JPH08191692A - ヒトガンに有効な新規なbr96抗体異性体 - Google Patents

ヒトガンに有効な新規なbr96抗体異性体

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JPH08191692A
JPH08191692A JP7230629A JP23062995A JPH08191692A JP H08191692 A JPH08191692 A JP H08191692A JP 7230629 A JP7230629 A JP 7230629A JP 23062995 A JP23062995 A JP 23062995A JP H08191692 A JPH08191692 A JP H08191692A
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イェルトン デイル
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ジョアーン ロゾク メイ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ガン細胞への改良された特異性、より強い結
合親和性、血清中での長い半減期、及びより効果的なガ
ン細胞殺傷性などの改良された特徴を示すBR96の変
異体を得ること。 【解決手段】 BR96の可変領域と実質的に相同なア
ミノ酸配列を有する可変領域を有する変異体BR96ポ
リペプチドを遺伝子工学的に得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、BR96抗原のよ
うなターゲットに対してBR96より高く改良された親
和性を示す変異体BR96抗体及びその機能的等価物に
関する。変異体BR96とBR96はそのヌクレオチド
配列及び/又はアミノ酸配列が、分子の相補性決定領域
(CDRs)の一箇所以上の位置において異なる。モノ
クローナル抗体及びその誘導体は、免疫学に革命を引き
起こした。従来からの、抗原を使用して抗体形成動物を
免疫することにより得られる抗体は、それぞれ少しづつ
異なる性質を有する異なる抗体の混合物である。しか
し、モノクローナル抗体は、それ自身だけの単一物であ
り、結合特異性も含めてそれぞれ同じ性質を有する。
【従来の技術】ガン又は他の病気のスクリーニング、或
いはその治療において有用である、ガンや他の病変細胞
に対して増加した親和性又は特異性を有するような望ま
しい性質を有する分子を生産するようにコードされた抗
体タンパクや、遺伝子を扱う試み及び達成が多くの科学
者達によってなされてきた。多くの進歩が成されてきた
が、ゴールに達成するためには、モノクローナル抗体及
びその誘導体の研究がまださらに成されることが必要で
ある。BR96抗体は、抗原としてヒト胸部悪性腫瘍細
胞を使用して得られたモノクローナル抗体である(Hell
strom et al., "Highly Tumor-Reactive Internalizing
Mouse Monoclonal Antibodies to LeY -related Cell
Surface Antigen" Cancer Res. 50:2183-2190(1990) 参
照) 。BR96は高いガン選択性を示す。
【0002】ネズミのBR96抗体を生産するハイリド
ーマは、1989年2月22日に、American Type Cult
ure Collection (ATCC)(12301 Parklawn Drive, Rockvi
lle,MD 20852)に寄託され、BR96ハイブリドーマと
同定された(ATCC AccessionNo.:HB 10036) 。BR96
からのヒトガンマ1カッパキメラフォーム、すなわちC
hiBR96を生産するBR96ハイブリドーマは、1
990年5月23日に、ATCC(12301 Parklawn Drive, R
ockville, MD 20852) に寄託され、ChiBR96ハイ
ブリドーマと同定された(ATCC Accession No.:HB 1046
0) 。BR96は、結腸ガン、乳ガン、卵巣ガン、肺ガ
ン及び膵臓ガン並びに他のガンにおいて豊富に発現さ
れ、或いは、より少ないが、幾つかの分化した上皮細胞
において発現されるルイスY(LeY ) 抗原に関連した
炭化水素抗原を認識する。ヒトのガンの広い認識と、
2、3の正常組織(例えばgut上皮組織や膵臓組織)
に対するよりもガン細胞への結合率が高いため、BR9
6はガンの治療用抗体として研究されてきた。BR96
はインビトロにおけるガン細胞に結合後、内在化し、リ
ソゾームでそのほとんどは分解される(Garrigues, J.,
Garrigues,U., Hellstrom, I., and Hellstrom, K.E.
Le Y specfic antibody with potentanti-tumor activi
ty is internalized and degraded in lysosomes. Am.
J. Pathol., 142:607-621, 1993)。
【0003】ドキソルビシンと、酸性pHに不安定なヒ
ドラゾン結合を介して結合させたBR96の前臨床試験
は、ヒトガンを異種移植したヌードマウスモデルに著し
い治療効果を示した。(Trail, P.A., Willner, D., La
sch, S.J., Henderson, A.J., Casazza, A.M., Firesto
ne, R.A., Hellstrom, I., and Hellstrom, K.E. Cure
of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubici
n immunoconjugates.Science, 261: 212-215, 1993 参
照) 。BR96−ドキソルビシン複合体は、乳ガン、肺
ガン、結腸ガン、膵臓ガン、卵巣ガン及び他の悪性腫瘍
の治療のための第I相試験を行っている。BR96は、
抗体依存細胞性毒性(ADCC) 、補体依存性細胞毒性(CD
C) を媒介し、内在化している。驚くべきことに、BR
96はエフェクター細胞又は補体の非存在下で、ガン細
胞のDNA合成を阻害する(G.J. Schreiber et al.,
"An Unmodified Anticarcinoma Antibody, BR96, Local
izes To and Inhibits Outgrowths of Human Tumors in
Nude Mice", Cancer Reserach 52: 3262-3266 (1992)
参照) 。
【0004】BR96は明らかに膜の透過性を変化させ
ることにより、細胞毒性を示す。(Garrigues et al.,
"Le Y Specific Antibody With Potent Anti-tumor Act
ivity Internalized and Degraded in Lysosomes. Am.
J. Pathol., 142(2):607-622, February 1993 参照) 。
BR96への感受性は、細胞表面の抗原の発現レベルに
関係している(Garrigues et al. (February 1993) 参
照) 。抗原発現のレベルが高ければ、BR96への感受
性も上昇する。インビボにおけるBR96の抗ガン効果
を、元のBR96を変換した変異体のF(ab')2 フラグメ
ント、マウス−ヒトキメラフォーム、及びIgG1クラ
スと比較した(G.J. Schreiber et al., (1992)参照) 。
BR96のキメラフォームは最も強い抗ガン効果を示
し、次にネズミのIgG3であったのに対し、BR96
のIgG1及びF(ab')2 は制限された効果しか示さなか
った(G.J. Schreiber etal.,(1992)参照) 。BR96
の幾つかの機能形態は、ヒト肺腺ガンを異種移植された
ヌードマウスの未改質形態(unmodified form)で試験し
たとき、著しい抗ガン効果を示した。
【0005】他のルイスY抗原を認識するモノクローナ
ル抗体も報告されている(Brown ,A., Feizzi, T., Goo
i, H. C., Embleton, M.J., Picard, J.K., and Baldsi
n,R.w. A monoclonal antibody against houman coloni
c adenoma recognizes difucosylated type-2-blood-gr
oup chains. Biosci. Rep., 3:163-170, 1983 ; Lloyd,
K.O., Larson, G., Stromberg, N., Thurin, J., and
Karlsson, K.A. Mouse monoclonal antibody F-3 recog
nizes the difucosyl type-2-blood group-related ant
igenes in human malignabt, premalignant, and nonma
lignant colonic tissue. Cancer Res., 46:5985-5992,
1986; Hellstrom, K.E. Monoclonalmouse antibodies
raised against human lung carcinoma. Cancer Res.,
46:3917-3923, 1986; Ernst, C.S., Shen, T-W., Litwi
n, S., Herlyn, M., Koprowski, H., and Sears, H.F.
Multiparameter evaluation of the expression in sit
u of notmal and tumor-associated antigens in human
colorectal carcinoma. J. Natl. Cancer Inst., 77:3
87-395, 1986; Abe, K., Hakomori, S., and Ohshiba,
S. Differential expression of difucosyl type 2 cha
in (le Y ) defined by monoclonal antibody AH6 in d
ifferent location of colonic epithelia, various hi
stological types of colonic polyps, and adenocarci
nomas. Cancer Res., 46:2639-2644, 1986; Brown, A.,
Ellis, I.O., Embleton, M.J., Baldwin, R.W., Turne
r, D.R. and Hardcastle, J.D. Immunohistochemical l
acalization of Y hapten and the structurally relat
ed H type-2-blood-group antigens on large-bowel tu
mors and normal adult tissues. Int. J. Cancer,33:7
27-736, 1984; Abe, K., McKbbin, J.M., and Hakomor
i, S. The monoclonal antibody directed to difucosy
lated type 2 chain (Fucαl→2Galβ1 →4(Fuc αl
→3)GlcNAc; Y determinant). J. Biol. Chem., 258:11
793-11797, 1983; Blaineau, C., LePendu, J., Aenau
d, D., Connan, F., and Avner, P. Theglycosidic ant
igen recognized by a novel monoclonal antibody, 7
5.12, isdevelopmentally regulated on mouse embryon
al carcinoma cells. EMBO J., 2:2217-2222, 1983; Po
ur, P.M., Tempero, V.E., Cordon-Cardo, C., and Bos
l,G.J. Expression of blood group-related antigens
ABH, Lewis B, Lewis X,Lewis Y, and CA 19-9 in panc
reatic cancer cells in comparison with the patien
t's blood group type. Cancer Res., 48:5422-5426, 1
988; Motzer, R. J., Reuter, V.E., Cordon-Cardo,
C., and Bosl, G.J. Blood group-related antigenes i
n human germ cell tumors. Cancer Res., 48:5342-534
7, 1988) 。BR96と変異体BR96はその抗体が異
なる。BR96は、他の抗ガンモノクローナル抗体と同
様に正常な細胞にも結合するが、凍結した部分の免疫組
織学において確立されたように、我々が試験を行った他
のモノクローナル抗体の大部分におけるよりも、ガンに
対して高い選択性を示す。BR96は抗原陽性ガン細胞
に対して毒性であり、全てのBR96はADCCもCD
Cもどちらも媒介する(G.J. Schreiber et al., "An U
nmodified Anticarcinoma Antibody, BR96, Localizes
To and Inhibits Outgrowths of Human Tumors in Nude
Mice", CancerResearch 52: 3262-3266 (1992)参照)
【0006】
【発明が解決しようとする課題】ガン細胞への改良され
た特異性、より強い結合親和性、血清中でのより長い半
減期、又はより効果的なガン細胞殺傷性などのさらに改
良された特徴を示すBR96の変異体(すなわち変異体
BR96) が必要とされている。改良された抗体の変異
体は遺伝工学法により得られた。一般に、抗体分子又は
そのフラグメントを遺伝工学的に得るには、或いは親抗
体よりも増強された親和性を有する抗体分子を作るに
は、次の段階が必要である。(1)ハイブリドーマから
H鎖及び/又はL鎖遺伝子を単離し、プラスミドのよう
なベクター内にクローン化を行い、(2)抗体遺伝子を
修飾し、及び(3)修飾した遺伝子を効果的に発現しえ
る細胞内にトランスフェクションする。抗体遺伝子は、
様々な方法で修飾可能である。例えば、抗体のCDR内
で変異体のライブラリーを作製する効果的で迅速な方法
は、コドンをベースとした変異誘発である(Glaser, S.
M., et al., 1992, J. Immunol. 149:3903-3913) 。コ
ドンをベースとしたオリゴヌクレオチドの合成は、親フ
ァージに関連し、H鎖及びL鎖のライブラリーを生産す
るようにCDR内において選択した数のターゲットコド
ンに相当する多数の配列を得ることが可能である。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明は、BR96の可
変領域と、ここに述べる差異以外には実質的に相同であ
るアミノ酸配列を有する可変領域を含有するBR96ポ
リペプチド変異体(及びそれらをコードする核酸配列)
に関する。そのような差異は、BR96抗体への変異体
BR96の親和性を高めるものである。
【発明の実施の形態】一つの実施態様において、BR9
6ポリペプチド変異体は、BR96H3−36(以後M
1変異体と呼ぶ。)変異体を表す。BR96M1変異体
は、CDR3のH鎖の101位のアミノ酸がアラニンで
ある点を除いて、BR96と同じアミノ酸配列の可変領
域を有する。これに対し、BR96の101位のアミノ
酸はアスラギン酸である。一つの実施態様において、B
R96ポリペプチド変異体は、BR96H2−60(以
後M2変異体と呼ぶ。)変異体を表す。BR96M2変
異体は、CDR2のH鎖の54位のアミノ酸がアスパラ
ギン酸である点を除いて、BR96と同じアミノ酸配列
の可変領域を有する。これに対し、BR96の54位の
アミノ酸はグリシンである。
【0008】他の実施態様では、BR96ポリペプチド
変異体はBR96H1−4−3(以後M4変異体と呼
ぶ。)変異体を表す。BR96M4変異体は、28位の
アミノ酸がBR96ではトレオニン(ACTでコードさ
れている)であるのに対し、プロリン(CCGでコード
されている)である点を除いて、BR96と同じアミノ
酸配列の可変領域を有する。さらに、30位のアミノ酸
は、BR96がセリン(TCG)であるのに対し、変異
体BR96ではアラニン(GCG)であり、31位のア
ミノ酸は、アスパラギン酸(GAC)ではなく、変異体
BR96ではセリン(TCG)であり、また、101位
のアミノ酸はアラニン(GCG)である。ここで使用さ
れる配列の番号は、BR96及び変異体BR96のアミ
ノ酸の位置を、初めのアミノ酸の位置を1番として番号
付したである。
【0009】定義 “ポリペプチド”は、抗体(例としてポリクローナル又
はモノクローナル抗体;二重特異性抗体又は異種抗体で
ある)及び/又はFv、Fab、F(ab’) 2 或いは
組み換え法又はタンパク質分解消化により生産された抗
原結合部位を有する可変H鎖及び/又はL鎖を含む機能
的等価体のようなタンパク分子を含む。ポリペプチドは
単一のアミノ酸鎖を有していてもよい。または、ポリペ
プチドは、共有結合的又は非共有結合的に結合した少な
くとも二つのアミノ酸鎖を有していてもよい。ここで使
用されるように“CDR”は、抗原又はターゲットに対
する特異性と親和性を決定する、超可変部領域及び/又
はポリペプチドの結合ループ(CDRループとしても知
られている。)の形状を維持するアミノ酸を含む領域で
あるポリペプチドの部位を表す。用語“BR96”は、
米国出願057,444号(1993年5月5日登録)
に記載の全てのモノクローナル抗体を示し、これは、同
等の結合特異性を有する各種の一定の領域又はそのフラ
グメントのH鎖及びL鎖両方を含み、Fab、F(a
b’)2 、Fv及びsFv分子を含有している。
【0010】用語“変異体BR96”は、Fab、F
(ab’)2 、Fv(単一鎖Fvを含む)及び融合タン
パクのような変異体抗体の抗原結合領域を少なくとも含
み、BR96の相当する領域に関して、除去、挿入、又
は置換などのアミノ酸の変換を少なくとも一種含む、全
ての抗体及び/又はそのフラグメントを示す。用語“フ
ラグメント”は、全ての抗体ではなく、機能的な抗体の
誘導体のみを表す。さらにフラグメントという用語は、
タンパク質の分解により得られたものに限らず、組み換
え工学の方法で得られた分子も含む。“実質的に精製さ
れた”とは、不純物が混入していない、又は抗原結合に
可逆的に作用又は阻害をする他のアミノ酸残基を含まな
いことを意味している。ここで用いる“Fab”は、F
ab’分子を含み、少なくともL鎖(VL 及びCL )及
び二つのアミノ末端H鎖ドメイン(VH 及びCH1)を有
する一価の分子を意味する。
【0011】ここで用いる“F(ab’)2 ”は、Fa
b’分子が二つ結合した二価の分子を意味する。ここで
用いる“Fv”は、L鎖の可変ドメインに非共有結合的
に結合したH鎖の可変ドメインからなる一価の分子を意
味する。ここで用いる“sFv”は、L鎖の可変ドメイ
ン(VL ) とH鎖の可変ドメイン(VH ) が結合タンパ
クにより結合している分子を意味する。sFvは、どの
ような方法で得てもよく、例えば、遺伝工学を用いても
よい。ここで用いる“Fd”は、イムノグロブリンのH
鎖の可変領域(VH ) とイムノグロブリンのH鎖の一定
領域(CH1 ) のアミノ末端部位を有する分子を意味す
る。“異種抗体”は、少なくとも二種の抗体が、SPD
P、又はリシンもしくはアルギニン残基と共に結合する
イミノチオランのような試薬により架橋された分子を意
味する。一般に、異種抗体は少なくとも4種の抗原結合
部位、各特異性を示す2つの結合部位を有する。“二重
特異性”は、2種以上の抗体への抗原結合部位を有する
分子を表している。
【0012】“実質的に相同である”とは、BR96抗
原に対する認識及び結合をするアミノ酸相同体を意味す
る。“処置(治療)(treating)”とは、(1) ある期間
ガンが触知可能では無くなるようにガンを退縮させる
(基本的なガンの測定方法については、A.B. Milleret
al. "Reporting results of cancer treatment" Cancer
47:207-214 (1981)に従った。) ; (2) 病気を安定化する;又は (3) 臨床的に有利な効果を与える;を意味する。 “突然変異”は、単純突然変異又は複合突然変異を表
し、どのような方法によるものでもよい。本発明をさら
に完全に理解するために、以下述べる。
【0013】ポリペプチド 本発明は様々な形態の変異体BR96を目的とする。す
なわち、例として全抗体、F(ab’)2 、Fab、F
v、Fc、Fd、又は少なくとも変異体BR96の抗原
結合部位を有するか、又は変異体BR96のターゲット
抗原への免疫特異的な結合を競争的に阻害する抗原結合
領域を有する分子が挙げられる。変異体BR96は、B
R96の可変領域と実質的に相同な可変領域を有する。
しかし、これらには著しい差異が存在し、この差異は、
変異体BR96にBR96と比較して増強した結合親和
性及び結合活性を与える。BR96及び変異体BR96
の差異を、次に示す。BR96のH鎖のCDR1では、
トレオニンがアミノ酸の28位に位置している。さら
に、CDR1では、セリン及びアスパラギン酸がそれぞ
れアミノ酸の30及び31位に位置している。BR96
のH鎖のCDR2では、グリシンがアミノ酸の54位に
位置している。さらにBR96のH鎖のCDR3では、
アスパラギン酸がアミノ酸の101位に位置している。
BR96に対し、BR96M1Fab変異体(図3)
は、変異体BR96のH鎖のCDR3の101位にアラ
ニンを有している(表1)。表1は、配列番号及びカバ
ット(Kabat)番号両方を示している。両方の番号システ
ムは共にアミノ酸の位置を表すのに適する方法である。
さらに、BR96に対して、BR96M4変異体(図
5)のH鎖のCDR1において、28位にはプロリン
が、30位にはアラニンが、31位にはセリンが、また
101位にはアラニンが位置している(表1)。
【0014】BR96M2変異体は、H鎖のCDR2の
アミノ酸の54位にアスパラギン酸を有しており、これ
に対し、BR96は相当する位置にグリシンを有してい
る。BR96M3変異体は、H鎖のCDR2の54位の
アミノ酸にはアスパラギン酸を有し、CDR3の101
位のアミノ酸にはアラニンを有している。これに対し、
BR96は相当する位置にグリシンとアスパラギン酸を
それぞれ有している。BR96M14変異体は、図26
に示されるアミノ酸の26位から33位のGly Ph
e Pro Phe Ser Asp Tyr Tyr
の配列を含むH鎖のCDR、及び図26に示されるアミ
ノ酸の52位から59位にSer Gln Asp G
ly Asp Ile Thr Aspの配列を含むH
鎖にCDR、並びに表1に示されるアミノ酸のカバット
配列の95位から100a位にGly Leu Ala
Asp Gly Ala Trpの配列を含むH鎖の
CDRを含む。
【0015】BR96M1、M3、M4及びM14変異
体の機能的等価体又は誘導体は、(1) BR96の可変領
域と実質的に相同なアミノ酸配列を有し、(2) BR96
抗原に対する親和性の向上及び特異性の増強を示すこと
が可能であり、及び/又は(3) BR96のH鎖の可変領
域の101位において少なくとも一種の異なるアミノ酸
を有する分子を有する。さらに、BR96M2及びM3
変異体の機能的等価体又は誘導体は、(1) BR96の可
変領域と実質的に相同なアミノ酸配列を有し、(2) BR
96抗原に対する親和性の向上及び特異性の増強を示す
ことが可能であり、及び/又は(3) BR96のH鎖の可
変領域の54位において少なくとも一種の異なるアミノ
酸を有する分子を有する。
【0016】
【表1】
【0017】
【表2】
【0018】
【表3】
【0019】BR96と比較して、一つより多いアミノ
酸変異体を有する変異体BR96分子は本発明に含まれ
る。その形態により、変異体BR96はモノクローナル
抗体のような単機能抗体であるか、或いは二重特異性抗
体又は異種抗体のような二重機能抗体である。治療又は
診断剤などの変異体BR96の使用法により、変異体B
R96の異なる形態を決定する。例えば、抗体フラグメ
ントは、一つの実施態様において、細胞のFc受容体へ
の非特異的結合を阻害するのに好ましい(ラベルした抗
体を用いて診断画像化などの様々な医療への適用におい
て非常に有利な性質を有する。)。他の実施態様では、
特異的Fcエフェクター機能が好ましい。これに関連し
て、それぞれの変異体を単一で又は組み合わせて、哺乳
類の発現系などの発現系に再導入することが可能であ
る。
【0020】抗体発現に関して幾つか選択可能である。
免疫発現ライブラリーはトランスフェクション技術と組
み合わせることが可能である。すなわち、免疫グロブリ
ン遺伝子発現ライブラリーから誘導されたFab分子の
遺伝子は、目的の一定領域のエクソンと接続可能であ
る。これらの組み換え遺伝子は、トランスフェクション
を行い、発現を行って、その中で全抗体分子を分泌させ
ることができる。一度生産されたならば、本発明のポリ
ペプチド(例として、BR96及び/又はその機能的等
価体)を、分子内のアミノ酸修飾などにより誘導体分子
を生産するように修飾を行ってもよい。そのような誘導
体分子は、ポリペプチドの機能性を保持している。すな
わち、そのような置換を受けた分子はBR96抗原のポ
リペプチド又はその一部にまだ結合しえる。これらのア
ミノ酸置換は、限定されないが、“保存的(conservati
ve) ”方法として知られているアミノ酸置換を含む。
【0021】例えば、“保存的アミノ酸置換”と言われ
るある種のアミノ酸置換は、タンパク質の機能又は構造
を変化せずにしばしば行えることが、タンパク質化学に
