段与如Remington'sPharmaceutical Sciences第16版Osol,A.编辑[1980]中所详细描述和阐释的任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂混合。可接受的载剂、赋形剂、缓冲剂或稳定剂在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括可以在本公开的药物组合物中使用的合适的水性和/或非水性赋形剂，例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)以及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。可以例如通过使用包衣材料(例如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需的粒径，以及通过使用表面活性剂、缓冲剂(例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸)维持适当的流动性。可以包括抗氧化剂，例如，(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)。其他示例性药学上可接受的赋形剂可包括多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一个阐释性实施方案中，药物组合物可任选地含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂和毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。在一些实施方案中，本公开的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段被配制用于储存并且可以冻干用于储存，并且在使用之前根据本领域已知的冻干和重构技术在合适的赋形剂中重构。在含有抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段的一种示例性药物组合物中，将所述组合物配制成抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段的无菌、无防腐剂的溶液用于静脉内或皮下施用。所述配制剂可以作为一次性使用的预填充笔、作为一次性使用例如含有约1mL预填充的玻璃注射器或作为一次性使用的机构用小瓶供应。优选地，含有抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段的药物组合物是透明且无色的，pH值为约6.9-5.0，优选pH值为6.5-5.0，并且甚至更优选pH值范围为约6.0至约5.0。在各种实施方案中，包含药物组合物的配制剂可含有约1,000mg至约10mg，或约500mg至约20mg，或约400mg至约30mg或约300mg至约50mg的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段/毫升溶液，此时重构并施用于受试者。示例性注射或输注赋形剂可包括甘露醇、柠檬酸一水合物、二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、聚山梨醇酯80、氯化钠、柠檬酸钠和水用于肠胃外施用(例如，静脉内、肌内、腹膜内或皮下施用)。
在另一个示例性实施方案中，利用pH值范围为约5至6的乙酸钠、聚山梨醇酯80和氯化钠将抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段配制为含有约0.1mg/mL至约100mg/mL或更优选地约5-75mg/mL或更优选地约10-50mg/mL或甚至更优选地约10-40mg/mL抗体的无菌水溶液用于静脉内或皮下施用。优选地，静脉内或皮下配制剂是含有5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/mL抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA抗体或其抗原结合片段的无菌水溶液，具有pH 5.5的20mM乙酸钠、0.2mg/mL聚山梨醇酯80和140mM氯化钠。此外，包含抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段的溶液可包含组氨酸、甘露醇、蔗糖、海藻糖、甘氨酸、聚(乙烯)二醇、EDTA、甲硫氨酸等许多其他化合物及它们的任何组合以及相关领域中已知的许多其他化合物。
