KR100480985B1 - 표피 성장 인자 수용체에 대한 사람화된 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ECACC에 수탁 번호 제97021428호로 기탁된 세포주로부터 수득할 수 있는 항체 340의 사람화된 형태를 제공한다. 이러한 항체는 뮤린 항체 340과 비교하여 세포를 죽이는 능력이 증가되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 발명은 이러한 항체를 암호화하는 핵산, 및 특히 암 치료에 있어 항체의 약물로서의 용도를 제공한다.

Description

표피 성장 인자 수용체에 대한 사람화된 항체{Humanized antibodies to the epidermal growth factor receptor}
본 발명은 사람화된 항체 및 이의 단편, 특히 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 대해 특이적인 사람화된 항체에 관한 것이다.
EGFR은 종양-관련 세포 표면 항원이므로, 항체에 대한 널리 공지된 표적물이다. 문헌[참조: Durrant et al., Prenatal Diagnosis, 14, 131-140, 1994]은, EGFR에 고특이적으로 결합하는, "340"으로 공지된 마우스 모노클로날 항체를 기술하고 있다. 이들 항체를 발현하는 세포주는 ECACC에 수탁번호 제97021428호로 기탁되었다. 모노클로날 항체 340은 골육종 세포주 791T에 대해 생성되었다. 면역침전 연구에서는, 340이 골육종 종양 및 태반 조직 모두로부터의 분자량 170kDa인 막 당단백질을 인지한다고 밝혔다. 정제된 항원의 말단 아미노산 서열분석 결과, 표피 성장 인자 수용체와 서열 동일성을 나타냈다. 340 항원이 EGF 수용체라는 것을 확인하기 위해, 방사선-표지된 EGF 및 EGF 수용체 항체가 S340 항체 항원에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 340은 EGF의 수용체에의 결합에 대해 EGF와 경쟁할 수 있었으며, EGF는 340의 항원에 대한 결합에 대해 340과 경쟁할 수 있었다. 광범위한 조사에서는, 340이 결장, 위, 난소, 골육종 종양 세포주에 결합한다고 밝혔다. 또한, 이 항체는 태아 영양아층을 인지하며 어머니 혈액으로부터의 태반 세포를 분류하는데 사용되어 왔다.
수개의 다른 마우스 모노클로날 항체가 EGF 수용체를 인지하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 광범위하게는 2개의 범주에 해당한다: 수용체에는 결합하나 EGF의 결합을 억제하지 않는 항체 및 수용체에 결합하고 EGF의 결합을 억제하는 항체. 340 모노클로날 항체는 후자의 그룹에 속한다.
설치류, 특히 마우스 모노클로날 항체를 사람에서의 치료적 적용 및 생체내 진단 적용에 사용하는 것은, 설치류 항체에 대해 환자에 의해 유도되는 면역 반응에 의해 제한되는 것으로 밝혀졌다. 환자에서 소위 "HAMA"(사람 항-마우스 항체) 반응의 전개로 인해 항체들이 그들의 항원성 표적물에 도달하는 능력이 제한되어 항체의 효능이 감소되는 것으로 밝혀졌다. HAMA 반응을 감소시키기 위해, 마우스 가변(V) 영역이 사람의 불변(C) 영역에 결합되는 키메릭 항체가 개발되었다. 이러한 항체는, 마우스 V 영역 성분이 여전히 환자에서 면역원성을 발생시키는 기초를 제공하지만, 임상적으로 유용한 것으로 입증되었다[참조: LoBuglio et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989]. 따라서, 설치류 항체로부터의 보체 결정 영역(CDR)이 사람 V 영역에 이식되고 사람 C 영역에 연결되어 유일한 "비-사람" 성분이 사람 골격(framework) 영역에 인접한 CDR인, 사람화된 항체의 제조 기술이 개발되었다. 그러나, CDR를 단순 이식하면 종종 사람화된 항체의 친화성을 감소시키며, 그 결과 친화성을 회복하기 위해 사람 V 영역 골격에 특정 비-사람 아미노산의 도입이 필요하다는 것을 깨닫게 되었다.
사람화된 항체의 생성을 위한 이들 방법의 공통적인 양상은 사람에서 본질적으로 비-면역원성인 항체를 제조하는 것이다. 그러나, 이것이 이루어지는 수단은 가능한 한 많은 사람 서열을 설치류 항체로 도입하는 것이었다. 특정한 짧은 펩타이드 서열 또는 "에피토프"가 사람에서 면역원성일 수 있다는 것이 공지되어 있다. 따라서, 이러한 에피토프를 컴퓨터 분석으로 확인하고 비-면역원성 펩타이드를 생성하기 위해 아미노산을 대체하는 기술이 개발되었다(WO98/52976 and WO00/34317).
도 1은 마우스 모노클로날 항체 340 Vh 및 Vk 서열의 DNA 서열을 나타낸다.
도 2는 마우스 모노클로날 항체 340 Vh 및 Vk 서열의 해독된 단백질 서열을 나타낸다. 굵게 표시하고 밑줄친 서열은 순차적인 CDR을 나타낸다. 즉, CDR1은 각각의 쇄에 대해 나타낸 제1 서열이며 CDR3은 마지막 서열이다.
도 3은 뮤린 Vh 및 Vk 서열을 증폭시키는데 사용되는 프라이머 서열을 나타낸다.
도 4는 중쇄의 발현을 위해 사용되는 발현 벡터의 도식적 표시이다.
도 5는 경쇄의 발현을 위해 사용되는 발현 벡터의 도식적 표시이다.
도 6은 탈면역화된(deimmunised:DI) 중쇄 변형물에서의 MHC 결합 에피토프의 위치를 포함한, 탈면역화된 중쇄 서열의 정렬을 나타낸다.
도 7은 탈면역화된 경쇄에서의 MHC 결합 에피토프의 위치를 포함한, 탈면역화된 경쇄 서열의 정렬을 나타낸다.
도 8은 α340 키메릭 및 α340 마우스 모노클로날 항체를 사용한 A431 세포 결합 검정의 결과를 나타낸다.
도 9는 Vhd 탈면역화된 변형물의 A431 세포 결합 검정의 결과를 나타낸다.
도 10은 Vhe 탈면역화된 변형물의 A431 세포 결합 검정의 결과를 나타낸다.
도 11은 Vhb 탈면역화된 변형물의 A431 세포 결합 검정의 결과를 나타낸다.
도 12는 SC100 모노클로날 항체와 EGF 사이의 아미노산 상동성을 설명한다. SC100 항체의 면역글로불린 중쇄의 상보성 결정 영역 3에 대해 유추된 아미노산 서열은 표피 성장 인자에 대해 공지된 서열의 특정 부분과 뚜렷한 상동성을 보인다.
도 13은 EGF와 SC100을 비교하는 분자 모델이다. 이들 예시적 그림은 각각 SC100 중쇄 및 EGF를 나타내며, 도 6에 나타낸 아미노산 상동성을 갖는 2개 영역 사이의 구조적 유사성을 설명한다. 특히, 이들 다이아그램은 유사한 서열의 2개 부분이 EGF 구조에서 밀접히 인접하게 되는 방식 및 이들이 SC100 항체의 CDRH3중의 상동 서열에 의해 모방되는 방식을 나타낸다.
도 14는, 마우스 340 모노클로날 항체와 비교되는, (a) 탈면역화된 SC100 항체(클론 VhdVkd) 및 (b) 탈면역화된 SC100 항체(클론 VhdVkb)에 대한 A431 세포의 성장 억제률(%)을 나타낸다.
본 발명자는, 임상적으로 유용한 치료적 수단을 제공하기 위해 면역원성이 감소된 340 항체의 사람화된 버젼(version)["340Ch"(마우스 사람 키메라의 경우) 또는 "SC100"(탈면역화된 항체의 경우)로도 알려짐]을 생성하였다. 뜻밖에도, 본 발명자들은 이러한 사람화된 항체가 본래의 뮤린 항체가 EGFR을 발현하는 세포에 결합하는 것과 유사하게 이러한 세포에 결합하고 이러한 세포의 성장을 억제하는 증가된 능력을 갖는다는 발견하였다.