おいて確立されている。そのような変換は、イソロイシ
ン(I)、バリン(V)及びロイシン(L)を他の疎水
性アミノ酸と置換することを含み、アスパラギン酸
(D)をグルタミン酸(E)に、グルタミン(Q)をア
スパラギン(N)に、またセリン(S)をトレオニン
(T)に置換することを含む。他の置換も、そのアミノ
酸のタンパク質内での3次元構造における環境及び役割
によって、保存的と考えることができる。例えばグリシ
ン(G)及びアラニン(A)は、しばしば交換可能であ
り、アラニンとバリン(V)も同様である。比較的疎水
性のメチオニン(M)は、しばしばロイシン及びイソロ
イシンと交換可能であり、場合によりバリンとも可能で
ある。リシン(K)及びアルギニン(R)は、アミノ酸
残基の重要な性質が、その電荷にあり、二つのアミノ酸
残基の異なるpKは重要でない場合、位置の入れ代わり
が可能である。特別な条件によっては、その他の“保存
的”変換も考えられる。本発明の一つの実施態様におい
て、ポリペプチドは実質的に純粋である。すなわち、ポ
リペプチドがターゲットに結合するのを阻害又は低下さ
せる他のアミノ酸残基を含まない。
【0022】核酸分子 BR96のH鎖及びL鎖両方の抗原結合部位又は可変領
域のヌクレオチド及びアミノ酸配列は既知である。基本
的な配列技術により、全てのBR96のヌクレオチド及
びアミノ酸配列は識別可能である。変異体BR96の可
変領域の核酸配列は、実質的にBR96と相同性であ
る。BR96において、アミノ酸の28位のトレオニン
はコドンACTによりコードされている。さらに、アミ
ノ酸の30位及び31位のセリン及びアスパラギン酸
は、コドンAGT及びGACによりそれぞれコードされ
ている。さらに、アミノ酸101位のアスパラギン酸は
コドンGACによりコードされている。BR96M1変
異体は、101位にアラニンを有しており、コドンGC
Gによりコードされている。他のアラニンをコードする
コドンすなわち、GCT、GCC又はGCAも本発明に
含まれる。さらに、BR96ポリペプチド変異体の他の
実施態様では、H鎖のCDR3の101位のアミノ酸
は、アラニン、アルギニン、セリン、グリシン、チロシ
ン及びバリンからなる群から選択されたアミノ酸を含ん
でいてもよい。これは次のように図示される。
【0023】 クローン 結合表現型 コドン アミノ酸 1 高い GTT/GCT Ala/Val 7 高い CGT Arg 8 高い TCT Ser 9 高い CGT Arg 10 高い TCT Ser 13 高い GGG Gly 14 高い GGT Gly 15 高い GCT Ala 16 高い CGT Arg 20 高い TCT Ser 24 高い GCG Ala 28 高い TAT Tyr 30 高い AGT Ser 31 高い GTG Val 32 高い TCT Ser 33 高い CGG Arg 34 高い GTG Val
【0024】BR96M4変異体は、28位にプロリ
ン、30位にアラニン、及び31位にセリンを有してお
り、それぞれコドンCCG、GCG及びTCGでコード
されている(表1)。さらに、BR96に対して、10
1位のアラニンは、コドンGCGでコードされている。
他のプロリンをコードするコドン(CCT、CCC、C
CA)、アラニン(GCT、GCC、GCA)、セリン
(TCT、TCC、TCA、AGT、AGC)も本発明
に含まれる。BR96M2変異体はCDR2のH鎖の5
4位にアスパラギン酸を有しており、コドンGAT又は
GACでコードされている(表1)。さらに、BR96
M3変異体はCDR2のH鎖の54位にアスパラギン酸
を有しており、コドンGAT又はGACでコードされて
いる(表1)。また、CDR3のH鎖の101位にアラ
ニンを有しており、コドンGCG、GCT、GCC、又
はGCAでコードされている。本発明の核酸は、抗原結
合部位を含む変異体BR96の可変領域を少なくともコ
ードしている。核酸は、相補性DNA(cDNA)のよ
うなデオキシリボ核酸(DNA)でもよく、又はリボ核
酸(RNA)でもよい。DNAが好ましい。
【0025】融合タンパク トキシン、リンフォカイン又はオンコスタチンのような
抗ガン活性を有する第二タンパク質の活性な部分に少な
くとも機能的に結合する変異体BR96抗体の抗原結合
領域を少なくとも有する融合タンパクも、同様にインビ
ボにおけるヒト悪性腫瘍の治療に使用することが可能で
ある。さらに、当業者に既知の組み換え技術を、二つの
異なる抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を構築す
るのに使用することができる。二つの異なる抗原のうち
一つは、ハイブリドーマATCCHB10036から生
産されたモノクローナル抗体BR96が結合する(米国
特許第4,474,893号参照)ものであるが、抗体
と特異的に結合するもう一方は、BR96以外の分子の
抗原である。変異体BR96の可変領域を含む二重特異
性抗体はこの方法を用いて作製してもよい。
【0026】変異体BR96抗体の抗ID抗体 BR96の抗イディオタイプ抗体はすでに作製されてい
る。抗イディオタイプの作製方法は周知である(Farid
and Lo (1985) Anti-idiotypic antibodies asprobes f
or receptor structure and function. Endocr. Rev.
6:1-23参照) 。これらの作製方法は、変異体BR96の
抗id抗体の作製に使用してもよい。さらに、変異体B
R96抗体の抗イディオタイプ抗体は、活性ガン免疫治
療及びガン治療に用いてもよい(Hellstrom et al., "I
mmmunological Approaches To Tumor Therapy: Monoclo
nal Antibodies, Tumor Vaccines, And Anti-Idiotype
s", Covalently Modified Antigens And Antibodies In
Diagnosis And Therapy, supra at pp.35-41参照) 。
メトトレキセート及びクロラムブシル(Smyth et al.,
"Specific Targeting of Chlorambucil to Tumors With
the Use of Monoclonal Antibodies", J. Natl. Cance
r Inst., 76:503-510(1986)参照) のような化学療法剤
を用いて、様々なドキソルビシンン(DOX)(Yang and Rei
sfeld "Doxorubicin Conjugated with a Monoclonal An
tibody Directed to a Human Melanoma-Associated Pro
teoglycanSuppresses Growth of Established Tumor Xe
nografts in Nude Mice PNAS (USA)" 85:1189-1193(198
8) 参照) 、ダウノマイシン(Arnon and Sela "In Vitro
and in vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin
With Anti-Tumor Antibodies"Immunol. Rev., 65:5-27
(1982)参照) 及びモルホリノドキソルビシン(Muelleret
al., "Antibody Conjugates With Morpholinodoxorubi
cin and Acid-Cleavable Linkers", Bioconjugate Che
m., 1:325-330(1990) 参照) を含むアンスラサイクリン
類との免疫複合体が既に作製されている。BR96とド
キソルビシンの複合体はある種のガン又は悪性腫瘍の治
療に効果があることが示されている(Trail, P.A., Wil
lner, D., Lasch, S. J., Henderson, A.J., Casazza,
A.M., Firestone, R.A., Hellstrom, I., and Hellstro
m,K.E. Cure of xenografted human carcinomas by BR9
6-doxorubicin immunoconjugates. Science, 261:212-2
15, 1993 参照) 。
【0027】本発明の実施態様において、変異体BR9
6は、天然IgG変異体、還元IgG変異体、F(a
b’)2 変異体、sFv、融合タンパク及びFab変異
体の形態で用いられてもよい。適する免疫複合治療剤と
しては、天然のPE又はLysPE40 型のシュードモナスエ
キソトキシンA(Pseudomonas exotoxin A) (PE)が
挙げられる。LysPE40は、複合体を作製するためのリシ
ン残基を含む遺伝工学的に修飾したアミノ末端を含むよ
うに切り出された形態である。ドキソルビシンもまた治
療剤に適している。変異体BR96の抗原結合領域を毒
性物質とDNAレベルで融合させ、キメラタンパクとし
て毒性分子を作製することにより生産した組み換え免疫
毒性物質を作製するために、当業者に既知の遺伝子工学
技術を以下記載するように使用する。
【0028】これらの融合タンパクは、免疫グロブリン
分子の細胞結合部位の特異性と、毒性物質の細胞毒性活
性を合わせ持つ。好ましい実施態様においては、単純鎖
免疫毒性物質分子であるBR96sFV−PE40変異
体は、PE40に結合した変異体BR96のクローン化
されたH鎖又はL鎖のFv部位から作製されてもよい。
この単純鎖免疫毒性物質はクローン化及び発現化され
て、BR96抗原をその表面に発現する悪性腫瘍細胞に
対して細胞毒性活性を示す。このBR96sFV−PE
40変異体のような単純鎖の免疫毒性物質は、単分子と
して発現される。これらは、免疫グロブリンと毒性物質
のタンパク融合により得られる複合体より有利である。
単純鎖毒性物質は、組み換え免疫グロブリンフラグメン
トを作製した後、融合段階は不必要であるため、より簡
単に作製することができる。さらに、同じアミノ酸残基
からなる単一ペプチドなどの相同性分子群を生じる。さ
らに、毒性物質又は薬剤のため、複合体は非複合変異体
BR96より活性がある。BR96sFV−PE40変
異体の単純鎖免疫毒性物質に相当するアミノ酸配列をコ
ードするDNA配列の発現又はクローン化技術、すなわ
ち、オリゴヌクレオチドの合成、PCR、細胞の形質転
換、ベクターの作製、発現系などは、よく確立されてお
り、特別な条件及び方法に使用する標準資源物質(stand
ard resource material ) は大部分の当業者らに知られ
ている(Sambrook et al., eds., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press (1989) 参照) 。
【0029】下記のものの作製の詳細を以下に示す。 (1)本発明の単純鎖組み換え免疫毒性物質は、実施例
3及び4に記載され、及び(2)BR96sFV−PE
40変異体融合タンパクは実施例5に記載される。簡単
に述べると、例えば単純鎖変異体BR96を構築するに
は、ポリメラーゼ鎖反応(PCR)(Mullis et al.,
米国特許第4,683,195号及び米国特許第4,6
83,202号、Mullis and Faloona, Methods Enzymo
l. 154:335-350(1987)参照) をほぼ550bpBR96
sFV変異体配列を増幅するために用いる。PCRは、
BR96の配列由来の配列を有し、特にsFV領域を増
幅するプライマーを使用して行われ、。プライマーはさ
らに次のPCR生成物をクローン化するのに使用される
制限酵素に対する認識部位を有している。選択された制
限酵素は、増幅される配列内の配列を認識しないもので
ある。
【0030】PCR増幅後、約550bpフラグメント
が、プライマー内の部位を認識する制限酵素によって、
消化され、標準的な方法を用いてpMS8(Covellら。
Cancer Res. 46:3969-3978(1986)) のようなPE40遺伝
子をコードして中間ベクターを形成するベクターのフラ
グメントに連結される。変異体BR96Fvのフラグメ
ントは中間ベクター内にサブクローン化され、変異体B
R96sFv−PE40遺伝子の融合体をコードするプ
ラスミドを形成する。構築物は、既知のDNA配列分析
方法(Sangerら。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463
(1977)及びMessing ら。Nucleic Acids Res. 9:309(198
1)参照)により確認した。変異体BR96の発現及び精
製変異体BR96をコードするDNA配列を増殖し、下
記に示す多様な系で発現してもよい。DNAを適する制
限酵素で中間ベクターから切除して、そのような発現を
行うための適する発現ベクターに連結してもよい。使用
する宿主細胞により、変異体BR96は適当なベクター
内にクローン化される。形質転換又はトランスフェクシ
ョンは個々の宿主細胞に適する標準技術を用いて行われ
る。
【0031】原核細胞における変異体BR96の発現 原核細胞における変異体BR96の発現は、幾つかの目
的から好ましいものである。変異体BR96の実施例は
Fab、sFv、sFv−毒性物質を含むsFv−融合
蛋白を含む。原核生物は、最も多くは細菌の様々な種類
に代表される。細菌はグラム陰性でもグラム陽性菌でも
どちらでもよい。典型的には、E.coli(大腸菌)のよう
なグラム陰性菌が好ましい。他の微生物種もまた使用し
てもよい。変異体BR96をコードする配列は、E.coli
のような原核生物の異物(foreign) 配列を発現するよう
にデザインされたベクターに挿入された。これらのベク
ターは通常使用されている原核生物の制御配列を含み、
これは、リボソーム結合部位配列と共に転写開始のプロ
モーターを含むと定義され、オペレーターを含んでもよ
い。これらの通常使用されているプロモーターとして
は、ベータラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)及びラクト
ース(lac)プロモーター系(Chang ら。Nature198:1056
(1977) 参照)、トリプトファン(trp) プロモーター系
(Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8:4057(1980)
参照) 及びラムダ誘導Pl プロモーター及びN−遺伝子
リボソーム結合部位(Shimatake et al., Nature 292:1
28(1981)参照) が挙げられる。そのようなベクターは、
複製の起点及び選択的マーカーもまた含んでいる。その
ようなベクターとしては、抗生物質に抵抗力を与えるベ
ータラクタマーゼ又はネオマイシンホスホトランスフェ
ラーゼが挙げられ、これにより、ベクターが細菌中で複
製でき、プラスミドを有する細胞がアンピシリン又はカ
ナマイシンの存在下に成育するとき選択されることがで
きる。発現プラスミドは原核細胞内に、様々な標準的な
方法で導入され、限定されないが、CaCl 2 −刺激
(Cohen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1972) 69:2110
及び Sambrooket al., (eds.), Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor
Press, (1989) 参照) 及び電気穿孔法が挙げられる。
【0032】真核細胞における変異体BR96の発現 本発明の例に従い、真核細胞もまた宿主細胞として適す
る。真核細胞の例としては、動物細胞、初代又は不死化
した、酵素(例、Saccharomyces cerevisiae, Schizosa
ccharomyces pombe 及びPichia pastoris)及び植物細胞
が挙げられる。ミエローマ、COS及びCHO細胞は宿
主細胞として使用できる動物細胞の例として挙げられ
る。植物細胞の例としては、タバコ(全植物又はタバコ
のカルス)、とうもろこし、大豆、及び米の細胞が挙げ
られる。とうもろこし、大豆及び米の種もまた使用可能
である。変異体BR96をコードする配列は真核生物宿
主における異物(foreign) 配列を発現するようにデザイ
ンされたベクター内に挿入される。ベクターの調節因子
は個々の真核生物宿主により変化する。通常使用される
真核生物の制御配列はプロモーター及び哺乳類の細胞と
適合する制御配列を含み、例えば、CMVプロモーター
(CDM8ベクター)及びアビアンザルコーマ(avian
sarcoma)ウィルス(ASV)(πLNベクター)が挙げ
られる。他の通常使用されるプロモーターとしては、シ
ミアン(Simian)ウィルス40(SV40)(Fiers, et
al., Nature 273:113(1973) 参照) からの初期又は後期
プロモーター、又は他の、ポリオーマ、アデノウィルス
2及びボバインパピローマウィルスから誘導されたウィ
ルスプロモーターが挙げられる。hMTII(Karin, e
t al., Nature, 299:797-802(1982)参照) のような誘導
プロモーターもまた使用してもよい。
【0033】真核生物における変異体BR96を発現す
るベクターはまたエンハンサー領域と呼ばれる配列を有
していてもよい。これらは遺伝子発現を最適化するのに
重要であり、プロモーター領域の上流又は下流に存在す
る。変異体BR96をコードする配列は真核宿主細胞の
ゲノム内に組み込まれてもよく、宿主ゲノム複製として
複製されてもよい。又は、変異体BR96を含むベクタ
ーは、染色体外複製を起こす複製の起点を含んでいても
よい。Saccharomoyces cerevisiae の配列を発現するた
めに、内在性酵素プラスミドからの複製の起点である2
μの環を使用することができる(Broach, Meth. Enz.10
1:307(1983)参照) 。又は自律的な複製をプロモートし
得る酵素のゲノムの配列を使用してもよい(例として、
Stinchomb et al., Nature 282:39 (1979)、Tschemper
et al., Gene 10:157(1980) 及びClarke et al., Meth.
Enz. 101:300(1983)参照) 。酵素ベクターの転写制御
配列は解糖酵素合成のプロモーターを含む(Hess eta
l., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149 (1968) 、Holland et
al., Biochemistry 17:4900(1978)参照)。当業者に知
られている他のプロモーターとしては、CDM8ベクタ
ー内から得られるCMVプロモーター(Toyama and Oka
yama, FEBS 268:217-221 (1990))、3−ホスホグリセレ
ートキナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol.Chem. 255:20
73(1980))、及び他の解糖酵素のプロモーターが挙げら
れる。
【0034】他のプロモーターは、環境的な刺激又は細
胞の育成培地により調節することができるので、誘導可
能である。これらの誘導プロモーターは、熱刺激プロテ
イン、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロー
ムC、酸ホスファターゼ、窒素の異化作用を伴う酵素並
びにマルトース及びガラクトースを使用する酵素の遺伝
子からのプロモーターを含む。制御配列はまたコード配
列の3′に位置していてもよい。これらの配列はメッセ
ンジャーRNAを安定化する働きをしている。そのよう
なターミネーターは、幾つかの酵素誘導及び哺乳類の遺
伝子のコード配列が続く非翻訳領域の3′において見ら
れる。植物及び植物細胞のベクターとしては、限定され
るものではないが、アグロバクテリウムTi プラスミ
ド、カリフラワーモザイクウィルス(CaMV)、トマ
ト金色モザイクウィルス(TGMV)が挙げられる。哺
乳類細胞宿主系形質転換の一般的な観点は、Axelにより
既に述べられている(米国特許第4,399,216
号、8月16日、1986年)。哺乳類の細胞は、限定
されるものではないが、リン酸カルシウムの存在下にお
けるトランスフェクション、マイクロインジェクショ
ン、電気穿孔又はウィルスベクターとの形質導入等を含
む方法により形質転換される。
【0035】異物(foreign)DNA配列を植物及び酵素
のゲノムに導入する方法は、(1)単細胞又はプロトプ
ラストへのDNAのマイクロインジェクション、DNA
存在下に細胞をガラスビーズと共に攪拌する、又はDN
A被膜したタングステン又は金の球を細胞又はプロトプ
ラストへ打ち込む等の機械的な方法、(2)ポリエチレ
ングリコール処理によりマクロ分子へプロトプラストを
浸透させることによりDNAを挿入するか、高圧電気パ
ルスを与える(電気穿孔)、又は(3)プロトプラスト
に融合するリポゾーム(cDNA含有)を使用する方法
が挙げられる。変異体BR96の確認及び回収変異体B
R96の発現はクーマシー(Coomassie) で着色したSD
S−PAGE及びBR96に結合する抗イデオタイプの
抗体、又は変異体BR96免疫複合体の場合には、複合
体の非変異体BR96部分に結合する抗体を使用したイ
ムノブロット法で検出される。タンパクの回収は標準タ
ンパク精製法、例えば、アフィニティクロマトグラフィ
ー又はイオン交換クロマトグラフィーによる方法で行わ
れ、実質的に純粋な生成物を与える(R. Scopes Protei
n Purification, Principles and Practice, Third Edi
tion Springer-Verlag (1994) 参照) 。
【0036】組み換え変異体BR96免疫性毒性物質
は、sFv毒性物質を分泌させるシグナル配列と共に生
産されてもよい。シグナル配列は、宿主細胞がこの配列
をプロセシングできるように選択される。原核生物の宿
主における発現では、シグナルはさらにsFv毒性物質
を細胞周辺腔に融合させるように選択されてもよい。ま
た、タンパクはシグナル配列を伴わずに生産されてもよ
く、細胞質から回収され、尿素のような変性剤を使用し
て再生し、生物学的に活性な物質(タンパク又は抗体)
を得てもよい。免疫性毒性物質は、アニオン交換及びゲ
ル濾過クロマトグラフィーのような標準的なタンパク精
製法を用いて回収してもよい(Siegall etal., Proc. N
atl. Acad. Sci. USA 85:9738-9742 (1988)参照) 。 作製方法 LeY 抗原に対する増加した親和性を有する変異体BR
96をコードするDNA配列を、次の方法で構築し、単
離した。基本的な方法は、VH 及びVL 鎖のCDRにお
ける変異体を含有する変質したBR96分子を構築し、
次にこれらの変異体のうちどちらがLeY 抗原に対して
増強された結合を示すか確かめた。これを行うために、
相補性決定領域のアミノ酸をコードするオリゴヌクレオ
チドの混合物をアニーリングして、失活したVL及びV
H BR96コード配列を有する一本鎖テンプレートにし
た。変異したCDR領域をコードするアニーリングを行
ったオリゴヌクレオチドと共にテンプレート鎖をDNA
ポリメラーゼ及びリパーゼで二重鎖に変換した。連結生
成物は次にE.coliに形質転換し、形質転換物をLeY
対する反応性に対してスクリーニングした。
【0037】次のセクションで、VH 及びVL BR96
コードDNA配列を有するM−13誘導親免疫発現ベク
ターの構築及びCDR領域で配列変異体を構築する方法
の詳細について述べる。 1.VH 及びVL BR96領域を有するM13免疫発現
ベクターの構築 失活したBR96コード配列は、CDR領域に挿入され
て異性化される早期停止コドンを含有するものである。
そのような配列は機能性タンパクを生成しないため、L
Y 抗原に結合しない。これは、停止コドンを置換し、
LeY −結合タンパクを生成する変質化した配列のみが
検出されるので、変異体のスクリーニングを簡単にし
た。M13は、次の突然変異誘発段階において一重鎖D
NAを単離するのに必要なため、クローン化したベクタ
ーとして使用した。特に、親分子に相当するDNA鎖と
新規な配列を有するDNA鎖とを区別するのに好まし
い。VH 又はVL BR96配列をM13ベクター内に、
ポリメラーゼ鎖反応(PCR)及びハイブリッド形成突
然変異誘発法を使用して挿入した。この方法は、一つの
DNA分子と第二の相同配列のものとの置換を可能にす
る(Near, R. 1992.Biotechniques 11:88-97)。PCR
は、インビトロにおける核酸合成法であり、これによ
り、DNAの特定のセグメントを特異的に複製すること
ができる。PCR法は、DNAフラグメントを横に配列
して、DNAの変性サイクルを増幅し、繰り返す二種類
のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、プライマーを
その相補配列にアニーリングすること、及びアニーリン
グしたプライマーをDNAポリメラーゼと共に伸長する
ことを含む。
【0038】これらのプライマーはターゲット配列と反
対の鎖にハイブリダイズし、ポリメラーゼによるDNA
合成が、プライマーの間の領域を横切るように進行する
ように配向される。伸長生成物それ自身はまた相補性で
あり、かつプライマーに結合可能であり、続く増幅サイ
クルは、前サイクルで合成されたターゲットDNAの量
の2倍であることが必要である。PCR増幅による生成
物は、ハイブリッド形成突然変異誘発と呼ばれる方法に
より第二のベクター内に再クローン化することができ
る。この方法は、受容ベクターがドナーPCR増幅VH
及びVL 配列に相同である領域を有することが必要であ
る。受容ベクターはまた、一重鎖DNA形態で存在しな
ければならない。ドナー増幅配列は、リン酸化され、変
質され、及び次にドナーテンプレートにアニーリングさ
れる。DNAポリメラーゼにより鎖の伸長及び連結後、
得られた連結生成物はE.coli内に導入され、目的の組み
換え物が同一であると確認された。供給された配列を組
み入れた組み換え物を回収するという好ましい方法へ、
片寄らせるために、宿主テンプレートはdut - ung - E.
