ES2330444T3 - Inmunoglobulinas neutralizantes de nogo-a para el tratamiento de enfermedades neurologicas. - Google Patents

Inmunoglobulinas neutralizantes de nogo-a para el tratamiento de enfermedades neurologicas. Download PDF

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Abstract

Un Anticuerpo que comprende cada una de las siguientes CDR: Las CDR de la cadena ligera: SEC ID N.º 1, 2 y 3 Las CDR de la cadena pesada: SEC ID N.º 4, 5 y 6, o un fragmento o análogo funcional del mismo, anticuerpo, fragmento o análogo funcional del mismo que se une con y neutraliza a la Nogo-A humana.

Description

Inmunoglobulinas neutralizantes de Nogo-A para el tratamiento de enfermedades neurológicas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a inmunoglobulinas, particularmente, a anticuerpos que se unen con Nogo-A y neutralizan su actividad, a polinucleótidos que codifican tales anticuerpos, a formulaciones farmacéuticas que contienen dichos anticuerpos y al uso de tales anticuerpos en el tratamiento y/o la profilaxis de enfermedades neurológicas. Otros aspectos, objetivos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción que figura más adelante.
Antecedentes de la invención
La apoplegía es la principal causa de mortalidad y discapacidad en el mundo occidental. No hay una terapia autorizada para el tratamiento de la apoplegía además del plasminógeno tisular (t-PA), que tiene que ser administrado en el transcurso de las 3 horas de la aparición tras un escáner de tomografía informatizada (CT) para excluir una hemorragia. Hasta la fecha, la mayoría de los agentes terapéuticos dirigidos hacia el tratamiento de la apoplegía aguda (i.e., neuroprotección) han implicado predominantemente la dirección de receptores de glutamato y sus rutas de señalización secuencia abajo conocidas por su implicación en la muerte celular aguda. Sin embargo, hasta la fecha, estas estrategias han resultado insatisfactorias en las pruebas clínicas y a menudo se asocian con efectos secundarios limitantes de la dosis (Hill & Hachinski, The Lancet, 352: (supl. III) 10-14 (1998)). Por lo tanto, existe la necesidad de contar con nuevos enfoques dirigidos hacia la mejora de la muerte celular tras un cese del flujo sanguíneo. La neuroprotección es la capacidad de un tratamiento para prevenir o mejorar la pérdida de células neuronales como respuesta a un ataque o un proceso patológico. Esto se puede conseguir dirigiendo las neuronas directa o indirectamente mediante la prevención de la pérdida de células gliales (incluyendo oligodendrocitos).
Tras la aparición de la apoplegía, en muchos pacientes, se observa un cierto grado de recuperación funcional espontánea, lo que sugiere que el cerebro tiene la capacidad (aunque limitada) de repararse y/o remodelarse tras una lesión. Los agentes que tienen el potencial de aumentar esta recuperación pueden permitir, por tanto, que la intervención se haga mucho más tarde (posiblemente, que tarde días) tras la aparición de la isquemia cerebral. Los agentes que pueden ofrecer tanto una neuroprotección aguda como una mayor recuperación funcional pueden proporcionar ventajas significativas frente a las estrategias neuroprotectoras potenciales actuales.
La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por la presencia de dos características de diagnóstico de la patología. Éstas son las placas de amiloide y los ovillos neurofibrilares compuestos por péptido beta-amiloide agregado (A\beta40 y A\beta42) y tau hiperfosforilada, respectivamente (Dawbarn & Allen, 2001, Neurobiology of Alzheimer's Disease OUP).
Un estudio exhaustivo ha demostrado una fuerte relación en los pacientes entre la acumulación de beta-amiloide y la disminución cognitiva (Naslund et al., JAMA, marzo 22/29, 2000, Vol. 283, N.º 12, páginas 1571-1577). Esto coincide con los estudios genéticos y epidemiológicos que sugieren que algunas mutaciones de la APP y los genes de la presenilina pueden predisponer a una aparición temprana de la EA, mutaciones que también aumentan los niveles de péptido A\beta40 y A\beta42, incluyendo la proporción entre los mismos.
La escisión de la proteína precursora de amiloide (APP) transmembrana de tipo I por dos proteasas distintas denominadas beta- y gamma-secretasa es necesaria para la formación de péptido beta-amiloide. Se ha confirmado la identidad molecular de la beta-secretasa como la aspartil-proteasa Asp2/BACE1 (Hussain et al., Mol. Cell. NeuroSci. 16, 609-619 (2000); Vassar et al., Science (1999), Oct. 22; 286 (5440):735-741). La naturaleza de la gamma-secretasa sigue suscitando un cierto debate y es probable que esté constituida por un complejo de alto peso molecular constituido por al menos las siguientes proteínas: presenilinas, Aph1, Pen2 y nicastrina (revisado en Medina y Dotti, Cell Signalling, 2003. 15(9):829-41).
El procesamiento de la APP en el SNC es probable que tenga lugar en un número de tipos de células, incluyendo neuronas, oligodendrocitos, astrocitos y microglia. Mientras que la velocidad global del procesamiento de la APP en estas células estará influido por el nivel de expresión relativa de APP, BACE1/Asp2, presenilina-1 y -2, Aph1, Pen2 y nicastrina.
Además, otros datos que regulan la ubicación subcelular de la APP también pueden influir en su procesamiento según lo demuestra el descubrimiento de que la mutación del motivo YENP en el dominio citoplasmático de la APP que bloquea su endocitosis reduce la producción de beta-amiloide (Perez et al., 1999, J. Biol. Chem. 274 (27) 18851-6). La retención de APP-beta-CTF en el ER mediante la adición del motivo de retención KKQN es suficiente para reducir la producción de amiloide en células transfectadas (Maltese et al., 2001, J. Biol. Chem. 276 (23) 20267-20279). Por el contrario, la elevación de la endocitosis, por sobre-expresión de Rab5, es suficiente para elevar la secreción de amiloide desde células transfectadas (Grbovic et al., 2003, J. Biol. Chem. 278 (33) 31261-31268).
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Coincidiendo con estos hallazgos, otros estudios han demostrado que la reducción de los niveles de colesterol celular (un factor de riesgo conocido para la EA) redujo la formación de beta-amiloide. Este cambio dependía de la endocitosis modificada según fue demostrado por el uso de los mutantes negativos dominantes de la dinamina (K44A) y la sobre-expresión de la proteína activadora de la GTPasa de Rab5 RN-Tre (Ehehalt et al., 2003, J. Cell. Biol. 160 (1) 113-123).
Los microdominios o balsas ricos en colesterol también son una importante zona celular de producción de beta-amiloide, y también se ha demostrado que la APP, BACE1 y los componentes del complejo de gamma-secretasa residen transitoriamente en las balsas. El entrecruzamiento de anticuerpos de la APP y BACE1 hacia las balsas ricas en colesterol fue capaz de elevar la producción de beta-amiloide (Ehehalt et al., 2003, J. Cell. Biol. 160 (1) 113-123). La expresión de BACE1 anclado a GPI, que se dirige exclusivamente a las balsas de lípido, es capaz similarmente de elevar la escisión de la APP y la producción de beta-amiloide (Cordy et al., 2003. PNAS 100(20) 11735-11740).
En la actualidad, se desconocen los mecanismos subyacentes a la recuperación funcional. Se ha propuesto como un mecanismo posible el brote de axones lesionados o no lesionados. Sin embargo, aunque algunos estudios in vivo han demostrado que el tratamiento de la lesión de médula dorsal o de la apoplegía con factores neurotróficos da como resultado un aumento de la recuperación funcional y un grado de brote axonal, éstos no prueban la existencia de una relación directa entre el grado de brote axonal y el grado de recuperación funcional (Jakeman, et al., 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamata et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 94:8179-8184, Ribotta, et al., 2000, J. Neurosci. 20: 5144-5152). Además, el brote axonal requiere una neurona viable. En enfermedades tales como la apoplegía, que está asociado con una amplia muerte celular, el aumento de la recuperación funcional ofrecida por un agente dado después de la apoplegía puede darse, por tanto, a través de mecanismos distintos al brote axonal, tales como la diferenciación de células madre endógenas, la activación de las rutas redundantes, los cambios en la distribución de los receptores o la excitabilidad de las neuronas o las células gliales (Fawcett y Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, Horner y Gage, 2000, Nature 407 963-970).
La capacidad limitada del sistema nervioso central (SNC) para la reparación tras una lesión se cree que se debe en parte a moléculas del entorno del SNC que tienen un efecto inhibidor sobre el brote axonal (brote neurítico). Se cree que la mielina del SNC contiene moléculas inhibidoras (Schwab M. E. y Caroni P. (1988) J. Neurosci. 8, 2381-2193). Se han clonado dos proteínas de mielina, la glicoproteína asociada a la mielina (MAG) y NOGO, y han sido identificadas como inhibidores putativos del brote neurítico (Sato S. et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 1473-1480; McKerracher L. et al., (1994) Neuron 13, 805-811; Mukhopadhyay G. et al., (1994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K. y Lundborg G. (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer et al., (1996) Neuron 16, 1107-1113; WO9522344; WO9701352; Prinjha R. et al (2000) Nature 403, 383-384; Chen M. S. et al., (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T. et al., (2000) Nature 403, 439-444; US005250414A; WO200005364A1; W00031235).
Se han identificado tres formas de Nogo humana: Nogo-A que tiene 1192 residuos de aminoácido (n.º de acceso del GenBank AJ251383); Nogo-B, una variante de empalme que carece de los residuos 186 a 1004 en el dominio extracelular putativo (n.º de acceso del GenBank AJ251384) y una variante de empalme más corta, Nogo-C, que también carece de los residuos 186 a 1004 y, además, tiene el dominio amino-terminal alternativo más pequeño (n.º de acceso del GenBank AJ251385) (Prinjha et al., (2000) supra).
La inhibición de las proteínas inhibidoras del SNC, tales como la Nogo, puede proporcionar un medio terapéutico para mejorar el daño neuronal y promover la reparación y el crecimiento neuronal, ayudando potencialmente de ese modo a la recuperación de una lesión neuronal, tal como, la sufrida en la apoplegía. Los ejemplos de tales inhibidores Nogo pueden incluir moléculas pequeñas, péptidos y anticuerpos.
Los anticuerpos comprenden comúnmente dos cadenas pesadas unidas entre sí mediante enlaces de tipo disulfuro y dos cadenas ligeras. Cada cadena ligera está unida a la respectiva cadena pesada mediante enlaces de tipo disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en el otro extremo. El dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada. Los dominios constantes de las cadenas ligeras y pesadas no están implicados directamente en la unión del anticuerpo con el antígeno.
Los dominios variables de cada par de cadenas ligeras y pesadas forman el sitio de unión antigénica. Los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas tienen la misma estructura general y cada dominio comprende un marco de cuatro regiones, cuyas secuencias están relativamente conservadas, conectadas por tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) denominadas, habitualmente, regiones hipervariables. Las cuatro regiones marco adoptan en buena parte una configuración de lámina beta y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las CDR se mantienen muy próximas por las regiones marco y, con las CDR del otro dominio, contribuyen a la formación del sitio de unión antigénica. Las CDR y las regiones marco de los anticuerpos pueden estar determinadas en referencia a Kabat et al., ("Sequences of proteins of immunological interest" Departamento estadounidense de sanidad y servicios sociales, Imprenta del gobierno estadounidense, 1987).
Se ha descubierto que cuando los anticuerpos monoclonales anti-MAG, descritos (Poltorak et al., (1987) Journal of Cell Biology 105,1893-1899, DeBellard et al., (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tang et al., (1997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K. y Lundborg G. (1997) Exp. Neurology 150, 254-262) y comercialmente disponibles (MAB1567 (Chemicon)), son administrados bien directamente en el cerebro o intravenosamente tras una isquemia cerebral focal en la rata (un modelo de apoplegía) proporcionan neuroprotección y aumentan la recuperación funcional (PCT/EP03/08749).
Por tanto, los anticuerpos anti-MAG proporcionan agentes terapéuticos potenciales tanto para la neuroprotección aguda, como para la promoción de la recuperación funcional tras la apoplegía. Este anticuerpo es un anticuerpo murino. Aunque los anticuerpos murinos se usan habitualmente como agentes de diagnóstico, su utilidad como agentes terapéuticos ha sido probada sólo en unos cuantos casos. Su limitada aplicación se debe en parte a que la administración repetida de un anticuerpo monoclonal murino a un ser humano habitualmente provoca respuestas inmunes humanas frente a estas moléculas. Para superar estas propiedades intrínsecas no deseables de los anticuerpos murinos, se han desarrollado anticuerpos "modificados" diseñados para incorporar regiones de anticuerpos humanos, y están bien establecidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado contiene regiones determinantes de la complementariedad ("CDR") de origen no humano, derivado la mayoría del resto de la estructura de un anticuerpo humano.
También se ha publicado que un anticuerpo monoclonal murino, el IN-1, que fue originado frente a NI-220/250, una proteína de mielina que es un potente inhibidor del brote neurítico (y que posteriormente demostró ser un fragmento de Nogo-A) promueve la regeneración axonal (Caroni, P. y Schwab, M.E. (1988) Neuron 1, 85-96; Schnell, L. y Schwab, M.E. (1990) Nature 343 269-272; Bregman, B. S. et al., (1995) Nature 378 498-501 y Thallmair, M. et. al., (1998) Nature Neuroscience 1, 124-131). También se ha publicado que la Nogo-A es el antígeno de IN-1 (Chen et al., (2000) Nature 403, 434-439). La administración de un fragmento Fab de IN-1 o IN-1 humanizado a ratas que han sufrido una transección de la médula espinal aumentó su recuperación (Fiedler, M. et al., (2002) Protein Eng 15 931-941; Brosamle, C. et al., (2000) J. Neuroscience 20, 8061-8068). Sin embargo, hasta la fecha no hay pruebas en la bibliografía que sugieran que IN-1, o su forma humanizada, pueda unirse e inhibir la Nogo-A humana, un requisito necesario para que un anticuerpo monoclonal sea útil en el tratamiento terapéutico de enfermedades y trastornos mediados por la Nogo, tales como la apoplegía y las enfermedades neurodegenerativas en seres humanos.
El 7B12 es un anticuerpo monoclonal murino originado frente a N:R-G de rata, que se corresponde con los aminoácidos 1 a 979 de la Nogo-A de rata. Se ha publicado que la administración de 7B12 mejora el resultado del comportamiento y la plasticidad corticoespinal en los modelos de apoplegía realizados en ratas (Wiessner, C. et al., (2003) Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 23, 154-165).
Sigue siendo muy deseable aislar y desarrollar un anticuerpo monoclonal terapéuticamente útil que se una e inhiba la actividad de la Nogo humana. El procedimiento de neurodegeneración subyace a muchas enfermedades/trastornos neurológicos que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades agudas, tales como la apoplegía (isquémico o hemorrágico), la lesión cerebral traumática y la lesión de médula espinal, así como enfermedades crónicas que incluyen la enfermedad de Alzheimer, demencias fronto-temporales (tauopatías), la neuropatía periférica, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), la esquizofrenia, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la esclerosis múltiple, la enfermedad de Huntington, la esclerosis múltiple y la miositis por cuerpos de inclusión.
Por consiguiente, puede ser útil un anticuerpo monoclonal anti-Nogo en el tratamiento de estas enfermedades/tras-
tornos. Tales anticuerpos para el tratamiento de las enfermedades/los trastornos anteriormente mencionados son proporcionados por la presente invención y descritos detalladamente más adelante.
Breve resumen de la invención
La invención proporciona un anticuerpo según la reivindicación 1. También se describen en la presente memoria los anticuerpos aislados independientemente: 2A10/3, 2C4/1 y 15C3/3. Las CDR están identificadas según lo descrito por Kabat (Kabat et al. (1991) "Sequences of proteins of immunological interest"; quinta edición; Departamento estadounidense de sanidad y servicios sociales; publicación NIH N.º 91-3242). Las CDR son preferiblemente según lo definido por Kabat, pero siguiendo los principios de la estructura y el plegamiento de proteínas según lo definido por Chothia y Lesk, (Chothia et al., (1989) "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions"; Nature 342, p. 877-883). Se apreciará la posibilidad de considerar otros residuos como parte de la región de unión antigénica, estando éstos, por tanto, englobados por la presente invención.
TABLA 1 CDR de las cadenas ligeras del anticuerpo 2A10/3 ("2A10")
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TABLA 2 CDR de las cadenas pesadas del anticuerpo 2A10/3
2 
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TABLA 3 CDR de las cadenas ligeras del anticuerpo 2C4/1 ("2C4")
3 
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TABLA 4 CDR de las cadenas pesadas del anticuerpo 2C4/1
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TABLA 5 CDR de las cadenas ligeras del anticuerpo 15C3/3 ("15C3")
5
TABLA 6 CDR de las cadenas pesadas del anticuerpo 15C3/3
6
El anticuerpo puede ser quimérico, completamente humano o humanizado.
En una realización preferida, el anticuerpo de la invención tiene un epítopo comprendido en la región de 586 a 785 (numeración de aminoácidos de Nogo-A, n.º de acceso del GenBank AJ251383), más preferiblemente, el epítopo está comprendido en la región de 586 a 685. Se usan análisis de inhibición competitiva para el mapeado de los epítopos sobre un antígeno. De este modo, también se proporciona un anticuerpo anti-Nogo-A que se une con la Nogo-A humana entre los aminoácidos 586 a 685, y neutraliza la actividad de Nogo-A. Tal anticuerpo se puede producir según los procedimientos expuestos más adelante.
Anticuerpos quiméricos
El anticuerpo de la invención puede ser quimérico. Preferiblemente, el anticuerpo quimérico comprende secuencias humanas y de ratón (p. ej., la región variable de ratón y la región constante humana). Además, se proporciona un anticuerpo quimérico que comprende una región variable de cadena pesada que comprende cada una de las CDR de la tabla 2 y una región variable de cadena ligera que comprende cada una de las CDR de la tabla 1.
Anticuerpos humanizados
En otra realización, el anticuerpo es humanizado. Más específicamente, se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada que comprende cada una de las CDR de la tabla 2 y una región variable de cadena ligera que comprende cada una de las CDR de la tabla 1.
En las realizaciones más comunes, los anticuerpos de la invención, ya sean quiméricos, humanizados o completamente humanos, son de la clase d las IgG, más comúnmente, IgG1 o IgG4 humana, con una cadena ligera humana de tipo \kappa.
Otro aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-Nogo-A de la presente invención o un fragmento funcional del mismo junto con un diluyente o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-Nogo-A de la invención, o un fragmento o un análogo funcional del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la apoplegía (particularmente, la apoplegía isquémica) y otras enfermedades neurológicas según lo expuesto más adelante, en concreto, la enfermedad de Alzheimer.
En otro aspecto más, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-Nogo-A de la invención, o un fragmento o un análogo funcional del mismo, en la preparación de un medicamento para inhibir la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente humano afectado con, o con riesgo de desarrollar, una apoplegía y otra enfermedad neurológica según lo expuesto más adelante, en concreto, la enfermedad de Alzheimer.
Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen en mayor profundidad en la descripción detallada y las realizaciones preferidas de la misma.