따라서, 본 발명의 제1 양상에 따라, 수탁번호 제97021428호로 ECACC에 기탁된 세포주로부터 입수가능한 항체 340의 사람화된 형태를 제공된다.
본 발명의 항체는 사람 항체 골격에 제공된 항체 340의 CDRH3을 포함하는 경우 바람직하다. 이 항체는 340의 중쇄 또는 경쇄의 다른 CDR중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 CDR이 첨부된 도면의 도 2에 나타나 있다. 이는 항체 340의 과가변 영역을 포함할 수 있다. 과가변 영역 이외의 가변 영역은 사람 항체의 가변 영역으로부터 유도될 수 있다, 이러한 항체를 제조하는 방법은, 예를 들어 미국 특허 제5,225,539호(Winter)에 공지되어 있다.
과가변 영역 밖의 항체의 가변 영역은 모노클로날 항체 340으로부터 유도될 수도 있다. 이러한 항체를 제조하는 방법은, 예를 들어 Boss에 의한 미국 특허 제4,816,397호(Celltech) 및 Cabilly에 의한 미국 특허 제4,816,567호(Genentech)에 기술되어 있는 것을 포함하여, 당 분야에 공지되어 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, 항체는 사람 항체 골격 및 항체 340의 가변 영역의 실질적인 부분, 바람직하게는 도 2에 나타난 바와 같은 가변 영역을 포함한다.
또다른 양태에서, 항체는 사람 항체 골격 및 도 6에 기술된 바와 같은 VHb, c, d 또는 e중 하나 및 도 7에 기술된 바와 같은 VKb, c 또는 d중 하나를 포함한다. 바람직한 항체는 VHd 및 VKd 또는 VHd 또는 VKb와 함께 사람 항체 골격을 포함한다.
사람 항체 골격은 바람직하게는 사람 항체의 불변 영역 모두 또는 이의 일부이다. 예를 들어, 도 2에 나타낸 VL 영역 모두 또는 이의 일부에 기초한 사람화된 항체는 이의 C-말단에서 사람 Cκ 또는 Cλ쇄를 포함한 항체 경쇄 불변 도메인에 결합될 수 있다. 유사하게, 도 2에 나타낸 VH 영역 모두 또는 이의 일부에 기초한 항체는 이의 C-말단에서 항체 이소타입, 예를 들어 IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 이소타입의 아부류, 특히 IgG1 및 IgG4으로부터 유도된 면역글로불린 중쇄 모두 또는 이의 일부에 결합될 수 있다. IgG1이 바람직하다.
모노클로날 항체는 리간드 수용체의 리간드 결합 부위 근처에 결합하여 리간드에의 접근를 입체적으로 차단함으로써 리간드를 차단시킬 수 있다. 달리는, 항체는 분자적으로 리간드를 모방하고 리간드 결합 부위에서 상호작용할 수 있다. 본원에서 본 발명자는, 340 항체 및 이의 SC100 유도체가 리간드 결합 부위에 결합하는 것뿐만 아니라 2차 구조에 의해 함께 하게 되는 리간드의 2개의 상이한 부분과 아미노산 상동성을 나타내기 때문에 특이하다는 것을 밝힌다. 또한, 단일 아미노산이 이러한 영역에서 변화되었을 때 SC100의 EGFR에 대한 결합이 상당히 감소되기 때문에, 세포 결합 조사에서 CDRH3 영역의 중요성이 확인되었다. 이는 펩타이드 리간드와 상동성을 보이는 CDR 영역을 갖는 항체가 수용체에 대한 결합에 있어 리간드와 효과적으로 경쟁할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 이들은 리간드/수용체 상호작용과 관련된 세포내 시그날화를 차단시킬 수 있다, 이러한 예에서, EGF는 성장 인자이고 생존 인자이기 때문에, 이의 수용체와의 상호작용을 차단하면 세포 성장 및 아폽토시스(apoptosis)를 억제한다. EGF 수용체는 악성종양에서 광범위하게 과다-발현되기 때문에, 약물 또는 항체에 의해 EGF 수용체를 차단하면 종양 성장을 억제시킨다, 이들 제제는 동물 모델에서 종양 퇴화(regression)를 일으키는데 화학요법과 병행하여 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다.
항체는 다양하게 변형될 수 있기 때문에, 용어 "항체"는 요구되는 특이성을 보유하는 결합 도메인을 갖는 어떠한 결합 요소 또는 물질도 포함하는 것으로 설명되어져야 한다. 따라서, 이러한 용어는, 면역글로불린 결합 도메인을 포함한 어떠한 폴리펩타이드라도 포함하는, 항체 단편, 유도체, 작용적 등가물 및 항체의 상동물(homologue)을 포함한다.
전체 항체의 단편이 항원을 결합하는 기능을 수행할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편[참조: Ward, E.S. et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된, 단일 쇄 Fv 분자(scFv)[참조: Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85:5879-5883 (1988)]; (viii) 이특이적 단일 쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (iv) 유전자 융합에 의해 작제된 다가 또는 다특이적 단편인 디아버디(diabody)[참조: WO94/13804; P. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]를 포함한다.
디아버디는 폴리펩타이드의 다량체로서, 각각의 폴리펩타이드는 면역글로불린 경쇄의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인 및 면역글로불린 중쇄의 결합 영역을 포함하는 제2 도멘인을 포함하고 이 두 도메인은 연결(예를 들어 펩타이드 링커에 의해)은 되지만 항원 결합 부위를 형성하기 위해 서로 결합될 수는 없다(항원 결합 부위는 다량체중의 하나의 폴리펩타이드의 제1 도메인이 다량체중의 또다른 폴리펩타이드의 제2 도메인과 결합되어 형성된다)(WO94/13804).
이특이적 항체가 사용될 경우, 이들은 다양한 방법[참조: Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 1993 4:446-449], 예를 들어 화학적으로 제조되거나 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 통상의 이특이적 항체이거나, 상술한 이특이적 항체 단편일 수 있다, 전체 항체를 사용하기 보다는 scFv 이량체 또는 디아버디를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 디아버디 및 scFv는 Fc 영역 없이 단지 가변 영역만을 이용하여 제조될 수 있으며, 잠정적으로 항-유전자형(idiotypic) 반응의 효과를 감소시킨다. 다른 형태의 이특이적 항체는 단일 쇄 "자누신(Janusin)"을 포함한다[참조: Traunecker et al., EMBO Journal 10:3655-3659 (1991)].
이특이적 전체 항체와는 달리, 이특이적 디아버디는 용이하게 작제되고 이. 콜라이에서 발현될 수 있기 때문에 특히 유용할 수 있다. 적합한 결합 특이성을 갖는 디아버디 (및 항체 단편과 같은 많은 다른 폴리펩타이드)는 라이브러리로부터 파아지 디스플레이(WO94/13804)를 사용하여 용이하게 선택될 수 있다. 디아버디의 하나의 암(arm)이 예를 들어 항원 X에 대해 지시된 특이성을 갖고 일정하게 유지되는 경우, 다른 암은 변화되고 적합한 특이성을 갖는 항체가 선택되는 라이브러리가 제조될 수 있다.