coli種の中で作製される。これらの変異体を含む種は、
チミジンではなくウラシルをDNA分子内に組み入れ
る。DNA分子がdut + ung + 種内に再導入されると、
ウラシル含有DNAは分解する。このように、PCR増
幅VL 及び/又はVH BR96配列からのドナー鎖のみ
が複製する。
【0039】親M13ベクターであるM13IXL60
4がL6抗体をコードする配列を含み、L6はBR96
に高い割合で相同性であるので、本発明では、相同性の
要求は満たされている。VL 及びVH セグメントをハイ
ブリッド形成突然変異誘発により導入することの第一の
利点は、従来のDNA連結方法で行われているように、
制限エンドヌクレアーゼ部位が、クローン化のためにV
H 又はVL 遺伝子配列に組み込まれている必要が無いこ
とである。これは、抗原結合に悪影響し得る制限部位に
よりコードされたアミノ酸残基の導入の可能性を排除す
る。VL 及びVH BR96鎖配列は、PCR法を用いて
増幅し、完全長の生成物をアクリルアミドゲルから回収
した。生成物は、リン酸化され、変質され、及び次にL
6配列である、M13IXL604を有する一重鎖DN
Aテンプレートにアニーリングされた。M13IXL6
04テンプレートは、dut - ung - E.coli種から単離さ
れた。M13IXL604テンプレート上のアニーリン
グをしたBR96配列を用いてDNA合成及び連結を行
った後、連結生成物は、dut + ung + 種内に導入され
た。PCR法及びそれに続くハイブリッド形成突然変異
誘発法により増幅されたV L 及びVH 配列の導入は、抗
体をコードする配列を、効果的なFab発現のために必
要なM13ベクターの調節因子でフレーム中に位置決め
した。
【0040】2.抗体のH鎖及びL鎖をコードする単一
M13構築物を生成させるための受容ベクターの作製。 受容ベクターとして用いられるM13ファージであるM
13IXL604は、BR96の可変領域を導入する前
にVL 及びVH のCDR内に削除及び停止コドンを導入
することにより、簡単に抗体又はタンパクの発現をしな
くなる。これは、BR96配列を組み込んだ組み換え物
のみが機能性タンパクを発現するため、簡単なスクリー
ニングを与えた。BR96VL 鎖配列がM13IXL6
04ベクターに伝達された組み換え物は、形質転換物
を、ヒト抗κL鎖抗体に対する活性をスクリーニングす
ることにより、同一物と確認された。この抗体は、失活
したL6ではなく、変異体BR96L鎖を認識する。M
13IXBR96VL −2のようなクローンは、同一物
と確認され、DNA配列により構造が正しいことを確認
された。BR96VH 配列は次に、PCR法及び上記に
述べたハイブリッド形成突然変異誘発法によりM13I
XBR96VL 一重鎖DNAを作製した、dut - ung -
に導入された。
【0041】BR96VH 配列をBR96VL −2に組
み入れた組み換え物は、デカペプチドTyr Pro Tyr Asp
Val Pro Asp Tyr Ala Ser を認識するマウスモノクロー
ナル抗体に対する活性をスクリーニングすることによ
り、同一物と確認した。この配列は、早期停止コドンの
下流をコードしているため、BR96VL −2親におい
て発現されない。しかし、早期停止コドンが適する読み
込みフレーム内に挿入されたBR96VH 配列により置
換されれば、発現される。記載した配列を持つデカペプ
チド以外の標識も存在し、同じ目的に使用できること
は、当業者らに明らかである。M13IXBR961
3.24発現タンパクがBR96と反応性の既知のもの
と反応性であることを確認するために、E.coli内で発現
させ、Fab分子を単離した。これらは、LeY を発現
する胸部腺ガン細胞系であるH3396に特異的に結合
することが見出された。BR96の改質を行うベクター
の構築の最終段階において、M13IXBR9613.
24におけるVL 及びVH 配列は、削除及び早期停止コ
ドンを部位特異性突然変異誘発法を用いて各鎖の各CD
R領域内に導入することにより、失活した。親ベクター
はそのためLeY −反応性抗体を発現し、改質された親
和性を有する変異体のスクリーニングは簡単になる。
【0042】3.コドン−ベースの突然変異誘導された
BR96のライブラリーの構築 LeY 抗原に対して改質された親和性を有する変異体B
R96の合成及びスクリーニングを行うため、二段階の
方法を用いた。実験は、最初にVL 及びVH コードCD
R領域で変異体の多くのライブラリーを作製し、次にこ
れらをLeY 抗原に対する複製フィルターリフトアッセ
イを用いてスクリーニングし、次にBR96抗原に対す
る改質された反応性を有する変異体を確認するためにH
3396ガン細胞に対し、ELISA法によりスクリー
ニングを行った。CDRライブラリーはコドン−ベース
突然変異誘発法と呼ばれる方法を用いて構築した(Glase
r, S. M., et al., 1992, J. Immunol. 149:3903-391
3)。この方法は幾つかの理由から選択された。第一に、
この方法は、最小限の情報でよい。コドン−ベース突然
変異誘発法において必要なのは、変異化するべきプライ
マリーDNA配列及びターゲット抗原の機能アッセイの
知識のみである。コドン−ベース突然変異誘発法は、予
め構造情報は必要なく、望ましい結果を得るために特別
なアミノ酸置換も必要としない。勿論、構造情報が存在
する場合には、コドン−ベース突然変異誘発法のデザイ
ンに利用することができる。コドン−ベースオリゴヌク
レオチド合成は、H鎖又はL鎖CDR内で、選択したタ
ーゲットコドンの数に相当する多数の完全にランダムな
DNA配列を与えてもよい。
【0043】可能な変異体の数は非常に多いため、異性
化するべき位置の数を制限することが好ましい。好まし
くは、溶媒が近づきやすく、従って抗原が近づきやすい
CDRループの領域のみをコドン−ベース突然変異誘発
法により変異化するのがよい。CDRループとフレーム
ワーク残基の間の分岐点のような分子の他の領域はルー
プの配向を改良するのに重要である。コドン−ベース突
然変異誘発法による第二の利点は、各コドンにおける全
てのアミノ酸を含む変異体が作製できる点にある。コド
ン−ベース突然変異誘発法は、個々のヌクレオチドでは
なく全体のコドンを置換するものである。その技術は、
突然変異誘発の方法がトリヌクレオチドDNA配列XX
G/Tの置換にベースを置くものである時、すなわち、
この配列における32の活性なコドンが、全ての20の
アミノ酸及び一つの停止コドンをコードしているとき特
に効果的である。このように、異性化はヌクレオチドを
ランダムな導入よりもより効果的に導入する。BR96
L 及びVH のCDR領域にコドン−ベース突然変異誘
発法を用いるためには、どのCDR領域を異性化し、ど
のような範囲で領域を変異化するか決定することが必要
であった。CDRの各コドンにおける50%の置換率は
任意に選ばれた。CDRループ内のどのコドンを異性化
するかという選択はBR96のコンピューターモデルに
基づき行った。
【0044】CDRループ内の新規なアミノ酸配列をコ
ードするコドンの集合の合成は、二種類のDNA合成カ
ラムのうちのどちらか一つに配置されたビーズ上で行わ
れた。ビーズは、初期のオリゴヌクレオチドを二つのカ
ラムの間に簡単に移動することを可能にした。合成は次
のように行った(図7)。 1.前もって決定したトリヌクレオチド又は選択した位
置で見出された“親”コドン配列のトリヌクレオチドを
カラム1で合成した。 2.ランダムXXG/Tコドンのトリヌクレオチド(X
は、dA、dG、dC、及びTシアノエチルホスホルア
ミダイトの混合物を表し、及びG/Tは、dG及びdC
シアノエチルホスホルアミダイトの混合物を表す)をカ
ラム2で合成した。 3.各コドンの合成後、二つのカラムからのビーズを混
合した。 4.混合したビーズを半分に分けた。 5.各半量のビーズを新しいカラムに積載した。 6.カラムをDNA合成機に戻し、続くCDRの配置の
ために段階1〜4 を繰り返した。 7.最終合成段階後、二つのカラムのプールの含有物を
プールし、オリゴヌクレオチドを回収し、精製した。 得られたオリゴヌクレオチドをBR96のVL 及びVH
CDRsを突然変異化するために使用した。BR96の
全6種類のコドン−ベースの突然変異化ライブラリーを
構築した。各ライブラリーは、異なる突然変異化された
CDRを含有している。これらの合成オリゴヌクレオチ
ドは、BR96イムノグロブリンの可変L又はH鎖を有
する親ファージの相補的配向性における全ての可能な目
的の変異体を含むようにデザインされている。
【0045】4.変化した結合を有する変異体BR96
分子の同一性の確認 変異体BR96ライブラリーは、目的の変異体であるか
どうかの同一性の確認をするためにスクリーニングを行
った。目的の変異体の確認を行った後、変異体を親ベク
ターに再導入した。これは、変異体が目的の表現型を示
すのに必要かつ十分であるかどうかを確認する。さら
に、変異体を、診断又は治療のような、適用に適する他
の分子の形態を作製するために、親ベクターに再導入す
る。使用方法は、変異体BR96の形態を例えばFa
b、Fv、F(ab’)2 、融合タンパク、及び二重特
異性抗体などに決定する。上記に述べた方法は、変異体
BR96を生産する単なる一方法である。他の当業者に
周知の方法も可能である(Foot and Winter, Mol. Biol
(1992) 224:487-499)。
【0046】発明の使用方法1.診断技術 本発明の変異体BR96抗体は、インビトロ及びインビ
ボにおける、抗体が特異な抗原を有するヒト悪性腫瘍の
検出のための診断に有用である。インビトロの診断方法
は、ガン細胞(例として、ヒト組織、細胞又は切除した
ガン種)の免疫組織学的検出又はガンによる抗原(例と
して、血液試料中又は他の生物学的流出物中のもの)の
血清学的検出を含む。血清学的診断方法は、悪性腫瘍を
患っていると考えられる患者の血清又は他の生物学的な
流出物に分泌又は“放出(shed)" されたガンに伴う抗原
の検出及び測定を含む。そのような抗原は、放射性免疫
測定法(RIA)又は酵素結合免疫固相測定法(ELI
SA)のような当業者に既知の技術を用いて体液から検
出することが可能であり、その方法において、“放出”
抗原に反応する抗体が流出物試料中の抗原の存在を検出
するのに使用される(Uotila et al., "Two-Site Sandw
ich ELISA With Monoclonal Antibodies To Human AF
P", J. Immunol. Methods,42:11(1981)及びAllum et a
l., supra at pp. 48-51参照) 。ここに記載した変異体
BR96抗体を使用したこれらのアッセイは、生物的流
出物中の変異体BR96抗体が反応する抗原の検出及び
及び患者のヒト悪性腫瘍の検出に使用することができ
る。このように、本発明の変異体BR96抗体は抗原−
抗体反応に関連するほとんどのアッセイに使用すること
ができる。これらのアッセイは、制限されるものではな
いが、液体及び固体両相の標準RIA技術、及びELI
SAアッセイ、免疫蛍光法及び他の免疫細胞化学的方法
を含む(Sikora et al., (eds.),Monoclonal Antibodie
s, pp. 32-52 (Blackwell Scientific Publications 19
84)参照) 。
【0047】免疫組織化学法は、本発明の変異体BR9
6抗体を有する組織検体のような生物学的検体の染色、
及び検体上の抗原と複合化した抗体の存在を検出するこ
とを含む。そのような検体の抗体−抗原複合体の形成
は、組織内の悪性腫瘍細胞の存在を示している。検体の
抗体の検出は、例えば、イムノパーオキシダーゼ染色法
又はアビジン−ビオチン(ABC)法又は免疫蛍光法等
の免疫酵素法のような当業技術を用いて行うことができ
る(Ciocca et al., "Immunohistochemical Techniques
Using Monoclonal Antibodies", Meth. Enzymol., 12
1:562-79(1986); Hellstrom et al., "Monoclonal Mous
e Antibodies Raised Against Human LungCarcinoma",
Cancer Research, 46:3917-23(1986);及びKimball (e
d.), Introduction to Immunology (2nd Ed.), pp. 113
-117(Macmillan Pub. Co. 1986))。例として、イムノパ
ーオキシダーゼ染色は、変異体BR96抗体の肺、胸
部、結腸及び卵巣の悪性腫瘍への活性、及び正常なヒト
の組織検体への抗体には低活性であることを示すのに用
いられた。
【0048】本発明はまた、上記に述べたアッセイを行
うための診断キットを包含する。一つの実施態様では、
診断キットは、本発明のBR96モノクローナル抗体変
異体、そのフラグメント、融合タンパク、二重特異性抗
体又はキメラ抗体並びに変異体BR96抗体に対して共
に特異的結合を行うもの及び検出シグナルを発生させる
ラベルを含む複合体を含む。試薬はまた、緩衝剤及びタ
ンパク安定化剤(例としてポリサッカライド)のような
補助剤を含んでもよい。診断キットはさらに、必要な場
合には、他の背景の障害物を減少させる薬剤、調節剤又
は試験を行うための機械もしくは容器を含むシグナル発
生系の他の成分を含むことができる。他の実施態様にお
いて、診断キットは、本発明の変異体BR96抗体及び
検出可能なシグナルを発しし得るラベルとの複合体を含
む。上記に述べた補助剤もまた存在していてもよい。本
発明の変異体BR96抗体は、インビボでの、ヒト悪性
腫瘍の検出を行う診断に有用である。そのような方法
は、ガン画像技術を用いたインビボでのガンの検出を含
む。この方法に従い、変異体BR96抗体は検出可能な
シグナルを発生する適当な画像薬剤によりラベルされ
る。使用可能な画像薬剤の例としては、限定するもので
はないが、 131I、 111In、 123I、99m Tc、
32P、 125I、 3H、及び14Cのような放射性ラベル、
フルオレセイン及びローダミンのような蛍光ラベル及び
ルシフェリンのような化学ルミネッセンス物質が挙げら
れる。抗体はこのような薬剤を用いて、当業技術により
ラベル化することができる。例えば、抗体の放射性物質
ラベル化に関する技術についてはWensel and Meares, R
adioimmunoimaging And Radioimmunotherapy, Elsevie
r, New York (1983) を参照文献として挙げる(Colcher
et al., "Use of Monoclonal Antibodies As Radiophar
maceuticals For The Localization Of Human Carcinom
a Xenografts In Athymic Mice", Meth., Enzymol., 12
1:802-16 (1986)参照) 。
【0049】放射性物質でラベル化された抗体の場合、
抗体は患者に投与され、抗体が反応する抗原を有するガ
ンに局在化し、及びインビボで、ガンマカメラ又は放射
断層撮影法等を使用した放射核走査のような既知の当業
技術を用いて、検出又は“画像化”する(Bradwell et
al., "Developments In Antibody Imaging", in Monocl
onal Antibodies For Cancer Detection And Therapy,
Baldwin et al. (eds.), pp. 65-85 (Academic Press 1
985)) 。抗体は、水、血清、リンゲル液、ハンク液又は
不揮発性油のような非水担体などの薬学的に許容される
担体内に入れて患者に投与する。担体は、また、緩衝剤
又は防腐剤のような抗体の等張性及び化学安定性を増加
させる物質を含んでいてもよい。抗体剤形は、例えば、
ガンターゲット部位を十分可視化させるガンマ発光を与
えるのに十分な投与量を、静脈注射で投与される。一般
的なガンの画像化については、Allum et al., supra at
pp.51-55 を参照。
【0050】2.発明の抗体及びそのフラグメントの治
療への適用 BR96と同様に、変異体BR96抗体の性質は、a)
ガン細胞に非常に高い特異性を有し、b)内在化し、
c)非改質形態において、適する濃度で使用した場合、
抗原陽性なガン細胞にのみ毒性を有し、d)(Fcを有
する抗体又は機能的に等価であるものの場合)相補体依
存性細胞毒性及び抗体依存性細胞性細胞毒性活性は、種
々のインビボ治療適用性を示唆する。第一に、変異体B
R96抗体はインビボにおいて、それのみでガン細胞を
ターゲットとして殺すのに用いることができる。Fc領
域を含まない変異体BR96抗体の機能的な等価体はA
DCC又はCDCの性質を示さない。抗体はまたヒト悪
性腫瘍を治療する適当な治療剤との複合体で使用するこ
とができる。例えば、抗体は、化学療法、放射性療法の
ような標準又は従来の治療法との組み合わせ、又は治療
剤もしくは毒性物質、及び悪性腫瘍の部位への治療剤の
分布のためのリンホカインもしくはガン抑制成育因子と
の複合体又は結合体で使用することができる。
【0051】そのような治療剤の抗体への複合技術はよ
く知られている(Arnon et al., "Monoclonal Antibodi
es For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therap
y", inMonoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Re
isfeld et al. (eds.), pp.243-56(Alan R. Liss, Inc.
1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Del
ivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Rob
inson et al. (eds.),pp. 623-53(Marcel Dekker, Inc.