Descripción de las figuras
La figura 1 muestra el efecto inhibidor de la proteína de fusión GST-NOGO-A56 sobre el brote neurítico. El eje Y muestra la longitud neurítica/neurita media (NUN) en unidades arbitrarias.
La figura 2 muestra el efecto bloqueador realizado por el sobrenadante del hibridoma 2A10 sobre la actividad inhibidora del brote neurítico de NOGO-A56 (GST-Nogo 5 y 6). El eje Y es igual que en la figura 1.
La figura 3 muestra el efecto bloqueador realizado por el sobrenadante del hibridoma 2C4 sobre la actividad inhibidora del brote neurítico de NOGO-A56 (GST-Nogo 5 y 6). El eje Y es igual que en la figura 1.
La figura 4 muestra el efecto bloqueador realizado por el sobrenadante del hibridoma 15C3 sobre la actividad inhibidora del brote neurítico de NOGO-A56 (GST-Nogo 5 y 6). El eje Y es igual que en la figura 1.
La figura 5 es el sobrenadante de hibridoma control 12G3 que no tiene actividad bloqueadora de NOGO-A56. El eje Y es igual que en la figura 1.
La figura 6 muestra el efecto bloqueador de NOGO-A56 de 2A10 purificado a 4 concentraciones. El eje Y es igual que en la figura 1.
La figura 7 muestra que el anticuerpo monoclonal IN-1 recombinante no presenta ninguna actividad bloqueadora hacia NOGO-A56 (GST-NOGO5 y 6). El eje Y es igual que en la figura 1.
Para las figuras 1 a 7, el control negativo es la proteína GST sola.
La figura 8 muestra la unión de los anticuerpos monoclonales 2A10, 2C4 y 15C3 con NOGO-A56 humana. El eje Y muestra la DO medida a 450 nm, una medida cuantitativa del anticuerpo capturado en los pocillos. El eje X muestra la concentración de anticuerpo usada (ng/ml) por pocillo en cada punto de datos.
La figura 9 muestra el volumen de la lesión como un porcentaje del volumen total del cerebro a diversas concentraciones tras el estudio del ejemplo 10.
La figura 10 muestra los datos de puntuación neurológica del ejemplo 10 representados como las medias \pm EEM.
Figuras 11A, 11B, 11C, 11D. Los datos de la prueba del cilindro del ejemplo 10 representados como la media \pm EEM para A) ambas patas, B) la pata izquierda, C) la pata derecha y D) la pata derecha divididos entre las ratas que recibieron 3 dosis de 15 \mug de anticuerpo anti-Nogo-A y aquéllas que recibieron 4 dosis de anticuerpo anti-Nogo-A.
La figura 12 muestra los deslizamientos de las patas anteriores del ejemplo 10 representados como la media \pm intervalos de confianza del 95%.
La figura 13 muestra los deslizamientos de las patas posteriores del ejemplo 10 representados como la media \pm intervalos de confianza del 95%.
La figura 14A) muestra los pesos corporales representados como las medias \pm EEM. La dosificación de los animales con 15 \mug del anticuerpo provoca un aumento del peso corporal a las 24 horas, a la semana y en cada punto temporal a partir de la semana 3 hasta la finalización del estudio.
El gráfico de la figura 14B) muestra los pesos para el grupo que ha recibido la dosis de 15 \mug dividido en animales que han recibido la dosis 3 veces y aquéllos que han recibido la dosis cuatro veces. Los datos son expresados como las medias \pm intervalos de confianza del 95%. * P < 0,05, ANOVA con medidas repetidas.
El gráfico de la figura 14C) muestra los pesos para el grupo que ha recibido la dosis de 15 \mug dividido en animales que han recibido la dosis 3 veces y aquéllos que han recibido la dosis cuatro veces. Comparación con los animales que han recibido la dosis de 5 \mug de anticuerpo anti-Nogo-A y los animales que han recibido la dosis del anticuerpo de control. Los datos son expresados como las medias \pm intervalos de confianza del 95%. * P < 0,05, ANOVA con medidas repetidas.
La figura 15 representa el volumen de la lesión como un porcentaje del volumen total del cerebro del ejemplo 11.
La figura 16 muestra los datos de puntuación neurológica representados como las medias \pm EEM del ejemplo 11.
Figuras 17A, 17B y 17C. Los datos de la prueba del cilindro representados como la media \pm EEM para A) ambas patas, B) la pata izquierda, C) la pata derecha del ejemplo 11.
La figura 18 muestra los deslizamientos de las patas anteriores representados como la media \pm EEM de la prueba de la viga afilada del ejemplo 11 .
La figura 19 muestra los deslizamientos de las patas posteriores representados como la media \pm EEM del ejemplo 11.
La figura 20 muestra los deslizamientos de las patas posteriores representados como la media \pm EEM (latencia para la prueba de la viga cruzada).
Figura 21: La transfección de Nogo-A conduce a la elevación de los niveles del péptido A\beta 40 en células SHSY5Y-APPwt.
Figura 22: La transfección de Nogo-A conduce a la elevación de los niveles del péptido A\beta 42 en células SHSY5Y-APPwt.
Figura 23: Efecto de la expresión de Nogo-A sobre los niveles del péptido A\beta 40.
Figura 24: Efecto de la expresión de Nogo-A sobre los niveles del péptido A\beta 42.
Figura 25: Efecto de la expresión de Nogo-A, Nogo-B y Nogo-C sobre A\beta 40 y A\beta 42.
Figura 26: El anticuerpo anti-Nogo-A 2A10-BR inhibe la secreción de A\beta desde las células SHSY5Y-APPwt.
Figura 27: Efecto de la IgG1 control sobre la secreción de A\beta desde células SHSY5Y-APPwt.
Figura 28: Efecto de la IgG1 control sobre la secreción de A\beta desde células SHSY5Y-APPswe.
Figura 29: Efecto del anticuerpo anti-Nogo-A control 6D5 (no bloqueador funcional) sobre la secreción de A\beta desde células SHSY5Y-APPwt.
Figura 30: Efecto del anticuerpo anti-Nogo-A control 6D5 (no bloqueador funcional) sobre la secreción de A\beta desde células SHSY5Y-APPswe.
Figura 31: El anticuerpo monoclonal anti-Nogo-A bloqueador funcional 2A10 inhibe la secreción de A\beta desde las células SHSY5Y-APPwt.
Figura 32: El anticuerpo monoclonal anti-Nogo-A bloqueador funcional 2A10 inhibe la secreción de A\beta desde las células SHSY5Y-APPswe.
Figura 33: El anticuerpo monoclonal anti-Nogo-A bloqueador funcional 2C4 inhibe la secreción de A\beta desde las células SHSY5Y-APPwt.
Figura 34: Efecto de preparaciones de anticuerpo en cultivo estático anti-Nogo-A y otros anticuerpos control sobre la secreción de A\beta desde células SHSY5Y-APPwt. 2A10, 2C4 y 15C3 son los anticuerpos del cultivo estático. El resto son controles purificados BR (Bioreactor) o controles comercialmente disponibles.
Las figuras 35A a C ilustra la unión dependiente de la dosis del anticuerpo humanizado H1L11 en comparación con la quimera (HcLc) con NOGO-A56 humana en un análisis ELISA. El eje Y muestra la densidad óptica (DO) medida a 490 nm, una medida cuantitativa del anticuerpo capturado en los pocillos. El eje X muestra la concentración de anticuerpo usada (ug/ml) por pocillo en cada punto de datos.
Figura 36: El aumento de la expresión de Nogo-A eleva los niveles de A\beta de una manera dependiente de la dosis. El eje Y de la gráfica es el % de aumento de A\beta40. El eje X muestra la concentración creciente de ADNc de Nogo-A marcado con myc. Sobre la gráfica, hay un gel que muestra el aumento de la cantidad de la expresión de la proteína Nogo-A según lo mostrado mediante una transferencia Western usando un anticuerpo anti-Nogo-A.
Descripción detallada de la invención
Los anticuerpos de la invención son comúnmente anticuerpos monoclonales (Acm) y, preferiblemente, son quiméricos, humanizados, completamente humanos o reconfigurados. Entre éstos, se prefieren particularmente los humanizados y los completamente humanos.
Los anticuerpos de la invención tienen comúnmente la estructura de un anticuerpo natural o un fragmento funcional del mismo. El anticuerpo puede comprender, por lo tanto, un anticuerpo de longitud completa, un fragmento (Fab')_{2}, un fragmento Fab, un dímero de cadena ligera o un dímero de cadena pesada. El anticuerpo puede ser una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4; o IgM, IgA, IgE o IgD, o una variante modificada de las mismas. El dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo puede ser seleccionado en consecuencia. El dominio constante de la cadena ligera puede ser un dominio constante kappa o lambda. Además, el anticuerpo puede comprender modificaciones de todas las clases, p. ej., dímeros de IgG, mutantes de Fc que ya no se unan a receptores de Fc o medien la unión de C1q. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo quimérico del tipo descrito en el documento WO86/01533, que comprende una región de unión antigénica y una región de no inmunoglobulina. La región de unión antigénica es un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo o un dominio variable de cadena pesada. Comúnmente, la región de unión antigénica comprende los dominios variables de tanto las cadenas ligeras como las pesadas. La región de no inmunoglobulina está fusionada en su terminal C con la región de unión antigénica.
La región de no inmunoglobulina es comúnmente una proteína de no inmunoglobulina y puede ser una enzima, una toxina o una proteína que tenga una especificidad de unión conocida. Las dos regiones de este tipo de anticuerpo quimérico pueden estar conectadas mediante una secuencia ligadora escindible. Las inmunoadhesinas que tienen las CDR como se describe anteriormente en la presente memoria también están contempladas en la presente invención.
La región constante se selecciona según la funcionalidad requerida. Normalmente, una IgG1 demostrará capacidad lítica a través de la unión con el complemento y/o mediará la CCDA (citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo). Se preferirá una IgG4 si es necesario un anticuerpo bloqueador no citotóxico. Sin embargo, los anticuerpos IgG4 pueden demostrar inestabilidad en la producción y, por tanto, puede ser más preferible modificar la IgG1, que generalmente es más estable. En el documento EP0307434 se describen las modificaciones sugeridas, estando las modificaciones preferidas incluidas en las posiciones 235 y 237. La invención proporciona, por tanto, una forma lítica o no lítica de un anticuerpo según la invención.
En las formas preferidas, por tanto, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo IgG1 no lítico de longitud completa (i.e., tetrámero H2L2) que tiene las CDR descritas anteriormente. En las formas más preferidas, se proporciona un anticuerpo IgG1 no lítico de longitud completa que tiene las CDR de las SEC ID N.º 1 a 6. También se describen en la presente memoria polinucleótidos que codifica las CDR. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 según lo revelado en las tablas 1 a 6. Las secuencias de polinucleótidos preferidas se muestran a continuación en las tablas 7 a 12.
TABLA 7 CDR de las cadenas ligeras del anticuerpo 2A10/3
7 
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TABLA 8 CDR de las cadenas pesadas del anticuerpo 2A10/3
8 
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TABLA 9 CDR de las cadenas ligeras del anticuerpo 2C4/1
9
TABLA 10 CDR de las cadenas pesadas del anticuerpo 2C4/1
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TABLA 11 CDR de las cadenas ligeras del anticuerpo 15C3/3
11 
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TABLA 12 CDR de las cadenas pesadas del anticuerpo 15C/3
12 
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Los anticuerpos anti-Nogo-A 2A10/3, 2C4/1 y 15C/3 comprenden una región variable de cadena pesada que comprende una de las siguientes secuencias de aminoácido:
13 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 37); 
\newpage
14 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 38); 
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 39); 
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos anti-Nogo-A 2A10/3, C4/1 y 15C/3 comprenden una región variable de cadena ligera que comprende una de las siguientes secuencias de aminoácido:
16 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 40); 
\vskip1.000000\baselineskip
17 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 41); 
\vskip1.000000\baselineskip
18 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 42); 
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En otro aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo anti-Nogo-A, o un fragmento funcional del mismo, que se une a y neutraliza la actividad de la Nogo-A humana que comprende:
a)
una región variable de cadena pesada de SEC ID N.º 37 junto con una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de 40.
También se describen en la presente memoria polinucleótidos que codifican la región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de SEC ID N.º 37 a 39 y las regiones variables de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEC ID N.º 40 a 42.
Una secuencia de polinucleótido preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 37 es:
19 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 43); 
\vskip1.000000\baselineskip
Una secuencia de polinucleótido preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 38 es:
20 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 44); 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una secuencia de polinucleótido preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 39 es:
21 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 45); 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una secuencia de polinucleótido preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 40 es:
22 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 46); 
\newpage
Una secuencia de polinucleótido preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 41 es:
23 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 47); 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una secuencia de polinucleótido preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 42 es:
24 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 48); 
\vskip1.000000\baselineskip
El anticuerpo anti-Nogo-A 2A10 comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 37 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 40.
El anticuerpo anti-Nogo-A 2C4 comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 38 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 41.
El anticuerpo anti-Nogo-A 15C3 comprende una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 39 y una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 42.
"Nogo" se refiere a cualquier polipéptido Nogo, incluyendo las formas de variación. Éstas incluyen, pero no se limitan a, Nogo-A que tiene 1192 residuos de aminoácido (n.º de acceso del GenBank AJ251383); Nogo-B, una variante de empalme que carece de los residuos 186 a 1004 en el dominio extracelular putativo (n.º de acceso del GenBank AJ251384) y una variante de empalme más corta, Nogo-C, que también carece de los residuos 186 a 1004 y, además, tiene el dominio amino-terminal alternativo más pequeño (n.º de acceso del GenBank AJ251385) (Prinjha et al., (2000) supra). Se entiende que todas las referencias realizadas a "Nogo" en la presente memoria incluyen cualquiera y todas las formas de variación de Nogo, tales como Nogo-A, y las variantes de empalme descritas, a no ser que se indique una forma específica.
"Neutralizar" y las variaciones gramaticales del término se refieren a la inhibición, bien total o parcial, de la función de las Nogo, incluyendo su unión con las neuronas y la inhibición del brote neurítico.
"Anticuerpo modificado" se refiere a una proteína codificada por una región que codifica la inmunoglobulina modificada, que se puede obtener mediante la expresión en una célula huésped seleccionada. Tales anticuerpos modificados incluyen anticuerpos diseñados genéticamente (p. ej., anticuerpos quiméricos, reconfigurados, humanizados o vectorizados) o fragmentos de anticuerpos que carecen de toda o parte de una región constante de inmunoglobulina, p. ej., Fv, Fab o F(ab)_{2} y similares.
"Región que codifica la inmunoglobulina modificada" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo modificado. Cuando el anticuerpo modificado es un anticuerpo humanizado o injertado en una CDR, las secuencias que codifican las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una inmunoglobulina no humana están insertadas en una primera pareja de inmunoglobulina que comprende secuencias marco variables humanas. Opcionalmente, la primera pareja de inmunoglobulina está unida operativamente con una segunda pareja de inmunoglobulina.
"Primera pareja de inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de inmunoglobulina humana o una región marco humana en la que las regiones que codifican las CDR nativas (o naturales) están reemplazadas por regiones que codifican las CDR de un anticuerpo donante. La región variable humana puede ser una cadena pesada de inmunoglobulina, una cadena ligera de inmunoglobulina (o ambas cadenas), un análogo o sus fragmentos funcionales. Tales regiones CDR, localizadas dentro de la región variable de los anticuerpos (inmunoglobulinas), pueden ser determinadas mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, Kabat et al. ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", IV Ed., Departamento Estadounidense de Sanidad y Asuntos Sociales, Instituto Nacional de la Salud (1987)) revelan las reglas para localizar las CDR. Además, se conocen programas informáticos que son útiles para identificar regiones/estructuras CDR.
"Segunda pareja de inmunoglobulina" se refiere a otra secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o un péptido con el que la primera pareja de inmunoglobulina se fusiona en marco o por medio de una secuencia ligadora convencional (i.e., unida operativamente). Preferiblemente, es un gen de inmunoglobulina. La segunda pareja de inmunoglobulina puede incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica toda la región constante para el mismo anticuerpo de interés (i.e., homóloga: el primer y segundo anticuerpo modificado tienen el mismo origen) o para otro anticuerpo de interés más (i.e., heteróloga). Puede ser una cadena pesada o una cadena ligera de inmunoglobulina (o ambas cadenas como parte de un solo polipéptido). La segunda pareja de inmunoglobulina no se limita a una clase o a un isotipo de inmunoglobulina en concreto. Además, la segunda pareja de inmunoglobulina puede comprender parte de una región constante de inmunoglobulina, tal como la encontrada en un Fab o F(ab)_{2} (i.e., una parte diferenciada de una región constate o región marco humana apropiada). Tal segunda pareja de inmunoglobulina también puede comprender una secuencia que codifica una proteína integral de membrana expuesta en la superficie exterior de una célula huésped, p. ej., como parte de un banco de despliegue en fagos o una secuencia que codifica una proteína para la detección analítica o de diagnóstico, p. ej., peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, etc.
Los términos Fv, Fc, Fd, Fab o F(ab)_{2} se usan con sus significados estándar (véase, p. ej., Harlow et al., "Antibodies A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
Como se usa en la presente memoria, un "anticuerpo diseñado genéticamente" describe un tipo de anticuerpo modificado, i.e., un anticuerpo sintético de longitud completa (p. ej., un anticuerpo quimérico, reconfigurado o humanizado en oposición a un fragmento de anticuerpo) en el que una parte del dominio variable de las cadenas ligeras y/o pesadas de un anticuerpo aceptor seleccionado está reemplazada por partes análogas de uno o más anticuerpos donantes que tienen especificidad por el epítopo seleccionado. Por ejemplo, tales moléculas pueden incluir anticuerpos caracterizados por una cadena pesada humanizada asociada con una cadena ligera sin modificar (o cadena ligera quimérica) o viceversa. Los anticuerpos diseñados genéticamente también pueden estar caracterizados por la modificación de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las regiones marco del dominio variable de cadena ligera y/o pesada del anticuerpo aceptor para conservar la especificidad de unión del anticuerpo donante. Estos anticuerpos pueden comprender el reemplazo de una o más CDR (preferiblemente, todas) del anticuerpo aceptor por las CDR de un anticuerpo donante descrito en la presente memoria.
Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un tipo de anticuerpo diseñado genéticamente que contiene una región variable natural (cadena ligera y cadenas pesadas) derivada de un anticuerpo donante en asociación con las regiones constantes de cadena ligera y pesada derivadas de un anticuerpo aceptor.
Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo diseñado genéticamente cuyas CDR derivan de una inmunoglobulina donante no humana, derivando el resto de partes derivadas de la inmunoglobulina de una (o más) inmunoglobulinas humanas. Además, se pueden modificar los residuos del soporte marco para conservar la afinidad de unión (véase, p. ej., Queen et al., Proc. Natl Acad Sci, EE.UU., 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Un anticuerpo aceptor humano adecuado puede ser uno seleccionado entre una base de datos convencional, p. ej., la base de datos KARAT®, la base de datos de Los Alamos, la base de datos suiza de proteínas, por homología con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del anticuerpo donante. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología con las regiones marco del anticuerpo donante (en base a los aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región constate de cadena pesada y/o una región marco variable de cadena pesada para la inserción de las CDR del donante. Del mismo modo, es posible seleccionar un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar las regiones marco variables o constantes de cadena ligera. Cabe destacar que no es necesario que las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo aceptor procedan del mismo anticuerpo aceptor. La técnica anterior describe varios modos de producir tales anticuerpos humanizados; véase, por ejemplo, los documentos EP-A-0239400 y EP-A-054951.
