JPH08191692A - ヒトガンに有効な新規なｂｒ９６抗体異性体 - Google Patents
ヒトガンに有効な新規なｂｒ９６抗体異性体Info
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- JPH08191692A JPH08191692A JP7230629A JP23062995A JPH08191692A JP H08191692 A JPH08191692 A JP H08191692A JP 7230629 A JP7230629 A JP 7230629A JP 23062995 A JP23062995 A JP 23062995A JP H08191692 A JPH08191692 A JP H08191692A
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- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
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- A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
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- A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ガン細胞への改良された特異性、より強い結
合親和性、血清中での長い半減期、及びより効果的なガ
ン細胞殺傷性などの改良された特徴を示すＢＲ９６の変
異体を得ること。 【解決手段】 ＢＲ９６の可変領域と実質的に相同なア
ミノ酸配列を有する可変領域を有する変異体ＢＲ９６ポ
リペプチドを遺伝子工学的に得る。
合親和性、血清中での長い半減期、及びより効果的なガ
ン細胞殺傷性などの改良された特徴を示すＢＲ９６の変
異体を得ること。 【解決手段】 ＢＲ９６の可変領域と実質的に相同なア
ミノ酸配列を有する可変領域を有する変異体ＢＲ９６ポ
リペプチドを遺伝子工学的に得る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＢＲ９６抗原のよ
うなターゲットに対してＢＲ９６より高く改良された親
和性を示す変異体ＢＲ９６抗体及びその機能的等価物に
関する。変異体ＢＲ９６とＢＲ９６はそのヌクレオチド
配列及び／又はアミノ酸配列が、分子の相補性決定領域
（ＣＤＲｓ）の一箇所以上の位置において異なる。モノ
クローナル抗体及びその誘導体は、免疫学に革命を引き
起こした。従来からの、抗原を使用して抗体形成動物を
免疫することにより得られる抗体は、それぞれ少しづつ
異なる性質を有する異なる抗体の混合物である。しか
し、モノクローナル抗体は、それ自身だけの単一物であ
り、結合特異性も含めてそれぞれ同じ性質を有する。
うなターゲットに対してＢＲ９６より高く改良された親
和性を示す変異体ＢＲ９６抗体及びその機能的等価物に
関する。変異体ＢＲ９６とＢＲ９６はそのヌクレオチド
配列及び／又はアミノ酸配列が、分子の相補性決定領域
（ＣＤＲｓ）の一箇所以上の位置において異なる。モノ
クローナル抗体及びその誘導体は、免疫学に革命を引き
起こした。従来からの、抗原を使用して抗体形成動物を
免疫することにより得られる抗体は、それぞれ少しづつ
異なる性質を有する異なる抗体の混合物である。しか
し、モノクローナル抗体は、それ自身だけの単一物であ
り、結合特異性も含めてそれぞれ同じ性質を有する。
【従来の技術】ガン又は他の病気のスクリーニング、或
いはその治療において有用である、ガンや他の病変細胞
に対して増加した親和性又は特異性を有するような望ま
しい性質を有する分子を生産するようにコードされた抗
体タンパクや、遺伝子を扱う試み及び達成が多くの科学
者達によってなされてきた。多くの進歩が成されてきた
が、ゴールに達成するためには、モノクローナル抗体及
びその誘導体の研究がまださらに成されることが必要で
ある。ＢＲ９６抗体は、抗原としてヒト胸部悪性腫瘍細
胞を使用して得られたモノクローナル抗体である（Hell
strom et al., "Highly Tumor-Reactive Internalizing
Mouse Monoclonal Antibodies to LeY -related Cell
Surface Antigen" Cancer Res. 50:2183-2190(1990) 参
照) 。ＢＲ９６は高いガン選択性を示す。
いはその治療において有用である、ガンや他の病変細胞
に対して増加した親和性又は特異性を有するような望ま
しい性質を有する分子を生産するようにコードされた抗
体タンパクや、遺伝子を扱う試み及び達成が多くの科学
者達によってなされてきた。多くの進歩が成されてきた
が、ゴールに達成するためには、モノクローナル抗体及
びその誘導体の研究がまださらに成されることが必要で
ある。ＢＲ９６抗体は、抗原としてヒト胸部悪性腫瘍細
胞を使用して得られたモノクローナル抗体である（Hell
strom et al., "Highly Tumor-Reactive Internalizing
Mouse Monoclonal Antibodies to LeY -related Cell
Surface Antigen" Cancer Res. 50:2183-2190(1990) 参
照) 。ＢＲ９６は高いガン選択性を示す。
【０００２】ネズミのＢＲ９６抗体を生産するハイリド
ーマは、１９８９年２月２２日に、American Type Cult
ure Collection (ATCC)(12301 Parklawn Drive, Rockvi
lle,MD 20852)に寄託され、ＢＲ９６ハイブリドーマと
同定された(ATCC AccessionNo.:HB 10036) 。ＢＲ９６
からのヒトガンマ１カッパキメラフォーム、すなわちＣ
ｈｉＢＲ９６を生産するＢＲ９６ハイブリドーマは、１
９９０年５月２３日に、ATCC(12301 Parklawn Drive, R
ockville, MD 20852) に寄託され、ＣｈｉＢＲ９６ハイ
ブリドーマと同定された(ATCC Accession No.:HB 1046
0) 。ＢＲ９６は、結腸ガン、乳ガン、卵巣ガン、肺ガ
ン及び膵臓ガン並びに他のガンにおいて豊富に発現さ
れ、或いは、より少ないが、幾つかの分化した上皮細胞
において発現されるルイスＹ（ＬｅY ) 抗原に関連した
炭化水素抗原を認識する。ヒトのガンの広い認識と、
２、３の正常組織（例えばｇｕｔ上皮組織や膵臓組織）
に対するよりもガン細胞への結合率が高いため、ＢＲ９
６はガンの治療用抗体として研究されてきた。ＢＲ９６
はインビトロにおけるガン細胞に結合後、内在化し、リ
ソゾームでそのほとんどは分解される（Garrigues, J.,
Garrigues,U., Hellstrom, I., and Hellstrom, K.E.
Le Y specfic antibody with potentanti-tumor activi
ty is internalized and degraded in lysosomes. Am.
J. Pathol., 142:607-621, 1993)。
ーマは、１９８９年２月２２日に、American Type Cult
ure Collection (ATCC)(12301 Parklawn Drive, Rockvi
lle,MD 20852)に寄託され、ＢＲ９６ハイブリドーマと
同定された(ATCC AccessionNo.:HB 10036) 。ＢＲ９６
からのヒトガンマ１カッパキメラフォーム、すなわちＣ
ｈｉＢＲ９６を生産するＢＲ９６ハイブリドーマは、１
９９０年５月２３日に、ATCC(12301 Parklawn Drive, R
ockville, MD 20852) に寄託され、ＣｈｉＢＲ９６ハイ
ブリドーマと同定された(ATCC Accession No.:HB 1046
0) 。ＢＲ９６は、結腸ガン、乳ガン、卵巣ガン、肺ガ
ン及び膵臓ガン並びに他のガンにおいて豊富に発現さ
れ、或いは、より少ないが、幾つかの分化した上皮細胞
において発現されるルイスＹ（ＬｅY ) 抗原に関連した
炭化水素抗原を認識する。ヒトのガンの広い認識と、
２、３の正常組織（例えばｇｕｔ上皮組織や膵臓組織）
に対するよりもガン細胞への結合率が高いため、ＢＲ９
６はガンの治療用抗体として研究されてきた。ＢＲ９６
はインビトロにおけるガン細胞に結合後、内在化し、リ
ソゾームでそのほとんどは分解される（Garrigues, J.,
Garrigues,U., Hellstrom, I., and Hellstrom, K.E.
Le Y specfic antibody with potentanti-tumor activi
ty is internalized and degraded in lysosomes. Am.
J. Pathol., 142:607-621, 1993)。
【０００３】ドキソルビシンと、酸性ｐＨに不安定なヒ
ドラゾン結合を介して結合させたＢＲ９６の前臨床試験
は、ヒトガンを異種移植したヌードマウスモデルに著し
い治療効果を示した。（Trail, P.A., Willner, D., La
sch, S.J., Henderson, A.J., Casazza, A.M., Firesto
ne, R.A., Hellstrom, I., and Hellstrom, K.E. Cure
of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubici
n immunoconjugates.Science, 261: 212-215, 1993 参
照) 。ＢＲ９６−ドキソルビシン複合体は、乳ガン、肺
ガン、結腸ガン、膵臓ガン、卵巣ガン及び他の悪性腫瘍
の治療のための第Ｉ相試験を行っている。ＢＲ９６は、
抗体依存細胞性毒性（ADCC) 、補体依存性細胞毒性(CD
C) を媒介し、内在化している。驚くべきことに、ＢＲ
９６はエフェクター細胞又は補体の非存在下で、ガン細
胞のＤＮＡ合成を阻害する（G.J. Schreiber et al.,
"An Unmodified Anticarcinoma Antibody, BR96, Local
izes To and Inhibits Outgrowths of Human Tumors in
Nude Mice", Cancer Reserach 52: 3262-3266 (1992)
参照) 。
ドラゾン結合を介して結合させたＢＲ９６の前臨床試験
は、ヒトガンを異種移植したヌードマウスモデルに著し
い治療効果を示した。（Trail, P.A., Willner, D., La
sch, S.J., Henderson, A.J., Casazza, A.M., Firesto
ne, R.A., Hellstrom, I., and Hellstrom, K.E. Cure
of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubici
n immunoconjugates.Science, 261: 212-215, 1993 参
照) 。ＢＲ９６−ドキソルビシン複合体は、乳ガン、肺
ガン、結腸ガン、膵臓ガン、卵巣ガン及び他の悪性腫瘍
の治療のための第Ｉ相試験を行っている。ＢＲ９６は、
抗体依存細胞性毒性（ADCC) 、補体依存性細胞毒性(CD
C) を媒介し、内在化している。驚くべきことに、ＢＲ
９６はエフェクター細胞又は補体の非存在下で、ガン細
胞のＤＮＡ合成を阻害する（G.J. Schreiber et al.,
"An Unmodified Anticarcinoma Antibody, BR96, Local
izes To and Inhibits Outgrowths of Human Tumors in
Nude Mice", Cancer Reserach 52: 3262-3266 (1992)
参照) 。
【０００４】ＢＲ９６は明らかに膜の透過性を変化させ
ることにより、細胞毒性を示す。（Garrigues et al.,
"Le Y Specific Antibody With Potent Anti-tumor Act
ivity Internalized and Degraded in Lysosomes. Am.
J. Pathol., 142(2):607-622, February 1993 参照) 。
ＢＲ９６への感受性は、細胞表面の抗原の発現レベルに
関係している(Garrigues et al. (February 1993) 参
照) 。抗原発現のレベルが高ければ、ＢＲ９６への感受
性も上昇する。インビボにおけるＢＲ９６の抗ガン効果
を、元のＢＲ９６を変換した変異体のF(ab')2 フラグメ
ント、マウス−ヒトキメラフォーム、及びＩｇＧ１クラ
スと比較した(G.J. Schreiber et al., (1992)参照) 。
ＢＲ９６のキメラフォームは最も強い抗ガン効果を示
し、次にネズミのＩｇＧ３であったのに対し、ＢＲ９６
のＩｇＧ１及びF(ab')2 は制限された効果しか示さなか
った（G.J. Schreiber etal.,(1992)参照) 。ＢＲ９６
の幾つかの機能形態は、ヒト肺腺ガンを異種移植された
ヌードマウスの未改質形態（unmodified form)で試験し
たとき、著しい抗ガン効果を示した。
ることにより、細胞毒性を示す。（Garrigues et al.,
"Le Y Specific Antibody With Potent Anti-tumor Act
ivity Internalized and Degraded in Lysosomes. Am.
J. Pathol., 142(2):607-622, February 1993 参照) 。
ＢＲ９６への感受性は、細胞表面の抗原の発現レベルに
関係している(Garrigues et al. (February 1993) 参
照) 。抗原発現のレベルが高ければ、ＢＲ９６への感受
性も上昇する。インビボにおけるＢＲ９６の抗ガン効果
を、元のＢＲ９６を変換した変異体のF(ab')2 フラグメ
ント、マウス−ヒトキメラフォーム、及びＩｇＧ１クラ
スと比較した(G.J. Schreiber et al., (1992)参照) 。
ＢＲ９６のキメラフォームは最も強い抗ガン効果を示
し、次にネズミのＩｇＧ３であったのに対し、ＢＲ９６
のＩｇＧ１及びF(ab')2 は制限された効果しか示さなか
った（G.J. Schreiber etal.,(1992)参照) 。ＢＲ９６
の幾つかの機能形態は、ヒト肺腺ガンを異種移植された
ヌードマウスの未改質形態（unmodified form)で試験し
たとき、著しい抗ガン効果を示した。
【０００５】他のルイスＹ抗原を認識するモノクローナ
ル抗体も報告されている（Brown ,A., Feizzi, T., Goo
i, H. C., Embleton, M.J., Picard, J.K., and Baldsi
n,R.w. A monoclonal antibody against houman coloni
c adenoma recognizes difucosylated type-2-blood-gr
oup chains. Biosci. Rep., 3:163-170, 1983 ; Lloyd,
K.O., Larson, G., Stromberg, N., Thurin, J., and
Karlsson, K.A. Mouse monoclonal antibody F-3 recog
nizes the difucosyl type-2-blood group-related ant
igenes in human malignabt, premalignant, and nonma
lignant colonic tissue. Cancer Res., 46:5985-5992,
1986; Hellstrom, K.E. Monoclonalmouse antibodies
raised against human lung carcinoma. Cancer Res.,
46:3917-3923, 1986; Ernst, C.S., Shen, T-W., Litwi
n, S., Herlyn, M., Koprowski, H., and Sears, H.F.
Multiparameter evaluation of the expression in sit
u of notmal and tumor-associated antigens in human
colorectal carcinoma. J. Natl. Cancer Inst., 77:3
87-395, 1986; Abe, K., Hakomori, S., and Ohshiba,
S. Differential expression of difucosyl type 2 cha
in (le Y ) defined by monoclonal antibody AH6 in d
ifferent location of colonic epithelia, various hi
stological types of colonic polyps, and adenocarci
nomas. Cancer Res., 46:2639-2644, 1986; Brown, A.,
Ellis, I.O., Embleton, M.J., Baldwin, R.W., Turne
r, D.R. and Hardcastle, J.D. Immunohistochemical l
acalization of Y hapten and the structurally relat
ed H type-2-blood-group antigens on large-bowel tu
mors and normal adult tissues. Int. J. Cancer,33:7
27-736, 1984; Abe, K., McKbbin, J.M., and Hakomor
i, S. The monoclonal antibody directed to difucosy
lated type 2 chain (Fucαｌ→2Galβ1 →4(Fuc αｌ
→3)GlcNAc; Y determinant). J. Biol. Chem., 258:11
793-11797, 1983; Blaineau, C., LePendu, J., Aenau
d, D., Connan, F., and Avner, P. Theglycosidic ant
igen recognized by a novel monoclonal antibody, 7
5.12, isdevelopmentally regulated on mouse embryon
al carcinoma cells. EMBO J., 2:2217-2222, 1983; Po
ur, P.M., Tempero, V.E., Cordon-Cardo, C., and Bos
l,G.J. Expression of blood group-related antigens
ABH, Lewis B, Lewis X,Lewis Y, and CA 19-9 in panc
reatic cancer cells in comparison with the patien
t's blood group type. Cancer Res., 48:5422-5426, 1
988; Motzer, R. J., Reuter, V.E., Cordon-Cardo,
C., and Bosl, G.J. Blood group-related antigenes i
n human germ cell tumors. Cancer Res., 48:5342-534
7, 1988) 。ＢＲ９６と変異体ＢＲ９６はその抗体が異
なる。ＢＲ９６は、他の抗ガンモノクローナル抗体と同
様に正常な細胞にも結合するが、凍結した部分の免疫組
織学において確立されたように、我々が試験を行った他
のモノクローナル抗体の大部分におけるよりも、ガンに
対して高い選択性を示す。ＢＲ９６は抗原陽性ガン細胞
に対して毒性であり、全てのＢＲ９６はＡＤＣＣもＣＤ
Ｃもどちらも媒介する（G.J. Schreiber et al., "An U
nmodified Anticarcinoma Antibody, BR96, Localizes
To and Inhibits Outgrowths of Human Tumors in Nude
Mice", CancerResearch 52: 3262-3266 (1992)参照)
。
ル抗体も報告されている（Brown ,A., Feizzi, T., Goo
i, H. C., Embleton, M.J., Picard, J.K., and Baldsi
n,R.w. A monoclonal antibody against houman coloni
c adenoma recognizes difucosylated type-2-blood-gr
oup chains. Biosci. Rep., 3:163-170, 1983 ; Lloyd,
K.O., Larson, G., Stromberg, N., Thurin, J., and
Karlsson, K.A. Mouse monoclonal antibody F-3 recog
nizes the difucosyl type-2-blood group-related ant
igenes in human malignabt, premalignant, and nonma
lignant colonic tissue. Cancer Res., 46:5985-5992,
1986; Hellstrom, K.E. Monoclonalmouse antibodies
raised against human lung carcinoma. Cancer Res.,
46:3917-3923, 1986; Ernst, C.S., Shen, T-W., Litwi
n, S., Herlyn, M., Koprowski, H., and Sears, H.F.
Multiparameter evaluation of the expression in sit
u of notmal and tumor-associated antigens in human
colorectal carcinoma. J. Natl. Cancer Inst., 77:3
87-395, 1986; Abe, K., Hakomori, S., and Ohshiba,
S. Differential expression of difucosyl type 2 cha
in (le Y ) defined by monoclonal antibody AH6 in d
ifferent location of colonic epithelia, various hi
stological types of colonic polyps, and adenocarci
nomas. Cancer Res., 46:2639-2644, 1986; Brown, A.,
Ellis, I.O., Embleton, M.J., Baldwin, R.W., Turne
r, D.R. and Hardcastle, J.D. Immunohistochemical l
acalization of Y hapten and the structurally relat
ed H type-2-blood-group antigens on large-bowel tu
mors and normal adult tissues. Int. J. Cancer,33:7
27-736, 1984; Abe, K., McKbbin, J.M., and Hakomor
i, S. The monoclonal antibody directed to difucosy
lated type 2 chain (Fucαｌ→2Galβ1 →4(Fuc αｌ
→3)GlcNAc; Y determinant). J. Biol. Chem., 258:11
793-11797, 1983; Blaineau, C., LePendu, J., Aenau
d, D., Connan, F., and Avner, P. Theglycosidic ant
igen recognized by a novel monoclonal antibody, 7
5.12, isdevelopmentally regulated on mouse embryon
al carcinoma cells. EMBO J., 2:2217-2222, 1983; Po
ur, P.M., Tempero, V.E., Cordon-Cardo, C., and Bos
l,G.J. Expression of blood group-related antigens
ABH, Lewis B, Lewis X,Lewis Y, and CA 19-9 in panc
reatic cancer cells in comparison with the patien
t's blood group type. Cancer Res., 48:5422-5426, 1
988; Motzer, R. J., Reuter, V.E., Cordon-Cardo,
C., and Bosl, G.J. Blood group-related antigenes i
n human germ cell tumors. Cancer Res., 48:5342-534
7, 1988) 。ＢＲ９６と変異体ＢＲ９６はその抗体が異
なる。ＢＲ９６は、他の抗ガンモノクローナル抗体と同
様に正常な細胞にも結合するが、凍結した部分の免疫組
織学において確立されたように、我々が試験を行った他
のモノクローナル抗体の大部分におけるよりも、ガンに
対して高い選択性を示す。ＢＲ９６は抗原陽性ガン細胞
に対して毒性であり、全てのＢＲ９６はＡＤＣＣもＣＤ
Ｃもどちらも媒介する（G.J. Schreiber et al., "An U
nmodified Anticarcinoma Antibody, BR96, Localizes
To and Inhibits Outgrowths of Human Tumors in Nude
Mice", CancerResearch 52: 3262-3266 (1992)参照)
。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ガン細胞への改良され
た特異性、より強い結合親和性、血清中でのより長い半
減期、又はより効果的なガン細胞殺傷性などのさらに改
良された特徴を示すＢＲ９６の変異体（すなわち変異体
ＢＲ９６) が必要とされている。改良された抗体の変異
体は遺伝工学法により得られた。一般に、抗体分子又は
そのフラグメントを遺伝工学的に得るには、或いは親抗
体よりも増強された親和性を有する抗体分子を作るに
は、次の段階が必要である。（１）ハイブリドーマから
Ｈ鎖及び／又はＬ鎖遺伝子を単離し、プラスミドのよう
なベクター内にクローン化を行い、（２）抗体遺伝子を
修飾し、及び（３）修飾した遺伝子を効果的に発現しえ
る細胞内にトランスフェクションする。抗体遺伝子は、
様々な方法で修飾可能である。例えば、抗体のＣＤＲ内
で変異体のライブラリーを作製する効果的で迅速な方法
は、コドンをベースとした変異誘発である（Glaser, S.
M., et al., 1992, J. Immunol. 149:3903-3913) 。コ
ドンをベースとしたオリゴヌクレオチドの合成は、親フ
ァージに関連し、Ｈ鎖及びＬ鎖のライブラリーを生産す
るようにＣＤＲ内において選択した数のターゲットコド
ンに相当する多数の配列を得ることが可能である。
た特異性、より強い結合親和性、血清中でのより長い半
減期、又はより効果的なガン細胞殺傷性などのさらに改
良された特徴を示すＢＲ９６の変異体（すなわち変異体
ＢＲ９６) が必要とされている。改良された抗体の変異
体は遺伝工学法により得られた。一般に、抗体分子又は
そのフラグメントを遺伝工学的に得るには、或いは親抗
体よりも増強された親和性を有する抗体分子を作るに
は、次の段階が必要である。（１）ハイブリドーマから
Ｈ鎖及び／又はＬ鎖遺伝子を単離し、プラスミドのよう
なベクター内にクローン化を行い、（２）抗体遺伝子を
修飾し、及び（３）修飾した遺伝子を効果的に発現しえ
る細胞内にトランスフェクションする。抗体遺伝子は、
様々な方法で修飾可能である。例えば、抗体のＣＤＲ内
で変異体のライブラリーを作製する効果的で迅速な方法
は、コドンをベースとした変異誘発である（Glaser, S.
M., et al., 1992, J. Immunol. 149:3903-3913) 。コ
ドンをベースとしたオリゴヌクレオチドの合成は、親フ
ァージに関連し、Ｈ鎖及びＬ鎖のライブラリーを生産す
るようにＣＤＲ内において選択した数のターゲットコド
ンに相当する多数の配列を得ることが可能である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＢＲ９６の可
変領域と、ここに述べる差異以外には実質的に相同であ
るアミノ酸配列を有する可変領域を含有するＢＲ９６ポ
リペプチド変異体（及びそれらをコードする核酸配列）
に関する。そのような差異は、ＢＲ９６抗体への変異体
ＢＲ９６の親和性を高めるものである。
変領域と、ここに述べる差異以外には実質的に相同であ
るアミノ酸配列を有する可変領域を含有するＢＲ９６ポ
リペプチド変異体（及びそれらをコードする核酸配列）
に関する。そのような差異は、ＢＲ９６抗体への変異体
ＢＲ９６の親和性を高めるものである。
【発明の実施の形態】一つの実施態様において、ＢＲ９
６ポリペプチド変異体は、ＢＲ９６Ｈ３−３６（以後Ｍ
１変異体と呼ぶ。）変異体を表す。ＢＲ９６Ｍ１変異体
は、ＣＤＲ３のＨ鎖の１０１位のアミノ酸がアラニンで
ある点を除いて、ＢＲ９６と同じアミノ酸配列の可変領
域を有する。これに対し、ＢＲ９６の１０１位のアミノ
酸はアスラギン酸である。一つの実施態様において、Ｂ
Ｒ９６ポリペプチド変異体は、ＢＲ９６Ｈ２−６０（以
後Ｍ２変異体と呼ぶ。）変異体を表す。ＢＲ９６Ｍ２変
異体は、ＣＤＲ２のＨ鎖の５４位のアミノ酸がアスパラ
ギン酸である点を除いて、ＢＲ９６と同じアミノ酸配列
の可変領域を有する。これに対し、ＢＲ９６の５４位の
アミノ酸はグリシンである。
６ポリペプチド変異体は、ＢＲ９６Ｈ３−３６（以後Ｍ
１変異体と呼ぶ。）変異体を表す。ＢＲ９６Ｍ１変異体
は、ＣＤＲ３のＨ鎖の１０１位のアミノ酸がアラニンで
ある点を除いて、ＢＲ９６と同じアミノ酸配列の可変領
域を有する。これに対し、ＢＲ９６の１０１位のアミノ
酸はアスラギン酸である。一つの実施態様において、Ｂ
Ｒ９６ポリペプチド変異体は、ＢＲ９６Ｈ２−６０（以
後Ｍ２変異体と呼ぶ。）変異体を表す。ＢＲ９６Ｍ２変
異体は、ＣＤＲ２のＨ鎖の５４位のアミノ酸がアスパラ
ギン酸である点を除いて、ＢＲ９６と同じアミノ酸配列
の可変領域を有する。これに対し、ＢＲ９６の５４位の
アミノ酸はグリシンである。
【０００８】他の実施態様では、ＢＲ９６ポリペプチド
変異体はＢＲ９６Ｈ１−４−３（以後Ｍ４変異体と呼
ぶ。）変異体を表す。ＢＲ９６Ｍ４変異体は、２８位の
アミノ酸がＢＲ９６ではトレオニン（ＡＣＴでコードさ
れている）であるのに対し、プロリン（ＣＣＧでコード
されている）である点を除いて、ＢＲ９６と同じアミノ
酸配列の可変領域を有する。さらに、３０位のアミノ酸
は、ＢＲ９６がセリン（ＴＣＧ）であるのに対し、変異
体ＢＲ９６ではアラニン（ＧＣＧ）であり、３１位のア
ミノ酸は、アスパラギン酸（ＧＡＣ）ではなく、変異体
ＢＲ９６ではセリン（ＴＣＧ）であり、また、１０１位
のアミノ酸はアラニン（ＧＣＧ）である。ここで使用さ
れる配列の番号は、ＢＲ９６及び変異体ＢＲ９６のアミ
ノ酸の位置を、初めのアミノ酸の位置を１番として番号
付したである。
変異体はＢＲ９６Ｈ１−４−３（以後Ｍ４変異体と呼
ぶ。）変異体を表す。ＢＲ９６Ｍ４変異体は、２８位の
アミノ酸がＢＲ９６ではトレオニン（ＡＣＴでコードさ
れている）であるのに対し、プロリン（ＣＣＧでコード
されている）である点を除いて、ＢＲ９６と同じアミノ
酸配列の可変領域を有する。さらに、３０位のアミノ酸
は、ＢＲ９６がセリン（ＴＣＧ）であるのに対し、変異
体ＢＲ９６ではアラニン（ＧＣＧ）であり、３１位のア
ミノ酸は、アスパラギン酸（ＧＡＣ）ではなく、変異体
ＢＲ９６ではセリン（ＴＣＧ）であり、また、１０１位
のアミノ酸はアラニン（ＧＣＧ）である。ここで使用さ
れる配列の番号は、ＢＲ９６及び変異体ＢＲ９６のアミ
ノ酸の位置を、初めのアミノ酸の位置を１番として番号
付したである。
【０００９】定義 “ポリペプチド”は、抗体（例としてポリクローナル又
はモノクローナル抗体；二重特異性抗体又は異種抗体で
ある）及び／又はＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’） 2 或いは
組み換え法又はタンパク質分解消化により生産された抗
原結合部位を有する可変Ｈ鎖及び／又はＬ鎖を含む機能
的等価体のようなタンパク分子を含む。ポリペプチドは
単一のアミノ酸鎖を有していてもよい。または、ポリペ
プチドは、共有結合的又は非共有結合的に結合した少な
くとも二つのアミノ酸鎖を有していてもよい。ここで使
用されるように“ＣＤＲ”は、抗原又はターゲットに対
する特異性と親和性を決定する、超可変部領域及び／又
はポリペプチドの結合ループ（ＣＤＲループとしても知
られている。）の形状を維持するアミノ酸を含む領域で
あるポリペプチドの部位を表す。用語“ＢＲ９６”は、
米国出願０５７，４４４号（１９９３年５月５日登録）
に記載の全てのモノクローナル抗体を示し、これは、同
等の結合特異性を有する各種の一定の領域又はそのフラ
グメントのＨ鎖及びＬ鎖両方を含み、Ｆａｂ、Ｆ（ａ
ｂ’）2 、Ｆｖ及びｓＦｖ分子を含有している。
はモノクローナル抗体；二重特異性抗体又は異種抗体で
ある）及び／又はＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’） 2 或いは
組み換え法又はタンパク質分解消化により生産された抗
原結合部位を有する可変Ｈ鎖及び／又はＬ鎖を含む機能
的等価体のようなタンパク分子を含む。ポリペプチドは
単一のアミノ酸鎖を有していてもよい。または、ポリペ
プチドは、共有結合的又は非共有結合的に結合した少な
くとも二つのアミノ酸鎖を有していてもよい。ここで使
用されるように“ＣＤＲ”は、抗原又はターゲットに対
する特異性と親和性を決定する、超可変部領域及び／又
はポリペプチドの結合ループ（ＣＤＲループとしても知
られている。）の形状を維持するアミノ酸を含む領域で
あるポリペプチドの部位を表す。用語“ＢＲ９６”は、
米国出願０５７，４４４号（１９９３年５月５日登録）
に記載の全てのモノクローナル抗体を示し、これは、同
等の結合特異性を有する各種の一定の領域又はそのフラ
グメントのＨ鎖及びＬ鎖両方を含み、Ｆａｂ、Ｆ（ａ
ｂ’）2 、Ｆｖ及びｓＦｖ分子を含有している。
【００１０】用語“変異体ＢＲ９６”は、Ｆａｂ、Ｆ
（ａｂ’）2 、Ｆｖ（単一鎖Ｆｖを含む）及び融合タン
パクのような変異体抗体の抗原結合領域を少なくとも含
み、ＢＲ９６の相当する領域に関して、除去、挿入、又
は置換などのアミノ酸の変換を少なくとも一種含む、全
ての抗体及び／又はそのフラグメントを示す。用語“フ
ラグメント”は、全ての抗体ではなく、機能的な抗体の
誘導体のみを表す。さらにフラグメントという用語は、
タンパク質の分解により得られたものに限らず、組み換
え工学の方法で得られた分子も含む。“実質的に精製さ
れた”とは、不純物が混入していない、又は抗原結合に
可逆的に作用又は阻害をする他のアミノ酸残基を含まな
いことを意味している。ここで用いる“Ｆａｂ”は、Ｆ
ａｂ’分子を含み、少なくともＬ鎖（ＶL 及びＣL ）及
び二つのアミノ末端Ｈ鎖ドメイン（ＶH 及びＣH1）を有
する一価の分子を意味する。
（ａｂ’）2 、Ｆｖ（単一鎖Ｆｖを含む）及び融合タン
パクのような変異体抗体の抗原結合領域を少なくとも含
み、ＢＲ９６の相当する領域に関して、除去、挿入、又
は置換などのアミノ酸の変換を少なくとも一種含む、全
ての抗体及び／又はそのフラグメントを示す。用語“フ
ラグメント”は、全ての抗体ではなく、機能的な抗体の
誘導体のみを表す。さらにフラグメントという用語は、
タンパク質の分解により得られたものに限らず、組み換
え工学の方法で得られた分子も含む。“実質的に精製さ
れた”とは、不純物が混入していない、又は抗原結合に
可逆的に作用又は阻害をする他のアミノ酸残基を含まな
いことを意味している。ここで用いる“Ｆａｂ”は、Ｆ
ａｂ’分子を含み、少なくともＬ鎖（ＶL 及びＣL ）及
び二つのアミノ末端Ｈ鎖ドメイン（ＶH 及びＣH1）を有
する一価の分子を意味する。
【００１１】ここで用いる“Ｆ（ａｂ’）2 ”は、Ｆａ
ｂ’分子が二つ結合した二価の分子を意味する。ここで
用いる“Ｆｖ”は、Ｌ鎖の可変ドメインに非共有結合的
に結合したＨ鎖の可変ドメインからなる一価の分子を意
味する。ここで用いる“ｓＦｖ”は、Ｌ鎖の可変ドメイ
ン（ＶL ) とＨ鎖の可変ドメイン（ＶH ) が結合タンパ
クにより結合している分子を意味する。ｓＦｖは、どの
ような方法で得てもよく、例えば、遺伝工学を用いても
よい。ここで用いる“Ｆｄ”は、イムノグロブリンのＨ
鎖の可変領域（ＶH ) とイムノグロブリンのＨ鎖の一定
領域（ＣＨ1 ) のアミノ末端部位を有する分子を意味す
る。“異種抗体”は、少なくとも二種の抗体が、ＳＰＤ
Ｐ、又はリシンもしくはアルギニン残基と共に結合する
イミノチオランのような試薬により架橋された分子を意
味する。一般に、異種抗体は少なくとも４種の抗原結合
部位、各特異性を示す２つの結合部位を有する。“二重
特異性”は、２種以上の抗体への抗原結合部位を有する
分子を表している。
ｂ’分子が二つ結合した二価の分子を意味する。ここで
用いる“Ｆｖ”は、Ｌ鎖の可変ドメインに非共有結合的
に結合したＨ鎖の可変ドメインからなる一価の分子を意
味する。ここで用いる“ｓＦｖ”は、Ｌ鎖の可変ドメイ
ン（ＶL ) とＨ鎖の可変ドメイン（ＶH ) が結合タンパ
クにより結合している分子を意味する。ｓＦｖは、どの
ような方法で得てもよく、例えば、遺伝工学を用いても
よい。ここで用いる“Ｆｄ”は、イムノグロブリンのＨ
鎖の可変領域（ＶH ) とイムノグロブリンのＨ鎖の一定
領域（ＣＨ1 ) のアミノ末端部位を有する分子を意味す
る。“異種抗体”は、少なくとも二種の抗体が、ＳＰＤ
Ｐ、又はリシンもしくはアルギニン残基と共に結合する
イミノチオランのような試薬により架橋された分子を意
味する。一般に、異種抗体は少なくとも４種の抗原結合
部位、各特異性を示す２つの結合部位を有する。“二重
特異性”は、２種以上の抗体への抗原結合部位を有する
分子を表している。
【００１２】“実質的に相同である”とは、ＢＲ９６抗
原に対する認識及び結合をするアミノ酸相同体を意味す
る。“処置（治療）（treating）”とは、(1) ある期間
ガンが触知可能では無くなるようにガンを退縮させる
（基本的なガンの測定方法については、A.B. Milleret
al. "Reporting results of cancer treatment" Cancer
47:207-214 (1981)に従った。) ； (2) 病気を安定化する；又は (3) 臨床的に有利な効果を与える；を意味する。 “突然変異”は、単純突然変異又は複合突然変異を表
し、どのような方法によるものでもよい。本発明をさら
に完全に理解するために、以下述べる。
原に対する認識及び結合をするアミノ酸相同体を意味す
る。“処置（治療）（treating）”とは、(1) ある期間
ガンが触知可能では無くなるようにガンを退縮させる
（基本的なガンの測定方法については、A.B. Milleret
al. "Reporting results of cancer treatment" Cancer
47:207-214 (1981)に従った。) ； (2) 病気を安定化する；又は (3) 臨床的に有利な効果を与える；を意味する。 “突然変異”は、単純突然変異又は複合突然変異を表
し、どのような方法によるものでもよい。本発明をさら
に完全に理解するために、以下述べる。
【００１３】ポリペプチド 本発明は様々な形態の変異体ＢＲ９６を目的とする。す
なわち、例として全抗体、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ、Ｆ
ｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、又は少なくとも変異体ＢＲ９６の抗原
結合部位を有するか、又は変異体ＢＲ９６のターゲット
抗原への免疫特異的な結合を競争的に阻害する抗原結合
領域を有する分子が挙げられる。変異体ＢＲ９６は、Ｂ
Ｒ９６の可変領域と実質的に相同な可変領域を有する。
しかし、これらには著しい差異が存在し、この差異は、
変異体ＢＲ９６にＢＲ９６と比較して増強した結合親和
性及び結合活性を与える。ＢＲ９６及び変異体ＢＲ９６
の差異を、次に示す。ＢＲ９６のＨ鎖のＣＤＲ１では、
トレオニンがアミノ酸の２８位に位置している。さら
に、ＣＤＲ１では、セリン及びアスパラギン酸がそれぞ
れアミノ酸の３０及び３１位に位置している。ＢＲ９６
のＨ鎖のＣＤＲ２では、グリシンがアミノ酸の５４位に
位置している。さらにＢＲ９６のＨ鎖のＣＤＲ３では、
アスパラギン酸がアミノ酸の１０１位に位置している。
ＢＲ９６に対し、ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂ変異体（図３）
は、変異体ＢＲ９６のＨ鎖のＣＤＲ３の１０１位にアラ
ニンを有している（表１）。表１は、配列番号及びカバ
ット（Kabat)番号両方を示している。両方の番号システ
ムは共にアミノ酸の位置を表すのに適する方法である。
さらに、ＢＲ９６に対して、ＢＲ９６Ｍ４変異体（図
５）のＨ鎖のＣＤＲ１において、２８位にはプロリン
が、３０位にはアラニンが、３１位にはセリンが、また
１０１位にはアラニンが位置している（表１）。
なわち、例として全抗体、Ｆ（ａｂ’）2 、Ｆａｂ、Ｆ
ｖ、Ｆｃ、Ｆｄ、又は少なくとも変異体ＢＲ９６の抗原
結合部位を有するか、又は変異体ＢＲ９６のターゲット
抗原への免疫特異的な結合を競争的に阻害する抗原結合
領域を有する分子が挙げられる。変異体ＢＲ９６は、Ｂ
Ｒ９６の可変領域と実質的に相同な可変領域を有する。
しかし、これらには著しい差異が存在し、この差異は、
変異体ＢＲ９６にＢＲ９６と比較して増強した結合親和
性及び結合活性を与える。ＢＲ９６及び変異体ＢＲ９６
の差異を、次に示す。ＢＲ９６のＨ鎖のＣＤＲ１では、
トレオニンがアミノ酸の２８位に位置している。さら
に、ＣＤＲ１では、セリン及びアスパラギン酸がそれぞ
れアミノ酸の３０及び３１位に位置している。ＢＲ９６
のＨ鎖のＣＤＲ２では、グリシンがアミノ酸の５４位に
位置している。さらにＢＲ９６のＨ鎖のＣＤＲ３では、
アスパラギン酸がアミノ酸の１０１位に位置している。
ＢＲ９６に対し、ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂ変異体（図３）
は、変異体ＢＲ９６のＨ鎖のＣＤＲ３の１０１位にアラ
ニンを有している（表１）。表１は、配列番号及びカバ
ット（Kabat)番号両方を示している。両方の番号システ
ムは共にアミノ酸の位置を表すのに適する方法である。
さらに、ＢＲ９６に対して、ＢＲ９６Ｍ４変異体（図
５）のＨ鎖のＣＤＲ１において、２８位にはプロリン
が、３０位にはアラニンが、３１位にはセリンが、また
１０１位にはアラニンが位置している（表１）。
【００１４】ＢＲ９６Ｍ２変異体は、Ｈ鎖のＣＤＲ２の
アミノ酸の５４位にアスパラギン酸を有しており、これ
に対し、ＢＲ９６は相当する位置にグリシンを有してい
る。ＢＲ９６Ｍ３変異体は、Ｈ鎖のＣＤＲ２の５４位の
アミノ酸にはアスパラギン酸を有し、ＣＤＲ３の１０１
位のアミノ酸にはアラニンを有している。これに対し、
ＢＲ９６は相当する位置にグリシンとアスパラギン酸を
それぞれ有している。ＢＲ９６Ｍ１４変異体は、図２６
に示されるアミノ酸の２６位から３３位のＧｌｙ Ｐｈ
ｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
の配列を含むＨ鎖のＣＤＲ、及び図２６に示されるアミ
ノ酸の５２位から５９位にＳｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇ
ｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐの配列を含むＨ
鎖にＣＤＲ、並びに表１に示されるアミノ酸のカバット
配列の９５位から１００ａ位にＧｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐの配列を含むＨ鎖の