在一个实施方案中，本公开的药物组合物包含以下组分：5-100mg本公开的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段、10mM组氨酸、5％蔗糖和0.01％聚山梨醇酯80，pH为5.8。该组合物可以作为冻干粉末提供。当粉末以全体积重构时，组合物保留相同的配方。可选地，粉末可以一半体积重构，在这种情况下，该组合物包含10-200mg本公开的抗瓜氨酸化表位共享QKCitAA抗体或其抗原结合片段、20mM组氨酸、10％蔗糖和0.02％的聚山梨醇酯80，pH为5.8。
在一个实施方案中，部分剂量通过静脉内浓注施用，且其余部分通过输注抗体配制剂施用。例如，在一些实施方案中，通过静脉内注射抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段以浓注形式提供在约0.001至约200mg/kg(例如约0.001mg/kg至约100mg/kg，或约0.001mg/kg至约50mg/kg，或约0.001mg/kg至约10mg/kg)范围内的量的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段，并且其余的抗体剂量可以通过静脉内注射施用。预定剂量的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA抗体或其抗原结合片段可以例如在1小时至2小时至5小时的时段内施用。
在另一个实施方案中，部分剂量通过静脉内施用、通过以浓注形式皮下注射和/或输注来施用，并且其余部分通过输注抗体配制剂施用。在一些示例性剂量中，抗体配制剂可以静脉内或皮下施用，剂量范围为约0.001至约200mg/kg，例如约0.001mg/kg至约100mg/kg，或约0.001mg/kg至约50mg/kg，或约0.001mg/kg至约10mg/kg静脉内注射抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，剂量可以浓注形式给予，并且其余的抗体剂量可以通过皮下或静脉内注射施用。预定剂量的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段可以例如在1小时至2小时至5小时的时段内施用。
如本文提供的示例性配制剂还可含有一种以上治疗具体适应症所必需的活性剂，优选具有补体活性且彼此不会不利地影响的那些活性剂。例如，可能需要提供具有其他特异性的抗体。可选地或另外，组合物可包含抗炎剂、化学治疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和/或小分子酶抑制剂或受体调节剂。所述分子合适地以对预期目的有效的量组合存在。
待用于体内施用的配制剂应该是无菌的，或几乎是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤而容易地完成。
在各种实施方案中，本文所述药物组合物的阐释性配制剂可使用药物配制剂领域中广泛已知的方法制备。通常，所述制备方法可包括如下步骤：使活性成分与载剂或一种或多种其它辅助成分结合，并且然后如果需要，将产品包装成所需的单剂量或多剂量单元。
在一些实施方案中，药物组合物还可以在囊泡中、特别是在含有一种或多种脂质体表面部分(例如聚乙二醇)、抗体和其抗体片段的脂质体中递送，其选择性地转运到特定细胞或器官中，因此增强靶向药物递送。
所选介质中活性成分的最佳浓度可以根据本领域技术人员熟知的方法凭经验确定，并且将取决于所需的最终药物配制剂和待使用的用途。
本公开还提供了药物包或试剂盒，其包含一个或多个装有本公开药物组合物的一种或多种成分的容器，所述药物组合物至少包括如本文所述的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，试剂盒可以包含一个或多个另外的容器，所述容器提供药学上可接受的赋形剂，例如稀释剂。在一个实施方案中，试剂盒可包含至少一个容器，其中所述容器可包括本公开的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段，或本文公开的药物组合物和/或抗炎药，和/或包含细胞毒素和/或化学治疗药物和/或免疫抑制剂和/或放射性同位素的免疫缀合物。试剂盒还可以包括用于制备最终药物组合物和向有需要的受试者施用最终药物组合物的一组说明书，其用于治疗瓜氨酸-HLR-DR4介导的疾病或病症。
在各种实施方案中，本文所述的适当剂量的活性剂由临床医生，例如使用已知或在本领域中怀疑影响治疗或预测影响治疗的参数或因素来制得。在一些实施方案中，合理的医学实践将规定初始剂量以略低于最佳剂量的量开始，并且此后以小的增量增加，直到相对于任何负面副作用达到所需或最佳效应。重要的诊断措施包括瓜氨酸-HLR-DR4介导的疾病过程(例如类风湿性关节炎)中例如炎症的那些症状或所产生的炎症性细胞因子的水平、自身抗体滴度、组织损伤或估计的活性或状态。在一些实施方案中，可以改变本公开的药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得在对患者无毒的情况下对于特定受试者、组合物和/或施用方式有效实现所需治疗反应的活性成分的量。包含本公开的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段的组合物可通过一种或多种施用方式，例如通过静脉内注射、连续输注，或以例如一天、几天、一周或每周1-7次的间隔分剂量施用给受试者，例如人受试者。剂量可以肠胃外(例如静脉内或皮下)提供。