1987);Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Age
nts In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal An
tibodies '84:Biological And Clinical Applications,
Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); and T
hrope et al., "The Preparation And Cytotoxic Prope
rties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Re
v., 62:119-58 (1982))。本発明の変異体BR96抗体
は特に、悪性腫瘍内に簡単に取り込まれ、結合して、治
療剤を細胞内の活性部位に分布させることができるた
め、治療用複合体の使用に適する。また、変異体BR9
6抗体は、131 Iのような放射性同位元素のような高エ
ネルギー放射性薬剤と結合することができる。これは、
ガンの部位に局在化した時、幾つかの細胞の横径(diame
ters) を殺す(Order, "Analysis, Results, And Futur
e Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabel
ed Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Anti
bodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin et
al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985))。
【0052】他の実施態様において、変異体BR96抗
体は第2の抗体と結合して、Segalらにより米国特許第
4,676,980号に報告されたガン細胞の治療のた
めの抗体ヘテロ複合体を形成する。本発明の変異体BR
96抗体の治療への適用は、組み換えDNA技術又はタ
ンパク化学法により、プロドラッグを細胞毒性薬剤に変
換し得る酵素に複合化又は結合すること、及びこの抗体
−酵素複合体を、プロドラッグとの組み合わせて使用
し、ガンの部位において細胞毒性物質に変換することを
含む(Senter et al.,"Anti-Tumor Effects Of Antibod
y-alkaline Phosphatase", Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 85:4842-46 (1988); "Enhancement of the in vitro
and in vivoAntitumor Activities of Phosphorylated
Mitomycin C and Etoposide Derivatives by Monoclon
al Antibody-Alkaline Phosphatase Conjugates", Canc
er Research 49:5789-5792 (1989); and Senter, "Acti
vation of Prodrugs by Antibody-Enzyme Conjugates:
A New Approach to Cancer Therapy", FASEB J. 4: 188
-193 (1990))。変異体BR96抗体の他の治療への使用
には、抗体−薬剤又は抗体−毒性物質複合体として又は
その一部として、ガン患者の骨髄からガン細胞を除去す
るための使用がある。この方法に従って、自己の骨髄を
体外で抗体処理を行い、清浄し、患者に骨髄を戻しても
よい(Ramsay et al., "Bone Marrow Purging Using Mo
noclonal Antibodies", J. Clin. Immunol., 8(2):81-8
8(1988))。
【0053】本発明の例に従い、被治療体には、ヒト、
ウマ、ブタ、ウシ、ネズミ、イヌ、ネコ及びトリが挙げ
られる。他の温血動物もまた、本発明に含まれる。従っ
て、本発明はヒトの悪性腫瘍を治療するためのBR96
を含む薬学的な組成物、組み合わせ及び方法を含む。例
えば、ヒトの悪性腫瘍を治療するための、変異体BR9
6と薬学的に許容される担体を薬学的に効果的な量含む
薬学的な組成物を含む。組成物は、変異体BR96抗体
又は抗体フラグメントを、非修飾体、治療剤との複合体
(薬剤、毒性物質、酵素又は第二抗体)、又は組み換え
形態(例として、変異体BR96のフラグメント、二重
特異性変異体BR96又は一重鎖免疫毒性物質変異体B
R96)として含有していてもよい。組成物は、さらに
他の、悪性腫瘍を治療するための抗体又は複合体を含ん
でいてもよい(例えば、抗体混合物)。
【0054】本発明の抗体、抗体複合体及び免疫毒性物
質組成物は、従来からの投与形態を使用して投与するこ
とができ、これは、限定されるものではないが、鞘内、
静脈内、腹腔内、経口、リンパ内又はガンへの直接投与
が含む。静脈内への投与が好ましい。本発明の組成物は
様々な投与形態で使用することができ、これは、限定さ
れるものではないが、溶液もしくは懸濁液、タブレッ
ト、ピル、粉末、座薬、高分子ミクロカプセルもしくは
ミクロ小胞、リポソーム及び注射可能な又は浸剤を形成
しうる溶液を含む。好ましい形態は、投与形態及び治療
を適用するものに依存する。本発明の組成物はまた、当
業者に知られている、ヒト血清アルブミン、イオン交換
体、アルミナ、レシチン、緩衝剤(リン酸、グリシン、
ソルビン酸、ソルビン酸カリウム及び塩に代表される)
及び硫酸プロタミンのような電界質のような従来からの
薬学的に許容される担体及び補助剤を含むことが好まし
い。本発明の例に従い、薬学的な担体は、脂質担体であ
ってもよい。脂質担体は、ホスホリピッドであってもよ
い。さらに、脂質担体は、脂肪酸であってもよい。ま
た、脂質担体は、洗浄剤であってもよい。ここで使用さ
れるように、洗浄剤は、液体の表面張力を変化、一般的
には低下させる物質である。
【0055】本発明の一つの例において、洗浄剤は非イ
オン性洗浄剤であってもよい。非イオン性洗浄剤の例と
しては、限定されるものではないが、ポリソルベート8
0(これはツウィーン80又はポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレートとして知られている。)、Bri
j、及びトリトン(例として、トリトンWR−1339
及びトリトンA−20)が挙げられる。また、洗浄剤
は、イオン性洗浄剤であってもよい。イオン性洗浄剤と
しては、例えば、限定されるものではないが、アルキル
トリメチルアンモニウムロミドが挙げられる。さらに、
本発明に従い、脂質担体はリポソームであってもよい。
ここでは、“リポソーム”は、本発明の分子又はその複
合体を含む膜結合小胞体である。最も効果的な本発明の
組成物の投与形態及び投与量の方向は、病気の重度及び
進度、患者の健康状態及び処置への反応並びに治療を行
う医者の判断に依る。従って、組成物の投与量は、個々
の患者により決定しなければならない。しかし、本発明
の組成物の効果的な投与量は、約1〜約2000mg/
2 の範囲であってもよい。
【0056】BR96は抗ガン剤として有用であると報
告されている(Trail et al. supra) 。BR96をイン
ビボで使用する方法は、よく知られている(Trail et a
l. supra) 。変異体BR96及び/又はBR96のよう
なその機能的等価体は、抗ガン又は抗腫瘍剤として使用
してもよい。最も効果的な本発明の分子の投与形態及び
投与量の方向は、処置を行うガンの位置、患者の健康状
態及び処置に対する反応並びに処置を行う医者の判断に
よる。従って、分子の投与量は、個々の患者により決定
しなければならない。様々な大きさ及び種類の動物と、
人間との間の、表面積のmg/m2 を基本とした投与量
の関係は、Freireich, E. J., et al. Cancer Chemothe
r., Rep. 50(4): 219-244(1966) に記載されている。投
与量の方向性の調製は、ガン細胞成長抑制及び殺作用の
応答性を最適化するように行ってもよい。例えば、投与
量を分割して、一日づつ投与するか又は状況に応じて投
与量の比例して減少させていく等である(例として、個
々の治療状況に応じて、幾つかに分けた投与量を毎日投
与するか又は比例して減少させる。)本発明の組成物
の、治療を達成するのに必要な投与量は、さらに最適化
のスケジュールに応じて減少させてもよい。
【0057】発明の利点 BR96のCDRsにおける異性化は変異体BR96の
ターゲット抗体に対する結合親和性を改良した。改良さ
れた結合は、ガン抗原のLeY 成分に対する改良された
結合に関連している。BR96M1変異体の高い親和性
をもつ表現型はH鎖CDR3残基のAsp101からA
la101の変異体に特によるものである。特に、BR
96M1変異体のLeY −HSAに対する親和性は、加
水分解により誘導されたキメラBR96Fabよりも、
約4.5倍高く、BR96M4変異体はキメラBR96F
abよりも14倍高い改良された親和性を有する。この
改良された結合親和性は、本発明の抗体がガン細胞及び
組織によりしっかりと結合し、上記に述べた適用におけ
る使用をより増強することを意味する。ここに述べた本
発明をさらに詳しく理解するために、次の実施例を挙げ
た。これらの実施例は、単に説明のために挙げたもので
あり、本発明の観点を限定するものではない。
【0058】
【実施例】実施例1 改良された結合アフィニティーを有する変異体BR96 クローニング方法及びベクター構築の説明: BR96L鎖
可変(VL )及びH鎖(VH )抗体領域をコードするDN
A 配列をハイブリダイゼーション突然変異誘発(Near,
R., 1995, Biotechniques 11:88-97; Glaser, S., Kris
tensson, K.,Chilton, T.,及びHuse, W., 1994, Borreb
aeck, C.編集、抗体エンジニアリング:実用的な手引
き、第2編、W.H.フリーマン社、ニューヨーク)により
Ixsys M13 繊維状ファージ発現ベクターにクローン化し
た。ドナーBR96VL 配列及びVH 配列を最初にポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR) により増幅した。PCR プライマーは
下記のベクター中の特定の配列と相同の領域を含んでい
た。ハイブリダイゼーション突然変異誘発による増幅さ
れたVL 配列及びVH 配列の導入は、有効なFab 発現に
必要とされるM13 ベクターの調節要素でフレーム中に抗
体配列を位置決めした。この技術の主たる利点は、制限
エンドヌクレアーゼ部位が通常のDNA 連結方法で行われ
るようなクローニングのためにVL 配列またはVH 配列
にとり込まれる必要がないことである。これは抗原結合
に悪影響し得る制限部位によりコードされたアミノ酸残
基を導入する可能性を排除する。レシピエントIxsys M1
3 ベクターの調製: M13 ファージレシピエントベクタ
ーはキメラL6 Fabを発現するM13 バクテリオファージで
あるM13IXL604 であった(Huse, W.D. ら, 1992, J.Immu
nol. 149:3914-3920; Glaser, S.M.ら, 1992, J.Immuno
l. 149:3903-3913) 。ベクター中に含まれた一定領域は
ヒトIgG1のCH1 及びヒトカッパーL鎖のCk であった。
BR96遺伝子配列とL6遺伝子配列の間の比較的高い核酸相
同性がM13 ベクターへのBR96配列の有効なハイブリダイ
ゼーションを促進した。
【0059】オリゴヌクレオチド5'-AGGGACTCCAGAAAGCT
TTT AGGCATAAATCCA-3'を使用して4つのアミノ酸を欠失
し、L6のL鎖V領域の相補性決定領域(CDR)2に終止コド
ンTAA 及びHind III制限部位を導入した。これをKunkel
(Kunkel, T.A., 1985, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 3
2:488-492; Kunkel, T.A. ら, 1987, Methods Enzymol.
154:367-382) により記載されたようなウラシル置換一
本鎖M13IXL604 DNA の部位誘導突然変異誘発により行っ
た(また、バイオ−ラド ムタ−ジーン(商標)In Vit
ro突然変異誘発キット、バージョン2マニュアル、バイ
オ−ラド、リッチモンド、VAを参考のこと)。M13IXL60
4 ファージを約0.2 の感染多重度でdut - ung - エシェ
リキア・コリ(Escherichia coli)株CJ236(バイオ−ラ
ド)中で増殖させた。37℃で4〜6時間後に、バクテリ
アを遠心分離により除去し、ファージを3.5Mの酢酸アン
モニウム、20%(w/v) のポリエチレングリコールによる
沈殿により回収した。次いでウラシル置換一本鎖(ss)DN
A をフェノールで抽出し、エタノールで沈殿させた。そ
のオリゴヌクレオチドを製造業者の指示(ベーリンガー
・マンハイム、インジアナポリス、IN)に従ってT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼでホスホリル化した。200pモルを
2μl の10x キナーゼ緩衝液(1.0M のトリス-HCl、pH8.
0 、100 mMのMgCl2 、50mMのジチオスレートール(DT
T))、1μl の10mMのATP(ベーリンガー・マンハイ
ム)、1μl のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(ベーリン
ガー・マンハイム)、及び無菌水と合わせて全容積を20
μl にした。その反応は37℃で45分間進行し、次いで混
合物を65℃で10分間加熱することによりキナーゼを不活
化した。ホスホリル化オリゴヌクレオチドをM13IXL604
ベクターssDNA にアニールし、続いて二本鎖を合成し
た。10μl の全容積中で、6〜8 pモルのホスホリル化
オリゴヌクレオチドを70℃の水浴中のアニーリング緩衝
液(20 mMのトリス-HCl、pH7.4 、2mMのMgCl2 、50mMの
NaCl) 中でベクターDNA 250 ngにアニールし、40分間に
わたって30℃に冷却した。
【0060】その反応液を氷の上に置き、下記の物質を
第二鎖の合成のために添加した。1μl の10x 合成緩衝
液(10 mMのATP 、100 mMのトリス-HCl、pH7.4 、50mMの
MgCl 2 、20mMのDTT 、及び5mMの夫々のdATP、dCTP、dG
TP、及びTTP)、1μl のT4 DNAリガーゼ(ベーリンガー
・マンハイム)、及び1μl のT4 DNAポリメラーゼ(ベ
ーリンガー・マンハイム)。その反応混合物を氷の上で
5分間インキュベートし、室温で5分間インキュベート
し、37℃で90分間インキュベートした。延長され、つな
がれた突然変異誘発DNA 産物をE.coli株DH10B(ギブコBR
L 、ガイザースブルグ、MD) にエレクトロポレーション
した。DH10B バクテリアを以下のようにしてエレクトロ
コンピテントにした。500 mlのLブロース(LB)(1%(w
/v) のバクトトリプトン、0.5 %(w/v) のバクト酵母エ
キス、1%(w/v) のNaCl) に1/100 容積のLB中のDH10B
の一夜培養液を接種した。600nm における吸光度が0.5-
1.0 光学密度(OD)になるまでバクテリアを37℃で振とう
しながら増殖させた。培養フラスコを氷の上で15-30 分
間冷却し、次いでバクテリアを15分間にわたって4℃で
4500 x gで遠心分離によりペレットにした。上澄みをデ
カントし、ペレットを冷脱イオン水500 ml中で再度懸濁
させた。バクテリアをペレットにし、冷脱イオン水250
ml中で洗浄し、再度ペレットにし、10%(V/V) のグリセ
ロール(ベーリンガー・マンハイム)(4℃)10ml中で
再度懸濁させた。遠心分離を繰り返し、バクテリアを10
%(V/V) のグリセロール(4℃)2ml中で再度懸濁さ
せ、0.1 mlの容積に分け、-70 ℃で貯蔵した。
【0061】突然変異誘発反応混合物を水で20μl に希
釈し、1μl をエレクトロコンピテントDH10B 25μl に
添加した。ピペット操作により混合した後、その混合物
を前冷却したバイオラド0.1cm ギャップキュベットに移
した。エレクトロポレーションは1.88kV、25μF 、及び
200 オームであった。10倍のアリコート、10μl 、1μ
l 、0.1 μl を夫々E.coliXL-1ブルー(LB+10μg/mlの
テトラサイクリン中で増殖させた)(Stratagene, San Di
ego, CA)の一夜培養液0.2 mlに添加し、トップアガー
(0.7 %(w/v) のバクトアガー)2.5 mlと混合し、10cm
のLBプレート(1.5%(w/v) のバクトアガーを含むLB)に
塗布した。プレートを37℃で4−6時間インキュベート
した。そのオリゴヌクレオチドをとり込んだファージは
ヒトカッパーL鎖を発現しないようであり、こうしてフ
ィルターリフトアッセイ(Huse, W.D.ら, 1992, J.Immu
nol. 149:3914-3920) により予備同定した。Fab 発現
を、夫々のプレートに10mMのイソプロピル−β−D−チ
オガラクロピラノシド(IPTG)( ベーリンガー・マンハイ
ム)中でソーキングされた0.45μのニトロセルロースフ
ィルター(シュライヒェル&シュエル、キーン、NH)で
オーバーレイすることにより誘導した。プレートを室温
で6時間〜一夜にわたってインキュベートした。フィル
ターを除去し、イムノブロッティング技術により処理し
た。全ての工程につき、フィルターをロッキングプラッ
トフォームの上で絶えず攪拌した。最初に、フィルター
をブロッキング緩衝液(バイオサイト、サンジエゴ、C
A)中でブロックして抗体の非特異性結合を阻止した。
次いでフィルターをブロッキング緩衝液中で1:1000に希
釈されたアルカリ性ホスファターゼ(フィッシャー・バ
イオテク、サンフランシスコ、CA)に接合されたヤギ抗
ヒトカッパーL鎖と共に室温で1−2時間インキュベー
トした。フィルターを10分間にわたってTBST(25 mMのト
リス-HCl、pH7.4、0.137MのNaCl、5mMのKCl 、0.9 mM
のCaCl2 、0.5 mMのMgCl2 、0.05%(V/V)のトゥイーン2
0(商標))で3回洗浄し、次いでアルカリ性ホスファタ
ーゼ基質試薬(バイオ−ラド)で展開した。
【0062】抗ヒトカッパー試薬で染色しなかったプラ
ークを単離し、ファージssDNA を配列決定(Sambrook,
J, Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989,分子クローニ
ング、実験マニュアル, Cold Spring Harbor Laborator
y Press)のために調製した。製造業者(ユナイテッド・
ステーツ・バイオケミカル、クレーブランド、OH)に従
ってシーケナーゼ・バージョン2で行われた配列分析
は、オリゴヌクレオチド配列がベクターDNA にとり込ま
れたことを確かめた。同様に、オリゴヌクレオチド5'-G
AAGTCATCAGCACGCGTTTAAGTGTAGGTGTT-3' を使用して3つ
のアミノ酸を欠失し、L6のH鎖V領域のCDR2に終止コド
ンTAA 及びMlu I 制限部位を導入した。L鎖のCDR2中に
終止をとり込んだ上記のファージからのベクターDNA を
突然変異誘発の鋳型として使用した。突然変異をとり込
んだファージと親の間の表現型の相違は、CDR2中の終止
の導入がベクターCH1 ドメインのカルボキシ末端に付加
されたデカペプチド、Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Ty
r Ala Ser (Huse, W.D. ら, 1989, Science 246:1275-1
281)の発現を阻止することであった。突然変異誘発反応
からのファージのニトロセルロースリフトを、そのデカ
ペプチドを結合するマウスモノクローナル抗体である7F
11- アルカリ性ホスファターゼ接合体(バイオサイト
社、サンジエゴ、CA)で探査し、そして7F11を結合しな
かったファージを単離した。配列分析は突然変異誘発性
オリゴヌクレオチド配列の存在を確かめた。
【0063】BR96配列の増幅に使用したオリゴヌクレオ
チド:全てのオリゴヌクレオチドをミリゲンサイクロン
+DNA シンセサイザー(バーリントン、MA)によるβ−
シアノエチルホスホルアミジト化学により合成した。オ
リゴヌクレオチド精製カートリッジ(アプライド・バイ
オシステムズ、フォスターシティ、CA)を使用してオリ
ゴヌクレオチドを精製した。5'センスまたは正(forwar
d)PCRプライマーはM13 発現ベクター中に含まれたリー
ダーペプチド配列の3'末端と同一のDNA 配列、直ぐに続
いてクローン化すべきBR96V領域遺伝子のアミノ末端配
列からなっていた。BR96L鎖正PCR プライマーの配列は
5'-GCCCAACCAGCCATGGCC GATGTTTTGATGACCCAAAT-3' であ
った。下線を施した領域は6つのコドン+BR96VL 遺伝
子配列のアミノ末端の7アミノ酸をコードする最初の二
つのヌクレオチドに相当する。そのプライマーの残りは
M13 発現ベクター中に含まれたリーダーペプチド配列の
3'末端にハイブリッドを形成した。3'アンチセンスまた
は逆PCR プライマーはV領域遺伝子のカルボキシ末端配
列にハイブリッドを形成した配列により直ぐに先行され
たM13 発現ベクター中に含まれたヒトカッパーL鎖一定
領域の5'末端と同一のDNA 配列からなっていた。BR96L
鎖逆PCR プライマーの配列は5'-AGATGGCGGGAAGATGAAGAC
AGATGGTGCAGCCACAGTCCGTTTTATTTCCAA -3' であった(初
期のL鎖逆PCR プライマーはコドン112中に点突然変異
を有していた。これはM13IX ベクターへのBR96のクロー
ニングに続いて修正された。その突然変異を修正するの
に使用されたオリゴヌクレオチドは5'-GACAGATGGTGCAGC
CACAGTCCG-3'であった)。
【0064】下線を施された領域はBR96VL のカルボキ
シ末端残基104-108 をコードする5つのコドンに相当す
る。この配列はセンス3'BR96VL 遺伝子配列にアニール
し、それを増幅した。増幅されたPCR 生成物はバクテリ
アのペクテートリアーゼ(pelB) リーダーペプチド配列
の3'末端にハイブリッドを形成し、これはVL - Ck(Be
tter, M. ら, 1988, Science 240:1041-1045)をバクテ
リアの細胞周辺腔、そしてM13 発現ベクター中に含まれ
たL鎖一定配列のコドン109-116 に向ける。同様に、BR
96H鎖正PCR プライマー配列は5'-CCTGTGGCAAAAGCCGAAG
TGAATCTGGTGGAG-3' であり、BR96H鎖逆PCR プライマー
配列は5'-ATGGGCCCTTGGTGGAGGCTACAGAGACCGTGACCAG-3'
であった。H鎖PCR 増幅配列はバクテリアのアルカリ性
ホスファターゼリーダーペプチド配列の3'末端にハイブ
リッドを形成し、これはバクテリアの細胞周辺腔、そし
てM13 発現ベクター中に含まれたH鎖CH1 配列のコドン
114-119 へのVH -CH1(Skerra, A. 及びPluckthun, A.,
Science 240:1038-1041) の分泌を誘導する。
【0065】M13IX ベクターへのBR96配列のクローニン
グ: BR96VL 遺伝子及びVH 遺伝子をハイブリダイゼ
ーション突然変異誘発によりIxsysM13IXL604発現ベクタ
ーに逐次移入した。可変領域遺伝子のPCR 増幅のため
に、BR96VL 遺伝子配列またはVH 遺伝子配列を含むpU
C19 プラスミドを制限エンドヌクレアーゼXho I で完全
に消化した。DNA を等容積のフェノール/クロロホルム
/イソアミルアルコール(25:24:1) で1回抽出し、等容
積のクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)で1回
抽出し、次いでエタノールで沈殿させた。制限DNA を無
菌水で2ng/μl の濃度まで再度懸濁させた。直線状にさ
れたpUC19/BR96VL プラスミド10ngを、上記のL鎖正PC
R プライマー及び逆PCR プライマーを使用して50μl の
反応容積で増幅させた。PCR 増幅をSaiki らの方法(198
8, Science 239:487-491) により行った。増幅の条件は
94℃で2分間の変性、次いで94℃で1分間の変性の2サ
イクル、50℃で1分間のアニーリング、そして72℃で1
分間のDNA 合成であった。これに続いて40サイクルで94
℃で1分間の変性、55℃で1分間のアニーリング、そし
て72℃で1分間のDNA 合成、そして最後に72℃で10分間
の延長を行った。増幅産物を等容積のクロロホルム/イ
ソアミルアルコール(24:1)で1回抽出し、エタノールで
沈殿させた。
【0066】VH 配列のPCR 増幅を、直線状にされたpU
C19/BR96VH プラスミド及び上記の適当なプライマーを
用いて同様に行った。増幅されたVH 及びVL 二本鎖DN
A 産物をゲル電気泳動により単離した。DNA 産物を5%
(w/v) のポリアクリルアミド/1 Xトリスボレート、pH
8.3-EDTAゲルに適用し、そして100Vで電気泳動にかけ
た。ゲルを臭化エチジウム(1μg/ml) で染色し、DNA を
紫外線で可視化し、レーザーブレードで切除した。DNA
を一夜にわたって37℃で振とうしながらゲル溶離緩衝液
(0.3M のNaCl、10mMのトリス-HCl、pH7.5 、1mMのEDT
A、0.1 %[w/v ]のSDS)でゲルから化学溶離した。溶
出液を回収し、ゲル溶離緩衝液0.25mlをゲルスライスに
添加し、そして37℃で振とうしながら更に30-60 分間イ
ンキュベートした。第二溶出液を第一溶出液と共に溜
め、そして両方をブタノールで3回、クロロホルム/イ
ソアミルアルコール(24:1)で1回抽出し、次いでエタノ
ールで沈殿させた。DNA を10,000 x gで20分間の遠心分
離により回収した。ペレットを80%(v/v) のエタノール
で1回洗浄し、次いで空気乾燥させた。DNA を水約15μ
lに可溶化し、試料3−4μl の260 nmにおける吸光度
を測定することによりその濃度を測定した。ハイブリダ
イゼーション突然変異誘発を実質的に上記のようにして
行った。二本鎖(ds)PCR 産物を、dsDNA 400 ngを2μl
の10x キナーゼ緩衝液、1μl の10mMのATP 、1μl の
T4ポリヌクレオチドキナーゼ、及び無菌水と合わせて全
容積を20μl とすることによりT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼでホスホリル化した。その反応は37℃で45分間進行
した。その混合物を65℃で10分間加熱することによりキ
ナーゼを不活化した。
【0067】ホスホリル化PCR 増幅BR96VL DNA を修飾
ウリジニル化M13IXL604 ssDNA ベクターにアニールし、
続いて第二鎖を合成した。10μl の全容積で、ホスホリ
ル化BR96VL DNA100ngをアニーリング緩衝液中で90℃で
3分間にわたってベクターDNA 250ng にアニールし、次
いで30℃に徐々に冷却した。その反応液を氷の上に置
き、第二鎖合成が上記のように進行した。延長され、つ
ながれた突然変異誘発DNA 産物をE.coli株DH10B にエレ
クトロポレーションした。ドナーBR96L鎖による修飾L6
L鎖の成功した置換を、アルカリ性ホスファターゼに接
合されたヤギ抗ヒトカッパーL鎖によるプラークリフト
アッセイにより検出した。クローンM13IX BR96VL -2は
DNA 配列分析により測定されたように正確なインフレー
ムキメラ免疫グロブリン配列を有していた。修飾ウリジ
ニル化M13IXL BR96 VL -2一本鎖DNA 鋳型を調製し、ホ
スホリル化PCR 増幅BR96VH で突然変異誘発した。ドナ
ーBR96VH 領域によるL6H鎖配列の置換はベクターCH1
ドメインのカルボキシ末端に付加されたデカペプチドの
発現をもたらし、そして7F11- アルカリ性ホスファター
ゼ接合体によるプラークリフトアッセイで検出された。
また、BR96を結合するマウス抗イディオタイプモノクロ
ーナル抗体である757-4-1 を使用してBR96VH 配列の成
功した導入及び発現を検出した。ニトロセルロースフィ
ルターをブロックした後、757-4-1 (ブロッキング緩衝
液中1μg/ml)を室温で1−2時間にわたって添加し
た。フィルターを夫々10分間でTBSTで3回洗浄し、次い
でヤギ抗マウスIgG(フィッシャー・バイオテク)で探査
した。再度、フィルターを洗浄し、上記のようにしてア
ルカリ性ホスファターゼ基質中で展開した。
【0068】クローンM13IX BR96 13.2 をフィルターリ
フトアッセイにおいて抗イディオタイプ757-4-1 で同定
し、フレーム中に完全長キメラ免疫グロブリン配列を有
していた。単一の点突然変異が位置51で見られ、これが
Ile をVal に変換した。オリゴヌクレオチド5'-ACCTTGA
CTAATGTATGCGACC-3'を使用してこの点突然変異をIleに
逆に変換してM13IX BR96 13.24を構築した。M13IX BR96
13.24をE.coli中で発現し、粗Fab 製剤をHuse, W.D.