ＣＤＲを含む。
アミノ酸の５４位にアスパラギン酸を有しており、これ
に対し、ＢＲ９６は相当する位置にグリシンを有してい
る。ＢＲ９６Ｍ３変異体は、Ｈ鎖のＣＤＲ２の５４位の
アミノ酸にはアスパラギン酸を有し、ＣＤＲ３の１０１
位のアミノ酸にはアラニンを有している。これに対し、
ＢＲ９６は相当する位置にグリシンとアスパラギン酸を
それぞれ有している。ＢＲ９６Ｍ１４変異体は、図２６
に示されるアミノ酸の２６位から３３位のＧｌｙ Ｐｈ
ｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
の配列を含むＨ鎖のＣＤＲ、及び図２６に示されるアミ
ノ酸の５２位から５９位にＳｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇ
ｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐの配列を含むＨ
鎖にＣＤＲ、並びに表１に示されるアミノ酸のカバット
配列の９５位から１００ａ位にＧｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐの配列を含むＨ鎖の
ＣＤＲを含む。
【００１５】ＢＲ９６Ｍ１、Ｍ３、Ｍ４及びＭ１４変異
体の機能的等価体又は誘導体は、(1) ＢＲ９６の可変領
域と実質的に相同なアミノ酸配列を有し、(2) ＢＲ９６
抗原に対する親和性の向上及び特異性の増強を示すこと
が可能であり、及び／又は(3) ＢＲ９６のＨ鎖の可変領
域の１０１位において少なくとも一種の異なるアミノ酸
を有する分子を有する。さらに、ＢＲ９６Ｍ２及びＭ３
変異体の機能的等価体又は誘導体は、(1) ＢＲ９６の可
変領域と実質的に相同なアミノ酸配列を有し、(2) ＢＲ
９６抗原に対する親和性の向上及び特異性の増強を示す
ことが可能であり、及び／又は(3) ＢＲ９６のＨ鎖の可
変領域の５４位において少なくとも一種の異なるアミノ
酸を有する分子を有する。
体の機能的等価体又は誘導体は、(1) ＢＲ９６の可変領
域と実質的に相同なアミノ酸配列を有し、(2) ＢＲ９６
抗原に対する親和性の向上及び特異性の増強を示すこと
が可能であり、及び／又は(3) ＢＲ９６のＨ鎖の可変領
域の１０１位において少なくとも一種の異なるアミノ酸
を有する分子を有する。さらに、ＢＲ９６Ｍ２及びＭ３
変異体の機能的等価体又は誘導体は、(1) ＢＲ９６の可
変領域と実質的に相同なアミノ酸配列を有し、(2) ＢＲ
９６抗原に対する親和性の向上及び特異性の増強を示す
ことが可能であり、及び／又は(3) ＢＲ９６のＨ鎖の可
変領域の５４位において少なくとも一種の異なるアミノ
酸を有する分子を有する。
【００１６】
【表１】
【００１７】
【表２】
【００１８】
【表３】
【００１９】ＢＲ９６と比較して、一つより多いアミノ
酸変異体を有する変異体ＢＲ９６分子は本発明に含まれ
る。その形態により、変異体ＢＲ９６はモノクローナル
抗体のような単機能抗体であるか、或いは二重特異性抗
体又は異種抗体のような二重機能抗体である。治療又は
診断剤などの変異体ＢＲ９６の使用法により、変異体Ｂ
Ｒ９６の異なる形態を決定する。例えば、抗体フラグメ
ントは、一つの実施態様において、細胞のＦｃ受容体へ
の非特異的結合を阻害するのに好ましい（ラベルした抗
体を用いて診断画像化などの様々な医療への適用におい
て非常に有利な性質を有する。）。他の実施態様では、
特異的Ｆｃエフェクター機能が好ましい。これに関連し
て、それぞれの変異体を単一で又は組み合わせて、哺乳
類の発現系などの発現系に再導入することが可能であ
る。
酸変異体を有する変異体ＢＲ９６分子は本発明に含まれ
る。その形態により、変異体ＢＲ９６はモノクローナル
抗体のような単機能抗体であるか、或いは二重特異性抗
体又は異種抗体のような二重機能抗体である。治療又は
診断剤などの変異体ＢＲ９６の使用法により、変異体Ｂ
Ｒ９６の異なる形態を決定する。例えば、抗体フラグメ
ントは、一つの実施態様において、細胞のＦｃ受容体へ
の非特異的結合を阻害するのに好ましい（ラベルした抗
体を用いて診断画像化などの様々な医療への適用におい
て非常に有利な性質を有する。）。他の実施態様では、
特異的Ｆｃエフェクター機能が好ましい。これに関連し
て、それぞれの変異体を単一で又は組み合わせて、哺乳
類の発現系などの発現系に再導入することが可能であ
る。
【００２０】抗体発現に関して幾つか選択可能である。
免疫発現ライブラリーはトランスフェクション技術と組
み合わせることが可能である。すなわち、免疫グロブリ
ン遺伝子発現ライブラリーから誘導されたＦａｂ分子の
遺伝子は、目的の一定領域のエクソンと接続可能であ
る。これらの組み換え遺伝子は、トランスフェクション
を行い、発現を行って、その中で全抗体分子を分泌させ
ることができる。一度生産されたならば、本発明のポリ
ペプチド（例として、ＢＲ９６及び／又はその機能的等
価体）を、分子内のアミノ酸修飾などにより誘導体分子
を生産するように修飾を行ってもよい。そのような誘導
体分子は、ポリペプチドの機能性を保持している。すな
わち、そのような置換を受けた分子はＢＲ９６抗原のポ
リペプチド又はその一部にまだ結合しえる。これらのア
ミノ酸置換は、限定されないが、“保存的（conservati
ve) ”方法として知られているアミノ酸置換を含む。
免疫発現ライブラリーはトランスフェクション技術と組
み合わせることが可能である。すなわち、免疫グロブリ
ン遺伝子発現ライブラリーから誘導されたＦａｂ分子の
遺伝子は、目的の一定領域のエクソンと接続可能であ
る。これらの組み換え遺伝子は、トランスフェクション
を行い、発現を行って、その中で全抗体分子を分泌させ
ることができる。一度生産されたならば、本発明のポリ
ペプチド（例として、ＢＲ９６及び／又はその機能的等
価体）を、分子内のアミノ酸修飾などにより誘導体分子
を生産するように修飾を行ってもよい。そのような誘導
体分子は、ポリペプチドの機能性を保持している。すな
わち、そのような置換を受けた分子はＢＲ９６抗原のポ
リペプチド又はその一部にまだ結合しえる。これらのア
ミノ酸置換は、限定されないが、“保存的（conservati
ve) ”方法として知られているアミノ酸置換を含む。
【００２１】例えば、“保存的アミノ酸置換”と言われ
るある種のアミノ酸置換は、タンパク質の機能又は構造
を変化せずにしばしば行えることが、タンパク質化学に
おいて確立されている。そのような変換は、イソロイシ
ン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）を他の疎水
性アミノ酸と置換することを含み、アスパラギン酸
（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）に、グルタミン（Ｑ）をア
スパラギン（Ｎ）に、またセリン（Ｓ）をトレオニン
（Ｔ）に置換することを含む。他の置換も、そのアミノ
酸のタンパク質内での３次元構造における環境及び役割
によって、保存的と考えることができる。例えばグリシ
ン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は、しばしば交換可能であ
り、アラニンとバリン（Ｖ）も同様である。比較的疎水
性のメチオニン（Ｍ）は、しばしばロイシン及びイソロ
イシンと交換可能であり、場合によりバリンとも可能で
ある。リシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸
残基の重要な性質が、その電荷にあり、二つのアミノ酸
残基の異なるｐＫは重要でない場合、位置の入れ代わり
が可能である。特別な条件によっては、その他の“保存
的”変換も考えられる。本発明の一つの実施態様におい
て、ポリペプチドは実質的に純粋である。すなわち、ポ
リペプチドがターゲットに結合するのを阻害又は低下さ
せる他のアミノ酸残基を含まない。
るある種のアミノ酸置換は、タンパク質の機能又は構造
を変化せずにしばしば行えることが、タンパク質化学に
おいて確立されている。そのような変換は、イソロイシ
ン（Ｉ）、バリン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）を他の疎水
性アミノ酸と置換することを含み、アスパラギン酸
（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）に、グルタミン（Ｑ）をア
スパラギン（Ｎ）に、またセリン（Ｓ）をトレオニン
（Ｔ）に置換することを含む。他の置換も、そのアミノ
酸のタンパク質内での３次元構造における環境及び役割
によって、保存的と考えることができる。例えばグリシ
ン（Ｇ）及びアラニン（Ａ）は、しばしば交換可能であ
り、アラニンとバリン（Ｖ）も同様である。比較的疎水
性のメチオニン（Ｍ）は、しばしばロイシン及びイソロ
イシンと交換可能であり、場合によりバリンとも可能で
ある。リシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）は、アミノ酸
残基の重要な性質が、その電荷にあり、二つのアミノ酸
残基の異なるｐＫは重要でない場合、位置の入れ代わり
が可能である。特別な条件によっては、その他の“保存
的”変換も考えられる。本発明の一つの実施態様におい
て、ポリペプチドは実質的に純粋である。すなわち、ポ
リペプチドがターゲットに結合するのを阻害又は低下さ
せる他のアミノ酸残基を含まない。
【００２２】核酸分子 ＢＲ９６のＨ鎖及びＬ鎖両方の抗原結合部位又は可変領
域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は既知である。基本
的な配列技術により、全てのＢＲ９６のヌクレオチド及
びアミノ酸配列は識別可能である。変異体ＢＲ９６の可
変領域の核酸配列は、実質的にＢＲ９６と相同性であ
る。ＢＲ９６において、アミノ酸の２８位のトレオニン
はコドンＡＣＴによりコードされている。さらに、アミ
ノ酸の３０位及び３１位のセリン及びアスパラギン酸
は、コドンＡＧＴ及びＧＡＣによりそれぞれコードされ
ている。さらに、アミノ酸１０１位のアスパラギン酸は
コドンＧＡＣによりコードされている。ＢＲ９６Ｍ１変
異体は、１０１位にアラニンを有しており、コドンＧＣ
Ｇによりコードされている。他のアラニンをコードする
コドンすなわち、ＧＣＴ、ＧＣＣ又はＧＣＡも本発明に
含まれる。さらに、ＢＲ９６ポリペプチド変異体の他の
実施態様では、Ｈ鎖のＣＤＲ３の１０１位のアミノ酸
は、アラニン、アルギニン、セリン、グリシン、チロシ
ン及びバリンからなる群から選択されたアミノ酸を含ん
でいてもよい。これは次のように図示される。
域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は既知である。基本
的な配列技術により、全てのＢＲ９６のヌクレオチド及
びアミノ酸配列は識別可能である。変異体ＢＲ９６の可
変領域の核酸配列は、実質的にＢＲ９６と相同性であ
る。ＢＲ９６において、アミノ酸の２８位のトレオニン
はコドンＡＣＴによりコードされている。さらに、アミ
ノ酸の３０位及び３１位のセリン及びアスパラギン酸
は、コドンＡＧＴ及びＧＡＣによりそれぞれコードされ
ている。さらに、アミノ酸１０１位のアスパラギン酸は
コドンＧＡＣによりコードされている。ＢＲ９６Ｍ１変
異体は、１０１位にアラニンを有しており、コドンＧＣ
Ｇによりコードされている。他のアラニンをコードする
コドンすなわち、ＧＣＴ、ＧＣＣ又はＧＣＡも本発明に
含まれる。さらに、ＢＲ９６ポリペプチド変異体の他の
実施態様では、Ｈ鎖のＣＤＲ３の１０１位のアミノ酸
は、アラニン、アルギニン、セリン、グリシン、チロシ
ン及びバリンからなる群から選択されたアミノ酸を含ん
でいてもよい。これは次のように図示される。
【００２３】 クローン 結合表現型 コドン アミノ酸 １ 高い ＧＴＴ／ＧＣＴ Ａｌａ／Ｖａｌ ７ 高い ＣＧＴ Ａｒｇ ８ 高い ＴＣＴ Ｓｅｒ ９ 高い ＣＧＴ Ａｒｇ １０ 高い ＴＣＴ Ｓｅｒ １３ 高い ＧＧＧ Ｇｌｙ １４ 高い ＧＧＴ Ｇｌｙ １５ 高い ＧＣＴ Ａｌａ １６ 高い ＣＧＴ Ａｒｇ ２０ 高い ＴＣＴ Ｓｅｒ ２４ 高い ＧＣＧ Ａｌａ ２８ 高い ＴＡＴ Ｔｙｒ ３０ 高い ＡＧＴ Ｓｅｒ ３１ 高い ＧＴＧ Ｖａｌ ３２ 高い ＴＣＴ Ｓｅｒ ３３ 高い ＣＧＧ Ａｒｇ ３４ 高い ＧＴＧ Ｖａｌ
【００２４】ＢＲ９６Ｍ４変異体は、２８位にプロリ
ン、３０位にアラニン、及び３１位にセリンを有してお
り、それぞれコドンＣＣＧ、ＧＣＧ及びＴＣＧでコード
されている（表１）。さらに、ＢＲ９６に対して、１０
１位のアラニンは、コドンＧＣＧでコードされている。
他のプロリンをコードするコドン（ＣＣＴ、ＣＣＣ、Ｃ
ＣＡ）、アラニン（ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ）、セリン
（ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ）も本発明
に含まれる。ＢＲ９６Ｍ２変異体はＣＤＲ２のＨ鎖の５
４位にアスパラギン酸を有しており、コドンＧＡＴ又は
ＧＡＣでコードされている（表１）。さらに、ＢＲ９６
Ｍ３変異体はＣＤＲ２のＨ鎖の５４位にアスパラギン酸
を有しており、コドンＧＡＴ又はＧＡＣでコードされて
いる（表１）。また、ＣＤＲ３のＨ鎖の１０１位にアラ
ニンを有しており、コドンＧＣＧ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、又
はＧＣＡでコードされている。本発明の核酸は、抗原結
合部位を含む変異体ＢＲ９６の可変領域を少なくともコ
ードしている。核酸は、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のよ
うなデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもよく、又はリボ核
酸（ＲＮＡ）でもよい。ＤＮＡが好ましい。
ン、３０位にアラニン、及び３１位にセリンを有してお
り、それぞれコドンＣＣＧ、ＧＣＧ及びＴＣＧでコード
されている（表１）。さらに、ＢＲ９６に対して、１０
１位のアラニンは、コドンＧＣＧでコードされている。
他のプロリンをコードするコドン（ＣＣＴ、ＣＣＣ、Ｃ
ＣＡ）、アラニン（ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ）、セリン
（ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＡＧＴ、ＡＧＣ）も本発明
に含まれる。ＢＲ９６Ｍ２変異体はＣＤＲ２のＨ鎖の５
４位にアスパラギン酸を有しており、コドンＧＡＴ又は
ＧＡＣでコードされている（表１）。さらに、ＢＲ９６
Ｍ３変異体はＣＤＲ２のＨ鎖の５４位にアスパラギン酸
を有しており、コドンＧＡＴ又はＧＡＣでコードされて
いる（表１）。また、ＣＤＲ３のＨ鎖の１０１位にアラ
ニンを有しており、コドンＧＣＧ、ＧＣＴ、ＧＣＣ、又
はＧＣＡでコードされている。本発明の核酸は、抗原結
合部位を含む変異体ＢＲ９６の可変領域を少なくともコ
ードしている。核酸は、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のよ
うなデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもよく、又はリボ核
酸（ＲＮＡ）でもよい。ＤＮＡが好ましい。
【００２５】融合タンパク トキシン、リンフォカイン又はオンコスタチンのような
抗ガン活性を有する第二タンパク質の活性な部分に少な
くとも機能的に結合する変異体ＢＲ９６抗体の抗原結合
領域を少なくとも有する融合タンパクも、同様にインビ
ボにおけるヒト悪性腫瘍の治療に使用することが可能で
ある。さらに、当業者に既知の組み換え技術を、二つの
異なる抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を構築す
るのに使用することができる。二つの異なる抗原のうち
一つは、ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ１００３６から生
産されたモノクローナル抗体ＢＲ９６が結合する（米国
特許第４，４７４，８９３号参照）ものであるが、抗体
と特異的に結合するもう一方は、ＢＲ９６以外の分子の
抗原である。変異体ＢＲ９６の可変領域を含む二重特異
性抗体はこの方法を用いて作製してもよい。
抗ガン活性を有する第二タンパク質の活性な部分に少な
くとも機能的に結合する変異体ＢＲ９６抗体の抗原結合
領域を少なくとも有する融合タンパクも、同様にインビ
ボにおけるヒト悪性腫瘍の治療に使用することが可能で
ある。さらに、当業者に既知の組み換え技術を、二つの
異なる抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を構築す
るのに使用することができる。二つの異なる抗原のうち
一つは、ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ１００３６から生
産されたモノクローナル抗体ＢＲ９６が結合する（米国
特許第４，４７４，８９３号参照）ものであるが、抗体
と特異的に結合するもう一方は、ＢＲ９６以外の分子の
抗原である。変異体ＢＲ９６の可変領域を含む二重特異
性抗体はこの方法を用いて作製してもよい。
【００２６】変異体ＢＲ９６抗体の抗ＩＤ抗体 ＢＲ９６の抗イディオタイプ抗体はすでに作製されてい
る。抗イディオタイプの作製方法は周知である（Farid
and Lo (1985) Anti-idiotypic antibodies asprobes f
or receptor structure and function. Endocr. Rev.
6:1-23参照) 。これらの作製方法は、変異体ＢＲ９６の
抗ｉｄ抗体の作製に使用してもよい。さらに、変異体Ｂ
Ｒ９６抗体の抗イディオタイプ抗体は、活性ガン免疫治
療及びガン治療に用いてもよい（Hellstrom et al., "I
mmmunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclo
nal Antibodies, Tumor Vaccines, And Anti-Idiotype
s", Covalently Modified Antigens And Antibodies In
Diagnosis And Therapy, supra at pp.35-41参照) 。
メトトレキセート及びクロラムブシル(Smyth et al.,
"Specific Targeting of Chlorambucil to Tumors With
the Use of Monoclonal Antibodies", J. Natl. Cance
r Inst., 76:503-510(1986)参照) のような化学療法剤
を用いて、様々なドキソルビシンン(DOX)(Yang and Rei
sfeld "Doxorubicin Conjugated with a Monoclonal An
tibody Directed to a Human Melanoma-Associated Pro
teoglycanSuppresses Growth of Established Tumor Xe
nografts in Nude Mice PNAS (USA)" 85:1189-1193(198
8) 参照) 、ダウノマイシン(Arnon and Sela "In Vitro
and in vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin
With Anti-Tumor Antibodies"Immunol. Rev., 65:5-27
(1982)参照) 及びモルホリノドキソルビシン(Muelleret
al., "Antibody Conjugates With Morpholinodoxorubi
cin and Acid-Cleavable Linkers", Bioconjugate Che
m., 1:325-330(1990) 参照) を含むアンスラサイクリン
類との免疫複合体が既に作製されている。ＢＲ９６とド
キソルビシンの複合体はある種のガン又は悪性腫瘍の治
療に効果があることが示されている（Trail, P.A., Wil
lner, D., Lasch, S. J., Henderson, A.J., Casazza,
A.M., Firestone, R.A., Hellstrom, I., and Hellstro
m,K.E. Cure of xenografted human carcinomas by BR9
6-doxorubicin immunoconjugates. Science, 261:212-2
15, 1993 参照) 。
る。抗イディオタイプの作製方法は周知である（Farid
and Lo (1985) Anti-idiotypic antibodies asprobes f
or receptor structure and function. Endocr. Rev.
6:1-23参照) 。これらの作製方法は、変異体ＢＲ９６の
抗ｉｄ抗体の作製に使用してもよい。さらに、変異体Ｂ
Ｒ９６抗体の抗イディオタイプ抗体は、活性ガン免疫治
療及びガン治療に用いてもよい（Hellstrom et al., "I
mmmunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclo
nal Antibodies, Tumor Vaccines, And Anti-Idiotype
s", Covalently Modified Antigens And Antibodies In
Diagnosis And Therapy, supra at pp.35-41参照) 。
メトトレキセート及びクロラムブシル(Smyth et al.,
"Specific Targeting of Chlorambucil to Tumors With
the Use of Monoclonal Antibodies", J. Natl. Cance
r Inst., 76:503-510(1986)参照) のような化学療法剤
を用いて、様々なドキソルビシンン(DOX)(Yang and Rei
sfeld "Doxorubicin Conjugated with a Monoclonal An
tibody Directed to a Human Melanoma-Associated Pro
teoglycanSuppresses Growth of Established Tumor Xe
nografts in Nude Mice PNAS (USA)" 85:1189-1193(198
8) 参照) 、ダウノマイシン(Arnon and Sela "In Vitro
and in vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin
With Anti-Tumor Antibodies"Immunol. Rev., 65:5-27
(1982)参照) 及びモルホリノドキソルビシン(Muelleret
al., "Antibody Conjugates With Morpholinodoxorubi
cin and Acid-Cleavable Linkers", Bioconjugate Che
m., 1:325-330(1990) 参照) を含むアンスラサイクリン
類との免疫複合体が既に作製されている。ＢＲ９６とド
キソルビシンの複合体はある種のガン又は悪性腫瘍の治
療に効果があることが示されている（Trail, P.A., Wil
lner, D., Lasch, S. J., Henderson, A.J., Casazza,
A.M., Firestone, R.A., Hellstrom, I., and Hellstro
m,K.E. Cure of xenografted human carcinomas by BR9
6-doxorubicin immunoconjugates. Science, 261:212-2
15, 1993 参照) 。
【００２７】本発明の実施態様において、変異体ＢＲ９
６は、天然ＩｇＧ変異体、還元ＩｇＧ変異体、Ｆ（ａ
ｂ’）2 変異体、ｓＦｖ、融合タンパク及びＦａｂ変異
体の形態で用いられてもよい。適する免疫複合治療剤と
しては、天然のＰＥ又はLysPE40 型のシュードモナスエ
キソトキシンＡ（Pseudomonas exotoxin A) （ＰＥ）が
挙げられる。LysPE40は、複合体を作製するためのリシ
ン残基を含む遺伝工学的に修飾したアミノ末端を含むよ
うに切り出された形態である。ドキソルビシンもまた治
療剤に適している。変異体ＢＲ９６の抗原結合領域を毒
性物質とＤＮＡレベルで融合させ、キメラタンパクとし
て毒性分子を作製することにより生産した組み換え免疫
毒性物質を作製するために、当業者に既知の遺伝子工学
技術を以下記載するように使用する。
６は、天然ＩｇＧ変異体、還元ＩｇＧ変異体、Ｆ（ａ
ｂ’）2 変異体、ｓＦｖ、融合タンパク及びＦａｂ変異
体の形態で用いられてもよい。適する免疫複合治療剤と
しては、天然のＰＥ又はLysPE40 型のシュードモナスエ
キソトキシンＡ（Pseudomonas exotoxin A) （ＰＥ）が
挙げられる。LysPE40は、複合体を作製するためのリシ
ン残基を含む遺伝工学的に修飾したアミノ末端を含むよ
うに切り出された形態である。ドキソルビシンもまた治
療剤に適している。変異体ＢＲ９６の抗原結合領域を毒
性物質とＤＮＡレベルで融合させ、キメラタンパクとし
て毒性分子を作製することにより生産した組み換え免疫
毒性物質を作製するために、当業者に既知の遺伝子工学
技術を以下記載するように使用する。
【００２８】これらの融合タンパクは、免疫グロブリン
分子の細胞結合部位の特異性と、毒性物質の細胞毒性活
性を合わせ持つ。好ましい実施態様においては、単純鎖
免疫毒性物質分子であるＢＲ９６ｓＦＶ−ＰＥ４０変異
体は、ＰＥ４０に結合した変異体ＢＲ９６のクローン化
されたＨ鎖又はＬ鎖のＦｖ部位から作製されてもよい。
この単純鎖免疫毒性物質はクローン化及び発現化され
て、ＢＲ９６抗原をその表面に発現する悪性腫瘍細胞に
対して細胞毒性活性を示す。このＢＲ９６ｓＦＶ−ＰＥ
４０変異体のような単純鎖の免疫毒性物質は、単分子と
して発現される。これらは、免疫グロブリンと毒性物質
のタンパク融合により得られる複合体より有利である。
単純鎖毒性物質は、組み換え免疫グロブリンフラグメン
トを作製した後、融合段階は不必要であるため、より簡
単に作製することができる。さらに、同じアミノ酸残基
からなる単一ペプチドなどの相同性分子群を生じる。さ
らに、毒性物質又は薬剤のため、複合体は非複合変異体
ＢＲ９６より活性がある。ＢＲ９６ｓＦＶ−ＰＥ４０変
異体の単純鎖免疫毒性物質に相当するアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列の発現又はクローン化技術、すなわ
ち、オリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ、細胞の形質転
換、ベクターの作製、発現系などは、よく確立されてお
り、特別な条件及び方法に使用する標準資源物質(stand
ard resource material ) は大部分の当業者らに知られ
ている(Sambrook et al., eds., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press (1989) 参照) 。
分子の細胞結合部位の特異性と、毒性物質の細胞毒性活
性を合わせ持つ。好ましい実施態様においては、単純鎖
免疫毒性物質分子であるＢＲ９６ｓＦＶ−ＰＥ４０変異
体は、ＰＥ４０に結合した変異体ＢＲ９６のクローン化
されたＨ鎖又はＬ鎖のＦｖ部位から作製されてもよい。
この単純鎖免疫毒性物質はクローン化及び発現化され
て、ＢＲ９６抗原をその表面に発現する悪性腫瘍細胞に
対して細胞毒性活性を示す。このＢＲ９６ｓＦＶ−ＰＥ
４０変異体のような単純鎖の免疫毒性物質は、単分子と
して発現される。これらは、免疫グロブリンと毒性物質
のタンパク融合により得られる複合体より有利である。
単純鎖毒性物質は、組み換え免疫グロブリンフラグメン
トを作製した後、融合段階は不必要であるため、より簡
単に作製することができる。さらに、同じアミノ酸残基
からなる単一ペプチドなどの相同性分子群を生じる。さ
らに、毒性物質又は薬剤のため、複合体は非複合変異体
ＢＲ９６より活性がある。ＢＲ９６ｓＦＶ−ＰＥ４０変
異体の単純鎖免疫毒性物質に相当するアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡ配列の発現又はクローン化技術、すなわ
ち、オリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ、細胞の形質転
換、ベクターの作製、発現系などは、よく確立されてお
り、特別な条件及び方法に使用する標準資源物質(stand
ard resource material ) は大部分の当業者らに知られ
ている(Sambrook et al., eds., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press (1989) 参照) 。
【００２９】下記のものの作製の詳細を以下に示す。 （１）本発明の単純鎖組み換え免疫毒性物質は、実施例
３及び４に記載され、及び（２）ＢＲ９６ｓＦＶ−ＰＥ
４０変異体融合タンパクは実施例５に記載される。簡単
に述べると、例えば単純鎖変異体ＢＲ９６を構築するに
は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Mullis et al.,
米国特許第４，６８３，１９５号及び米国特許第４，６
８３，２０２号、Mullis and Faloona, Methods Enzymo
l. 154:335-350(1987)参照) をほぼ５５０ｂｐＢＲ９６
ｓＦＶ変異体配列を増幅するために用いる。ＰＣＲは、
ＢＲ９６の配列由来の配列を有し、特にｓＦＶ領域を増
幅するプライマーを使用して行われ、。プライマーはさ
らに次のＰＣＲ生成物をクローン化するのに使用される
制限酵素に対する認識部位を有している。選択された制
限酵素は、増幅される配列内の配列を認識しないもので
ある。
３及び４に記載され、及び（２）ＢＲ９６ｓＦＶ−ＰＥ
４０変異体融合タンパクは実施例５に記載される。簡単
に述べると、例えば単純鎖変異体ＢＲ９６を構築するに
は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Mullis et al.,
米国特許第４，６８３，１９５号及び米国特許第４，６
８３，２０２号、Mullis and Faloona, Methods Enzymo
l. 154:335-350(1987)参照) をほぼ５５０ｂｐＢＲ９６
ｓＦＶ変異体配列を増幅するために用いる。ＰＣＲは、
ＢＲ９６の配列由来の配列を有し、特にｓＦＶ領域を増
幅するプライマーを使用して行われ、。プライマーはさ
らに次のＰＣＲ生成物をクローン化するのに使用される
制限酵素に対する認識部位を有している。選択された制
限酵素は、増幅される配列内の配列を認識しないもので
ある。
【００３０】ＰＣＲ増幅後、約５５０ｂｐフラグメント
が、プライマー内の部位を認識する制限酵素によって、
消化され、標準的な方法を用いてｐＭＳ８（Covellら。
Cancer Res. 46:3969-3978(1986)) のようなＰＥ40遺伝
子をコードして中間ベクターを形成するベクターのフラ
グメントに連結される。変異体ＢＲ９６Ｆｖのフラグメ
ントは中間ベクター内にサブクローン化され、変異体Ｂ
Ｒ９６ｓＦｖ−ＰＥ４０遺伝子の融合体をコードするプ
ラスミドを形成する。構築物は、既知のＤＮＡ配列分析
方法（Sangerら。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463
(1977)及びMessing ら。Nucleic Acids Res. 9:309(198
1)参照)により確認した。変異体ＢＲ９６の発現及び精
製変異体ＢＲ９６をコードするＤＮＡ配列を増殖し、下
記に示す多様な系で発現してもよい。ＤＮＡを適する制
限酵素で中間ベクターから切除して、そのような発現を
行うための適する発現ベクターに連結してもよい。使用
する宿主細胞により、変異体ＢＲ９６は適当なベクター
内にクローン化される。形質転換又はトランスフェクシ
ョンは個々の宿主細胞に適する標準技術を用いて行われ
る。
が、プライマー内の部位を認識する制限酵素によって、
消化され、標準的な方法を用いてｐＭＳ８（Covellら。
Cancer Res. 46:3969-3978(1986)) のようなＰＥ40遺伝
子をコードして中間ベクターを形成するベクターのフラ
グメントに連結される。変異体ＢＲ９６Ｆｖのフラグメ
ントは中間ベクター内にサブクローン化され、変異体Ｂ
Ｒ９６ｓＦｖ−ＰＥ４０遺伝子の融合体をコードするプ
ラスミドを形成する。構築物は、既知のＤＮＡ配列分析
方法（Sangerら。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463
(1977)及びMessing ら。Nucleic Acids Res. 9:309(198
1)参照)により確認した。変異体ＢＲ９６の発現及び精
製変異体ＢＲ９６をコードするＤＮＡ配列を増殖し、下
記に示す多様な系で発現してもよい。ＤＮＡを適する制
限酵素で中間ベクターから切除して、そのような発現を
行うための適する発現ベクターに連結してもよい。使用
する宿主細胞により、変異体ＢＲ９６は適当なベクター
内にクローン化される。形質転換又はトランスフェクシ
ョンは個々の宿主細胞に適する標準技術を用いて行われ
る。
【００３１】原核細胞における変異体ＢＲ９６の発現 原核細胞における変異体ＢＲ９６の発現は、幾つかの目
的から好ましいものである。変異体ＢＲ９６の実施例は
Ｆａｂ、ｓＦｖ、ｓＦｖ−毒性物質を含むｓＦｖ−融合
蛋白を含む。原核生物は、最も多くは細菌の様々な種類
に代表される。細菌はグラム陰性でもグラム陽性菌でも
どちらでもよい。典型的には、E.coli（大腸菌）のよう
なグラム陰性菌が好ましい。他の微生物種もまた使用し
てもよい。変異体ＢＲ９６をコードする配列は、E.coli
のような原核生物の異物(foreign) 配列を発現するよう
にデザインされたベクターに挿入された。これらのベク
ターは通常使用されている原核生物の制御配列を含み、
これは、リボソーム結合部位配列と共に転写開始のプロ
モーターを含むと定義され、オペレーターを含んでもよ
い。これらの通常使用されているプロモーターとして
は、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクト
ース（lac)プロモーター系（Chang ら。Nature198:1056
(1977) 参照）、トリプトファン(trp) プロモーター系
（Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057(1980)
参照) 及びラムダ誘導Ｐl プロモーター及びＮ−遺伝子
リボソーム結合部位（Shimatake et al., Nature 292:1
28(1981)参照) が挙げられる。そのようなベクターは、
複製の起点及び選択的マーカーもまた含んでいる。その
ようなベクターとしては、抗生物質に抵抗力を与えるベ
ータラクタマーゼ又はネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼが挙げられ、これにより、ベクターが細菌中で複
製でき、プラスミドを有する細胞がアンピシリン又はカ
ナマイシンの存在下に成育するとき選択されることがで
きる。発現プラスミドは原核細胞内に、様々な標準的な
方法で導入され、限定されないが、ＣａＣｌ 2 −刺激
（Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1972) 69:2110
及び Sambrooket al., (eds.), Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor
Press, (1989) 参照) 及び電気穿孔法が挙げられる。
的から好ましいものである。変異体ＢＲ９６の実施例は
Ｆａｂ、ｓＦｖ、ｓＦｖ−毒性物質を含むｓＦｖ−融合
蛋白を含む。原核生物は、最も多くは細菌の様々な種類
に代表される。細菌はグラム陰性でもグラム陽性菌でも
どちらでもよい。典型的には、E.coli（大腸菌）のよう
なグラム陰性菌が好ましい。他の微生物種もまた使用し
てもよい。変異体ＢＲ９６をコードする配列は、E.coli
のような原核生物の異物(foreign) 配列を発現するよう
にデザインされたベクターに挿入された。これらのベク
ターは通常使用されている原核生物の制御配列を含み、
これは、リボソーム結合部位配列と共に転写開始のプロ
モーターを含むと定義され、オペレーターを含んでもよ
い。これらの通常使用されているプロモーターとして
は、ベータラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクト
ース（lac)プロモーター系（Chang ら。Nature198:1056
(1977) 参照）、トリプトファン(trp) プロモーター系
（Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057(1980)
参照) 及びラムダ誘導Ｐl プロモーター及びＮ−遺伝子
リボソーム結合部位（Shimatake et al., Nature 292:1
28(1981)参照) が挙げられる。そのようなベクターは、
複製の起点及び選択的マーカーもまた含んでいる。その
ようなベクターとしては、抗生物質に抵抗力を与えるベ
ータラクタマーゼ又はネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼが挙げられ、これにより、ベクターが細菌中で複
製でき、プラスミドを有する細胞がアンピシリン又はカ
ナマイシンの存在下に成育するとき選択されることがで
きる。発現プラスミドは原核細胞内に、様々な標準的な
方法で導入され、限定されないが、ＣａＣｌ 2 −刺激
（Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1972) 69:2110
及び Sambrooket al., (eds.), Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor
Press, (1989) 参照) 及び電気穿孔法が挙げられる。
【００３２】真核細胞における変異体ＢＲ９６の発現 本発明の例に従い、真核細胞もまた宿主細胞として適す
る。真核細胞の例としては、動物細胞、初代又は不死化
した、酵素（例、Saccharomyces cerevisiae, Schizosa
ccharomyces pombe 及びPichia pastoris)及び植物細胞
が挙げられる。ミエローマ、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞は宿
主細胞として使用できる動物細胞の例として挙げられ
る。植物細胞の例としては、タバコ（全植物又はタバコ
のカルス）、とうもろこし、大豆、及び米の細胞が挙げ
られる。とうもろこし、大豆及び米の種もまた使用可能
である。変異体ＢＲ９６をコードする配列は真核生物宿
主における異物(foreign) 配列を発現するようにデザイ
ンされたベクター内に挿入される。ベクターの調節因子
は個々の真核生物宿主により変化する。通常使用される
真核生物の制御配列はプロモーター及び哺乳類の細胞と
適合する制御配列を含み、例えば、ＣＭＶプロモーター
（ＣＤＭ８ベクター）及びアビアンザルコーマ（avian
sarcoma)ウィルス（ＡＳＶ）（πＬＮベクター）が挙げ
られる。他の通常使用されるプロモーターとしては、シ
ミアン(Simian)ウィルス４０（ＳＶ４０）（Fiers, et
al., Nature 273:113(1973) 参照) からの初期又は後期
プロモーター、又は他の、ポリオーマ、アデノウィルス
２及びボバインパピローマウィルスから誘導されたウィ
ルスプロモーターが挙げられる。ｈＭＴＩＩ（Karin, e
t al., Nature, 299:797-802(1982)参照) のような誘導
プロモーターもまた使用してもよい。
る。真核細胞の例としては、動物細胞、初代又は不死化
した、酵素（例、Saccharomyces cerevisiae, Schizosa
ccharomyces pombe 及びPichia pastoris)及び植物細胞
が挙げられる。ミエローマ、ＣＯＳ及びＣＨＯ細胞は宿
主細胞として使用できる動物細胞の例として挙げられ
る。植物細胞の例としては、タバコ（全植物又はタバコ
のカルス）、とうもろこし、大豆、及び米の細胞が挙げ
られる。とうもろこし、大豆及び米の種もまた使用可能
である。変異体ＢＲ９６をコードする配列は真核生物宿
主における異物(foreign) 配列を発現するようにデザイ
ンされたベクター内に挿入される。ベクターの調節因子
は個々の真核生物宿主により変化する。通常使用される
真核生物の制御配列はプロモーター及び哺乳類の細胞と
適合する制御配列を含み、例えば、ＣＭＶプロモーター
（ＣＤＭ８ベクター）及びアビアンザルコーマ（avian
sarcoma)ウィルス（ＡＳＶ）（πＬＮベクター）が挙げ
られる。他の通常使用されるプロモーターとしては、シ
ミアン(Simian)ウィルス４０（ＳＶ４０）（Fiers, et
al., Nature 273:113(1973) 参照) からの初期又は後期
プロモーター、又は他の、ポリオーマ、アデノウィルス
２及びボバインパピローマウィルスから誘導されたウィ
ルスプロモーターが挙げられる。ｈＭＴＩＩ（Karin, e
t al., Nature, 299:797-802(1982)参照) のような誘導
プロモーターもまた使用してもよい。
【００３３】真核生物における変異体ＢＲ９６を発現す
るベクターはまたエンハンサー領域と呼ばれる配列を有
していてもよい。これらは遺伝子発現を最適化するのに
重要であり、プロモーター領域の上流又は下流に存在す
る。変異体ＢＲ９６をコードする配列は真核宿主細胞の
ゲノム内に組み込まれてもよく、宿主ゲノム複製として
複製されてもよい。又は、変異体ＢＲ９６を含むベクタ
ーは、染色体外複製を起こす複製の起点を含んでいても
よい。Saccharomoyces cerevisiae の配列を発現するた
めに、内在性酵素プラスミドからの複製の起点である２
μの環を使用することができる（Broach, Meth. Enz.10
1:307(1983)参照) 。又は自律的な複製をプロモートし
得る酵素のゲノムの配列を使用してもよい（例として、
Stinchomb et al., Nature 282:39 (1979)、Tschemper
et al., Gene 10:157(1980) 及びClarke et al., Meth.
Enz. 101:300(1983)参照) 。酵素ベクターの転写制御
配列は解糖酵素合成のプロモーターを含む（Hess eta
l., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968) 、Holland et
al., Biochemistry 17:4900(1978)参照）。当業者に知
られている他のプロモーターとしては、ＣＤＭ８ベクタ
ー内から得られるＣＭＶプロモーター（Toyama and Oka
yama, FEBS 268:217-221 (1990))、３−ホスホグリセレ
ートキナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol.Chem. 255:20
73(1980))、及び他の解糖酵素のプロモーターが挙げら
れる。
るベクターはまたエンハンサー領域と呼ばれる配列を有
していてもよい。これらは遺伝子発現を最適化するのに
重要であり、プロモーター領域の上流又は下流に存在す
る。変異体ＢＲ９６をコードする配列は真核宿主細胞の
ゲノム内に組み込まれてもよく、宿主ゲノム複製として
複製されてもよい。又は、変異体ＢＲ９６を含むベクタ
ーは、染色体外複製を起こす複製の起点を含んでいても
よい。Saccharomoyces cerevisiae の配列を発現するた
めに、内在性酵素プラスミドからの複製の起点である２
μの環を使用することができる（Broach, Meth. Enz.10
1:307(1983)参照) 。又は自律的な複製をプロモートし
得る酵素のゲノムの配列を使用してもよい（例として、
Stinchomb et al., Nature 282:39 (1979)、Tschemper
et al., Gene 10:157(1980) 及びClarke et al., Meth.