仅以说明方式并考虑用于确定适当剂量和给药频率的各种因素，待施用给有需要的患者的包含抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段的示例性剂量可以包括约0.01至约100mg/kg体重、更优选约0.02至约50、更优选约0.02至约10、更优选约0.02至约7、约0.03至约5或约0.05至约3mg/kg体重的单剂量，视治疗需要，每天给药一次或多次，和/或每周一次或多次，例如持续一至四周，或一至八周，或一至十二周，或一至十四周，或一个月至几年范围内的时段。在一些实施方案中，示例性给药方案可包括施用最大剂量或给药频率，其避免显著的不良副作用。在一些实施方案中，总的日剂量或周剂量可以是至少0.05μg/kg体重、至少0.2μg/kg、至少0.5μg/kg、至少1μg/kg、至少10μg/kg、至少100μg/kg、至少0.2mg/kg、至少0.5mg/kg、至少1.0mg/kg、至少2.0mg/kg、至少10mg/kg、至少15mg/kg、至少20mg/kg、至少25mg/kg或至少50mg/kg或至少或至少100mg/kg。
在另一个实例中，待施用给有需要的患者的包含本公开的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段的阐释性剂量(其可以是治疗有效剂量或治疗剂量)可以是约0.001mg/kg至约200mg/kg每天给药的患者体重，以单剂量(例如单位剂量)施用，或每天两次或施用的分开剂量施用。有需要的受试者的剂量可以介于0.001mg/kg与200mg/kg之间，介于0.001mg/kg与100mg/kg之间，介于0.001mg/kg与50mg/kg之间，介于0.001mg/kg与25mg/kg之间，介于0.001mg/kg与10mg/kg之间，介于0.001mg/kg与5mg/kg之间，介于0.001mg/kg与1mg/kg之间，介于0.001mg/kg与0.5mg/kg之间以及其间的任何剂量量。作为非限制性实例，根据本公开的治疗可以抗体或其抗原结合片段的日剂量提供，其量为每天约0.1-100mg/kg，例如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg，在治疗开始后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或可选地在治疗开始后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周，或它们的任何组合，使用每24、12、8、6、4或2小时的单剂量或分开剂量或它们的任何组合来提供。
根据病症的严重程度和本文讨论的各种因素，鉴于本领域技术人员已知的适当医学标准，可相应地调整治疗的剂量、频率和持续时间。在某些示例性实施方案中，本公开的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段可以作为至少约0.1mg至约800mg、约1至约500mg、约5至约300mg或约10至约200mg、至约100mg或至约50mg的初始剂量施用。第一剂量可以是初始负荷剂量，随后是多个维持剂量。在某些示例性实施方案中，初始剂量之后可以施用第二或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段，其量可以与初始剂量的量大致相同或更小，其中随后的剂量间隔至少1天至3天；至少一周，至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或至少14周，或者可以重复本公开的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段的剂量，并且施用可以分开至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或至少6个月。