ら, 1992, J.Immunol. 149:3914-3920に記載されたよう
にして周辺腔から単離した。簡単に言えば、対数期E.co
li株MK-30-3(ベーリンガー・マンハイム)を1-5 M.O.I.
で感染し、インキュベーターシェーカー中で37℃で1−
3時間増殖させた。0.5 mMのIPTGを添加することにより
培養液をFab 発現のために誘導し、25℃で一夜インキュ
ベートし続けた。バクテリアを遠心分離(4500 x g)によ
り回収し、培養容積の約1/10のTES 緩衝液(30 mMのトリ
ス-HCl、pH8.0 、2mMのEDTA、20%[w/v ]の蔗糖)中
で再度懸濁させた。等容積のTES 中の2mg/ml のリソチ
ームを懸濁液に添加し、氷の上で10分間インキュベート
して細胞を透過性にした。次いで上澄みを遠心分離(13,
500 x g)し、細胞周辺フラクションである上澄みを除去
し、4℃で貯蔵した。
【0069】BR96 13.24 Fab製剤を、腺乳癌腫瘍細胞系
H3396(Hellstrom, I. ら, 1990, Cancer Research , 5
0:2183-2190) への結合につきELISA により分析した。H
3396細胞を96ウェル組織培養プレートに接種し、10%の
ウシ胎児血清を含むIMDM(ギブコ、グランド・アイラン
ド、NY)中で37℃で一夜増殖させた。培地をプレートか
らはらい落とし、細胞を2%のパラホルムアルデヒド/
食塩加リン酸緩衝液(PBS) で15分間定着した。定着細胞
をPBS 、1%(w/v) のBSA で3回洗浄し、PBS、1%のB
SA 中で1時間ブロックした。周辺質50μl を75μl の
トリス緩衝食塩液、pH7.5 (TBS) 、1%のBSA で希釈し
た。希釈した周辺質50μl をH3396 と共に室温で1時間
インキュベートした。細胞をTBS 、1%のBSA で4−5
回洗浄し、そしてヤギ抗ヒトカッパーアルカリ性ホスフ
ァターゼ接合体(TBS 、1%のBSA 中1:1000に希釈)10
0 μl を室温で30分間にわたってウェルに添加した。細
胞をTBS で5回洗浄し、そして0.1Mのアミノメチルプロ
パンジオール、0.5Mのトリス-HCl、pH10.2、0.1 %(w/
v) のNaN3(JBLサイエンティフィック、サン・ルイス・
オビスポ、CA)中で6mg/ml のフェノールフタレインモ
ノホスフェートで展開した。その反応を10mMのトリス塩
基、5mMのEDTAの最終濃度にすることにより反応を停止
した。BR96は腫瘍細胞系H3396 を特異的に結合した。
【0070】コドンをベースとする突然変異誘発BR96ラ
イブラリーの構築: コドンをベースとする突然変異誘
発技術により突然変異誘発するためのVH ドメイン及び
LドメインのCDR ループ内の残基を、正準構造に基く
コンピューターモデリング(Chothia, C. ら, J.Mol.Bi
ol., 186:651-663[1985]及びChothia, C. ら, Natur
e, 342:877-883 [1989])(J.Bajorath, BMSPRI) によ
り測定した。以下の推奨をつくった。 VL CDR 1 残基Val30-Tyr37 VL CDR 2 残基Tyr54-Ser57 VL CDR 3 残基Gly96-Phe101 VH CDR 1 残基Gly26-Tyr33 VH CDR 2 残基Ser52-Asp59 VH CDR 3 残基Gly99-Trp105 6のコドンをベースとする突然変異誘発ライブラリーを
BR96において構築し、夫々のライブラリーが異なる突然
変異誘発CDR を含んでいた。6つの鋳型を、欠失、続い
てBR96のCDR 中の終止コドンを導入することにより調製
した。欠失及び終止を導入したオリゴヌクレオチドを以
下に示す。終止コドンが下線を施された配列により示さ
れる。
【0071】欠失/終止を導入するのに使用したL鎖オ
リゴヌクレオチド: ΔCDR 1 VL : 5'-GTACCATTCTAAAAGCTT TTA AATGATCTGACT-3' ΔCDR 2 VL : 5'-AGAAAATCGGTTAAGCTT TTA GATCAGGAGCTG-3' ΔCDR 3 VL : 5'-CGAGCCGAACGTAAGCTT TTA TTGAAAGCAGTA-3' 欠失/終止を導入するのに使用したH鎖オリゴヌクレオ
チド: ΔCDR 1 VH : 5'-AACCCAATACATACGCGT TTA AGAGGTTACACA-3' ΔCDR 2 VH : 5'-AGTGTCTGGATAACGCGT TTA AATGTATGCGAC-3' ΔCDR 3 VH : 5'-CCAGTAAGCAAAACGCGT TTA TCTTGCACAGTA-3' 6種のBR96 CDR欠失/終止鋳型を部位誘導突然変異誘発
により構築し、免疫化学染色試薬との反応性の損失によ
り同定した。BR96L鎖は最早3種のL鎖鋳型中で発現さ
れず、またBR96H鎖は3種のH鎖鋳型中で発現されなか
った。コドンをベースとする突然変異誘発による非機能
性CDR の再構成は免疫化学技術により免疫グロブリン鎖
発現を検出する能力を救済するであろう。全ての構築物
の配列をDNA 配列分析により確認した。次いでウリジニ
ル化一本鎖DNA 鋳型を、コドンをベースとする突然変異
誘発のために調製した。
【0072】コドンをベースとするオリゴヌクレオチド
を、Glaser, S.M.ら, 1992, J.Immunol. 149:3903-3913
に記載されたような親BR96 CDR配列につき50%のバイア
スで合成した。オリゴヌクレオチド配列を以下に示す。
最後の合成工程後に、親カラム(P) 及び突然変異誘発性
カラム(M) からの内容物を溜め、そして全ての6種の混
合物を変性12%ポリアクリルアミド/7M尿素/1Xトリス
ボレート-EDTA ゲルによる電気泳動により精製した。DN
A を切除されたゲルスライスからゲル溶離緩衝液で化学
溶離し、ブタノールで3回抽出し、エタノールで沈殿さ
せた。6回の合成の夫々からの精製オリゴヌクレオチド
2μg をホスホリル化し、続いて夫々100ng を使用して
部位誘導突然変異誘発(上記の操作を参照のこと)によ
り6のBR96 CDRライブラリーを生じた。下記のコドンを
ベースとするオリゴヌクレオチドを、BR96のVH CDR 及
びVLCDR を突然変異誘発するために合成した。全ての
オリゴヌクレオチドをアンチセンス形態で表し、Nは
A、G、C、及びTを同等に表す。A/C は50%のA及び
50%のCを示す。
【0073】L鎖オリゴヌクレオチド: BR96 L1P: 5'-GTA CCA TTC TAA ATA GGT GTT GCC ATT A
TT ATG TAC AAT GAT CTGACT-3' BR96 L1M: 5'-GTA CCA TTC TAA A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN A/CNN AAT GAT CTG ACT-3' BR96 L2P: 5'-AGA AAA TCG GTT GGA AAC TTT GTA GAT C
AG GAG CTG-3' BR96 L2M: 5'-AGA AAA TCG GTT A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN GAT CAG GAG CTG-3' BR96 L3P: 5'-CGA GCC GAA CGT GAA TGG AAC ATG TGA A
CC TTG AAA GCA GTA-3' BR96 L3M: 5'-CGA GCC GAA CGT A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN TTG AAAGCA GTA-3' H鎖オリゴヌクレオチド: BR96 H1P: 5'-AAC CCA ATA CAT GTA ATA GTC ACT GAA A
GT GAA TCC AGA GGT TACACA-3' BR96 H1M: 5'-AAC CCA ATA CAT A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN A/CNN AGA GGT TAC ACA-3' BR96 H2P: 5'-AGT GTC TGG ATA GTC GGT TAT ATC ACC A
CC TTG ACT AAT GTA TGCGAC-3' BR96 H2M: 5'-AGT GTC TGG ATA A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN A/CNN AAT GTA TGC GAC-3' BR96 H3P: 5'-CCA GTA AGC AAA CCA GGC CCC GTC GTC C
AG GCC TCT TGC ACA GTA-3' BR96 H3M: 5'-CCA GTA AGC AAA A/CNN A/CNN A/CNN A/C
NN A/CNN A/CNN A/CNN TCT TGC ACA GTA-3'
【0074】高アフィニティーFab に関するBR96 CDRラ
イブラリーのスクリーニング:BR96 CDRライブラリーを
パラホルムアルデヒド定着H3396 細胞に関するELISAア
ッセイにより高アフィニティー変異体Fab につきスクリ
ーニングした。一例として、オリゴヌクレオチドBR96 H
3P及びBR96 H3Mで構築されたBR96 CDR3 H鎖ライブラリ
ーをプラークリフトアッセイにより分析し、そしてデカ
ペプチド陽性クローンを単離した。周辺質フラクション
を夫々のクローンから調製し、上記のようにして定着H3
396 細胞に関して分析した。72のBR96VH CDR3変異体Fa
b の初期スクリーンから、一つのクローンであるM1が同
濃度で親BR96分子よりも高いODシグナルを示すH3396 腫
瘍細胞を結合し、M1が抗原に対し大きなアフィニティー
を有することを示唆した。BR96M1は、BR96抗原を発現し
ない結腸癌細胞系である定着H3719 に結合しなかった。
これは、抗原へのクローンBR96 M1 の改良された結合が
特異的であることを示した。BR96 M1 のDNA 配列分析
は、Asp101 (GAC)からAla101 (GCG)(連続ナンバリング
系)までのH鎖のCDR3中の単一アミノ酸変化を明らかに
した。オリゴヌクレオチド5'-CCA GGC CCC GTC CGC CAG
GCC TCT TGC-3' を合成し、使用して部位誘導突然変異
誘発により親BR96鋳型中のAsp101残基をAla101に変え、
それ故、BR96 A101 と称した。このクローンの正確なDN
A 配列の後に、BR96 A101 ( 即ち、H鎖のCDR3の位置10
1 にあるアラニンを含む変異体BR96) を確認し、パラホ
ルムアルデヒド定着H3396 細胞への結合を評価した。BR
96 A101 はBR96 M1 と同様にH3396 腫瘍細胞を結合し、
BR96 M1 の高アフィニティー表現型がAla101へのH鎖CD
R3残基の突然変異のために特異性であることを実証し
た。
【0075】ELISA によるBR96 M1 Fab の分析: BR96
は多くの癌及び癌由来細胞系(Hellstrom I. ら, 1990,
Cancer Res. 50:2183-2190) で発現された腫瘍抗原のル
イスY(LeY )部分に結合する。腫瘍細胞へのBR96 M1
の改良された結合が腫瘍抗原のLeY 成分への改良された
結合と相関関係があることを示すために、ヒト血清アル
ブミンに接合されたLeY テトラサッカリド(LeY -HSA)
(アルベルタ・リサーチ・カウンシル、エドモントン、
アルベルタ、カナダ)を使用するELISA を行った。ELIS
A のための別の抗原源はH3396 細胞の膜製剤であった。
膜の単離の操作は以下のとおりである。細胞をIMDM、10
%(v/v) のウシ胎児血清中で集密まで増殖し、37℃で5-
10分間にわたってEDTA溶液(PBS 中0.02%[w/v ]のED
TA及び0.02%[w/v ]のデキストロース)で処理して細
胞を培養フラスコから脱着した。細胞を遠心分離(1000
x g)により回収し、PBS(4℃)で1回洗浄した。上澄み
を吸引し、細胞ペレットを直ちに処理し、または-70 ℃
で凍結した。細胞ペレット0.5-3 mlを回収した時、細胞
を膜単離のために処理した。凍結された場合、ペレット
を室温で解凍した。10mlの溶解緩衝液(10mMのトリス-H
Cl、pH7.4 、5mMのEDTA、pH10.2、10.5μg/mlのアプロ
チニン、0.5 mMのPMSF、5μg/mlのロイペプチン)(4
℃)をペレットに添加し、ピペットで良く混合し、氷の
上で15分間インキュベートした。次いでその懸濁液を冷
却ドウンスホモジナイザー中で30-40 ストロークで均一
にし、ホモジネートを4℃で5-10分間1500 x gで遠心分
離した。上澄みを注意して除去し、12mlの超透明遠心分
離管(ベックマン、フラートン、CA)に入れ、膜を高速
遠心分離(82,000 x g 、4℃)によりペレットにした。
管の上部の脂質層をパスツールピペットで注意して除去
し、上澄みの残部をデカントした。ペレットをPBS 緩衝
液(5mMのEDTA、pH10.2、10.5μg/mlのアプロチニン、
0.5 mMのPMSF、5μg/mlのロイペプチン、25mMのヨード
アセトアミドを含むPBS)中で再度懸濁させ、上記のよう
にして高速で遠心分離した。ペレットをPBS 緩衝液1-3
ml中で再度懸濁させ、タンパク質含量をBCA タンパク質
アッセイ(ピアス・ケミカル社、ロックフォード、IL)
により推定した。
【0076】M1 Fabの源は周辺質フラクションまたは精
製Fab であった。M1 Fabを培養液4リットルに由来する
周辺質製剤から精製した。周辺質フラクションを等容積
のPB-0.5M のNaCl(NaCl を補給されてその濃度を0.5Mに
したPBS)で希釈し、次いで0.45μm のフィルターで濾過
した。希釈され、濾過されたフラクションを製造業者の
指示に従ってCNBr活性化セファロース4B(ファーマシ
ア、ピスキャットアウェー、ニュージャージー)にカッ
プリングされたヤギ抗ヒトFab 抗血清(シグマ、セント
ルス、ミズーリー)であるアフィニティーカラムに適用
した。カラムをPB-0.5M のNaClで洗浄した後、M1 Fabを
0.1MのNaClを含む0.1Mのクエン酸、pH2.2で溶離した。F
ab の溶離をA280により監視し、溶離直後に、Fab フラ
クションを1/10容積の1Mのトリス-HCl、pH8.5 の添加に
より中和した。PBS に対する透析による緩衝液交換後
に、M1 FabをYM-10 フィルターを備えたアミコン攪拌セ
ル(アミコン・ディビジョン、W.R.グレース&Co. 、ベ
バリィ、MA)中で濃縮した。ELISA のために、96ウェル
マイクロタイタプレート(イムンロンII、ダイナテック
・ラボラトリィズ、チャンチリィ、VA)をLeY -HSA(0.0
5Mの炭酸塩/重炭酸塩、pH9.6 中1μg/ml、ウェル当た
り100 μl)で被覆した。プレートを4℃で一夜インキュ
ベートした。吸収されなかった抗原をプレートからはら
い落とし、ウェルを食塩水−トィーン(0.9%[w/v ]の
NaCl、0.5 %[w/v ]のトィーン20(商標))で3回洗浄
した。抗体の非特異的結合を室温で1時間にわたって20
0 μl/ウェルの標本希釈剤(10%[v/v ]のスペシメ
ン・ディルエント、ゲネティック・システムズ、シアト
ル、ワシントン)の添加によりブロックした。過剰のブ
ロッキング緩衝液を除き、プレートを食塩水−トィーン
で1回洗浄した。
【0077】M1 Fabをタンパク質加水分解により誘導さ
れたキメラBR96 Fabと比較した。キメラBR96 (Fell, H.