Enz. 101:300(1983)参照) 。酵素ベクターの転写制御
配列は解糖酵素合成のプロモーターを含む（Hess eta
l., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968) 、Holland et
al., Biochemistry 17:4900(1978)参照）。当業者に知
られている他のプロモーターとしては、ＣＤＭ８ベクタ
ー内から得られるＣＭＶプロモーター（Toyama and Oka
yama, FEBS 268:217-221 (1990))、３−ホスホグリセレ
ートキナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol.Chem. 255:20
73(1980))、及び他の解糖酵素のプロモーターが挙げら
れる。
【００３４】他のプロモーターは、環境的な刺激又は細
胞の育成培地により調節することができるので、誘導可
能である。これらの誘導プロモーターは、熱刺激プロテ
イン、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロー
ムＣ、酸ホスファターゼ、窒素の異化作用を伴う酵素並
びにマルトース及びガラクトースを使用する酵素の遺伝
子からのプロモーターを含む。制御配列はまたコード配
列の３′に位置していてもよい。これらの配列はメッセ
ンジャーＲＮＡを安定化する働きをしている。そのよう
なターミネーターは、幾つかの酵素誘導及び哺乳類の遺
伝子のコード配列が続く非翻訳領域の３′において見ら
れる。植物及び植物細胞のベクターとしては、限定され
るものではないが、アグロバクテリウムＴi プラスミ
ド、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）、トマ
ト金色モザイクウィルス（ＴＧＭＶ）が挙げられる。哺
乳類細胞宿主系形質転換の一般的な観点は、Axelにより
既に述べられている（米国特許第４，３９９，２１６
号、８月１６日、１９８６年）。哺乳類の細胞は、限定
されるものではないが、リン酸カルシウムの存在下にお
けるトランスフェクション、マイクロインジェクショ
ン、電気穿孔又はウィルスベクターとの形質導入等を含
む方法により形質転換される。
胞の育成培地により調節することができるので、誘導可
能である。これらの誘導プロモーターは、熱刺激プロテ
イン、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロー
ムＣ、酸ホスファターゼ、窒素の異化作用を伴う酵素並
びにマルトース及びガラクトースを使用する酵素の遺伝
子からのプロモーターを含む。制御配列はまたコード配
列の３′に位置していてもよい。これらの配列はメッセ
ンジャーＲＮＡを安定化する働きをしている。そのよう
なターミネーターは、幾つかの酵素誘導及び哺乳類の遺
伝子のコード配列が続く非翻訳領域の３′において見ら
れる。植物及び植物細胞のベクターとしては、限定され
るものではないが、アグロバクテリウムＴi プラスミ
ド、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）、トマ
ト金色モザイクウィルス（ＴＧＭＶ）が挙げられる。哺
乳類細胞宿主系形質転換の一般的な観点は、Axelにより
既に述べられている（米国特許第４，３９９，２１６
号、８月１６日、１９８６年）。哺乳類の細胞は、限定
されるものではないが、リン酸カルシウムの存在下にお
けるトランスフェクション、マイクロインジェクショ
ン、電気穿孔又はウィルスベクターとの形質導入等を含
む方法により形質転換される。
【００３５】異物（foreign)ＤＮＡ配列を植物及び酵素
のゲノムに導入する方法は、（１）単細胞又はプロトプ
ラストへのＤＮＡのマイクロインジェクション、ＤＮＡ
存在下に細胞をガラスビーズと共に攪拌する、又はＤＮ
Ａ被膜したタングステン又は金の球を細胞又はプロトプ
ラストへ打ち込む等の機械的な方法、（２）ポリエチレ
ングリコール処理によりマクロ分子へプロトプラストを
浸透させることによりＤＮＡを挿入するか、高圧電気パ
ルスを与える（電気穿孔）、又は（３）プロトプラスト
に融合するリポゾーム（ｃＤＮＡ含有）を使用する方法
が挙げられる。変異体ＢＲ９６の確認及び回収変異体Ｂ
Ｒ９６の発現はクーマシー(Coomassie) で着色したＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ及びＢＲ９６に結合する抗イデオタイプの
抗体、又は変異体ＢＲ９６免疫複合体の場合には、複合
体の非変異体ＢＲ９６部分に結合する抗体を使用したイ
ムノブロット法で検出される。タンパクの回収は標準タ
ンパク精製法、例えば、アフィニティクロマトグラフィ
ー又はイオン交換クロマトグラフィーによる方法で行わ
れ、実質的に純粋な生成物を与える（R. Scopes Protei
n Purification, Principles and Practice, Third Edi
tion Springer-Verlag (1994) 参照) 。
のゲノムに導入する方法は、（１）単細胞又はプロトプ
ラストへのＤＮＡのマイクロインジェクション、ＤＮＡ
存在下に細胞をガラスビーズと共に攪拌する、又はＤＮ
Ａ被膜したタングステン又は金の球を細胞又はプロトプ
ラストへ打ち込む等の機械的な方法、（２）ポリエチレ
ングリコール処理によりマクロ分子へプロトプラストを
浸透させることによりＤＮＡを挿入するか、高圧電気パ
ルスを与える（電気穿孔）、又は（３）プロトプラスト
に融合するリポゾーム（ｃＤＮＡ含有）を使用する方法
が挙げられる。変異体ＢＲ９６の確認及び回収変異体Ｂ
Ｒ９６の発現はクーマシー(Coomassie) で着色したＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ及びＢＲ９６に結合する抗イデオタイプの
抗体、又は変異体ＢＲ９６免疫複合体の場合には、複合
体の非変異体ＢＲ９６部分に結合する抗体を使用したイ
ムノブロット法で検出される。タンパクの回収は標準タ
ンパク精製法、例えば、アフィニティクロマトグラフィ
ー又はイオン交換クロマトグラフィーによる方法で行わ
れ、実質的に純粋な生成物を与える（R. Scopes Protei
n Purification, Principles and Practice, Third Edi
tion Springer-Verlag (1994) 参照) 。
【００３６】組み換え変異体ＢＲ９６免疫性毒性物質
は、ｓＦｖ毒性物質を分泌させるシグナル配列と共に生
産されてもよい。シグナル配列は、宿主細胞がこの配列
をプロセシングできるように選択される。原核生物の宿
主における発現では、シグナルはさらにｓＦｖ毒性物質
を細胞周辺腔に融合させるように選択されてもよい。ま
た、タンパクはシグナル配列を伴わずに生産されてもよ
く、細胞質から回収され、尿素のような変性剤を使用し
て再生し、生物学的に活性な物質（タンパク又は抗体）
を得てもよい。免疫性毒性物質は、アニオン交換及びゲ
ル濾過クロマトグラフィーのような標準的なタンパク精
製法を用いて回収してもよい（Siegall etal., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 85:9738-9742 (1988)参照) 。 作製方法 ＬｅY 抗原に対する増加した親和性を有する変異体ＢＲ
９６をコードするＤＮＡ配列を、次の方法で構築し、単
離した。基本的な方法は、ＶH 及びＶL 鎖のＣＤＲにお
ける変異体を含有する変質したＢＲ９６分子を構築し、
次にこれらの変異体のうちどちらがＬｅY 抗原に対して
増強された結合を示すか確かめた。これを行うために、
相補性決定領域のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオ
チドの混合物をアニーリングして、失活したＶL及びＶ
H ＢＲ９６コード配列を有する一本鎖テンプレートにし
た。変異したＣＤＲ領域をコードするアニーリングを行
ったオリゴヌクレオチドと共にテンプレート鎖をＤＮＡ
ポリメラーゼ及びリパーゼで二重鎖に変換した。連結生
成物は次にE.coliに形質転換し、形質転換物をＬｅY に
対する反応性に対してスクリーニングした。
は、ｓＦｖ毒性物質を分泌させるシグナル配列と共に生
産されてもよい。シグナル配列は、宿主細胞がこの配列
をプロセシングできるように選択される。原核生物の宿
主における発現では、シグナルはさらにｓＦｖ毒性物質
を細胞周辺腔に融合させるように選択されてもよい。ま
た、タンパクはシグナル配列を伴わずに生産されてもよ
く、細胞質から回収され、尿素のような変性剤を使用し
て再生し、生物学的に活性な物質（タンパク又は抗体）
を得てもよい。免疫性毒性物質は、アニオン交換及びゲ
ル濾過クロマトグラフィーのような標準的なタンパク精
製法を用いて回収してもよい（Siegall etal., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 85:9738-9742 (1988)参照) 。 作製方法 ＬｅY 抗原に対する増加した親和性を有する変異体ＢＲ
９６をコードするＤＮＡ配列を、次の方法で構築し、単
離した。基本的な方法は、ＶH 及びＶL 鎖のＣＤＲにお
ける変異体を含有する変質したＢＲ９６分子を構築し、
次にこれらの変異体のうちどちらがＬｅY 抗原に対して
増強された結合を示すか確かめた。これを行うために、
相補性決定領域のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオ
チドの混合物をアニーリングして、失活したＶL及びＶ
H ＢＲ９６コード配列を有する一本鎖テンプレートにし
た。変異したＣＤＲ領域をコードするアニーリングを行
ったオリゴヌクレオチドと共にテンプレート鎖をＤＮＡ
ポリメラーゼ及びリパーゼで二重鎖に変換した。連結生
成物は次にE.coliに形質転換し、形質転換物をＬｅY に
対する反応性に対してスクリーニングした。
【００３７】次のセクションで、ＶH 及びＶL ＢＲ９６
コードＤＮＡ配列を有するＭ−１３誘導親免疫発現ベク
ターの構築及びＣＤＲ領域で配列変異体を構築する方法
の詳細について述べる。 １．ＶH 及びＶL ＢＲ９６領域を有するＭ１３免疫発現
ベクターの構築 失活したＢＲ９６コード配列は、ＣＤＲ領域に挿入され
て異性化される早期停止コドンを含有するものである。
そのような配列は機能性タンパクを生成しないため、Ｌ
ｅY 抗原に結合しない。これは、停止コドンを置換し、
ＬｅY −結合タンパクを生成する変質化した配列のみが
検出されるので、変異体のスクリーニングを簡単にし
た。Ｍ１３は、次の突然変異誘発段階において一重鎖Ｄ
ＮＡを単離するのに必要なため、クローン化したベクタ
ーとして使用した。特に、親分子に相当するＤＮＡ鎖と
新規な配列を有するＤＮＡ鎖とを区別するのに好まし
い。ＶH 又はＶL ＢＲ９６配列をＭ１３ベクター内に、
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリッド形成突
然変異誘発法を使用して挿入した。この方法は、一つの
ＤＮＡ分子と第二の相同配列のものとの置換を可能にす
る（Near, R. 1992.Biotechniques 11:88-97)。ＰＣＲ
は、インビトロにおける核酸合成法であり、これによ
り、ＤＮＡの特定のセグメントを特異的に複製すること
ができる。ＰＣＲ法は、ＤＮＡフラグメントを横に配列
して、ＤＮＡの変性サイクルを増幅し、繰り返す二種類
のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、プライマーを
その相補配列にアニーリングすること、及びアニーリン
グしたプライマーをＤＮＡポリメラーゼと共に伸長する
ことを含む。
コードＤＮＡ配列を有するＭ−１３誘導親免疫発現ベク
ターの構築及びＣＤＲ領域で配列変異体を構築する方法
の詳細について述べる。 １．ＶH 及びＶL ＢＲ９６領域を有するＭ１３免疫発現
ベクターの構築 失活したＢＲ９６コード配列は、ＣＤＲ領域に挿入され
て異性化される早期停止コドンを含有するものである。
そのような配列は機能性タンパクを生成しないため、Ｌ
ｅY 抗原に結合しない。これは、停止コドンを置換し、
ＬｅY −結合タンパクを生成する変質化した配列のみが
検出されるので、変異体のスクリーニングを簡単にし
た。Ｍ１３は、次の突然変異誘発段階において一重鎖Ｄ
ＮＡを単離するのに必要なため、クローン化したベクタ
ーとして使用した。特に、親分子に相当するＤＮＡ鎖と
新規な配列を有するＤＮＡ鎖とを区別するのに好まし
い。ＶH 又はＶL ＢＲ９６配列をＭ１３ベクター内に、
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリッド形成突
然変異誘発法を使用して挿入した。この方法は、一つの
ＤＮＡ分子と第二の相同配列のものとの置換を可能にす
る（Near, R. 1992.Biotechniques 11:88-97)。ＰＣＲ
は、インビトロにおける核酸合成法であり、これによ
り、ＤＮＡの特定のセグメントを特異的に複製すること
ができる。ＰＣＲ法は、ＤＮＡフラグメントを横に配列
して、ＤＮＡの変性サイクルを増幅し、繰り返す二種類
のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、プライマーを
その相補配列にアニーリングすること、及びアニーリン
グしたプライマーをＤＮＡポリメラーゼと共に伸長する
ことを含む。
【００３８】これらのプライマーはターゲット配列と反
対の鎖にハイブリダイズし、ポリメラーゼによるＤＮＡ
合成が、プライマーの間の領域を横切るように進行する
ように配向される。伸長生成物それ自身はまた相補性で
あり、かつプライマーに結合可能であり、続く増幅サイ
クルは、前サイクルで合成されたターゲットＤＮＡの量
の２倍であることが必要である。ＰＣＲ増幅による生成
物は、ハイブリッド形成突然変異誘発と呼ばれる方法に
より第二のベクター内に再クローン化することができ
る。この方法は、受容ベクターがドナーＰＣＲ増幅ＶH
及びＶL 配列に相同である領域を有することが必要であ
る。受容ベクターはまた、一重鎖ＤＮＡ形態で存在しな
ければならない。ドナー増幅配列は、リン酸化され、変
質され、及び次にドナーテンプレートにアニーリングさ
れる。ＤＮＡポリメラーゼにより鎖の伸長及び連結後、
得られた連結生成物はE.coli内に導入され、目的の組み
換え物が同一であると確認された。供給された配列を組
み入れた組み換え物を回収するという好ましい方法へ、
片寄らせるために、宿主テンプレートはdut - ung - E.
coli種の中で作製される。これらの変異体を含む種は、
チミジンではなくウラシルをＤＮＡ分子内に組み入れ
る。ＤＮＡ分子がdut + ung + 種内に再導入されると、
ウラシル含有ＤＮＡは分解する。このように、ＰＣＲ増
幅ＶL 及び／又はＶH ＢＲ９６配列からのドナー鎖のみ
が複製する。
対の鎖にハイブリダイズし、ポリメラーゼによるＤＮＡ
合成が、プライマーの間の領域を横切るように進行する
ように配向される。伸長生成物それ自身はまた相補性で
あり、かつプライマーに結合可能であり、続く増幅サイ
クルは、前サイクルで合成されたターゲットＤＮＡの量
の２倍であることが必要である。ＰＣＲ増幅による生成
物は、ハイブリッド形成突然変異誘発と呼ばれる方法に
より第二のベクター内に再クローン化することができ
る。この方法は、受容ベクターがドナーＰＣＲ増幅ＶH
及びＶL 配列に相同である領域を有することが必要であ
る。受容ベクターはまた、一重鎖ＤＮＡ形態で存在しな
ければならない。ドナー増幅配列は、リン酸化され、変
質され、及び次にドナーテンプレートにアニーリングさ
れる。ＤＮＡポリメラーゼにより鎖の伸長及び連結後、
得られた連結生成物はE.coli内に導入され、目的の組み
換え物が同一であると確認された。供給された配列を組
み入れた組み換え物を回収するという好ましい方法へ、
片寄らせるために、宿主テンプレートはdut - ung - E.
coli種の中で作製される。これらの変異体を含む種は、
チミジンではなくウラシルをＤＮＡ分子内に組み入れ
る。ＤＮＡ分子がdut + ung + 種内に再導入されると、
ウラシル含有ＤＮＡは分解する。このように、ＰＣＲ増
幅ＶL 及び／又はＶH ＢＲ９６配列からのドナー鎖のみ
が複製する。
【００３９】親Ｍ１３ベクターであるＭ１３ＩＸＬ６０
４がＬ６抗体をコードする配列を含み、Ｌ６はＢＲ９６
に高い割合で相同性であるので、本発明では、相同性の
要求は満たされている。ＶL 及びＶH セグメントをハイ
ブリッド形成突然変異誘発により導入することの第一の
利点は、従来のＤＮＡ連結方法で行われているように、
制限エンドヌクレアーゼ部位が、クローン化のためにＶ
H 又はＶL 遺伝子配列に組み込まれている必要が無いこ
とである。これは、抗原結合に悪影響し得る制限部位に
よりコードされたアミノ酸残基の導入の可能性を排除す
る。ＶL 及びＶH ＢＲ９６鎖配列は、ＰＣＲ法を用いて
増幅し、完全長の生成物をアクリルアミドゲルから回収
した。生成物は、リン酸化され、変質され、及び次にＬ
６配列である、Ｍ１３ＩＸＬ６０４を有する一重鎖ＤＮ
Ａテンプレートにアニーリングされた。Ｍ１３ＩＸＬ６
０４テンプレートは、dut - ung - E.coli種から単離さ
れた。Ｍ１３ＩＸＬ６０４テンプレート上のアニーリン
グをしたＢＲ９６配列を用いてＤＮＡ合成及び連結を行
った後、連結生成物は、dut + ung + 種内に導入され
た。ＰＣＲ法及びそれに続くハイブリッド形成突然変異
誘発法により増幅されたＶ L 及びＶH 配列の導入は、抗
体をコードする配列を、効果的なＦａｂ発現のために必
要なＭ１３ベクターの調節因子でフレーム中に位置決め
した。
４がＬ６抗体をコードする配列を含み、Ｌ６はＢＲ９６
に高い割合で相同性であるので、本発明では、相同性の
要求は満たされている。ＶL 及びＶH セグメントをハイ
ブリッド形成突然変異誘発により導入することの第一の
利点は、従来のＤＮＡ連結方法で行われているように、
制限エンドヌクレアーゼ部位が、クローン化のためにＶ
H 又はＶL 遺伝子配列に組み込まれている必要が無いこ
とである。これは、抗原結合に悪影響し得る制限部位に
よりコードされたアミノ酸残基の導入の可能性を排除す
る。ＶL 及びＶH ＢＲ９６鎖配列は、ＰＣＲ法を用いて
増幅し、完全長の生成物をアクリルアミドゲルから回収
した。生成物は、リン酸化され、変質され、及び次にＬ
６配列である、Ｍ１３ＩＸＬ６０４を有する一重鎖ＤＮ
Ａテンプレートにアニーリングされた。Ｍ１３ＩＸＬ６
０４テンプレートは、dut - ung - E.coli種から単離さ
れた。Ｍ１３ＩＸＬ６０４テンプレート上のアニーリン
グをしたＢＲ９６配列を用いてＤＮＡ合成及び連結を行
った後、連結生成物は、dut + ung + 種内に導入され
た。ＰＣＲ法及びそれに続くハイブリッド形成突然変異
誘発法により増幅されたＶ L 及びＶH 配列の導入は、抗
体をコードする配列を、効果的なＦａｂ発現のために必
要なＭ１３ベクターの調節因子でフレーム中に位置決め
した。
【００４０】２．抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする単一
Ｍ１３構築物を生成させるための受容ベクターの作製。 受容ベクターとして用いられるＭ１３ファージであるＭ
１３ＩＸＬ６０４は、ＢＲ９６の可変領域を導入する前
にＶL 及びＶH のＣＤＲ内に削除及び停止コドンを導入
することにより、簡単に抗体又はタンパクの発現をしな
くなる。これは、ＢＲ９６配列を組み込んだ組み換え物
のみが機能性タンパクを発現するため、簡単なスクリー
ニングを与えた。ＢＲ９６ＶL 鎖配列がＭ１３ＩＸＬ６
０４ベクターに伝達された組み換え物は、形質転換物
を、ヒト抗κＬ鎖抗体に対する活性をスクリーニングす
ることにより、同一物と確認された。この抗体は、失活
したＬ６ではなく、変異体ＢＲ９６Ｌ鎖を認識する。Ｍ
１３ＩＸＢＲ９６ＶL −２のようなクローンは、同一物
と確認され、ＤＮＡ配列により構造が正しいことを確認
された。ＢＲ９６ＶH 配列は次に、ＰＣＲ法及び上記に
述べたハイブリッド形成突然変異誘発法によりＭ１３Ｉ
ＸＢＲ９６ＶL 一重鎖ＤＮＡを作製した、dut - ung -
に導入された。
Ｍ１３構築物を生成させるための受容ベクターの作製。 受容ベクターとして用いられるＭ１３ファージであるＭ
１３ＩＸＬ６０４は、ＢＲ９６の可変領域を導入する前
にＶL 及びＶH のＣＤＲ内に削除及び停止コドンを導入
することにより、簡単に抗体又はタンパクの発現をしな
くなる。これは、ＢＲ９６配列を組み込んだ組み換え物
のみが機能性タンパクを発現するため、簡単なスクリー
ニングを与えた。ＢＲ９６ＶL 鎖配列がＭ１３ＩＸＬ６
０４ベクターに伝達された組み換え物は、形質転換物
を、ヒト抗κＬ鎖抗体に対する活性をスクリーニングす
ることにより、同一物と確認された。この抗体は、失活
したＬ６ではなく、変異体ＢＲ９６Ｌ鎖を認識する。Ｍ
１３ＩＸＢＲ９６ＶL −２のようなクローンは、同一物
と確認され、ＤＮＡ配列により構造が正しいことを確認
された。ＢＲ９６ＶH 配列は次に、ＰＣＲ法及び上記に
述べたハイブリッド形成突然変異誘発法によりＭ１３Ｉ
ＸＢＲ９６ＶL 一重鎖ＤＮＡを作製した、dut - ung -
に導入された。
【００４１】ＢＲ９６ＶH 配列をＢＲ９６ＶL −２に組
み入れた組み換え物は、デカペプチドTyr Pro Tyr Asp
Val Pro Asp Tyr Ala Ser を認識するマウスモノクロー
ナル抗体に対する活性をスクリーニングすることによ
り、同一物と確認した。この配列は、早期停止コドンの
下流をコードしているため、ＢＲ９６ＶL −２親におい
て発現されない。しかし、早期停止コドンが適する読み
込みフレーム内に挿入されたＢＲ９６ＶH 配列により置
換されれば、発現される。記載した配列を持つデカペプ
チド以外の標識も存在し、同じ目的に使用できること
は、当業者らに明らかである。Ｍ１３ＩＸＢＲ９６１
３．２４発現タンパクがＢＲ９６と反応性の既知のもの
と反応性であることを確認するために、E.coli内で発現
させ、Ｆａｂ分子を単離した。これらは、ＬｅY を発現
する胸部腺ガン細胞系であるＨ３３９６に特異的に結合
することが見出された。ＢＲ９６の改質を行うベクター
の構築の最終段階において、Ｍ１３ＩＸＢＲ９６１３．
２４におけるＶL 及びＶH 配列は、削除及び早期停止コ
ドンを部位特異性突然変異誘発法を用いて各鎖の各ＣＤ
Ｒ領域内に導入することにより、失活した。親ベクター
はそのためＬｅY −反応性抗体を発現し、改質された親
和性を有する変異体のスクリーニングは簡単になる。
み入れた組み換え物は、デカペプチドTyr Pro Tyr Asp
Val Pro Asp Tyr Ala Ser を認識するマウスモノクロー
ナル抗体に対する活性をスクリーニングすることによ
り、同一物と確認した。この配列は、早期停止コドンの
下流をコードしているため、ＢＲ９６ＶL −２親におい
て発現されない。しかし、早期停止コドンが適する読み
込みフレーム内に挿入されたＢＲ９６ＶH 配列により置
換されれば、発現される。記載した配列を持つデカペプ
チド以外の標識も存在し、同じ目的に使用できること
は、当業者らに明らかである。Ｍ１３ＩＸＢＲ９６１
３．２４発現タンパクがＢＲ９６と反応性の既知のもの
と反応性であることを確認するために、E.coli内で発現
させ、Ｆａｂ分子を単離した。これらは、ＬｅY を発現
する胸部腺ガン細胞系であるＨ３３９６に特異的に結合
することが見出された。ＢＲ９６の改質を行うベクター
の構築の最終段階において、Ｍ１３ＩＸＢＲ９６１３．
２４におけるＶL 及びＶH 配列は、削除及び早期停止コ
ドンを部位特異性突然変異誘発法を用いて各鎖の各ＣＤ
Ｒ領域内に導入することにより、失活した。親ベクター
はそのためＬｅY −反応性抗体を発現し、改質された親
和性を有する変異体のスクリーニングは簡単になる。
【００４２】３．コドン−ベースの突然変異誘導された
ＢＲ９６のライブラリーの構築 ＬｅY 抗原に対して改質された親和性を有する変異体Ｂ
Ｒ９６の合成及びスクリーニングを行うため、二段階の
方法を用いた。実験は、最初にＶL 及びＶH コードＣＤ
Ｒ領域で変異体の多くのライブラリーを作製し、次にこ
れらをＬｅY 抗原に対する複製フィルターリフトアッセ
イを用いてスクリーニングし、次にＢＲ９６抗原に対す
る改質された反応性を有する変異体を確認するためにＨ
３３９６ガン細胞に対し、ＥＬＩＳＡ法によりスクリー
ニングを行った。ＣＤＲライブラリーはコドン−ベース
突然変異誘発法と呼ばれる方法を用いて構築した(Glase
r, S. M., et al., 1992, J. Immunol. 149:3903-391
3)。この方法は幾つかの理由から選択された。第一に、
この方法は、最小限の情報でよい。コドン−ベース突然
変異誘発法において必要なのは、変異化するべきプライ
マリーＤＮＡ配列及びターゲット抗原の機能アッセイの
知識のみである。コドン−ベース突然変異誘発法は、予
め構造情報は必要なく、望ましい結果を得るために特別
なアミノ酸置換も必要としない。勿論、構造情報が存在
する場合には、コドン−ベース突然変異誘発法のデザイ
ンに利用することができる。コドン−ベースオリゴヌク
レオチド合成は、Ｈ鎖又はＬ鎖ＣＤＲ内で、選択したタ
ーゲットコドンの数に相当する多数の完全にランダムな
ＤＮＡ配列を与えてもよい。
ＢＲ９６のライブラリーの構築 ＬｅY 抗原に対して改質された親和性を有する変異体Ｂ
Ｒ９６の合成及びスクリーニングを行うため、二段階の
方法を用いた。実験は、最初にＶL 及びＶH コードＣＤ
Ｒ領域で変異体の多くのライブラリーを作製し、次にこ
れらをＬｅY 抗原に対する複製フィルターリフトアッセ
イを用いてスクリーニングし、次にＢＲ９６抗原に対す
る改質された反応性を有する変異体を確認するためにＨ
３３９６ガン細胞に対し、ＥＬＩＳＡ法によりスクリー
ニングを行った。ＣＤＲライブラリーはコドン−ベース
突然変異誘発法と呼ばれる方法を用いて構築した(Glase
r, S. M., et al., 1992, J. Immunol. 149:3903-391
3)。この方法は幾つかの理由から選択された。第一に、
この方法は、最小限の情報でよい。コドン−ベース突然
変異誘発法において必要なのは、変異化するべきプライ
マリーＤＮＡ配列及びターゲット抗原の機能アッセイの
知識のみである。コドン−ベース突然変異誘発法は、予
め構造情報は必要なく、望ましい結果を得るために特別
なアミノ酸置換も必要としない。勿論、構造情報が存在
する場合には、コドン−ベース突然変異誘発法のデザイ
ンに利用することができる。コドン−ベースオリゴヌク
レオチド合成は、Ｈ鎖又はＬ鎖ＣＤＲ内で、選択したタ
ーゲットコドンの数に相当する多数の完全にランダムな
ＤＮＡ配列を与えてもよい。
【００４３】可能な変異体の数は非常に多いため、異性
化するべき位置の数を制限することが好ましい。好まし
くは、溶媒が近づきやすく、従って抗原が近づきやすい
ＣＤＲループの領域のみをコドン−ベース突然変異誘発
法により変異化するのがよい。ＣＤＲループとフレーム
ワーク残基の間の分岐点のような分子の他の領域はルー
プの配向を改良するのに重要である。コドン−ベース突
然変異誘発法による第二の利点は、各コドンにおける全
てのアミノ酸を含む変異体が作製できる点にある。コド
ン−ベース突然変異誘発法は、個々のヌクレオチドでは
なく全体のコドンを置換するものである。その技術は、
突然変異誘発の方法がトリヌクレオチドＤＮＡ配列ＸＸ
Ｇ／Ｔの置換にベースを置くものである時、すなわち、
この配列における３２の活性なコドンが、全ての２０の
アミノ酸及び一つの停止コドンをコードしているとき特
に効果的である。このように、異性化はヌクレオチドを
ランダムな導入よりもより効果的に導入する。ＢＲ９６
ＶL 及びＶH のＣＤＲ領域にコドン−ベース突然変異誘
発法を用いるためには、どのＣＤＲ領域を異性化し、ど
のような範囲で領域を変異化するか決定することが必要
であった。ＣＤＲの各コドンにおける５０％の置換率は
任意に選ばれた。ＣＤＲループ内のどのコドンを異性化
するかという選択はＢＲ９６のコンピューターモデルに
基づき行った。
化するべき位置の数を制限することが好ましい。好まし
くは、溶媒が近づきやすく、従って抗原が近づきやすい
ＣＤＲループの領域のみをコドン−ベース突然変異誘発
法により変異化するのがよい。ＣＤＲループとフレーム
ワーク残基の間の分岐点のような分子の他の領域はルー
プの配向を改良するのに重要である。コドン−ベース突
然変異誘発法による第二の利点は、各コドンにおける全
てのアミノ酸を含む変異体が作製できる点にある。コド
ン−ベース突然変異誘発法は、個々のヌクレオチドでは
なく全体のコドンを置換するものである。その技術は、
突然変異誘発の方法がトリヌクレオチドＤＮＡ配列ＸＸ
Ｇ／Ｔの置換にベースを置くものである時、すなわち、
この配列における３２の活性なコドンが、全ての２０の
アミノ酸及び一つの停止コドンをコードしているとき特
に効果的である。このように、異性化はヌクレオチドを
ランダムな導入よりもより効果的に導入する。ＢＲ９６
ＶL 及びＶH のＣＤＲ領域にコドン−ベース突然変異誘
発法を用いるためには、どのＣＤＲ領域を異性化し、ど
のような範囲で領域を変異化するか決定することが必要
であった。ＣＤＲの各コドンにおける５０％の置換率は
任意に選ばれた。ＣＤＲループ内のどのコドンを異性化
するかという選択はＢＲ９６のコンピューターモデルに
基づき行った。
【００４４】ＣＤＲループ内の新規なアミノ酸配列をコ
ードするコドンの集合の合成は、二種類のＤＮＡ合成カ
ラムのうちのどちらか一つに配置されたビーズ上で行わ
れた。ビーズは、初期のオリゴヌクレオチドを二つのカ
ラムの間に簡単に移動することを可能にした。合成は次
のように行った（図７）。 １．前もって決定したトリヌクレオチド又は選択した位
置で見出された“親”コドン配列のトリヌクレオチドを
カラム１で合成した。 ２．ランダムＸＸＧ／Ｔコドンのトリヌクレオチド（Ｘ
は、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、及びＴシアノエチルホスホルア
ミダイトの混合物を表し、及びＧ／Ｔは、ｄＧ及びｄＣ
シアノエチルホスホルアミダイトの混合物を表す）をカ
ラム２で合成した。 ３．各コドンの合成後、二つのカラムからのビーズを混
合した。 ４．混合したビーズを半分に分けた。 ５．各半量のビーズを新しいカラムに積載した。 ６．カラムをＤＮＡ合成機に戻し、続くＣＤＲの配置の
ために段階１〜4 を繰り返した。 ７．最終合成段階後、二つのカラムのプールの含有物を
プールし、オリゴヌクレオチドを回収し、精製した。 得られたオリゴヌクレオチドをＢＲ９６のＶL 及びＶH
ＣＤＲｓを突然変異化するために使用した。ＢＲ９６の
全６種類のコドン−ベースの突然変異化ライブラリーを
構築した。各ライブラリーは、異なる突然変異化された
ＣＤＲを含有している。これらの合成オリゴヌクレオチ
ドは、ＢＲ９６イムノグロブリンの可変Ｌ又はＨ鎖を有
する親ファージの相補的配向性における全ての可能な目
的の変異体を含むようにデザインされている。
ードするコドンの集合の合成は、二種類のＤＮＡ合成カ
ラムのうちのどちらか一つに配置されたビーズ上で行わ
れた。ビーズは、初期のオリゴヌクレオチドを二つのカ
ラムの間に簡単に移動することを可能にした。合成は次
のように行った（図７）。 １．前もって決定したトリヌクレオチド又は選択した位
置で見出された“親”コドン配列のトリヌクレオチドを
カラム１で合成した。 ２．ランダムＸＸＧ／Ｔコドンのトリヌクレオチド（Ｘ
は、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、及びＴシアノエチルホスホルア
ミダイトの混合物を表し、及びＧ／Ｔは、ｄＧ及びｄＣ
シアノエチルホスホルアミダイトの混合物を表す）をカ
ラム２で合成した。 ３．各コドンの合成後、二つのカラムからのビーズを混
合した。 ４．混合したビーズを半分に分けた。 ５．各半量のビーズを新しいカラムに積載した。 ６．カラムをＤＮＡ合成機に戻し、続くＣＤＲの配置の
ために段階１〜4 を繰り返した。 ７．最終合成段階後、二つのカラムのプールの含有物を
プールし、オリゴヌクレオチドを回収し、精製した。 得られたオリゴヌクレオチドをＢＲ９６のＶL 及びＶH
ＣＤＲｓを突然変異化するために使用した。ＢＲ９６の
全６種類のコドン−ベースの突然変異化ライブラリーを
構築した。各ライブラリーは、異なる突然変異化された
ＣＤＲを含有している。これらの合成オリゴヌクレオチ
ドは、ＢＲ９６イムノグロブリンの可変Ｌ又はＨ鎖を有
する親ファージの相補的配向性における全ての可能な目
的の変異体を含むようにデザインされている。
【００４５】４．変化した結合を有する変異体ＢＲ９６
分子の同一性の確認 変異体ＢＲ９６ライブラリーは、目的の変異体であるか
どうかの同一性の確認をするためにスクリーニングを行
った。目的の変異体の確認を行った後、変異体を親ベク
ターに再導入した。これは、変異体が目的の表現型を示
すのに必要かつ十分であるかどうかを確認する。さら
に、変異体を、診断又は治療のような、適用に適する他
の分子の形態を作製するために、親ベクターに再導入す
る。使用方法は、変異体ＢＲ９６の形態を例えばＦａ
ｂ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2 、融合タンパク、及び二重特
異性抗体などに決定する。上記に述べた方法は、変異体
ＢＲ９６を生産する単なる一方法である。他の当業者に
周知の方法も可能である（Foot and Winter, Mol. Biol
(1992) 224:487-499)。
分子の同一性の確認 変異体ＢＲ９６ライブラリーは、目的の変異体であるか
どうかの同一性の確認をするためにスクリーニングを行
った。目的の変異体の確認を行った後、変異体を親ベク
ターに再導入した。これは、変異体が目的の表現型を示
すのに必要かつ十分であるかどうかを確認する。さら
に、変異体を、診断又は治療のような、適用に適する他
の分子の形態を作製するために、親ベクターに再導入す
る。使用方法は、変異体ＢＲ９６の形態を例えばＦａ
ｂ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2 、融合タンパク、及び二重特
異性抗体などに決定する。上記に述べた方法は、変異体
ＢＲ９６を生産する単なる一方法である。他の当業者に
周知の方法も可能である（Foot and Winter, Mol. Biol
(1992) 224:487-499)。
【００４６】発明の使用方法１．診断技術 本発明の変異体ＢＲ９６抗体は、インビトロ及びインビ
ボにおける、抗体が特異な抗原を有するヒト悪性腫瘍の
検出のための診断に有用である。インビトロの診断方法
は、ガン細胞（例として、ヒト組織、細胞又は切除した
ガン種）の免疫組織学的検出又はガンによる抗原（例と
して、血液試料中又は他の生物学的流出物中のもの）の
血清学的検出を含む。血清学的診断方法は、悪性腫瘍を
患っていると考えられる患者の血清又は他の生物学的な
流出物に分泌又は“放出(shed)" されたガンに伴う抗原
の検出及び測定を含む。そのような抗原は、放射性免疫
測定法（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫固相測定法（ＥＬＩ
ＳＡ）のような当業者に既知の技術を用いて体液から検
出することが可能であり、その方法において、“放出”
抗原に反応する抗体が流出物試料中の抗原の存在を検出
するのに使用される（Uotila et al., "Two-Site Sandw
ich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AF
P", J. Immunol. Methods,42:11(1981)及びAllum et a
l., supra at pp. 48-51参照) 。ここに記載した変異体
ＢＲ９６抗体を使用したこれらのアッセイは、生物的流
出物中の変異体ＢＲ９６抗体が反応する抗原の検出及び
及び患者のヒト悪性腫瘍の検出に使用することができ
る。このように、本発明の変異体ＢＲ９６抗体は抗原−
抗体反応に関連するほとんどのアッセイに使用すること
ができる。これらのアッセイは、制限されるものではな
いが、液体及び固体両相の標準ＲＩＡ技術、及びＥＬＩ
ＳＡアッセイ、免疫蛍光法及び他の免疫細胞化学的方法
を含む（Sikora et al., (eds.),Monoclonal Antibodie
s, pp. 32-52 (Blackwell Scientific Publications 19
84)参照) 。
ボにおける、抗体が特異な抗原を有するヒト悪性腫瘍の
検出のための診断に有用である。インビトロの診断方法
は、ガン細胞（例として、ヒト組織、細胞又は切除した
ガン種）の免疫組織学的検出又はガンによる抗原（例と
して、血液試料中又は他の生物学的流出物中のもの）の
血清学的検出を含む。血清学的診断方法は、悪性腫瘍を
患っていると考えられる患者の血清又は他の生物学的な
流出物に分泌又は“放出(shed)" されたガンに伴う抗原
の検出及び測定を含む。そのような抗原は、放射性免疫
測定法（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫固相測定法（ＥＬＩ
ＳＡ）のような当業者に既知の技術を用いて体液から検
出することが可能であり、その方法において、“放出”
抗原に反応する抗体が流出物試料中の抗原の存在を検出
するのに使用される（Uotila et al., "Two-Site Sandw
ich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AF
P", J. Immunol. Methods,42:11(1981)及びAllum et a
l., supra at pp. 48-51参照) 。ここに記載した変異体
ＢＲ９６抗体を使用したこれらのアッセイは、生物的流
出物中の変異体ＢＲ９６抗体が反応する抗原の検出及び
及び患者のヒト悪性腫瘍の検出に使用することができ
る。このように、本発明の変異体ＢＲ９６抗体は抗原−
抗体反応に関連するほとんどのアッセイに使用すること
ができる。これらのアッセイは、制限されるものではな
いが、液体及び固体両相の標準ＲＩＡ技術、及びＥＬＩ
ＳＡアッセイ、免疫蛍光法及び他の免疫細胞化学的方法
を含む（Sikora et al., (eds.),Monoclonal Antibodie
s, pp. 32-52 (Blackwell Scientific Publications 19
84)参照) 。
【００４７】免疫組織化学法は、本発明の変異体ＢＲ９
６抗体を有する組織検体のような生物学的検体の染色、
及び検体上の抗原と複合化した抗体の存在を検出するこ
とを含む。そのような検体の抗体−抗原複合体の形成
は、組織内の悪性腫瘍細胞の存在を示している。検体の
抗体の検出は、例えば、イムノパーオキシダーゼ染色法
又はアビジン−ビオチン（ＡＢＣ）法又は免疫蛍光法等
の免疫酵素法のような当業技術を用いて行うことができ
る（Ciocca et al., "Immunohistochemical Techniques
Using Monoclonal Antibodies", Meth. Enzymol., 12
1:562-79(1986); Hellstrom et al., "Monoclonal Mous
e Antibodies Raised Against Human LungCarcinoma",
Cancer Research, 46:3917-23(1986);及びKimball (e
d.), Introduction to Immunology (2nd Ed.), pp. 113
-117(Macmillan Pub. Co. 1986))。例として、イムノパ
ーオキシダーゼ染色は、変異体ＢＲ９６抗体の肺、胸
部、結腸及び卵巣の悪性腫瘍への活性、及び正常なヒト
の組織検体への抗体には低活性であることを示すのに用
いられた。
６抗体を有する組織検体のような生物学的検体の染色、
及び検体上の抗原と複合化した抗体の存在を検出するこ
とを含む。そのような検体の抗体−抗原複合体の形成
は、組織内の悪性腫瘍細胞の存在を示している。検体の
抗体の検出は、例えば、イムノパーオキシダーゼ染色法
又はアビジン−ビオチン（ＡＢＣ）法又は免疫蛍光法等
の免疫酵素法のような当業技術を用いて行うことができ
る（Ciocca et al., "Immunohistochemical Techniques
Using Monoclonal Antibodies", Meth. Enzymol., 12
1:562-79(1986); Hellstrom et al., "Monoclonal Mous
e Antibodies Raised Against Human LungCarcinoma",
Cancer Research, 46:3917-23(1986);及びKimball (e
d.), Introduction to Immunology (2nd Ed.), pp. 113
-117(Macmillan Pub. Co. 1986))。例として、イムノパ
ーオキシダーゼ染色は、変異体ＢＲ９６抗体の肺、胸
部、結腸及び卵巣の悪性腫瘍への活性、及び正常なヒト
の組織検体への抗体には低活性であることを示すのに用
いられた。
【００４８】本発明はまた、上記に述べたアッセイを行
うための診断キットを包含する。一つの実施態様では、
診断キットは、本発明のＢＲ９６モノクローナル抗体変
異体、そのフラグメント、融合タンパク、二重特異性抗
体又はキメラ抗体並びに変異体ＢＲ９６抗体に対して共
に特異的結合を行うもの及び検出シグナルを発生させる
ラベルを含む複合体を含む。試薬はまた、緩衝剤及びタ
ンパク安定化剤（例としてポリサッカライド）のような
補助剤を含んでもよい。診断キットはさらに、必要な場
合には、他の背景の障害物を減少させる薬剤、調節剤又
は試験を行うための機械もしくは容器を含むシグナル発
生系の他の成分を含むことができる。他の実施態様にお
いて、診断キットは、本発明の変異体ＢＲ９６抗体及び
検出可能なシグナルを発しし得るラベルとの複合体を含
む。上記に述べた補助剤もまた存在していてもよい。本
発明の変異体ＢＲ９６抗体は、インビボでの、ヒト悪性
腫瘍の検出を行う診断に有用である。そのような方法
は、ガン画像技術を用いたインビボでのガンの検出を含
む。この方法に従い、変異体ＢＲ９６抗体は検出可能な
シグナルを発生する適当な画像薬剤によりラベルされ
る。使用可能な画像薬剤の例としては、限定するもので
はないが、 131Ｉ、 111Ｉｎ、 123Ｉ、99m Ｔｃ、
32Ｐ、 125Ｉ、 3Ｈ、及び14Ｃのような放射性ラベル、
フルオレセイン及びローダミンのような蛍光ラベル及び
ルシフェリンのような化学ルミネッセンス物質が挙げら
れる。抗体はこのような薬剤を用いて、当業技術により
ラベル化することができる。例えば、抗体の放射性物質
ラベル化に関する技術についてはWensel and Meares, R
adioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevie
r, New York (1983) を参照文献として挙げる(Colcher
et al., "Use of Monoclonal Antibodies As Radiophar
maceuticals For The Localization Of Human Carcinom
a Xenografts In Athymic Mice", Meth., Enzymol., 12
1:802-16 (1986)参照) 。
うための診断キットを包含する。一つの実施態様では、
診断キットは、本発明のＢＲ９６モノクローナル抗体変
異体、そのフラグメント、融合タンパク、二重特異性抗
体又はキメラ抗体並びに変異体ＢＲ９６抗体に対して共
に特異的結合を行うもの及び検出シグナルを発生させる
ラベルを含む複合体を含む。試薬はまた、緩衝剤及びタ
ンパク安定化剤（例としてポリサッカライド）のような
補助剤を含んでもよい。診断キットはさらに、必要な場
合には、他の背景の障害物を減少させる薬剤、調節剤又
は試験を行うための機械もしくは容器を含むシグナル発
生系の他の成分を含むことができる。他の実施態様にお
いて、診断キットは、本発明の変異体ＢＲ９６抗体及び
検出可能なシグナルを発しし得るラベルとの複合体を含
む。上記に述べた補助剤もまた存在していてもよい。本
発明の変異体ＢＲ９６抗体は、インビボでの、ヒト悪性
腫瘍の検出を行う診断に有用である。そのような方法
は、ガン画像技術を用いたインビボでのガンの検出を含
む。この方法に従い、変異体ＢＲ９６抗体は検出可能な
シグナルを発生する適当な画像薬剤によりラベルされ
る。使用可能な画像薬剤の例としては、限定するもので
はないが、 131Ｉ、 111Ｉｎ、 123Ｉ、99m Ｔｃ、
32Ｐ、 125Ｉ、 3Ｈ、及び14Ｃのような放射性ラベル、
フルオレセイン及びローダミンのような蛍光ラベル及び
ルシフェリンのような化学ルミネッセンス物質が挙げら
れる。抗体はこのような薬剤を用いて、当業技術により
ラベル化することができる。例えば、抗体の放射性物質
ラベル化に関する技術についてはWensel and Meares, R
adioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevie
r, New York (1983) を参照文献として挙げる(Colcher
et al., "Use of Monoclonal Antibodies As Radiophar
maceuticals For The Localization Of Human Carcinom
a Xenografts In Athymic Mice", Meth., Enzymol., 12
1:802-16 (1986)参照) 。
【００４９】放射性物質でラベル化された抗体の場合、
抗体は患者に投与され、抗体が反応する抗原を有するガ
ンに局在化し、及びインビボで、ガンマカメラ又は放射
断層撮影法等を使用した放射核走査のような既知の当業
技術を用いて、検出又は“画像化”する（Bradwell et
al., "Developments In Antibody Imaging", in Monocl
onal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,
Baldwin et al. (eds.), pp. 65-85 (Academic Press 1
985)) 。抗体は、水、血清、リンゲル液、ハンク液又は
不揮発性油のような非水担体などの薬学的に許容される
担体内に入れて患者に投与する。担体は、また、緩衝剤
又は防腐剤のような抗体の等張性及び化学安定性を増加
させる物質を含んでいてもよい。抗体剤形は、例えば、
ガンターゲット部位を十分可視化させるガンマ発光を与
えるのに十分な投与量を、静脈注射で投与される。一般
的なガンの画像化については、Allum et al., supra at
pp.51-55 を参照。
抗体は患者に投与され、抗体が反応する抗原を有するガ
ンに局在化し、及びインビボで、ガンマカメラ又は放射
断層撮影法等を使用した放射核走査のような既知の当業
技術を用いて、検出又は“画像化”する（Bradwell et
al., "Developments In Antibody Imaging", in Monocl
onal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,
Baldwin et al. (eds.), pp. 65-85 (Academic Press 1
985)) 。抗体は、水、血清、リンゲル液、ハンク液又は
不揮発性油のような非水担体などの薬学的に許容される
担体内に入れて患者に投与する。担体は、また、緩衝剤
又は防腐剤のような抗体の等張性及び化学安定性を増加
させる物質を含んでいてもよい。抗体剤形は、例えば、
ガンターゲット部位を十分可視化させるガンマ発光を与
えるのに十分な投与量を、静脈注射で投与される。一般
的なガンの画像化については、Allum et al., supra at
pp.51-55 を参照。
【００５０】２．発明の抗体及びそのフラグメントの治
療への適用 ＢＲ９６と同様に、変異体ＢＲ９６抗体の性質は、ａ）
ガン細胞に非常に高い特異性を有し、ｂ）内在化し、
ｃ）非改質形態において、適する濃度で使用した場合、
抗原陽性なガン細胞にのみ毒性を有し、ｄ）（Ｆｃを有
する抗体又は機能的に等価であるものの場合）相補体依
存性細胞毒性及び抗体依存性細胞性細胞毒性活性は、種
々のインビボ治療適用性を示唆する。第一に、変異体Ｂ
Ｒ９６抗体はインビボにおいて、それのみでガン細胞を
ターゲットとして殺すのに用いることができる。Ｆｃ領
域を含まない変異体ＢＲ９６抗体の機能的な等価体はＡ
ＤＣＣ又はＣＤＣの性質を示さない。抗体はまたヒト悪
性腫瘍を治療する適当な治療剤との複合体で使用するこ
とができる。例えば、抗体は、化学療法、放射性療法の
ような標準又は従来の治療法との組み合わせ、又は治療
剤もしくは毒性物質、及び悪性腫瘍の部位への治療剤の
分布のためのリンホカインもしくはガン抑制成育因子と
の複合体又は結合体で使用することができる。
療への適用 ＢＲ９６と同様に、変異体ＢＲ９６抗体の性質は、ａ）
ガン細胞に非常に高い特異性を有し、ｂ）内在化し、
ｃ）非改質形態において、適する濃度で使用した場合、
抗原陽性なガン細胞にのみ毒性を有し、ｄ）（Ｆｃを有
する抗体又は機能的に等価であるものの場合）相補体依
存性細胞毒性及び抗体依存性細胞性細胞毒性活性は、種
々のインビボ治療適用性を示唆する。第一に、変異体Ｂ
Ｒ９６抗体はインビボにおいて、それのみでガン細胞を
ターゲットとして殺すのに用いることができる。Ｆｃ領
域を含まない変異体ＢＲ９６抗体の機能的な等価体はＡ
ＤＣＣ又はＣＤＣの性質を示さない。抗体はまたヒト悪
性腫瘍を治療する適当な治療剤との複合体で使用するこ
とができる。例えば、抗体は、化学療法、放射性療法の
ような標準又は従来の治療法との組み合わせ、又は治療
剤もしくは毒性物質、及び悪性腫瘍の部位への治療剤の
分布のためのリンホカインもしくはガン抑制成育因子と
の複合体又は結合体で使用することができる。
【００５１】そのような治療剤の抗体への複合技術はよ
く知られている（Arnon et al., "Monoclonal Antibodi
es For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therap
y", inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Re
isfeld et al. (eds.), pp.243-56(Alan R. Liss, Inc.