本公开组合物的施用途径可以通过例如局部或皮肤施加，通过静脉内、腹膜内、皮下、脑内、肌内、眼内、动脉内、皮内、脑脊髓内、病灶内、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注来注射和输注，或通过持续释放系统或植入物。可注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射、滴注等的剂型。许多可重复使用的笔和自动注射器递送装置已应用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但不一定限于AUTOPENTM(Owen Mumford公司，Woodstock,UK)、DIS-ETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Burghdorf,Switzerland)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMA-LOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(EliLilly and Co.,Indianapolis,Ind.),NOVOPENTMI、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark),NOVOPEN JUNIORTM(Novo Nor-disk,Copenhagen,Denmark),BDTM笔(BectonDickinson,Franklin Lakes,N.J.)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTMOPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)，作为本文涵盖的示例性基于笔的递送方法，其用于使用本发明的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA抗体或其抗原结合片段。可应用于皮下递送本公开的药物组合物的基于笔的装置的阐释性实例包括SOLOSTARTM笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)和KWIKPENTM(Eli Lilly)。
在各种实施方案中，根据本发明的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段可以根据合理的医学实践施用给表现出一种或多种关节炎标准的患者，例如，当鉴于2010ACR/EULAR RA分类标准，受试者被认为患有类风湿性关节炎时，所述分类标准通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，表现未分化的炎症性关节炎或未分化的滑膜炎的受试者或根据如本文表1中所示的2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟针对类风湿性关节炎的分类标准发现具有确定的RA的受试者可以用根据本发明的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段进行治疗。在各种实施方案中，通过施用根据本发明的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段的治疗可以在任何时间开始，并且持续到症状消退或持续如由缓解症状所指示的预定时段或持续无限期的时间。
表1.2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟针对类风湿性关节炎的分类标准
*标准旨在对新呈现的患者进行分类。此外，具有类风湿性关节炎(RA)典型的糜烂性疾病并且病史与2010标准的先前符合相符的患者应分类为患有RA。患有长期疾病的患者，包括那些疾病无活性(有或无治疗)并且基于回顾可用数据先前符合2010年标准的患者应分类为患有RA。
不同表现的患者的诊断不同，但可能包括诸如全身性红斑狼疮、牛皮癣关节炎和痛风的病症。如果不清楚考虑的相关的差异诊断，应咨询专家风湿病学家。
虽然评分<6/10的患者不能分类为患有RA，但可以重新评估其状态，并且可能会随着时间的推移累积符合标准。
§关节受累是指在检查时任何肿或触痛关节上，其可以通过滑膜炎的影像证据来确认。远端指间关节、第一腕掌关节和第一跖趾关节被排除在评估之外。根据受累关节的位置和数目对关节分布的类别进行分类，基于关节受累的型式放置到最高类别可能。
“大关节”是指肩、肘、臀、膝盖和踝。
#“小关节”是指掌指关节、近端指间关节、第二至第五跖趾关节、拇指指间关节和腕关节。
**在此类别中，至少1个受累关节必须是小关节；其他关节可以包括大关节和额外的小关节的任何组合，以及别处未具体列出的其他关节(例如颞下颌、肩锁、胸锁等)。
阴性是指IU值小于或等于实验室和测定的正常上限(ULN)，低阳性是指IU值高于ULN并且是实验室和测定的ULN的3倍；高阳性是指IU值是实验室和测定的ULN的>3倍。如果类风湿因子(RF)信息仅可用作阳性或阴性，则阳性结果应评分为RF的低阳性。ACPA＝抗瓜氨酸化蛋白抗体。通常当地实验室标准确定正常/异常。CRP＝C反应蛋白；ESR＝红细胞沉降率。
§§症状持续时间是指在评估时临床受累的关节的滑膜炎的体征或症状(例如，疼痛、肿胀、触痛)的持续时间的患者自我报告，而与治疗状态无关。