"Anticuerpo humano reconfigurado" se refiere a un anticuerpo modificado en el que, como mínimo, al menos una CDR de un primer anticuerpo donante monoclonal humano está sustituida por una CDR en un segundo anticuerpo aceptor humano. Preferiblemente, están reemplazadas las seis CDR. Más preferiblemente, hay una región de combinación antigénica completa (p. ej., Fv, Fab o F(ab')_{2}) de un primer anticuerpo monoclonal donante humano sustituida por la correspondiente región de un segundo anticuerpo monoclonal aceptor humano. Más preferiblemente, la región Fab de un primer donante humano está unida operativamente a las regiones constantes apropiadas de un segundo anticuerpo aceptor humano para formar un anticuerpo monoclonal de longitud completa.
Un "anticuerpo vectorizado" se refiere a un anticuerpo al que se ha unido un agente para mejorar el transporte a través de la barrera hematoencefálica (BHE). (Para más información, véase Pardridge, "Advanced Drug Delivery Review" 36, 299-321, 1999). La unión puede ser química o, alternativamente, el resto puede ser diseñado genéticamente en el anticuerpo. Un ejemplo consiste en fabricar una quimera con un anticuerpo dirigido hacia un receptor de células endoteliales de los capilares cerebrales, p. ej., un anticuerpo receptor anti-insulina o un anticuerpo receptor anti-transferrina (Saito et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 92 10227-31; Pardridge et al., (1995) Pharm. Res. 12 807-816; Broadwell et al., (1996) Exp. Neurol. 142 47-65; Bickel et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90, 2618-2622; Friden et al., (1996) J. Pharm. Exp. Ther. 278 1491-1498, US5182107, US5154924, US5833988, US5527527). Una vez unidos al receptor, ambos componentes del anticuerpo biespecífico traspasan la BHE mediante el proceso de transcitosis. Alternativamente, el agente puede ser un ligando que se una a tales receptores de la superficie celular, p. ej., insulina, transferrina o lipoproteína de baja densidad (Descamps et al., (1996) Am. J. Physiol. 270 H1149-H1158; Duffy et al., (1987) Brain Res. 420 32-38; Dehouck et al., (1997) J. Cell Biol. 1997 877-889). Los péptidos naturales, tales como la penetratina y SynB1 y SynB3, que son conocidos por mejorar el transporte a través de la BHE, también se pueden usar (Rouselle et al., (2000) Mol. Pharm. 57, 679-686 y Rouselle et al., (2001) Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296, 124-131).
El término "anticuerpo donante" se refiere a un anticuerpo (monoclonal y/o recombinante) que aporta las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables, CDR u otros fragmentos o sus análogos a una primera pareja de inmunoglobulina, para proporcionar a la región que codifica una inmunoglobulina modificada y al anticuerpo modificado expresado resultante la especificidad antigénica y la actividad neutralizadora característica del anticuerpo donante.
El término "anticuerpo aceptor" se refiere a un anticuerpo (monoclonal y/o recombinante) heterólogo para el anticuerpo donante, que aporta todas (o cualquier parte, pero preferiblemente, todas) las secuencias de aminoácidos que codifican sus regiones marco de cadena pesada y/o ligera, y/o sus regiones constantes de cadena pesada y/o ligera a la primera pareja de inmunoglobulina. Preferiblemente, un anticuerpo humano es el anticuerpo aceptor.
Las "CDR" se definen como las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad de un anticuerpo que son las regiones hipervariable de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Kabat et al., ("Sequences of Proteins of Immunological Interest", IV Ed., Departamento Estadounidense de Sanidad y Asuntos Sociales, Instituto Nacional de la Salud (1987). Hay tres CDR de cadena pesada y tres CDR de cadena ligera (o regiones CDR) en la parte variable de una inmunoglobulina. De este modo, las "CDR", como se usan en la presente memoria, se refieren a las tres CDR de cadena pesada, o a las tres CDR de cadena ligera (o a tanto todas las CDR de cadena pesada como todas las de cadena ligera, según sea lo apropiado). La estructura y el plegamiento proteico del anticuerpo pueden significar que hay otros residuos considerados como parte de la región de unión antigénica, y así sería entendido por un experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Chothia et al., (1989) "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions"; Nature 342, p877-883. Por comodidad, las CDR según lo definido por Kabat en las SEC ID N.º 37-42 se encuentran encuadradas.
Las CDR proporcionan la mayoría de los residuos de contacto para la unión del anticuerpo con el antígeno o el epítopo. Las CDR de interés de esta invención derivan de las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras variables del anticuerpo donante, e incluyen los análogos de las CDR naturales, análogos que también comparten o conservan la misma especificidad de unión antigénica y/o capacidad neutralizadora que el anticuerpo donante del que derivan.
Un "fragmento funcional" es una secuencia variable de cadena pesada o ligera parcial (p. ej., eliminaciones menores en el terminal amino o carboxilo de la región variable de inmunoglobulina) que conserva la misma especificidad de unión antigénica y la misma o una capacidad neutralizadora similar a la del anticuerpo del que el fragmento deriva.
Un "análogo" es una secuencia de aminoácidos modificada en al menos un aminoácido, en la que dicha modificación puede ser química o una sustitución o una reordenación de unos cuantos aminoácidos (i.e., no más de 10), modificación que permite que la secuencia de aminoácidos conserve las características biológicas, p. ej., la especificidad antigénica y la afinidad elevada de la secuencia sin modificar. Por ejemplo, se pueden formar mutaciones (silenciosas), mediante sustituciones, cuando se crean ciertos sitios de restricción de endonucleasas en o en los alrededores de las regiones que codifican las CDR. La presente invención contempla el uso de análogos del anticuerpo de la invención. Se sabe que los cambios menores en las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos pueden conducir, p. ej., a una forma alélica de la proteína original que conserve propiedades sustancialmente similares. Por lo tanto, los análogos del anticuerpo de la invención incluyen aquéllos en los que las CDR de la región hipervariable de las cadenas pesadas y ligeras son al menos un 80% homólogas, preferiblemente, al menos un 90% homólogas y, más preferiblemente, al menos un 95% homólogas a las CDR según lo definido anteriormente, tales como CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 y CDRL3 en las tablas 1 a 6, y conservan su actividad neutralizadora de las Nogo. Las secuencias de aminoácidos son al menos un 80% homólogas si tienen un 80% de residuos de aminoácido idénticos en una posición similar al alinear óptimamente las secuencias, siendo los huecos o las inserciones contabilizados como residuos no idénticos. La invención también contempla análogos de los anticuerpos de la invención, en los que las regiones marco son al menos un 80%, preferiblemente, al menos un 90% y, más preferiblemente, al menos un 95% homólogas a las regiones marco expuestas en las SEC ID N.º 37 a 42. Las secuencias de aminoácidos son al menos un 80% homólogas si tienen un 80% de residuos de aminoácido idénticos en una posición similar al alinear óptimamente las secuencias, siendo los huecos o las inserciones contabilizados como residuos no idénticos.
Los análogos también pueden darse como variaciones alélicas. Una "variación o modificación alélica" es una alteración en la secuencia de ácido nucleico. Tales variaciones o modificaciones pueden deberse a la degeneración del código genético o pueden ser diseñadas genéticamente deliberadamente para proporcionar las características deseadas. Estas variaciones o modificaciones pueden dar o no el resultado de alteraciones en cualquier secuencia de aminoácidos codificada.
El término "agentes efectores" se refiere a moléculas vehículo no proteicas con las que los anticuerpos modificados y/o las cadenas ligeras o pesadas naturales o sintéticas del anticuerpo donante u otros fragmentos del anticuerpo donante se pueden asociar mediante procedimientos convencionales. Tales vehículos no proteicos pueden incluir vehículos convencionales usados en el campo del diagnóstico, p. ej., poliestireno u otras perlas de plástico, polisacáridos, p. ej., como los usados en el sistema BIAcore (Pharmacia) u otras sustancias no proteicas útiles en el campo médico y seguras para la administración a seres humanos y animales. Otros agentes efectores pueden incluir un macrociclo, para quelatar un átomo de metal pesado o radioisótopos. Tales agentes efectores también pueden ser útiles para aumentar la vida media de los anticuerpos modificados, p. ej., el polietilenglicol.
Alternativamente, es posible construir anticuerpos, anticuerpos modificados y fragmentos, mediante la inmunización de una especie no humana (por ejemplo, bovina, ovina, de mono, de pollo, de roedor (p. ej., murina y de rata), etc.) para generar una inmunoglobulina deseable tras la presentación con Nogo nativa de cualquier especie frente a la que los anticuerpos reaccionan de forma cruzada, p. ej., humana o de pollo. Se emplean técnicas de hibridoma convencionales para proporcionar una línea celular de hibridoma que secrete un Acm no humano frente a Nogo. Tales hibridomas pueden se entonces evaluados selectivamente en cuanto a su unión usando placas de 384 ó 96 pocillos revestidas de Nogo, con Nogo biotinilada unida a una placa revestida de estreptavidina o en un inmunoanálisis unido a APC-europio homogéneo usando Nogo biotinilada.
Se puede producir un anticuerpo humano nativo en un ratón con anticuerpos humanos, tal como el "Xenomouse^{TM}" (Abgenix), del que se han retirado los genes de inmunoglobulina de ratón y se han insertado los genes que codifican las inmunoglobulinas humanas en el cromosoma del ratón. Los ratones son inmunizados con normalidad y desarrollan una respuesta de anticuerpos que deriva de los genes humanos. Por tanto, el ratón produce anticuerpos humanos que obvian la necesidad de una humanización tras la selección de hibridomas positivos. (Véase Green L.L., J. Immunol Methods, 1999 Dic 10; 231(1-2):11-23).
La presente invención también incluye el uso de fragmentos Fab o fragmentos F(ab')_{2} derivados de Acm dirigidos frente a Nogo. Un fragmento Fab contiene toda la cadena ligera y la parte amino-terminal de la cadena pesada; y un fragmento F(ab')_{2} es el fragmento formado por dos fragmentos Fab unidos por enlaces tipo disulfuro. Los fragmentos Fab y los fragmentos F(ab')_{2} se pueden obtener mediante procedimientos convencionales, p. ej., escisión de Acm con las enzimas proteolíticas apropiadas, papaína y/o pepsina, o mediante procedimientos recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} son útiles en sí mismos como terapéuticos o profilácticos, y como donantes de secuencias que incluyen las regiones variables y las secuencias de las CDR útiles en la formación de anticuerpos humanizados o recombinantes según lo descrito en la presente memoria.
Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} también pueden ser formados mediante un banco combinatorio de fagos (véase, p. ej., Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994)) o mediante el barajado de cadenas de inmunoglobulina (véase, p. ej., Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992), encontrándose ambos incorporados por referencia en su totalidad.
Por lo tanto, es posible aislar fragmentos de anticuerpo humano (Fv, scFv, Fab) específicos de Nogo usando bancos de despliegue en fagos de fragmentos de anticuerpos humanos. Se criba frente a la proteína Nogo un banco de partículas de bacteriófago, que despliegan las proteínas de fragmentos de anticuerpos humanos. Estos fagos que despliegan fragmentos de anticuerpos que se unen a Nogo son conservados desde el banco y amplificados por clonación. Entonces se separan los genes de anticuerpos humanos del bacteriófago específico y se insertan en los constructos de expresión de IgG humana que contienen las regiones constantes de la IgG humana para formar la molécula de IgG humana intacta con las regiones variables procedentes del bacteriófago aislado específico de Nogo.
Los anticuerpos donantes pueden aportar secuencias, tales como secuencias peptídicas de cadena ligera y/o pesada variable, secuencias marco, secuencias de CDR, fragmentos y análogos funcionales de las mismas, y las secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, útiles en el diseño y la obtención de diversos anticuerpos modificados que se caracterizan por la especificidad de unión antigénica del anticuerpo donante.
Teniendo en cuanta la degeneración del código genético, se pueden construir diversas secuencias codificantes que codifiquen las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada variable, y las secuencias de CDR, así como los fragmentos y análogos funcionales de las mismas, que compartan la especificidad antigénica del anticuerpo donante. Se pueden usar secuencias de ácidos nucleicos aisladas, o fragmentos de las mismas, que codifican las secuencias peptídicas de cadena variable o las CDR para producir anticuerpos modificados, p. ej., anticuerpos humanizados o quiméricos, u otros anticuerpos diseñados genéticamente cuando estén combinados operativamente con una segunda pareja de inmunoglobulina.
Las moléculas de inmunoglobulina modificadas pueden codificar anticuerpos modificados que incluyan anticuerpos diseñados genéticamente, tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Una región que codifica una inmunoglobulina modificada deseada contiene regiones que codifican las CDR que codifican péptidos que tienen la especificidad antigénica de un anticuerpo anti-Nogo, preferiblemente, un anticuerpo de alta afinidad, insertadas en una primera pareja de inmunoglobulina (una región variable de inmunoglobulina humana o una región marco
humana).
Preferiblemente, la primera pareja de inmunoglobulina está unida operativamente con una segunda pareja de inmunoglobulina. La segunda pareja de inmunoglobulina se define anteriormente, y puede incluir una secuencia que codifica una segunda región de anticuerpo de interés, por ejemplo, una región de Fc. Las segundas parejas de inmunoglobulina también pueden incluir secuencias que codifican otra inmunoglobulina con la que la región constante de cadena ligera o pesada está fusionada en marco o por medio de una secuencia ligadora. Se pueden crear anticuerpos diseñados genéticamente dirigidos frente a fragmentos o análogos funcionales de Nogo para aumentar la unión.
La segunda pareja de inmunoglobulina también puede estar asociada con agentes efectores según lo definido anteriormente, incluyendo moléculas vehículo no proteicas, con las que la segunda pareja de inmunoglobulina puede estar unida operativamente mediante procedimientos convencionales.
La fusión o el enlace entre las segundas parejas de inmunoglobulina, p. ej., secuencias de anticuerpo y el agente efector puede ser mediante cualquier procedimiento adecuado, p. ej., mediante enlaces covalentes o iónicos convencionales, fusiones de proteínas o ligadores cruzados hetero-bifuncionales, p. ej., carbodiimida, glutaraldehído y similares. Tales técnicas son conocidas en la técnica, y se describen fácilmente en los análisis de Química y Bioquímica convencionales.
Además, también se pueden construir secuencias ligadoras convencionales que simplemente proporcionan una cantidad deseada de espacio entre la segunda pareja de inmunoglobulina y el agente efector dentro de la región que codifica la inmunoglobulina modificada. El diseño de tales ligadores es conocido por aquéllos expertos en la técnica. En otros aspectos de la invención, se proporcionan fragmentos divalentes (divalentes o biespecíficos), fragmentos trivalentes, fragmentos tetravalentes y otras especies proteicas de scFv multivalentes que tienen una o más CDR según lo descrito anteriormente que se unen con y neutralizan la función de las Nogo.
En otra realización más, el anticuerpo de la invención puede tener unido otro agente. Por ejemplo, se puede usar el procedimiento de tecnología de ADN recombinante para producir un anticuerpo diseñado genéticamente de la invención en el que el fragmento Fc o el dominio CH2-CH3 de una molécula de anticuerpo de longitud completa haya sido reemplazado por una enzima y otra molécula detectable (i.e., una molécula efectora o indicadora polipeptídica).
La segunda pareja de inmunoglobulina también puede estar unida operativamente con un péptido de no inmunoglobulina, una proteína de no inmunoglobulina o un fragmento de los mismos heterólogo a la secuencia que contiene las CDR que tiene la especificidad antigénica del anticuerpo anti-Nogo. La proteína resultante puede presentar tanto especificidad antigénica anti-Nogo como características de la no inmunoglobulina tras la expresión. Esta característica de la pareja de fusión puede ser, p. ej., una característica funcional, tal como otro dominio de unión o receptor, o una característica terapéutica si la pareja de fusión es una proteína terapéutica, u otras características antigénicas.
Otra proteína deseable de esta invención puede comprender una molécula de anticuerpo de longitud completa que tenga cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, o cualquier fragmento diferenciado de las mismas, tal como los fragmentos Fab o F(ab')_{2}, un dímero de cadena pesada o cualquiera de sus fragmentos recombinantes mínimos, tales como un Fv o un anticuerpo monocatenario (SCA) o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el Acm donante seleccionado. Tal proteína se puede usar en forma de un anticuerpo modificado, o se puede usar en su forma no fusionada.
Siempre que la segunda pareja de inmunoglobulina derive de un anticuerpo diferente del anticuerpo donante, p. ej., cualquier isotipo o clase de regiones marco o constantes de inmunoglobulina, se produce un anticuerpo diseñado genéticamente. Los anticuerpos diseñados genéticamente pueden comprender regiones constantes y regiones marco variables de inmunoglobulina (Ig) de una fuente, p. ej., el anticuerpo aceptor, y una o más (preferiblemente, todas) las CDR del anticuerpo donante. Además, se pueden hacer modificaciones, p. ej., eliminaciones, sustituciones o adiciones, de la región marco del dominio variable de cadena ligera y/o pesada del Acm aceptor a nivel de ácido nucleico o de aminoácidos, o se pueden formar las regiones CDR donantes para que conserven la especificidad de unión antigénica del anticuerpo donante.
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Tales anticuerpos diseñados genéticamente son diseñados para emplear una (o ambas) cadenas pesadas y/o ligeras variables del Acm anti-Nogo, o una o más de las CDR de cadena pesada o ligera. Los anticuerpos diseñados genéticamente pueden ser neutralizantes, según lo definido anteriormente.
Tales anticuerpos diseñados genéticamente pueden incluir un anticuerpo humanizado que contenga las regiones marco de una inmunoglobulina humana seleccionada o un subtipo, o un anticuerpo quimérico que contenga las regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas fusionadas con los fragmentos funcionales del anticuerpo anti-Nogo. Un anticuerpo aceptor humano (o de otro animal) adecuado puede ser uno seleccionado de una base de datos convencional, p. ej., la base de datos KARAT®, la base de datos de Los Alamos, la base de datos suiza de proteínas, por homología con las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del anticuerpo donante. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología con las regiones marco del anticuerpo donante (en base a los aminoácidos) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de cadena pesada y/o una región marco variable de cadena pesada para la inserción de las CDR del donante. Del mismo modo, es posible seleccionar un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar las regiones marco variables y constantes de cadena ligera. Cabe destacar que no es necesario que las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo aceptor procedan del mismo anticuerpo aceptor.
Es deseable que las regiones constantes y marco heterólogas se seleccionen de las clases y los isótopos de inmunoglobulina humana, tales como la IgG (subtipos 1 a 4), IgM, IgA y IgE. Sin embargo, el anticuerpo aceptor necesita no comprender sólo las secuencias de proteína inmunoglobulina humana. Por ejemplo, se puede crear un gen en el que una secuencia de ADN que codifica parte de una cadena de inmunoglobulina humana esté fusionada con una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de no inmunoglobulina, tal como una molécula efectora o indicadora polipeptídica.