1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Del
ivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Rob
inson et al. (eds.),pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc.
1987);Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Age
nts In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal An
tibodies '84:Biological And Clinical Applications,
Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); and T
hrope et al., "The Preparation And Cytotoxic Prope
rties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Re
v., 62:119-58 (1982))。本発明の変異体ＢＲ９６抗体
は特に、悪性腫瘍内に簡単に取り込まれ、結合して、治
療剤を細胞内の活性部位に分布させることができるた
め、治療用複合体の使用に適する。また、変異体ＢＲ９
６抗体は、131 Ｉのような放射性同位元素のような高エ
ネルギー放射性薬剤と結合することができる。これは、
ガンの部位に局在化した時、幾つかの細胞の横径(diame
ters) を殺す（Order, "Analysis, Results, And Futur
e Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabel
ed Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Anti
bodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et
al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985))。
く知られている（Arnon et al., "Monoclonal Antibodi
es For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therap
y", inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Re
isfeld et al. (eds.), pp.243-56(Alan R. Liss, Inc.
1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Del
ivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Rob
inson et al. (eds.),pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc.
1987);Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Age
nts In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal An
tibodies '84:Biological And Clinical Applications,
Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); and T
hrope et al., "The Preparation And Cytotoxic Prope
rties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Re
v., 62:119-58 (1982))。本発明の変異体ＢＲ９６抗体
は特に、悪性腫瘍内に簡単に取り込まれ、結合して、治
療剤を細胞内の活性部位に分布させることができるた
め、治療用複合体の使用に適する。また、変異体ＢＲ９
６抗体は、131 Ｉのような放射性同位元素のような高エ
ネルギー放射性薬剤と結合することができる。これは、
ガンの部位に局在化した時、幾つかの細胞の横径(diame
ters) を殺す（Order, "Analysis, Results, And Futur
e Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabel
ed Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Anti
bodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et
al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985))。
【００５２】他の実施態様において、変異体ＢＲ９６抗
体は第２の抗体と結合して、Segalらにより米国特許第
４，６７６，９８０号に報告されたガン細胞の治療のた
めの抗体ヘテロ複合体を形成する。本発明の変異体ＢＲ
９６抗体の治療への適用は、組み換えＤＮＡ技術又はタ
ンパク化学法により、プロドラッグを細胞毒性薬剤に変
換し得る酵素に複合化又は結合すること、及びこの抗体
−酵素複合体を、プロドラッグとの組み合わせて使用
し、ガンの部位において細胞毒性物質に変換することを
含む（Senter et al.,"Anti-Tumor Effects Of Antibod
y-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro
and in vivoAntitumor Activities of Phosphorylated
Mitomycin C and Etoposide Derivatives by Monoclon
al Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Canc
er Research 49:5789-5792 (1989); and Senter, "Acti
vation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates:
A New Approach to Cancer Therapy", FASEB J. 4: 188
-193 (1990))。変異体ＢＲ９６抗体の他の治療への使用
には、抗体−薬剤又は抗体−毒性物質複合体として又は
その一部として、ガン患者の骨髄からガン細胞を除去す
るための使用がある。この方法に従って、自己の骨髄を
体外で抗体処理を行い、清浄し、患者に骨髄を戻しても
よい（Ramsay et al., "Bone Marrow Purging Using Mo
noclonal Antibodies", J. Clin. Immunol., 8(2):81-8
8(1988))。
体は第２の抗体と結合して、Segalらにより米国特許第
４，６７６，９８０号に報告されたガン細胞の治療のた
めの抗体ヘテロ複合体を形成する。本発明の変異体ＢＲ
９６抗体の治療への適用は、組み換えＤＮＡ技術又はタ
ンパク化学法により、プロドラッグを細胞毒性薬剤に変
換し得る酵素に複合化又は結合すること、及びこの抗体
−酵素複合体を、プロドラッグとの組み合わせて使用
し、ガンの部位において細胞毒性物質に変換することを
含む（Senter et al.,"Anti-Tumor Effects Of Antibod
y-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro
and in vivoAntitumor Activities of Phosphorylated
Mitomycin C and Etoposide Derivatives by Monoclon
al Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Canc
er Research 49:5789-5792 (1989); and Senter, "Acti
vation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates:
A New Approach to Cancer Therapy", FASEB J. 4: 188
-193 (1990))。変異体ＢＲ９６抗体の他の治療への使用
には、抗体−薬剤又は抗体−毒性物質複合体として又は
その一部として、ガン患者の骨髄からガン細胞を除去す
るための使用がある。この方法に従って、自己の骨髄を
体外で抗体処理を行い、清浄し、患者に骨髄を戻しても
よい（Ramsay et al., "Bone Marrow Purging Using Mo
noclonal Antibodies", J. Clin. Immunol., 8(2):81-8
8(1988))。
【００５３】本発明の例に従い、被治療体には、ヒト、
ウマ、ブタ、ウシ、ネズミ、イヌ、ネコ及びトリが挙げ
られる。他の温血動物もまた、本発明に含まれる。従っ
て、本発明はヒトの悪性腫瘍を治療するためのＢＲ９６
を含む薬学的な組成物、組み合わせ及び方法を含む。例
えば、ヒトの悪性腫瘍を治療するための、変異体ＢＲ９
６と薬学的に許容される担体を薬学的に効果的な量含む
薬学的な組成物を含む。組成物は、変異体ＢＲ９６抗体
又は抗体フラグメントを、非修飾体、治療剤との複合体
（薬剤、毒性物質、酵素又は第二抗体）、又は組み換え
形態（例として、変異体ＢＲ９６のフラグメント、二重
特異性変異体ＢＲ９６又は一重鎖免疫毒性物質変異体Ｂ
Ｒ９６）として含有していてもよい。組成物は、さらに
他の、悪性腫瘍を治療するための抗体又は複合体を含ん
でいてもよい（例えば、抗体混合物）。
ウマ、ブタ、ウシ、ネズミ、イヌ、ネコ及びトリが挙げ
られる。他の温血動物もまた、本発明に含まれる。従っ
て、本発明はヒトの悪性腫瘍を治療するためのＢＲ９６
を含む薬学的な組成物、組み合わせ及び方法を含む。例
えば、ヒトの悪性腫瘍を治療するための、変異体ＢＲ９
６と薬学的に許容される担体を薬学的に効果的な量含む
薬学的な組成物を含む。組成物は、変異体ＢＲ９６抗体
又は抗体フラグメントを、非修飾体、治療剤との複合体
（薬剤、毒性物質、酵素又は第二抗体）、又は組み換え
形態（例として、変異体ＢＲ９６のフラグメント、二重
特異性変異体ＢＲ９６又は一重鎖免疫毒性物質変異体Ｂ
Ｒ９６）として含有していてもよい。組成物は、さらに
他の、悪性腫瘍を治療するための抗体又は複合体を含ん
でいてもよい（例えば、抗体混合物）。
【００５４】本発明の抗体、抗体複合体及び免疫毒性物
質組成物は、従来からの投与形態を使用して投与するこ
とができ、これは、限定されるものではないが、鞘内、
静脈内、腹腔内、経口、リンパ内又はガンへの直接投与
が含む。静脈内への投与が好ましい。本発明の組成物は
様々な投与形態で使用することができ、これは、限定さ
れるものではないが、溶液もしくは懸濁液、タブレッ
ト、ピル、粉末、座薬、高分子ミクロカプセルもしくは
ミクロ小胞、リポソーム及び注射可能な又は浸剤を形成
しうる溶液を含む。好ましい形態は、投与形態及び治療
を適用するものに依存する。本発明の組成物はまた、当
業者に知られている、ヒト血清アルブミン、イオン交換
体、アルミナ、レシチン、緩衝剤（リン酸、グリシン、
ソルビン酸、ソルビン酸カリウム及び塩に代表される）
及び硫酸プロタミンのような電界質のような従来からの
薬学的に許容される担体及び補助剤を含むことが好まし
い。本発明の例に従い、薬学的な担体は、脂質担体であ
ってもよい。脂質担体は、ホスホリピッドであってもよ
い。さらに、脂質担体は、脂肪酸であってもよい。ま
た、脂質担体は、洗浄剤であってもよい。ここで使用さ
れるように、洗浄剤は、液体の表面張力を変化、一般的
には低下させる物質である。
質組成物は、従来からの投与形態を使用して投与するこ
とができ、これは、限定されるものではないが、鞘内、
静脈内、腹腔内、経口、リンパ内又はガンへの直接投与
が含む。静脈内への投与が好ましい。本発明の組成物は
様々な投与形態で使用することができ、これは、限定さ
れるものではないが、溶液もしくは懸濁液、タブレッ
ト、ピル、粉末、座薬、高分子ミクロカプセルもしくは
ミクロ小胞、リポソーム及び注射可能な又は浸剤を形成
しうる溶液を含む。好ましい形態は、投与形態及び治療
を適用するものに依存する。本発明の組成物はまた、当
業者に知られている、ヒト血清アルブミン、イオン交換
体、アルミナ、レシチン、緩衝剤（リン酸、グリシン、
ソルビン酸、ソルビン酸カリウム及び塩に代表される）
及び硫酸プロタミンのような電界質のような従来からの
薬学的に許容される担体及び補助剤を含むことが好まし
い。本発明の例に従い、薬学的な担体は、脂質担体であ
ってもよい。脂質担体は、ホスホリピッドであってもよ
い。さらに、脂質担体は、脂肪酸であってもよい。ま
た、脂質担体は、洗浄剤であってもよい。ここで使用さ
れるように、洗浄剤は、液体の表面張力を変化、一般的
には低下させる物質である。
【００５５】本発明の一つの例において、洗浄剤は非イ
オン性洗浄剤であってもよい。非イオン性洗浄剤の例と
しては、限定されるものではないが、ポリソルベート８
０（これはツウィーン８０又はポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレートとして知られている。）、Ｂｒｉ
ｊ、及びトリトン（例として、トリトンＷＲ−１３３９
及びトリトンＡ−２０）が挙げられる。また、洗浄剤
は、イオン性洗浄剤であってもよい。イオン性洗浄剤と
しては、例えば、限定されるものではないが、アルキル
トリメチルアンモニウムロミドが挙げられる。さらに、
本発明に従い、脂質担体はリポソームであってもよい。
ここでは、“リポソーム”は、本発明の分子又はその複
合体を含む膜結合小胞体である。最も効果的な本発明の
組成物の投与形態及び投与量の方向は、病気の重度及び
進度、患者の健康状態及び処置への反応並びに治療を行
う医者の判断に依る。従って、組成物の投与量は、個々
の患者により決定しなければならない。しかし、本発明
の組成物の効果的な投与量は、約１〜約２０００ｍｇ／
ｍ2 の範囲であってもよい。
オン性洗浄剤であってもよい。非イオン性洗浄剤の例と
しては、限定されるものではないが、ポリソルベート８
０（これはツウィーン８０又はポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレートとして知られている。）、Ｂｒｉ
ｊ、及びトリトン（例として、トリトンＷＲ−１３３９
及びトリトンＡ−２０）が挙げられる。また、洗浄剤
は、イオン性洗浄剤であってもよい。イオン性洗浄剤と
しては、例えば、限定されるものではないが、アルキル
トリメチルアンモニウムロミドが挙げられる。さらに、
本発明に従い、脂質担体はリポソームであってもよい。
ここでは、“リポソーム”は、本発明の分子又はその複
合体を含む膜結合小胞体である。最も効果的な本発明の
組成物の投与形態及び投与量の方向は、病気の重度及び
進度、患者の健康状態及び処置への反応並びに治療を行
う医者の判断に依る。従って、組成物の投与量は、個々
の患者により決定しなければならない。しかし、本発明
の組成物の効果的な投与量は、約１〜約２０００ｍｇ／
ｍ2 の範囲であってもよい。
【００５６】ＢＲ９６は抗ガン剤として有用であると報
告されている（Trail et al. supra) 。ＢＲ９６をイン
ビボで使用する方法は、よく知られている（Trail et a
l. supra) 。変異体ＢＲ９６及び／又はＢＲ９６のよう
なその機能的等価体は、抗ガン又は抗腫瘍剤として使用
してもよい。最も効果的な本発明の分子の投与形態及び
投与量の方向は、処置を行うガンの位置、患者の健康状
態及び処置に対する反応並びに処置を行う医者の判断に
よる。従って、分子の投与量は、個々の患者により決定
しなければならない。様々な大きさ及び種類の動物と、
人間との間の、表面積のｍｇ／ｍ2 を基本とした投与量
の関係は、Freireich, E. J., et al. Cancer Chemothe
r., Rep. 50(4): 219-244(1966) に記載されている。投
与量の方向性の調製は、ガン細胞成長抑制及び殺作用の
応答性を最適化するように行ってもよい。例えば、投与
量を分割して、一日づつ投与するか又は状況に応じて投
与量の比例して減少させていく等である（例として、個
々の治療状況に応じて、幾つかに分けた投与量を毎日投
与するか又は比例して減少させる。）本発明の組成物
の、治療を達成するのに必要な投与量は、さらに最適化
のスケジュールに応じて減少させてもよい。
告されている（Trail et al. supra) 。ＢＲ９６をイン
ビボで使用する方法は、よく知られている（Trail et a
l. supra) 。変異体ＢＲ９６及び／又はＢＲ９６のよう
なその機能的等価体は、抗ガン又は抗腫瘍剤として使用
してもよい。最も効果的な本発明の分子の投与形態及び
投与量の方向は、処置を行うガンの位置、患者の健康状
態及び処置に対する反応並びに処置を行う医者の判断に
よる。従って、分子の投与量は、個々の患者により決定
しなければならない。様々な大きさ及び種類の動物と、
人間との間の、表面積のｍｇ／ｍ2 を基本とした投与量
の関係は、Freireich, E. J., et al. Cancer Chemothe
r., Rep. 50(4): 219-244(1966) に記載されている。投
与量の方向性の調製は、ガン細胞成長抑制及び殺作用の
応答性を最適化するように行ってもよい。例えば、投与
量を分割して、一日づつ投与するか又は状況に応じて投
与量の比例して減少させていく等である（例として、個
々の治療状況に応じて、幾つかに分けた投与量を毎日投
与するか又は比例して減少させる。）本発明の組成物
の、治療を達成するのに必要な投与量は、さらに最適化
のスケジュールに応じて減少させてもよい。
【００５７】発明の利点 ＢＲ９６のＣＤＲｓにおける異性化は変異体ＢＲ９６の
ターゲット抗体に対する結合親和性を改良した。改良さ
れた結合は、ガン抗原のＬｅY 成分に対する改良された
結合に関連している。ＢＲ９６Ｍ１変異体の高い親和性
をもつ表現型はＨ鎖ＣＤＲ３残基のＡｓｐ１０１からＡ
ｌａ１０１の変異体に特によるものである。特に、ＢＲ
９６Ｍ１変異体のＬｅY −ＨＳＡに対する親和性は、加
水分解により誘導されたキメラＢＲ９６Ｆａｂよりも、
約４.5倍高く、ＢＲ９６Ｍ４変異体はキメラＢＲ９６Ｆ
ａｂよりも１４倍高い改良された親和性を有する。この
改良された結合親和性は、本発明の抗体がガン細胞及び
組織によりしっかりと結合し、上記に述べた適用におけ
る使用をより増強することを意味する。ここに述べた本
発明をさらに詳しく理解するために、次の実施例を挙げ
た。これらの実施例は、単に説明のために挙げたもので
あり、本発明の観点を限定するものではない。
ターゲット抗体に対する結合親和性を改良した。改良さ
れた結合は、ガン抗原のＬｅY 成分に対する改良された
結合に関連している。ＢＲ９６Ｍ１変異体の高い親和性
をもつ表現型はＨ鎖ＣＤＲ３残基のＡｓｐ１０１からＡ
ｌａ１０１の変異体に特によるものである。特に、ＢＲ
９６Ｍ１変異体のＬｅY −ＨＳＡに対する親和性は、加
水分解により誘導されたキメラＢＲ９６Ｆａｂよりも、
約４.5倍高く、ＢＲ９６Ｍ４変異体はキメラＢＲ９６Ｆ
ａｂよりも１４倍高い改良された親和性を有する。この
改良された結合親和性は、本発明の抗体がガン細胞及び
組織によりしっかりと結合し、上記に述べた適用におけ
る使用をより増強することを意味する。ここに述べた本
発明をさらに詳しく理解するために、次の実施例を挙げ
た。これらの実施例は、単に説明のために挙げたもので
あり、本発明の観点を限定するものではない。
【００５８】
【実施例】実施例１ 改良された結合アフィニティーを有する変異体BR96 クローニング方法及びベクター構築の説明： BR96Ｌ鎖
可変（ＶL ）及びＨ鎖（ＶH ）抗体領域をコードするDN
A 配列をハイブリダイゼーション突然変異誘発(Near,
R., 1995, Biotechniques 11:88-97; Glaser, S., Kris
tensson, K.,Chilton, T.,及びHuse, W., 1994, Borreb
aeck, C.編集、抗体エンジニアリング：実用的な手引
き、第２編、W.H.フリーマン社、ニューヨーク）により
Ixsys M13 繊維状ファージ発現ベクターにクローン化し
た。ドナーBR96ＶL 配列及びＶH 配列を最初にポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR) により増幅した。PCR プライマーは
下記のベクター中の特定の配列と相同の領域を含んでい
た。ハイブリダイゼーション突然変異誘発による増幅さ
れたＶL 配列及びＶH 配列の導入は、有効なFab 発現に
必要とされるM13 ベクターの調節要素でフレーム中に抗
体配列を位置決めした。この技術の主たる利点は、制限
エンドヌクレアーゼ部位が通常のDNA 連結方法で行われ
るようなクローニングのためにＶL 配列またはＶH 配列
にとり込まれる必要がないことである。これは抗原結合
に悪影響し得る制限部位によりコードされたアミノ酸残
基を導入する可能性を排除する。レシピエントIxsys M1
3 ベクターの調製： M13 ファージレシピエントベクタ
ーはキメラL6 Fabを発現するM13 バクテリオファージで
あるM13IXL604 であった(Huse, W.D. ら, 1992, J.Immu
nol. 149:3914-3920; Glaser, S.M.ら, 1992, J.Immuno
l. 149:3903-3913) 。ベクター中に含まれた一定領域は
ヒトIgG1のCH1 及びヒトカッパーＬ鎖のＣk であった。
BR96遺伝子配列とL6遺伝子配列の間の比較的高い核酸相
同性がM13 ベクターへのBR96配列の有効なハイブリダイ
ゼーションを促進した。
可変（ＶL ）及びＨ鎖（ＶH ）抗体領域をコードするDN
A 配列をハイブリダイゼーション突然変異誘発(Near,
R., 1995, Biotechniques 11:88-97; Glaser, S., Kris
tensson, K.,Chilton, T.,及びHuse, W., 1994, Borreb
aeck, C.編集、抗体エンジニアリング：実用的な手引
き、第２編、W.H.フリーマン社、ニューヨーク）により
Ixsys M13 繊維状ファージ発現ベクターにクローン化し
た。ドナーBR96ＶL 配列及びＶH 配列を最初にポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR) により増幅した。PCR プライマーは
下記のベクター中の特定の配列と相同の領域を含んでい
た。ハイブリダイゼーション突然変異誘発による増幅さ
れたＶL 配列及びＶH 配列の導入は、有効なFab 発現に
必要とされるM13 ベクターの調節要素でフレーム中に抗
体配列を位置決めした。この技術の主たる利点は、制限
エンドヌクレアーゼ部位が通常のDNA 連結方法で行われ
るようなクローニングのためにＶL 配列またはＶH 配列
にとり込まれる必要がないことである。これは抗原結合
に悪影響し得る制限部位によりコードされたアミノ酸残
基を導入する可能性を排除する。レシピエントIxsys M1
3 ベクターの調製： M13 ファージレシピエントベクタ
ーはキメラL6 Fabを発現するM13 バクテリオファージで
あるM13IXL604 であった(Huse, W.D. ら, 1992, J.Immu
nol. 149:3914-3920; Glaser, S.M.ら, 1992, J.Immuno
l. 149:3903-3913) 。ベクター中に含まれた一定領域は
ヒトIgG1のCH1 及びヒトカッパーＬ鎖のＣk であった。
BR96遺伝子配列とL6遺伝子配列の間の比較的高い核酸相
同性がM13 ベクターへのBR96配列の有効なハイブリダイ
ゼーションを促進した。
【００５９】オリゴヌクレオチド5'-AGGGACTCCAGAAAGCT
TTT AGGCATAAATCCA-3'を使用して４つのアミノ酸を欠失
し、L6のＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域(CDR)2に終止コド
ンTAA 及びHind III制限部位を導入した。これをKunkel
(Kunkel, T.A., 1985, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 3
2:488-492; Kunkel, T.A. ら, 1987, Methods Enzymol.
154:367-382) により記載されたようなウラシル置換一
本鎖M13IXL604 DNA の部位誘導突然変異誘発により行っ
た（また、バイオ−ラド ムタ−ジーン（商標）In Vit
ro突然変異誘発キット、バージョン２マニュアル、バイ
オ−ラド、リッチモンド、VAを参考のこと）。M13IXL60
4 ファージを約0.2 の感染多重度でdut - ung - エシェ
リキア・コリ(Escherichia coli)株CJ236(バイオ−ラ
ド）中で増殖させた。37℃で４〜６時間後に、バクテリ
アを遠心分離により除去し、ファージを3.5Mの酢酸アン
モニウム、20％(w/v) のポリエチレングリコールによる
沈殿により回収した。次いでウラシル置換一本鎖(ss)DN
A をフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。そ
のオリゴヌクレオチドを製造業者の指示（ベーリンガー
・マンハイム、インジアナポリス、IN）に従ってT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼでホスホリル化した。200pモルを
２μl の10x キナーゼ緩衝液(1.0M のトリス-HCl、pH8.
0 、100 mMのMgCl2 、50mMのジチオスレートール(DT
T))、１μl の10mMのATP(ベーリンガー・マンハイ
ム）、１μl のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリン
ガー・マンハイム）、及び無菌水と合わせて全容積を20
μl にした。その反応は37℃で45分間進行し、次いで混
合物を65℃で10分間加熱することによりキナーゼを不活
化した。ホスホリル化オリゴヌクレオチドをM13IXL604
ベクターssDNA にアニールし、続いて二本鎖を合成し
た。10μl の全容積中で、６〜８ pモルのホスホリル化
オリゴヌクレオチドを70℃の水浴中のアニーリング緩衝
液(20 mMのトリス-HCl、pH7.4 、２mMのMgCl2 、50mMの
NaCl) 中でベクターDNA 250 ngにアニールし、40分間に
わたって30℃に冷却した。
TTT AGGCATAAATCCA-3'を使用して４つのアミノ酸を欠失
し、L6のＬ鎖Ｖ領域の相補性決定領域(CDR)2に終止コド
ンTAA 及びHind III制限部位を導入した。これをKunkel
(Kunkel, T.A., 1985, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 3
2:488-492; Kunkel, T.A. ら, 1987, Methods Enzymol.
154:367-382) により記載されたようなウラシル置換一
本鎖M13IXL604 DNA の部位誘導突然変異誘発により行っ
た（また、バイオ−ラド ムタ−ジーン（商標）In Vit
ro突然変異誘発キット、バージョン２マニュアル、バイ
オ−ラド、リッチモンド、VAを参考のこと）。M13IXL60
4 ファージを約0.2 の感染多重度でdut - ung - エシェ
リキア・コリ(Escherichia coli)株CJ236(バイオ−ラ
ド）中で増殖させた。37℃で４〜６時間後に、バクテリ
アを遠心分離により除去し、ファージを3.5Mの酢酸アン
モニウム、20％(w/v) のポリエチレングリコールによる
沈殿により回収した。次いでウラシル置換一本鎖(ss)DN
A をフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。そ
のオリゴヌクレオチドを製造業者の指示（ベーリンガー
・マンハイム、インジアナポリス、IN）に従ってT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼでホスホリル化した。200pモルを
２μl の10x キナーゼ緩衝液(1.0M のトリス-HCl、pH8.