根据本发明的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段可用于诊断或用作研究工具。例如，可包括根据本发明的一种或多种抗体作为用于测试抗原呈递细胞存在的诊断试剂盒中的阳性对照，所述抗原呈递细胞带有瓜氨酸化HLA-DR4共享表位、促进T细胞介导的免疫活性的致病因子，包括细胞因子产生的上调(例如TNF-α、IL-6和IL-17)、T细胞增殖和其他促炎细胞的募集。
当在体外使用时，抗体或其特异性结合片段的合适浓度可以是10ng/mL至100μg/mL。本领域技术人员可以找到产生具有低背景(良好信噪比)的合适信号的适当浓度。用于稀释抗体的合适介质也是本领域已知的，并且可以是例如磷酸盐缓冲盐水，任选地补充有BSA。
本发明的另一方面是诊断试剂盒，其包含根据本发明的抗体。所述试剂盒优选包含ELISA板、流式细胞仪或用于抗体分析的其他平台以及用于检测抗体的试剂，例如标记的抗人抗体和合适的缓冲液。因此，根据本发明的抗体可用于体外诊断。在一些实施方案中，可以首先筛选存在患者白细胞表面上呈现的瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA的受试者。可以使用根据本发明的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段进行该诊断测试。在一些实施方案中，抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段用检测部分(例如荧光蛋白或剂(例如荧光素或GFP)、放射性标记、化学发光标签等)标记。在患者的白血细胞(例如，抗原呈递细胞(例如B细胞))表面上存在瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA指示，患有如本文所定义的自身免疫疾病的受试者可以使用抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段得以治疗。
在一些实施方案中，可能未被确认为患有RA但可能是治疗的合适候选者的受试者可以进行一个或多个诊断测试以确定它们是否携带瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA。在一些实施方案中，诊断测试将用于检测外周血B细胞上瓜氨酸化共享表位的存在。可以使用几种测定，例如，1)使用抗Cit SE mAb的流式细胞术；2)使用与夹心中的捕获抗体相同的mAb(例如IF9单克隆抗QKCitAA SE HLA-DR4抗体，和识别非瓜氨酸化天然表位的第二抗DR4mAb)的细胞裂解物的ELISA；和3)来自所测试的受试者的B细胞裂解物的免疫沉淀的HLA-DR4的质谱分析。免疫沉淀可以使用任何抗HLA-DR4mAb(例如，抗DR4mAb(L243))。然后可以对免疫沉淀的材料进行胰蛋白酶消化，并且可以使用LC-质谱法或MS拆分和鉴定所得的肽，这是因为瓜氨酸化表位肽的质量预期比表位QKRAA、QRRAA或RRRAA中的一个精氨酸残基未被瓜氨酸化的大。在一些实施方案中，诊断测定可用于鉴定可受益于使用包含抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段的药物组合物治疗的受试者。在本诊断测定中，可以使用本发明的抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段对RA患者中类风湿性滑膜进行分子成像，所述抗瓜氨酸化共享表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA抗体或其抗原结合片段用99mTc标记用于单光子发射计算体层摄影(SPECT)成像，或用光学成像的近红外染料(NIR)标记。
实施例
实施例1.针对瓜氨酸化EQKCitAA肽半抗原的单克隆抗体的产生
小鼠的免疫
具有氨基酸序列C-氨基己酸-EQKCitAA的肽由Cayman Chemical的科学家设计，并且其合成与LifeTein,LLC签订合同。纳入N末端半胱氨酸(C)以允许与载体蛋白的化学连接。氨基己酸是在载体蛋白和所需半抗原之间提供物理空间的接头。包括来自DRB1*0401的总共六个氨基酸，即氨基酸69-74(EQKRAA)作为半抗原，通常在72位发现的精氨酸(R)被氨基酸瓜氨酸(Cit)替代。使用商业试剂盒(Imject Maleimide Activated Carrier ProteinSpin Kit，Thermo Scientific)将该肽与钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)载体蛋白偶联以产生“免疫原”。