Preferiblemente, en un anticuerpo humanizado, los dominios variables de tanto las cadenas ligeras como pesadas humanas han sido diseñados genéticamente mediante uno o más reemplazos de CDR. Es posible usar las seis CDR, o diversas combinaciones de menos de las seis CDR. Preferiblemente, se reemplazan las seis CDR. Es posible reemplazar las CDR sólo en la cadena pesada humana, usando como cadena ligera la cadena ligera sin modificar del anticuerpo aceptor humano. Alternativamente, se puede seleccionar una cadena ligera compatible de otro anticuerpo humano recurriendo a las bases de datos de anticuerpos convencionales. El resto del anticuerpo diseñado genéticamente puede ser derivado de cualquier inmunoglobulina humana aceptora adecuada.
El anticuerpo humanizado diseñado genéticamente tiene, por tanto, preferiblemente, la estructura de un anticuerpo humano natural o un fragmento del mismo, y posee la combinación de las propiedades necesarias para un uso terapéutico eficaz.
Los expertos en la técnica entenderán que es posible modificar un anticuerpo diseñado genéticamente mediante cambios en los aminoácidos de los dominios variables sin afectar necesariamente a la especificidad y a la afinidad elevada del anticuerpo donante (i.e., un análogo). Se anticipa que los aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras pueden ser sustituidos por otros aminoácidos bien en los marcos de dominio variable o en las CDR, o en ambos.
Además, es posible modificar la región constante para aumentar o disminuir las propiedades selectivas de las moléculas de la presente invención. Por ejemplo, la dimerización, la unión con receptores Fc o la capacidad para unirse y activar complementos (véase, p. ej., Angal et al., Mol. Immunol, 30:105-108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem, 269:3469-3474 (1994), Winter et al., EP 307,434-B).
Un anticuerpo modificado que sea un anticuerpo quimérico difiere de los anticuerpos humanizados descritos anteriormente proporcionando las regiones variables enteras de cadena pesada y ligera del anticuerpo donante no humano, incluyendo las regiones marco, en asociación con las regiones constantes de inmunoglobulina de otra especie, preferiblemente, la especie humana para ambas cadenas.
Preferiblemente, las secuencias de las cadenas ligeras y/o pesadas variables y las CDR de los Acm donantes adecuados, y sus secuencias de ácidos nucleicos codificantes, se utilizan en la creación de anticuerpos modificados, preferiblemente, anticuerpos humanizados, de esta invención, mediante los siguientes procedimientos. También se pueden emplear las mismas técnicas o técnicas similares para generar otras realizaciones de esta invención.
Se clona convencionalmente un hibridoma productor de un Acm donante seleccionado, y se obtiene el ADN de sus regiones variables de cadena pesada y ligera mediante técnicas conocidas por el experto en la técnica, p. ej., las técnicas descritas en Sambrook et al., ("Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", II edición, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Las regiones variables de cadena pesada y ligera que contienen al menos las regiones que codifican las CDR y aquellas partes de las regiones marco de dominio variable de cadena ligera y/o pesada del Acm aceptor necesarias para conservar la especificidad de unión del Acm donante, así como el resto de partes derivadas de la inmunoglobulina de la cadena de anticuerpo derivada de una inmunoglobulina humana, se obtienen usando cebadores de polinucleótido y transcriptasa inversa. Las regiones que codifican las CDR se identifican usando una base de datos conocida y mediante la comparación con otros anticuerpos.
Entonces se puede preparar un anticuerpo quimérico humano/de ratón y analizarlo en cuanto a su capacidad de unión. Tal anticuerpo quimérico contiene las regiones VH y VL completas del anticuerpo donante no humano, en asociación con las regiones constantes de Ig humana para ambas cadenas.
Las regiones marco homólogas de una región variable de cadena pesada de un anticuerpo humano se pueden identificar usando bases de datos informatizadas, p. ej., KABAT®, y se seleccionará un anticuerpo humano que tenga homología con el anticuerpo donante como anticuerpo aceptor. Del mismo modo, es posible diseñar una región marco variable de cadena ligera adecuada.
Se puede formar un anticuerpo humanizado a partir del anticuerpo quimérico, o preferiblemente, elaborarlo sintéticamente mediante la inserción de las regiones que codifica las CDR del Acm donante procedentes de cadenas pesadas y ligeras apropiadamente en el marco de cadena pesada y cadena ligera seleccionado. Alternativamente, se puede formar un anticuerpo humanizado usando técnicas de mutagénesis estándar. De este modo, el anticuerpo humanizado resultante contiene las regiones marco humanas y las regiones que codifican las CDR del Acm donante. Puede haber una manipulación posterior de los residuos del marco. El anticuerpo humanizado resultante puede ser expresado en células huésped recombinantes, p. ej., células COS, CHO o de mieloma.
Se produce un vector de expresión o un plásmido recombinante convencional colocando estas secuencias que codifican el anticuerpo en asociación operativa con las secuencias control reguladoras convencionales capaces de controlar la replicación y la expresión en, y/o la secreción desde, una célula huésped. Las secuencias reguladoras incluyen secuencias promotoras, p. ej., el promotor del CMV, y secuencias señal, que pueden ser derivadas de otros anticuerpos conocidos. De manera similar, se puede producir un segundo vector de expresión que tenga una secuencia de ADN que codifique una cadena pesada o ligera de anticuerpo complementaria. Preferiblemente, este segundo vector de expresión es idéntico al primero, a excepción en lo que se refiere a las secuencias codificantes y los marcadores seleccionables, para garantizar en la medida de lo posible que cada cadena de polipéptido sea expresada funcionalmente. Alternativamente, las secuencias que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo modificado pueden residir en un solo vector.
Se con-transfecta una célula huésped seleccionada mediante técnicas convencionales con tanto el primer como el segundo vector (o se transfectan simplemente mediante un solo vector) para crear la célula huésped transfectada de la invención que comprende ambas cadenas ligeras y pesadas recombinantes o sintéticas. Entonces se cultiva la célula transfectada mediante técnicas convencionales para producir el anticuerpo diseñado genéticamente de la invención. El anticuerpo que incluye la asociación de la cadena pesada y/o cadena ligera recombinante es examinado desde el cultivo mediante un análisis apropiado, tal como ELISA o RIA. Se pueden emplear técnicas convencionales similares para crear otros anticuerpos y otras moléculas modificados.
El experto en la técnica puede seleccionar los vectores adecuados para las etapas de clonación y la subclonación empleadas en los procedimientos y en la elaboración de las composiciones de esta invención. Se puede usar, por ejemplo, la serie pUC convencional de vectores de clonación. Hay un vector, pUC19, que se encuentra comercialmente disponible en casas de suministro tales como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Además, para la clonación, se puede usar cualquier vector que sea capaz de replicarse fácilmente, tenga una abundancia de sitios de clonación y genes seleccionables (p. ej., de resistencia a antibióticos) y pueda ser manipulado fácilmente. De este modo, la selección del vector de clonación no es un factor limitante de esta invención.
De manera similar, los vectores empleados para la expresión de los anticuerpos pueden ser seleccionados por cualquier experto en la técnica a partir de cualquier vector convencional. Los vectores también contienen secuencias reguladoras seleccionadas (tales como promotores de CMV o RSV), que dirigen la replicación y la expresión de secuencias de ADN heterólogas en células huésped seleccionadas. Estos vectores contienen las secuencias de ADN descritas anteriormente que codifican el anticuerpo o la región que codifica la inmunoglobulina modificada. Además, los vectores pueden incorporar las secuencias de inmunoglobulina seleccionadas modificadas por la inserción de los sitios de restricción deseables para su fácil manipulación.
Los vectores de expresión también se pueden caracterizar por genes adecuados para amplificar la expresión de secuencias de ADN heterólogas, p. ej., el gen de la dihidrofolato-reductasa de mamífero (DHFR). Otras secuencias de vectores preferibles incluyen la secuencia de la señal poly(A), tal como la de la hormona de crecimiento bovino (BGH) y la secuencia promotora de la betaglobina (betaglopro). Los vectores de expresión útiles en la presente memoria pueden ser sintetizados mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
Los componentes de tales vectores, p. ej., los replicones, los genes de selección, los potenciadores, los promotores, las secuencias señal y similares, se pueden obtener de fuentes comerciales o naturales, o pueden ser sintetizados mediante procedimientos conocidos para su uso en la dirección de la expresión y/o la secreción del producto del ADN recombinante en un huésped seleccionado. Se pueden seleccionar a este efecto otros vectores de expresión apropiados de los que se conocen numerosos tipos en la técnica para la expresión de mamífero, bacteriana, de insecto, de levadura y de hongo.
También se describe en la presente memoria una línea celular transfectada con un plásmido recombinante que contiene las secuencias que codifican los anticuerpos o las moléculas de inmunoglobulina modificadas de los mismos. Las células huésped útiles para la clonación u otras manipulaciones de estos vectores de clonación también son las convencionales. Sin embargo, lo más deseable es el uso de células de diversas cepas de E. coli para la replicación de los vectores de clonación y otras etapas de la elaboración de los anticuerpos modificados de esta invención.
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Las células huésped o líneas celulares adecuadas para la expresión del anticuerpo de la invención son preferiblemente células de mamífero, tales como NS0, Sp2/0, CHO (p. ej., DG44), COS, una célula fibroblástica (p. ej., 3T3) y células de mieloma, y más preferiblemente, una célula CHO o de mieloma. Se pueden usar células humanas que permitan, por tanto, la modificación de la molécula con patrones de glicosilación humanos. Alternativamente, se pueden emplear otras líneas celulares eucariotas. La selección de las células huésped de mamífero adecuadas y de los procedimientos para la transformación, el cultivo, la amplificación, la evaluación selectiva y la generación y purificación de los productos son conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Sambrook et al., citado anteriormente.
Las células bacterianas pueden ser útiles como células huésped adecuadas para la expresión de los Fab recombinantes de la presente invención (véase, p. ej., Plückthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992)). Sin embargo, debido a la tendencia de las proteínas expresadas en células bacterianas a estar en una forma no plegada o plegada incorrectamente, o en una forma no glicosilada, cualquier Fab recombinante producido en una célula bacteriana tendría que ser evaluado selectivamente en cuanto a la conservación de su capacidad de unión antigénica. Si la molécula expresada por la célula bacteriana fuera producida de una forma plegada apropiadamente, la célula bacteriana sería un huésped deseable. Por ejemplo, diversas cepas de E. coli usadas para la expresión son conocidas como células huésped en el campo de la Biotecnología. También se pueden emplear en este procedimiento diversas cepas de B. subtilis, Streptomyces, otros bacilos y similares.
Cuando se desee, las cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica también se encuentran disponibles como células huésped, así como las células de insecto, p. ej., Drosophila y Lepidoptera, y los sistemas de expresión vírica. Véase, p. ej., Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) y las referencias citadas en esa memoria.
Los procedimientos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los procedimientos de transfección necesarios para producir las células huésped de la invención y los procedimientos de cultivo necesarios para producir el anticuerpo de la invención a partir de tal célula huésped son todos técnicas convencionales. Comúnmente, el procedimiento de cultivo de la presente invención es un procedimiento de cultivo libre de suero, habitualmente, mediante el cultivo de células libres de suero en suspensión. Asimismo, uno vez producidos, los anticuerpos de la invención pueden ser purificados de sus contenidos de cultivo celular según procedimientos estándar de la técnica, que incluyen la precipitación en sulfato de amonio, las columnas de afinidad, la cromatografía en columna, la electroforesis sobre gel y similares. Tales técnicas pertenecen al alcance de la técnica y no limitan esta invención. Por ejemplo, en los documentos WO 99/58679 y WO 96/16990, se describe la preparación de anticuerpos modificados.
Otro procedimiento de expresión más de los anticuerpos puede utilizar la expresión en un animal transgénico, tal como la descrita en la patente estadounidense n.º: 4.873.316. Esta se refiere a un sistema de expresión que usa el promotor de la caseína de un animal que cuando se incorpora transgénicamente a un mamífero permite que la hembra produzca la proteína recombinante deseada en su leche.
Una vez expresado mediante el procedimiento deseado, el anticuerpo es examinado en cuanto a su actividad in vitro mediante el uso de un análisis apropiado. Actualmente, se emplean formatos de análisis ELISA convencionales para evaluar la unión cualitativa y cuantitativa del anticuerpo con Nogo. Además, se pueden usar otros análisis in vitro para verificar la eficacia neutralizadora antes de los estudios clínicos posteriores en seres humanos realizados para evaluar la persistencia del anticuerpo en el cuerpo humano a pesar de los mecanismos de aclaramiento habituales.
Los agentes terapéuticos de esta invención pueden ser administrados como un profiláctico o tras una apoplegía/la aparición de síntomas clínicos, o cuando se necesiten por otra causa. La dosis y la duración del tratamiento se refieren a la duración relativa de las moléculas de la presente invención en el sistema circulatorio humano, y pueden ser ajustadas por cualquier experto en la técnica en función de la afección que esté siendo tratada y del estado de salud general del paciente. Se prevé que es posible la necesidad de una dosificación repetida (p. ej., una vez a la semana o una vez cada dos semanas) durante un período de tiempo prolongado (p. ej., de cuatro a seis meses) para alcanzar la máxima eficacia terapéutica.
El modo de administración del agente terapéutico de la invención puede ser cualquier vía adecuada que haga llegar el agente al huésped. Los antagonistas y los anticuerpos, y las composiciones farmacéuticas de la invención, son particularmente útiles para la administración parenteral, i.e., subcutánea, intratecal, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa o intranasalmente, de entre las que se prefiere particularmente la administración intravenosa.
Los agentes terapéuticos de la invención se pueden preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del anticuerpo de la invención como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En el agente profiláctico de la invención, se prefiere una suspensión o una solución acuosa que contenga el anticuerpo diseñado genéticamente, preferiblemente, tamponada a un pH fisiológico, en una forma lista para ser inyectada. Las composiciones para la administración parenteral comprenderán comúnmente una solución del anticuerpo de la invención, o un cóctel de la misma, disuelta en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente, en un vehículo acuoso. Se puede emplear una variedad de vehículos acuosos, p. ej., solución salina al 0,9%, glicina al 0,3% y similares. Estas soluciones son estériles y están generalmente libres de materia particulada. Estas soluciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas convencionales de esterilización conocidas (p. ej., mediante filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según lo requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste del pH y de tamponamiento, etc. La concentración del antagonista o del anticuerpo de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, i.e., desde menos del aproximadamente 0,5%, habitualmente a o al menos aproximadamente el 1%, hasta tanto como del 15 o el 20% en peso, y será seleccionada fundamentalmente en base a los volúmenes del fluido, las viscosidades, etc., según el modo de administración seleccionado en particular.
De este modo, se podría preparar una composición farmacéutica de la invención para su inyección intramuscular para que contuviera 1 ml de agua tamponada estéril y entre aproximadamente 1 ng hasta aproximadamente 100 mg, p. ej., de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg, o más preferiblemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg, de un anticuerpo de la invención. De manera similar, se podría elaborar una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa para que contuviera aproximadamente 250 ml de solución de Ringer estéril y aproximadamente 1 a aproximadamente 30, y preferiblemente, de 5 mg a 25 mg de un anticuerpo diseñado genéticamente de la invención. Los procedimientos reales para preparar composiciones administrables parenteralmente son conocidos y serán evidentes para los expertos en la técnica, y se describen más detalladamente en, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Science", XV ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania. Para la preparación de las formulaciones de anticuerpo administrables intravenosamente de la invención, véase Lasmar U. y Parkins D., "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci. Tech. today, páginas 129-137, Vol. 3 (3 de abril de 2000), Wang, W., "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, "Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B", ed Ahern T. J., Manning M.C., Nueva York, NY: Plenum Press (1992), Akers, M. J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm. Sci. 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K. et al., "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J. Pharm. Sci. 92 (2003) 266-274, Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J. Pharm. Pharmacol., 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci., 91 (2002) 914-922. Ha, E. Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264, (2002), cuyos contenidos completos se incorporan en la presente memoria por referencia y hacia los que el lector es específicamente dirigido.
Es preferible que el agente terapéutico de la invención, cuando se encuentre en una preparación farmacéutica, esté presente en formas de dosificación unitarias. La dosis terapéuticamente eficaz apropiada puede ser fácilmente determinada por los expertos en la técnica. Para tratar eficazmente la apoplegía y otras enfermedades neurológicas según lo descrito más adelante en un ser humano, se debería administrar una dosis de hasta 700 mg para un peso corporal de 70 kg de un anticuerpo de esta invención parenteralmente, preferiblemente, i.v. o i.m. (intramuscularmente). Tal dosis puede, si fuera necesario, ser repetida a los intervalos de tiempo apropiados seleccionados según lo apropiado por un médico. Según lo revelado en los ejemplos, los presentes inventores han sido capaces de demostrar un efecto positivo sobre la recuperación funcional en el modelo de ratas al que se administraron los anticuerpos de la invención intravenosamente.
Los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden estar liofilizados para su almacenamiento y ser reconstituidos en un vehículo adecuado antes de su uso. Se ha demostrado la eficacia de esta técnica con inmunoglobulinas convencionales, y se pueden emplear las técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica.
También se pueden usar anticuerpos de la invención en combinación (i.e., simultáneamente, consecutivamente o por separado) con un factor neurotrófico tal como un factor de crecimiento nervioso (NGF), por ejemplo, factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), agentes anti-inflamatorios, tales como corticosteroides y/o tPA. Las combinaciones de un anticuerpo frente a Nogo-A de la invención y, p. ej., tPA, se pueden evaluar en el modelo de OACM expuesto en los ejemplos que figuran más adelante.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-Nogo-A de la presente invención, o un fragmento o análogo funcional del mismo, y un diluyente o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-Nogo-A de la presente invención, o un fragmento funcional del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para inhibir la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente humano que padece, o tiene riesgo de desarrollar, una apoplegía u otra enfermedad neurológica.
El fragmento funcional de anticuerpo, o un análogo del mismo, según la invención se puede utilizar en un procedimiento para el tratamiento o la profilaxis de la apoplegía (particularmente, la apoplegía isquémica) y otras enfermedades/trastornos neurológicos según lo descrito más adelante, en particular, la enfermedad de Alzheimer, en un ser humano, procedimiento que comprende la administración a dicho ser humano en necesidad del mismo de una cantidad eficaz de anticuerpo anti-Nogo-A, o un fragmento o análogo funcional del mismo. Los anticuerpos de la invención se pueden usar en procedimientos de tratamiento para ralentizar o detener la progresión y/o la aparición de la enfermedad de Alzheimer además del (o como una alternativa al) tratamiento de la enfermedad establecida en un paciente
humano.
Otro aspecto más de la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-Nogo-A, o un fragmento o análogo funcional del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de la apoplegía y otras enfermedades/trastornos neurológicos según lo descrito más adelante, en concreto, la enfermedad de Alzheimer.