면역글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분은 적어도 3개의 CDR 영역 및 이들을 중재하는 골격 영역을 포함할 것이다. 바람직하게는, 상기 부분은 제1 및 제4 골격 영역중 하나 또는 모두의 약 50% 이상을 포함할 것이며, 50%는 제1 골격 영역의 C-말단 50%이고 제4 골격 영역의 N-말단 50%이다. 가변 도메인의 실질적인 부분의 N-말단 또는 C-말단에 있는 추가의 잔기는 천연적으로 발생하는 가변 도메인 영역과 통상적으로 관련되지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 본 발명의 항체의 작제물은, 면역글로불린 중쇄, 다른 가변 도메인(예를 들어 디아버디의 제조시) 또는 하기에서 보다 상세히 설명되는 단백질 표지물을 포함한 추가의 단백질 서열에 본 발명의 가변 도메인을 연결시키기 위한 링커의 도입을 포함하여, 클로닝 또는 다른 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입된 링커에 의해 암호화된 N- 또는 C-말단 잔기가 도입될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태로서, 실질적으로 도 2에 나타낸 바와 같은 VL 및 VH 영역에 대한 아미노산 서열에 기초한 한 쌍의 결합 도메인을 포함하는 항체가 바람직하지만, 이들 서열중 하나에 기초한 단일 결합 도메인이 본 발명의 추가의 양태를 형성한다. 실질적으로 도 2에 나타낸 VH 영역에 대한 아미노산 서열에 기초한 결합 도메인의 경우, 이러한 결합 도메인은 면역글로불린 VH 도메인이 특정한 방식으로 표적 항원에 결합할 수 있는 것으로 공지되어 있으므로 표적제로서 사용될 수 있다.
단일 쇄 특이적 결합 도메인중 하나의 경우, 이들 도메인은 본원에 기술된 항체와 같이 우수하거나 동일한 생체내 특성을 갖는 2-도메인 특이적 결합 부분을 형성할 수 있는 상보적 도메인을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이는, H쇄 또는 L쇄 클론을 포함하는 개개의 콜로니가 다른 쇄(L 또는 H)를 암호화하는 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키는데 사용되고 생성된 2-쇄 특이적 결합 부분이 WO92/01047에 기술된 것과 같이 파아지 디스플레이 기술에 따라 선택되는, WO92/01047에 기술된 바와 같은 소위 계층적 이중 결합 접근을 이용하는 파아지 디스플레이 스크리닝 방법으로 성취될 수 있다.
CDR, 과가변 및 가변 영역의 서열이 EGFR에 결합하는 능력을 상실하지 않으면서 변형될 수 있다는 것이 당 분야의 전문가들에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 CDR 영역은 도 1 및 2의 특정한 영역과 동일하거나 고도로 상동성일 것이다. "고도로 상동성"이란, 1 내지 5개, 바람직하게는 1 내지 4개, 예를 들어 1 내지 3개 또는 1 또는 2개의 치환이 CDR에서 이루어질 수 있다는 것을 의도한다. 또한, 과가변 및 가변 영역도 이들이 본원에 특이적으로 기술된 영역과 실질적인 상동성을 보이도록 변형될 수 있다. 바람직하게는, (각각의 CDR, 과가변 영역 또는 가변 영역 및 이들의 비-변형 상대물 사이의) 상동 정도는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 80%, 보다 더욱 바람직하게는 90%, 가장 바람직하게는 95%일 것이다. 이러한 변형된 서열은, 이들이 EGFR에 결합하고 항체 340 보다 높은 비율로 세포의 성장을 억제하는 능력을 갖는 한, 본 발명의 범위에 속한다. 용어 "항체"가 상응하게 추론될 수 있다.
2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 동일성(%)은 최적 비교를 위해 서열을 정렬하고(예를 들어 서열과의 최상의 정렬을 위해 제1 서열에 갭이 도입될 수 있다) 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교하여 결정된다. "최상의 정렬"이란, 최고의 동일성(%)이 나오는 2개 서열의 정렬이다. 동일성(%)은 비교되는 서열에서 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 수에 의해 결정된다(즉, 동일성(%)=동일한 위치의 수/위치의 총수 X 100).
2개 서열 사이의 동일성(%)의 결정은 당 분야의 전문가들에게 공지된 수학적 연산을 이용하여 성취될 수 있다. 2개 서열을 비교하기 위한 수학적 연산의 예는 문헌[참조: Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된 연산[참조: Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268]이다. 문헌[참조: Altschul, et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램은 그러한 연산을 포함하였다. BLAST 뉴클레오타이드 조사는 본 발명의 핵산 분자와 상동인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 스코어=100, 단어길이(wordlength)=12인 NBLAST 프로그램으로 수행될 수 있다. BLAST 단백질 조사는 본 발명의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 얻기 위해 스코어=50, 단어길이=3인 XBLAST 프로그램으로 수행될 수 있다. 비교용의 갭을 갖는(gapped) 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST가 문헌[참조: Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다, 달리는, PSI-Blast가 분자 사이의 거리 관계(Id.)를 알아내는 반복적 조사를 수행하는데 이용될 수 있다. BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램(예: XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트(default) 변수가 이용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov.를 참조한다.
서열 비교를 위해 이용되는 수학적 연산의 또다른 예는 문헌[참조: Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 연산이다. CGC 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)이 그러한 연산을 포함하였다. 당 분야에서 공지된 서열 분석을 위한 다른 연산은 문헌[참조: Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5]에 기술된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌[참조: Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-8]에 기술된 FASTA를 포함한다. FASTA에서, ktup는 조사의 감도와 속도를 정하는 조절 옵션이다.
본원에서 보여지는 바와 같이, SC100의 CDRH3은 성장 인자 EGF와 아미노산 상동성을 나타낸다. 후술되는 이러한 결과는, SC100 및 이의 단편 및 유도체가, 종양 세포주의 성장을 억제, 종양 세포주의 아폽토시스, 누드 마우스에서 종양 이종이식편의 생체내 억제에 의해 예시되는 바와 같이, 종양 세포의 성장을 억제하거나 종양 세포의 아폽토시스를 유도하기 위한 암 치료제로서 사용될 수 있다는 것을 제시한다. 따라서, 본 발명은 SC100 또는 EGF의 결합을 억제할 수 있는 "SC100" 부류의 다른 폴리펩타이드의 "단편" 또는 "유도체"의 사용을 추가로 포함한다. 단편의 바람직한 그룹은 모노클로날 항체 SC100의 CDR 영역 모두 또는 일부를 포함하는 것들이다. SC100 또는 SC100 부류의 폴리펩타이드의 단편은 적어도 5 내지 7개의 인접하는 아미노산의 아미노산 잔기의 스트레치를 의미한다. 종종 적어도 약 7 내지 9개의 인접한 아미노산, 통상적으로 적어도 약 9 내지 13개의 인접한 아미노산, 보다 바람직하게는 약 20 내지 30개 이상의 인접한 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 약 30 내지 40개 이상의 인접한 아미노산의 아미노산 잔기의 스트레치를 의미한다. SC100 또는 SC100 부류의 폴리펩타이드의 "유도체", 또는 SC100 부류 폴리펩타이드의 단편의 "유도체"는, 단백질의 아미노산 서열을 다양화시켜 변형된 폴리펩타이드, 예를 들어 단백질을 암호화하는 핵산의 조작 또는 단백질 자체의 변형에 의해 변형된 폴리펩타이드를 의미한다. 천연 아미노산 서열의 이러한 유도체는, 항-종양 T-세포 반응을 유도할 수 있는 펩타이드를 제공하는 한, 하나 이상의 아미노산의 삽입, 첨가, 결실 및/또는 치환을 수반할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 유도체는 25개 이하의 아미노산, 보다 바람직하게는 15개 이하, 보다 더 바람직하게는 10개 이하, 보다 더욱 더 바람직하게는 4개 이하, 가장 바람직하게는 1 또는 2개의 아미노산의 삽입, 첨가, 결실 및/또는 치환을 수반한다.