在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中将免疫原稀释至200μg/ml的浓度。在第0天，将1ml免疫原与1ml完全弗氏佐剂(CFA)混合并乳化。用50μg免疫原:CFA乳液经腹膜内(IP)免疫三只BALB/c雌性小鼠。在第14天和第34天，将1ml免疫原与1ml不完全弗氏佐剂(IFA)混合并乳化。向三只BALB/c雌性小鼠再次(加强)IP注射50μg免疫原:IFA乳液。在第65天，在无佐剂的情况下将50μg免疫原注射到小鼠的尾静脉中。在第68天，处死一只小鼠并收获脾用于杂交瘤产生。
单克隆抗体的产生
在RPMI-1640基础培养基中由小鼠脾细胞制备无菌单细胞悬浮液。通过用TRIS缓冲的氯化铵处理使脾中的红细胞裂解。剩余的白细胞在RPMI-1640中洗涤，重悬于RPMI-1640中，并与P3x63Ag8.653骨髓瘤细胞以5:1脾细胞/骨髓瘤比例组合。沉淀细胞，吸出液体，并用50％聚乙二醇处理细胞沉淀以诱发细胞融合和杂交瘤形成。将融合的细胞接种到96孔组织培养板中并在HAT培养基中生长以选择杂交瘤。选择10天后，测试上清液中是否存在能够结合免疫原的肽部分的单克隆抗体。通过ELISA针对平板结合的半抗原肽(C-氨基己酸-EQKCitAA)进行该筛选。类似地，通过ELISA针对含有精氨酸而非瓜氨酸的平板结合的对照肽(C-氨基己酸-EQKRAA)进行反筛选以确定选择性。发现一种单克隆抗体1F9与含瓜氨酸的肽结合，但不与含精氨酸的肽结合。通过ELISA进一步表征该单克隆抗体与板结合的人α烯醇酶、瓜氨酸化人α烯醇酶、组蛋白H3(全长蛋白)、瓜氨酸化组蛋白H3(全长蛋白)、组蛋白H3尾肽(氨基酸1-21)和瓜氨酸化组蛋白H3尾肽(在R2、R8和R17处瓜氨酸化)的结合。1F9抗体仅结合瓜氨酸化半抗原肽(C-氨基己酸-EQKCitAA)。其不与任何其他测试的肽或蛋白质结合，不管瓜氨酸化或未瓜氨酸化。这表明1F9单克隆抗体对共享表位序列的瓜氨酸化形式具有特异性。为了支持1F9单克隆抗体的特异性结合对于共享表位序列的瓜氨酸化形式具有特异性的发现，将各种抗原平铺在96孔板中并使用各种浓度的1F9单克隆抗体进行筛选。用于涂布板的抗原包括MHC II类肽(EQKRAA)、瓜氨酸化MHC II类肽(EQKCitAA)、烯醇酶、瓜氨酸化烯醇酶、H3蛋白和瓜氨酸化H3蛋白。如图2A和图2B中所示，1F9单克隆抗体特异性结合瓜氨酸化肽。甚至当肽用于测试1F9单克隆抗体(例如H3(1-21)肽和瓜氨酸化H3肽(1-21)(2、8和17位处的Cit精氨酸))的特异性时，仅瓜氨酸化MHC II类肽特异性结合IF9单克隆抗体。
实施例2.重组PAD4体外对HLA-DR4转基因小鼠B细胞上DRB1*0401蛋白的瓜氨酸化
从Taconic(型号4149-F或4149-M)获得在不存在内源性小鼠MHC II类表达的情形下表达人HLA-DRB1*0401基因的小鼠。来自这些小鼠脾的B细胞在其表面上表达HLA-DR4异二聚体蛋白质，包括含有共享表位氨基酸序列QKRAA的DRB1*0401β链。在无菌条件下收获来自这些小鼠之一的脾，并如以下中所述产生单细胞悬浮液：Current Protocols inImmunology，单元3.1，“Isolation of Mouse Mononuclear Cells”，其公开内容通过引用整体并入本文中。将脾细胞以1×107个细胞/ml悬浮于补充有1mM CaCl2的TRIS缓冲盐水溶液中。
将等份的0.5mL脾细胞用重组人PAD4(Cayman Chemical，目录号10500，AnnArbor，MI USA)以0、0.05、0.2、1和5μg/mL在37℃下处理30分钟。将细胞以150x g离心5分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于0.2ml FACS缓冲液(补充有0.1％牛血清白蛋白和0.01％叠氮化钠的汉克氏平衡盐溶液)中。
向细胞悬浮液中添加2μL FITC缀合的抗B220mAb(BioLegend目录号103205)和2微克的APC缀合的1F9mAb。抗B200染色所有B细胞，并且1F9mAb仅染色表达瓜氨酸化共享表位的B细胞。将细胞在冰上孵育30分钟，以150x g离心，并将沉淀重悬于FACS缓冲液中。通过流式细胞术分析细胞。PAD4处理导致DRB1*0401链的共享表位区域的瓜氨酸化，其随后被1F9抗体识别。
实施例3.来自HLA-DR4转基因小鼠的B细胞上的DRB1*0401蛋白的瓜氨酸化诱发T 细胞增殖和细胞因子产生