El fragmento funcional de anticuerpo, o un análogo del mismo, según la invención se puede utilizar en un procedimiento para inhibir la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente que padezca, o esté en riesgo de desarrollar, una apoplegía u otra enfermedad/trastorno neurológico según lo descrito más adelante, en particular, la enfermedad de Alzheimer, procedimiento que comprende la administración a dicho ser humano en necesidad del mismo de una cantidad eficaz de anticuerpo anti-Nogo-A, o un fragmento o análogo funcional del mismo.
Además, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-Nogo-A, o un fragmento o análogo funcional del mismo, en la preparación de un medicamento para inhibir la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente humano afectado con, o con riesgo de desarrollar, una apoplegía y otra enfermedad/trastorno neurológico según lo expuesto más adelante, en concreto, la enfermedad de Alzheimer.
Las enfermedades o los trastornos neurológicos, como se usa anteriormente en la presente memoria, incluyen, pero no se limitan a, la lesión cerebral traumática, la lesión de la médula espinal, las demencias fronto-temporales (tautopatías), la neuropatía periférica, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington, la esclerosis múltiple y, en concreto, la enfermedad de Alzheimer.
La invención también proporciona un procedimiento in vitro de promoción del brote axonal que comprende la etapa de poner en contacto un axón humano con un anticuerpo anti-Nogo-A.
Como se usa en la presente memoria, el término "recuperación funcional" se refiere a una mejoría motora y/o sensorial y/o del comportamiento en un sujeto tras, p. ej., un hecho o una lesión isquémica o la aparición de síntomas clínicos. Es posible evaluar la recuperación funcional en seres humanos con instrumentos diseñados para medir las funciones neurológicas elementales, tales como, la resistencia motora, la sensibilidad y la coordinación; las funciones cognitivas, tales como la memoria, el lenguaje y la capacidad para seguir instrucciones; y las capacidades funcionales, tales como la actividades de la vida cotidiana o actividades instrumentales. La recuperación de la función neurológica elemental se puede medir con instrumentos, tales como la escala para la apoplegía del NIH (NIHSS); la recuperación de la función cognitiva se puede medir con pruebas neuropsicológicas, tales como el test de denominación de Boston, el test del trazo y el test de aprendizaje verbal de California; y las actividades de la vida cotidiana se pueden evaluar con instrumentos, tales como la escala ADCS/ADL (estudios clínicos de la enfermedad de Alzheimer/actividades de la vida cotidiana) o la escala de las actividades de la vida cotidiana de Bristol, siendo todos las pruebas y todas las escalas conocidas en la técnica.
Los siguientes ejemplos ilustran pero no limitan la invención.
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Ejemplificación Ejemplo 1 Preparación y selección de los hibridomas
Los anticuerpos monoclonales anti-Nogo-A son producidos por células de hibridoma, el resultado de la fusión de células de mieloma de ratón con linfocitos B de ratones humanizados con el antígeno diana. La célula de hibridoma es inmortalizada por la pareja de fusión del mieloma, mientras que la capacidad para producir anticuerpos es proporcionada por el linfocito B. Cada célula de hibridoma crea sólo un anticuerpo individual con una especificidad única, de ahí, el término monoclonal.
Se inmunizaron ratones SJL con 10 \mug de proteína total (1:1, empalme de Nogo-A humana (aminoácidos 186-1004) y empalme de Nogo-A de rata (aminoácidos 173-975) producidos como proteínas de fusión con GST en BL21 de E. Coli) usando los adyuvantes CFA y RIBI subcutáneamente. Los ratones recibieron entonces otra dosis de 5 \mug de las mismas proteínas usando adyuvante RIBI tras 4 y 8 días. Tras otros 3 días más, se cosecharon las células inmunes de los nódulos linfáticos localmente drenantes y se fusionaron con células de mieloma de ratón usando PEG1500 para generar hibridomas. Se clonaron las líneas celulares de los hibridomas individuales en dos series de dilución limitante. Mediante la inmunización de los ratones con Nogo-A tanto humana como de rata, se pueden elevar los anticuerpos que tengan una buena especificidad de unión y/o afinidad de unión tanto por la Nogo-A de rata como por la humana. Esto, a su vez, permite la evaluación de tales anticuerpos en modelos de rata y/o roedor antes de su administración a un ser humano.
La selección de los anticuerpos de los hibridomas iniciales se realizó en base a la unión directa de la(s) proteína(s)
Nogo sobre las placas de microvaloración. Posteriormente, se seleccionaron aproximadamente 60 hibridomas en base a la capacidad de la proteína soluble (constituida por la secuencia de Nogo-A humana escindida del resto de GST usando la proteasa Prescission^{TM}) para competir por esta actividad de unión en los análisis de ELISA.
Ejemplo 2 Clonación de las regiones variables
Se extrajo ARN total de las células de los hibridomas 2A10/3, 2C4/1 y 15C3/3 seleccionados, tras lo que se realizó una transcripción inversa y una reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para extraer la secuencia de ADNc de dominio variable de cadena pesada y ligera. El cebador directo para la RT-PCR fue una mezcla de los cebadores degenerados específicos de las secuencias líder del gen murino de inmunoglobulina y el cebador inverso fue un anticuerpo específico de un isotipo dirigido frente a las regiones constantes. Los cebadores PCR fueron diseñados para que portaran sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción en 5' que permitieran la clonación en pUC19 para la secuenciación del ADN.
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Extracción del ARN
El ARN total fue extraído de sedimentos de 10^{6} células de cada clon de hibridoma usando un sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega según las instrucciones del fabricante.
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Transcripción inversa
Se transcribió inversamente el ARN para producir ADNc de los dominios variables de cadena pesada y ligera usando cebadores directos específicos de las secuencias líder murinas y cebadores inversos para las regiones constantes de la IgGk murina. Para los hibridomas 2C4/1 y 15C3/3, se usó el cebador inverso de IgG\gamma1; y para 2A10/3, el de IgG\gamma2b. Los cebadores directos portan un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Sall en el extremo 5', con cuatro nucleótidos más añadidos en 5' con respecto a éste para una digestión por restricción eficaz. Estos cebadores fueron adaptados a partir de Jones S.T. y Bendig M.M. 1991 (Biotechnology 9, 88-89). Los cebadores inversos portan un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xmal más cuatro nucleótidos en los extremos 5'.
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Cebadores Cebadores directos de las secuencias líder de los V_{H} murinos
AG77: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA ATG CAG CTG GGT CAT STT CTT C-3' (SEC ID N.º 51)
AG78: 5'-ACT AGT CGA CAT GGG ATG GAG CTR TAT CAT SYT CTT-3' (SEC ID N.º 52)
AG79: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA GWT GTG GTT AAA CTG GGT TTT T-3' (SEC ID N.º 53)
AGBO: 5'-ACT AGT CGA CAT GRA CTT TGG GYT CAG CTT GRT TT-3' (SEC ID N.º 54)
AG81: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA CTC CAG GCT CAA TTT AGT TTT CCT T-3' (SEC ID N.º 55)
AG82: 5'-ACT AGT CGA CAT GGC TGT CYT RGS GCT RCT CTT CTG C-3' (SEC ID N.º 56)
AG83: 5'-ACT AGT CGA CAT GGR ATG GAG CKG GRT CTT TMT CTT-3' (SEC ID N.º 57)
AG84: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG AGT GCT GAT TCT TTT GTG-3' (SEC ID N.º 58)
AG85: 5'-ACT AGT CGA CAT GGM TTG GGT GTG GAM CTT GCT ATT CCT G-3' (SEC ID N.º 59)
AG86: 5'-ACT AGT CGA CAT GGG CAG ACT TAC ATT CTC ATT CCT G-3' (SEC ID N.º 60)
AG87: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA TTT TGG GCT GAT TTT TTT TAT TG-3' (SEC ID N.º 61)
AG89: 5'-ACT AGT CGA CAT GAT GGT GTT AAG TCT TCT GTA CCT G-3' (SEC ID N.º 62) 
\newpage
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Cebadores directos de las secuencias líder de los V_{L} murinos
AG90: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT GGT GCT G-3' (SEC ID N.º 63)
AG91: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA GWC AGA CAC ACT CCT GYT ATG GGT-3' (SEC ID N.º 64)
AG92: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG TGT GCT CAC TCA GGT CCT GGC GTT G-3' (SEC ID N.º 65)
AG93: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG GRC CCC TGC TCA GWT TYT TGG MWT CTT G-3' 
\,
(SEC ID N.º 66)
AG94: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C-3' (SEC ID N.º 67)
AG95: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG GTK CYY TGY TSA GYT YCT GRG G-3' (SEC ID N.º 68)
AG96: 5'-ACT AGT CGA CAT GGG CWT CAA GAT GGA GTC ACA KWY YCW GG-3' (SEC ID N.º 69)
AG97: 5'-ACT AGT CGA CAT GTG GGG AYC TKT TTY CMM TTT TTC AAT TG-3' (SEC ID N.º 70)
AG98: 5'-ACT AGT CGA CAT GGT RTC CWC ASC TCA GTT CCT TG-3' (SEC ID N.º 71)
AG99: 5'-ACT AGT CGA CAT GTA TAT ATG TTT GTT GTC TAT TTC T-3' (SEC ID N.º 72)
AG100: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA AGC CCC AGC TCA GCT TCT CTT CC-3' (SEC ID N.º 73)
MKV12: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA GTT TCC TTC TCA ACT TCT GCT C-3' (SEC ID N.º 74) 
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Cebador inverso de la región constante \gamma_{1} murina
AG102: 5'-GGA TCC CGG GCC AGT GGA TAG ACA GAT G-3' (SEC ID N.º 75) 
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso de la región constante \gamma2b murina
AG104: 5'-GGA TCC CGG GAG TGG ATA GAC TGA TGG-3' (SEC ID N.º 76) 
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Cebador inverso de la región constante \kappa murina
AG101: 5'-GGA TCC CGG GTG GAT GGT GGG AAG ATG-3' (SEC ID N.º 77) 
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon mezclas de los cebadores directos de las secuencias líder de los V_{H} o V_{L} murinos a 50 \muM. También se prepararon soluciones de los cebadores inversos de las regiones constantes \gamma o \kappa murinas a 50 \muM.
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PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Se llevó a cabo una transcripción inversa del ARN que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera por duplicado usando el sistema de RT-PCR Access de Promega según las instrucciones del fabricante. Se incluyeron aproximadamente 200 ng de ARN en 50 \mul de reacción que contenía tampón de RT-PCR suministrado, dNTP 0,2 mM, 1 \muM de cada conjunto de cebadores, MgSO_{4} 1 \muM y 5 U de transcriptasa inversa de AMV y 5 U de ADN polimerasa de Tfl.
Ciclo de RT-PCR:
1-48ºC durante 45 min.
\quad
2-94ºC durante 2 min.
\quad
3-94ºC durante 30 s.
\quad
4-50ºC durante 1 min.
\quad
5-68ºC durante 2 min.
\quad
6-68ºC durante 7 min.
\quad
etapas 3 a 5: repetición 30 veces.
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Clonación en pUC19
Se purificaron los productos de la RT-PCR de las regiones variables usando un equipo de purificación de PCR Qiagen de Qiagen MinElute según sus instrucciones y se digirieron consecutivamente con Xmal y Sall de New England Biolabs según las instrucciones del fabricante. Entonces fueron cargados en un gel de agarosa al 1% preparativo que contenía bromuro de etidio al 0,5% y se trataron en un tampón de TAE a 50 mA durante 1 hora, siendo las bandas de las regiones V fueron escindidas bajo luz ultravioleta. Se purificaron los fragmentos de ADN del gel usando un equipo de extracción sobre gel MinElute de Quiagen según las instrucciones del fabricante. Se prepararon los brazos del vector pUC19 mediante la digestión de pUC19 con Sall y Xmal, luego se purificaron usando el equipo de limpieza de reacciones MinElute de Qiagen y se desfosforilaron usando fosfatasa alcalina de gamba (USB) según las instrucciones del fabricante. Se estimó la concentración de los brazos del vector y los fragmentos de las regiones V desde un gel de agarosa al 1%/bromuro de etidio analítico, se mezclaron en una proporción molar de 1:2 y se unieron usando un equipo de unión rápida de Promega según las instrucciones del fabricante. Se transformaron los plásmidos unidos en células DH5a (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron colonias desarrolladas en placas de L-agar que contenían 100 \mug/ml de ampicilina para el análisis de las secuencias de ADN.
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Secuenciación de las regiones variables
Se cultivaron colonias durante una noche a 37ºC en 5 ml de medio LB complementado con 100 \mug/ml de ampicilina, y se extrajo y purificó el ADN plasmídico usando el equipo QIAprep Spin Miniprep de Qiagen según las instrucciones del fabricante. Se secuenció el ADN de las regiones V_{H} y V_{L} usando cebadores directos e inversos de M13 estándar. Los resultados de la determinación de la secuenciación se muestran en las SEC ID N.º 43 a 48.
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Ejemplo 3 Anticuerpos anti-Nogo-A recombinantes
Se pudieron purificar anticuerpos recombinantes que tenían regiones constantes 2a/k murinas de células transfectadas con plásmidos que comprendían las regiones variables de cadena ligera y pesada clonadas en segmentos génicos de regiones constantes IgG2a/k de ratón. Se amplificaron las regiones V murinas clonadas por PCR para introducir los sitios de restricción necesarios para la clonación en vectores de expresión de mamífero de RId y RIn. Los sitios de HindIII y SpeI fueron diseñados en marco con el dominio V_{H} para permitir la clonación en el vector RId modificado que contenía la región constante \gamma2a de ratón. Los sitios HindIII y BsiWI fueron diseñados en marco con el dominio V_{L} para permitir la clonación en un vector RIn modificado que contenía la región constante \kappa de ratón.
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Cebadores de la PCR Cebador directo de V_{H} de 2A10
5'-ACTCATAAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTT-TGGTAG-3' (SEC ID N.º 78) 
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso de V_{H}
5'-ACTATGACTAGTGTGCCTTGGCCCCAGTAG-3' (SEC ID N.º 79) 
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Cebador directo de V_{L}
5'-ACTCATAAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTG-3' (SEC ID N.º 80) 
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso de V_{L}
5'-ACTATGCGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGG-3' (SEC ID N.º 81) 
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La PCR se realizó usando Hercules (Stratagene) según las instrucciones del fabricante en un volumen de 50 \mul que contenía aprox. 10 ng de la miniprep. de pUC19 que contenía la región V, DMSO al 2%, dNTP 400 \muM, 1 \muM de cada cebador y tampón suministrado. La PCR se llevó a cabo según lo siguiente: 1: 95ºC, 2 min.; 2: 95ºC, 1 min.; 3: 56ºC, 1 min., 4: 72ºC, 1 min. 30 ciclos de las etapas 2-4.
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Clonación en vectores de expresión
Se purificaron los productos de la PCR usando un equipo de purificación de PCR MinElute de Quiagen según las instrucciones del fabricante. El producto de la PCR de V_{H} y el vector de expresión de mamífero RId (IgG2a) fueron digeridos con HindIII-SpeI. El producto de la PCR de V_{L} y el vector de expresión de mamífero RId (k) fueron digeridos con HindIII-BsiWI (NEB) según las instrucciones del fabricante. Se unieron los vectores con insertos en una proporción molar de 1:2 usando el equipo de unión rápida de Promega. Las mezclas de unión fueron transfectadas en células DH5\alpha, y se desarrollaron colonas cultivadas en una selección de ampicilina y fueron enviadas para la verificación de las secuencias de ADN.
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Secuenciación del anticuerpo anti-Nogo-A recombinante 2A10/3
La secuencia de la cadena pesada de 2A10 entre los sitios de clonación de HindIII y EcoRI fue determinada como:
25 
\hskip1.2cm
(SEC ID Nº 49) 
\newpage
La secuencia de la cadena ligera de 2A10 entre los sitios de clonación de HindIII y EcoRI fue determinada como:
26 
\hskip1.2cm
(SEC ID Nº 50) 
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También se construyó una quimera de 2A10 como a la que hace referencia en la presente memoria como HcLc.
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Ejemplo 4 Anticuerpo anti-Nogo-A de ratón se une con NOGO-A56 humana
Se revistieron placas Immunosorp de Nunc con GST-NOGO-A56 humana a 5 \mug/ml en Tris 50 mM, pH 9,5 (100 \mul por pocillo) a 4ºC durante una noche. Se aclararon los pocillos una vez con PBS, luego se incubaron con ASB al 1% en PBS para bloquear los sitios de unión inespecífica a temperatura ambiente durante 1 hora. Se diluyeron los anticuerpos en PBS hasta 2 \mug/ml y se hicieron diluciones de 1/3 a partir de ésta. Se añadieron los anticuerpos a pocillos por triplicado y se incubaron a 4ºC durante una noche. Se lavaron los pocillos tres veces con PBS y luego se incubaron con HRP anti-ratón (1:1000) durante 1 hora. Se lavaron cinco veces con PBS y luego se incubaron con 100 \mul de sustrato de TMB (Sigma) por pocillo durante 10 minutos. Se detuvo la reacción de coloración mediante la adición de 50 \mul de HCl concentrado. Se midió la densidad óptica a 450 nm usando un lector de placas. Se restaron los valores de fondo leídos de los pocillos sin anticuerpo.
Las figuras 8 muestran la unión dependiente de la dosis de los tres anticuerpos monoclonales anti-Nogo-A de ratón, 2A10, 2C4 y 15C3, con la NOGO-A56 humana en un análisis ELISA. El eje Y muestra la densidad óptica (DO) medida a 450 nm, una medida cuantitativa del anticuerpo capturado en los pocillos. El eje X muestra la concentración de anticuerpo usada (ng/ml) por pocillo en cada punto de datos. El anticuerpo 2A10 muestra la señal más potente a un intervalo de concentraciones que parece indicar la afinidad más elevada por la Nogo-A humana.
\newpage
Ejemplo 5 Producción de fragmento de Nogo-A inhibidor (NOGO-A56, SEC ID N.º 87)
Se clonó una secuencia de ADNc que codifica los aminoácidos 586-785
27
de la Nogo-A humana en los sitios de BamHI-XhoI de pGEX-6P1 para generar una proteína de fusión marcada con GST denominada NOGO-A56. Se expresó el plásmido en células BL21 en medio 2XTY con 100 \mug/ml de ampicilina tras la inducción con IPTG hasta 0,5 mM a 37ºC durante 3 horas. Se lisaron los sedimentos celulares mediante un tratamiento de ultrasonidos y se purificó la proteína de fusión usando glutationa-sefarosa (Amersham Pharmacia) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Se eluyó la proteína purificada usando glutationa reducida y se sometió a diálisis exhaustivamente frente a PBS, se cuantificó usando patrones de ASB y un análisis de proteínas basado en Coomassie de BioRad, y luego se almacenó en alícuotas a -80ºC. Por lo tanto, la presente invención proporciona un anticuerpo, o un fragmento funcional del mismo, que se une con Nogo-A, particularmente, con Nogo-A humana, anticuerpo o fragmento funcional del mismo que neutraliza la actividad de una proteína Nogo que comprende el polipéptido codificado por la SEC ID N.º 87, y anticuerpo que se une con la SEC ID N.º 87 de dicha proteína. En las formas más comunes, los anticuerpos de la invención se unen entre los aminoácidos 586-785 de la Nogo-A humana y neutralizan la actividad de la Nogo-A.