또한, 본 발명은 커플링 파트너, 예를 들어 작동자(effector) 분자, 표지물, 약물, 독소 및/또는 캐리어 또는 전달 분자에 연결된 상술한 항체를 제공한다. 본 발명의 항체를 펩타이드 및 비-펩타이드 커플링 파트너 모두에 커플링시키기 위한 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 하나의 양태에서, 캐리어 분자는, 말단 Cys 잔기를 통해 펩타이드에 커플링될 수 있는, 안테나페디아(Antennapedia)의 유사도메인(homeodomain)으로부터 유도되는 16개 아미노산 펩타이드(예를 들어 "Penetratin"으로 시판되는 것)이다. "Penetratin" 분자 및 이의 특성은 WO91/18981호에 기술되어 있다.
따라서, 본 발명의 항체는 항체 이미지화 분야에서 공지된 통상의 화학을 이용하여 부착될 수 있는 검출가능한 표지물, 예를 들어 131I 또는 99Tc와 같은 방사성표지물로 표지될 수 있다. 또한, 표지물은 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소 표지물을 포함한다. 또한, 표지물은 특정한 동류의(cognate) 검출가능한 잔기, 예를 들어 표지된 아비딘에 결합하는 것을 통해 검출될 수 있는 화학적 잔기, 예를 들어 바이오틴을 포함한다. 따라서, 본 발명의 항체는 작용성 표지물로 표지될 수 있다. 이러한 작용성 표지물은, 독소, 예를 들어 리신, 및 암 부위에서 프로약물을 활성 약물로 전환시킬 수 있는 효소, 예를 들어 세균성 카복시펩티다제 또는 니트로리덕타제를 포함한다.
본 발명의 항체는 전부 또는 부분적으로 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체는 완전히 확립된, 표준 액체 또는, 바람직하게는, 고체상 펩타이드 합성 방법(이의 일반적 기술은 광범위하게 이용가능하다)에 따라 용이하게 제조될 수 있거나[참조: J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984); M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984); and Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California], 액체상 방법 또는 고체상, 액체상 및 용액 화학의 조합에 의해, 예를 들어 먼저 각각의 펩타이드 부분을 완성한 후, 필요하고 적합한 경우, 존재하는 보호 그룹을 제거한 후, 각각의 카본산 또는 설폰산 또는 이의 반응성 유도체의 반응에 의해 잔기 X를 도입함으로써 용액중에서 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 항체(펩타이드 또는 폴리펩타이드)를 제조하는 또다른 편리한 방법은 발현 시스템에서 핵산을 사용하여 이를 암호화하는 핵산을 발현시키는 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산을 제공한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 핵산은 분리 및/또는 정제 형태, 또는 천연적으로 결합된 물질이 없거나 실질적으로 없는, 예를 들어, 발현을 위한 하나 이상의 조절 서열(들)은 제외하고는 사람 게놈 유전자를 플랭킹(flanking)하는 핵산이 없거나 실질적으로 없는, 분리물로서 제공된다. 핵산은 전부 또는 부분적으로 합성될 수 있으며, 게놈성 DNA, cDNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산이 RNA를 포함하는 경우, 나타낸 서열에 대한 언급은 T를 U로 치환하는 경우 RNA 등가물에 대한 언급으로 간주되어야 한다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은, 이용가능한 핵산 서열 및 클론이 주어지는 한, 본원에 기재된 정보 및 참조물 및 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 전문가에 의해 용이하게 제조될 수 있다[참조: Sambrook, Fritsch and Maniatis, "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992]. 이들 기술은 (i) 예를 들어 게놈 공급원으로부터 이러한 핵산의 샘플을 증폭시키기 위해 폴리머라제 쇄 반응(PCR)의 이용, (ii) 화학적 합성, 또는 (iii) cDNA 서열의 제조를 포함한다. SC100 단편을 암호화하는 DNA는, 암호화 DNA를 취하고 발현될 부분의 어느 한 측에 있는 적합한 제한 효소 인지 부위를 확인한 후 DNA로부터 상기 부분을 절단하는 것을 포함하여, 당 분야의 전문가들에게 공지된 적합한 방법으로 제조되고 이용될 수 있다. 이어서, 상기 부분은 표준 시판 발현 시스템의 적합한 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 또다른 재조합 접근은 적합한 PCR 프라이머를 사용하여 DNA의 관련 부분을 증폭시키는 것이다. 서열에 대한 변형물은, 변형된 펩타이드의 발현을 이끌거나 핵산을 발현시키는데 사용되는 숙주 세포에서의 코돈 선호도를 고려하기 위해, 예를 들어 특정 부위 돌연변이유발(site directed mutagenesis)을 이용하여 제조될 수 있다.
핵산 서열의 발현물을 얻기 위해서, 서열은 발현을 조절하기 위해 핵산에 작동적으로 연결된 하나 이상의 조절 서열을 갖는 벡터에 삽입될 수 있다. 이 벡터는 다른 서열, 예를 들어 삽입된 핵산의 발현을 이끄는 프로모터 또는 인핸서, 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 융합물로 생성되도록 하기 위한 핵산 서열 및/또는 숙주 세포에서 생성된 폴리펩타이드가 세포로부터 분비되도록 하기 위한 분비 시그날을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 이어서, 폴리펩타이드는, 벡터를 이것이 작용할 수 있는 숙주 세포로 형질전환시키고, 폴리펩타이드가 생성되도록 숙주 세포를 배양한 후, 숙주 세포 또는 주위 배지로부터 폴리펩타이드를 회수하여 수득될 수 있다. 이. 콜라이, 효모, 및 COS 또는 CHO 세포와 같은 진핵 세포를 포함하여, 원핵 세포 또는 진핵 세포가 당 분야에서 이러한 목적을 위해 사용된다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 항체를 암호화하는 핵산(일반적으로 본 발명에 따른 핵산)으로부터의 발현을 포함한 본 발명의 항체를 제조하는 방법을 포함한다. 이는 편리하게는 항체 발현을 일으키거나 가능하게 하는 적합한 조건하에서 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양물로 성장시킴으로써 성취될 수 있다.
폴리펩타이드 및 펩타이드는 시험관내 시스템, 예를 들어 망상적혈구 용해질에서 발현될 수 도 있다.
클로닝 및 많은 상이한 숙주 세포에서의 폴리펩타이드 발현을 위한 시스템은 충분히 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포는 세균, 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 및 효모, 및 배큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종 폴리펩타이드의 발현을 위한 당 분야에서 이용가능한 포유동물 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, COS 세포 등을 포함한다. 일반적인 바람직한 세균 숙주는 이. 콜라이이다.
프로모터 서열, 터미네이터 단편, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 적합한 기타 서열을 포함한 적합한 조절 서열을 포함하는, 적합한 벡터가 선택되거나 작제될 수 있다, 벡터는 플라스미드, 바이러스, 예를 들어 파지, 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 설명을 위해, 예를 들어 문헌[참조: Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 예를 들어 핵산 작제물의 제조, 돌연변이유발, 서열분석, DNA의 세포로의 도입 및 유전자 발현에서, 핵산의 조작을 위한 많은 기술 및 프로토콜, 및 단백질의 분석이 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, 1992]에 상세히 기술되어 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 양태는 본원에 기술된 바와 같은 이종 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예: 염색체)에 통합될 수 있다. 통합은 표준 기술에 따라 게놈과의 제조합을 개선시키는 서열을 포함함으로써 개선될 수 있다. 핵산은 세포내의 염색체외 벡터상에 존재하거나, 달리는 세포에 대해 이종이거나 외인성일 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 핵산을 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. (특히 시험관내 도입에 대해) 일반적으로 제한 없이 "형질전환"으로 언급될 수 있는 도입은 어떠한 이용가능한 기술도 이용할 수 있다. 진핵 세포에 대해 적합한 기술은 인산칼슘 형질감염(tansfection), DEAE-Dextran, 전기천공, 리포좀-매개된 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어 백시니아 또는 곤충 세포를 위한 배큘로바이러스를 이용한 형질도입(transduction)을 포함할 수 있다. 세균 세포에 대해 적합한 기술은 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함한다. 달리는, 핵산의 직접 주입이 이용될 수 있다.