0 、100 mMのMgCl2 、50mMのジチオスレートール(DT
T))、１μl の10mMのATP(ベーリンガー・マンハイ
ム）、１μl のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリン
ガー・マンハイム）、及び無菌水と合わせて全容積を20
μl にした。その反応は37℃で45分間進行し、次いで混
合物を65℃で10分間加熱することによりキナーゼを不活
化した。ホスホリル化オリゴヌクレオチドをM13IXL604
ベクターssDNA にアニールし、続いて二本鎖を合成し
た。10μl の全容積中で、６〜８ pモルのホスホリル化
オリゴヌクレオチドを70℃の水浴中のアニーリング緩衝
液(20 mMのトリス-HCl、pH7.4 、２mMのMgCl2 、50mMの
NaCl) 中でベクターDNA 250 ngにアニールし、40分間に
わたって30℃に冷却した。
【００６０】その反応液を氷の上に置き、下記の物質を
第二鎖の合成のために添加した。１μl の10x 合成緩衝
液(10 mMのATP 、100 mMのトリス-HCl、pH7.4 、50mMの
MgCl 2 、20mMのDTT 、及び５mMの夫々のdATP、dCTP、dG
TP、及びTTP)、１μl のT4 DNAリガーゼ（ベーリンガー
・マンハイム）、及び１μl のT4 DNAポリメラーゼ（ベ
ーリンガー・マンハイム）。その反応混合物を氷の上で
５分間インキュベートし、室温で５分間インキュベート
し、37℃で90分間インキュベートした。延長され、つな
がれた突然変異誘発DNA 産物をE.coli株DH10B(ギブコBR
L 、ガイザースブルグ、MD) にエレクトロポレーション
した。DH10B バクテリアを以下のようにしてエレクトロ
コンピテントにした。500 mlのＬブロース(LB)（１％(w
/v) のバクトトリプトン、0.5 ％(w/v) のバクト酵母エ
キス、１％(w/v) のNaCl) に1/100 容積のLB中のDH10B
の一夜培養液を接種した。600nm における吸光度が0.5-
1.0 光学密度(OD)になるまでバクテリアを37℃で振とう
しながら増殖させた。培養フラスコを氷の上で15-30 分
間冷却し、次いでバクテリアを15分間にわたって４℃で
4500 x gで遠心分離によりペレットにした。上澄みをデ
カントし、ペレットを冷脱イオン水500 ml中で再度懸濁
させた。バクテリアをペレットにし、冷脱イオン水250
ml中で洗浄し、再度ペレットにし、10％(V/V) のグリセ
ロール（ベーリンガー・マンハイム）（４℃）10ml中で
再度懸濁させた。遠心分離を繰り返し、バクテリアを10
％(V/V) のグリセロール（４℃）２ml中で再度懸濁さ
せ、0.1 mlの容積に分け、-70 ℃で貯蔵した。
第二鎖の合成のために添加した。１μl の10x 合成緩衝
液(10 mMのATP 、100 mMのトリス-HCl、pH7.4 、50mMの
MgCl 2 、20mMのDTT 、及び５mMの夫々のdATP、dCTP、dG
TP、及びTTP)、１μl のT4 DNAリガーゼ（ベーリンガー
・マンハイム）、及び１μl のT4 DNAポリメラーゼ（ベ
ーリンガー・マンハイム）。その反応混合物を氷の上で
５分間インキュベートし、室温で５分間インキュベート
し、37℃で90分間インキュベートした。延長され、つな
がれた突然変異誘発DNA 産物をE.coli株DH10B(ギブコBR
L 、ガイザースブルグ、MD) にエレクトロポレーション
した。DH10B バクテリアを以下のようにしてエレクトロ
コンピテントにした。500 mlのＬブロース(LB)（１％(w
/v) のバクトトリプトン、0.5 ％(w/v) のバクト酵母エ
キス、１％(w/v) のNaCl) に1/100 容積のLB中のDH10B
の一夜培養液を接種した。600nm における吸光度が0.5-
1.0 光学密度(OD)になるまでバクテリアを37℃で振とう
しながら増殖させた。培養フラスコを氷の上で15-30 分
間冷却し、次いでバクテリアを15分間にわたって４℃で
4500 x gで遠心分離によりペレットにした。上澄みをデ
カントし、ペレットを冷脱イオン水500 ml中で再度懸濁
させた。バクテリアをペレットにし、冷脱イオン水250
ml中で洗浄し、再度ペレットにし、10％(V/V) のグリセ
ロール（ベーリンガー・マンハイム）（４℃）10ml中で
再度懸濁させた。遠心分離を繰り返し、バクテリアを10
％(V/V) のグリセロール（４℃）２ml中で再度懸濁さ
せ、0.1 mlの容積に分け、-70 ℃で貯蔵した。
【００６１】突然変異誘発反応混合物を水で20μl に希
釈し、１μl をエレクトロコンピテントDH10B 25μl に
添加した。ピペット操作により混合した後、その混合物
を前冷却したバイオラド0.1cm ギャップキュベットに移
した。エレクトロポレーションは1.88kV、25μF 、及び
200 オームであった。10倍のアリコート、10μl 、１μ
l 、0.1 μl を夫々E.coliXL-1ブルー（LB＋10μg/mlの
テトラサイクリン中で増殖させた)(Stratagene, San Di
ego, CA)の一夜培養液0.2 mlに添加し、トップアガー
（0.7 ％(w/v) のバクトアガー）2.5 mlと混合し、10cm
のLBプレート(1.5％(w/v) のバクトアガーを含むLB）に
塗布した。プレートを37℃で４−６時間インキュベート
した。そのオリゴヌクレオチドをとり込んだファージは
ヒトカッパーＬ鎖を発現しないようであり、こうしてフ
ィルターリフトアッセイ（Huse, W.D.ら, 1992, J.Immu
nol. 149:3914-3920) により予備同定した。Fab 発現
を、夫々のプレートに10mMのイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクロピラノシド(IPTG)( ベーリンガー・マンハイ
ム）中でソーキングされた0.45μのニトロセルロースフ
ィルター（シュライヒェル＆シュエル、キーン、NH）で
オーバーレイすることにより誘導した。プレートを室温
で６時間〜一夜にわたってインキュベートした。フィル
ターを除去し、イムノブロッティング技術により処理し
た。全ての工程につき、フィルターをロッキングプラッ
トフォームの上で絶えず攪拌した。最初に、フィルター
をブロッキング緩衝液（バイオサイト、サンジエゴ、C
A）中でブロックして抗体の非特異性結合を阻止した。
次いでフィルターをブロッキング緩衝液中で1:1000に希
釈されたアルカリ性ホスファターゼ（フィッシャー・バ
イオテク、サンフランシスコ、CA）に接合されたヤギ抗
ヒトカッパーＬ鎖と共に室温で１−２時間インキュベー
トした。フィルターを10分間にわたってTBST(25 mMのト
リス-HCl、pH7.4、0.137MのNaCl、５mMのKCl 、0.9 mM
のCaCl2 、0.5 mMのMgCl2 、0.05％(V/V)のトゥイーン2
0（商標))で３回洗浄し、次いでアルカリ性ホスファタ
ーゼ基質試薬（バイオ−ラド）で展開した。
釈し、１μl をエレクトロコンピテントDH10B 25μl に
添加した。ピペット操作により混合した後、その混合物
を前冷却したバイオラド0.1cm ギャップキュベットに移
した。エレクトロポレーションは1.88kV、25μF 、及び
200 オームであった。10倍のアリコート、10μl 、１μ
l 、0.1 μl を夫々E.coliXL-1ブルー（LB＋10μg/mlの
テトラサイクリン中で増殖させた)(Stratagene, San Di
ego, CA)の一夜培養液0.2 mlに添加し、トップアガー
（0.7 ％(w/v) のバクトアガー）2.5 mlと混合し、10cm
のLBプレート(1.5％(w/v) のバクトアガーを含むLB）に
塗布した。プレートを37℃で４−６時間インキュベート
した。そのオリゴヌクレオチドをとり込んだファージは
ヒトカッパーＬ鎖を発現しないようであり、こうしてフ
ィルターリフトアッセイ（Huse, W.D.ら, 1992, J.Immu
nol. 149:3914-3920) により予備同定した。Fab 発現
を、夫々のプレートに10mMのイソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクロピラノシド(IPTG)( ベーリンガー・マンハイ
ム）中でソーキングされた0.45μのニトロセルロースフ
ィルター（シュライヒェル＆シュエル、キーン、NH）で
オーバーレイすることにより誘導した。プレートを室温
で６時間〜一夜にわたってインキュベートした。フィル
ターを除去し、イムノブロッティング技術により処理し
た。全ての工程につき、フィルターをロッキングプラッ
トフォームの上で絶えず攪拌した。最初に、フィルター
をブロッキング緩衝液（バイオサイト、サンジエゴ、C
A）中でブロックして抗体の非特異性結合を阻止した。
次いでフィルターをブロッキング緩衝液中で1:1000に希
釈されたアルカリ性ホスファターゼ（フィッシャー・バ
イオテク、サンフランシスコ、CA）に接合されたヤギ抗
ヒトカッパーＬ鎖と共に室温で１−２時間インキュベー
トした。フィルターを10分間にわたってTBST(25 mMのト
リス-HCl、pH7.4、0.137MのNaCl、５mMのKCl 、0.9 mM
のCaCl2 、0.5 mMのMgCl2 、0.05％(V/V)のトゥイーン2
0（商標))で３回洗浄し、次いでアルカリ性ホスファタ
ーゼ基質試薬（バイオ−ラド）で展開した。
【００６２】抗ヒトカッパー試薬で染色しなかったプラ
ークを単離し、ファージssDNA を配列決定(Sambrook,
J, Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989,分子クローニ
ング、実験マニュアル, Cold Spring Harbor Laborator
y Press)のために調製した。製造業者（ユナイテッド・
ステーツ・バイオケミカル、クレーブランド、OH）に従
ってシーケナーゼ・バージョン２で行われた配列分析
は、オリゴヌクレオチド配列がベクターDNA にとり込ま
れたことを確かめた。同様に、オリゴヌクレオチド5'-G
AAGTCATCAGCACGCGTTTAAGTGTAGGTGTT-3' を使用して３つ
のアミノ酸を欠失し、L6のＨ鎖Ｖ領域のCDR2に終止コド
ンTAA 及びMlu I 制限部位を導入した。Ｌ鎖のCDR2中に
終止をとり込んだ上記のファージからのベクターDNA を
突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異をとり込
んだファージと親の間の表現型の相違は、CDR2中の終止
の導入がベクターCH1 ドメインのカルボキシ末端に付加
されたデカペプチド、Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Ty
r Ala Ser (Huse, W.D. ら, 1989, Science 246:1275-1
281)の発現を阻止することであった。突然変異誘発反応
からのファージのニトロセルロースリフトを、そのデカ
ペプチドを結合するマウスモノクローナル抗体である7F
11- アルカリ性ホスファターゼ接合体（バイオサイト
社、サンジエゴ、CA）で探査し、そして7F11を結合しな
かったファージを単離した。配列分析は突然変異誘発性
オリゴヌクレオチド配列の存在を確かめた。
ークを単離し、ファージssDNA を配列決定(Sambrook,
J, Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989,分子クローニ
ング、実験マニュアル, Cold Spring Harbor Laborator
y Press)のために調製した。製造業者（ユナイテッド・
ステーツ・バイオケミカル、クレーブランド、OH）に従
ってシーケナーゼ・バージョン２で行われた配列分析
は、オリゴヌクレオチド配列がベクターDNA にとり込ま
れたことを確かめた。同様に、オリゴヌクレオチド5'-G
AAGTCATCAGCACGCGTTTAAGTGTAGGTGTT-3' を使用して３つ
のアミノ酸を欠失し、L6のＨ鎖Ｖ領域のCDR2に終止コド
ンTAA 及びMlu I 制限部位を導入した。Ｌ鎖のCDR2中に
終止をとり込んだ上記のファージからのベクターDNA を
突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異をとり込
んだファージと親の間の表現型の相違は、CDR2中の終止
の導入がベクターCH1 ドメインのカルボキシ末端に付加
されたデカペプチド、Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Ty
r Ala Ser (Huse, W.D. ら, 1989, Science 246:1275-1
281)の発現を阻止することであった。突然変異誘発反応
からのファージのニトロセルロースリフトを、そのデカ
ペプチドを結合するマウスモノクローナル抗体である7F
11- アルカリ性ホスファターゼ接合体（バイオサイト
社、サンジエゴ、CA）で探査し、そして7F11を結合しな
かったファージを単離した。配列分析は突然変異誘発性
オリゴヌクレオチド配列の存在を確かめた。
【００６３】BR96配列の増幅に使用したオリゴヌクレオ
チド：全てのオリゴヌクレオチドをミリゲンサイクロン
＋DNA シンセサイザー（バーリントン、MA）によるβ−
シアノエチルホスホルアミジト化学により合成した。オ
リゴヌクレオチド精製カートリッジ（アプライド・バイ
オシステムズ、フォスターシティ、CA）を使用してオリ
ゴヌクレオチドを精製した。5'センスまたは正(forwar
d)PCRプライマーはM13 発現ベクター中に含まれたリー
ダーペプチド配列の3'末端と同一のDNA 配列、直ぐに続
いてクローン化すべきBR96Ｖ領域遺伝子のアミノ末端配
列からなっていた。BR96Ｌ鎖正PCR プライマーの配列は
5'-GCCCAACCAGCCATGGCC GATGTTTTGATGACCCAAAT-3' であ
った。下線を施した領域は６つのコドン＋BR96ＶL 遺伝
子配列のアミノ末端の７アミノ酸をコードする最初の二
つのヌクレオチドに相当する。そのプライマーの残りは
M13 発現ベクター中に含まれたリーダーペプチド配列の
3'末端にハイブリッドを形成した。3'アンチセンスまた
は逆PCR プライマーはＶ領域遺伝子のカルボキシ末端配
列にハイブリッドを形成した配列により直ぐに先行され
たM13 発現ベクター中に含まれたヒトカッパーＬ鎖一定
領域の5'末端と同一のDNA 配列からなっていた。BR96Ｌ
鎖逆PCR プライマーの配列は5'-AGATGGCGGGAAGATGAAGAC
AGATGGTGCAGCCACAGTCCGTTTTATTTCCAA -3' であった（初
期のＬ鎖逆PCR プライマーはコドン112中に点突然変異
を有していた。これはM13IX ベクターへのBR96のクロー
ニングに続いて修正された。その突然変異を修正するの
に使用されたオリゴヌクレオチドは5'-GACAGATGGTGCAGC
CACAGTCCG-3'であった）。
チド：全てのオリゴヌクレオチドをミリゲンサイクロン
＋DNA シンセサイザー（バーリントン、MA）によるβ−
シアノエチルホスホルアミジト化学により合成した。オ
リゴヌクレオチド精製カートリッジ（アプライド・バイ
オシステムズ、フォスターシティ、CA）を使用してオリ
ゴヌクレオチドを精製した。5'センスまたは正(forwar
d)PCRプライマーはM13 発現ベクター中に含まれたリー
ダーペプチド配列の3'末端と同一のDNA 配列、直ぐに続
いてクローン化すべきBR96Ｖ領域遺伝子のアミノ末端配
列からなっていた。BR96Ｌ鎖正PCR プライマーの配列は
5'-GCCCAACCAGCCATGGCC GATGTTTTGATGACCCAAAT-3' であ
った。下線を施した領域は６つのコドン＋BR96ＶL 遺伝
子配列のアミノ末端の７アミノ酸をコードする最初の二
つのヌクレオチドに相当する。そのプライマーの残りは
M13 発現ベクター中に含まれたリーダーペプチド配列の
3'末端にハイブリッドを形成した。3'アンチセンスまた
は逆PCR プライマーはＶ領域遺伝子のカルボキシ末端配
列にハイブリッドを形成した配列により直ぐに先行され
たM13 発現ベクター中に含まれたヒトカッパーＬ鎖一定
領域の5'末端と同一のDNA 配列からなっていた。BR96Ｌ
鎖逆PCR プライマーの配列は5'-AGATGGCGGGAAGATGAAGAC
AGATGGTGCAGCCACAGTCCGTTTTATTTCCAA -3' であった（初
期のＬ鎖逆PCR プライマーはコドン112中に点突然変異
を有していた。これはM13IX ベクターへのBR96のクロー
ニングに続いて修正された。その突然変異を修正するの
に使用されたオリゴヌクレオチドは5'-GACAGATGGTGCAGC
CACAGTCCG-3'であった）。
【００６４】下線を施された領域はBR96ＶL のカルボキ
シ末端残基104-108 をコードする５つのコドンに相当す
る。この配列はセンス3'BR96ＶL 遺伝子配列にアニール
し、それを増幅した。増幅されたPCR 生成物はバクテリ
アのペクテートリアーゼ(pelB) リーダーペプチド配列
の3'末端にハイブリッドを形成し、これはＶL - Ｃk(Be
tter, M. ら, 1988, Science 240:1041-1045)をバクテ
リアの細胞周辺腔、そしてM13 発現ベクター中に含まれ
たＬ鎖一定配列のコドン109-116 に向ける。同様に、BR
96Ｈ鎖正PCR プライマー配列は5'-CCTGTGGCAAAAGCCGAAG
TGAATCTGGTGGAG-3' であり、BR96Ｈ鎖逆PCR プライマー
配列は5'-ATGGGCCCTTGGTGGAGGCTACAGAGACCGTGACCAG-3'
であった。Ｈ鎖PCR 増幅配列はバクテリアのアルカリ性
ホスファターゼリーダーペプチド配列の3'末端にハイブ
リッドを形成し、これはバクテリアの細胞周辺腔、そし
てM13 発現ベクター中に含まれたＨ鎖CH1 配列のコドン
114-119 へのＶH -CH1(Skerra, A. 及びPluckthun, A.,
Science 240:1038-1041) の分泌を誘導する。
シ末端残基104-108 をコードする５つのコドンに相当す
る。この配列はセンス3'BR96ＶL 遺伝子配列にアニール
し、それを増幅した。増幅されたPCR 生成物はバクテリ
アのペクテートリアーゼ(pelB) リーダーペプチド配列
の3'末端にハイブリッドを形成し、これはＶL - Ｃk(Be
tter, M. ら, 1988, Science 240:1041-1045)をバクテ
リアの細胞周辺腔、そしてM13 発現ベクター中に含まれ
たＬ鎖一定配列のコドン109-116 に向ける。同様に、BR
96Ｈ鎖正PCR プライマー配列は5'-CCTGTGGCAAAAGCCGAAG
TGAATCTGGTGGAG-3' であり、BR96Ｈ鎖逆PCR プライマー
配列は5'-ATGGGCCCTTGGTGGAGGCTACAGAGACCGTGACCAG-3'
であった。Ｈ鎖PCR 増幅配列はバクテリアのアルカリ性
ホスファターゼリーダーペプチド配列の3'末端にハイブ
リッドを形成し、これはバクテリアの細胞周辺腔、そし
てM13 発現ベクター中に含まれたＨ鎖CH1 配列のコドン
114-119 へのＶH -CH1(Skerra, A. 及びPluckthun, A.,
Science 240:1038-1041) の分泌を誘導する。
【００６５】M13IX ベクターへのBR96配列のクローニン
グ： BR96ＶL 遺伝子及びＶH 遺伝子をハイブリダイゼ
ーション突然変異誘発によりIxsysM13IXL604発現ベクタ
ーに逐次移入した。可変領域遺伝子のPCR 増幅のため
に、BR96ＶL 遺伝子配列またはＶH 遺伝子配列を含むpU
C19 プラスミドを制限エンドヌクレアーゼXho I で完全
に消化した。DNA を等容積のフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコール(25:24:1) で１回抽出し、等容
積のクロロホルム／イソアミルアルコール(24:1)で１回
抽出し、次いでエタノールで沈殿させた。制限DNA を無
菌水で2ng/μl の濃度まで再度懸濁させた。直線状にさ
れたpUC19/BR96ＶL プラスミド10ngを、上記のＬ鎖正PC
R プライマー及び逆PCR プライマーを使用して50μl の
反応容積で増幅させた。PCR 増幅をSaiki らの方法(198
8, Science 239:487-491) により行った。増幅の条件は
94℃で２分間の変性、次いで94℃で１分間の変性の２サ
イクル、50℃で１分間のアニーリング、そして72℃で１
分間のDNA 合成であった。これに続いて40サイクルで94
℃で１分間の変性、55℃で１分間のアニーリング、そし
て72℃で１分間のDNA 合成、そして最後に72℃で10分間
の延長を行った。増幅産物を等容積のクロロホルム／イ
ソアミルアルコール(24:1)で１回抽出し、エタノールで
沈殿させた。
グ： BR96ＶL 遺伝子及びＶH 遺伝子をハイブリダイゼ
ーション突然変異誘発によりIxsysM13IXL604発現ベクタ
ーに逐次移入した。可変領域遺伝子のPCR 増幅のため
に、BR96ＶL 遺伝子配列またはＶH 遺伝子配列を含むpU
C19 プラスミドを制限エンドヌクレアーゼXho I で完全
に消化した。DNA を等容積のフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコール(25:24:1) で１回抽出し、等容
積のクロロホルム／イソアミルアルコール(24:1)で１回
抽出し、次いでエタノールで沈殿させた。制限DNA を無
菌水で2ng/μl の濃度まで再度懸濁させた。直線状にさ
れたpUC19/BR96ＶL プラスミド10ngを、上記のＬ鎖正PC
R プライマー及び逆PCR プライマーを使用して50μl の
反応容積で増幅させた。PCR 増幅をSaiki らの方法(198
8, Science 239:487-491) により行った。増幅の条件は
94℃で２分間の変性、次いで94℃で１分間の変性の２サ
イクル、50℃で１分間のアニーリング、そして72℃で１
分間のDNA 合成であった。これに続いて40サイクルで94
℃で１分間の変性、55℃で１分間のアニーリング、そし
て72℃で１分間のDNA 合成、そして最後に72℃で10分間
の延長を行った。増幅産物を等容積のクロロホルム／イ
ソアミルアルコール(24:1)で１回抽出し、エタノールで
沈殿させた。
【００６６】ＶH 配列のPCR 増幅を、直線状にされたpU
C19/BR96ＶH プラスミド及び上記の適当なプライマーを
用いて同様に行った。増幅されたＶH 及びＶL 二本鎖DN
A 産物をゲル電気泳動により単離した。DNA 産物を５％
(w/v) のポリアクリルアミド／1 Ｘトリスボレート、pH
8.3-EDTAゲルに適用し、そして100Vで電気泳動にかけ
た。ゲルを臭化エチジウム(1μg/ml) で染色し、DNA を
紫外線で可視化し、レーザーブレードで切除した。DNA
を一夜にわたって37℃で振とうしながらゲル溶離緩衝液
(0.3M のNaCl、10mMのトリス-HCl、pH7.5 、１mMのEDT
A、0.1 ％［w/v ］のSDS)でゲルから化学溶離した。溶
出液を回収し、ゲル溶離緩衝液0.25mlをゲルスライスに
添加し、そして37℃で振とうしながら更に30-60 分間イ
ンキュベートした。第二溶出液を第一溶出液と共に溜
め、そして両方をブタノールで３回、クロロホルム／イ
ソアミルアルコール(24:1)で１回抽出し、次いでエタノ
ールで沈殿させた。DNA を10,000 x gで20分間の遠心分
離により回収した。ペレットを80％(v/v) のエタノール
で１回洗浄し、次いで空気乾燥させた。DNA を水約15μ
lに可溶化し、試料３−４μl の260 nmにおける吸光度
を測定することによりその濃度を測定した。ハイブリダ
イゼーション突然変異誘発を実質的に上記のようにして
行った。二本鎖(ds)PCR 産物を、dsDNA 400 ngを２μl
の10x キナーゼ緩衝液、１μl の10mMのATP 、１μl の
T4ポリヌクレオチドキナーゼ、及び無菌水と合わせて全
容積を20μl とすることによりT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼでホスホリル化した。その反応は37℃で45分間進行
した。その混合物を65℃で10分間加熱することによりキ
ナーゼを不活化した。
C19/BR96ＶH プラスミド及び上記の適当なプライマーを
用いて同様に行った。増幅されたＶH 及びＶL 二本鎖DN
A 産物をゲル電気泳動により単離した。DNA 産物を５％
(w/v) のポリアクリルアミド／1 Ｘトリスボレート、pH
8.3-EDTAゲルに適用し、そして100Vで電気泳動にかけ
た。ゲルを臭化エチジウム(1μg/ml) で染色し、DNA を
紫外線で可視化し、レーザーブレードで切除した。DNA
を一夜にわたって37℃で振とうしながらゲル溶離緩衝液
(0.3M のNaCl、10mMのトリス-HCl、pH7.5 、１mMのEDT
A、0.1 ％［w/v ］のSDS)でゲルから化学溶離した。溶
出液を回収し、ゲル溶離緩衝液0.25mlをゲルスライスに
添加し、そして37℃で振とうしながら更に30-60 分間イ
ンキュベートした。第二溶出液を第一溶出液と共に溜
め、そして両方をブタノールで３回、クロロホルム／イ
ソアミルアルコール(24:1)で１回抽出し、次いでエタノ
ールで沈殿させた。DNA を10,000 x gで20分間の遠心分
離により回収した。ペレットを80％(v/v) のエタノール
で１回洗浄し、次いで空気乾燥させた。DNA を水約15μ
lに可溶化し、試料３−４μl の260 nmにおける吸光度
を測定することによりその濃度を測定した。ハイブリダ
イゼーション突然変異誘発を実質的に上記のようにして
行った。二本鎖(ds)PCR 産物を、dsDNA 400 ngを２μl
の10x キナーゼ緩衝液、１μl の10mMのATP 、１μl の
T4ポリヌクレオチドキナーゼ、及び無菌水と合わせて全
容積を20μl とすることによりT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼでホスホリル化した。その反応は37℃で45分間進行
した。その混合物を65℃で10分間加熱することによりキ
ナーゼを不活化した。
【００６７】ホスホリル化PCR 増幅BR96ＶL DNA を修飾
ウリジニル化M13IXL604 ssDNA ベクターにアニールし、
続いて第二鎖を合成した。10μl の全容積で、ホスホリ
ル化BR96ＶL DNA100ngをアニーリング緩衝液中で90℃で
３分間にわたってベクターDNA 250ng にアニールし、次
いで30℃に徐々に冷却した。その反応液を氷の上に置
き、第二鎖合成が上記のように進行した。延長され、つ
ながれた突然変異誘発DNA 産物をE.coli株DH10B にエレ
クトロポレーションした。ドナーBR96Ｌ鎖による修飾L6
Ｌ鎖の成功した置換を、アルカリ性ホスファターゼに接
合されたヤギ抗ヒトカッパーＬ鎖によるプラークリフト
アッセイにより検出した。クローンM13IX BR96ＶL -2は
DNA 配列分析により測定されたように正確なインフレー
ムキメラ免疫グロブリン配列を有していた。修飾ウリジ
ニル化M13IXL BR96 ＶL -2一本鎖DNA 鋳型を調製し、ホ
スホリル化PCR 増幅BR96ＶH で突然変異誘発した。ドナ
ーBR96ＶH 領域によるL6Ｈ鎖配列の置換はベクターCH1
ドメインのカルボキシ末端に付加されたデカペプチドの
発現をもたらし、そして7F11- アルカリ性ホスファター
ゼ接合体によるプラークリフトアッセイで検出された。
また、BR96を結合するマウス抗イディオタイプモノクロ
ーナル抗体である757-4-1 を使用してBR96ＶH 配列の成
功した導入及び発現を検出した。ニトロセルロースフィ
ルターをブロックした後、757-4-1 （ブロッキング緩衝
液中１μg/ml）を室温で１−２時間にわたって添加し
た。フィルターを夫々10分間でTBSTで３回洗浄し、次い
でヤギ抗マウスIgG(フィッシャー・バイオテク）で探査
した。再度、フィルターを洗浄し、上記のようにしてア
ルカリ性ホスファターゼ基質中で展開した。
ウリジニル化M13IXL604 ssDNA ベクターにアニールし、
続いて第二鎖を合成した。10μl の全容積で、ホスホリ
ル化BR96ＶL DNA100ngをアニーリング緩衝液中で90℃で
３分間にわたってベクターDNA 250ng にアニールし、次
いで30℃に徐々に冷却した。その反応液を氷の上に置
き、第二鎖合成が上記のように進行した。延長され、つ
ながれた突然変異誘発DNA 産物をE.coli株DH10B にエレ
クトロポレーションした。ドナーBR96Ｌ鎖による修飾L6
Ｌ鎖の成功した置換を、アルカリ性ホスファターゼに接
合されたヤギ抗ヒトカッパーＬ鎖によるプラークリフト
アッセイにより検出した。クローンM13IX BR96ＶL -2は
DNA 配列分析により測定されたように正確なインフレー
ムキメラ免疫グロブリン配列を有していた。修飾ウリジ
ニル化M13IXL BR96 ＶL -2一本鎖DNA 鋳型を調製し、ホ
スホリル化PCR 増幅BR96ＶH で突然変異誘発した。ドナ
ーBR96ＶH 領域によるL6Ｈ鎖配列の置換はベクターCH1
ドメインのカルボキシ末端に付加されたデカペプチドの
発現をもたらし、そして7F11- アルカリ性ホスファター
ゼ接合体によるプラークリフトアッセイで検出された。
また、BR96を結合するマウス抗イディオタイプモノクロ
ーナル抗体である757-4-1 を使用してBR96ＶH 配列の成
功した導入及び発現を検出した。ニトロセルロースフィ
ルターをブロックした後、757-4-1 （ブロッキング緩衝
液中１μg/ml）を室温で１−２時間にわたって添加し
た。フィルターを夫々10分間でTBSTで３回洗浄し、次い
でヤギ抗マウスIgG(フィッシャー・バイオテク）で探査
した。再度、フィルターを洗浄し、上記のようにしてア
ルカリ性ホスファターゼ基質中で展開した。
【００６８】クローンM13IX BR96 13.2 をフィルターリ
フトアッセイにおいて抗イディオタイプ757-4-1 で同定
し、フレーム中に完全長キメラ免疫グロブリン配列を有
していた。単一の点突然変異が位置51で見られ、これが
Ile をVal に変換した。オリゴヌクレオチド5'-ACCTTGA
CTAATGTATGCGACC-3'を使用してこの点突然変異をIleに
逆に変換してM13IX BR96 13.24を構築した。M13IX BR96
13.24をE.coli中で発現し、粗Fab 製剤をHuse, W.D.
ら, 1992, J.Immunol. 149:3914-3920に記載されたよう
にして周辺腔から単離した。簡単に言えば、対数期E.co
li株MK-30-3(ベーリンガー・マンハイム）を1-5 M.O.I.
で感染し、インキュベーターシェーカー中で37℃で１−
３時間増殖させた。0.5 mMのIPTGを添加することにより
培養液をFab 発現のために誘導し、25℃で一夜インキュ
ベートし続けた。バクテリアを遠心分離(4500 x g)によ
り回収し、培養容積の約1/10のTES 緩衝液(30 mMのトリ
ス-HCl、pH8.0 、２mMのEDTA、20％［w/v ］の蔗糖）中
で再度懸濁させた。等容積のTES 中の２mg/ml のリソチ
ームを懸濁液に添加し、氷の上で10分間インキュベート
して細胞を透過性にした。次いで上澄みを遠心分離(13,
500 x g)し、細胞周辺フラクションである上澄みを除去
し、４℃で貯蔵した。
フトアッセイにおいて抗イディオタイプ757-4-1 で同定
し、フレーム中に完全長キメラ免疫グロブリン配列を有
していた。単一の点突然変異が位置51で見られ、これが
Ile をVal に変換した。オリゴヌクレオチド5'-ACCTTGA
CTAATGTATGCGACC-3'を使用してこの点突然変異をIleに
逆に変換してM13IX BR96 13.24を構築した。M13IX BR96
13.24をE.coli中で発現し、粗Fab 製剤をHuse, W.D.
ら, 1992, J.Immunol. 149:3914-3920に記載されたよう
にして周辺腔から単離した。簡単に言えば、対数期E.co
li株MK-30-3(ベーリンガー・マンハイム）を1-5 M.O.I.
で感染し、インキュベーターシェーカー中で37℃で１−
３時間増殖させた。0.5 mMのIPTGを添加することにより
培養液をFab 発現のために誘導し、25℃で一夜インキュ
ベートし続けた。バクテリアを遠心分離(4500 x g)によ
り回収し、培養容積の約1/10のTES 緩衝液(30 mMのトリ
ス-HCl、pH8.0 、２mMのEDTA、20％［w/v ］の蔗糖）中
で再度懸濁させた。等容積のTES 中の２mg/ml のリソチ
ームを懸濁液に添加し、氷の上で10分間インキュベート
して細胞を透過性にした。次いで上澄みを遠心分離(13,
500 x g)し、細胞周辺フラクションである上澄みを除去
し、４℃で貯蔵した。
【００６９】BR96 13.24 Fab製剤を、腺乳癌腫瘍細胞系
H3396(Hellstrom, I. ら, 1990, Cancer Research , 5
0:2183-2190) への結合につきELISA により分析した。H
3396細胞を96ウェル組織培養プレートに接種し、10％の
ウシ胎児血清を含むIMDM（ギブコ、グランド・アイラン
ド、NY）中で37℃で一夜増殖させた。培地をプレートか
らはらい落とし、細胞を２％のパラホルムアルデヒド／
食塩加リン酸緩衝液(PBS) で15分間定着した。定着細胞
をPBS 、１％(w/v) のBSA で３回洗浄し、PBS、１％のB
SA 中で１時間ブロックした。周辺質50μl を75μl の
トリス緩衝食塩液、pH7.5 (TBS) 、１％のBSA で希釈し
た。希釈した周辺質50μl をH3396 と共に室温で１時間
インキュベートした。細胞をTBS 、１％のBSA で４−５
回洗浄し、そしてヤギ抗ヒトカッパーアルカリ性ホスフ
ァターゼ接合体（TBS 、１％のBSA 中1:1000に希釈）10
0 μl を室温で30分間にわたってウェルに添加した。細
胞をTBS で５回洗浄し、そして0.1Mのアミノメチルプロ
パンジオール、0.5Mのトリス-HCl、pH10.2、0.1 ％(w/
v) のNaN3(JBLサイエンティフィック、サン・ルイス・
オビスポ、CA）中で６mg/ml のフェノールフタレインモ
ノホスフェートで展開した。その反応を10mMのトリス塩
基、５mMのEDTAの最終濃度にすることにより反応を停止
した。BR96は腫瘍細胞系H3396 を特異的に結合した。
H3396(Hellstrom, I. ら, 1990, Cancer Research , 5
0:2183-2190) への結合につきELISA により分析した。H
3396細胞を96ウェル組織培養プレートに接種し、10％の
ウシ胎児血清を含むIMDM（ギブコ、グランド・アイラン
ド、NY）中で37℃で一夜増殖させた。培地をプレートか
らはらい落とし、細胞を２％のパラホルムアルデヒド／
食塩加リン酸緩衝液(PBS) で15分間定着した。定着細胞
をPBS 、１％(w/v) のBSA で３回洗浄し、PBS、１％のB
SA 中で１時間ブロックした。周辺質50μl を75μl の
トリス緩衝食塩液、pH7.5 (TBS) 、１％のBSA で希釈し
た。希釈した周辺質50μl をH3396 と共に室温で１時間
インキュベートした。細胞をTBS 、１％のBSA で４−５
回洗浄し、そしてヤギ抗ヒトカッパーアルカリ性ホスフ
ァターゼ接合体（TBS 、１％のBSA 中1:1000に希釈）10
0 μl を室温で30分間にわたってウェルに添加した。細
胞をTBS で５回洗浄し、そして0.1Mのアミノメチルプロ
パンジオール、0.5Mのトリス-HCl、pH10.2、0.1 ％(w/
v) のNaN3(JBLサイエンティフィック、サン・ルイス・
オビスポ、CA）中で６mg/ml のフェノールフタレインモ
ノホスフェートで展開した。その反応を10mMのトリス塩
基、５mMのEDTAの最終濃度にすることにより反応を停止
した。BR96は腫瘍細胞系H3396 を特異的に結合した。
【００７０】コドンをベースとする突然変異誘発BR96ラ
イブラリーの構築： コドンをベースとする突然変異誘
発技術により突然変異誘発するためのＶH ドメイン及び
ＶLドメインのCDR ループ内の残基を、正準構造に基く
コンピューターモデリング（Chothia, C. ら, J.Mol.Bi
ol., 186:651-663［1985］及びChothia, C. ら, Natur
e, 342:877-883 ［1989］)(J.Bajorath, BMSPRI) によ
り測定した。以下の推奨をつくった。 ＶL CDR 1 残基Val30-Tyr37 ＶL CDR 2 残基Tyr54-Ser57 ＶL CDR 3 残基Gly96-Phe101 ＶH CDR 1 残基Gly26-Tyr33 ＶH CDR 2 残基Ser52-Asp59 ＶH CDR 3 残基Gly99-Trp105 ６のコドンをベースとする突然変異誘発ライブラリーを
BR96において構築し、夫々のライブラリーが異なる突然
変異誘発CDR を含んでいた。６つの鋳型を、欠失、続い
てBR96のCDR 中の終止コドンを導入することにより調製
した。欠失及び終止を導入したオリゴヌクレオチドを以
下に示す。終止コドンが下線を施された配列により示さ
れる。
イブラリーの構築： コドンをベースとする突然変異誘
発技術により突然変異誘発するためのＶH ドメイン及び
ＶLドメインのCDR ループ内の残基を、正準構造に基く
コンピューターモデリング（Chothia, C. ら, J.Mol.Bi
ol., 186:651-663［1985］及びChothia, C. ら, Natur
e, 342:877-883 ［1989］)(J.Bajorath, BMSPRI) によ
り測定した。以下の推奨をつくった。 ＶL CDR 1 残基Val30-Tyr37 ＶL CDR 2 残基Tyr54-Ser57 ＶL CDR 3 残基Gly96-Phe101 ＶH CDR 1 残基Gly26-Tyr33 ＶH CDR 2 残基Ser52-Asp59 ＶH CDR 3 残基Gly99-Trp105 ６のコドンをベースとする突然変異誘発ライブラリーを
BR96において構築し、夫々のライブラリーが異なる突然
変異誘発CDR を含んでいた。６つの鋳型を、欠失、続い
てBR96のCDR 中の終止コドンを導入することにより調製
した。欠失及び終止を導入したオリゴヌクレオチドを以
下に示す。終止コドンが下線を施された配列により示さ
れる。
【００７１】欠失／終止を導入するのに使用したＬ鎖オ
リゴヌクレオチド： ΔCDR 1 ＶL : 5'-GTACCATTCTAAAAGCTT TTA AATGATCTGACT-3' ΔCDR 2 ＶL : 5'-AGAAAATCGGTTAAGCTT TTA GATCAGGAGCTG-3' ΔCDR 3 ＶL : 5'-CGAGCCGAACGTAAGCTT TTA TTGAAAGCAGTA-3' 欠失／終止を導入するのに使用したＨ鎖オリゴヌクレオ
チド： ΔCDR 1 ＶH : 5'-AACCCAATACATACGCGT TTA AGAGGTTACACA-3' ΔCDR 2 ＶH : 5'-AGTGTCTGGATAACGCGT TTA AATGTATGCGAC-3' ΔCDR 3 ＶH : 5'-CCAGTAAGCAAAACGCGT TTA TCTTGCACAGTA-3' ６種のBR96 CDR欠失／終止鋳型を部位誘導突然変異誘発
により構築し、免疫化学染色試薬との反応性の損失によ
り同定した。BR96Ｌ鎖は最早３種のＬ鎖鋳型中で発現さ
れず、またBR96Ｈ鎖は３種のＨ鎖鋳型中で発現されなか
った。コドンをベースとする突然変異誘発による非機能
性CDR の再構成は免疫化学技術により免疫グロブリン鎖
発現を検出する能力を救済するであろう。全ての構築物
の配列をDNA 配列分析により確認した。次いでウリジニ
ル化一本鎖DNA 鋳型を、コドンをベースとする突然変異
誘発のために調製した。
リゴヌクレオチド： ΔCDR 1 ＶL : 5'-GTACCATTCTAAAAGCTT TTA AATGATCTGACT-3' ΔCDR 2 ＶL : 5'-AGAAAATCGGTTAAGCTT TTA GATCAGGAGCTG-3' ΔCDR 3 ＶL : 5'-CGAGCCGAACGTAAGCTT TTA TTGAAAGCAGTA-3' 欠失／終止を導入するのに使用したＨ鎖オリゴヌクレオ
チド： ΔCDR 1 ＶH : 5'-AACCCAATACATACGCGT TTA AGAGGTTACACA-3' ΔCDR 2 ＶH : 5'-AGTGTCTGGATAACGCGT TTA AATGTATGCGAC-3' ΔCDR 3 ＶH : 5'-CCAGTAAGCAAAACGCGT TTA TCTTGCACAGTA-3' ６種のBR96 CDR欠失／終止鋳型を部位誘導突然変異誘発
により構築し、免疫化学染色試薬との反応性の損失によ
り同定した。BR96Ｌ鎖は最早３種のＬ鎖鋳型中で発現さ
れず、またBR96Ｈ鎖は３種のＨ鎖鋳型中で発現されなか
った。コドンをベースとする突然変異誘発による非機能
性CDR の再構成は免疫化学技術により免疫グロブリン鎖
発現を検出する能力を救済するであろう。全ての構築物
の配列をDNA 配列分析により確認した。次いでウリジニ
ル化一本鎖DNA 鋳型を、コドンをベースとする突然変異
誘発のために調製した。
【００７２】コドンをベースとするオリゴヌクレオチド
を、Glaser, S.M.ら, 1992, J.Immunol. 149:3903-3913
に記載されたような親BR96 CDR配列につき50％のバイア
スで合成した。オリゴヌクレオチド配列を以下に示す。
最後の合成工程後に、親カラム(P) 及び突然変異誘発性
カラム(M) からの内容物を溜め、そして全ての６種の混
合物を変性12％ポリアクリルアミド／7M尿素／1Xトリス
ボレート-EDTA ゲルによる電気泳動により精製した。DN
A を切除されたゲルスライスからゲル溶離緩衝液で化学
溶離し、ブタノールで３回抽出し、エタノールで沈殿さ
せた。６回の合成の夫々からの精製オリゴヌクレオチド
２μg をホスホリル化し、続いて夫々100ng を使用して
部位誘導突然変異誘発（上記の操作を参照のこと）によ
り６のBR96 CDRライブラリーを生じた。下記のコドンを
ベースとするオリゴヌクレオチドを、BR96のＶH CDR 及
びＶLCDR を突然変異誘発するために合成した。全ての
オリゴヌクレオチドをアンチセンス形態で表し、Ｎは
Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴを同等に表す。A/C は50％のＡ及び
50％のＣを示す。
を、Glaser, S.M.ら, 1992, J.Immunol. 149:3903-3913
に記載されたような親BR96 CDR配列につき50％のバイア
スで合成した。オリゴヌクレオチド配列を以下に示す。
最後の合成工程後に、親カラム(P) 及び突然変異誘発性
カラム(M) からの内容物を溜め、そして全ての６種の混
合物を変性12％ポリアクリルアミド／7M尿素／1Xトリス
ボレート-EDTA ゲルによる電気泳動により精製した。DN
A を切除されたゲルスライスからゲル溶離緩衝液で化学
溶離し、ブタノールで３回抽出し、エタノールで沈殿さ
せた。６回の合成の夫々からの精製オリゴヌクレオチド
２μg をホスホリル化し、続いて夫々100ng を使用して
部位誘導突然変異誘発（上記の操作を参照のこと）によ
り６のBR96 CDRライブラリーを生じた。下記のコドンを
ベースとするオリゴヌクレオチドを、BR96のＶH CDR 及
びＶLCDR を突然変異誘発するために合成した。全ての
オリゴヌクレオチドをアンチセンス形態で表し、Ｎは
Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴを同等に表す。A/C は50％のＡ及び
50％のＣを示す。
【００７３】Ｌ鎖オリゴヌクレオチド： BR96 L1P: 5'-GTA CCA TTC TAA ATA GGT GTT GCC ATT A