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Ejemplo 6 Análisis del brote neurítico
Se decongelaron GST control sola o proteínas de fusión GST-NOGOA56 sobre hielo y se diluyeron en 0,5 x PBS de grado de cultivo tisular hasta 3 pmoles/\mul. Se secaron puntos de 5 \mul sobre el centro de cada pocillo de las placas de 96 pocillos revestidos con poli-D-lisina BD-Biocoat^{TM} en la cabina de cultivo tisular. Una vez secos, se diluyeron los anticuerpos purificados, el sobrenadante del cultivo tisular acondicionado con hibridomas o los compuestos en HBSS (Life Technologies) y se aplicaron 50 \mul a los pocillos por duplicados de entre 4 y 8 pocillos. Se trataron los pocillos control de sólo GST y de GST-NOGO-A56 con HBSS sin complementos. Tras un pretratamiento de 2 horas a 37ºC, se añadieron neuronas granuladas cerebrales disociadas de cerebros de ratas de 8 días de vida a 20-40.000 neuronas por pocillo en un volumen de 100 \mul y se incubaron a 37ºC durante 24 horas. Se fijaron los cultivos usando paraformaldehído al 4%/sacarosa al 10% en PBS durante 1 hora, luego se tiñeron las neuritas usando un anticuerpo anti-beta-tubulina-III policlonal.
Se cuantificó el brote neurítico usando una captura y un análisis automáticos de imágenes con el sistema
Arrayscan^{TM} de Cellomics.
Los resultados se muestran en las figuras 1 a 6.
La figura 1 muestra el efecto inhibidor de NOGO-A56 sobre el brote neurítico en comparación con el control de sólo proteína GST.
Las figuras 2 a 5 muestran la identificación de los anticuerpos Nogo-A bloqueadores funcionales 2A10/3, 2C4/1 y 15C3/3, junto con un anticuerpo control no bloqueador funcional. El anticuerpo 12G3 se une con NOGO56, pero no inhibe la actividad del brote neurítico. Los gráficos muestran la longitud neurítica media en cultivos expuestos a anticuerpos sin purificar (en sobrenadantes). Los datos muestran el efecto bloqueador de 2A10/3, 2C4/1 y 15C3/3 de la actividad inhibidora del brote neurítico de NOGO-A56. El control es sólo GST.
La figura 6 muestra el bloqueo del efecto inhibidor del brote neurítico de NOGO-A56 mediante 2A10/3 purificado.
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Ejemplo 7 IN-1 no tiene actividad bloqueadora frente a Nogo-A humana
El análisis del brote neurítico según lo descrito en el ejemplo 5, cuando se lleva a cabo con el anticuerpo IN-1, muestra que IN-1 no bloquea la actividad inhibidora de Nogo-A humana (figura 7).
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Ejemplo 8 Humanización de 2A10
Se prepararon de novo constructos de V_{H} y V_{L} humanizados mediante la acumulación de oligonucleótidos solapantes que incluían sitios de restricción para la clonación en los vectores de expresión de mamífero RId y RIn, así como una secuencia señal humana. Los sitios de restricción de HindIII y SpeI fueron introducidos para enmarcar el dominio V_{H} que contenía la secuencia señal CAMPATH-1 H para la clonación en RId que contenía la región constante mutada \gamma1 humana. Los sitios de restricción de HindIII y BsiWI fueron introducidos para enmarcar el dominio V_{L} que contenía la secuencia señal CAMPATH-1 H para la clonación en RIn que contenía la región constante kappa humana.
Secuencia señal CAMPATH-1H: MGWSCIILFLVATATGVHS (SEC ID N.º 82)
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Cadena pesada
Se identificó una secuencia de la línea germinal humana con un 66% de identidad con la secuencia de aminoácidos de V_{H} de 2A10. Se seleccionó la secuencia marco de U84162 para la humanización:
28 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 83) 
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Las posiciones 93 y 94 fueron identificadas como residuos potencialmente importantes en el mantenimiento de la configuración de las CDR.
100 
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Cabe destacar que el motivo EL en estas posiciones es poco habitual.
Se diseñó el siguiente constructo humanizado:
Constructo de V_{H} humanizado H1:
29 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 84) 
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Cadena ligera
Se identificaron secuencias de la línea germinal humana con un 66% de identidad con la secuencia de aminoácidos de V_{L} de 2A10. Se seleccionó la secuencia marco de CAA85593 para la humanización:
Marco: CAA85593
30 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 85) 
\newpage
Los siguientes residuos marco fueron identificados como potencialmente importantes en la recuperación de la afinidad:
101 
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Se diseñó un constructo de V_{L} humanizado:
102 
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Constructo de V_{L} humanizado L11:
31 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 86) 
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Se co-transfectaron transitoriamente los plásmidos que codifican la SEC ID N.º 84 y 86 en células CHO y se expresaron a una escala pequeña para producir anticuerpo H1L11. Se co-transfectaron transitoriamente los plásmidos que codifican la SEC ID N.º 92 y 86 en células CHO y se expresaron a una escala pequeña para producir anticuerpo H7L11.
Por lo tanto, la invención proporciona un anticuerpo humanizado que se une con y neutraliza la actividad de Nogo-A humana, anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada de SEC ID N.º 84 y una región variable de cadena ligera de SEC ID N.º 86.
Según la presente invención se proporciona un anticuerpo anti-Nogo-A que se une específicamente con y neutraliza la actividad de Nogo-A humana, anticuerpo que comprende una cadena pesada de SEC ID N.º 88 y una cadena aligera de SEC ID N.º 89. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dicho anticuerpo y a procedimientos para tratar a un paciente humano, particularmente, a un paciente que ha sufrido una apoplegía (tal como una apoplegía isquémica) o la enfermedad de Alzheimer. Será evidente para los expertos en la técnica que la SEC ID N.º 88 y la SEC ID N.º 89 representan la cadena pesada y la cadena ligera respectivamente antes de cualquier procesamiento (p. ej., procesamiento mediado por la célula huésped) para la eliminación de una secuencia señal. Comúnmente, la forma procesada de SEC ID N.º 88 comenzará en la posición 20 y la forma procesada de SEC ID N.º 89 comenzará en la posición 20.
SEC ID Nº. 88
32
SEC ID N.º 89
33 
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En la SEC ID N.º 90, se expone un polinucleótido que codifica la SEC ID N.º 88:
34 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 90) 
\newpage
En la SEC ID N.º 91, se expone un polinucleótido que codifica la SEC ID N.º 89:
35 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 91) 
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Ejemplo 9 Análisis BIAcore del anticuerpo monoclonal anti-Nogo H1L11
Se analizó la cinética de unión del anticuerpo monoclonal (Acm) anti-Nogo-A con la Nogo-A humana expresada recombinantemente (hNogo) usando el biosensor Biacore3000. La metodología fue la siguiente:
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Procedimiento
Se inmovilizó hNogo a un chip de CM5 mediante el acoplamiento de una amina primaria usando el programa Wizard de BIAcore diseñado para niveles de inmovilización dirigidos. Se activó la superficie del sensor CM5 haciendo pasar una solución de N-hidroxisuccinimida (NHS) 50 mM y N-etil-N'-dimetilaminopropil carbonida (EDC) 200 mM. Entonces, mediante el uso de una solución 300 nM de hNogo en acetato de sodio 5 mM, pH 5,0, se inmovilizó un intervalo de concentraciones de entre 50-200 unidades de resonancia de hNogo. Una vez completada la inmovilización, se bloqueó cualquier éster que todavía estuviera activado mediante una inyección de clorhidrato de etanolamina 1M, pH 8,5.
Se diluyó el Acm H1L11 (véase el ejemplo 8) en HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P-20 al 0,005%) y se llevaron a cabo estudios de unión a concentraciones que variaron entre 0,1-100 nM. Para el análisis cinético, se usó un caudal de 60 \mul/minuto, sin que se observaran efectos de transferencia de masa. Se realizaron todas las concentraciones por duplicado, en un orden aleatorio con blancos de tampón incluidos. Se consiguió la regeneración bien mediante una sola inyección de un pulso de 15 \mul de hidróxido de sodio 50 mM solo o mediante la inyección de 15 \mul de H_{3}PO_{4} 100 mM, seguida por una inyección posterior de 15 \mul de hidróxido de sodio 50 mM. Ambos protocolos de regeneración fueron realizados a un caudal de 30 \mul/minuto; y ambos procedimientos dieron como resultado la eliminación completa del H1L11 unido, pero no dieron como resultado ninguna pérdida de la capacidad de unión de la superficie del sensor con hNogo. Todas las series fueron referenciadas frente a la superficie del sensor con blanco (una que había sido activada y bloqueada según lo descrito anteriormente, pero sin la adición de ligando). El análisis de la unión se llevó a cabo usando un programa informático de análisis cinético BIAevaluation versión 4.1. El análisis BIAcore de otros anticuerpos de la invención siguió esencialmente el mismo protocolo descrito en la presente memoria.
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Resultados
36
Se llevó a cabo un análisis similar usando Nogo-A de rata.
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Resultados
37 
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Ejemplo 10 Efecto del anticuerpo anti-Nogo-A (2C4) sobre el volumen de la lesión y la recuperación funcional tras una OACMt Objetivo
El objetivo de este estudio fue investigar la eficacia de un anticuerpo monoclonal (Acm) anti-Nogo-A administrado intracerebroventricularmente (I.C.V.) sobre el volumen de la lesión y la recuperación funcional de ratas tras una oclusión de la arteria cerebral media transitoria (OACMt). Se utilizaron la prueba del cilindro, de la viga afilada y las tareas de puntuación neurológica para evaluar la recuperación funcional a largo plazo tras 90 minutos de una isquemia transitoria, y se extrajeron los cerebros para la evaluación inmunohistoquímica de procedimientos regenerativos y para la medición del volumen de la lesión.
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Procedimientos Preparación quirúrgica
En el estudio, se usaron ratas Sprague-Dawley macho (300-350 g) suministradas por Charles River. Se colocaron cánulas intracerebral-ventriculares (i.c.v) en el ventrículo cerebral lateral izquierdo bajo anestesia general. Tras al menos 4 días de la recuperación de la cirugía, se confirmó la colocación de las cánulas mediante el desafío con angiotensina II administrada I.C.V.
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Inducción de una isquemia focal
Todos los animales fueron sometidos a una OACMt bajo una anestesia con halotano/oxígeno/óxido nitroso según lo descrito por Longa y colaboradores (Stroke, 1989, 20, 84-91). Se controló la temperatura corporal durante el procedimiento quirúrgico con un termómetro por vía rectal, y se mantuvieron normotérmicos a los animales (37 \pm 0,5ºC) con una manta eléctrica controlada por el termómetro. Se registraron los valores reales de la temperatura central en el momento de la oclusión de la arteria cerebral media izquierda (ACM) y en el momento de la reperfusión. Noventa minutos después de la oclusión de la ACM, se volvieron a anestesiar las ratas y se introdujo lentamente el filamento completamente retraído para permitir la reperfusión. Se cerró la arteriotomía con diatermia, se volvió a comprobar la hemostasia y se cosió la herida cervical.
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Recuperación tras la oclusión
Tras la oclusión de la ACM, se interrumpió la anestesia y se dejó que los animales recuperaran la consciencia y el reflejo de enderezamiento bajo una observación rigurosa en una incubadora (23-25ºC) durante 1 hora. Entonces se metieron los animales individualmente en la sala de recuperación post-operatoria, en la que se controló de cerca su estado de salud general durante el período de supervivencia.
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Tareas del comportamiento 1. Evaluación neurológica
Se evaluaron los cambios motores y del comportamiento tras la oclusión de la ACM usando una escala de graduación de 28 puntos en los puntos temporales de 1 hora, 24 horas y, luego, semanalmente durante 8 semanas tras la oclusión de la ACM.
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Información sobre la evaluación neurológica "puntuación neurológica" usada
Puntuación neurológica de animales sometidos a una OACM en comparación con otras ratas del mismo estudio: puntuación máxima de 28 puntos.
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Colocación de las patas
Se sujeta al animal a lo largo del borde del banco, ahuecando las manos sobre su cabeza, y se cogen las patas de una en una, y se van colocando sobre el borde del banco. Se observa la retracción de las patas y la recolocación sobre el banco.
Puntuación:
1 por cada pata colocada correctamente (puntuación máxima = 4)
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Reflejo de enderezamiento
Se agarra firmemente el animal y se le da vueltas hasta que se cae de espaldas sobre la palma de la mano. Se le suelta y se observa si el animal se pone derecho por sí mismo.
Puntuación:
1 para un enderezamiento correcto
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Barra horizontal
Se colocan las patas anteriores del animal sobre una barra nervada y se deja que se cuelgue.
Puntuación:
3: si ambas extremidades traseras se elevan sobre la barra
\quad
2: si una extremidad trasera se eleva hasta la barra
\quad
1: si el animal sólo se cuelga
\quad
0: si el animal se suelta (por la falta de agarre)
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Plataforma inclinada
Se sujeta la tapa de la jaula a 45º. Se coloca al animal "cuesta abajo" sobre la tapa.
Puntuación:
3: si el animal gira para mirar "cuesta arriba" en el transcurso de 15 segundos
\quad
2: si le lleva de 15-30 segundos
\quad
1: si le lleva más de 30 segundos
\quad
0: si el animal se suelta de la tapa debido a un agarre débil/ausente, o permanece mirando "cuesta abajo".
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Rotación contralateral
Se sujeta al animal por la base de la cola y se le hace girar en el sentido de las agujas del reloj y luego en el sentido contrario de las agujas del reloj. Se observa la capacidad del animal para volverse contralateralmente al sentido de la rotación.
Puntuación:
1 por cada lado (puntuación máxima = 2)
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Alcance visual de las patas anteriores
Se sujeta al animal por la base de la cola con la cabeza justo por debajo del nivel de la parte superior del banco. Se aproxima el banco hasta que las vibrisas del animal casi lo tocan. El animal debería arquearse e intentar colocar sus patas anteriores sobre la superficie del banco.
Puntuación:
1 por cada pata colocada correctamente (puntuación máxima = 2)
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Dar vueltas
Se coloca el animal sobre el suelo y se observa si da vueltas
Puntuación:
4: si no da vueltas
\quad
3: se tiende hacia un lado
\quad
2: si da vueltas grandes > 50 cm de radio
\quad
1: si da vueltas medias > 15 < 50 cm de radio
\quad
0: si gira/vueltas pequeñas < 15 cm de radio
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Reflejo contralateral
Se sujeta al animal por la base de la cola.
Puntuación:
0: si hay reflejo
\quad
1: si no hay reflejo
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Fuerza de agarre
Se deja el animal colgado de las barras de la jaula sólo por las patas delanteras. Se arrastra al animal por la cola.
Puntuación:
2: fuerza de agarre normal
\quad
1: fuerza de agarre débil
\quad
0: sin agarre
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Movilidad
Se observa si el animal da vueltas en el suelo
Puntuación:
3: para una movilidad normal
\quad
2: si está animado pero da vuelta
\quad
1: si está inestable
\quad
0: si está reacio a moverse
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Estado general
Puntuación:
3: normal (pelaje en buenas condiciones, se mantiene alerta, se mueve, ganancia de peso normal)
\quad
2: muy bueno, pero ganancia de peso menor de lo normal
\quad
1: bueno
\quad
0: débil (p. ej., pelaje sucio, puede no estar acicalándose mucho, postura encorvada, agresivo, tono muscular débil)
Puntuación máxima (i.e., rata normal) = 28 
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2. Prueba del cilindro
Los animales fueron evaluados semanalmente en la prueba del cilindro de colocación de las patas anteriores. Se colocaron los animales dentro de un cilindro Perspex® transparente de 20 cm de diámetro y 30 cm de altura durante un período de 3 minutos. Se cuentan el número de colocaciones de la pata anterior izquierda y derecha en este período. Esta prueba se realizó bajo una luz roja.
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3. Paseo sobre una viga afilada
Para esta prueba, todas las ratas son entrenadas en una sala bajo una luz roja para que atraviesen una viga afilada cuadrada de 1 m de longitud colocada a un ángulo de aprox. 40 grados que va cuesta arriba hacia su jaula. La dificultad de esta tarea va aumentando progresivamente a medida que la rata va ascendiendo por la viga y la anchura de la misma va decreciendo. La viga está marcada para dividirla en 3 secciones a efectos del análisis, de la sección más ancha graduada como fácil (6 cm) hasta la más difícil que corresponde al extremo afilado (2 cm).
Entrenamiento pre-operatorio: durante 2 días se sacó a cada rata de su jaula, y se colocó sobre la viga a distancias crecientes (aprox. 4 veces en total). Cuando cada rata pudo atravesar la viga sin necesidad de persuadirla y con pocos errores, fue clasificada como entrenada. Se excluyeron de la prueba aquéllas que no consiguieron buenos resultados.
Prueba: se coloca cada rata sobre la viga 3 veces por cada sesión de la prueba y se registra manualmente el tiempo de latencia antes de atravesarla, el número de deslizamientos de pata, definidos como una colocación de la pata que no entra en contacto con la superficie superior de la viga, (extremidad trasera y delantera), tomando luego la media de los valores. A la semana 5 para el lote 1 y la semana 4 para el lote dos de los animales, se cambió el análisis a una grabación en vídeo de la prueba. Entonces se llevó a cabo el análisis de la prueba grabada para aumentar la sensibilidad.
Las sesiones de la prueba para los animales sometidos a OACM se hicieron antes de la cirugía, y luego después de la operación, el día 7 y semanalmente después de la misma hasta su sacrificio en la semana 8.
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Régimen de dosificación
Se administró anticuerpo a la hora, las 24 horas, la semana y las dos semanas de realizar la oclusión.
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Grupos
Control de IgG1 (5 \mug) (Grupo D)
Anticuerpo 2C4 (5 \mug) (Grupo F)
Anticuerpo 2C4 (15 \mug) (Grupo E)
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Todas las preparaciones fueron hechas en solución salina estéril.
Los grupos fueron cegados antes de la administración.
Para evitar el margen de error introducido por el orden de las ratas usado, se empleó un diseño de cuadrado latino. Los anticuerpos fueron administrados en un volumen de 5 \mul de solución madre (1 mg/ml y 3 mg/ml) durante 2 min con la ayuda de una bomba de infusión (2,5 \mul/min). Tras la inyección, se dejaron las cánulas en su sitio durante 2 min. más.
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Neuropatología y cuantificación del daño isquémico
8 semanas después de la oclusión de la ACM, se fijaron las ratas por reperfusión con paraformaldehído al 4% enfriado con hielo. Entonces los animales fueron decapitados, y se almacenaron los cerebros in situ en paraformaldehído al 4% enfriado con hielo, antes de su disección y procesamiento para cubrirlos con parafina y realizar la posterior inmunohistoquímica.