마커 유전자, 예를 들어 항생제 내성 또는 민감 유전자가, 당 분야에서 충분히 공지된 바와 같이, 목적하는 핵산을 포함하는 클론을 확인하는데 이용될 수 있다.
도입 후에는, 예를 들어 유전자의 발현을 위한 조건하에서 숙주 세포(이 세포는 보다 가능하게는 형질전환된 세포의 자손이지만 실제로 형질전환된 세포를 포함할 수 있다)를 배양하여 암호화된 폴리펩타이드(또는 펩타이드)를 생성함으로써, 핵산으로부터 발현을 일으키거나 가능하게 할 수 있다. 적합한 시그날 리더 펩타이드에 커플링된 폴리펩타이드가 발현되는 경우, 폴리펩타이드는 세포로부터 배양 배지로 분비될 수 있다. 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 발현에 의해 생성된 후, 이들은 흔히 있는 바와 같이 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 분리되고/되거나 정제될 수 있으며, 이어서 예를 들어 하나 이상의 추가의 성분을 포함할 수 있는 조성물의 제형, 예를 들어 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 비히클 또는 담체(예: 이하 참조)를 포함하는 약제학적 조성물로 목적하는 바에 따라 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 폴리펩타이드는 또한 작동자 분자에 결합될 수 있다. 작동자 분자는 다양한 기능, 예를 들어 종양 성장을 억제하고, 폴리펩타이드가 종양 세포와 같은 세포에 들어가게 하고, 폴리펩타이드를 세포내의 적합한 부위로 가게하는 다양한 유용한 기능을 수행한다.
작동자 분자는 예를 들어 세포독성 분자일 수 있다. 세포 독성 분자는 단백질, 비-단백질성 유기 화학요법제일 수 있다. 적합한 화학요법제의 예는 예를들어 독소루비신, 탁솔 및 시스플라틴을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드에 결합하기에 적합한 작동자 분자의 일부 추가의 예는 시그날 형질도입 억제제, ras 억제제 및 세포 사이클 억제제를 포함한다. 시그날 형질도입 억제제의 일부 예는 단백질 타이로신 키나제 억제제, 예를 들어 케르세틴[참조: Grazieri et al., Biochim. Biophs. Acta 714, 415 (1981)]; 라벤더스틴 A[참조: Onoda et al., J. Nat. Produc. 52, 1251 (1989)]; 및 허비마이신 A[참조: Ushara et al., Biochem. Int., 41: 831 (1988)]를 포함한다.
단백질 및 비-단백질 화학요법제는 당 분야의 공지된 방법에 의해 본 발명의 항체에 결합될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 독소루비신 결합에 대해 문헌[참조: Greenfield et al., Cancer Research 50, 6600-6607 (1990)]에 기술된 것 및 백금 화합물의 결합에 대해 문헌[참조: Kiseleva et al., Mol. Biol (USSR) 25, 508-514 (1991)]에 기술된 것을 포함한다. 독소루비신, 탁솔 및 시스플라틴이 바람직하다.
본 발명의 항체는 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하여 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 이들 조성물은, 상기 물질중 하나 이외에, 약제학적으로 허용되는 부형제, 완충제, 안정화제 또는 당 분야의 전문가들에게 충분히 공지된 기타 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 무독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 방해하지 말아야 한다. 담체 또는 기타 물질의 정확한 특성은 투여 방식, 예를 들어 경구, 정맥내, 경피 또는 피하, 비강, 근육내, 복강내 경로에 의존할 수 있다. 제형물은 바람직하게는 액체이며, 통상적으로 pH 6.8 내지 7.6의 비-인산염 완충액을 포함하는 생리적 염 용액이거나 동결건조된 분말일 수 있다.
본 발명의 항체를 포함하거나 수송을 위한 조성물은 바람직하게는 개개인에게 이로움을 주기에 충분한 "치료학적으로 효과적인 양"으로 개개인에게 투여된다. 투여되는 실제양, 및 투여 속도 및 시간-경로는 치료되는 질병의 특성 및 중증도에 따를 것이다. 치료 처방, 예를 들어 용량에 대한 결정 등은 일반 개업 의사 및 다른 의사들의 책임 범위에 속하며, 통상적으로 치료되는 장애, 개개 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사들에게 공지된 기타 요인을 고려한다.
본 발명의 항체는 특히 기존 암의 치료 및 초기 치료 또는 수술 후의 암 재발 예방에 적절하다. 상술된 기술 및 프로토콜의 예시를 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Science, 16th edition, Oslo, A. (ed), 1980]에서 찾을 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 (a) 암의 치료 또는 예방용 약제를 제조하는데 있어 본 발명의 항체 또는 핵산의 용도, 및 (b) 대상에게 본 발명의 항체 또는 핵산의 치료학적 유효량을 투여하여 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항체는 유효량으로 사람에게 투여되는 경우 종양 세포의 성장을 상당히 억제할 수 있다. 최적 용량은 예를 들어 연령, 성별, 체중, 치료되는 상태의 중증도, 투여되는 활성 성분 및 투여 경로를 포함한 다수의 변수에 기초하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, EGF 수용체의 포화를 가능하게 하는 폴리펩타이드 및 항체의 혈청 농도가 바람직할 수 있다. 약 0.1nM 초과의 농도가 통상적으로 충분하다. 예를 들어, 100mg/m2 용량의 항체는 약 8일 동안 약 20nM의 혈청 농도를 제공한다.
대략적 지침으로서, 항체의 용량은 10 내지 300mg/m2의 양으로 주 단위로 투여될 수 있다. 항체 단편의 상당 용량은, 혈청 수준을 EGF 수용체의 포화를 가능하게 하는 농도를 초과하게 유지시키기 위해 보다 빈번한 간격으로 사용되어야 한다.
투여를 위한 일부 적합한 경로는 정맥내, 피하 및 근육내 투여를 포함한다. 정맥내 투여가 바람직하다.
본 발명의 항체는 추가의 약제학적으로 허용되는 성분과 함께 투여될 수 있다. 이러한 성분은, 예를 들어 면역 시스템 자극제 및 화학요법제, 예를 들어 상술한 것들을 포함한다.
조성물은, 치료되는 상태에 따라, 단독으로 투여되거나, 다른 처리와 병행하여 별개로 투여되거나 동시에 투여되거나 연속해서 투여될 수 있다. 다른 암 치료는 다른 모노클로날 항체, 다른 화학요법제, 다른 방사성치료 기술 또는 당 분야에 공지된 다른 면역 치료를 포함한다. 본 발명의 조성물의 하나의 특정 적용은 수술에 대한 보조제로서, 즉 암을 제거한 후 암 재발의 위험을 감소시키는 것을 돕기 위한 것이다.
주사(iv)가 본 발명의 항체의 치료학적 투여를 위한 주요 경로일 것으로 고찰되며, 정맥내 수송, 또는 카테터 또는 다른 수술적 튜빙을 통한 수송도 이용된다. 액체 제형은 분말 제형으로부터 재구성한 후 사용될 수 있다.
또한, 항체는 미소구, 리포좀, 다른 미립자 수송 시스템 또는 혈액을 포함한 특정 조직에 놓이는 서방출 제형을 통해 투여될 수 있다. 서방출 담체의 적합한 예는 분할 물품, 예를 들어 좌제 또는 미소캡슐 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 이식가능 또는 미소캡슐 서방출 매트릭스는 폴리악티드[참조: US Patent No. 3,773,919, EP-A-0058481], L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체[참조: Sidman et al., Biopolymers 22(1):547-556, 1985], 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 에틸렌 비닐 아세테이트[참조: Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, 1981, and Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982]를 포함한다. 폴리펩타이드를 포함한 리포좀은 충분히 공지된 방법[참조: DE 3,218,121A,; Epstein et al., PNAS USA, 82:3688-3692, 1985; Hwang et al., PNAS USA, 77:4030-4034, 1980; EP-A-0052522; E-A-0036676; EP-A-0088046; EP-A-0143949; EP-A-0142541; JP-A-83-11808; US Patent Nos. 4,485,045 and 4,544,545]에 의해 제조된다. 통상적으로, 리포좀은 지질 함량이 약 30몰% 초과의 콜레스테롤(선택 비율은 폴리펩타이드 누출의 최적 속도에 의해 조절된다)인 작은(약 200 내지 800Å) 단일박막 타입이다.