P., Yarnold, S., Hellstrom, I., Hellstrom, K.E., F
olger, K.R., 1989, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 86:8
507-8511; Yarnold, S. 及びFell, H.P. 1994 Cancer R
esearch 54:506-512) を製造業者の文献(ピアス・ケミ
カル社)に概説されたようにしてパパインで消化した。
M1 Fab及びキメラBR96Fabを標本希釈剤中の連続の3倍
希釈液中で滴定し、4℃で一夜にわたってLeY-HSA膜及
びH3396 膜でインキュベートした。プレートを食塩水−
トィーンで4回洗浄し、接合体希釈剤(ゲネティック・
システムズ)(ウェル当たり100 μl)中で先に行われた滴
定に従って希釈されたホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ(HRP) 接合ヤギ抗ヒトカッパーL鎖特異性試薬(カ
ルタグ、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア)を
添加した。反応液を室温で1時間インキュベートし、次
いで接合体をウェルからはらい落とし、プレートを食塩
水−トィーンで5回洗浄した。クロモーゲンであるTMB
(3,3',5,5' テトラメチルベンジリジン)(ゲネティック
・システムズ)を緩衝基質(0.015 %[v/v ]のH2O2
含む0.1Mのクエン酸でpH5.5 に調節された0.1Mの酢酸ナ
トリウム)中で1:100 に希釈し、室温で20-30 分にわた
って96ウェルプレートに添加した(100μl/ウェル)。反
応をウェル当たり100 μl の3NのH2SO4 の添加により停
止し、450nm における吸光度をバイオテクEL312 ミクロ
プレートリーダー(バーリントン、VT)で測定した。
【0078】H3396 膜及びLeY -HSAへのM1 Fabの結合プ
ロフィールは同様であった(図8及び9)。タンパク質
加水分解により誘導されたキメラBR96 Fabと比較して、
約5倍少ない変異体BR96 M1 Fab が最大ODの半分を得る
のに必要とされた。このデータは、M1中の突然変異がそ
の抗原に対するFab の結合アフィニティーを増大するこ
とを確かめた。LeY - ホースラディッシュペルオキシダ
ーゼによるBR96 CDR3 ライブラリーのスクリーニング:
抗原へのM1の増大された結合に関するAla101へのAsp1
01の突然変異の寄与を独立の方法により調べた。LeY -
ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合体(LeY -HS
A)をフィルターリフトアッセイにおいて使用してBR96
コドンをベースとする突然変異誘発CDR ライブラリーを
スクリーニングした。LeY- ヒドラジド(アルベルタ・
リサーチ・カウンシル)を以下のようにしてHRP で誘導
体化した。10mgのHRP(ベーリンガー・マンハイム)を0.
1Mの酢酸塩緩衝液、pH5.0(4℃)0.5 mlに可溶化した。
0.5Mの過ヨウ素酸ナトリウム25.7μl をHRP溶液に添加
し、光から保護された氷浴中で20分間インキュベートし
た。酸化されたHRP をセファデックスG25 ゲル濾過によ
り消費されなかった過ヨウ素酸ナトリウムから分離し
た。酸化されたHRP をLeY - ヒドラジド3mgに添加し、
4時間にわたって4℃で暗所に保ち、時折混合した。そ
の反応液をホウ水素化シアンナトリウムの136.8 mg/ml
2.86μl の添加により中和した。その溶液を暗所で一夜
にわたって4℃に保ち、次いでPBS に対し透析した。ア
リコートを1:20に希釈し、403 nmにおける吸光度を測定
し、0.73の吸光率を使用してその濃度を計算することに
よりHRP 濃度を測定した。チメロソール(0.01%[w/v
])を防腐剤としてLeY -HRPに添加し、それを4℃で
貯蔵した。
【0079】BR96 CDR3 H鎖ライブラリーからのフィル
ターリフトを上記のようにして調製し、ブロット−トィ
ーン(0.5 %[w/v ]のカーネーション無脂肪ドライミ
ルク、0.01%[v/v ]のアンチフォーム-A、0.01%[v/
v ]のチメロソール、0.2 %[v/v ]のトィーン20(商
標) を含むPBS)でブロックした。ニトロセルロースリフ
トを4℃で一夜にわたってブロット−トィーン中2μg/
mlのLeY -HRPで探査した。フィルターをPBS 、0.1 %(v
/v) のトィーン20(商標) 中で室温で5分間にわたって
5回洗浄し、次いでエンハンスト・ケミルミネッセンス
・リーゲント(商標)(アメーシャム・ライフ・サイエン
シィズ、アーリントン・ハイツ、IL)で展開した。BR96
CDR3 H鎖ライブラリースクリーンから、単一クロー
ン、即ち、BR96 H3-1 は親BR96よりも強いシグナルを生
じた。このクローンをプラーク精製し、周辺質フラクシ
ョンを調製し、そしてパラホルムアルデヒド定着H3396
腫瘍細胞への結合につきELISA により分析した。BR96 H
3-1-1 と称されるプラーク精製されたBR96変異体は定着
H3396 細胞を結合しただけでなく、BR96 M1 を結合し
た。親BR96及びBR96 M1 と比較してBR96 H3-1-1 のDNA
配列を以下に示す。
【0080】 VH CDR3 アミノ酸位置: 99 100 101 102 103 104 105 BR96 GGC CTG GAC GAC GGG GCC TGG Gly Leu Asp Asp Gly Ala Trp BR96 M1 GGC CTG GCG GAC GGG GCC TGG Gly Leu Ala Asp Gly Ala Trp BR96 GGC CTG GCG GAC GGG GCG TGG H3-1-1 Gly Leu Ala Asp Gly Ala Trp DNA 配列分析は、高アフィニティーBR96変異体BR96 H3-
1-1 がBR96 M1 (これはH3396 腫瘍細胞へのそれの結合
により選択された)と同一のアミノ酸配列を有すること
を明らかにし、BR96 M1 高アフィニティー表現型がH339
6 細胞で発現されたLeY 抗原との強い相互作用から生じ
ることを再度実証した。また、配列同一性は、CDR3の位
置101 のアラニンが高アフィニティー表現型を与えるの
に重要であることを示唆した。最後にまた、配列決定
は、BR96 H3-1-1 がBR96 CDR3 H鎖ライブラリーから選
択され、そして変異体BR96 M1 ではないことを示した。
何となれば、BR96 H3-1-1 中のAla104が親BR96そしてBR
96 M1 に見られるGCC ではなくGCG によりコードされた
からである。
【0081】コドンをベースとする突然変異誘発BR96 M
1 ライブラリーの構築:LeY 抗原に対するBR96 M1 のア
フィニティーを更に強化する試みでBR96 M1 をコドンを
ベースとする突然変異誘発の鋳型として使用した。ウリ
ジニル化BR96ΔCDR 1 VH 鋳型を、CDR3 Ala101 突然変
異をコードするオリゴヌクレオチドで突然変異誘発し、
VHのCDR3中にAla101突然変異を含むクローンを単離し
た。ウリジニル化鋳型を調製し、そして上記のようにし
てBR96 H1P及びBR96 H1Mコドンをベースとするオリゴヌ
クレオチドを使用してコドンをベースとするライブラリ
ーをH鎖CDR1中に構築した。このライブラリーを前記の
ようにしてLeY -HRPを用いるリフトアッセイによりスク
リーニングし、一つのクローンであるM4を抗原に対しBR
96 M1 よりも高いアフィニティーを潜在的に有するもの
として同定した。クローンのDNA 配列決定はCDR1中の3
アミノ酸変化を明らかにし、これらを以下に記載する。 VH CDR1 アミノ酸位置: 26 27 28 29 30 31 32 BR96 GGA TTC ACT TTC AGT GAC TAT Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr BR96 M4 GGA TTC CCG TTC GCG TCG TAT Gly Phe Pro Phe Ala Ser Tyr
【0082】BR96 M4 Fab をアフィニティークロマトグ
ラフィー(上記の方法を参照のこと)により単離し、EL
ISA により分析して、それがBR96 M1 と比較して増大さ
れたアフィニティーを有するという観察をリフトアッセ
イで確認した。LeY -HSAへの精製BR96 M4 Fab 及び精製
BR96 M1 Fab の結合をタンパク質加水分解により誘導さ
れたキメラBR96 Fabと比較した。結果は、BR96 M4 Fab
がBR96 M1 Fab と比較してLeY -HSAへの結合を約4倍改
良し、そして親BR96 Fabと比較して15倍の改良に近づく
ことを示した(図10)。親BR96 Fab、BR96 M1 Fab 、
及びBR96 M4 Fab のアフィニティーを表面プラズモン共
鳴(BIAコアー、バイオセンサー、ピスキャットアウェ
ー、NJ) により定量化した。実験をE.Wolff ら, (1993,
Cancer Res., 53:2560-2565) により記載されたように
して行ったが、以下のように改良した。LeY -HSAを、約
7300 pg/mm2に相当する7300 RU(屈折単位)がカップリ
ングされるように誘導体化された金属センサーチップに
固定した。次いで夫々の精製Fab を40μl/分の流量でチ
ップに注入し、センサーチップとのFab の相互作用の時
間を38秒に制限した。減衰された表面プラズモン共鳴角
度の変化を表面に結合されたタンパク質の質量の変化の
指標として測定した。タンパク質加水分解により誘導さ
れたキメラBR96 Fabを1.0 μM から9.4 μM の範囲の5
つの濃度で、BR96 M1 Fab を0.8 μM から4.2 μM の範
囲の5つの濃度で、またBR96 M4 Fab を0.4 μM から4.
2 μM の範囲の5つの濃度で分析した。夫々の試料の二
重反復試験を行い、データをバイオセンサー・ソフトウ
ェアー・パッケージで分析した。koff 及びkonをE.Wo
lff ら(1993, Cancer Res., 53:2560-2565) により記載
されたようにして結合曲線の解離部分及び会合部分から
測定し、二つの比をKd とした。
【0083】速度定数及びKd を以下に示す。BR96 M1
のアフィニティーはLeY -HSAに対しタンパク質加水分解
により誘導されたキメラBR96 Fabよりも4.5 倍大きく、
またBR96 M4 はキメラBR96 Fabと較べて14倍改良された
アフィニティーを有していた。Kd 値の差は主としてk
off 速度定数の差により反映された。 Fab koff (秒-1) kond (μM) キメラBR96 Fab (M-1-1) に対する相対値 キメラ 0.17 1.7 x 104 9.9 1.0x BR96 BR96 M1 0.043 2.0 x 104 2.2 4.5x BR96 M4 0.017 2.4 x 104 0.72 14x ELISA 実験及び表面プラズモン共鳴実験は、BR96 M4 が
BR96 M1 よりも高いアフィニティーでLeY に結合するこ
とを実証した。別のELISA をH3396 膜(上記の方法)を
用いて行って腫瘍抗原に関する差異を調べた。抗原とし
てLeY を用いるアッセイの結果と対照的に、BR96 M4 は
BR96 M1 と較べて同じ倍率の増加を示さなかったが、非
常に類似して結合した(図11)。同様の結果をヒト転移
肺腺癌由来細胞系であるH2987(Schreiber, G. ら, 199
2, Cancer Res. 52:3262-3266) からの膜で観察した。
それ故、テトラサッカリドに対するBR96またはその他の
抗Le Y 抗体の結合アフィニティーの改良は腫瘍抗原に対
する増大されたアフィニティーを必ずしも付与しないか
もしれない(図25)。
【0084】実施例2 変異体BR96抗体の哺乳類発現: 変異体BR96、特に、変
異体BR96 M1 及び変異体BR96 M4 、VH 領域配列を哺乳
類発現ベクターに導入した。マウスBR96L鎖のみを産生
するハイブリドーマHB10036 を産生するBR96の変異体
に、エレクトロポレーションによりH鎖ベクターを移入
し、全抗体を産生する細胞をクローン化した。細胞を96
ウェル組織培養プレートに塗布し、ベクターを含む細胞
のみが生存するように選択培地に入れた。培養上澄みを
免疫グロブリンの存在につき2−3週間後に分析した。
免疫グロブリンを分泌する細胞を軟寒天クローニング(C
asino, P., Baumal, R., Laskov, R.,及びSharff, M.
D., “マウスミエローマ細胞のクローニング及び稀少変
異体の検出" J.Cell.Physio. (1972) 79:429-444) によ
りクローン化し、そして抗体を産生するクローンを単離
した。培養物を1−4リットルの容積中で増殖させ、抗
体をプロテインAクロマトグラフィーにより上澄みから
単離した。変異体BR96 IgG抗体を培養上澄みから単離
し、表面プラズモン共鳴実験によるアフィニティーの組
織学及び測定に使用した。両方の変異体からのVH 領域
配列を、夫々の変異体の夫々を含む二本鎖ファージベク
ターDNA を使用してPCR により増幅した。夫々の変異体
につき、VH 領域をコードする増幅DNA を、ヒトIgG4(C
oloma, M.J., Hastings, A., Wims, L.A.,Morrison, S.
L.“PCR により生じた可変領域を使用する抗体分子の発
現のための新規なベクター" J.Meth. (1992) 152:89-10
4)の一定領域を含むH鎖ベクターに挿入した。
【0085】精製された変異体BR96 M1 IgG 及び変異体
BR96 M4 IgG を組織化学技術により腫瘍細胞、腫瘍由来
細胞系、及び正常な組織への結合特異性につき分析し
た。H.J.Garrigues ら(原発性ヒトメラノーマの組織部
分中のヒトメラノーマ関連抗原、p97 の検出)により改
良されたペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ(PAP)
技術(L.A.Sternberger, 標識されていない抗体ペルオキ
シダーゼ−抗ペルオキシダーゼ(PAP) 方法; Immunocyto
chemistry, 104-169頁; ニューヨーク: ジョン・ウィリ
ィ・サンズ社, 1979) を使用した。マウスIgG1H鎖及び
マウスカッパー鎖一定領域を含むマウスBR96、並びにヒ
トIgG4及びマウスカッパー鎖一定領域を含むキメラBR96
(ChiBR96)を対照として入れた。追加の対照は精製抗体
の希釈剤として使用した培地を含んでいた。実験の結果
を表2(変異体BR96抗体の組織学)に示す。変異体抗
体、即ち、変異体BR96 M1 及び変異体BR96 M4 は腫瘍組
織に対し同様の特異性、並びにBR96のマウス形態及びキ
メラ形態の両方で観察されたのと同様の正常な結腸、膵
臓、胃及び食道組織への結合を有していた。変異体抗体
は正常な肝臓及び心臓組織に結合せず、また結合は脾臓
及び腎臓につき対照で観察されたのよりもほんのわずか
に大きかった。それ故、BR96 CDR領域の可変配列中の突
然変異の導入は腫瘍特異性に悪影響せず、また正常な組
織への結合を著しく増大しなかった。
【0086】
【表4】 表2 変異体BR96抗体の組織学 培地 抗体1 mu BR96 chi BR96 chi M1 chi M4単独 組織 癌 卵巣 4+ 4+ 4+ 4+ - 肺 4+ 4+ 4+ 4+ - 乳 4+ 4+ 4+ 4+ - 結腸 4+ 4+ 4+ 4+ ± 正常な組織 結腸 - - - - ± 膵臓 3 3+ 3+ 3+ ± 胃 3 3+ 3+ 3+ ± 食道 2+ 2+ 2+ 1+ - 脾臓 ± ± ± ± - 肝臓 - - - - - 腎臓 - - - - - 心臓 - - - - - 細胞系 H3719 - - - - - M1 4+ 4+ 4+ 4+ - 1 マウスBR96のH鎖一定領域はマウスIgG1である。chi
BR96、M1及びM4のH鎖一定領域はヒトIgG4である。全て
の抗体はマウスカッパーL鎖一定領域を有する。
【0087】全抗体分子中の突然変異の導入は抗体の機
能性アフィニティー(結合活性)に影響した。変異体BR
96 M1 及びM4抗体を表面プラズモン共鳴(BIAコアー、フ
ァーマシア)により分析してLeY -HSAへのそれらの結合
速度定数を測定した。データ及び計算KD を表3に示
す。変異体BR96 M1 抗体はLeY -HSAに対しBR96抗体より
も8倍大きい機能性アフィニティーを有し、またM4はBR
96と較べてほぼ50倍大きい機能性アフィニティーを有す
る。
【0088】
【表5】 表3変異体BR96 M1 抗体及びM4抗体の結合速度定数及び計算KD のBIA コアー測定onoff D (M-1-1) (S-1) ) (M) chiBR961 2.9x104 60x10-4 210x10-9 M1 1.8x104 3.0x10-4 16x10-9 M4 2.4x104 0.96x10-4 4x10-9 1 chi BR96 はヒトIgG1H鎖一定領域及びヒトカッパーL
鎖一定領域を有する。M1及びM4はヒトIgG4H鎖一定領域
及びマウスカッパーL鎖一定領域を有する。
【0089】実施例3 変異体BR96配列を有するSFv 分子 M1突然変異、即ち、BR96のH鎖のCDR3中の位置101 にお
けるアラニンへのアスパラギン酸の変化を一本鎖Fv (sF
v)及びsFv-PE40融合タンパク質構築物に導入した。更に
また、変異体BR96 M1 sFv 分子をM13 ベクター中で構築
した。 変異体BR96 sFvの発現 変異体BR96 M1 を、構築されたpBR96sFv/T7 と称される
BR96 sFv遺伝子融合ベクターに導入した(図17)。BR96
sFv 分子は、(gly4ser)3ペプチドリンカー(Huston, J.
S. ら, 1988, 抗体結合部位のタンパク質エンジニアリ
ング:エシェリキア・コリ中で産生された抗ジギトキシ
ン一本鎖Fv類縁体における特定の活性の回復; Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883; Chaudhary, V.K.ら,
1989, シュードモナスエキソトキシンに融合された二つ
の抗体可変ドメインからなる組換え免疫毒素, Nature
(ロンドン)339:394-397)によりBR96のVL 領域に共有
結合されたBR96のVH 領域からなる。(gly4ser)3ペプチ
ドリンカーは適当なリンカーの単に一つの例である。短
いリンカーの全範囲がVL + VH (FV )(Huston, J.S.,L
evinson, D., Mudgett-Hunter, M., Tai, M.S., Novotn
y, J., Margolies, M.N., Ridge, R.J., Bruccoleri,
R.E., Haber, E., Crea, R., Oppermann, H. (1988) 抗
体結合部位のタンパク質エンジニアリング:エシェリキ
ア・コリ中で産生された抗ジギトキシン一本鎖Fv類縁体
における特定の活性の回復; Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A.85:5879-5883; Pluckthun, 1991) の免疫グロブリン
鎖を結合するのに使用し得る。
【0090】変異体BR96 M1 sFv (本明細書中、変異体
BR96 M1(D:A-101)と称される)を、BR96と相同の配列に
より3'末端及び5'末端の両方に隣接した突然変異を含む
オリゴヌクレオチドを設計することによりつくった。こ
のオリゴヌクレオチドを使用するPCR 増幅、続いて最大
のストリンジェンシーで変異体オリゴヌクレオチドにハ
イブリッドを形成したプラスミドとのクローンを選択す
るためのハイブリダイゼーション実験は、M1突然変異を
含むプラスミドの単離を生じた。BR96 sFv (D:A-101)プ
ラスミドの配列をヌクレオチド配列決定により確認し
た。発現されたBR96 sFv及び変異体BR96 sFv (D:A-101)
を、バクテリア内で形成された封入体から単離した。封
入体を単離し、変性し、タンパク質を再度折り畳み、P.
N.Friedmanら(1993, BR96 sFv-PE40, 癌細胞を選択的に
死滅させる強力な一本鎖免疫毒素; Cancer Res. 53:334
-339) により記載されたようにして精製した。精製さ
れ、再度折り畳まれたsFv 分子をELISA によりLeY -HSA
及び腫瘍細胞膜への結合につき分析した(図18及び1
9)。BR96IgG 及びBR96タンパク質加水分解誘導Fab を
アッセイに入れ、そしてL6 IgGを陰性対照として入れ
た。同様のデータが、BR96 sFv-Pe40 及び変異体M1 sFv
-PE40 融合タンパク質を用いる表面プラズモン共鳴実験
から得られた。BR96 sFv-Pe40 ベクターの構築及びその
発現がP.Friedmanら(1993) BR96 sFv-Pe40, 癌細胞を選
択的に死滅させる強力な一本鎖免疫毒素; Cancer Res.