使用来自Solulink(Solulink公司，目录号S-1002，San Diego，CA USA)的S-HyNic/4FB缀合技术遵循制造商的说明书将重组人PAD4(Cayman Chemical，目录号10500，Ann Arbor，MI USA)与山羊抗小鼠IgG/IgM/IgA抗体(ThermoFisher目录号A-10666)以1:1摩尔比化学偶联。基本上，重组人PAD4与S-HyNic接头(琥珀酰亚胺基-6-肼基-烟酰胺)缀合，并通过与山羊抗小鼠IgG/IgM/IgA抗体偶联的4FB(4-甲酰基苯甲酰胺)与山羊抗小鼠IgG/IgM/IgA抗体缀合。根据制造商的方案(Solulink公司，目录号S-2006-105，San Diego，CA USA)将HyNic修饰的重组人PAD4与4FB修饰的山羊抗小鼠IgG/IgM/IgA抗体一起在TurboLinkTM催化的缀合反应中孵育。
结果是通过UV可追踪的稳定键(双-芳基腙)缀合的重组人PAD4/山羊抗小鼠IgG/IgM/IgA抗体复合物，其在354nm处具有可测量的吸光度。将该“PAD4/抗小鼠Ig缀合物”在完全培养基中稀释至1mg/mL的浓度，无菌过滤，并在4℃下储存。
从Taconic(Abb Knockout/Transgenic HLA-DR4目录号4149-F或4149-M TaconicBiosciences Rensselaer，NY USA)获得在不存在内源性小鼠MHC II类表达的情况下表达人HLA-DRB1*0401基因的小鼠。来自这些小鼠脾的B细胞在其表面上表达HLA-DR4异二聚体蛋白质，包括含有共享表位序列QKRAA的DRB1*0401β链。在无菌条件下收获来自这些小鼠之一的脾，并如以下中所述产生单细胞悬浮液：Current Protocols in Immunology，单元3.1，“Isolation of Mouse Mononuclear Cells”，其公开内容通过引用整体并入本文中。将脾细胞以2×106/mL的浓度悬浮于“完全培养基”(补充有10％胎牛血清、1mM CaCl2和抗生素的RPMI-1640)中，并在冰上冷却至4℃并保持30分钟。
将10ml(2×107个总细胞)的脾细胞悬浮液在4℃下以150x g离心5分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1mL 4℃的完全培养基中。向该1mL脾细胞悬浮液中添加100μL无菌PAD4/抗小鼠Ig缀合物，并在冰上孵育1小时。然后将细胞在4℃下以150x g离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10ml 4℃的完全培养基中。将细胞再次在4℃下以150x g离心5分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于10mL 4℃的完全培养基中。该悬浮液中B细胞上的表面免疫球蛋白受体现在被抗小鼠Ig/PAD4缀合物结合，并且未结合的缀合物被洗掉。
将与瓜氨酸化共享表位结合的1F9单克隆抗体在完全培养基中以1mg/mL稀释，无菌过滤，并保持在4℃直至准备使用。
在无菌96孔圆底微量滴定板中，将脾细胞和抗体混合并在以下条件下培养：
A.6个含有100μL未用PAD4/抗小鼠Ig缀合物处理的脾细胞悬浮液(2×105个细胞)加100μL完全培养基的孔。
B.6个含有100μL用PAD4/抗小鼠Ig缀合物处理的脾细胞悬浮液(2×105个细胞)加100μL完全培养基的孔。
C.6个含有100μL未用PAD4/抗小鼠Ig缀合物处理的脾细胞悬浮液(2×105个细胞)加100μL1F9单克隆抗体稀释液的孔。
D.6个含有100μL用PAD4/抗小鼠Ig缀合物处理的脾细胞悬浮液(2×105个细胞)加100μL1F9单克隆抗体稀释液的孔。
将96孔板转移至37℃CO2孵育箱中72小时。培养72小时后，移出每种条件下6个孔中的3个孔的上清液，并遵循制造商的说明书通过ELISA评估TNF-α的产生(参见，例如，TNF-α(小鼠)ELISA试剂盒目录号500850Cayman Chemical，Ann Arbor，MI USA)。对于每种条件下剩余的三个孔，如以下中所述通过3H-胸苷纳入评估每个孔中T细胞增殖的程度：CurrentProtocols in Immunology，单元7.10.16，Support Protocol 2，其公开内容通过引用整体并入本文中。
在条件A或C下未检测到TNF-α产生或T细胞增殖。在条件B下检测到最高水平的TNF-α产生和T细胞增殖。在条件D下检测到中等水平的TNF-α和T细胞增殖。
实施例4.从RA患者分离的B细胞上的瓜氨酸化HLA-DRB1*0401的鉴定