본 발명의 항체는 종양 부위 또는 다른 목적하는 부위에 국소적 방법으로 투여되거나 종양 또는 다른 세포를 표적하는 방식으로 수송될 수 있다.
항체의 복용량은 사용되는 제제의 특성, 예를 들어 이의 결합 활성 및 생체내 혈장 반감기, 제형중 폴리펩타이드의 농도, 투여 경로, 투여 부위 및 속도, 수반되는 환자의 임상적 허용성, 환자를 괴롭히는 병리학적 상태 등에 따를 것이며, 의사의 기술 범위내에 속한다. 예를 들어, 복용량은 약 10μg 내지 1mg/용량의 범위일 수 있으나, 300μg의 폴리펩타이드/환자/투여의 용량이 바람직하다. 일련의 연속적 접종 동안 상이한 용량이 사용된다; 의사는 초기 접종물을 투여한 후 상대적으로 보다 소용량의 항체로 부스팅할 수 있다.
본 발명의 항체는 다양한 방법으로 상이한 부류의 수령자에게 투여될 수 있다. 항체로 처리될 수 있는 암 유형의 예는 결장암, 폐암, 유방암, 위암 및 난소암을 포함한다.
본 발명은 또한 암에 대해 예방적 면역 반응을 증강시키기 위한 최적 면역화 스케쥴에 관한 것이다.
본 발명의 각각의 양태에 대한 바람직한 특징은 필요한 변경을 가하여 각각의 다른 양태에 대한 것과 같다. 본원에 언급된 선행 기술 문헌이 법에 의해 허용되는 완전한 범위내에서 참조로 삽입된다.
본 발명은 하기의 비-제한적 실시예를 참조로 하여 더욱 기술될 것이다. 첨부된 도면이 참조된다;
실시예 1- α340으로부터 유도된 키메릭 항체의 작제
Qiagen RNeasy 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라 5 X 106 하이브리도마 α340 세포[참조: Durrant et al., Prenatal Diagnostics, 14, 131, 1994]로부터 총 RNA를 분리시켰다. RNA를 Promega(Southampton, UK) 역전사효소, 완충액 및 dNTP를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 가변 영역 중쇄(VH) 및 경쇄(VL) cDNA를 문헌[참조: Jones and Bendig, Bio/Technology, 9, 188, 1991]의 방법의 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 겔-정제하고 벡터 pGem??T Easy(Promega)로 클로닝하였다. 이들 PCT 생성물을 Applied Biosystems 자동 서열분석기 모델 373A(Applied Biosystems, Warrington, UK)를 사용하여 양 방향으로 서열분석하였다. 생성된 VH 및 VL DNA 서열이 도 1에 나타나 있으며, 단백질 서열은 도 2에 나타나 있다(VL은 VK와 같다).
보체 결정 영역(CDR)의 위치는 다른 항체 서열을 참조하여 결정되었다[참조: Kabat EA et al., US Deparment of Health and Human Services, 1991]. α340 VH은 마우스 중쇄 서브그룹 III(B)로 정하고[참조: Kabat et al., 1991], α340 VK는 마우스 카파 쇄 서브그룹 II로 정할 수 있다[참조: Kabat et al., 1991].
키메릭 항체는 사람 불변 영역에 연결된 뮤린 가변 영역으로 이루어진다. 키메릭 항체는 또한 탈면역화된 항체를 시험하는 경우 동일한 사람 불변 영역을 갖는 유용한 대조물을 제공한다(하기 참조). 벡터 VH-PCR1 및 VK-PCR1[참조: Riechmann et al., Nature, 332, 323, 1988]이, 뮤린 VH 및 VK 유전자 주위에, 리더 시그날 펩타이드, 리더 인트론 및 뮤린 면역글로불린 프로모터를 포함한 5' 플랭킹 서열, 및 스플라이스 부위 및 인트론 서열을 포함한 3' 플랭킹 서열을 도입하기 위한 주형으로 사용되었다. 뮤린 VH 및 VK 서열을 pfu 보정-능력(proof-reading) 폴리머라제(pfu turbo, Stratagene, La Jolla, California)를 사용하여 VH/VK-PCR1 벡터 서열(도 3)과 오버랩핑하는 프라이머로 증폭시켰다. 이는 전체 길이의 키메릭 중쇄 및 경쇄의 작제를 가능하게 하였다. 이들 PCT 프라이머는 VH/VK 영역 및 VH/VKPCR-1 벡터로부터의 5' 및 3' 사람 영역을 증폭시키는데 사용되었다.
5' HuH/K, VH/K 및 3' HuH/K 영역을 연결시키고 VH/K1 및 VH/K12 PCR 프라이머의 말단을 인지하는 플랭킹 프라이머(VH/K13, VH/K14)를 사용하여 증폭시켜 완전한 키메릭 항체 발현 카세트를 얻었다. 이 생성물을 BamHI 및 HindIII 제한 효소로 절단시키고 BamHI/HindIII 절단 pUC19에 연결시켰다(효소는 Promega, pUC19는 Amersham Pharmacia). 이어서, 발현 카세트의 서열을 전술한 바와 같이 서열분석하여 확인하였다.
뮤린 VH 및 VK 발현 카세트를 pUC19로부터 뮤린 중쇄 면역글로불린 프로모터, 리더 시그날 펩타이드, 리더 인트론, VH 또는 VL 서열 및 스플라이스 부위를 포함하는 HindIII 내지 BamHI 단편으로서 절단하였다. 이들을 각각 사람 IgG1 또는 κ 불변 영역 및 포유동물 세포에서 선별하기 위한 마커를 포함하는 발현 벡터 pSVgpt 및 pSVhyg(도 4 및 5)로 전이시켰다. DNA 서열은 발현 벡터에서 VH 및 VK에 대해 적합한 것으로 확인되었다.
실시예 2- α340 탈면역화된 서열의 디자인
하기 실시예는 기존의 치료 항체에 의해 유도된 사람 면역 반응이 감소되는 방법을 기술한다. 이것이 성취되는 2개의 단계가 있으며, 먼저 뮤린 중쇄 및 경쇄 서열이 사람 배아-주(germ-line) 서열의 데이터베이스와 비교되었다. 가장 유사한 배아-주 서열이 탈면역화된 서열을 위한 사람 주형으로서 선택되었으며 뮤린을 사람 배아-주 서열로 전환시키는데 필요한 변화가 도입되었다. 항체 구조 및 결합에 중요한 것으로 간주되었던 잔기는 이러한 공정에서 제외되었으며 변화시키지 않았다. 이 단계에서 보유되었던 뮤린 잔기는, 최종 항체에서 CDR에 인접한, 예를 들어 N-말단에 있는 잔기를 제외한, 주로 비-표면의 묻힌 잔기였다. 이 공정은, 표면 잔기가 주로 사람의 것이고 묻힌 잔기가 본래의 뮤린 서열에서와 같기 때문에, 넓게는 "베니어드(veneered)" 항체와 유사하다.
본 실시예에서, α340 항체에 대한 가변 영역 단백질 서열은 개별적으로 사람 배아-주 VH/K 서열과 비교되었다. α340의 경우에, α340VH 쇄는 배아-주 서열 VHDP42 및 JH6과 가장 유사한 것으로 나타났다. α340VK 쇄는 VK DP15 및 JK2와 가장 유사성을 나타내었다.