Para el análisis del volumen de los cerebros, se cortaron éstos en rodajas en serie desde el polo anterior hasta el cerebelo para su procesamiento en parafina a intervalos de 2 mm usando una matriz cerebral. Entonces se procesaron los cerebros en parafina y se cubrieron con cera. Se recogieron secciones de 4 micrómetros que correspondían a planos coronales predeterminados estereotácticamente desde el anterior + 3 mm hasta el posterior -7,5 mm en relación con el bregma. Se montaron las secciones sobre portaobjetos revestidos de poli-lisina antes de su tinción con hematoxilina y eosina. Se analizaron las secciones en cuanto al volumen de la lesión y se hincharon usando un sistema de análisis de imágenes informatizado (Datacell, soporte físico. Programa informático Optimas). Las superficies lesionadas están compuestas por tejido que no ha sido teñido por la hematoxilina y la eosina. Se miden las lesiones trazando los límites de la superficie lesionada y se expresan como % de superficie lesionada en comparación con el lado no lesionado contralateral del cerebro.
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Análisis estadístico
Se analizaron los datos de puntuación neurológica y de peso corporal usando un enfoque de ANOVA con medidas repetidas, con el tiempo como la medida repetida. Se analizó el volumen de las lesiones usando un enfoque de ANOVA unidireccional y ANCOVA, y se analizó la superficie de las lesiones usando un enfoque de ANCOVA con medidas repetidas.
Se analizaron los datos de los deslizamientos de pata por separado para la extremidad anterior y la extremidad posterior, para buscar un efecto en el grupo, usando un enfoque de ANOVA con medidas repetidas, con la semana y la dificultad de la viga como las medidas repetidas. Para buscar las diferencias entre las extremidades anterior y posterior, también se analizaron los datos de los deslizamientos de pata usando un enfoque de ANOVA con medidas repetidas con la semana y la pata como medidas repetidas, dificultad media de un lado al otro.
Tres animales del grupo E (grupo de alta dosis de Ac) recibieron una dosis menos que el resto de animales de este grupo (véase más adelante). Aunque el análisis se llevó a cabo con y sin estos animales, y se observó que no hubo un efecto significativo sobre los resultados y los animales fueron, por tanto, incluidos en el análisis, es importante destacar que, en el caso de la prueba del cilindro y los perfiles de peso corporal, al comparar los animales que recibieron 3 dosis con los animales que recibieron 4 dosis de controles, sólo los animales que recibieron 4 dosis son significativamente diferentes de los animales que recibieron el anticuerpo control.
Cabe destacar que en el transcurso de este estudio, murió un número de ratas debido a una infección putativa. Como consecuencia de ello, tres animales del grupo de mayor dosis (grupo E) recibieron una dosis menos que el resto de los animales de este grupo.
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Resultados
Tres animales del grupo E (grupo de alta dosis de Ac) recibieron una dosis menos que el resto de los animales de este grupo. Los datos fueron analizados con y sin estos animales, y no hubo un efecto significativo sobre los resultados de los análisis a no ser que se establezca lo contrario en el texto.
La figura 9 muestra el volumen de la lesión como un porcentaje del volumen total del cerebro en los grupos de prueba que recibieron control, 5 \mug y 15 \mug. El anticuerpo no tuvo efecto sobre el volumen de la lesión en comparación con el grupo control.
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Figura 10
Esta figura muestra los datos de puntuación neurológica representados como la media \pm EEM. Debido al gran intervalo de datos observados, se consideró válido un análisis paramétrico. Existen diferencias significativas entre el grupo que recibió 15 \mug y control en las semanas 1, 4, 7 y 8.
Existen diferencias significativas entre el grupo que recibió 15 \mug y control en la semana 7 y 8, al ser analizados de este modo.
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Prueba del cilindro
Véanse las figuras 11A, 11B, 11C, 11D. Datos de la prueba del cilindro representados como la media \pm EEM para A) ambas patas, B) la pata izquierda, C) la pata derecha y D) la pata derecha divididos entre ratas que recibieron 3 dosis de 15 \mug de anticuerpo anti-Nogo-A, y aquéllas que recibieron 4 dosis de anticuerpo anti-Nogo-A.
La dosis de 15 \mug del anticuerpo produjo un aumento significativo en el uso de la pata derecha.
Cuando se divide el grupo de dosis elevada en las ratas que reciben las cuatro dosis frente a las ratas que reciben sólo tres dosis del anticuerpo, no se observa una diferencia significativa entre los dos subgrupos. Sin embargo, como se muestra en la figura 11D, cuando se compara el grupo de las 4 dosis con el grupo control, existe una diferencia significativa que no se observa al comparar el grupo de las 3 dosis con el del control. El análisis estadístico usó el test de LSD de Fisher sobre los datos de medidas repetidas.
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Viga afilada
Véase la figura 12.
La figura 12 muestra los deslizamientos de las patas anteriores representados como la media \pm intervalos de confianza del 95%.
* En la semana 6, grupo F, la dosis de 5 \mug está aumentando el número de deslizamientos de la pata anterior en comparación con el grupo D, control, (p = 0,0305).
Aunque no se muestre aquí, el número de deslizamientos de la pata anterior aumentó al aumentar la dificultad a lo largo de la viga.
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Véase la figura 13.
La figura 13 muestra los deslizamientos de las patas posteriores representados como la media \pm intervalos de confianza del 95%.
* Grupo F, la dosis de 5 \mug está aumentando significativamente el número de deslizamientos de la pata posterior en comparación con el grupo D, control, (p = 0,0488) en el transcurso del estudio. En las semanas 6 y 7, el grupo F está aumentando significativamente el número de deslizamientos de la pata posterior en comparación con el grupo D, (p = 0,0098 y p = 0,0370 respectivamente). Aunque no se muestre aquí, el número de deslizamientos de la pata posterior aumentó al aumentar la dificultad a lo largo de la viga.
Los datos de latencia de los animales antes de atravesar la viga muestran que la latencia de la semana inicial disminuye a medida que el animal se recupera, sin embargo, no se observa ningún efecto del tratamiento.
La figura 14 A) muestra los pesos corporales representados como las medias \pm EEM. La dosificación de los animales con 15 \mug del anticuerpo provoca un aumento del peso corporal a las 24 horas, a la semana y en cada punto temporal a partir de la semana 3 hasta la finalización del estudio.
Figura 14B). El gráfico muestra los pesos para el grupo que ha recibido la dosis de 15 \mug dividido entre los animales que han recibido la dosis 3 veces y aquéllos que han recibido la dosis cuatro veces. Los datos son expresados como las medias \pm intervalos de confianza del 95%. * P < 0,05, ANOVA con medidas repetidas.
Figura 14C). El gráfico muestra los pesos para el grupo que ha recibido la dosis de 15 \mug dividido entre los animales que han recibido la dosis 3 veces y aquéllos que han recibido la dosis cuatro veces. Comparación con los animales que han recibido la dosis de 5 \mug de anticuerpo anti-Nogo-A y los animales que han recibido la dosis del anticuerpo de control. Los datos son expresados como las medias \pm intervalos de confianza del 95%. * P < 0,05, ANOVA con medidas repetidas.
Aunque no significativamente superior al resto de los grupos, el grupo de dosis elevada tuvo una proporción alta de animales retirados por eutanasia o muerte. Esto podría explicar la elevación media del peso corporal en comparación con el grupo control.
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Conclusiones
Este estudio observó el efecto de dos dosis del anticuerpo anti-Nogo-A 2C4 sobre el volumen de la lesión y la recuperación funcional tras una OACMt de 90 minutos cuando se administraron I.C.V. a la hora, las 24 horas, la semana y las dos semanas.
- El tratamiento con el anticuerpo no tuvo efecto sobre el volumen de la lesión.
- El tratamiento con el anticuerpo tuvo un efecto modesto, aunque significativo, sobre la puntuación neurológica a la dosis más alta, 15 \mug I.C.V. Esta dosis aumentó significativamente la puntuación neurológica a las semanas 1, 4, 7 y 8, usando la puntuación media (usada cuando los datos cubrieron un largo intervalo, justificando así el análisis paramétrico).
- El tratamiento con el anticuerpo tuvo un efecto significativo sobre el uso de la pata derecha en la prueba del cilindro a la dosis más alta de 15 \mug I.C.V. Esta dosis provocó un aumento significativo en el uso de la pata derecha en comparación con el control durante el período entero del estudio. También hubo aumentos significativos en el uso de la pata derecha específicamente en las semanas 2 y 6.
- El tratamiento con el anticuerpo no tuvo un efecto positivo sobre la actuación en la prueba del paseo por la viga afilada. Sin embargo, parece que el grupo de baja dosis de anticuerpo (5 \mug I.C.V.) aumentó el número de deslizamientos de pata, especialmente, en la semana 6. Sin embargo, no se observó ninguna diferencia cuando se analizó el número de deslizamientos de la pata por sección de dificultad, ni cuando se analizó la latencia antes de atravesar la viga.
- El tratamiento con anticuerpo tuvo un efecto significativo sobre el peso corporal a la dosis más alta, 15 \mug I.C.V. El grupo de este anticuerpo tenía un peso corporal significativamente mayor que los controles desde las 3 semanas en adelante. Aunque no es un resultado funcional, el peso corporal es un buen reflejo del buen estado general y este aumento reflejaría una mejor recuperación fisiológica tras la OACMt.
Las 3 últimas ratas del grupo que recibió la dosis más elevada del anticuerpo no recibieron la cuarta y última dosis por las razonas anteriormente explicadas. Para determinar la importancia de esta dosis final, se llevó a cabo una comparación entre las ratas del grupo de mayor dosis de anticuerpo que recibieron 3 dosis y las que recibieron 4 dosis.
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Duración de la dosificación
Los animales que recibieron 4 dosis aumentaron significativamente el número de desplazamientos de la pata derecha, mientras que los animales que recibieron 3 dosis no lo hicieron. Además, la dosificación de la segunda semana parece acelerar el aumento del peso corporal en comparación con los animales que recibieron 3 dosis. La dosificación realizada 4 veces también produce un aumento significativo del peso en comparación con los controles, mientras que la dosificación de 3 veces no lo hace.
La dosificación no afectó al volumen de la lesión, a la puntuación neurológica o a la actuación en la prueba del paseo por la viga afilada.
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Resumen
En resumen, aunque el tratamiento no tuvo efecto sobre el volumen de la lesión, la dosis más elevada de anticuerpo anti-Nogo-A 2C4 (15 \mug) tuvo un efecto positivo sobre la recuperación funcional, evaluado mediante la puntuación neurológica expuesta en la presente memoria, tras 3 ó 4 dosis, y la colocación de las patas y el peso corporal tas la administración de 4 dosis.
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Ejemplo 11 Efecto de los anticuerpos monoclonales anti-Nogo-A administrados intravenosamente sobre el volumen de la lesión y la recuperación funcional tras una OACMt Objetivo
El objetivo de este estudio fue investigar la eficacia de los anticuerpos monoclonales (Acm) anti-Nogo-A 2A10 y 2C4 administrados intravenosamente (I.V.) sobre el volumen de la lesión y la recuperación funcional de ratas tras una oclusión de la arteria cerebral media izquierda transitoria (OACMt). Se utilizaron la prueba del cilindro, de la viga afilada y las tareas de puntuación neurológica para evaluar la recuperación funcional a largo plazo tras 90 minutos de una isquemia transitoria, y se extrajeron los cerebros para la evaluación inmunohistoquímica de procedimientos regenerativos y para la medición del volumen de la lesión.
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Procedimientos Inducción de una isquemia focal
Todos los animales fueron sometidos a una OACMt bajo una anestesia con halotano/oxígeno/óxido nitroso según lo descrito por Longa y colaboradores (Stroke, 1989, 20, 84-91). Se controló la temperatura corporal durante el procedimiento quirúrgico con un termómetro por vía rectal, y se mantuvieron normotérmicos a los animales (37 \pm 0,5ºC) con una manta eléctrica controlada por el termómetro. Se registraron los valores reales de la temperatura central en el momento de la oclusión de la ACM y en el momento de la reperfusión. Noventa minutos después de la oclusión de la ACM, se volvieron a anestesiar las ratas y se introdujo lentamente el filamento completamente retraído para permitir la reperfusión. Se cerró la arteriotomía con diatermia, se volvió a comprobar la hemostasia y se cosió la herida cervical.
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Recuperación tras la oclusión
Tras la oclusión de la ACM, se interrumpió la anestesia y se dejó que los animales recuperaran la consciencia bajo una observación rigurosa en una incubadora (23-25ºC) durante 1 hora. Entonces se metieron los animales individualmente en la sala de recuperación post-operatoria, en la que se controló de cerca su estado de salud general durante el período de supervivencia.
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Tareas del comportamiento Evaluación neurológica
Se evaluaron los cambios motores y del comportamiento tras la oclusión de la ACM usando una escala de graduación de 28 puntos ("puntuación neurológica", véase el ejemplo 10 para más información) en los puntos temporales de 1 hora, 24 horas y luego semanalmente durante 8 semanas tras la oclusión de la ACM.
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Prueba del cilindro
Los animales fueron evaluados semanalmente en la prueba del cilindro de colocación de las patas anteriores. Se colocaron los animales dentro de un cilindro Perspex® transparente de 20 cm de diámetro y 30 cm de altura durante un período de 3 minutos. Se cuentan el número de colocaciones de la pata anterior izquierda, derecha y de ambas patas ante-
riores mientras tratan de explorar espontáneamente el medio en este período. Esta prueba se realizó bajo una luz roja.
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Paseo sobre una viga afilada
Para esta prueba, todas las ratas son entrenadas en una sala bajo una luz roja para que atraviesen una viga afilada cuadrada de 1 m de longitud colocada a un ángulo de aprox. 40 grados que va cuesta arriba hacia su jaula. La dificultad de esta tarea va aumentando progresivamente a medida que la rata va ascendiendo por la viga y la anchura de la misma va decreciendo.
Entrenamiento pre-operatorio: durante 2 días se sacó a cada rata de su jaula, y se colocó sobre la viga a distancias crecientes (aprox. 4 veces en total). Cuando cada rata pudo atravesar la viga sin la necesidad de persuadirla y con pocos errores, ésta se clasifica como entrenada. Se excluyeron de la prueba aquéllas que no consiguieron buenos resultados.
Prueba: se coloca cada rata sobre la viga 3 veces por cada sesión de la prueba y se graban por vídeo la latencia antes de atravesar la viga, el número de deslizamientos de pata, definido como una colocación de la pata que no entra en contacto con la superficie superior de la viga, (extremidad trasera y delantera), siendo esto evaluado en la fecha más tardía, y tomando después la media de estos valores. Las sesiones de la prueba para los animales sometidos a OACM se hicieron antes de la cirugía, y luego después de la operación, el día 7, y semanalmente después de la misma hasta su sacrificio en la semana 8.
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Régimen de dosificación (I.V.)
Se administró anticuerpo intravenosamente a la hora, las 24 horas, la semana y las dos semanas de realizar la oclusión.
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Grupos
A: 3 mg/kg de 2C4 (4,7 mg/kg ajustados debido a fracciones de bajo PM)
B: 3 mg/kg de 2A10
C: 3 mg/kg de IgG2a control
D: 10 mg/kg de 2A10
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Todas las preparaciones fueron hechas en solución salina estéril.
Los grupos fueron cegados antes de la administración.
Para evitar el margen de error introducido por el orden de las ratas usado, se empleó un diseño de cuadrado latino. Los animales fueron aleatorizados y los operadores fueron cegados para el tratamiento.
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Neuropatología y cuantificación del daño isquémico
8 semanas después de la oclusión de la ACM, se fijaron las ratas por reperfusión con paraformaldehído al 4% enfriado con hielo. Entonces los animales fueron decapitados, y se almacenaron los cerebros in situ en paraformaldehído al 4% enfriado con hielo durante 48 h, antes de su disección y procesamiento para cubrirlos con parafina y realizar el posterior análisis histológico.
Para el análisis del volumen de los cerebros, se cortaron éstos en rodajas en serie desde el polo anterior hasta el cerebelo para su procesamiento en parafina a intervalos de 2 mm usando una matriz cerebral. Entonces se procesaron los cerebros en parafina y se cubrieron con cera. Se recogieron secciones de 4 micrómetros que correspondían a planos coronales predeterminados estereotácticamente desde el anterior + 3 mm hasta el posterior -7,5 mm en relación con el bregma. Se montaron las secciones sobre portaobjetos revestidos de poli-lisina antes de su tinción con hematoxilina y eosina. Se analizaron las secciones en cuanto al volumen de la lesión y usando un sistema de análisis de imágenes informatizado (Datacell, soporte físico. Programa informático Optimas). Las superficies lesionadas están delineadas por las superficies de tejido con hematoxilina y eosina reducidas. Las lesiones se miden trazando los límites de la superficie lesionada, y se expresan como el % de superficie lesionada en comparación con el lado no lesionado contralateral del cerebro.
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Análisis estadístico
Se analizaron los datos de puntuación neurológica y de peso corporal usando un enfoque de ANOVA con medidas repetidas, con el tiempo como la medida repetida. Se analizó el volumen de las lesiones usando un enfoque de ANOVA unidireccional y ANCOVA, y se analizó la superficie de las lesiones usando un enfoque de ANCOVA con medidas repetidas.
Se analizaron los datos de los deslizamientos de pata por separado para la extremidad anterior y la extremidad posterior, para buscar un efecto en el grupo, usando un enfoque de ANOVA con medidas repetidas, con la semana y la dificultad de la viga como las medidas repetidas. Para buscar las diferencias entre las extremidades anterior y posterior, también se analizaron los datos de los deslizamientos de pata usando un enfoque de ANOVA con medidas repetidas con la semana y la pata como medidas repetidas, dificultad media de un lado al otro.
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Resultados Volumen de la lesión
La figura 15 representa el volumen de la lesión como un porcentaje del volumen total del cerebro. El anticuerpo no tuvo efecto sobre el volumen de la lesión en comparación con el grupo control.
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Puntuaciones neurológicas
La figura 16 muestra los datos de puntuación neurológica representados como las medias \pm EEM. Debido al gran intervalo de datos observados, se consideró válido un análisis paramétrico. * P < 0,05 en comparación con el anticuerpo control, ANOVA con medidas repetidas.
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Prueba del cilindro
Véanse las figuras 17A, 17B y 17C. Los datos de la prueba del cilindro representados como la media \pm EEM para A) ambas patas, B) la pata izquierda, C) la pata derecha. * P < 0,05; **P < 0,01 frente al anticuerpo control, ANOVA con medidas repetidas.
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Viga afilada Deslizamientos de las extremidades anteriores
Véase la figura 18. Los deslizamientos de las extremidades anteriores representados como la media \pm EEM. * P < 0,05; **P < 0,01 frente al anticuerpo control, ANOVA con medidas repetidas.
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Desplazamientos de las extremidades posteriores
Véase la figura 19. Deslizamientos de las extremidades posteriores representados como la media \pm EEM. * P < 0,05 frente al anticuerpo control, ANOVA con medidas repetidas.
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Latencia antes de atravesar la viga
Véase la figura 20. Deslizamientos de las extremidades posteriores representados como la media \pm EEM. * P < 0,05 frente al anticuerpo control, ANOVA con medidas repetidas.
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Conclusiones
Este estudio observó el efecto de dos dosis del anticuerpo anti-Nogo-A 2A10 (3 y 10 mg/kg) y de una dosis de 2C4 (3 mg/kg) sobre el volumen de la lesión y la recuperación funcional tras una OACMt de 90 minutos cuando se administraron I.V. a la hora, las 24 horas, la semana y las dos semanas.