TT ATG TAC AAT GAT CTGACT-3' BR96 L1M: 5'-GTA CCA TTC TAA A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN A/CNN AAT GAT CTG ACT-3' BR96 L2P: 5'-AGA AAA TCG GTT GGA AAC TTT GTA GAT C
AG GAG CTG-3' BR96 L2M: 5'-AGA AAA TCG GTT A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN GAT CAG GAG CTG-3' BR96 L3P: 5'-CGA GCC GAA CGT GAA TGG AAC ATG TGA A
CC TTG AAA GCA GTA-3' BR96 L3M: 5'-CGA GCC GAA CGT A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN TTG AAAGCA GTA-3' Ｈ鎖オリゴヌクレオチド： BR96 H1P: 5'-AAC CCA ATA CAT GTA ATA GTC ACT GAA A
GT GAA TCC AGA GGT TACACA-3' BR96 H1M: 5'-AAC CCA ATA CAT A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN A/CNN AGA GGT TAC ACA-3' BR96 H2P: 5'-AGT GTC TGG ATA GTC GGT TAT ATC ACC A
CC TTG ACT AAT GTA TGCGAC-3' BR96 H2M: 5'-AGT GTC TGG ATA A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN A/CNN AAT GTA TGC GAC-3' BR96 H3P: 5'-CCA GTA AGC AAA CCA GGC CCC GTC GTC C
AG GCC TCT TGC ACA GTA-3' BR96 H3M: 5'-CCA GTA AGC AAA A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN TCT TGC ACA GTA-3'
TT ATG TAC AAT GAT CTGACT-3' BR96 L1M: 5'-GTA CCA TTC TAA A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN A/CNN AAT GAT CTG ACT-3' BR96 L2P: 5'-AGA AAA TCG GTT GGA AAC TTT GTA GAT C
AG GAG CTG-3' BR96 L2M: 5'-AGA AAA TCG GTT A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN GAT CAG GAG CTG-3' BR96 L3P: 5'-CGA GCC GAA CGT GAA TGG AAC ATG TGA A
CC TTG AAA GCA GTA-3' BR96 L3M: 5'-CGA GCC GAA CGT A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN TTG AAAGCA GTA-3' Ｈ鎖オリゴヌクレオチド： BR96 H1P: 5'-AAC CCA ATA CAT GTA ATA GTC ACT GAA A
GT GAA TCC AGA GGT TACACA-3' BR96 H1M: 5'-AAC CCA ATA CAT A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN A/CNN AGA GGT TAC ACA-3' BR96 H2P: 5'-AGT GTC TGG ATA GTC GGT TAT ATC ACC A
CC TTG ACT AAT GTA TGCGAC-3' BR96 H2M: 5'-AGT GTC TGG ATA A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN A/CNN AAT GTA TGC GAC-3' BR96 H3P: 5'-CCA GTA AGC AAA CCA GGC CCC GTC GTC C
AG GCC TCT TGC ACA GTA-3' BR96 H3M: 5'-CCA GTA AGC AAA A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN TCT TGC ACA GTA-3'
【００７４】高アフィニティーFab に関するBR96 CDRラ
イブラリーのスクリーニング：BR96 CDRライブラリーを
パラホルムアルデヒド定着H3396 細胞に関するELISAア
ッセイにより高アフィニティー変異体Fab につきスクリ
ーニングした。一例として、オリゴヌクレオチドBR96 H
3P及びBR96 H3Mで構築されたBR96 CDR3 Ｈ鎖ライブラリ
ーをプラークリフトアッセイにより分析し、そしてデカ
ペプチド陽性クローンを単離した。周辺質フラクション
を夫々のクローンから調製し、上記のようにして定着H3
396 細胞に関して分析した。72のBR96ＶH CDR3変異体Fa
b の初期スクリーンから、一つのクローンであるM1が同
濃度で親BR96分子よりも高いODシグナルを示すH3396 腫
瘍細胞を結合し、M1が抗原に対し大きなアフィニティー
を有することを示唆した。BR96M1は、BR96抗原を発現し
ない結腸癌細胞系である定着H3719 に結合しなかった。
これは、抗原へのクローンBR96 M1 の改良された結合が
特異的であることを示した。BR96 M1 のDNA 配列分析
は、Asp101 (GAC)からAla101 (GCG)（連続ナンバリング
系）までのＨ鎖のCDR3中の単一アミノ酸変化を明らかに
した。オリゴヌクレオチド5'-CCA GGC CCC GTC CGC CAG
GCC TCT TGC-3' を合成し、使用して部位誘導突然変異
誘発により親BR96鋳型中のAsp101残基をAla101に変え、
それ故、BR96 A101 と称した。このクローンの正確なDN
A 配列の後に、BR96 A101 ( 即ち、Ｈ鎖のCDR3の位置10
1 にあるアラニンを含む変異体BR96) を確認し、パラホ
ルムアルデヒド定着H3396 細胞への結合を評価した。BR
96 A101 はBR96 M1 と同様にH3396 腫瘍細胞を結合し、
BR96 M1 の高アフィニティー表現型がAla101へのＨ鎖CD
R3残基の突然変異のために特異性であることを実証し
た。
イブラリーのスクリーニング：BR96 CDRライブラリーを
パラホルムアルデヒド定着H3396 細胞に関するELISAア
ッセイにより高アフィニティー変異体Fab につきスクリ
ーニングした。一例として、オリゴヌクレオチドBR96 H
3P及びBR96 H3Mで構築されたBR96 CDR3 Ｈ鎖ライブラリ
ーをプラークリフトアッセイにより分析し、そしてデカ
ペプチド陽性クローンを単離した。周辺質フラクション
を夫々のクローンから調製し、上記のようにして定着H3
396 細胞に関して分析した。72のBR96ＶH CDR3変異体Fa
b の初期スクリーンから、一つのクローンであるM1が同
濃度で親BR96分子よりも高いODシグナルを示すH3396 腫
瘍細胞を結合し、M1が抗原に対し大きなアフィニティー
を有することを示唆した。BR96M1は、BR96抗原を発現し
ない結腸癌細胞系である定着H3719 に結合しなかった。
これは、抗原へのクローンBR96 M1 の改良された結合が
特異的であることを示した。BR96 M1 のDNA 配列分析
は、Asp101 (GAC)からAla101 (GCG)（連続ナンバリング
系）までのＨ鎖のCDR3中の単一アミノ酸変化を明らかに
した。オリゴヌクレオチド5'-CCA GGC CCC GTC CGC CAG
GCC TCT TGC-3' を合成し、使用して部位誘導突然変異
誘発により親BR96鋳型中のAsp101残基をAla101に変え、
それ故、BR96 A101 と称した。このクローンの正確なDN
A 配列の後に、BR96 A101 ( 即ち、Ｈ鎖のCDR3の位置10
1 にあるアラニンを含む変異体BR96) を確認し、パラホ
ルムアルデヒド定着H3396 細胞への結合を評価した。BR
96 A101 はBR96 M1 と同様にH3396 腫瘍細胞を結合し、
BR96 M1 の高アフィニティー表現型がAla101へのＨ鎖CD
R3残基の突然変異のために特異性であることを実証し
た。
【００７５】ELISA によるBR96 M1 Fab の分析： BR96
は多くの癌及び癌由来細胞系(Hellstrom I. ら, 1990,
Cancer Res. 50:2183-2190) で発現された腫瘍抗原のル
イスＹ（LeY ）部分に結合する。腫瘍細胞へのBR96 M1
の改良された結合が腫瘍抗原のLeY 成分への改良された
結合と相関関係があることを示すために、ヒト血清アル
ブミンに接合されたLeY テトラサッカリド（LeY -HSA)
(アルベルタ・リサーチ・カウンシル、エドモントン、
アルベルタ、カナダ）を使用するELISA を行った。ELIS
A のための別の抗原源はH3396 細胞の膜製剤であった。
膜の単離の操作は以下のとおりである。細胞をIMDM、10
％(v/v) のウシ胎児血清中で集密まで増殖し、37℃で5-
10分間にわたってEDTA溶液（PBS 中0.02％［w/v ］のED
TA及び0.02％［w/v ］のデキストロース）で処理して細
胞を培養フラスコから脱着した。細胞を遠心分離(1000
x g)により回収し、PBS(４℃）で１回洗浄した。上澄み
を吸引し、細胞ペレットを直ちに処理し、または-70 ℃
で凍結した。細胞ペレット0.5-3 mlを回収した時、細胞
を膜単離のために処理した。凍結された場合、ペレット
を室温で解凍した。10mlの溶解緩衝液（10mMのトリス-H
Cl、pH7.4 、５mMのEDTA、pH10.2、10.5μg/mlのアプロ
チニン、0.5 mMのPMSF、５μg/mlのロイペプチン)(４
℃）をペレットに添加し、ピペットで良く混合し、氷の
上で15分間インキュベートした。次いでその懸濁液を冷
却ドウンスホモジナイザー中で30-40 ストロークで均一
にし、ホモジネートを４℃で5-10分間1500 x gで遠心分
離した。上澄みを注意して除去し、12mlの超透明遠心分
離管（ベックマン、フラートン、CA）に入れ、膜を高速
遠心分離(82,000 x g 、４℃）によりペレットにした。
管の上部の脂質層をパスツールピペットで注意して除去
し、上澄みの残部をデカントした。ペレットをPBS 緩衝
液（５mMのEDTA、pH10.2、10.5μg/mlのアプロチニン、
0.5 mMのPMSF、５μg/mlのロイペプチン、25mMのヨード
アセトアミドを含むPBS)中で再度懸濁させ、上記のよう
にして高速で遠心分離した。ペレットをPBS 緩衝液1-3
ml中で再度懸濁させ、タンパク質含量をBCA タンパク質
アッセイ（ピアス・ケミカル社、ロックフォード、IL）
により推定した。
は多くの癌及び癌由来細胞系(Hellstrom I. ら, 1990,
Cancer Res. 50:2183-2190) で発現された腫瘍抗原のル
イスＹ（LeY ）部分に結合する。腫瘍細胞へのBR96 M1
の改良された結合が腫瘍抗原のLeY 成分への改良された
結合と相関関係があることを示すために、ヒト血清アル
ブミンに接合されたLeY テトラサッカリド（LeY -HSA)
(アルベルタ・リサーチ・カウンシル、エドモントン、
アルベルタ、カナダ）を使用するELISA を行った。ELIS
A のための別の抗原源はH3396 細胞の膜製剤であった。
膜の単離の操作は以下のとおりである。細胞をIMDM、10
％(v/v) のウシ胎児血清中で集密まで増殖し、37℃で5-
10分間にわたってEDTA溶液（PBS 中0.02％［w/v ］のED
TA及び0.02％［w/v ］のデキストロース）で処理して細
胞を培養フラスコから脱着した。細胞を遠心分離(1000
x g)により回収し、PBS(４℃）で１回洗浄した。上澄み
を吸引し、細胞ペレットを直ちに処理し、または-70 ℃
で凍結した。細胞ペレット0.5-3 mlを回収した時、細胞
を膜単離のために処理した。凍結された場合、ペレット
を室温で解凍した。10mlの溶解緩衝液（10mMのトリス-H
Cl、pH7.4 、５mMのEDTA、pH10.2、10.5μg/mlのアプロ
チニン、0.5 mMのPMSF、５μg/mlのロイペプチン)(４
℃）をペレットに添加し、ピペットで良く混合し、氷の
上で15分間インキュベートした。次いでその懸濁液を冷
却ドウンスホモジナイザー中で30-40 ストロークで均一
にし、ホモジネートを４℃で5-10分間1500 x gで遠心分
離した。上澄みを注意して除去し、12mlの超透明遠心分
離管（ベックマン、フラートン、CA）に入れ、膜を高速
遠心分離(82,000 x g 、４℃）によりペレットにした。
管の上部の脂質層をパスツールピペットで注意して除去
し、上澄みの残部をデカントした。ペレットをPBS 緩衝
液（５mMのEDTA、pH10.2、10.5μg/mlのアプロチニン、
0.5 mMのPMSF、５μg/mlのロイペプチン、25mMのヨード
アセトアミドを含むPBS)中で再度懸濁させ、上記のよう
にして高速で遠心分離した。ペレットをPBS 緩衝液1-3
ml中で再度懸濁させ、タンパク質含量をBCA タンパク質
アッセイ（ピアス・ケミカル社、ロックフォード、IL）
により推定した。
【００７６】M1 Fabの源は周辺質フラクションまたは精
製Fab であった。M1 Fabを培養液４リットルに由来する
周辺質製剤から精製した。周辺質フラクションを等容積
のPB-0.5M のNaCl(NaCl を補給されてその濃度を0.5Mに
したPBS)で希釈し、次いで0.45μm のフィルターで濾過
した。希釈され、濾過されたフラクションを製造業者の
指示に従ってCNBr活性化セファロース4B（ファーマシ
ア、ピスキャットアウェー、ニュージャージー）にカッ
プリングされたヤギ抗ヒトFab 抗血清（シグマ、セント
ルス、ミズーリー）であるアフィニティーカラムに適用
した。カラムをPB-0.5M のNaClで洗浄した後、M1 Fabを
0.1MのNaClを含む0.1Mのクエン酸、pH2.2で溶離した。F
ab の溶離をA280により監視し、溶離直後に、Fab フラ
クションを1/10容積の1Mのトリス-HCl、pH8.5 の添加に
より中和した。PBS に対する透析による緩衝液交換後
に、M1 FabをYM-10 フィルターを備えたアミコン攪拌セ
ル（アミコン・ディビジョン、W.R.グレース＆Co. 、ベ
バリィ、MA）中で濃縮した。ELISA のために、96ウェル
マイクロタイタプレート（イムンロンII、ダイナテック
・ラボラトリィズ、チャンチリィ、VA）をLeY -HSA(0.0
5Mの炭酸塩／重炭酸塩、pH9.6 中１μg/ml、ウェル当た
り100 μl)で被覆した。プレートを４℃で一夜インキュ
ベートした。吸収されなかった抗原をプレートからはら
い落とし、ウェルを食塩水−トィーン(0.9％［w/v ］の
NaCl、0.5 ％［w/v ］のトィーン20（商標))で３回洗浄
した。抗体の非特異的結合を室温で１時間にわたって20
0 μl／ウェルの標本希釈剤（10％［v/v ］のスペシメ
ン・ディルエント、ゲネティック・システムズ、シアト
ル、ワシントン）の添加によりブロックした。過剰のブ
ロッキング緩衝液を除き、プレートを食塩水−トィーン
で１回洗浄した。
製Fab であった。M1 Fabを培養液４リットルに由来する
周辺質製剤から精製した。周辺質フラクションを等容積
のPB-0.5M のNaCl(NaCl を補給されてその濃度を0.5Mに
したPBS)で希釈し、次いで0.45μm のフィルターで濾過
した。希釈され、濾過されたフラクションを製造業者の
指示に従ってCNBr活性化セファロース4B（ファーマシ
ア、ピスキャットアウェー、ニュージャージー）にカッ
プリングされたヤギ抗ヒトFab 抗血清（シグマ、セント
ルス、ミズーリー）であるアフィニティーカラムに適用
した。カラムをPB-0.5M のNaClで洗浄した後、M1 Fabを
0.1MのNaClを含む0.1Mのクエン酸、pH2.2で溶離した。F
ab の溶離をA280により監視し、溶離直後に、Fab フラ
クションを1/10容積の1Mのトリス-HCl、pH8.5 の添加に
より中和した。PBS に対する透析による緩衝液交換後
に、M1 FabをYM-10 フィルターを備えたアミコン攪拌セ
ル（アミコン・ディビジョン、W.R.グレース＆Co. 、ベ
バリィ、MA）中で濃縮した。ELISA のために、96ウェル
マイクロタイタプレート（イムンロンII、ダイナテック
・ラボラトリィズ、チャンチリィ、VA）をLeY -HSA(0.0
5Mの炭酸塩／重炭酸塩、pH9.6 中１μg/ml、ウェル当た
り100 μl)で被覆した。プレートを４℃で一夜インキュ
ベートした。吸収されなかった抗原をプレートからはら
い落とし、ウェルを食塩水−トィーン(0.9％［w/v ］の
NaCl、0.5 ％［w/v ］のトィーン20（商標))で３回洗浄
した。抗体の非特異的結合を室温で１時間にわたって20
0 μl／ウェルの標本希釈剤（10％［v/v ］のスペシメ
ン・ディルエント、ゲネティック・システムズ、シアト
ル、ワシントン）の添加によりブロックした。過剰のブ
ロッキング緩衝液を除き、プレートを食塩水−トィーン
で１回洗浄した。
【００７７】M1 Fabをタンパク質加水分解により誘導さ
れたキメラBR96 Fabと比較した。キメラBR96 (Fell, H.
P., Yarnold, S., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E., F
olger, K.R., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 86:8
507-8511; Yarnold, S. 及びFell, H.P. 1994 Cancer R
esearch 54:506-512) を製造業者の文献（ピアス・ケミ
カル社）に概説されたようにしてパパインで消化した。
M1 Fab及びキメラBR96Fabを標本希釈剤中の連続の３倍
希釈液中で滴定し、４℃で一夜にわたってLeY-HSA膜及
びH3396 膜でインキュベートした。プレートを食塩水−
トィーンで４回洗浄し、接合体希釈剤（ゲネティック・
システムズ)(ウェル当たり100 μl)中で先に行われた滴
定に従って希釈されたホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ(HRP) 接合ヤギ抗ヒトカッパーＬ鎖特異性試薬（カ
ルタグ、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア）を
添加した。反応液を室温で１時間インキュベートし、次
いで接合体をウェルからはらい落とし、プレートを食塩
水−トィーンで５回洗浄した。クロモーゲンであるTMB
(3,3',5,5' テトラメチルベンジリジン)(ゲネティック
・システムズ）を緩衝基質（0.015 ％［v/v ］のH2O2を
含む0.1Mのクエン酸でpH5.5 に調節された0.1Mの酢酸ナ
トリウム）中で1:100 に希釈し、室温で20-30 分にわた
って96ウェルプレートに添加した(100μl/ウェル）。反
応をウェル当たり100 μl の3NのH2SO4 の添加により停
止し、450nm における吸光度をバイオテクEL312 ミクロ
プレートリーダー（バーリントン、VT）で測定した。
れたキメラBR96 Fabと比較した。キメラBR96 (Fell, H.
P., Yarnold, S., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E., F
olger, K.R., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 86:8
507-8511; Yarnold, S. 及びFell, H.P. 1994 Cancer R
esearch 54:506-512) を製造業者の文献（ピアス・ケミ
カル社）に概説されたようにしてパパインで消化した。
M1 Fab及びキメラBR96Fabを標本希釈剤中の連続の３倍
希釈液中で滴定し、４℃で一夜にわたってLeY-HSA膜及
びH3396 膜でインキュベートした。プレートを食塩水−
トィーンで４回洗浄し、接合体希釈剤（ゲネティック・
システムズ)(ウェル当たり100 μl)中で先に行われた滴
定に従って希釈されたホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ(HRP) 接合ヤギ抗ヒトカッパーＬ鎖特異性試薬（カ
ルタグ、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア）を
添加した。反応液を室温で１時間インキュベートし、次
いで接合体をウェルからはらい落とし、プレートを食塩
水−トィーンで５回洗浄した。クロモーゲンであるTMB
(3,3',5,5' テトラメチルベンジリジン)(ゲネティック
・システムズ）を緩衝基質（0.015 ％［v/v ］のH2O2を
含む0.1Mのクエン酸でpH5.5 に調節された0.1Mの酢酸ナ
トリウム）中で1:100 に希釈し、室温で20-30 分にわた
って96ウェルプレートに添加した(100μl/ウェル）。反
応をウェル当たり100 μl の3NのH2SO4 の添加により停
止し、450nm における吸光度をバイオテクEL312 ミクロ
プレートリーダー（バーリントン、VT）で測定した。
【００７８】H3396 膜及びLeY -HSAへのM1 Fabの結合プ
ロフィールは同様であった（図８及び９）。タンパク質
加水分解により誘導されたキメラBR96 Fabと比較して、
約５倍少ない変異体BR96 M1 Fab が最大ODの半分を得る
のに必要とされた。このデータは、M1中の突然変異がそ
の抗原に対するFab の結合アフィニティーを増大するこ
とを確かめた。LeY - ホースラディッシュペルオキシダ
ーゼによるBR96 CDR3 ライブラリーのスクリーニング：
抗原へのM1の増大された結合に関するAla101へのAsp1
01の突然変異の寄与を独立の方法により調べた。LeY -
ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体（LeY -HS
A）をフィルターリフトアッセイにおいて使用してBR96
コドンをベースとする突然変異誘発CDR ライブラリーを
スクリーニングした。LeY- ヒドラジド（アルベルタ・
リサーチ・カウンシル）を以下のようにしてHRP で誘導
体化した。10mgのHRP(ベーリンガー・マンハイム）を0.
1Mの酢酸塩緩衝液、pH5.0(４℃）0.5 mlに可溶化した。
0.5Mの過ヨウ素酸ナトリウム25.7μl をHRP溶液に添加
し、光から保護された氷浴中で20分間インキュベートし
た。酸化されたHRP をセファデックスG25 ゲル濾過によ
り消費されなかった過ヨウ素酸ナトリウムから分離し
た。酸化されたHRP をLeY - ヒドラジド３mgに添加し、
４時間にわたって４℃で暗所に保ち、時折混合した。そ
の反応液をホウ水素化シアンナトリウムの136.8 mg/ml
2.86μl の添加により中和した。その溶液を暗所で一夜
にわたって４℃に保ち、次いでPBS に対し透析した。ア
リコートを1:20に希釈し、403 nmにおける吸光度を測定
し、0.73の吸光率を使用してその濃度を計算することに
よりHRP 濃度を測定した。チメロソール（0.01％［w/v
］）を防腐剤としてLeY -HRPに添加し、それを４℃で
貯蔵した。
ロフィールは同様であった（図８及び９）。タンパク質
加水分解により誘導されたキメラBR96 Fabと比較して、
約５倍少ない変異体BR96 M1 Fab が最大ODの半分を得る
のに必要とされた。このデータは、M1中の突然変異がそ
の抗原に対するFab の結合アフィニティーを増大するこ
とを確かめた。LeY - ホースラディッシュペルオキシダ
ーゼによるBR96 CDR3 ライブラリーのスクリーニング：
抗原へのM1の増大された結合に関するAla101へのAsp1
01の突然変異の寄与を独立の方法により調べた。LeY -
ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体（LeY -HS
A）をフィルターリフトアッセイにおいて使用してBR96
コドンをベースとする突然変異誘発CDR ライブラリーを
スクリーニングした。LeY- ヒドラジド（アルベルタ・
リサーチ・カウンシル）を以下のようにしてHRP で誘導
体化した。10mgのHRP(ベーリンガー・マンハイム）を0.
1Mの酢酸塩緩衝液、pH5.0(４℃）0.5 mlに可溶化した。
0.5Mの過ヨウ素酸ナトリウム25.7μl をHRP溶液に添加
し、光から保護された氷浴中で20分間インキュベートし
た。酸化されたHRP をセファデックスG25 ゲル濾過によ
り消費されなかった過ヨウ素酸ナトリウムから分離し
た。酸化されたHRP をLeY - ヒドラジド３mgに添加し、
４時間にわたって４℃で暗所に保ち、時折混合した。そ
の反応液をホウ水素化シアンナトリウムの136.8 mg/ml
2.86μl の添加により中和した。その溶液を暗所で一夜
にわたって４℃に保ち、次いでPBS に対し透析した。ア
リコートを1:20に希釈し、403 nmにおける吸光度を測定
し、0.73の吸光率を使用してその濃度を計算することに
よりHRP 濃度を測定した。チメロソール（0.01％［w/v
］）を防腐剤としてLeY -HRPに添加し、それを４℃で
貯蔵した。
【００７９】BR96 CDR3 Ｈ鎖ライブラリーからのフィル
ターリフトを上記のようにして調製し、ブロット−トィ
ーン（0.5 ％［w/v ］のカーネーション無脂肪ドライミ
ルク、0.01％［v/v ］のアンチフォーム-A、0.01％［v/
v ］のチメロソール、0.2 ％［v/v ］のトィーン20（商
標) を含むPBS)でブロックした。ニトロセルロースリフ
トを４℃で一夜にわたってブロット−トィーン中２μg/
mlのLeY -HRPで探査した。フィルターをPBS 、0.1 ％(v
/v) のトィーン20（商標) 中で室温で５分間にわたって
５回洗浄し、次いでエンハンスト・ケミルミネッセンス
・リーゲント（商標)(アメーシャム・ライフ・サイエン
シィズ、アーリントン・ハイツ、IL）で展開した。BR96
CDR3 Ｈ鎖ライブラリースクリーンから、単一クロー
ン、即ち、BR96 H3-1 は親BR96よりも強いシグナルを生
じた。このクローンをプラーク精製し、周辺質フラクシ
ョンを調製し、そしてパラホルムアルデヒド定着H3396
腫瘍細胞への結合につきELISA により分析した。BR96 H
3-1-1 と称されるプラーク精製されたBR96変異体は定着
H3396 細胞を結合しただけでなく、BR96 M1 を結合し
た。親BR96及びBR96 M1 と比較してBR96 H3-1-1 のDNA
配列を以下に示す。
ターリフトを上記のようにして調製し、ブロット−トィ
ーン（0.5 ％［w/v ］のカーネーション無脂肪ドライミ
ルク、0.01％［v/v ］のアンチフォーム-A、0.01％［v/
v ］のチメロソール、0.2 ％［v/v ］のトィーン20（商
標) を含むPBS)でブロックした。ニトロセルロースリフ
トを４℃で一夜にわたってブロット−トィーン中２μg/
mlのLeY -HRPで探査した。フィルターをPBS 、0.1 ％(v
/v) のトィーン20（商標) 中で室温で５分間にわたって
５回洗浄し、次いでエンハンスト・ケミルミネッセンス
・リーゲント（商標)(アメーシャム・ライフ・サイエン
シィズ、アーリントン・ハイツ、IL）で展開した。BR96
CDR3 Ｈ鎖ライブラリースクリーンから、単一クロー
ン、即ち、BR96 H3-1 は親BR96よりも強いシグナルを生
じた。このクローンをプラーク精製し、周辺質フラクシ
ョンを調製し、そしてパラホルムアルデヒド定着H3396
腫瘍細胞への結合につきELISA により分析した。BR96 H
3-1-1 と称されるプラーク精製されたBR96変異体は定着
H3396 細胞を結合しただけでなく、BR96 M1 を結合し
た。親BR96及びBR96 M1 と比較してBR96 H3-1-1 のDNA
配列を以下に示す。
【００８０】 ＶH CDR3 アミノ酸位置： 99 100 101 102 103 104 105 BR96 GGC CTG GAC GAC GGG GCC TGG Gly Leu Asp Asp Gly Ala Trp BR96 M1 GGC CTG GCG GAC GGG GCC TGG Gly Leu Ala Asp Gly Ala Trp BR96 GGC CTG GCG GAC GGG GCG TGG H3-1-1 Gly Leu Ala Asp Gly Ala Trp DNA 配列分析は、高アフィニティーBR96変異体BR96 H3-
1-1 がBR96 M1 （これはH3396 腫瘍細胞へのそれの結合
により選択された）と同一のアミノ酸配列を有すること
を明らかにし、BR96 M1 高アフィニティー表現型がH339
6 細胞で発現されたLeY 抗原との強い相互作用から生じ
ることを再度実証した。また、配列同一性は、CDR3の位
置101 のアラニンが高アフィニティー表現型を与えるの
に重要であることを示唆した。最後にまた、配列決定
は、BR96 H3-1-1 がBR96 CDR3 Ｈ鎖ライブラリーから選
択され、そして変異体BR96 M1 ではないことを示した。
何となれば、BR96 H3-1-1 中のAla104が親BR96そしてBR
96 M1 に見られるGCC ではなくGCG によりコードされた
からである。
1-1 がBR96 M1 （これはH3396 腫瘍細胞へのそれの結合
により選択された）と同一のアミノ酸配列を有すること
を明らかにし、BR96 M1 高アフィニティー表現型がH339
6 細胞で発現されたLeY 抗原との強い相互作用から生じ
ることを再度実証した。また、配列同一性は、CDR3の位
置101 のアラニンが高アフィニティー表現型を与えるの
に重要であることを示唆した。最後にまた、配列決定
は、BR96 H3-1-1 がBR96 CDR3 Ｈ鎖ライブラリーから選
択され、そして変異体BR96 M1 ではないことを示した。
何となれば、BR96 H3-1-1 中のAla104が親BR96そしてBR
96 M1 に見られるGCC ではなくGCG によりコードされた
からである。
【００８１】コドンをベースとする突然変異誘発BR96 M
1 ライブラリーの構築：LeY 抗原に対するBR96 M1 のア
フィニティーを更に強化する試みでBR96 M1 をコドンを
ベースとする突然変異誘発の鋳型として使用した。ウリ
ジニル化BR96ΔCDR 1 ＶH 鋳型を、CDR3 Ala101 突然変
異をコードするオリゴヌクレオチドで突然変異誘発し、
VHのCDR3中にAla101突然変異を含むクローンを単離し
た。ウリジニル化鋳型を調製し、そして上記のようにし
てBR96 H1P及びBR96 H1Mコドンをベースとするオリゴヌ
クレオチドを使用してコドンをベースとするライブラリ
ーをＨ鎖CDR1中に構築した。このライブラリーを前記の
ようにしてLeY -HRPを用いるリフトアッセイによりスク
リーニングし、一つのクローンであるM4を抗原に対しBR
96 M1 よりも高いアフィニティーを潜在的に有するもの
として同定した。クローンのDNA 配列決定はCDR1中の３
アミノ酸変化を明らかにし、これらを以下に記載する。 ＶH CDR1 アミノ酸位置： 26 27 28 29 30 31 32 BR96 GGA TTC ACT TTC AGT GAC TAT Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr BR96 M4 GGA TTC CCG TTC GCG TCG TAT Gly Phe Pro Phe Ala Ser Tyr
1 ライブラリーの構築：LeY 抗原に対するBR96 M1 のア
フィニティーを更に強化する試みでBR96 M1 をコドンを
ベースとする突然変異誘発の鋳型として使用した。ウリ
ジニル化BR96ΔCDR 1 ＶH 鋳型を、CDR3 Ala101 突然変
異をコードするオリゴヌクレオチドで突然変異誘発し、
VHのCDR3中にAla101突然変異を含むクローンを単離し
た。ウリジニル化鋳型を調製し、そして上記のようにし
てBR96 H1P及びBR96 H1Mコドンをベースとするオリゴヌ
クレオチドを使用してコドンをベースとするライブラリ
ーをＨ鎖CDR1中に構築した。このライブラリーを前記の
ようにしてLeY -HRPを用いるリフトアッセイによりスク
リーニングし、一つのクローンであるM4を抗原に対しBR
96 M1 よりも高いアフィニティーを潜在的に有するもの
として同定した。クローンのDNA 配列決定はCDR1中の３
アミノ酸変化を明らかにし、これらを以下に記載する。 ＶH CDR1 アミノ酸位置： 26 27 28 29 30 31 32 BR96 GGA TTC ACT TTC AGT GAC TAT Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr BR96 M4 GGA TTC CCG TTC GCG TCG TAT Gly Phe Pro Phe Ala Ser Tyr
【００８２】BR96 M4 Fab をアフィニティークロマトグ
ラフィー（上記の方法を参照のこと）により単離し、EL
ISA により分析して、それがBR96 M1 と比較して増大さ
れたアフィニティーを有するという観察をリフトアッセ
イで確認した。LeY -HSAへの精製BR96 M4 Fab 及び精製
BR96 M1 Fab の結合をタンパク質加水分解により誘導さ
れたキメラBR96 Fabと比較した。結果は、BR96 M4 Fab
がBR96 M1 Fab と比較してLeY -HSAへの結合を約４倍改
良し、そして親BR96 Fabと比較して15倍の改良に近づく
ことを示した（図１０）。親BR96 Fab、BR96 M1 Fab 、
及びBR96 M4 Fab のアフィニティーを表面プラズモン共
鳴(BIAコアー、バイオセンサー、ピスキャットアウェ
ー、NJ) により定量化した。実験をE.Wolff ら, (1993,
Cancer Res., 53:2560-2565) により記載されたように
して行ったが、以下のように改良した。LeY -HSAを、約
7300 pg/mm2に相当する7300 RU(屈折単位）がカップリ
ングされるように誘導体化された金属センサーチップに
固定した。次いで夫々の精製Fab を40μl/分の流量でチ
ップに注入し、センサーチップとのFab の相互作用の時
間を38秒に制限した。減衰された表面プラズモン共鳴角
度の変化を表面に結合されたタンパク質の質量の変化の
指標として測定した。タンパク質加水分解により誘導さ
れたキメラBR96 Fabを1.0 μM から9.4 μM の範囲の５
つの濃度で、BR96 M1 Fab を0.8 μM から4.2 μM の範
囲の５つの濃度で、またBR96 M4 Fab を0.4 μM から4.
2 μM の範囲の５つの濃度で分析した。夫々の試料の二
重反復試験を行い、データをバイオセンサー・ソフトウ
ェアー・パッケージで分析した。ｋoff 及びｋonをE.Wo
lff ら(1993, Cancer Res., 53:2560-2565) により記載
されたようにして結合曲線の解離部分及び会合部分から
測定し、二つの比をＫd とした。
ラフィー（上記の方法を参照のこと）により単離し、EL
ISA により分析して、それがBR96 M1 と比較して増大さ
れたアフィニティーを有するという観察をリフトアッセ
イで確認した。LeY -HSAへの精製BR96 M4 Fab 及び精製
BR96 M1 Fab の結合をタンパク質加水分解により誘導さ
れたキメラBR96 Fabと比較した。結果は、BR96 M4 Fab
がBR96 M1 Fab と比較してLeY -HSAへの結合を約４倍改
良し、そして親BR96 Fabと比較して15倍の改良に近づく
ことを示した（図１０）。親BR96 Fab、BR96 M1 Fab 、
及びBR96 M4 Fab のアフィニティーを表面プラズモン共
鳴(BIAコアー、バイオセンサー、ピスキャットアウェ
ー、NJ) により定量化した。実験をE.Wolff ら, (1993,
Cancer Res., 53:2560-2565) により記載されたように
して行ったが、以下のように改良した。LeY -HSAを、約
7300 pg/mm2に相当する7300 RU(屈折単位）がカップリ
ングされるように誘導体化された金属センサーチップに
固定した。次いで夫々の精製Fab を40μl/分の流量でチ
ップに注入し、センサーチップとのFab の相互作用の時
間を38秒に制限した。減衰された表面プラズモン共鳴角
度の変化を表面に結合されたタンパク質の質量の変化の
指標として測定した。タンパク質加水分解により誘導さ
れたキメラBR96 Fabを1.0 μM から9.4 μM の範囲の５
つの濃度で、BR96 M1 Fab を0.8 μM から4.2 μM の範
囲の５つの濃度で、またBR96 M4 Fab を0.4 μM から4.
2 μM の範囲の５つの濃度で分析した。夫々の試料の二
重反復試験を行い、データをバイオセンサー・ソフトウ
ェアー・パッケージで分析した。ｋoff 及びｋonをE.Wo
lff ら(1993, Cancer Res., 53:2560-2565) により記載
されたようにして結合曲線の解離部分及び会合部分から
測定し、二つの比をＫd とした。
【００８３】速度定数及びＫd を以下に示す。BR96 M1
のアフィニティーはLeY -HSAに対しタンパク質加水分解
により誘導されたキメラBR96 Fabよりも4.5 倍大きく、
またBR96 M4 はキメラBR96 Fabと較べて14倍改良された
アフィニティーを有していた。Ｋd 値の差は主としてｋ
off 速度定数の差により反映された。 Fab ｋoff （秒-1） ｋon Ｋd （μM) キメラBR96 Fab (Ｍ-1秒-1） に対する相対値 キメラ 0.17 1.7 x 104 9.9 1.0x BR96 BR96 M1 0.043 2.0 x 104 2.2 4.5x BR96 M4 0.017 2.4 x 104 0.72 14x ELISA 実験及び表面プラズモン共鳴実験は、BR96 M4 が
BR96 M1 よりも高いアフィニティーでLeY に結合するこ
とを実証した。別のELISA をH3396 膜（上記の方法）を
用いて行って腫瘍抗原に関する差異を調べた。抗原とし
てLeY を用いるアッセイの結果と対照的に、BR96 M4 は
BR96 M1 と較べて同じ倍率の増加を示さなかったが、非
常に類似して結合した（図11）。同様の結果をヒト転移
肺腺癌由来細胞系であるH2987(Schreiber, G. ら, 199
2, Cancer Res. 52:3262-3266) からの膜で観察した。
それ故、テトラサッカリドに対するBR96またはその他の
抗Le Y 抗体の結合アフィニティーの改良は腫瘍抗原に対
する増大されたアフィニティーを必ずしも付与しないか
もしれない（図25）。
のアフィニティーはLeY -HSAに対しタンパク質加水分解
により誘導されたキメラBR96 Fabよりも4.5 倍大きく、
またBR96 M4 はキメラBR96 Fabと較べて14倍改良された
アフィニティーを有していた。Ｋd 値の差は主としてｋ
off 速度定数の差により反映された。 Fab ｋoff （秒-1） ｋon Ｋd （μM) キメラBR96 Fab (Ｍ-1秒-1） に対する相対値 キメラ 0.17 1.7 x 104 9.9 1.0x BR96 BR96 M1 0.043 2.0 x 104 2.2 4.5x BR96 M4 0.017 2.4 x 104 0.72 14x ELISA 実験及び表面プラズモン共鳴実験は、BR96 M4 が
BR96 M1 よりも高いアフィニティーでLeY に結合するこ
とを実証した。別のELISA をH3396 膜（上記の方法）を
用いて行って腫瘍抗原に関する差異を調べた。抗原とし
てLeY を用いるアッセイの結果と対照的に、BR96 M4 は
BR96 M1 と較べて同じ倍率の増加を示さなかったが、非
常に類似して結合した（図11）。同様の結果をヒト転移
肺腺癌由来細胞系であるH2987(Schreiber, G. ら, 199
2, Cancer Res. 52:3262-3266) からの膜で観察した。
それ故、テトラサッカリドに対するBR96またはその他の
抗Le Y 抗体の結合アフィニティーの改良は腫瘍抗原に対
する増大されたアフィニティーを必ずしも付与しないか
もしれない（図25）。
【００８４】実施例２ 変異体BR96抗体の哺乳類発現： 変異体BR96、特に、変
異体BR96 M1 及び変異体BR96 M4 、ＶH 領域配列を哺乳
類発現ベクターに導入した。マウスBR96Ｌ鎖のみを産生
するハイブリドーマHB10036 を産生するBR96の変異体
に、エレクトロポレーションによりＨ鎖ベクターを移入
し、全抗体を産生する細胞をクローン化した。細胞を96
ウェル組織培養プレートに塗布し、ベクターを含む細胞
のみが生存するように選択培地に入れた。培養上澄みを
免疫グロブリンの存在につき２−３週間後に分析した。
免疫グロブリンを分泌する細胞を軟寒天クローニング(C
asino, P., Baumal, R., Laskov, R.,及びSharff, M.
D., “マウスミエローマ細胞のクローニング及び稀少変
異体の検出" J.Cell.Physio. (1972) 79:429-444) によ
りクローン化し、そして抗体を産生するクローンを単離
した。培養物を１−４リットルの容積中で増殖させ、抗
体をプロテインＡクロマトグラフィーにより上澄みから
単離した。変異体BR96 IgG抗体を培養上澄みから単離
し、表面プラズモン共鳴実験によるアフィニティーの組
織学及び測定に使用した。両方の変異体からのＶH 領域
配列を、夫々の変異体の夫々を含む二本鎖ファージベク
ターDNA を使用してPCR により増幅した。夫々の変異体
につき、ＶH 領域をコードする増幅DNA を、ヒトIgG4(C
oloma, M.J., Hastings, A., Wims, L.A.,Morrison, S.
L.“PCR により生じた可変領域を使用する抗体分子の発
現のための新規なベクター" J.Meth. (1992) 152:89-10
4)の一定領域を含むＨ鎖ベクターに挿入した。
異体BR96 M1 及び変異体BR96 M4 、ＶH 領域配列を哺乳
類発現ベクターに導入した。マウスBR96Ｌ鎖のみを産生
するハイブリドーマHB10036 を産生するBR96の変異体
に、エレクトロポレーションによりＨ鎖ベクターを移入
し、全抗体を産生する細胞をクローン化した。細胞を96
ウェル組織培養プレートに塗布し、ベクターを含む細胞
のみが生存するように選択培地に入れた。培養上澄みを
免疫グロブリンの存在につき２−３週間後に分析した。
免疫グロブリンを分泌する細胞を軟寒天クローニング(C
asino, P., Baumal, R., Laskov, R.,及びSharff, M.
D., “マウスミエローマ細胞のクローニング及び稀少変
異体の検出" J.Cell.Physio. (1972) 79:429-444) によ
りクローン化し、そして抗体を産生するクローンを単離
した。培養物を１−４リットルの容積中で増殖させ、抗
体をプロテインＡクロマトグラフィーにより上澄みから
単離した。変異体BR96 IgG抗体を培養上澄みから単離
し、表面プラズモン共鳴実験によるアフィニティーの組
織学及び測定に使用した。両方の変異体からのＶH 領域
配列を、夫々の変異体の夫々を含む二本鎖ファージベク
ターDNA を使用してPCR により増幅した。夫々の変異体
につき、ＶH 領域をコードする増幅DNA を、ヒトIgG4(C
oloma, M.J., Hastings, A., Wims, L.A.,Morrison, S.