제2 단계는 면역 반응의 원인이 되는 항체 VH/K 에피토프의 확인, 및 이러한 서열을 제거하기 위한 항체 서열의 변형을 수반한다. α340은 펩타이드 드레딩(threading)의 새로운 공정에 의해 분석되었다. 분석은 MPT ver1.0 소프트웨어(Biovation, Aberdeen, UK)를 사용하여 컴퓨터를 사용하여 수행되었다. 소프트웨어 패키지는 WO98/52976호 기술된 방법에 따라 펩타이드 드레딩을 수행한다. 소프트웨어는 사람군에 남아있는 HLA DR 이인자형을 96% 보다 더 많이 포함하는 18개의 상이한 MHC 부류 II DR 대립유전자에 결합하는 잠정적인 펩타이드의 인덱스(index)를 제공할 수 있다.
전술된 사람 배아-주 서열을 모방하도록 고안된 α340 항체 쇄가 이 방법으로 드레딩되었으며 잠정적인 MHC 부류 II 에피토프가 확인되었다. 이러한 에피토프는 MHC 부류 II 결합의 원인이 되는 아미노산을 유사한 잔기로 치환시켜 돌연변이되었다. 이러한 치환은 일반적인 항체 구조 및 항원 결합능은 보유하나 MHC 에피토프는 제거되도록 고안된다.
각각의 쇄의 수개의 변형물이 본래의 뮤린 α340으로부터 상이한 수준의 MHC 결합 쇄 및 돌연변이를 갖는 일정 범위의 항체를 제공하도록 고안되었다. 3개의 DIVK 및 4개의 DIVH 변형물이 고안되었으며(VKb, VKc, VK d, VHb, VHc, VHd 및 VHe), 이들을 제거하기 위해 도입된 MHC 에피토프 및 돌연변이를 나타내기 위한 각각의 정렬에서 보여질 수 있다(도 6 및 도7 참조).
α340 항체의 CDR에 도입된 돌연변이는 2개의 돌연변이를 포함한다. VKb의 I-L 돌연변이는 VK 영역의 CDR3에 포함된다. 유사하게 VHe의 V-A 돌연변이는 VH 영역의 CDR3에 포함된다. 이러한 치환은 α340 항체의 항원 결합능에 대해 상당한 효과를 가질 수 있었으며, 상이한 돌연변이를 갖는 다른 변형물을 생성하는 것에 대한 가치를 설명한다.
실시예 3- 탈면역화된 항체 서열의 작제
탈면역화된 가변 영역을 오버랩핑 PCR 재조합 방법으로 작제하였다. 클로닝된 뮤린 VH 및 VK 유전자가 요구되는 탈면역화된 서열에 대한 골격 영역의 돌연변이유발을 위한 주형으로 사용되었다. 변형될 영역을 포함하는 수 세트의 돌연변이유발 프라이머 쌍이 합성되었다.
돌연변이유발 프라이머 쌍의 사용은 48 내지 50℃의 어닐링 온도의 이용을 필요로 하였다. pfu turbo 보정-능력 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, California)를 모든 증폭에 사용하였다. α340 키메릭 VH 및 VK 작제물은 변형될 가변 영역뿐만 아니라, 리더 시그날 펩타이드, 리더 인트론 및 뮤린 면역글로불린 프로모터를 포함하는 5' 플랭킹 서열, 및 스플라이스 부위 및 인트론 서열을 포함하는 3' 플랭킹 서열을 도입하기 위한 주형으로 사용되었다. 오버랩핑 PCR은 키메릭 발현 카세트를 만들기 위해 동일한 플랭킹 프라이머(VH/K13, VH/K14)를 사용하여 수행되었다. 제조된 탈면역화된 V 영역은 pUC19로 클로닝되었으며, 전체 DNA 서열이 각각의 탈면역화된 VH 및 VL에 적합한 것으로 확인되었다.
탈면역화된 중쇄 및 경쇄 V-영역 유전자를 pUC19로부터 뮤린 중쇄 면역글로불린 프로모터, 리더 시그날 펩타이드, 리더 인트론, VH 또는 VL 서열 및 스플라이스 부위를 포함하는 HindIII 내지 BamHI 단편으로서 절단하였다. 이를 각각 사람 IgG1 또는 κ 불변 영역 및 포유동물 세포에서의 선별을 위한 마커를 포함하는 발현 벡터 pSVgpt 및 pSVhyg에 전이시켰다. DNA 서열은 발현 벡터에서 탈면역화된 VH 및 VL에 적합한 것으로 확인되었다. 형질전환을 위한 작제물을 제조하기 위해, (형질전환당) 약 50μg의 VK 및 25μg의 VH 플라스미드를 pvuI(Promega, Southampton, UK)로 완전하게 분해시켰다. 이어서, 이 DNA를 에탄올 침전시켰고, DNA 펠렛을 건조시켰다. 형질전환하기 전에, 펠렛을 (형질전환당) 10μl의 분자 생물학 등급 수에 재현탁시켰다.
실시예 4- α340 탈면역화된 항체의 발현
항체 발현을 위한 숙주 세포주는, ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures, Porton, UK)(ECACC No. 85110505)로부터 입수된, 비-면역글로불린 생성 마우스 골수종인 NS0였다. 중쇄 및 경쇄 발현 벡터를 전기천공에 의해 NS0 세포에 다양한 조합으로 공동-형질감염시켰다. 각각의 DIVH 쇄를 각각의 DIVK 쇄와 함께 형질감염시켜 12개의 탈면역화된 변형 항체를 수득하였다. 또한, 키메릭 VH 및 VK 영역을 형질감염시켜 키메릭 α340 항체(α340Ch)를 발현하는 세포주를 생성하였다. α340Ch 항체는 탈면역화 이전의 항체의 결합을 나타내기 위해 대조물로서 사용되었다.
NS0 세포는, 75cm3 플라스크(NalgeNunc Int., Rochester, NY, USA)에서, 10% 태아 소 혈청(FBS), 5ml 항생제/항진균제 용액(Gibco BRL, Paisley, UK. Cat no. 15240-062), 2,5ml 겐타마이신(Gibco BRL, Paisley, UK. Cat no. 15710-049) 및 5ml 나트륨 피루베이트(Gibco BRL, Paisley, UK. Cat no. 11360-039)/배지 500ml로 보충된 듈베코 변형 이글 배지(DMEM) 20ml중에서 성장시켰다. 일단 융합(confluent)하게 되면, 이들 세포를 펠렛이 되게 원심분리시키고, 동일한 배지 0.5ml(형질전환당)에 재현탁시켰다. 이어서, 이러한 0.5ml의 세포를 미리 분해시킨 DNA에 가하고, 침전시킨 후, 재현탁시키고, 5분 동안 얼음상에서 항온처리하였다. 이어서, 세포를 2mm 큐벳(Biorad, Hercules, CA, USA)으로 분배하고, Biorad Genepulser II에서 170 volt 및 975μF로 펄스를 가한 후, 20분 동안 얼음에 놓고 회수하였다. 이어서, 세포를 상술한 바와 같은 DMEM/10%FBS 20ml로 분배한 후, 37℃, 5% CO2에서 밤새 성장시켰다.
24시간 후, 세포를 원심분리시키고, 85ml의 선별적 DMEM/10%FBS(상술한 바와 같음) (+5ml의 25mg/ml 크산틴 및 160μl의 2.5mg/ml 미코페놀산/배지 500ml: 이들은 psv 중쇄 벡터의 gpt 유전자에 대한 선별제이다)에 재현탁시켰다. 이어서, 웰당 200μl 분취량으로 4 x 96 웰 평판에 분배하였다. 이들 평판을 내성 콜로니가 전개될 때까지 10일 동안 성장시켰다.