- El tratamiento con el anticuerpo no tuvo efecto sobre el volumen de la lesión.
- El tratamiento con el anticuerpo tuvo un efecto significativo sobre la puntuación neurológica a la dosis más alta de 2A10 (10 mg/kg) a las 24 horas.
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- El tratamiento con el anticuerpo 2A10 (3 mg/kg) tuvo un efecto significativo sobre el uso de la pata derecha en la prueba del cilindro, específicamente en las semanas 1 y 2.
- 2A10 (3 mg/kg) tuvo un efecto claro de reducción del número de deslizamientos de las patas anteriores en las semanas 1 y 2 posteriores a la OACMt, 2A10 (10 mg/kg) tuvo el efecto de reducir los deslizamientos de las patas traseras a las 2 semanas de la OACMt, y ambas concentraciones de 2A10 redujeron la latencia antes de atravesar la viga a la semana de realizar la OACMt. 2C4 (3 mg/kg) redujo los deslizamientos de las patas anteriores a las 3 semanas de realizar la OACMt en comparación con el anticuerpo control.
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Resumen
En resumen, aunque el tratamiento no tuvo efecto sobre el volumen de la lesión, la inyección intravenosa de ambos anticuerpos monoclonales anti-Nogo-A 2A10 y 2C4 tuvo un efecto positivo sobre la recuperación funcional, evaluado por la puntuación neurológica, la colocación de las patas y la prueba de la viga afilada, predominantemente, en las dos primeras semanas posteriores a la OACMt.
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Ejemplo 12 Transfección de ADNc de Nogo-A en células SHSY5Y-APP
El día anterior a la transfección, se tripsinizaron las células SHSY5Y-APPwt, se contaron y se volvieron a emplacar a una concentración de 200.000 a 1 millón de células por cada pocillo de una placa de 6 pocillos (Nunc). Se formó un complejo con el constructo de expresión de Nogo (ADNc de Nogo-A marcado con FLAG en pCDNA3 (Invitrogen); Nogo-B marcada con MYC y Nogo-C en pCDNA3.1A) y reactivo Plus^{TM} diluyendo el ADN en medio libre de suero (OptiMEM-1), añadiendo reactivo Plus^{TM}, mezclando e incubando a la temperatura ambiente durante 15 min. (6 \mul de reactivo Plus^{TM} en un volumen total de 100 \mul con 2 \mug de ADN y OptiMEM-1 por pocillo). Se diluyó reactivo LipofectAMINE^{TM} en medio libre de suero (Optimem-I) en un segundo tubo y se mezclaron (4 \mul de LipofectAMINE^{TM} en un volumen de 100 \mul por pocillo). Se combinó el ADN con el que anteriormente se había formado el complejo (de arriba) con la LipofectAMINE^{TM} diluida, se mezcló y se incubó a temperatura ambiente durante 15 min. Mientras tanto, se lavaron las células con medio libre de suero (OptiMEM-I) y luego se añadió medio libre de suero recién preparado a las células (800 \mul por pocillo). Entonces se añadieron a las células los complejos de ADN-reactivo Plus^{TM}-reactivo LipofectAMINE^{TM} (200 \mul), se mezcló suavemente y se incubaron las células a 37ºC durante 5 h en CO_{2} al 5%. Tras 5 horas, se añadió 1 ml de medio de crecimiento que contenía suero a las células y luego se incubaron las células durante una noche o 2 horas. Tras 14 horas (o 2 horas) se retiró todo el medio y se volvió a colocar con 1 ml (OptiMEM-1) por pocillo. Tras 48 horas de acondicionamiento, se recogió el medio y se analizó su contenido en amiloide según lo descrito en el ejemplo 13.
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Ejemplo 13 Detección de péptido A\beta mediante ELISA de IGEN
Se sembraron células SHSY5Y que sobre-expresaban la secuencia de APPwt humana o la secuencia variante sueca de la proteína precursora de amiloide (APPswe) en placas de 6 pocillos o de 96 pocillos Nunc a la densidad requerida. Tras 24 horas, se añadieron los reactivos para el análisis (p. ej., anticuerpo, péptidos, compuestos, etc.) a las células en un volumen final de 120 \mul y se incubaron las células durante 24 h. Se retiró el medio de las células y se analizaron 50 \mul en cuanto a A\beta x-40 y 50 \mul en cuanto a A\beta x-42 en un inmunoanálisis ORIGEN de una noche empleando anticuerpos específicos del terminal C de A\beta. En síntesis, se capturaron los péptidos A\beta usando 6E10 biotinilado (Signet Labs). Se usaron anticuerpos específicos del terminal C de A\beta marcados con Ori para detectar las especies de A\beta x-40 y A\beta x-42. Se capturaron los complejos de anticuerpo-A\beta con perlas Dynabeads^{TM} revestidas con estreptavidina y se analizaron en un analizador M8 de IGEN. Se comprobó la viabilidad de las células usando reactivo MTT (bromuro de 3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio; azul de tiazolilo). En síntesis, se diluyó reactivo MTT (5 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato) 1:10 en medio de en cultivo y se añadieron 100 \mul a cada pocillo. Tras una incubación a 37ºC durante 4 h, se añadieron 100 \mul de solución disolvente (SDS al 20%/dimetil-formamida al 50%). Se leyó la absorbancia de las placas usando un lector de placas Delfia Wallac a 590 nm.
Los resultados se muestran en las figuras 21 a 34.
Las células SHSY5Y-APPwt expresan la APP de tipo natural. Las células SHSY5Y-APPswe expresan la forma de mutación sueca de la APP.
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Ejemplo 14 Efecto de la expresión de Nogo-A sobre los niveles de péptidos A\beta 40 y A\beta 42 secretados
Cuando se introduce un constructo de expresión que expresa a Nogo-A bien en células SHSY5Y-APPwt o en células SHSY5YAPPswe, se observa que los niveles de A\beta 40 y A\beta 42 aumentan significativamente, lo que sugiere que Nogo-A está modulando de algún modo, directa o indirectamente, el procesamiento proteolítico de la APP y/o la degradación de los péptidos A\beta. El hecho de que el producto de este procesamiento de la APP alterado sea el péptido A\beta 40 podría sugerir que el efecto de las Nogo podría estar al nivel de la modulación de la actividad de la \beta-secretasa.
La figura 21 muestra el aumento del nivel de A\beta 40 secretado cuando Nogo-A es expresada desde un vector de expresión. Las dos barras de la izquierda son los controles (sólo vector y vector que porta una proteína control, la proteína verde fluorescente (GFP)), que muestran los niveles de fondo de la producción de A\beta 40 en esta línea celular. El resto de las barras muestra que se detecta un nivel significativamente mayor de péptido A\beta 40 cuando la Nogo-A, fusionada con un péptido FLAG, se expresa en células, y además, una elevación similar, aunque menos marcada, cuando se expresa Nogo-B fusionada con myc.
Se repitió el mismo experimento usando un ELISA específico de A\beta 42. Los resultados muestran una elevación de los niveles de secreción de péptido A\beta 42 similar a la observada en el experimento anterior en el que se usó un ELISA para A\beta 40. De nuevo, la Nogo-B también mostró una mayor secreción del péptido A\beta 42, y, de nuevo, el aumento fue menos marcado que el obtenido con Nogo-A. Los resultados se muestran en la figura 22.
En las figuras 23 (para A\beta 40) y 24 (para A\beta 42), se muestran experimentos repetidos que comparan los niveles de péptido secretado desde células transfectadas con Nogo-A en comparación con el vector pCDNA3 solo.
En la figura 25, se muestra una comparación directa de los niveles de péptido A\beta 40 y A\beta 42 secretados. La figura 25 es la media de tres a cinco experimentos separados realizados para confirmar la regularidad de las Nogo.
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Ejemplo 15 El anticuerpo anti-Nogo-A inhibe la secreción de los péptidos A\beta 40 y A\beta 42 desde células SHSY5Y-APPwt y SHSY5Yswe
La figura 26 muestra la reducción espectacular de los niveles de péptidos A\beta 40 y A\beta 42 secretados desde células SHSY5Y-APPwt que expresan Nogo-A endógena cuando se introduce el anticuerpo anti-Nogo-A 2A10 en el medio de cultivo.
El efecto se observa de un modo dependiente de la dosis, alcanzándose a 30 \mug/ml niveles de inhibición casi del 90%. No se advierte ninguna diferencia en el efecto entre los péptidos A\beta 40 y A\beta 42 (las barras blancas y las barras negras respectivamente de la figura 26). En otras palabras, cualquier efecto del anticuerpo anti-Nogo-A sobre el procesamiento de APP no tiene preferencia por ninguno de los péptidos A\beta 40 o A\beta 42.
La figura 27 muestra el mismo experimento de la figura 26, pero con un anticuerpo IgG1 no relacionado. Como se puede observar claramente en la figura, un anticuerpo monoclonal (no anti-Nogo-A) no relacionado no tiene efecto inhibidor sobre los niveles de secreción de los péptidos A\beta 40 y A\beta 42 desde las células.
La figura 28 muestra que el mismo anticuerpo IgG1 no relacionado muestra similarmente un efecto inhibidor escaso o nulo sobre los niveles de secreción de los péptidos A\beta 40 y A\beta 42 desde las células SHSY5Y-APPswe que expresan a Nogo-A.
De manera similar, la figura 29 muestra los resultados del mismo experimento descrito anteriormente para la figura 26, pero usando un anticuerpo monoclonal anti-Nogo que se une con Nogo-A, pero que no es un bloqueador funcional (6D5). El anticuerpo monoclonal anti-Nogo-A no bloqueador funcional tiene un efecto inhibidor mínimo (menor del 10%) sobre la secreción de los péptidos A\beta 40 y A\beta 42 desde las células SHSY5Y-APPwt que expresan a Nogo-A. Este resultado sugiere que los resultados mostrados en la figura 26 son un resultado de la inhibición de la actividad funcional de Nogo por parte del anticuerpo anti-Nogo-A.
La figura 30 muestra los resultados del mismo experimento de la figura 29, usando el anticuerpo monoclonal anti-Nogo no bloqueador funcional (6D5), pero con células SHSY5Y-APPswe que expresan Nogo-A endógena. Como antes (figura 29), hay un efecto mínimo sobre los niveles de A\beta 40 y A\beta 42 que son secretados por esta línea celular, habiendo una inhibición menor del 10%.
La figura 31 muestra los resultados de un experimento que amplía los resultados del experimento de la figura 26. La figura 31 muestra que el efecto dependiente de la concentración del efecto inhibidor mostrado por el anticuerpo bloqueador funcional 2A10/3 continúa a una concentración mayor, alcanzándose un nivel de inhibición de más del 90% a una concentración de anticuerpo de 50 \mug/ml.
La figura 32 muestra los resultados de un experimento idéntico al de la figura 31, a excepción de que se usaron células SHSY5Yswe. El efecto inhibidor dependiente de la concentración del anticuerpo 2A10/3 continúa siendo observado a la concentración superior de 50 \mug/ml.
La figura 33 muestra el efecto de un anticuerpo anti-Nogo-A bloqueador funcional diferente, 2C4, sobre la secreción de los péptidos A\beta 40 y A\beta 42 desde células SHSY5Y-APPwt. Los resultados muestran un efecto inhibidor dependiente de la concentración sobre los niveles de secreción de los péptidos A\beta 40 y A\beta 42 hasta un nivel del 36% a una concentración de 20 \mug/ml. De nuevo, se vuelve a observar el efecto sobre ambos péptidos A\beta 40 y A\beta 42.
La figura 34 compara el efecto inhibidor de los anticuerpos bloqueadores funcionales anti-Nogo-A 2A10, 2C4 y 15C3 (a las concentraciones mostradas en la figura) con otros anticuerpos control 10A4, IgG2b y 14D12. La figura muestra que el efecto sobre la inhibición de la secreción de A\beta 40 y A\beta 42 es específico de los anticuerpos monoclonales anti-Nogo-A bloqueadores funcionales.
Ejemplo 16 El aumento de la expresión de Nogo-A eleva los niveles de A\beta de una manera dependiente de la dosis
Para investigar el efecto de la expresión de Nogo-A sobre los niveles de A\beta, se transfectaron transitoriamente células SHSY5Y-APPwt con cantidades crecientes de ADNc de Nogo-A marcado con myc C-terminal. Se mantuvo constante la cantidad total de ADNc (5 ug) para cada transfección usando ADNc marcado con myc en pcDNA3.1. 48 horas después de la transfección, se retiró el medio de cultivo y se analizó el A\beta 40. Además, se cosecharon células y se lisaron en Tris/HCl 10 mM que contenía Triton X-100 al 1% e inhibidores de la proteasa completos (Roche). Se resolvieron los lisados celulares sobre geles de Tris-glicina de Novex al 10% y se sometieron a un análisis de transferencia Western con anticuerpo anti-Nogo-A. Se observó un aumento de la expresión de la proteína Nogo-A con concentraciones de ADNc de Nogo-A crecientes. Esto fue concomitante con el correspondiente aumento de los niveles de A\beta 40 en el medio desde estas células. De este modo, el aumento de la expresión de Nogo-A provoca un aumento dependiente de la dosis de los niveles de A\beta 40. Véase la figura 36.
Ejemplo 17 2A10 quimérico (HcLc)
Se diseñó un anticuerpo quimérico que constaba de regiones V murinas precursoras injertadas en regiones C de tipo natural de k/IgG1 humana para su uso como una referencia en el análisis de constructos humanizados. Se cortó el dominio V_{H} de 2A10 de Nogo del plásmido RId recombinante de ratón con Hind III-SpeI y se unió en el vector RId que contenía hC\gamma1wt. Se cortó el dominio V_{L} de 2A10 de Nogo del plásmido RId recombinante de ratón con Hind III-BsiWI y se unió en el vector RId que contenía hC\kappa.
La SEC ID N.º 92 expone la secuencia de la cadena pesada de HcLc
38 
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Un polinucleótido que codifica la SEC ID N. 92 se expone como la SEC ID N.º 93.
39
40 
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La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de HcLc se expone como la SEC ID N.º 94:
41 
\hskip0.2cm
(SEC ID N.º 94) 
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Un polinucleótido que codifica la SEC ID N. 94 se expone como la SEC ID N.º 95:
42 
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Ejemplo 18 Anticuerpos anti-Nogo-A humanizados que se unen con las Nogo humanas
Se revistieron placas Immunosorp de Nunc con GST-NOGO-A56 humana a 1 \mug/ml en Tris 50 mM, pH 9,5 (100 \mul por pocillo) a 4ºC durante una noche. Se aclararon los pocillos una vez con TBS + Tween al 0,05%, luego se incubaron con ASB al 2% en TBS + Tween al 0,05% para bloquear los sitios de unión inespecífica a temperatura ambiente durante 1 hora. Se diluyeron los anticuerpos en TBS + Tween al 0,05% + ASB al 2% hasta 10 \mug/ml y se hicieron diluciones de 1/2 a partir de ésta. Se añadieron los anticuerpos a pocillos por duplicado y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Se lavaron los pocillos tres veces con TBS + Tween al 0,05%, y luego se incubaron con conjugado de peroxidasa kappa anti-humana (1:2000) durante 1 hora. Se lavaron tres veces con TBS + Tween al 0,05% y luego se incubaron con 100 \mul de sustrato de peroxidasa OPD (Sigma) por pocillo durante 10 minutos. Se detuvo la reacción de coloración mediante la adición de 25 \mul de H_{2}SO_{4} concentrado. Se midió la densidad óptica a 490 nm usando un lector de placas. Se restaron los valores de fondo leídos de los pocillos sin anticuerpo.
Las figuras 35A a C ilustran la unión dependiente de la dosis del anticuerpo humanizado H1L11 en comparación con la quimera (HcLc) con NOGO-A56 humana en un análisis ELISA. El eje Y muestra la densidad óptica (DO) medida a 490 nm, una medida cuantitativa del anticuerpo capturado en los pocillos. El eje X muestra la concentración de anticuerpo usada (ug/ml) por pocillo en cada punto de datos. Los anticuerpos H1L11 y HcLc ofrecieron vales de CE_{50} de 0,118 \mug/ml y 0,022 \mug/ml, respectivamente.

Claims (14)

1. Un Anticuerpo que comprende cada una de las siguientes CDR:
Las CDR de la cadena ligera: SEC ID N.º 1, 2 y 3
Las CDR de la cadena pesada: SEC ID N.º 4, 5 y 6,
o un fragmento o análogo funcional del mismo, anticuerpo, fragmento o análogo funcional del mismo que se une con y neutraliza a la Nogo-A humana.
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2. Un anticuerpo según la reivindicación 1 que se une con una región de la proteína Nogo-A humana entre los aminoácidos 586 a 785.
3. Un anticuerpo según la reivindicación 2 que se une con una región de la proteína Nogo-A humana entre los aminoácidos 586 a 685.
4. Un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es un anticuerpo monoclonal.
5. Un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es un anticuerpo humanizado o quimérico.
6. El anticuerpo según la reivindicación 1, en el que la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N.º 37.
7. El anticuerpo según la reivindicación 1 ó 6, en el que la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID N.º 40.
8. Un anticuerpo según la reivindicación 1, que comprende un fragmento variable de cadena pesada que comprende la SEC ID N.º 37 y una parte constante o un fragmento de la misma de una cadena pesada humana; y un fragmento variable de cadena ligera que comprende la SEC ID N.º 40 y una parte constante o un fragmento de la misma de una cadena ligera humana; o un fragmento o análogo funcional del mismo.
9. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-Nogo-A, o un fragmento o análogo funcional del mismo, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, junto con un diluyente o un vehículo farmacéuticamente aceptable.
10. Un anticuerpo anti-Nogo-A, un fragmento o un análogo funcional del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en un procedimiento para el tratamiento de la apoplegía, la lesión cerebral traumática, la lesión de la médula espinal, la enfermedad de Alzheimer, las demencias fronto-temporales (tautopatías), la neuropatía periférica, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington o la esclerosis múltiple en un ser humano.
11. El uso de un anticuerpo anti-Nogo-A, un fragmento o un análogo funcional del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la apoplegía, la lesión cerebral traumática, la lesión de la médula espinal, la enfermedad de Alzheimer, las demencias fronto-temporales (tautopatías), la neuropatía periférica, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington o la esclerosis múltiple en un ser humano.
12. Un anticuerpo anti-Nogo-A, un fragmento o un análogo funcional del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en un procedimiento para inhibir la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente humano que padece, o está en riesgo de desarrollar, una apoplegía, una lesión cerebral traumática, una lesión de la médula espinal, la enfermedad de Alzheimer, demencias fronto-temporales (tautopatías), una neuropatía periférica, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington o una esclerosis múltiple.
13. El uso de un anticuerpo anti-Nogo-A, un fragmento o un análogo funcional del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la preparación de un medicamento para inhibir la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente humano que padece, o está en riesgo de desarrollar, una apoplegía, una lesión cerebral traumática, una lesión de la médula espinal, la enfermedad de Alzheimer, demencias fronto-temporales (tautopatías), una neuropatía periférica, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Huntington o una esclerosis múltiple.
14. Un procedimiento in vitro de promoción del brote axonal que comprende poner en contacto un axón humano con un anticuerpo anti-Nogo-A según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
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