从患有抗瓜氨酸化蛋白抗体阳性(ACPA+)类风湿性关节炎的人患者和健康对照获得的新鲜抽取的外周血购自Dx Biosamples(San Diego CA USA)(或其他合格供应商)。在室温下将2mL每种血液样品添加至20ml ACK裂解缓冲液(Thermo Fisher目录号A1049201)中达10分钟以裂解红细胞。然后将样品以150x g离心5分钟，并将含有活白细胞的细胞沉淀重悬于2mL裂解缓冲液(50mM Tris、150mM NaCl、5mM EDTA、0.5％NP-40、10mM碘乙酰胺和蛋白酶抑制剂(Roche))中。将裂解物以10,000x g离心30分钟以去除不溶物质。将清除的裂解物移至新管中，并在4℃下与50μL琼脂糖珠一起孵育(预清除)30分钟。将裂解物以10,000xg离心10分钟以沉淀琼脂糖。将预清除的裂解物转移至新管中，并将与100μg小鼠抗人HLA-DR[L243]单克隆抗体(Abcam，抗HLA DR抗体[L243]，目录号ab136320，Cambridge，MA USA)共价偶联的50μL琼脂糖珠添加至裂解物中并在旋转下孵育1小时。将裂解物和L243-琼脂糖在4℃下旋转孵育4小时。将管在台式微量离心机中以1,000x g离心10分钟，并从沉淀的L243-琼脂糖缀合物中弃去上清液。用1mL裂解缓冲液洗涤L243-琼脂糖缀合物，然后用1mL含有20mM Tris-HCl、120mM NaCl(pH 8.0)的洗涤溶液洗涤。通过添加0.5mL 0.1M甘氨酸-HCl(pH 3.0)，从L243-琼脂糖缀合物中洗脱HLA-DR分子。将洗脱的HLA-DR4分子送至MSBioworks(Ann Arbor MI，USA)进行胰蛋白酶消化氨基酸分析，以确定共享表位区QKRAA是否存在瓜氨酸化。
应该理解，虽然已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前面的描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在权利要求的范围内。

Claims (14)

1.一种用于治疗人受试者中自身免疫疾病的方法，所述自身免疫疾病由存在包含以下的氨基酸序列的HLA-DR4瓜氨酸化共享表位介导：QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA，所述方法包括向有需要的所述人受试者施用治疗有效量的特异性结合瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA的抗体或其特异性结合片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述自身免疫疾病是炎症性关节炎、多发性硬化症、1型糖尿病、莱姆病诱发的关节炎、类风湿性关节炎、肼苯哒嗪诱发的女性全身性红斑狼疮、妊娠性类天疱疮、落叶型天疱疮、梗阻性肥厚型心肌病、牛皮癣关节炎、牛皮癣、IgA肾病、‘共同综合症’-全身性硬化症/类风湿性关节炎和风湿性多肌痛。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述自身免疫疾病是多发性硬化症、类风湿性关节炎、1型糖尿病和莱姆病诱发的关节炎。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述自身免疫疾病是类风湿性关节炎。
5.根据权利要求1所述的方法，其中首先筛选所述受试者是否存在于患者白细胞表面上存在的瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA。
6.根据权利要求5所述的方法，其中使用所述患者的B细胞确定所述瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA的存在。
7.根据权利要求6所述的方法，其中通过将所述患者的B细胞与单克隆抗体IF9混合并测量单克隆抗体IF9与所述瓜氨酸化表位QKCitAA之间的特异性结合来确定所述患者的B细胞上所述瓜氨酸化表位QKCitAA的存在。
8.根据权利要求7所述的方法，其中使用流式细胞术确定所述患者的B细胞上所述瓜氨酸化表位QKCitAA的存在。
9.根据权利要求1所述的方法，其中特异性结合瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA的所述抗体或其特异性结合片段通过静脉内、皮下或腹膜内施用。
10.根据权利要求1所述的方法，其中还向所述患者施用抗炎剂、化学治疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、小分子酶抑制剂或受体调节剂或它们的组合。
11.一种抗体或其特异性结合片段，其特异性结合HLA-DR4上存在的人瓜氨酸化表位QKCitAA、QRCitAA或RRCitAA。
12.根据权利要求11所述的抗体或其特异性结合片段，其特异性结合人瓜氨酸化表位QKCitAA。
13.根据权利要求11所述的抗体或其特异性结合片段，其是选自由以下组成的组：单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体。
14.根据权利要求13所述的抗体或其特异性结合片段，其中特异性结合人瓜氨酸化表位QKCitAA的所述抗体或其特异性结合片段命名为单克隆抗体IF9或其抗原结合片段。
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