형질감염된 세포 클론에 의한 사람 항체의 생성은 사람 IgG에 대해 ELISA로 측정하였다. 항체를 분비하는 세포주를 선별하고, 초기에는 24 웰 평판에 증대시켰다. 이어서, 이들을 25cm3 및 75cm3 플라스크로 증대시켰다. 항체 생성을 사람 대조 항체의 공지된 농도와 비교하여 ELISA로 분석하였다. 이어서, 각각의 형질감염으로부터 최적의 항체 생성 클론을 175cm3 플라스크로 증대시키고, 다른 클론은 액체 질소로 동결시켰다.
VH 버전 C로 형질감염된 세포로부터는 어떠한 항체도 생성되지 않았다. 상당수의 형질감염체 콜로니가 3가지 각각의 경우에 생성되었으나 어떠한 항체 생성 콜로니도 발견되지 않은 이유는 불명하다. VHh, VHd 및 VHe를 수반하는 변형물의 생성은 기술된 바와 같이 계속되었으나, VHc는 계속되지 않았다.
실시예 5- 탈면역화된 α340 항체의 생성 및 시험
항체를 0.5ml ProSepA(Bioprocessing Ltd)와 함께 밤새 교반시킴으로써 500ml 내지 1 l의 정지 배양물로부터 정제하였다. 이어서, Prosep A를 친화성 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 항체를 0.1M 글리신 pH3.0으로 용출시키고, 중화시킨 후, PBS에 대해 밤새 투석시켰다. 정제된 항체 제제를 여과에 의해 필터 멸균시키고, 4℃에서 저장하였다. 정제된 항체의 농도는 Human IgG에 대해 ELISA로 측정되었다.
α340 DI 항체 변형물을 A431 세포(ECCAC No. 85090402)에 대한 결합에 대해 ELISA로 시험하였다. 이들 상피 단층 세포는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 과발현하므로 EGFR 항원에 대한 α340의 결합을 검정하는데 적합하다. A431 세포를 DMEM/10% FBS 배지 및 1% 비-필수 아미노산(NEAA, Gibco BRL, Cat no, 11140-035)를 사용하여 96 웰 평판에서 융합되게 성장시켰다. 이어서, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 이들을 실온에서 1시간 동안 Immunoassay Stabiliser(Quadratech)에서 항온처리하였다. 이어서, 용액을 버리고, 평판을 실온에서 건조시켰다. 이어서, 평판을 -4℃에서 저장하였다.
α340Ch 항체와 본래의 뮤린 α340 항체를 비교하는 검정에 의해, 키메릭 형태가 동등한 결합을 하는 것으로 나타났다(도 9). 세척은 0.05% Tween(Sigma)를 갖는 PBS로 수행하였다. 검출은, 각각 키메릭 및 마우스 항체에 대해 양고추냉이 퍼옥시다제 결합된 염소 항-사람 IgG(The Binding Site, Cambridge, UK) 및 양 항-마우스(The Binding Site, Cambridge, UK)로 수행하였다. 색상은 o-페닐렌 디아민 물질(Sigma, Poole, Dorset, UK)를 사용하여 전개시켰다.
그 결과는 잠정적으로 상이한 결합능을 갖는 상이한 2차 항체의 사용으로 인해 직접적으로 비교될 수 없다. 그러나, 이는 α340Ch가 A431 세포의 EGFR에 결합하며 DI α340 변형물의 결합 친화성을 비교하기 위해 양성 대조물로서 사용될 수 있다는 것을 분명히 나타내었다.
DI α340 변형물을 검정하기 위해, 양성 대조물로서 DI 변형물의 이중 희석물(웰당 100ng부터) 및 α340 키메릭 항체(웰당 100mg부터)을 면역검정판에 가로질러 적용시켰다. ELISA는 α340Ch 항체와 비교되는 능력의 결합을 나타내는 변형물을 검색하기 위해 수행하였다.
3개의 탈면역화된 α340 경쇄와 조합된 3개의 탈면역화된 α340 중쇄에 대한 결합 검정 결과가 도 10 내지 12에 나타나 있다. 탈면역화된 경쇄 버전 b, c 및 d와 조합된 탈면역화된 중쇄 버전 b 및 d로 구성된 항체는 키메릭 항체와 비교하여 A431에 대해 동등한 결합을 나타내었으며, 이는 VK 영역으로 도입된 돌연변이가 α340의 EGFR 결합을 손상시키지 않는다는 것을 나타낸다. 그러나, VHe에 특정한 돌연변이의 도입(VH의 CDR3에서 V-A)으로 EGFR에 대한 결합 활성이 약 3 내지 4배 상실되었다.
탈면역화된 버전 VHd. VKb는 단지 하나의 잠정적인 MHC 에피토프를 포함하기 때문에 리드(lead) 탈면역화된 α340 항체로서 선택되었다. 이러한 마지막 에피토프의 제거로 항체에 의한 EGFR 결합이 상당히 상실되었다.
실시예 6- SC100 모노클로날 항체와 EGF 사이의 아미노산 상동성
Biosoft에 의한 Macintosh용 Gene Jockey II 소프트웨어 패키지를 유사/상동 부분을 확인하기 위해 단백질 서열의 쌍을 이룬 서열 비교에 사용하였다. SC100의 CDRH3 영역이 EGF의 단백질 서열과 비교되는 경우, 아미노산 상동성이 EGF의 2개의 상이한 영역에서 관측되었다. 그러나, 이들 영역이 EGF의 NMR 분석된 구조에서 강조되는 경우, 이들은 2차 구조에 의해 함께 하게 되고 SC100 CDRH3을 닮은 것으로 밝혀졌다.
실시예 7- 시험관내 종양 성장의 억제 입증
A431 세포를 37Å의 10% 태아 송아지 혈청 및 5% 이산화탄소가 보충된 RPMI 1640중에 유지시켰다. 생존 세포의 융합 배양물을 트립신/EDTA로 수거하고, 세척한 후, 5 x 104 세포/ml로 재현탁시켰다.
이어서, 100μl 분취량의 세포 현탁액을 증가량의 340 마우스 항체, 탈면역화된 SC100(VHd VKd 또는 VHd VKb) 항체와 함께 평저 96 웰 평판에 분배하였다. 이들 배양물을 5일 동안 방치시키고, 나머지 생존 세포의 수를 크리스탈 바이올렛 염색으로 측정하였다. 그 결과는 4중 웰에 대한 평균 + SE이다. 에러 바(error bar)가 나타나지 않는 경우, 이는 이들이 너무 작아 자료 점에 의해 포함되기 때문이다.
VHdVKb 및 VHdVKd SC100 클론 모두는 마우스 모노클로날 항체 340보다 효과적으로 A431의 성장을 억제할 수 있었다. 실제로, VHdVKb 클론은 세포 성장을 70% 억제하였다.

Claims (19)

  1. 도 6에 나타난 VHd 및 도 7에 나타난 VKd의 가변 영역의 아미노산 서열 또는 도 6에 나타난 VHd 및 도 7에 나타난 VKb의 가변 영역의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 사람화된 단클론 항체.
  2. 제1항에 있어서, 사람 항체 골격에 (i) VHd 및 VKd 또는 (ii) VHd 및 VKb가 제공된 항체.
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  9. 제2항에 있어서, 사람 항체 골격이 사람 항체의 불변 영역인 항체.
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  11. 제1항, 제2항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 핵산.
  12. 발현을 조절하기 위해 제11항의 핵산에 작동적으로 연결된 하나 이상의 조절 서열을 갖는 벡터.
  13. 제11항의 핵산 또는 제12항의 벡터를 포함하는 세포.
  14. 제11항의 핵산으로부터의 발현을 포함하는, 항체의 제조 방법.
  15. 제14항에 있어서, 항체의 발현을 일으키거나 가능하게 하는 적합한 조건하에서 제13항의 숙주 세포를 배양물로 성장시키는 방법.
  16. 제1항, 제2항 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항종양 조성물.
  17. 제11항의 핵산 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항종양 조성물.
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  19. 삭제
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