L.“PCR により生じた可変領域を使用する抗体分子の発
現のための新規なベクター" J.Meth. (1992) 152:89-10
4)の一定領域を含むＨ鎖ベクターに挿入した。
【００８５】精製された変異体BR96 M1 IgG 及び変異体
BR96 M4 IgG を組織化学技術により腫瘍細胞、腫瘍由来
細胞系、及び正常な組織への結合特異性につき分析し
た。H.J.Garrigues ら（原発性ヒトメラノーマの組織部
分中のヒトメラノーマ関連抗原、p97 の検出）により改
良されたペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ(PAP)
技術(L.A.Sternberger, 標識されていない抗体ペルオキ
シダーゼ−抗ペルオキシダーゼ(PAP) 方法; Immunocyto
chemistry, 104-169頁; ニューヨーク: ジョン・ウィリ
ィ・サンズ社, 1979) を使用した。マウスIgG1Ｈ鎖及び
マウスカッパー鎖一定領域を含むマウスBR96、並びにヒ
トIgG4及びマウスカッパー鎖一定領域を含むキメラBR96
(ChiBR96)を対照として入れた。追加の対照は精製抗体
の希釈剤として使用した培地を含んでいた。実験の結果
を表２（変異体BR96抗体の組織学）に示す。変異体抗
体、即ち、変異体BR96 M1 及び変異体BR96 M4 は腫瘍組
織に対し同様の特異性、並びにBR96のマウス形態及びキ
メラ形態の両方で観察されたのと同様の正常な結腸、膵
臓、胃及び食道組織への結合を有していた。変異体抗体
は正常な肝臓及び心臓組織に結合せず、また結合は脾臓
及び腎臓につき対照で観察されたのよりもほんのわずか
に大きかった。それ故、BR96 CDR領域の可変配列中の突
然変異の導入は腫瘍特異性に悪影響せず、また正常な組
織への結合を著しく増大しなかった。
BR96 M4 IgG を組織化学技術により腫瘍細胞、腫瘍由来
細胞系、及び正常な組織への結合特異性につき分析し
た。H.J.Garrigues ら（原発性ヒトメラノーマの組織部
分中のヒトメラノーマ関連抗原、p97 の検出）により改
良されたペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ(PAP)
技術(L.A.Sternberger, 標識されていない抗体ペルオキ
シダーゼ−抗ペルオキシダーゼ(PAP) 方法; Immunocyto
chemistry, 104-169頁; ニューヨーク: ジョン・ウィリ
ィ・サンズ社, 1979) を使用した。マウスIgG1Ｈ鎖及び
マウスカッパー鎖一定領域を含むマウスBR96、並びにヒ
トIgG4及びマウスカッパー鎖一定領域を含むキメラBR96
(ChiBR96)を対照として入れた。追加の対照は精製抗体
の希釈剤として使用した培地を含んでいた。実験の結果
を表２（変異体BR96抗体の組織学）に示す。変異体抗
体、即ち、変異体BR96 M1 及び変異体BR96 M4 は腫瘍組
織に対し同様の特異性、並びにBR96のマウス形態及びキ
メラ形態の両方で観察されたのと同様の正常な結腸、膵
臓、胃及び食道組織への結合を有していた。変異体抗体
は正常な肝臓及び心臓組織に結合せず、また結合は脾臓
及び腎臓につき対照で観察されたのよりもほんのわずか
に大きかった。それ故、BR96 CDR領域の可変配列中の突
然変異の導入は腫瘍特異性に悪影響せず、また正常な組
織への結合を著しく増大しなかった。
【００８６】
【表４】 表２ 変異体BR96抗体の組織学 培地 抗体1 mu BR96 chi BR96 chi M1 chi M4単独 組織 癌 卵巣 4+ 4+ 4+ 4+ - 肺 4+ 4+ 4+ 4+ - 乳 4+ 4+ 4+ 4+ - 結腸 4+ 4+ 4+ 4+ ± 正常な組織 結腸 - - - - ± 膵臓 3 3+ 3+ 3+ ± 胃 3 3+ 3+ 3+ ± 食道 2+ 2+ 2+ 1+ - 脾臓 ± ± ± ± - 肝臓 - - - - - 腎臓 - - - - - 心臓 - - - - - 細胞系 H3719 - - - - - M1 4+ 4+ 4+ 4+ - 1 マウスBR96のＨ鎖一定領域はマウスIgG1である。chi
BR96、M1及びM4のＨ鎖一定領域はヒトIgG4である。全て
の抗体はマウスカッパーＬ鎖一定領域を有する。
BR96、M1及びM4のＨ鎖一定領域はヒトIgG4である。全て
の抗体はマウスカッパーＬ鎖一定領域を有する。
【００８７】全抗体分子中の突然変異の導入は抗体の機
能性アフィニティー（結合活性）に影響した。変異体BR
96 M1 及びM4抗体を表面プラズモン共鳴(BIAコアー、フ
ァーマシア）により分析してLeY -HSAへのそれらの結合
速度定数を測定した。データ及び計算ＫD を表３に示
す。変異体BR96 M1 抗体はLeY -HSAに対しBR96抗体より
も８倍大きい機能性アフィニティーを有し、またM4はBR
96と較べてほぼ50倍大きい機能性アフィニティーを有す
る。
能性アフィニティー（結合活性）に影響した。変異体BR
96 M1 及びM4抗体を表面プラズモン共鳴(BIAコアー、フ
ァーマシア）により分析してLeY -HSAへのそれらの結合
速度定数を測定した。データ及び計算ＫD を表３に示
す。変異体BR96 M1 抗体はLeY -HSAに対しBR96抗体より
も８倍大きい機能性アフィニティーを有し、またM4はBR
96と較べてほぼ50倍大きい機能性アフィニティーを有す
る。
【００８８】
【表５】 表３変異体BR96 M1 抗体及びM4抗体の結合速度定数及び計算ＫD のBIA コアー測定 ｋon ｋoff ＫD （Ｍ-1Ｓ-1） （Ｓ-1) ) （Ｍ） chiBR961 2.9x104 60x10-4 210x10-9 M1 1.8x104 3.0x10-4 16x10-9 M4 2.4x104 0.96x10-4 4x10-9 1 chi BR96 はヒトIgG1Ｈ鎖一定領域及びヒトカッパーＬ
鎖一定領域を有する。M1及びM4はヒトIgG4Ｈ鎖一定領域
及びマウスカッパーＬ鎖一定領域を有する。
鎖一定領域を有する。M1及びM4はヒトIgG4Ｈ鎖一定領域
及びマウスカッパーＬ鎖一定領域を有する。
【００８９】実施例３ 変異体BR96配列を有するSFv 分子 M1突然変異、即ち、BR96のＨ鎖のCDR3中の位置101 にお
けるアラニンへのアスパラギン酸の変化を一本鎖Fv (sF
v)及びsFv-PE40融合タンパク質構築物に導入した。更に
また、変異体BR96 M1 sFv 分子をM13 ベクター中で構築
した。 変異体BR96 sFvの発現 変異体BR96 M1 を、構築されたpBR96sFv/T7 と称される
BR96 sFv遺伝子融合ベクターに導入した（図17）。BR96
sFv 分子は、(gly4ser)3ペプチドリンカー(Huston, J.
S. ら, 1988, 抗体結合部位のタンパク質エンジニアリ
ング：エシェリキア・コリ中で産生された抗ジギトキシ
ン一本鎖Fv類縁体における特定の活性の回復; Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883; Chaudhary, V.K.ら,
1989, シュードモナスエキソトキシンに融合された二つ
の抗体可変ドメインからなる組換え免疫毒素, Nature
（ロンドン）339:394-397)によりBR96のＶL 領域に共有
結合されたBR96のＶH 領域からなる。(gly4ser)3ペプチ
ドリンカーは適当なリンカーの単に一つの例である。短
いリンカーの全範囲がＶL + ＶH (FV )(Huston, J.S.,L
evinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.S., Novotn
y, J., Margolies, M.N., Ridge, R.J., Bruccoleri,
R.E., Haber, E., Crea, R., Oppermann, H. (1988) 抗
体結合部位のタンパク質エンジニアリング：エシェリキ
ア・コリ中で産生された抗ジギトキシン一本鎖Fv類縁体
における特定の活性の回復; Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.85:5879-5883; Pluckthun, 1991) の免疫グロブリン
鎖を結合するのに使用し得る。
けるアラニンへのアスパラギン酸の変化を一本鎖Fv (sF
v)及びsFv-PE40融合タンパク質構築物に導入した。更に
また、変異体BR96 M1 sFv 分子をM13 ベクター中で構築
した。 変異体BR96 sFvの発現 変異体BR96 M1 を、構築されたpBR96sFv/T7 と称される
BR96 sFv遺伝子融合ベクターに導入した（図17）。BR96
sFv 分子は、(gly4ser)3ペプチドリンカー(Huston, J.
S. ら, 1988, 抗体結合部位のタンパク質エンジニアリ
ング：エシェリキア・コリ中で産生された抗ジギトキシ
ン一本鎖Fv類縁体における特定の活性の回復; Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883; Chaudhary, V.K.ら,
1989, シュードモナスエキソトキシンに融合された二つ
の抗体可変ドメインからなる組換え免疫毒素, Nature
（ロンドン）339:394-397)によりBR96のＶL 領域に共有
結合されたBR96のＶH 領域からなる。(gly4ser)3ペプチ
ドリンカーは適当なリンカーの単に一つの例である。短
いリンカーの全範囲がＶL + ＶH (FV )(Huston, J.S.,L
evinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.S., Novotn
y, J., Margolies, M.N., Ridge, R.J., Bruccoleri,
R.E., Haber, E., Crea, R., Oppermann, H. (1988) 抗
体結合部位のタンパク質エンジニアリング：エシェリキ
ア・コリ中で産生された抗ジギトキシン一本鎖Fv類縁体
における特定の活性の回復; Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.85:5879-5883; Pluckthun, 1991) の免疫グロブリン
鎖を結合するのに使用し得る。
【００９０】変異体BR96 M1 sFv （本明細書中、変異体
BR96 M1(D:A-101)と称される）を、BR96と相同の配列に
より3'末端及び5'末端の両方に隣接した突然変異を含む
オリゴヌクレオチドを設計することによりつくった。こ
のオリゴヌクレオチドを使用するPCR 増幅、続いて最大
のストリンジェンシーで変異体オリゴヌクレオチドにハ
イブリッドを形成したプラスミドとのクローンを選択す
るためのハイブリダイゼーション実験は、M1突然変異を
含むプラスミドの単離を生じた。BR96 sFv (D:A-101)プ
ラスミドの配列をヌクレオチド配列決定により確認し
た。発現されたBR96 sFv及び変異体BR96 sFv (D:A-101)
を、バクテリア内で形成された封入体から単離した。封
入体を単離し、変性し、タンパク質を再度折り畳み、P.
N.Friedmanら(1993, BR96 sFv-PE40, 癌細胞を選択的に
死滅させる強力な一本鎖免疫毒素; Cancer Res. 53:334
-339) により記載されたようにして精製した。精製さ
れ、再度折り畳まれたsFv 分子をELISA によりLeY -HSA
及び腫瘍細胞膜への結合につき分析した（図18及び1
9）。BR96IgG 及びBR96タンパク質加水分解誘導Fab を
アッセイに入れ、そしてL6 IgGを陰性対照として入れ
た。同様のデータが、BR96 sFv-Pe40 及び変異体M1 sFv
-PE40 融合タンパク質を用いる表面プラズモン共鳴実験
から得られた。BR96 sFv-Pe40 ベクターの構築及びその
発現がP.Friedmanら(1993) BR96 sFv-Pe40, 癌細胞を選
択的に死滅させる強力な一本鎖免疫毒素; Cancer Res.
53:334-339) により記載されている。asp-->ala 101 突
然変異を、変異体BR96 sFv (D:A-101)につき記載された
ようにしてPCR により導入した。
BR96 M1(D:A-101)と称される）を、BR96と相同の配列に
より3'末端及び5'末端の両方に隣接した突然変異を含む
オリゴヌクレオチドを設計することによりつくった。こ
のオリゴヌクレオチドを使用するPCR 増幅、続いて最大
のストリンジェンシーで変異体オリゴヌクレオチドにハ
イブリッドを形成したプラスミドとのクローンを選択す
るためのハイブリダイゼーション実験は、M1突然変異を
含むプラスミドの単離を生じた。BR96 sFv (D:A-101)プ
ラスミドの配列をヌクレオチド配列決定により確認し
た。発現されたBR96 sFv及び変異体BR96 sFv (D:A-101)
を、バクテリア内で形成された封入体から単離した。封
入体を単離し、変性し、タンパク質を再度折り畳み、P.
N.Friedmanら(1993, BR96 sFv-PE40, 癌細胞を選択的に
死滅させる強力な一本鎖免疫毒素; Cancer Res. 53:334
-339) により記載されたようにして精製した。精製さ
れ、再度折り畳まれたsFv 分子をELISA によりLeY -HSA
及び腫瘍細胞膜への結合につき分析した（図18及び1
9）。BR96IgG 及びBR96タンパク質加水分解誘導Fab を
アッセイに入れ、そしてL6 IgGを陰性対照として入れ
た。同様のデータが、BR96 sFv-Pe40 及び変異体M1 sFv
-PE40 融合タンパク質を用いる表面プラズモン共鳴実験
から得られた。BR96 sFv-Pe40 ベクターの構築及びその
発現がP.Friedmanら(1993) BR96 sFv-Pe40, 癌細胞を選
択的に死滅させる強力な一本鎖免疫毒素; Cancer Res.
53:334-339) により記載されている。asp-->ala 101 突
然変異を、変異体BR96 sFv (D:A-101)につき記載された
ようにしてPCR により導入した。
【００９１】変異体BR96 sFvの発現 BR96 sFv配列及び変異体M1 sFv配列（夫々、(gly4ser)3
ペプチドリンカーによりBR96のＶL 領域に共有結合され
たBR96及びM1のＶH 領域）をM13 ベクターに導入した。
sFv 分子を5' (ＶH ) 末端でバクテリアリーダーペプチ
ド、pel B に結合し、その結果、そのポリペプチドをバ
クテリアの細胞周辺腔に送った（図17）。sFv 分子をバ
クテリアの細胞周辺腔から単離した。sFv をFab 分子に
つき前記されたようにして周辺質から単離し、こうして
変性及び再度の折り畳みが上記の封入体中のSfv 分子に
つき必要とされなかった。LeY -HSAへの周辺質製剤中の
BR96及び変異体BR96 M1 Sfv の結合をELISA により比較
し、結果を図20に示す。周辺質フラクションからのFab
分子で観察されたのと同じ倍率の差、４−５倍が、一本
鎖分子で観察された。
ペプチドリンカーによりBR96のＶL 領域に共有結合され
たBR96及びM1のＶH 領域）をM13 ベクターに導入した。
sFv 分子を5' (ＶH ) 末端でバクテリアリーダーペプチ
ド、pel B に結合し、その結果、そのポリペプチドをバ
クテリアの細胞周辺腔に送った（図17）。sFv 分子をバ
クテリアの細胞周辺腔から単離した。sFv をFab 分子に
つき前記されたようにして周辺質から単離し、こうして
変性及び再度の折り畳みが上記の封入体中のSfv 分子に
つき必要とされなかった。LeY -HSAへの周辺質製剤中の
BR96及び変異体BR96 M1 Sfv の結合をELISA により比較
し、結果を図20に示す。周辺質フラクションからのFab
分子で観察されたのと同じ倍率の差、４−５倍が、一本
鎖分子で観察された。
【００９２】BR96 SFV発現プラスミドの構築E.coli 中のBR96 sFvの産生に使用された発現プラスミド
はバクテリオファージT7 RNA ポリメラーゼプロモータ
ー(Studier及びMoffat, 1986) を使用する。可撓性(Gly
4Ser)3ペプチドリンカー(Huston ら, 1988; Chaudhary
ら, 1989) をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖を結
合することに適合性の制限部位を生じるために、PCR を
使用してBR96 V領域の両方の5'末端及び3'末端を修飾し
た。5'ＶH PCR プライマー(5'-GCTAGACATATGGAAGTGAATC
TGCTGGAGTCTGGGGGA-3') を、ATG 翻訳開始コドン（ボー
ルド）及びＶH 遺伝子の最初の９つのコドンを含む特異
なNde 1 制限部位（下線を施した）をコードするように
設計した。対照的に、3'ＶH PCR プライマー(5'-GCTAGA
GGATCCTACAGAGACCGTGACCAGAGTCCCTTG-3') はＪ領域相補
性を有する９のCOOH末端コドン及び3'BamH1 部位（下線
を施した）をコードした。5'ＶL PCR プライマー(5'-TA
CACAAAGCTTGATGTTTTGATGACCCAAATTCCAGTC-3') は成熟Ｖ
L 遺伝子の最初の９のコドン及び5'HindIII 部位（下線
を施した）をコードした。
はバクテリオファージT7 RNA ポリメラーゼプロモータ
ー(Studier及びMoffat, 1986) を使用する。可撓性(Gly
4Ser)3ペプチドリンカー(Huston ら, 1988; Chaudhary
ら, 1989) をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖を結
合することに適合性の制限部位を生じるために、PCR を
使用してBR96 V領域の両方の5'末端及び3'末端を修飾し
た。5'ＶH PCR プライマー(5'-GCTAGACATATGGAAGTGAATC
TGCTGGAGTCTGGGGGA-3') を、ATG 翻訳開始コドン（ボー
ルド）及びＶH 遺伝子の最初の９つのコドンを含む特異
なNde 1 制限部位（下線を施した）をコードするように
設計した。対照的に、3'ＶH PCR プライマー(5'-GCTAGA
GGATCCTACAGAGACCGTGACCAGAGTCCCTTG-3') はＪ領域相補
性を有する９のCOOH末端コドン及び3'BamH1 部位（下線
を施した）をコードした。5'ＶL PCR プライマー(5'-TA
CACAAAGCTTGATGTTTTGATGACCCAAATTCCAGTC-3') は成熟Ｖ
L 遺伝子の最初の９のコドン及び5'HindIII 部位（下線
を施した）をコードした。
【００９３】アニーリング後に、15アミノ酸リンカーを
コードする二重鎖51-merオリゴヌクレオチド(5'-GATCCG
GAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGAGGTTCTA-3'及
び5'-AGCTTAGAACCTCCACCTCCAGATCCACCTCCACCAGAACCTCCA
CCTCCG-3')を特異なBamH 1（ＶH の3'末端）部位とHind
III(ＶL の5'末端）部位の間でつないだ。通常の操作を
使用して、その後、連結反応混合物を5'ＶH プライマー
及び3'ＶL プライマーで増幅し、Nde 1 及びEcoR 1で消
化し、Nde 1 及びEcoR 1で消化されたpMS8(+)(Sambrook
ら, 1989) にクローン化した。得られる発現プラスミ
ド、即ち、BR96 sFv遺伝子融合をコードするpBR96sFv/T
7(図17) をDNA 配列分析により確認した。pBR96sFv-T7
発現プラスミドを、両方のBR96 V領域遺伝子の5'及び3'
EcoRI 末端を変えるPCR プライマーを設計することによ
り構築した。増幅に続いて、BR96ＶH をNdeI-BamHIフラ
グメントに入れ、一方、BR96ＶL をインフレーム翻訳終
止コドンを含むHindIII-EcoRI フラグメントに入れた。
これらのPCR 産物を、可撓性ポリペプチドリンカーをコ
ードする二重鎖オリゴヌクレオチドとつなぎ、そして連
結反応のアリコートを示されるようにPCR に使用した。
約760 bpの遺伝子融合を含む得られるPCR 産物をNde-Ec
oRI フラグメントとしてサブクローン化した。15アミノ
酸可撓性ポリペプチドリンカー((Gly4Ser)3)をコードす
る二重鎖オリゴヌクレオチドでつながれた、BR96Ｈ鎖(1
19アミノ酸) 及びＬ鎖(114アミノ酸) のＶドメインから
なる発現ベクターであるpBR96sFv/T7 をE.coli中のBR96
sFvの発現のために構築した。Nde I(N)部位、Bam HI
(B) 部位、HindIII(H)部位及びEcoRI(E)部位、転写終結
配列(Term)、複製開始点(ori) 及びβ−ラクタマーゼ遺
伝子(AmpR)の相対位置を示す。
コードする二重鎖51-merオリゴヌクレオチド(5'-GATCCG
GAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGAGGTTCTA-3'及
び5'-AGCTTAGAACCTCCACCTCCAGATCCACCTCCACCAGAACCTCCA
CCTCCG-3')を特異なBamH 1（ＶH の3'末端）部位とHind
III(ＶL の5'末端）部位の間でつないだ。通常の操作を
使用して、その後、連結反応混合物を5'ＶH プライマー
及び3'ＶL プライマーで増幅し、Nde 1 及びEcoR 1で消
化し、Nde 1 及びEcoR 1で消化されたpMS8(+)(Sambrook
ら, 1989) にクローン化した。得られる発現プラスミ
ド、即ち、BR96 sFv遺伝子融合をコードするpBR96sFv/T
7(図17) をDNA 配列分析により確認した。pBR96sFv-T7
発現プラスミドを、両方のBR96 V領域遺伝子の5'及び3'
EcoRI 末端を変えるPCR プライマーを設計することによ
り構築した。増幅に続いて、BR96ＶH をNdeI-BamHIフラ
グメントに入れ、一方、BR96ＶL をインフレーム翻訳終
止コドンを含むHindIII-EcoRI フラグメントに入れた。
これらのPCR 産物を、可撓性ポリペプチドリンカーをコ
ードする二重鎖オリゴヌクレオチドとつなぎ、そして連
結反応のアリコートを示されるようにPCR に使用した。
約760 bpの遺伝子融合を含む得られるPCR 産物をNde-Ec
oRI フラグメントとしてサブクローン化した。15アミノ
酸可撓性ポリペプチドリンカー((Gly4Ser)3)をコードす
る二重鎖オリゴヌクレオチドでつながれた、BR96Ｈ鎖(1
19アミノ酸) 及びＬ鎖(114アミノ酸) のＶドメインから
なる発現ベクターであるpBR96sFv/T7 をE.coli中のBR96
sFvの発現のために構築した。Nde I(N)部位、Bam HI
(B) 部位、HindIII(H)部位及びEcoRI(E)部位、転写終結
配列(Term)、複製開始点(ori) 及びβ−ラクタマーゼ遺
伝子(AmpR)の相対位置を示す。
【００９４】BR96 SFVタンパク質の発現及び精製 BL21（λDE3)細胞(Studier＆Moffat, 1986) を、37℃で
100 μg/mlのアンピシリンを含む“テリフィック−ブロ
ース”培地（ギブコ-BRL、ガイザースブルグ、MD) 中で
増殖された発現プラスミドpBR96sFv-T7 で形質転換し、
そして対数期において2.0 のOD650 で１mMのIPTGで誘導
した。細胞を２時間後に回収した。分析のために、試料
１mlを遠心分離により回収し、冷H2O 中で10分間にわた
って浸透圧衝撃を与えた。細胞を再度遠心分離し、細胞
ペレットを10mMのトリス-HCl、pH7.4/10％のグリセロー
ル中で再度懸濁させた。約108 のスフェロプラストから
調製されたアリコートをSDS-PAGEにかけ、染色し(Laemm
li, 1970) 、または抗イディオタイプ757-4-1 mAb を使
用してイムノブロットにかけた。10L 醗酵から調製され
たバルクバクテリア細胞ペレットを上記のようにして処
理し、封入体を前記(Friedman ら, 1993) のようにして
単離した。次いで、徹底的に洗浄された封入体を、100
mMのトリス、pH7.4-0.4 M のL-アルギニン-4mMの酸化グ
ルタチオン（シグマ）中に希釈された7Mのグアニジン-H
Cl、pH7.4 （シグマ）中で４℃で100 μg/mlを越えない
最終濃度まで変性し、そして20mMのトリス-HCl（pH7.4)
に対し徹底的に透析した。一夜の透析後に、再度折り畳
まれたタンパク質を前記(Friedman ら, 1993) のように
陰イオン交換（Ｑ−セファロース、ファーマシア）及び
ゲル濾過クロマトグラフィー(TSK-3000 、トーソハース
社）により精製した。BR96 sFvタンパク質を溜め、ブラ
ッドフォードアッセイ（Bradford, 1976) を使用して定
量化した。
100 μg/mlのアンピシリンを含む“テリフィック−ブロ
ース”培地（ギブコ-BRL、ガイザースブルグ、MD) 中で
増殖された発現プラスミドpBR96sFv-T7 で形質転換し、
そして対数期において2.0 のOD650 で１mMのIPTGで誘導
した。細胞を２時間後に回収した。分析のために、試料
１mlを遠心分離により回収し、冷H2O 中で10分間にわた
って浸透圧衝撃を与えた。細胞を再度遠心分離し、細胞
ペレットを10mMのトリス-HCl、pH7.4/10％のグリセロー
ル中で再度懸濁させた。約108 のスフェロプラストから
調製されたアリコートをSDS-PAGEにかけ、染色し(Laemm
li, 1970) 、または抗イディオタイプ757-4-1 mAb を使
用してイムノブロットにかけた。10L 醗酵から調製され
たバルクバクテリア細胞ペレットを上記のようにして処
理し、封入体を前記(Friedman ら, 1993) のようにして
単離した。次いで、徹底的に洗浄された封入体を、100
mMのトリス、pH7.4-0.4 M のL-アルギニン-4mMの酸化グ
ルタチオン（シグマ）中に希釈された7Mのグアニジン-H
Cl、pH7.4 （シグマ）中で４℃で100 μg/mlを越えない
最終濃度まで変性し、そして20mMのトリス-HCl（pH7.4)
に対し徹底的に透析した。一夜の透析後に、再度折り畳
まれたタンパク質を前記(Friedman ら, 1993) のように
陰イオン交換（Ｑ−セファロース、ファーマシア）及び
ゲル濾過クロマトグラフィー(TSK-3000 、トーソハース
社）により精製した。BR96 sFvタンパク質を溜め、ブラ
ッドフォードアッセイ（Bradford, 1976) を使用して定
量化した。
【００９５】プラスミド構築、タンパク質発現及び精製 BR96 sFv遺伝子融合を構築するためのクローニング戦略
及びBR96 sFvの構造を図17に示す。プラスミドpBR96sFv
/T7 はT7RNA ポリメラーゼ転写プロモーターを使用し、
BR96Ｈ鎖の119 アミノ酸、(Gly4Ser)3を含む15アミノ酸
ポリペプチドリンカー及びBR96Ｌ鎖の114 アミノ酸をコ
ードする。pBR96sFv/T7 をE.coli株BL21（λDE3)に形質
転換し、IPTGによる誘導後に、組換えタンパク質が主と
して封入体に局在化されることがわかった。発現された
sFv が不溶性凝集物として蓄積するので、変性及び再度
の折り畳みが活性タンパク質の精製に必要とされる。BR
96 sFvを含む封入体を変性し、そして物質及び方法に記
載されたようにして復元した。精製をＱ−セファロース
陰イオン交換カラム及びTSK-3000ゲル濾過カラムによる
連続のクロマトグラフィーにより行った。活性タンパク
質を含む画分を溜め、約20倍に濃縮し、-20 ℃における
貯蔵のためにアリコートにした。回収されたBR96 sFvタ
ンパク質は銀染色ゲル分析により90％以上均一であると
推定され、これを結合及び内在化の研究に使用した。ア
ミノ末端アミノ酸配列分析は、BR96 sFvに関して予想さ
れた最初の25アミノ酸を確認した。
及びBR96 sFvの構造を図17に示す。プラスミドpBR96sFv
/T7 はT7RNA ポリメラーゼ転写プロモーターを使用し、
BR96Ｈ鎖の119 アミノ酸、(Gly4Ser)3を含む15アミノ酸
ポリペプチドリンカー及びBR96Ｌ鎖の114 アミノ酸をコ
ードする。pBR96sFv/T7 をE.coli株BL21（λDE3)に形質
転換し、IPTGによる誘導後に、組換えタンパク質が主と
して封入体に局在化されることがわかった。発現された
sFv が不溶性凝集物として蓄積するので、変性及び再度
の折り畳みが活性タンパク質の精製に必要とされる。BR
96 sFvを含む封入体を変性し、そして物質及び方法に記
載されたようにして復元した。精製をＱ−セファロース
陰イオン交換カラム及びTSK-3000ゲル濾過カラムによる
連続のクロマトグラフィーにより行った。活性タンパク
質を含む画分を溜め、約20倍に濃縮し、-20 ℃における
貯蔵のためにアリコートにした。回収されたBR96 sFvタ
ンパク質は銀染色ゲル分析により90％以上均一であると
推定され、これを結合及び内在化の研究に使用した。ア
ミノ末端アミノ酸配列分析は、BR96 sFvに関して予想さ
れた最初の25アミノ酸を確認した。
【００９６】実施例４ IXSYS(商標) M13 ベクター中の一本鎖FV BR96 及び変異
体BR96 M1 の構築 クローニング方法の説明 BR96及び変異体BR96 M1 scFvs をコードするM13 ベクタ
ーを、ポリペプチド配列: pel B リーダー-VH-(Gly4Se
r)3リンカー-VL-デカペプチドを産生するように設計し
た。バクテリアアルカリ性ホスファターゼリーダーペプ
チドをコードする配列中を続くBR96ＶL -Ck 遺伝子で開
始する配列のM13IXBR96 鋳型及びM13IXBR96 M1鋳型を最
初に欠失することによりscFvs を構築した。このベクタ
ーを再度結合すると、BR96Ｈ鎖配列のアミノ末端をバク
テリアペクテートリアーゼ(pel B)リーダーペプチドの
カルボキシ末端に隣接させ、全BR96Ｌ鎖を欠失する。次
いでPCR を使用してpel B リーダーペプチド配列を含む
正プライマー及びM13 ベクター中に含まれたデカペプチ
ド配列に相補性のヌクレオチド配列に加えて(Gly4Ser)3
リンカー配列を含む逆プライマーでファージM13IXBR96
及びM13IXBR96 M1からBR96及び変異体BR96 M1 ＶH 配列
を増幅する。PCR 増幅されたBR96産物及び変異体BR96 M
1 ＶH 産物を使用してハイブリダイゼーション突然変異
誘発によりＬ鎖欠失M13 ベクター中に存在する内生のBR
96遺伝子及び変異体BR96 M1 ＶH 遺伝子を置換する。次
いでPCR を使用してカルボキシ末端BR96 M1 ＶH ヌクレ
オチド配列を含む正プライマー及びM13 ベクター中に含
まれたデカペプチド配列に相補性の配列を含む逆プライ
マーでプラスミドpSE1.0Ala101 (図21) から(Gly4Ser)3
リンカー-BR96 ＶL 配列を増幅する。PCR 増幅された(G
ly4Ser)3リンカー BR96 ＶL 配列の導入がscFvs の構築
を完結する。
体BR96 M1 の構築 クローニング方法の説明 BR96及び変異体BR96 M1 scFvs をコードするM13 ベクタ
ーを、ポリペプチド配列: pel B リーダー-VH-(Gly4Se
r)3リンカー-VL-デカペプチドを産生するように設計し
た。バクテリアアルカリ性ホスファターゼリーダーペプ
チドをコードする配列中を続くBR96ＶL -Ck 遺伝子で開
始する配列のM13IXBR96 鋳型及びM13IXBR96 M1鋳型を最
初に欠失することによりscFvs を構築した。このベクタ
ーを再度結合すると、BR96Ｈ鎖配列のアミノ末端をバク
テリアペクテートリアーゼ(pel B)リーダーペプチドの
カルボキシ末端に隣接させ、全BR96Ｌ鎖を欠失する。次
いでPCR を使用してpel B リーダーペプチド配列を含む
正プライマー及びM13 ベクター中に含まれたデカペプチ
ド配列に相補性のヌクレオチド配列に加えて(Gly4Ser)3
リンカー配列を含む逆プライマーでファージM13IXBR96
及びM13IXBR96 M1からBR96及び変異体BR96 M1 ＶH 配列
を増幅する。PCR 増幅されたBR96産物及び変異体BR96 M
1 ＶH 産物を使用してハイブリダイゼーション突然変異
誘発によりＬ鎖欠失M13 ベクター中に存在する内生のBR
96遺伝子及び変異体BR96 M1 ＶH 遺伝子を置換する。次
いでPCR を使用してカルボキシ末端BR96 M1 ＶH ヌクレ
オチド配列を含む正プライマー及びM13 ベクター中に含
まれたデカペプチド配列に相補性の配列を含む逆プライ
マーでプラスミドpSE1.0Ala101 (図21) から(Gly4Ser)3
リンカー-BR96 ＶL 配列を増幅する。PCR 増幅された(G
ly4Ser)3リンカー BR96 ＶL 配列の導入がscFvs の構築
を完結する。
【００９７】方法 全てのオリゴヌクレオチドをアプライド・バイオシステ
ムズ394 DNA シンセサイザーによるβ−シアノエチルホ
スホルアミジト化学により合成し、オリゴヌクレオチド
精製カートリッジ（アプライド・バイオシステムズ、フ
ォスターシティ、CA）を使用して精製した。オリゴヌク
レオチド961 (5'-CAGATTCACTTCGGCCATGGCCACAGGG-3')を
使用して、夫々クローンM13IXBR96 及びM13IXBR96 M1中
のアルカリ性ホスファターゼリーダーペプチドとBR96配
列及び変異体BR96 M1 配列の間の接合部で部位誘導突然
変異誘発によりNcol部位（下線を施した）を導入した。
Ncol部位を含むM13IXBR96 クローン及びM13IXBR96 M1ク
ローンをNcolエンドヌクレアーゼによる制限消化により
同定した。夫々の突然変異誘発製剤からの３種のクロー
ンを溜め、Ncolで消化した。消化産物をトリス−酢酸塩
緩衝液で緩衝された0.8 ％の低融解温度のアガロースゲ
ルで電気泳動にかけた。アルカリ性ホスファターゼリー
ダーペプチド配列中に欠失BR96Ｌ鎖を含む２種の得られ
る制限フラグメントのうちの大きい方をゲルから切除
し、そのDNA フラグメントを精製した。精製DNA 50ngを
自己連結し、上記のようにしてE.coli株DH10B にエレク
トロポレーションした。
ムズ394 DNA シンセサイザーによるβ−シアノエチルホ
スホルアミジト化学により合成し、オリゴヌクレオチド
精製カートリッジ（アプライド・バイオシステムズ、フ
ォスターシティ、CA）を使用して精製した。オリゴヌク
レオチド961 (5'-CAGATTCACTTCGGCCATGGCCACAGGG-3')を
使用して、夫々クローンM13IXBR96 及びM13IXBR96 M1中
のアルカリ性ホスファターゼリーダーペプチドとBR96配
列及び変異体BR96 M1 配列の間の接合部で部位誘導突然
変異誘発によりNcol部位（下線を施した）を導入した。
Ncol部位を含むM13IXBR96 クローン及びM13IXBR96 M1ク
ローンをNcolエンドヌクレアーゼによる制限消化により
同定した。夫々の突然変異誘発製剤からの３種のクロー
ンを溜め、Ncolで消化した。消化産物をトリス−酢酸塩
緩衝液で緩衝された0.8 ％の低融解温度のアガロースゲ
ルで電気泳動にかけた。アルカリ性ホスファターゼリー
ダーペプチド配列中に欠失BR96Ｌ鎖を含む２種の得られ
る制限フラグメントのうちの大きい方をゲルから切除
し、そのDNA フラグメントを精製した。精製DNA 50ngを
自己連結し、上記のようにしてE.coli株DH10B にエレク
トロポレーションした。
【００９８】レプリカフィルターリフトを調製し(Huse
ら, 1992) 、一つのフィルターをアルカリ性ホスファタ
ーゼに接合されたヤギ抗ヒトカッパー抗体で探査し、ま
た第二フィルターをBR96ＶH を認識する抗イディオタイ
プ抗体757-4-1 で探査した。４種のM13IXBR96 ΔＶL ク
ローン及びカッパー鎖反応性の損失を示すがＨ鎖反応性
の存在を示す４種のM13IXBR96 M1ΔＶL クローンを溜
め、そしてハイブリダイゼーション突然変異誘発により
PCR 増幅(Gly4Ser)3リンカー-BR96 ＶL 配列の導入のた
めのウリジニル化一本鎖鋳型を調製するのに使用した。
最後の突然変異誘発工程はＨ鎖CH1 を欠失する。オリゴ
ヌクレオチド977 (5'-GGGACTCTGGTCACGGTCTCT TCA GGAT
CCGGA-3') は、5'末端でBR96ＶH 配列を有し、そして3'
末端で(Gly4Ser)3リンカー配列を有する正PCR プライマ
ーである。BR96ＶH 中のカルボキシ末端Leu(CTG)を、下
線を施された配列により示されるようにSer(TCA)で置換
した。構築されたscFv BR96 分子はこの位置でLeu では
なくSer を有し、またLeu がどのようにしてscFvの機能
活性に影響するのかが知られていなかったので、これを
行った。オリゴヌクレオチド911 (5'-TGGGTAGGATCCACTA
GTGCGTTTGATCTCCAGCTTGG-3')は3'末端で相補性BR96ＶL
配列を有し、そして5'末端でデカペプチド配列を有する
逆PCR プライマーである。プラスミドpSE 1.0Ala101 を
制限エンドヌクレアーゼXholで直線状にし、そして２ n
g/μl の濃度で再度懸濁させた。10ngのpSE 1.0Ala101
を、プライマー977 及び911 を使用して(Gly4Ser)3リン
カー-BR96 ＶL 配列を増幅するのに使用した。PCR 増幅
DNA をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、
続いてハイブリダイゼーション突然変異誘発によりM13I
XBR96 M1ΔＶL 鋳型及びM13IXBR96 ΔＶL 鋳型に導入し
た。得られるM13IXBR96 クローン及びM13IXBR96 M1 scF
v クローンをH3396 腫瘍細胞への結合につきスクリーニ
ングし、そして腫瘍反応性クローンを同定し、プラーク
精製し、そして正確なDNA 配列をDNA 配列分析により確
認した（図20）。
ら, 1992) 、一つのフィルターをアルカリ性ホスファタ
ーゼに接合されたヤギ抗ヒトカッパー抗体で探査し、ま
た第二フィルターをBR96ＶH を認識する抗イディオタイ
プ抗体757-4-1 で探査した。４種のM13IXBR96 ΔＶL ク
ローン及びカッパー鎖反応性の損失を示すがＨ鎖反応性
の存在を示す４種のM13IXBR96 M1ΔＶL クローンを溜
め、そしてハイブリダイゼーション突然変異誘発により
PCR 増幅(Gly4Ser)3リンカー-BR96 ＶL 配列の導入のた
めのウリジニル化一本鎖鋳型を調製するのに使用した。
最後の突然変異誘発工程はＨ鎖CH1 を欠失する。オリゴ
ヌクレオチド977 (5'-GGGACTCTGGTCACGGTCTCT TCA GGAT
CCGGA-3') は、5'末端でBR96ＶH 配列を有し、そして3'
末端で(Gly4Ser)3リンカー配列を有する正PCR プライマ
ーである。BR96ＶH 中のカルボキシ末端Leu(CTG)を、下
線を施された配列により示されるようにSer(TCA)で置換
した。構築されたscFv BR96 分子はこの位置でLeu では
なくSer を有し、またLeu がどのようにしてscFvの機能
活性に影響するのかが知られていなかったので、これを
行った。オリゴヌクレオチド911 (5'-TGGGTAGGATCCACTA
GTGCGTTTGATCTCCAGCTTGG-3')は3'末端で相補性BR96ＶL
配列を有し、そして5'末端でデカペプチド配列を有する
逆PCR プライマーである。プラスミドpSE 1.0Ala101 を
制限エンドヌクレアーゼXholで直線状にし、そして２ n
g/μl の濃度で再度懸濁させた。10ngのpSE 1.0Ala101
を、プライマー977 及び911 を使用して(Gly4Ser)3リン
カー-BR96 ＶL 配列を増幅するのに使用した。PCR 増幅
DNA をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、
続いてハイブリダイゼーション突然変異誘発によりM13I
XBR96 M1ΔＶL 鋳型及びM13IXBR96 ΔＶL 鋳型に導入し
た。得られるM13IXBR96 クローン及びM13IXBR96 M1 scF
v クローンをH3396 腫瘍細胞への結合につきスクリーニ
ングし、そして腫瘍反応性クローンを同定し、プラーク
精製し、そして正確なDNA 配列をDNA 配列分析により確
認した（図20）。
【００９９】実施例５一本鎖BR96及び変異体BR96 sFv-PE40 免疫毒素の調製 この実施例は、一本鎖免疫毒素、BR96と、PE40に結合さ
れたBR96及び本発明の変異体BR96モノクローナル抗体の
クローン化されたＨ鎖Fv部分及びＬ鎖Fv部分からなる変
異体BR96 sFV-PE40 の調製及びその細胞毒性の特性決定
を記載する（図21）。一本鎖組換え免疫毒素を産生する
ために、BR96 IgGのＬ鎖及びＨ鎖のFvドメインを、PCR
増幅を使用してBR96 Fv 配列を含むプラスミドBR96 Fv
から単離した。プラスミドpBR96Fv によりコードされた
BR96 sFv配列で開始して、Ｌ鎖中のKpn I 制限部位まで
の合成(Gly4Ser)3ヒンジ領域と連結された可変Ｈ鎖及び
可変Ｌ鎖に相当する550 bpの配列を使用して特定のプラ
イマー(Friedman ら, 上記文献）でPCR 増幅した。PCR
増幅そしてNde I 及びKpn I による消化後に、550 bpの
Nde I-Kpn I フラグメントをプラスミドpMS8から調製さ
れた4220 bp のNde I-Kpn I ベクターフラグメントにつ
ないだ。このプラスミドはT7プロモーターの転写調節の
もとにPE40の遺伝子をコードする［Studier ら, J.Mol.
Biol. 189:113-130 (1986); Debinskiら, モノクローナ
ル抗体C242- シュードモナス外毒素Ａ：抗腫瘍活性を有
する特異性かつ強力な免疫毒素, J.Clin.Invest., 90:4
05-411, 1992) ］。この連結反応の生成物は、pBW 7.01
と称される中間体ベクターであった。続いて、変異体pB
R96 Fvからの227 bpのKpn I フラグメントをpBW 7.01の
特異なKpnI 部位にサブクローン化した。BR96 sFv-PE40
遺伝子融合をコードする得られるプラスミドpBW 7.0
をDNA 配列分析により確認した。変異体BR96を含む類似
プラスミドの生産のために、制限フラグメントまたは合
成オリゴを使用して変異体配列をプラスミドpBW 7.0 に
挿入した。
れたBR96及び本発明の変異体BR96モノクローナル抗体の
クローン化されたＨ鎖Fv部分及びＬ鎖Fv部分からなる変
異体BR96 sFV-PE40 の調製及びその細胞毒性の特性決定
を記載する（図21）。一本鎖組換え免疫毒素を産生する
ために、BR96 IgGのＬ鎖及びＨ鎖のFvドメインを、PCR
増幅を使用してBR96 Fv 配列を含むプラスミドBR96 Fv
から単離した。プラスミドpBR96Fv によりコードされた
BR96 sFv配列で開始して、Ｌ鎖中のKpn I 制限部位まで
の合成(Gly4Ser)3ヒンジ領域と連結された可変Ｈ鎖及び
可変Ｌ鎖に相当する550 bpの配列を使用して特定のプラ
イマー(Friedman ら, 上記文献）でPCR 増幅した。PCR
増幅そしてNde I 及びKpn I による消化後に、550 bpの
Nde I-Kpn I フラグメントをプラスミドpMS8から調製さ
れた4220 bp のNde I-Kpn I ベクターフラグメントにつ
ないだ。このプラスミドはT7プロモーターの転写調節の
もとにPE40の遺伝子をコードする［Studier ら, J.Mol.