53:334-339) により記載されている。asp-->ala 101 突
然変異を、変異体BR96 sFv (D:A-101)につき記載された
ようにしてPCR により導入した。
【0091】変異体BR96 sFvの発現 BR96 sFv配列及び変異体M1 sFv配列(夫々、(gly4ser)3
ペプチドリンカーによりBR96のVL 領域に共有結合され
たBR96及びM1のVH 領域)をM13 ベクターに導入した。
sFv 分子を5' (VH ) 末端でバクテリアリーダーペプチ
ド、pel B に結合し、その結果、そのポリペプチドをバ
クテリアの細胞周辺腔に送った(図17)。sFv 分子をバ
クテリアの細胞周辺腔から単離した。sFv をFab 分子に
つき前記されたようにして周辺質から単離し、こうして
変性及び再度の折り畳みが上記の封入体中のSfv 分子に
つき必要とされなかった。LeY -HSAへの周辺質製剤中の
BR96及び変異体BR96 M1 Sfv の結合をELISA により比較
し、結果を図20に示す。周辺質フラクションからのFab
分子で観察されたのと同じ倍率の差、4−5倍が、一本
鎖分子で観察された。
【0092】BR96 SFV発現プラスミドの構築E.coli 中のBR96 sFvの産生に使用された発現プラスミド
はバクテリオファージT7 RNA ポリメラーゼプロモータ
ー(Studier及びMoffat, 1986) を使用する。可撓性(Gly
4Ser)3ペプチドリンカー(Huston ら, 1988; Chaudhary
ら, 1989) をコードするオリゴヌクレオチド二重鎖を結
合することに適合性の制限部位を生じるために、PCR を
使用してBR96 V領域の両方の5'末端及び3'末端を修飾し
た。5'VH PCR プライマー(5'-GCTAGACATATGGAAGTGAATC
TGCTGGAGTCTGGGGGA-3') を、ATG 翻訳開始コドン(ボー
ルド)及びVH 遺伝子の最初の9つのコドンを含む特異
なNde 1 制限部位(下線を施した)をコードするように
設計した。対照的に、3'VH PCR プライマー(5'-GCTAGA
GGATCCTACAGAGACCGTGACCAGAGTCCCTTG-3') はJ領域相補
性を有する9のCOOH末端コドン及び3'BamH1 部位(下線
を施した)をコードした。5'VL PCR プライマー(5'-TA
CACAAAGCTTGATGTTTTGATGACCCAAATTCCAGTC-3') は成熟V
L 遺伝子の最初の9のコドン及び5'HindIII 部位(下線
を施した)をコードした。
【0093】アニーリング後に、15アミノ酸リンカーを
コードする二重鎖51-merオリゴヌクレオチド(5'-GATCCG
GAGGTGGAGGTTCTGGTGGAGGTGGATCTGGAGGTGGAGGTTCTA-3'及
び5'-AGCTTAGAACCTCCACCTCCAGATCCACCTCCACCAGAACCTCCA
CCTCCG-3')を特異なBamH 1(VH の3'末端)部位とHind
III(VL の5'末端)部位の間でつないだ。通常の操作を
使用して、その後、連結反応混合物を5'VH プライマー
及び3'VL プライマーで増幅し、Nde 1 及びEcoR 1で消
化し、Nde 1 及びEcoR 1で消化されたpMS8(+)(Sambrook
ら, 1989) にクローン化した。得られる発現プラスミ
ド、即ち、BR96 sFv遺伝子融合をコードするpBR96sFv/T
7(図17) をDNA 配列分析により確認した。pBR96sFv-T7
発現プラスミドを、両方のBR96 V領域遺伝子の5'及び3'
EcoRI 末端を変えるPCR プライマーを設計することによ
り構築した。増幅に続いて、BR96VH をNdeI-BamHIフラ
グメントに入れ、一方、BR96VL をインフレーム翻訳終
止コドンを含むHindIII-EcoRI フラグメントに入れた。
これらのPCR 産物を、可撓性ポリペプチドリンカーをコ
ードする二重鎖オリゴヌクレオチドとつなぎ、そして連
結反応のアリコートを示されるようにPCR に使用した。
約760 bpの遺伝子融合を含む得られるPCR 産物をNde-Ec
oRI フラグメントとしてサブクローン化した。15アミノ
酸可撓性ポリペプチドリンカー((Gly4Ser)3)をコードす
る二重鎖オリゴヌクレオチドでつながれた、BR96H鎖(1
19アミノ酸) 及びL鎖(114アミノ酸) のVドメインから
なる発現ベクターであるpBR96sFv/T7 をE.coli中のBR96
sFvの発現のために構築した。Nde I(N)部位、Bam HI
(B) 部位、HindIII(H)部位及びEcoRI(E)部位、転写終結
配列(Term)、複製開始点(ori) 及びβ−ラクタマーゼ遺
伝子(AmpR)の相対位置を示す。
【0094】BR96 SFVタンパク質の発現及び精製 BL21(λDE3)細胞(Studier&Moffat, 1986) を、37℃で
100 μg/mlのアンピシリンを含む“テリフィック−ブロ
ース”培地(ギブコ-BRL、ガイザースブルグ、MD) 中で
増殖された発現プラスミドpBR96sFv-T7 で形質転換し、
そして対数期において2.0 のOD650 で1mMのIPTGで誘導
した。細胞を2時間後に回収した。分析のために、試料
1mlを遠心分離により回収し、冷H2O 中で10分間にわた
って浸透圧衝撃を与えた。細胞を再度遠心分離し、細胞
ペレットを10mMのトリス-HCl、pH7.4/10%のグリセロー
ル中で再度懸濁させた。約108 のスフェロプラストから
調製されたアリコートをSDS-PAGEにかけ、染色し(Laemm
li, 1970) 、または抗イディオタイプ757-4-1 mAb を使
用してイムノブロットにかけた。10L 醗酵から調製され
たバルクバクテリア細胞ペレットを上記のようにして処
理し、封入体を前記(Friedman ら, 1993) のようにして
単離した。次いで、徹底的に洗浄された封入体を、100
mMのトリス、pH7.4-0.4 M のL-アルギニン-4mMの酸化グ
ルタチオン(シグマ)中に希釈された7Mのグアニジン-H
Cl、pH7.4 (シグマ)中で4℃で100 μg/mlを越えない
最終濃度まで変性し、そして20mMのトリス-HCl(pH7.4)
に対し徹底的に透析した。一夜の透析後に、再度折り畳
まれたタンパク質を前記(Friedman ら, 1993) のように
陰イオン交換(Q−セファロース、ファーマシア)及び
ゲル濾過クロマトグラフィー(TSK-3000 、トーソハース
社)により精製した。BR96 sFvタンパク質を溜め、ブラ
ッドフォードアッセイ(Bradford, 1976) を使用して定
量化した。
【0095】プラスミド構築、タンパク質発現及び精製 BR96 sFv遺伝子融合を構築するためのクローニング戦略
及びBR96 sFvの構造を図17に示す。プラスミドpBR96sFv
/T7 はT7RNA ポリメラーゼ転写プロモーターを使用し、
BR96H鎖の119 アミノ酸、(Gly4Ser)3を含む15アミノ酸
ポリペプチドリンカー及びBR96L鎖の114 アミノ酸をコ
ードする。pBR96sFv/T7 をE.coli株BL21(λDE3)に形質
転換し、IPTGによる誘導後に、組換えタンパク質が主と
して封入体に局在化されることがわかった。発現された
sFv が不溶性凝集物として蓄積するので、変性及び再度
の折り畳みが活性タンパク質の精製に必要とされる。BR
96 sFvを含む封入体を変性し、そして物質及び方法に記
載されたようにして復元した。精製をQ−セファロース
陰イオン交換カラム及びTSK-3000ゲル濾過カラムによる
連続のクロマトグラフィーにより行った。活性タンパク
質を含む画分を溜め、約20倍に濃縮し、-20 ℃における
貯蔵のためにアリコートにした。回収されたBR96 sFvタ
ンパク質は銀染色ゲル分析により90%以上均一であると
推定され、これを結合及び内在化の研究に使用した。ア
ミノ末端アミノ酸配列分析は、BR96 sFvに関して予想さ
れた最初の25アミノ酸を確認した。
【0096】実施例4 IXSYS(商標) M13 ベクター中の一本鎖FV BR96 及び変異
体BR96 M1 の構築 クローニング方法の説明 BR96及び変異体BR96 M1 scFvs をコードするM13 ベクタ
ーを、ポリペプチド配列: pel B リーダー-VH-(Gly4Se
r)3リンカー-VL-デカペプチドを産生するように設計し
た。バクテリアアルカリ性ホスファターゼリーダーペプ
チドをコードする配列中を続くBR96VL -Ck 遺伝子で開
始する配列のM13IXBR96 鋳型及びM13IXBR96 M1鋳型を最
初に欠失することによりscFvs を構築した。このベクタ
ーを再度結合すると、BR96H鎖配列のアミノ末端をバク
テリアペクテートリアーゼ(pel B)リーダーペプチドの
カルボキシ末端に隣接させ、全BR96L鎖を欠失する。次
いでPCR を使用してpel B リーダーペプチド配列を含む
正プライマー及びM13 ベクター中に含まれたデカペプチ
ド配列に相補性のヌクレオチド配列に加えて(Gly4Ser)3
リンカー配列を含む逆プライマーでファージM13IXBR96
及びM13IXBR96 M1からBR96及び変異体BR96 M1 VH 配列
を増幅する。PCR 増幅されたBR96産物及び変異体BR96 M
1 VH 産物を使用してハイブリダイゼーション突然変異
誘発によりL鎖欠失M13 ベクター中に存在する内生のBR
96遺伝子及び変異体BR96 M1 VH 遺伝子を置換する。次
いでPCR を使用してカルボキシ末端BR96 M1 VH ヌクレ
オチド配列を含む正プライマー及びM13 ベクター中に含
まれたデカペプチド配列に相補性の配列を含む逆プライ
マーでプラスミドpSE1.0Ala101 (図21) から(Gly4Ser)3
リンカー-BR96 VL 配列を増幅する。PCR 増幅された(G
ly4Ser)3リンカー BR96 VL 配列の導入がscFvs の構築
を完結する。
【0097】方法 全てのオリゴヌクレオチドをアプライド・バイオシステ
ムズ394 DNA シンセサイザーによるβ−シアノエチルホ
スホルアミジト化学により合成し、オリゴヌクレオチド
精製カートリッジ(アプライド・バイオシステムズ、フ
ォスターシティ、CA)を使用して精製した。オリゴヌク
レオチド961 (5'-CAGATTCACTTCGGCCATGGCCACAGGG-3')を
使用して、夫々クローンM13IXBR96 及びM13IXBR96 M1中
のアルカリ性ホスファターゼリーダーペプチドとBR96配
列及び変異体BR96 M1 配列の間の接合部で部位誘導突然
変異誘発によりNcol部位(下線を施した)を導入した。
Ncol部位を含むM13IXBR96 クローン及びM13IXBR96 M1ク
ローンをNcolエンドヌクレアーゼによる制限消化により
同定した。夫々の突然変異誘発製剤からの3種のクロー
ンを溜め、Ncolで消化した。消化産物をトリス−酢酸塩
緩衝液で緩衝された0.8 %の低融解温度のアガロースゲ
ルで電気泳動にかけた。アルカリ性ホスファターゼリー
ダーペプチド配列中に欠失BR96L鎖を含む2種の得られ
る制限フラグメントのうちの大きい方をゲルから切除
し、そのDNA フラグメントを精製した。精製DNA 50ngを
自己連結し、上記のようにしてE.coli株DH10B にエレク
トロポレーションした。
【0098】レプリカフィルターリフトを調製し(Huse
ら, 1992) 、一つのフィルターをアルカリ性ホスファタ
ーゼに接合されたヤギ抗ヒトカッパー抗体で探査し、ま
た第二フィルターをBR96VH を認識する抗イディオタイ
プ抗体757-4-1 で探査した。4種のM13IXBR96 ΔVL
ローン及びカッパー鎖反応性の損失を示すがH鎖反応性
の存在を示す4種のM13IXBR96 M1ΔVL クローンを溜
め、そしてハイブリダイゼーション突然変異誘発により
PCR 増幅(Gly4Ser)3リンカー-BR96 VL 配列の導入のた
めのウリジニル化一本鎖鋳型を調製するのに使用した。
最後の突然変異誘発工程はH鎖CH1 を欠失する。オリゴ
ヌクレオチド977 (5'-GGGACTCTGGTCACGGTCTCT TCA GGAT
CCGGA-3') は、5'末端でBR96VH 配列を有し、そして3'
末端で(Gly4Ser)3リンカー配列を有する正PCR プライマ
ーである。BR96VH 中のカルボキシ末端Leu(CTG)を、下
線を施された配列により示されるようにSer(TCA)で置換
した。構築されたscFv BR96 分子はこの位置でLeu では
なくSer を有し、またLeu がどのようにしてscFvの機能
活性に影響するのかが知られていなかったので、これを
行った。オリゴヌクレオチド911 (5'-TGGGTAGGATCCACTA
GTGCGTTTGATCTCCAGCTTGG-3')は3'末端で相補性BR96VL
配列を有し、そして5'末端でデカペプチド配列を有する
逆PCR プライマーである。プラスミドpSE 1.0Ala101 を
制限エンドヌクレアーゼXholで直線状にし、そして2 n
g/μl の濃度で再度懸濁させた。10ngのpSE 1.0Ala101
を、プライマー977 及び911 を使用して(Gly4Ser)3リン
カー-BR96 VL 配列を増幅するのに使用した。PCR 増幅
DNA をポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製し、
続いてハイブリダイゼーション突然変異誘発によりM13I
XBR96 M1ΔVL 鋳型及びM13IXBR96 ΔVL 鋳型に導入し
た。得られるM13IXBR96 クローン及びM13IXBR96 M1 scF
v クローンをH3396 腫瘍細胞への結合につきスクリーニ
ングし、そして腫瘍反応性クローンを同定し、プラーク
精製し、そして正確なDNA 配列をDNA 配列分析により確
認した(図20)。
【0099】実施例5一本鎖BR96及び変異体BR96 sFv-PE40 免疫毒素の調製 この実施例は、一本鎖免疫毒素、BR96と、PE40に結合さ
れたBR96及び本発明の変異体BR96モノクローナル抗体の
クローン化されたH鎖Fv部分及びL鎖Fv部分からなる変
異体BR96 sFV-PE40 の調製及びその細胞毒性の特性決定
を記載する(図21)。一本鎖組換え免疫毒素を産生する
ために、BR96 IgGのL鎖及びH鎖のFvドメインを、PCR
増幅を使用してBR96 Fv 配列を含むプラスミドBR96 Fv
から単離した。プラスミドpBR96Fv によりコードされた
BR96 sFv配列で開始して、L鎖中のKpn I 制限部位まで
の合成(Gly4Ser)3ヒンジ領域と連結された可変H鎖及び
可変L鎖に相当する550 bpの配列を使用して特定のプラ
イマー(Friedman ら, 上記文献)でPCR 増幅した。PCR
増幅そしてNde I 及びKpn I による消化後に、550 bpの
Nde I-Kpn I フラグメントをプラスミドpMS8から調製さ
れた4220 bp のNde I-Kpn I ベクターフラグメントにつ
ないだ。このプラスミドはT7プロモーターの転写調節の
もとにPE40の遺伝子をコードする[Studier ら, J.Mol.
Biol. 189:113-130 (1986); Debinskiら, モノクローナ
ル抗体C242- シュードモナス外毒素A:抗腫瘍活性を有
する特異性かつ強力な免疫毒素, J.Clin.Invest., 90:4
05-411, 1992) ]。この連結反応の生成物は、pBW 7.01
と称される中間体ベクターであった。続いて、変異体pB
R96 Fvからの227 bpのKpn I フラグメントをpBW 7.01の
特異なKpnI 部位にサブクローン化した。BR96 sFv-PE40
遺伝子融合をコードする得られるプラスミドpBW 7.0
をDNA 配列分析により確認した。変異体BR96を含む類似
プラスミドの生産のために、制限フラグメントまたは合
成オリゴを使用して変異体配列をプラスミドpBW 7.0 に
挿入した。
【0100】BR96及び変異体BR96 sFv-PE40 の発現及び精製 BR96及びBR96 sFv-PE40 をコードするプラスミドを、1
ml当たり75μg のアンピシリンを含むスーパーブロース
(ジジーン社、シルバー・スプリングス、MD)中で37℃
で培養された別々に形質転換されたE.coli BL21(λDE3)
細胞であった。650 nmにおける吸光度が1.0 に達した
時、イソプロピル1−チオール−B−D−ガラクトピラ
ノシド(IPTG)を1mMの最終濃度まで添加し、細胞を90分
後に回収した。IPTGによる誘導後に、そのプラスミドで
形質転換されたE.coli細胞は、封入体に局在化された多
量の融合タンパク質を発現した。バクテリアを蔗糖緩衝
液(20%の蔗糖、30mMのトリス-HCl (pH7.4)、1mMのED
TA)中で洗浄し、氷冷H2O 中で浸透圧衝撃を与えて周辺
質を単離した。続いて、封入体をタージトール(シグ
マ)による徹底的な処理によりスフェロプラスト膜タン
パク質から分離して過剰のバクテリアタンパク質を除去
し、続いて7Mのグアニジン-HCl (pH7.4)中で変性し、0.