Biol. 189:113-130 (1986); Debinskiら, モノクローナ
ル抗体C242- シュードモナス外毒素Ａ：抗腫瘍活性を有
する特異性かつ強力な免疫毒素, J.Clin.Invest., 90:4
05-411, 1992) ］。この連結反応の生成物は、pBW 7.01
と称される中間体ベクターであった。続いて、変異体pB
R96 Fvからの227 bpのKpn I フラグメントをpBW 7.01の
特異なKpnI 部位にサブクローン化した。BR96 sFv-PE40
遺伝子融合をコードする得られるプラスミドpBW 7.0
をDNA 配列分析により確認した。変異体BR96を含む類似
プラスミドの生産のために、制限フラグメントまたは合
成オリゴを使用して変異体配列をプラスミドpBW 7.0 に
挿入した。
【０１００】BR96及び変異体BR96 sFv-PE40 の発現及び精製 BR96及びBR96 sFv-PE40 をコードするプラスミドを、１
ml当たり75μg のアンピシリンを含むスーパーブロース
（ジジーン社、シルバー・スプリングス、MD)中で37℃
で培養された別々に形質転換されたE.coli BL21(λDE3)
細胞であった。650 nmにおける吸光度が1.0 に達した
時、イソプロピル１−チオール−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド(IPTG)を１mMの最終濃度まで添加し、細胞を90分
後に回収した。IPTGによる誘導後に、そのプラスミドで
形質転換されたE.coli細胞は、封入体に局在化された多
量の融合タンパク質を発現した。バクテリアを蔗糖緩衝
液（20％の蔗糖、30mMのトリス-HCl (pH7.4)、１mMのED
TA）中で洗浄し、氷冷H2O 中で浸透圧衝撃を与えて周辺
質を単離した。続いて、封入体をタージトール（シグ
マ）による徹底的な処理によりスフェロプラスト膜タン
パク質から分離して過剰のバクテリアタンパク質を除去
し、続いて7Mのグアニジン-HCl (pH7.4)中で変性し、0.
4MのL-アルギニンを補給したPBS中で再度折り畳み、そ
して0.02M のトリス、pH7.4 に対し徹底的に透析した。
Ｑ−セファロースカラムによる陰イオン交換を使用して
タンパク質を精製し、次いで変異体BR96 sFv-PE40 を含
む画分を溜め、そしてSiegall ら, Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 85:9738-9742 (1988)により記載されたようにし
てファーマシア高速タンパク質液体クロマトグラフィー
(FLPC)系によるゲル濾過（TSK-3000カラムによる）クロ
マトグラフィーにより分離した。直接ルイスＹ決定基結合ELISA BR96 sFv-PE40 と較べて変異体BR96 sFv-PE40 の相対結
合活性を試験するために、直接結合アッセイを行い、こ
の場合、H3396 腫瘍細胞膜をELISA プレートに被覆し、
変異体BR96 sFv-PE40 分子の結合がそのBR96カウンター
パートに対し改良されることが示された（図22）。
ml当たり75μg のアンピシリンを含むスーパーブロース
（ジジーン社、シルバー・スプリングス、MD)中で37℃
で培養された別々に形質転換されたE.coli BL21(λDE3)
細胞であった。650 nmにおける吸光度が1.0 に達した
時、イソプロピル１−チオール−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド(IPTG)を１mMの最終濃度まで添加し、細胞を90分
後に回収した。IPTGによる誘導後に、そのプラスミドで
形質転換されたE.coli細胞は、封入体に局在化された多
量の融合タンパク質を発現した。バクテリアを蔗糖緩衝
液（20％の蔗糖、30mMのトリス-HCl (pH7.4)、１mMのED
TA）中で洗浄し、氷冷H2O 中で浸透圧衝撃を与えて周辺
質を単離した。続いて、封入体をタージトール（シグ
マ）による徹底的な処理によりスフェロプラスト膜タン
パク質から分離して過剰のバクテリアタンパク質を除去
し、続いて7Mのグアニジン-HCl (pH7.4)中で変性し、0.
4MのL-アルギニンを補給したPBS中で再度折り畳み、そ
して0.02M のトリス、pH7.4 に対し徹底的に透析した。
Ｑ−セファロースカラムによる陰イオン交換を使用して
タンパク質を精製し、次いで変異体BR96 sFv-PE40 を含
む画分を溜め、そしてSiegall ら, Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 85:9738-9742 (1988)により記載されたようにし
てファーマシア高速タンパク質液体クロマトグラフィー
(FLPC)系によるゲル濾過（TSK-3000カラムによる）クロ
マトグラフィーにより分離した。直接ルイスＹ決定基結合ELISA BR96 sFv-PE40 と較べて変異体BR96 sFv-PE40 の相対結
合活性を試験するために、直接結合アッセイを行い、こ
の場合、H3396 腫瘍細胞膜をELISA プレートに被覆し、
変異体BR96 sFv-PE40 分子の結合がそのBR96カウンター
パートに対し改良されることが示された（図22）。
【０１０１】実施例６変異体BR96 M14の調製：付加的なCDR から単離された突
然変異の組み合わせ H2ライブラリーの約32,000プラークをフィルターリフト
によりスクリーニングした。sLeyに反応する91のクロー
ンを選択し、ELISA において腫瘍細胞への結合につき二
次スクリーンにかけた。クローンM2はBR96に較べて腫瘍
細胞膜への約４−５倍良好な結合を有していた（図12及
び14）。また、M2反応性はsLey-HSAにつき改良された
が、わずかに２倍であった（図15）。抗原に対する改良
された結合はH2の位置53におけるグリシンからアスパラ
ギン酸の置換(GGTからGAT へ）のためであった（図
４）。再度、この突然変異は、それをBR96配列に再度導
入することにより実証された改良された結合を与えるの
に必要かつ充分であった。突然変異の組み合わせが更な
る結合の改良に寄与するか否かを測定するために、二重
変異体、即ち、M3（表１）を、H2突然変異をコードする
オリゴヌクレオチドによるM1鋳型の部位誘導突然変異誘
発（Kunkelら, 上記文献）により構築した。図14は、二
重変異体がいずれかの突然変異単独よりもH3396 膜にか
なり良好に結合したことを示す。M3結合はM2に較べて約
７倍改良し、またM1よりも４倍改良し、またBR96親より
も約30倍良好であった。sLeyを抗原として使用した場合
の差はそれ程顕著ではなく、この場合、二重変異体はM1
変異体と較べて結合を更に２倍改良してBR96と比較して
10倍の増加を得た。
然変異の組み合わせ H2ライブラリーの約32,000プラークをフィルターリフト
によりスクリーニングした。sLeyに反応する91のクロー
ンを選択し、ELISA において腫瘍細胞への結合につき二
次スクリーンにかけた。クローンM2はBR96に較べて腫瘍
細胞膜への約４−５倍良好な結合を有していた（図12及
び14）。また、M2反応性はsLey-HSAにつき改良された
が、わずかに２倍であった（図15）。抗原に対する改良
された結合はH2の位置53におけるグリシンからアスパラ
ギン酸の置換(GGTからGAT へ）のためであった（図
４）。再度、この突然変異は、それをBR96配列に再度導
入することにより実証された改良された結合を与えるの
に必要かつ充分であった。突然変異の組み合わせが更な
る結合の改良に寄与するか否かを測定するために、二重
変異体、即ち、M3（表１）を、H2突然変異をコードする
オリゴヌクレオチドによるM1鋳型の部位誘導突然変異誘
発（Kunkelら, 上記文献）により構築した。図14は、二
重変異体がいずれかの突然変異単独よりもH3396 膜にか
なり良好に結合したことを示す。M3結合はM2に較べて約
７倍改良し、またM1よりも４倍改良し、またBR96親より
も約30倍良好であった。sLeyを抗原として使用した場合
の差はそれ程顕著ではなく、この場合、二重変異体はM1
変異体と較べて結合を更に２倍改良してBR96と比較して
10倍の増加を得た。
【０１０２】M4中で同定された一つの突然変異、即ち、
CDR1 (M12 変異体）中の残基28におけるThr からPro へ
の突然変異をM3にとり込んでH1、H2、及びH3中で突然変
異を生じることを、オリゴ5'-GCG AAC CCA ATA CAT GTA
ATA GTC ACT GAA CGG GAA TCC AGA GGT TAC ACA GGA-
3' を使用して部位誘導突然変異誘発により行った。ク
ローンを単離し、そして突然変異(Pro=CCG) の導入を配
列決定により確認した。Fab M12 + M2 + M1 (M14変異
体) の結合活性は二重突然変異M3よりも更に２倍改良し
（図27-28)、BR96 Fabよりも60倍大きかった。図29は、
BR96 M14 Fabの結合が(1) BR96 M12 Fab（即ち、アミノ
酸位置28においてスレオニンからプロリンへの単一突然
変異を有する）、(2) BR96 M6 Fab （即ち、アミノ酸位
置28(M12と同じ）及び97 (Asp -> Ala) における突然変
異を有する）、(3) BR96 M3 Fab 、及び(4) キメラBR96
Fabに対し改良されたことを示す。
CDR1 (M12 変異体）中の残基28におけるThr からPro へ
の突然変異をM3にとり込んでH1、H2、及びH3中で突然変
異を生じることを、オリゴ5'-GCG AAC CCA ATA CAT GTA
ATA GTC ACT GAA CGG GAA TCC AGA GGT TAC ACA GGA-
3' を使用して部位誘導突然変異誘発により行った。ク
ローンを単離し、そして突然変異(Pro=CCG) の導入を配
列決定により確認した。Fab M12 + M2 + M1 (M14変異
体) の結合活性は二重突然変異M3よりも更に２倍改良し
（図27-28)、BR96 Fabよりも60倍大きかった。図29は、
BR96 M14 Fabの結合が(1) BR96 M12 Fab（即ち、アミノ
酸位置28においてスレオニンからプロリンへの単一突然
変異を有する）、(2) BR96 M6 Fab （即ち、アミノ酸位
置28(M12と同じ）及び97 (Asp -> Ala) における突然変
異を有する）、(3) BR96 M3 Fab 、及び(4) キメラBR96
Fabに対し改良されたことを示す。
【図１】図１は、ＢＲ９６の可変Ｈ鎖及びＬ鎖のＤＮＡ
及びアミノ酸配列を示したものである。
及びアミノ酸配列を示したものである。
【図２】図２は、ＢＲ９６の可変Ｈ鎖及びＬ鎖のＤＮＡ
及びアミノ酸配列を示したものである。
及びアミノ酸配列を示したものである。
【図３】図３は、異性体ＢＲ９６Ｍ１の可変Ｈ鎖のＤＮ
Ａ及びアミノ酸配列を示したものである。
Ａ及びアミノ酸配列を示したものである。
【図４】図４は、異性体ＢＲ９６Ｍ２の可変Ｈ鎖のＤＮ
Ａ及びアミノ酸配列を示したものである。
Ａ及びアミノ酸配列を示したものである。
【図５】図５は、異性体ＢＲ９６Ｍ４の可変Ｈ鎖のＤＮ
Ａ及びアミノ酸配列を示したものである。
Ａ及びアミノ酸配列を示したものである。
【図６】図６は、異性体ＢＲ９６Ｈ２＋Ｈ３の可変Ｈ鎖
のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示したものである。
のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示したものである。
【図７】図７は、ＣＤＲ異性体を使用したオリゴヌクレ
オチドの合成スキームを図式的に示したものである（Gl
aser, S.M.ら。1992, J. Immunol. 149:3903-3913 参
照) 。
オチドの合成スキームを図式的に示したものである（Gl
aser, S.M.ら。1992, J. Immunol. 149:3903-3913 参
照) 。
【図８】図８は、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を線グラフ
で表したものである。異性体ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂは、Ｃ
ｈｉＢＲ９６Ｆａｂに比べてより強い親和性で、Ｈ３３
９６膜に結合する。
で表したものである。異性体ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂは、Ｃ
ｈｉＢＲ９６Ｆａｂに比べてより強い親和性で、Ｈ３３
９６膜に結合する。
【図９】図９は、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を線グラフ
で表したものである。異性体ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂは、Ｃ
ｈｉＢＲ９６Ｆａｂに比べてより強い親和性で、ＬｅY
−ＨＳＡに結合する。
で表したものである。異性体ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂは、Ｃ
ｈｉＢＲ９６Ｆａｂに比べてより強い親和性で、ＬｅY
−ＨＳＡに結合する。
【図１０】図１０は、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を線グ
ラフで表したものである。異性体ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂ及
び異性体ＢＲ９６Ｍ４Ｆａｂは、ＣｈｉＢＲ９６Ｆａｂ
に比べてより強い親和性で、ＬｅY −ＨＳＡに結合す
る。
ラフで表したものである。異性体ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂ及
び異性体ＢＲ９６Ｍ４Ｆａｂは、ＣｈｉＢＲ９６Ｆａｂ
に比べてより強い親和性で、ＬｅY −ＨＳＡに結合す
る。
【図１１】図１１は、異性体ＢＲ９６Ｍ４Ｆａｂ及び異
性体ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂの、Ｈ３３９６膜に対するＣｈ
ｉＢＲ９６Ｆａｂに比べて向上した親和性を、線グラフ
で表したものである。
性体ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂの、Ｈ３３９６膜に対するＣｈ
ｉＢＲ９６Ｆａｂに比べて向上した親和性を、線グラフ
で表したものである。
【図１２】図１２は、異性体ＢＲ９６Ｍ２Ｆａｂの、Ｈ
３３９６ガン細胞膜に対するＣｈｉＢＲ９６Ｆａｂに比
べて向上した親和性を、線グラフで表したものである。
３３９６ガン細胞膜に対するＣｈｉＢＲ９６Ｆａｂに比
べて向上した親和性を、線グラフで表したものである。
【図１３】図１３は、Ｈ鎖（ＢＲ９６Ｍ４Ｆａｂ）のＣ
ＤＲ１及びＣＤＲ３の突然変異を有する変異体が、ター
ゲット抗原（ＬｅY −ＨＳＡ）に対してＣＤＲ１（ＢＲ
９６Ｈ１（ここではＭ５とも表されている）Ｆａｂ）も
しくはＣＤＲ３（ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂ）単独よりも、又
はＣｈｉＢＲ９６Ｆａｂの突然変異を有する変異体より
も向上した親和性を示すことを、線グラフで表したもの
である。
ＤＲ１及びＣＤＲ３の突然変異を有する変異体が、ター
ゲット抗原（ＬｅY −ＨＳＡ）に対してＣＤＲ１（ＢＲ
９６Ｈ１（ここではＭ５とも表されている）Ｆａｂ）も
しくはＣＤＲ３（ＢＲ９６Ｍ１Ｆａｂ）単独よりも、又
はＣｈｉＢＲ９６Ｆａｂの突然変異を有する変異体より
も向上した親和性を示すことを、線グラフで表したもの
である。
【図１４】図１４は、Ｈ鎖（ＢＲ９６Ｍ３Ｆａｂ）のＣ
ＤＲ２及びＣＤＲ３の突然変異を有する変異体が、ター
ゲット抗原（Ｈ３３９６膜上の）に対してＣＤＲ２（Ｂ
Ｒ９６Ｍ２Ｆａｂ）もしくはＣＤＲ３（ＢＲ９６Ｍ１Ｆ
ａｂ）単独よりも、又はＣｈｉＢＲ９６Ｆａｂの突然変
異を有する変異体よりも向上した親和性を示すことを、
線グラフで表したものである。
ＤＲ２及びＣＤＲ３の突然変異を有する変異体が、ター
ゲット抗原（Ｈ３３９６膜上の）に対してＣＤＲ２（Ｂ
Ｒ９６Ｍ２Ｆａｂ）もしくはＣＤＲ３（ＢＲ９６Ｍ１Ｆ
ａｂ）単独よりも、又はＣｈｉＢＲ９６Ｆａｂの突然変
異を有する変異体よりも向上した親和性を示すことを、
線グラフで表したものである。
【図１５】図１５は、Ｈ鎖（ＢＲ９６Ｍ３Ｆａｂ）のＣ
ＤＲ２及びＣＤＲ３の突然変異を有する変異体が、ター
ゲット抗原（ＬｅY −ＨＳＡ）に対してＣＤＲ２（ＢＲ
９６Ｍ２Ｆａｂ）もしくはＣＤＲ３（ＢＲ９６Ｍ１Ｆａ
ｂ）単独よりも、又はＣｈｉＢＲ９６Ｆａｂの突然変異
を有する変異体よりも向上した親和性を示すことを、線
グラフで表したものである。
ＤＲ２及びＣＤＲ３の突然変異を有する変異体が、ター
ゲット抗原（ＬｅY −ＨＳＡ）に対してＣＤＲ２（ＢＲ
９６Ｍ２Ｆａｂ）もしくはＣＤＲ３（ＢＲ９６Ｍ１Ｆａ
ｂ）単独よりも、又はＣｈｉＢＲ９６Ｆａｂの突然変異
を有する変異体よりも向上した親和性を示すことを、線
グラフで表したものである。
【図１６】図１６は、親ＢＲ９６をＦａｂ分子としてコ
ードするｐＩＸＢＲ９６プラスミドの図式的に表したも
のである。
ードするｐＩＸＢＲ９６プラスミドの図式的に表したも
のである。
【図１７】図１７は、ｐＢＲ９６ｓＦｖ発現プラスミド
の構築スキームを図式的に表したものである。
の構築スキームを図式的に表したものである。
【図１８】図１８は、異性体ＢＲ９６ｓＦｖ（Ｍ１）
（図１７のプラスミドからバクテリア中で生産された再
生物質を表す）のＬｅY −ＨＳＡに対する結合を線グラ
フで表したものである。
（図１７のプラスミドからバクテリア中で生産された再
生物質を表す）のＬｅY −ＨＳＡに対する結合を線グラ
フで表したものである。
【図１９】図１９は、実施例３に記載された、異性体Ｂ
Ｒ９６ｓＦｖ（Ｍ１）（図１７のプラスミドからバクテ
リア中で生産された再生物質を表す）のＨ３３９６ガン
細胞膜に対する結合を線グラフで表したものである。
Ｒ９６ｓＦｖ（Ｍ１）（図１７のプラスミドからバクテ
リア中で生産された再生物質を表す）のＨ３３９６ガン
細胞膜に対する結合を線グラフで表したものである。
【図２０】図２０は、異性体ＢＲ９６ｓＦｖ（ペリプラ
スムからＭ−１３感染バクテリア中でシグナルペプチド
と共に生産されたもので、再生物質ではない）のＬｅY
−ＨＳＡに対する結合を線グラフで表したものである。
スムからＭ−１３感染バクテリア中でシグナルペプチド
と共に生産されたもので、再生物質ではない）のＬｅY
−ＨＳＡに対する結合を線グラフで表したものである。
【図２１】図２１は、ＢＲ９６ｓＦｖ−ＰＥ４０（Ｅ，
Ｅｃｏ ＲＩ；Ｈ，Ｈｉｎｄ ＩＩＩｌ；Ｋ，Ｋｐｎ
ｉ；Ｎ，ＮＤｅ Ｉ；Ｓ，Ｓａｌ Ｉ；（Ｇｌｙ4 Ｓｅ
ｒ） 3 は１５のアミノ酸結合基を表している）をコード
する発現プラスミドｐＢＷ７.0の構築スキームを図式的
に表したものである。
Ｅｃｏ ＲＩ；Ｈ，Ｈｉｎｄ ＩＩＩｌ；Ｋ，Ｋｐｎ
ｉ；Ｎ，ＮＤｅ Ｉ；Ｓ，Ｓａｌ Ｉ；（Ｇｌｙ4 Ｓｅ
ｒ） 3 は１５のアミノ酸結合基を表している）をコード
する発現プラスミドｐＢＷ７.0の構築スキームを図式的
に表したものである。
【図２２】図２２は、ＥＬＩＳＡアッセイの結果を線グ
ラフで表したものである。図２１のプラスミドにより発
現されたＢＲ９６Ｍ１ｓＦｖ−ＰＥ４０は、ＢＲ９６ｓ
Ｆｖ−ＰＥ４０に比べて向上した親和性をもって、Ｈ３
３９６膜に結合する。
ラフで表したものである。図２１のプラスミドにより発
現されたＢＲ９６Ｍ１ｓＦｖ−ＰＥ４０は、ＢＲ９６ｓ
Ｆｖ−ＰＥ４０に比べて向上した親和性をもって、Ｈ３
３９６膜に結合する。
【図２３】図２３は、Ｍ１のようなＢＲ９６異性体の可
変及び一定領域のＨ鎖をコードすうｐＡＨｇ４Ｈ３３
６．１プラスミド（１０.9ｋｂ）を図式的に表したもの
である。このプラスミドは、哺乳類細胞における全抗体
を作製するのに使用されたものである。
変及び一定領域のＨ鎖をコードすうｐＡＨｇ４Ｈ３３
６．１プラスミド（１０.9ｋｂ）を図式的に表したもの
である。このプラスミドは、哺乳類細胞における全抗体
を作製するのに使用されたものである。
【図２４】図２４は、異性体ライブラリーを構築するた
めに親ＢＲ９６鋳型に対して、どのように合成コドンベ
ースのオリゴマーをアニールするかを示した一重鎖Ｍ１
３プラスミドのスキームを図式的に表したものである。
めに親ＢＲ９６鋳型に対して、どのように合成コドンベ
ースのオリゴマーをアニールするかを示した一重鎖Ｍ１
３プラスミドのスキームを図式的に表したものである。
【図２５】図２５は、８脂肪族炭素のスペーサー及びヒ
ドラジド官能基へ結合した、合成テトラサッカライドＬ
ｅY の構造を示したものである。
ドラジド官能基へ結合した、合成テトラサッカライドＬ
ｅY の構造を示したものである。
【図２６】図２６は、異性体ＢＲ９６Ｍ１２＋Ｍ２＋Ｍ
１（Ｍ１４）のＨ鎖の可変領域のＤＮＡ及びアミノ酸配
列を示したものである。
１（Ｍ１４）のＨ鎖の可変領域のＤＮＡ及びアミノ酸配
列を示したものである。
【図２７】図２７は、Ｍ１４Ｆａｂ、Ｍ３Ｆａｂ、Ｍ２
Ｆａｂ及びＢＲ９６ＦｂのＨ３３９６膜への結合を線グ
ラフで表したものである。
Ｆａｂ及びＢＲ９６ＦｂのＨ３３９６膜への結合を線グ
ラフで表したものである。
【図２８】図２８は、Ｍ１４Ｆａｂ、Ｍ３Ｆａｂ、Ｍ２
Ｆａｂ及びＢＲ９６ＦｂのＬｅY−ＨＳＡへの結合を線
グラフで表したものである。
Ｆａｂ及びＢＲ９６ＦｂのＬｅY−ＨＳＡへの結合を線
グラフで表したものである。
【図２９】図２９は、ＢＲ９６Ｍ１４Ｆａｂ、ＢＲ９６
Ｍ１２Ｆａｂ、ＢＲ９６Ｍ６Ｆａｂ、ＢＲ９６Ｍ３Ｆａ
ｂ及びＢＲ９６ＦｂのＬｅY −ＨＳＡへの結合を線グラ
フで表したものである。
Ｍ１２Ｆａｂ、ＢＲ９６Ｍ６Ｆａｂ、ＢＲ９６Ｍ３Ｆａ
ｂ及びＢＲ９６ＦｂのＬｅY −ＨＳＡへの結合を線グラ
フで表したものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 16/32 8517−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 35/12 35/74 Ｚ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 スコット グレイザー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92116 サン ディエゴ ニュー ハンプ シャー ストリート 4548 (72)発明者 ウィリアム ヒューズ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92014 デル マー ザポ ストリート 1993 (72)発明者 メイ ジョアーン ロゾク アメリカ合衆国 ワシントン州 98155 シアトル ノースイースト ワンハンドレ ッドアンドナインティフォース ストリー ト 6340
Claims (60)
- 【請求項１】 表１のカバット９５位のアミノ酸で開
始し、カバット１００ａ位のアミノ酸で終止するＧｌｙ
Ｌｅｕ Ｘａａ Ａｓｐ Ｇｌｙ ＡｌａＴｒｐの配
列を含むＣＤＲを含有するアミノ酸配列を有する変異体
ＢＲ９６ポリペプチド。 - 【請求項２】 Ｘａａが、アラニン、アルギニン、セ
リン、グリシン、チロシン、バリンからなる群から選択
されるアミノ酸である請求項１記載の変異体ＢＲ９６ポ
リペプチド。 - 【請求項３】 図５の２６位のアミノ酸で開始し、３
３位のアミノ酸で終止するＧｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐ
ｈｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒの配列を含むＣ
ＤＲをさらに含有する請求項１記載の変異体ＢＲ９６ポ
リペプチド。 - 【請求項４】 図６の５２位のアミノ酸で開始し、５
９位のアミノ酸で終止するＳｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇ
ｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐの配列を含むＣ
ＤＲをさらに含有する請求項１記載の変異体ＢＲ９６ポ
リペプチド。 - 【請求項５】 図２６の２６位のアミノ酸で開始し、
３３位のアミノ酸で終止するＧｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒの配列を含む
ＣＤＲ及び図２６の５２位のアミノ酸で開始し、５９位
のアミノ酸で終止するＳｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐの配列を含むＣＤＲ
をさらに含有する請求項１記載の変異体ＢＲ９６ポリペ
プチド。 - 【請求項６】 表１のカバット９５位のアミノ酸で開
始し、カバット１００ａ位のアミノ酸で終止するＧｌｙ
Ｌｅｕ Ｘａａ Ａｓｐ Ｇｌｙ ＡｌａＴｒｐの配
列を含むＨ鎖可変領域を含有する変異体ＢＲ９６ポリペ
プチド。 - 【請求項７】 Ｘａａが、アラニン、アルギニン、セ
リン、グリシン、チロシン、バリンからなる群から選択
されるアミノ酸である請求項６記載の変異体ＢＲ９６ポ
リペプチド。 - 【請求項８】 図５の２６位のアミノ酸で開始し、３
３位のアミノ酸で終止するＧｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐ
ｈｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒの配列を含むＨ
鎖可変領域をさらに含有する請求項６記載の変異体ＢＲ
９６ポリペプチド。 - 【請求項９】 図６の５２位のアミノ酸で開始し、５
９位のアミノ酸で終止するＳｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇ
ｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐの配列を含むＨ
鎖可変領域をさらに含有する請求項６記載の変異体ＢＲ
９６ポリペプチド。 - 【請求項１０】 表１の２６位のアミノ酸で開始し、
３３位のアミノ酸で終止するＧｌｙ Ｐｈｅ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ ＴｙｒＴｙｒの配列
及び図２６の５２位のアミノ酸で開始し、５９位のアミ
ノ酸で終止するＳｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓ
ｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐの配列を含むＨ鎖可変領域
をさらに含有する請求項６記載の変異体ＢＲ９６ポリペ
プチド。 - 【請求項１１】 ＣＤＲ１が、図１のＧｌｙ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ ＰｈｅＳｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍ
ｅｔ Ｔｙｒの配列を有し、ＣＤＲ２が、Ｔｙｒ Ｉｌ
ｅ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｘａａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ
ＴｈｒＡｓｐ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖ
ａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙの配列を有し、かつＣＤＲ３が、
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔ
ｒｐの配列を有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含有する変異体ＢＲ９６ポリペプチド。 - 【請求項１２】 ＣＤＲ１が、図３のＧｌｙ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ ＰｈｅＳｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍ
ｅｔ Ｔｙｒの配列を有し、かつＣＤＲ３が、Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐの配
列を有する、ＣＤＲ１及びＣＤＲ３を含有する変異体Ｂ
Ｒ９６ポリペプチド。 - 【請求項１３】 ＣＤＲ２が、図３のＴｙｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ ＧｌｎＸａａ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｒｏ ＡｓｐＴｈｒ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｇｌｙの配列を有し、かつＣＤＲ３が、Ｇｌ
ｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ
の配列を有する、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する変異
体ＢＲ９６ポリペプチド。 - 【請求項１４】 Ｘａａが、グリシン及びアスパラギ
ン酸からなる群から選択される、請求項１１又は１３の
いずれかに記載の変異体ポリペプチド。 - 【請求項１５】 図４の５０位のアミノ酸で開始し、
６６位のアミノ酸で終止するＴｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ ＩｌｅＴｈｒ Ａｓ
ｐ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ
Ｇｌｙの配列を含むＣＤＲを含有するアミノ酸配列を
含む変異体ＢＲ９６ポリペプチド。 - 【請求項１６】 図４の５０位のアミノ酸で開始し、
６６位のアミノ酸で終止するＴｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ ＩｌｅＴｈｒ Ａｓ
ｐ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ
Ｇｌｙの配列を含むＨ鎖可変領域を含有する変異体Ｂ
Ｒ９６ポリペプチド。 - 【請求項１７】 ＣＤＲ１が、図４のＧｌｙ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ ＰｈｅＳｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｍ
ｅｔ Ｔｙｒの配列を有し、ＣＤＲ２が、Ｔｙｒ Ｉｌ
ｅ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ
ＴｈｒＡｓｐ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ｖ
ａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｙの配列を有し、かつＣＤＲ３が、
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔ
ｒｐの配列を有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３
を含有する変異体ＢＲ９６ポリペプチド。 - 【請求項１８】 ＣＤＲ２が、図４のＴｙｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ ＧｌｎＡｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔ
ｈｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｒｏ ＡｓｐＴｈｒ Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ｇｌｙの配列を有し、かつＣＤＲ３が、Ｇｌ
ｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐ
の配列を有する、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する変異
体ＢＲ９６ポリペプチド。 - 【請求項１９】 ＣＤＲ１が、図２６のＧｌｙ Ｐｈ
ｅ Ｐｒｏ ＰｈｅＳｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒの
配列を有し、ＣＤＲ２が、Ｓｅｒ ＧｌｎＡｓｐ Ｇｌ
ｙ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐの配列を有し、か
つＣＤＲ３が、Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌ
ｙ Ａｌａ Ｔｒｐの配列を有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ
２及びＣＤＲ３を含有する変異体ＢＲ９６ポリペプチ
ド。 - 【請求項２０】 ＣＤＲ１が、図６のＧｌｙ Ｐｈｅ
Ｔｈｒ ＰｈｅＳｅｒ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｔｙｒの配
列を有し、ＣＤＲ２が、Ｓｅｒ ＧｌｎＡｓｐ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐの配列を有し、かつ
ＣＤＲ３が、Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ｔｒｐの配列を有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２
及びＣＤＲ３を含有する変異体ＢＲ９６ポリペプチド。 - 【請求項２１】 ＣＤＲ１が、表１のＧｌｙ Ｐｈｅ
Ｐｒｏ ＰｈｅＡｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒの配
列を有し、ＣＤＲ２が、Ｓｅｒ ＧｌｎＧｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐの配列を有し、かつ
ＣＤＲ３が、Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ｔｒｐの配列を有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２
及びＣＤＲ３を含有する変異体ＢＲ９６ポリペプチド。 - 【請求項２２】 ＣＤＲ１が、図５のＧｌｙ Ｐｈｅ
Ｐｒｏ ＰｈｅＡｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒの配
列を有し、ＣＤＲ２が、Ｓｅｒ ＧｌｎＧｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ａｓｐの配列を有し、かつ
ＣＤＲ３が、Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ａｌａ Ｔｒｐの配列を有する、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２
及びＣＤＲ３を含有する変異体ＢＲ９６ポリペプチド。 - 【請求項２３】 実質的に精製されている請求項１、
６又は１９のいずれかに記載のポリペプチド。 - 【請求項２４】 請求項１、６又は１９のいずれかに
記載の変異体ＢＲ９６抗体分子。 - 【請求項２５】 請求項２４記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項２６】 請求項２５記載のキメラモノクロー
ナル抗体。 - 【請求項２７】 請求項１、６又は１９のいずれかに
記載の変異体ＢＲ９６Ｆａｂポリペプチド。 - 【請求項２８】 請求項１、６又は１９のいずれかに
記載のポリペプチドを含有する変異体ＢＲ９６Ｆ（ａ
ｂ′）2 ポリペプチド。 - 【請求項２９】 請求項１、６又は１９のいずれかに
記載の変異体ＢＲ９６Ｆｖポリペプチド。 - 【請求項３０】 請求項１、６又は１９のいずれかに
記載のポリペプチドをコードする核酸分子。 - 【請求項３１】 請求項３０記載のｃＤＮＡ。
- 【請求項３２】 複製を与える少なくとも一つの配列
に結合し得る請求項３０記載の核酸分子を有するプラス
ミド。 - 【請求項３３】 転写制御を与える少なくとも一つの
配列に結合し得る請求項３０記載の核酸分子を有するプ
ラスミド。 - 【請求項３４】 適する宿主細胞内に請求項３２又は
３３のいずれかに記載のプラスミドを有する宿主ベクタ
ー系。 - 【請求項３５】 適する宿主細胞が細菌性細胞である
請求項３４記載の宿主ベクター系。 - 【請求項３６】 細菌性細胞がグラム陰性菌である請
求項３５記載の宿主ベクター系。 - 【請求項３７】 グラム陰性菌がE.coli菌である請求
項３６記載の宿主ベクター系。 - 【請求項３８】 適する宿主細胞が原核細胞である請
求項３５記載の宿主ベクター系。 - 【請求項３９】 請求項３４記載の宿主ベクター系
を、宿主内でポリペプチドを生産するように育成するこ
と及び生産されたポリペプチドを回収することを含むポ
リペプチドの生産方法。 - 【請求項４０】 ａ．被検体から細胞試料を得るこ
と、ｂ．請求項１、６又は１９のいずれかに記載のポリ
ペプチドと細胞試料を、細胞−ＢＲ９６抗体−ポリペプ
チド複合体を得るように、接触させること、該複合体の
存在はＢＲ９６抗原を伴うガン細胞の存在を示唆するも
のであることを含む、被検体からの細胞試料内のＢＲ９
６抗原を伴うガン細胞の存在を検出する方法。 - 【請求項４１】 正常細胞を、図３の９９位のアミノ
酸で開始し、１０５位のアミノ酸で終止するＧｌｙ Ｌ
ｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｔｒｐの配列
を含むＣＤＲを含有するアミノ酸配列を含む変異体ＢＲ
９６ポリペプチドと、ポリペプチド−正常細胞複合体を
形成するように接触させること及び形成したポリペプチ
ド−正常細胞複合体の数を定量的に決定することをさら
に含み、該数を細胞−ＢＲ９６抗原−ポリペプチド複合
体の数と比較し、ポリペプチド−正常細胞複合体と比較
して、細胞−ＢＲ９６抗原−ポリペプチド複合体の方が
より多い時、細胞試料中のＢＲ９６抗原を伴うガン細胞
の存在を示すものである、請求項４０記載の方法。 - 【請求項４２】 ＢＲ９６抗原の存在を伴う被検体の
ガンを診断する方法であって、請求項１、６又は１９の
いずれかに記載のポリペプチドを使用して、被検体から
の細胞試料中のＢＲ９６抗原を伴うガンの数を決定する
こと及びそのように決定した細胞の数を正常な被検体か
らの試料中の数と比較することを含み、測定可能な異な
る量がガンの存在を示すものである、診断方法。 - 【請求項４３】 細胞毒性物質に結合した請求項１、
６又は１９のいずれかに記載のポリペプチドを含有する
免疫複合体。 - 【請求項４４】 請求項４３記載の免疫複合体を該ガ
ン細胞と反応させることを含む、ＢＲ９６モノクローナ
ル抗体に免疫特異的に結合する抗体を発現する選択的に
ガン細胞を殺す方法。 - 【請求項４５】 薬学的に有効量の請求項４３記載の
免疫複合体と薬学的に許容される担体を含む悪性腫瘍の
治療に有用な薬学的組成物。 - 【請求項４６】 薬学的に有効量の請求項４５記載の
組成物を患者に投与することを含むインビボにおける悪
性腫瘍の治療方法。 - 【請求項４７】 請求項１、６又は１９のいずれかに
記載のポリペプチドと、組織検体を接触させること及び
該組織と該抗体の結合を検出することを含むヒトの組織
の悪性腫瘍の存在を決定する方法。 - 【請求項４８】 該分子が直接又は間接に、放射性ラ
ベル、酵素、クロモフォア及び蛍光発生体からなる群か
ら選択される化合物による検出可能なシグナルを生産す
るようにラベルされた請求項４７記載の方法。 - 【請求項４９】 悪性腫瘍を検出するのに十分な量
の、請求項１、６又は１９記載のポリペプチドを被検体
に静脈注射により投与すること、抗体を悪性腫瘍に結合
させ、悪性腫瘍部位に局在化させること及び悪性腫瘍細
胞に結合した該抗体を検出することを含む悪性腫瘍を画
像化する方法。 - 【請求項５０】 該分子が直接又は間接に、放射性ラ
ベル、酵素、クロモフォア及び蛍光発生体からなる群か
ら選択されるラベルにより検出可能なシグナルを生産す
るようにラベルされた請求項４９記載の方法。 - 【請求項５１】 請求項１、６又は１９のいずれかに
記載のポリペプチド上の抗原決定基と反応し得るモノク
ローナル抗イディオタイプ抗体。 - 【請求項５２】 ａ）請求項１、６又は１９のいずれ
かに記載のポリペプチド；及びｂ）上記ａ）の抗体の特
異的被結合体と検出可能なラベルとの複合体、を含む診
断キット。 - 【請求項５３】 ラベルが、酵素、放射性ラベル、ク
ロモフォア及び蛍光発生体からなる群から選択される、
請求項５２記載の診断キット。 - 【請求項５４】 細胞毒性物質が、抗代謝物、アルキ
ル化剤、アンスラサイクリン類、抗生物質、抗分裂剤及
び化学療法剤からなる群から選択される、請求項４３記
載の免疫複合体。 - 【請求項５５】 細胞毒性物質が、リシン、ドキソル
ビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウ
ム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンク
リスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ジヒドロキシ
アントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、１−デヒド
ロテストステロン及びグルココルチコイドからなる群か
ら選択される、請求項４３記載の免疫複合体。 - 【請求項５６】 ガンである被検体を治療する方法で
あり、ガンは細胞表面に抗原を伴うガンを有する細胞の
群であることを特徴とし、結合した細胞を殺して被検体
を治療するように、細胞表面上に抗原を伴うガンに分子
を結合させる条件下において、細胞毒性物質に結合した
請求項１、６又は１９のいずれかに記載のポリペプチド
のガンを殺す量を被検体に投与することを含む治療方
法。 - 【請求項５７】 哺乳類ガン細胞の増殖を抑制するよ
うに、ドキソルビシンに結合した請求項４３の免疫複合
体の増殖を抑制し得る量を、哺乳類のガン細胞に接触さ
せることを含む、哺乳類ガン細胞の増殖を抑制する方
法。 - 【請求項５８】 ＢＲ９６モノクローナル抗体に免疫
特異的に結合する抗原を発現するガン細胞を選択的に殺
す方法であって、ＢＲ９６／ドキソルビシン−ガン細胞
複合体を得るように、ドキソルビシンを結合させ請求項
４３の免疫複合体と、ガン細胞を反応させることを含
み、それによりドキソルビシンが複合化したガン細胞を
殺す方法。 - 【請求項５９】 哺乳類ガン細胞の増殖を抑制する方
法であって、免疫複合体−ガン細胞複合体を得るように
ドキソルビシンに結合した請求項４３の免疫複合体の十
分な濃度を、哺乳類のガン細胞に接触させることを含
み、それにより複合化した哺乳類のガン細胞の増殖を抑
制する方法。 - 【請求項６０】 細胞表面上にＢＲ９６抗原を伴う細
胞を有することを特徴とする増殖型の病気である被検体
を治療する方法であって、ドキソルビシンに結合した請
求項４３記載の免疫複合体の有効量を被検体に投与する
ことを含み、そのような免疫複合体はＢＲ９６抗原に結
合して該細胞を殺し、それにより被検体を治療する方
法。
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