4MのL-アルギニンを補給したPBS中で再度折り畳み、そ
して0.02M のトリス、pH7.4 に対し徹底的に透析した。
Q−セファロースカラムによる陰イオン交換を使用して
タンパク質を精製し、次いで変異体BR96 sFv-PE40 を含
む画分を溜め、そしてSiegall ら, Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 85:9738-9742 (1988)により記載されたようにし
てファーマシア高速タンパク質液体クロマトグラフィー
(FLPC)系によるゲル濾過(TSK-3000カラムによる)クロ
マトグラフィーにより分離した。直接ルイスY決定基結合ELISA BR96 sFv-PE40 と較べて変異体BR96 sFv-PE40 の相対結
合活性を試験するために、直接結合アッセイを行い、こ
の場合、H3396 腫瘍細胞膜をELISA プレートに被覆し、
変異体BR96 sFv-PE40 分子の結合がそのBR96カウンター
パートに対し改良されることが示された(図22)。
【0101】実施例6変異体BR96 M14の調製:付加的なCDR から単離された突
然変異の組み合わせ H2ライブラリーの約32,000プラークをフィルターリフト
によりスクリーニングした。sLeyに反応する91のクロー
ンを選択し、ELISA において腫瘍細胞への結合につき二
次スクリーンにかけた。クローンM2はBR96に較べて腫瘍
細胞膜への約4−5倍良好な結合を有していた(図12及
び14)。また、M2反応性はsLey-HSAにつき改良された
が、わずかに2倍であった(図15)。抗原に対する改良
された結合はH2の位置53におけるグリシンからアスパラ
ギン酸の置換(GGTからGAT へ)のためであった(図
4)。再度、この突然変異は、それをBR96配列に再度導
入することにより実証された改良された結合を与えるの
に必要かつ充分であった。突然変異の組み合わせが更な
る結合の改良に寄与するか否かを測定するために、二重
変異体、即ち、M3(表1)を、H2突然変異をコードする
オリゴヌクレオチドによるM1鋳型の部位誘導突然変異誘
発(Kunkelら, 上記文献)により構築した。図14は、二
重変異体がいずれかの突然変異単独よりもH3396 膜にか
なり良好に結合したことを示す。M3結合はM2に較べて約
7倍改良し、またM1よりも4倍改良し、またBR96親より
も約30倍良好であった。sLeyを抗原として使用した場合
の差はそれ程顕著ではなく、この場合、二重変異体はM1
変異体と較べて結合を更に2倍改良してBR96と比較して
10倍の増加を得た。
【0102】M4中で同定された一つの突然変異、即ち、
CDR1 (M12 変異体)中の残基28におけるThr からPro へ
の突然変異をM3にとり込んでH1、H2、及びH3中で突然変
異を生じることを、オリゴ5'-GCG AAC CCA ATA CAT GTA
ATA GTC ACT GAA CGG GAA TCC AGA GGT TAC ACA GGA-
3' を使用して部位誘導突然変異誘発により行った。ク
ローンを単離し、そして突然変異(Pro=CCG) の導入を配
列決定により確認した。Fab M12 + M2 + M1 (M14変異
体) の結合活性は二重突然変異M3よりも更に2倍改良し
(図27-28)、BR96 Fabよりも60倍大きかった。図29は、
BR96 M14 Fabの結合が(1) BR96 M12 Fab(即ち、アミノ
酸位置28においてスレオニンからプロリンへの単一突然
変異を有する)、(2) BR96 M6 Fab (即ち、アミノ酸位
置28(M12と同じ)及び97 (Asp -> Ala) における突然変
異を有する)、(3) BR96 M3 Fab 、及び(4) キメラBR96
Fabに対し改良されたことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、BR96の可変H鎖及びL鎖のDNA
及びアミノ酸配列を示したものである。
【図2】図2は、BR96の可変H鎖及びL鎖のDNA
及びアミノ酸配列を示したものである。
【図3】図3は、異性体BR96M1の可変H鎖のDN
A及びアミノ酸配列を示したものである。
【図4】図4は、異性体BR96M2の可変H鎖のDN
A及びアミノ酸配列を示したものである。
【図5】図5は、異性体BR96M4の可変H鎖のDN
A及びアミノ酸配列を示したものである。
【図6】図6は、異性体BR96H2+H3の可変H鎖
のDNA及びアミノ酸配列を示したものである。
【図7】図7は、CDR異性体を使用したオリゴヌクレ
オチドの合成スキームを図式的に示したものである(Gl
aser, S.M.ら。1992, J. Immunol. 149:3903-3913 参
照) 。
【図8】図8は、ELISAアッセイの結果を線グラフ
で表したものである。異性体BR96M1Fabは、C
hiBR96Fabに比べてより強い親和性で、H33
96膜に結合する。
【図9】図9は、ELISAアッセイの結果を線グラフ
で表したものである。異性体BR96M1Fabは、C
hiBR96Fabに比べてより強い親和性で、LeY
−HSAに結合する。
【図10】図10は、ELISAアッセイの結果を線グ
ラフで表したものである。異性体BR96M1Fab及
び異性体BR96M4Fabは、ChiBR96Fab
に比べてより強い親和性で、LeY −HSAに結合す
る。
【図11】図11は、異性体BR96M4Fab及び異
性体BR96M1Fabの、H3396膜に対するCh
iBR96Fabに比べて向上した親和性を、線グラフ
で表したものである。
【図12】図12は、異性体BR96M2Fabの、H
3396ガン細胞膜に対するChiBR96Fabに比
べて向上した親和性を、線グラフで表したものである。
【図13】図13は、H鎖(BR96M4Fab)のC
DR1及びCDR3の突然変異を有する変異体が、ター
ゲット抗原(LeY −HSA)に対してCDR1(BR
96H1(ここではM5とも表されている)Fab)も
しくはCDR3(BR96M1Fab)単独よりも、又
はChiBR96Fabの突然変異を有する変異体より
も向上した親和性を示すことを、線グラフで表したもの
である。
【図14】図14は、H鎖(BR96M3Fab)のC
DR2及びCDR3の突然変異を有する変異体が、ター
ゲット抗原(H3396膜上の)に対してCDR2(B
R96M2Fab)もしくはCDR3(BR96M1F
ab)単独よりも、又はChiBR96Fabの突然変
異を有する変異体よりも向上した親和性を示すことを、
線グラフで表したものである。
【図15】図15は、H鎖(BR96M3Fab)のC
DR2及びCDR3の突然変異を有する変異体が、ター
ゲット抗原(LeY −HSA)に対してCDR2(BR
96M2Fab)もしくはCDR3(BR96M1Fa
b)単独よりも、又はChiBR96Fabの突然変異
を有する変異体よりも向上した親和性を示すことを、線
グラフで表したものである。
【図16】図16は、親BR96をFab分子としてコ
ードするpIXBR96プラスミドの図式的に表したも
のである。
【図17】図17は、pBR96sFv発現プラスミド
の構築スキームを図式的に表したものである。
【図18】図18は、異性体BR96sFv(M1)
(図17のプラスミドからバクテリア中で生産された再
生物質を表す)のLeY −HSAに対する結合を線グラ
フで表したものである。
【図19】図19は、実施例3に記載された、異性体B
R96sFv(M1)(図17のプラスミドからバクテ
リア中で生産された再生物質を表す)のH3396ガン
細胞膜に対する結合を線グラフで表したものである。
【図20】図20は、異性体BR96sFv(ペリプラ
スムからM−13感染バクテリア中でシグナルペプチド
と共に生産されたもので、再生物質ではない)のLeY
−HSAに対する結合を線グラフで表したものである。
【図21】図21は、BR96sFv−PE40(E,
Eco RI;H,Hind IIIl;K,Kpn
i;N,NDe I;S,Sal I;(Gly4 Se
r) 3 は15のアミノ酸結合基を表している)をコード
する発現プラスミドpBW7.0の構築スキームを図式的
に表したものである。
【図22】図22は、ELISAアッセイの結果を線グ
ラフで表したものである。図21のプラスミドにより発
現されたBR96M1sFv−PE40は、BR96s
Fv−PE40に比べて向上した親和性をもって、H3
396膜に結合する。
【図23】図23は、M1のようなBR96異性体の可
変及び一定領域のH鎖をコードすうpAHg4H33
6.1プラスミド(10.9kb)を図式的に表したもの
である。このプラスミドは、哺乳類細胞における全抗体
を作製するのに使用されたものである。
【図24】図24は、異性体ライブラリーを構築するた
めに親BR96鋳型に対して、どのように合成コドンベ
ースのオリゴマーをアニールするかを示した一重鎖M1
3プラスミドのスキームを図式的に表したものである。
【図25】図25は、8脂肪族炭素のスペーサー及びヒ
ドラジド官能基へ結合した、合成テトラサッカライドL
Y の構造を示したものである。
【図26】図26は、異性体BR96M12+M2+M
1(M14)のH鎖の可変領域のDNA及びアミノ酸配
列を示したものである。
【図27】図27は、M14Fab、M3Fab、M2
Fab及びBR96FbのH3396膜への結合を線グ
ラフで表したものである。
【図28】図28は、M14Fab、M3Fab、M2
Fab及びBR96FbのLeY−HSAへの結合を線
グラフで表したものである。
【図29】図29は、BR96M14Fab、BR96
M12Fab、BR96M6Fab、BR96M3Fa
b及びBR96FbのLeY −HSAへの結合を線グラ
フで表したものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C07K 16/32 8517−4H C12P 21/08 G01N 33/574 D 33/577 B // A61K 35/12 35/74 Z (C12P 21/08 C12R 1:19) (72)発明者 スコット グレイザー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92116 サン ディエゴ ニュー ハンプ シャー ストリート 4548 (72)発明者 ウィリアム ヒューズ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92014 デル マー ザポ ストリート 1993 (72)発明者 メイ ジョアーン ロゾク アメリカ合衆国 ワシントン州 98155 シアトル ノースイースト ワンハンドレ ッドアンドナインティフォース ストリー ト 6340

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 表1のカバット95位のアミノ酸で開
    始し、カバット100a位のアミノ酸で終止するGly
    Leu Xaa Asp Gly AlaTrpの配
    列を含むCDRを含有するアミノ酸配列を有する変異体
    BR96ポリペプチド。
  2. 【請求項2】 Xaaが、アラニン、アルギニン、セ
    リン、グリシン、チロシン、バリンからなる群から選択
    されるアミノ酸である請求項1記載の変異体BR96ポ
    リペプチド。
  3. 【請求項3】 図5の26位のアミノ酸で開始し、3
    3位のアミノ酸で終止するGly Phe Pro P
    he Ala Ser Tyr Tyrの配列を含むC
    DRをさらに含有する請求項1記載の変異体BR96ポ
    リペプチド。
  4. 【請求項4】 図6の52位のアミノ酸で開始し、5
    9位のアミノ酸で終止するSer Gln Asp G
    ly Asp Ile Thr Aspの配列を含むC
    DRをさらに含有する請求項1記載の変異体BR96ポ
    リペプチド。
  5. 【請求項5】 図26の26位のアミノ酸で開始し、
    33位のアミノ酸で終止するGly Phe Pro
    Phe Ser Asp Tyr Tyrの配列を含む
    CDR及び図26の52位のアミノ酸で開始し、59位
    のアミノ酸で終止するSer Gln Asp Gly
    Asp Ile Thr Aspの配列を含むCDR
    をさらに含有する請求項1記載の変異体BR96ポリペ
    プチド。
  6. 【請求項6】 表1のカバット95位のアミノ酸で開
    始し、カバット100a位のアミノ酸で終止するGly
    Leu Xaa Asp Gly AlaTrpの配
    列を含むH鎖可変領域を含有する変異体BR96ポリペ
    プチド。
  7. 【請求項7】 Xaaが、アラニン、アルギニン、セ
    リン、グリシン、チロシン、バリンからなる群から選択
    されるアミノ酸である請求項6記載の変異体BR96ポ
    リペプチド。
  8. 【請求項8】 図5の26位のアミノ酸で開始し、3
    3位のアミノ酸で終止するGly Phe Pro P
    he Ala Ser Tyr Tyrの配列を含むH
    鎖可変領域をさらに含有する請求項6記載の変異体BR
    96ポリペプチド。
  9. 【請求項9】 図6の52位のアミノ酸で開始し、5
    9位のアミノ酸で終止するSer Gln Asp G
    ly Asp Ile Thr Aspの配列を含むH
    鎖可変領域をさらに含有する請求項6記載の変異体BR
    96ポリペプチド。
  10. 【請求項10】 表1の26位のアミノ酸で開始し、
    33位のアミノ酸で終止するGly Phe Pro
    Phe Ala Ser Asp TyrTyrの配列
    及び図26の52位のアミノ酸で開始し、59位のアミ
    ノ酸で終止するSer Gln Asp Gly As
    p Ile Thr Aspの配列を含むH鎖可変領域
    をさらに含有する請求項6記載の変異体BR96ポリペ
    プチド。
  11. 【請求項11】 CDR1が、図1のGly Phe
    Thr PheSer Asp Tyr Tyr M
    et Tyrの配列を有し、CDR2が、Tyr Il
    e Ser Gln Xaa Gly Asp Ile
    ThrAsp Tyr Pro Asp Thr V
    al Lys Glyの配列を有し、かつCDR3が、
    Gly Leu Ala Asp Gly Ala T
    rpの配列を有する、CDR1、CDR2及びCDR3
    を含有する変異体BR96ポリペプチド。
  12. 【請求項12】 CDR1が、図3のGly Phe
    Thr PheSer Asp Tyr Tyr M
    et Tyrの配列を有し、かつCDR3が、Gly
    Leu Ala Asp Gly Ala Trpの配
    列を有する、CDR1及びCDR3を含有する変異体B
    R96ポリペプチド。
  13. 【請求項13】 CDR2が、図3のTyr Ile
    Ser GlnXaa Gly Asp Ile T
    hr Asp Tyr Pro AspThr Val
    Lys Glyの配列を有し、かつCDR3が、Gl
    y Leu Ala Asp Gly Ala Trp
    の配列を有する、CDR2及びCDR3を含有する変異
    体BR96ポリペプチド。
  14. 【請求項14】 Xaaが、グリシン及びアスパラギ
    ン酸からなる群から選択される、請求項11又は13の
    いずれかに記載の変異体ポリペプチド。
  15. 【請求項15】 図4の50位のアミノ酸で開始し、
    66位のアミノ酸で終止するTyr Ile Ser
    Gln Asp Gly Asp IleThr As
    p Tyr Pro Asp Thr Val Lys
    Glyの配列を含むCDRを含有するアミノ酸配列を
    含む変異体BR96ポリペプチド。
  16. 【請求項16】 図4の50位のアミノ酸で開始し、
    66位のアミノ酸で終止するTyr Ile Ser
    Gln Asp Gly Asp IleThr As
    p Tyr Pro Asp Thr Val Lys
    Glyの配列を含むH鎖可変領域を含有する変異体B
    R96ポリペプチド。
  17. 【請求項17】 CDR1が、図4のGly Phe
    Thr PheSer Asp Tyr Tyr M
    et Tyrの配列を有し、CDR2が、Tyr Il
    e Ser Gln Asp Gly Asp Ile
    ThrAsp Tyr Pro Asp Thr V
    al Lys Glyの配列を有し、かつCDR3が、
    Gly Leu Asp Asp Gly Ala T
    rpの配列を有する、CDR1、CDR2及びCDR3
    を含有する変異体BR96ポリペプチド。
  18. 【請求項18】 CDR2が、図4のTyr Ile
    Ser GlnAsp Gly Asp Ile T
    hr Asp Tyr Pro AspThr Val
    Lys Glyの配列を有し、かつCDR3が、Gl
    y Leu Asp Asp Gly Ala Trp
    の配列を有する、CDR2及びCDR3を含有する変異
    体BR96ポリペプチド。
  19. 【請求項19】 CDR1が、図26のGly Ph
    e Pro PheSer Asp Tyr Tyrの
    配列を有し、CDR2が、Ser GlnAsp Gl
    y Asp Ile Thr Aspの配列を有し、か
    つCDR3が、Gly Leu Ala Asp Gl
    y Ala Trpの配列を有する、CDR1、CDR
    2及びCDR3を含有する変異体BR96ポリペプチ
    ド。
  20. 【請求項20】 CDR1が、図6のGly Phe
    Thr PheSer Asp Tyr Tyrの配
    列を有し、CDR2が、Ser GlnAsp Gly
    Asp Ile Thr Aspの配列を有し、かつ
    CDR3が、Gly Leu Ala Asp Gly
    Ala Trpの配列を有する、CDR1、CDR2
    及びCDR3を含有する変異体BR96ポリペプチド。
  21. 【請求項21】 CDR1が、表1のGly Phe
    Pro PheAla Ser Tyr Tyrの配
    列を有し、CDR2が、Ser GlnGly Gly
    Asp Ile Thr Aspの配列を有し、かつ
    CDR3が、Gly Leu Asp Asp Gly
    Ala Trpの配列を有する、CDR1、CDR2
    及びCDR3を含有する変異体BR96ポリペプチド。
  22. 【請求項22】 CDR1が、図5のGly Phe
    Pro PheAla Ser Tyr Tyrの配
    列を有し、CDR2が、Ser GlnGly Gly
    Asp Ile Thr Aspの配列を有し、かつ
    CDR3が、Gly Leu Ala Asp Gly
    Ala Trpの配列を有する、CDR1、CDR2
    及びCDR3を含有する変異体BR96ポリペプチド。
  23. 【請求項23】 実質的に精製されている請求項1、
    6又は19のいずれかに記載のポリペプチド。
  24. 【請求項24】 請求項1、6又は19のいずれかに
    記載の変異体BR96抗体分子。
  25. 【請求項25】 請求項24記載のモノクローナル抗
    体。
  26. 【請求項26】 請求項25記載のキメラモノクロー
    ナル抗体。
  27. 【請求項27】 請求項1、6又は19のいずれかに
    記載の変異体BR96Fabポリペプチド。
  28. 【請求項28】 請求項1、6又は19のいずれかに
    記載のポリペプチドを含有する変異体BR96F(a
    b′)2 ポリペプチド。
  29. 【請求項29】 請求項1、6又は19のいずれかに
    記載の変異体BR96Fvポリペプチド。
  30. 【請求項30】 請求項1、6又は19のいずれかに
    記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
  31. 【請求項31】 請求項30記載のcDNA。
  32. 【請求項32】 複製を与える少なくとも一つの配列
    に結合し得る請求項30記載の核酸分子を有するプラス
    ミド。
  33. 【請求項33】 転写制御を与える少なくとも一つの
    配列に結合し得る請求項30記載の核酸分子を有するプ
    ラスミド。
  34. 【請求項34】 適する宿主細胞内に請求項32又は
    33のいずれかに記載のプラスミドを有する宿主ベクタ
    ー系。
  35. 【請求項35】 適する宿主細胞が細菌性細胞である
    請求項34記載の宿主ベクター系。
  36. 【請求項36】 細菌性細胞がグラム陰性菌である請
    求項35記載の宿主ベクター系。
  37. 【請求項37】 グラム陰性菌がE.coli菌である請求
    項36記載の宿主ベクター系。
  38. 【請求項38】 適する宿主細胞が原核細胞である請
    求項35記載の宿主ベクター系。
  39. 【請求項39】 請求項34記載の宿主ベクター系
    を、宿主内でポリペプチドを生産するように育成するこ
    と及び生産されたポリペプチドを回収することを含むポ
    リペプチドの生産方法。
  40. 【請求項40】 a.被検体から細胞試料を得るこ
    と、b.請求項1、6又は19のいずれかに記載のポリ
    ペプチドと細胞試料を、細胞−BR96抗体−ポリペプ
    チド複合体を得るように、接触させること、該複合体の
    存在はBR96抗原を伴うガン細胞の存在を示唆するも
    のであることを含む、被検体からの細胞試料内のBR9
    6抗原を伴うガン細胞の存在を検出する方法。
  41. 【請求項41】 正常細胞を、図3の99位のアミノ
    酸で開始し、105位のアミノ酸で終止するGly L
    eu Ala Asp Gly Ala Trpの配列
    を含むCDRを含有するアミノ酸配列を含む変異体BR
    96ポリペプチドと、ポリペプチド−正常細胞複合体を
    形成するように接触させること及び形成したポリペプチ
    ド−正常細胞複合体の数を定量的に決定することをさら
    に含み、該数を細胞−BR96抗原−ポリペプチド複合
    体の数と比較し、ポリペプチド−正常細胞複合体と比較
    して、細胞−BR96抗原−ポリペプチド複合体の方が
    より多い時、細胞試料中のBR96抗原を伴うガン細胞
    の存在を示すものである、請求項40記載の方法。
  42. 【請求項42】 BR96抗原の存在を伴う被検体の
    ガンを診断する方法であって、請求項1、6又は19の
    いずれかに記載のポリペプチドを使用して、被検体から
    の細胞試料中のBR96抗原を伴うガンの数を決定する
    こと及びそのように決定した細胞の数を正常な被検体か
    らの試料中の数と比較することを含み、測定可能な異な
    る量がガンの存在を示すものである、診断方法。
  43. 【請求項43】 細胞毒性物質に結合した請求項1、
    6又は19のいずれかに記載のポリペプチドを含有する
    免疫複合体。
  44. 【請求項44】 請求項43記載の免疫複合体を該ガ
    ン細胞と反応させることを含む、BR96モノクローナ
    ル抗体に免疫特異的に結合する抗体を発現する選択的に
    ガン細胞を殺す方法。
  45. 【請求項45】 薬学的に有効量の請求項43記載の
    免疫複合体と薬学的に許容される担体を含む悪性腫瘍の
    治療に有用な薬学的組成物。
  46. 【請求項46】 薬学的に有効量の請求項45記載の
    組成物を患者に投与することを含むインビボにおける悪
    性腫瘍の治療方法。
  47. 【請求項47】 請求項1、6又は19のいずれかに
    記載のポリペプチドと、組織検体を接触させること及び
    該組織と該抗体の結合を検出することを含むヒトの組織
    の悪性腫瘍の存在を決定する方法。
  48. 【請求項48】 該分子が直接又は間接に、放射性ラ
    ベル、酵素、クロモフォア及び蛍光発生体からなる群か
    ら選択される化合物による検出可能なシグナルを生産す
    るようにラベルされた請求項47記載の方法。
  49. 【請求項49】 悪性腫瘍を検出するのに十分な量
    の、請求項1、6又は19記載のポリペプチドを被検体
    に静脈注射により投与すること、抗体を悪性腫瘍に結合
    させ、悪性腫瘍部位に局在化させること及び悪性腫瘍細
    胞に結合した該抗体を検出することを含む悪性腫瘍を画
    像化する方法。
  50. 【請求項50】 該分子が直接又は間接に、放射性ラ
    ベル、酵素、クロモフォア及び蛍光発生体からなる群か
    ら選択されるラベルにより検出可能なシグナルを生産す
    るようにラベルされた請求項49記載の方法。
  51. 【請求項51】 請求項1、6又は19のいずれかに
    記載のポリペプチド上の抗原決定基と反応し得るモノク
    ローナル抗イディオタイプ抗体。
  52. 【請求項52】 a)請求項1、6又は19のいずれ
    かに記載のポリペプチド;及びb)上記a)の抗体の特
    異的被結合体と検出可能なラベルとの複合体、を含む診
    断キット。
  53. 【請求項53】 ラベルが、酵素、放射性ラベル、ク
    ロモフォア及び蛍光発生体からなる群から選択される、
    請求項52記載の診断キット。
  54. 【請求項54】 細胞毒性物質が、抗代謝物、アルキ
    ル化剤、アンスラサイクリン類、抗生物質、抗分裂剤及
    び化学療法剤からなる群から選択される、請求項43記
    載の免疫複合体。
  55. 【請求項55】 細胞毒性物質が、リシン、ドキソル
    ビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウ
    ム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンク
    リスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ジヒドロキシ
    アントラシンジオン、アクチノマイシンD、1−デヒド
    ロテストステロン及びグルココルチコイドからなる群か
    ら選択される、請求項43記載の免疫複合体。
  56. 【請求項56】 ガンである被検体を治療する方法で
    あり、ガンは細胞表面に抗原を伴うガンを有する細胞の
    群であることを特徴とし、結合した細胞を殺して被検体
    を治療するように、細胞表面上に抗原を伴うガンに分子
    を結合させる条件下において、細胞毒性物質に結合した
    請求項1、6又は19のいずれかに記載のポリペプチド
    のガンを殺す量を被検体に投与することを含む治療方
    法。
  57. 【請求項57】 哺乳類ガン細胞の増殖を抑制するよ
    うに、ドキソルビシンに結合した請求項43の免疫複合
    体の増殖を抑制し得る量を、哺乳類のガン細胞に接触さ
    せることを含む、哺乳類ガン細胞の増殖を抑制する方
    法。
  58. 【請求項58】 BR96モノクローナル抗体に免疫
    特異的に結合する抗原を発現するガン細胞を選択的に殺
    す方法であって、BR96/ドキソルビシン−ガン細胞
    複合体を得るように、ドキソルビシンを結合させ請求項
    43の免疫複合体と、ガン細胞を反応させることを含
    み、それによりドキソルビシンが複合化したガン細胞を
    殺す方法。
  59. 【請求項59】 哺乳類ガン細胞の増殖を抑制する方
    法であって、免疫複合体−ガン細胞複合体を得るように
    ドキソルビシンに結合した請求項43の免疫複合体の十
    分な濃度を、哺乳類のガン細胞に接触させることを含
    み、それにより複合化した哺乳類のガン細胞の増殖を抑
    制する方法。
  60. 【請求項60】 細胞表面上にBR96抗原を伴う細
    胞を有することを特徴とする増殖型の病気である被検体
    を治療する方法であって、ドキソルビシンに結合した請
    求項43記載の免疫複合体の有効量を被検体に投与する
    ことを含み、そのような免疫複合体はBR96抗原に結
    合して該細胞を殺し、それにより被検体を治療する方
    法。
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