JP2008504220A - 神経疾患治療用の、ｎｏｇｏ−ａを中和する免疫グロブリン - Google Patents

神経疾患治療用の、ｎｏｇｏ−ａを中和する免疫グロブリン Download PDF

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Abstract

本発明は、NOGOに対する抗体、それらの抗体を含有している医薬品製剤、およびそれらの抗体の神経疾患/障害の治療および/または予防における使用に関する。

Description

本発明は免疫グロブリン、とりわけNOGOと結合しNOGOの活性を中和する抗体、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、該抗体を含有する医薬組成物、および神経疾患の治療および/または予防におけるそのような抗体の使用に関する。本発明のその他の態様、目的および利点については下記の説明から明らかなものとなろう。
脳卒中は西洋では死亡と身体障害の主要な原因の１つである。組織プラスミノゲンアクチベーター(t-PA)以外で脳卒中の治療法として承認されたものはなく、このt-PAは脳出血の可能性を排除するためにCTスキャンを行った後、発症から3時間以内に投与されなければならない。現在までのところ、大多数の治療用剤は急性脳卒中の治療を目指しており(すなわち、神経防護)、主として急性の細胞死に関与していることが知られているグルタミン酸受容体とその受容体の下流のシグナル伝達経路を標的としたものである。しかし、これまでのところ、それらの方策は臨床試験では不成功に終わっており、投与量を限定させることとなる副作用を伴うことが多い(HillとHachinski, The Lancet, 352:(suppl. III) 10-14(1998))。従って、血流停止後の細胞死の程度を改善するための新規のアプローチが必要である。傷害または疾病の進行に応じて進むニューロンの喪失の防止または改善のための治療に必要なのは神経防護能である。このことはグリア細胞(オリゴデンドロサイトを含む)が失われることを防止してニューロンを直接的または間接的に標的とすることによって達成されるであろう。
脳卒中の発症後に、ある程度の自発的な機能回復が多くの患者で観察され、このことは脳が傷害を受けた後に修復および/または再構成する能力(限定的ではあるが)を有していることを示唆している。従ってこの回復を増強させる能力を有している可能性のある薬剤は、脳虚血の発症後、今までの治療法よりも遅い時期に(数日後の可能性もある)治療効果を上げる可能性がある。急性期の神経防護と機能回復の増強の双方の効力を示す薬剤があれば現行の神経防護療法とされているものに比べて大きな利点を提供するであろう。
アルツハイマー病(AD)は診断に用いられる2つの病理学的特徴によって特徴付けられる。その2つとはアミロイド斑と神経原線維のもつれで、それらはそれぞれ、凝集したβアミロイドペプチド(Aβ40およびAβ42)、および高度にリン酸化されたタウからなるものである(DawbarnとAllen, 2001, 「アルツハイマー病の神経生物学」"Neurobiology of Alzheimer's Disease", OUP)。
広範な研究によって、患者でβアミロイドの蓄積と認知能力の低下との間に強い関連性があることが示された(Naslundら, JAMA, March 22/29, 2000, Vol.283, No.12, page 1571-1577)。このことは、APP遺伝子とプレセニリン遺伝子中の何らかの変異がADの早期発症を起こしやすくしており、それらの変異がAβ40とAβ42ペプチドの比率を含めそれらの量を増大させることを示唆している遺伝学的および疫学的な種々の研究結果と一致している。
βアミロイドペプチドの形成にはI型の膜貫通型アミロイド前駆体タンパク質(APP)の2つの別々のプロテアーゼ、それらはβセクレターゼおよびγセクレターゼと名付けられているが、それらのプロテアーゼによる切断が必要である。βセクレターゼは分子的にはアスパルチル-プロテアーゼ Asp2/BACE1であることが確認されている(Hussainら, Mol. Cell. NeuroSci. 16, 609-619(2000); Vassarら, Science (1999), Oct.22; 286 (5440):735-741)。γセクレターゼの性質については依然として議論があり、おそらくは少なくとも次のタンパク質から構成される高分子量複合体を形成しているのであろう：プレセニリン、Aph1, Pen2、およびニカストリン(MedinaとDotti, Cell Signaling, 2003, 15(9):829-41中に総説されている)。
CNS内でのAPPのプロセシングは、ニューロン、オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびミクログリアを含む多数の細胞のタイプの内部で起こっているものと考えられる。これらの細胞内での総体的なAPPプロセシングの速度は、APP、BACE/Asp2、プレセニリン-1および-2、Aph1、Pen2、およびニカストリンの相対的発現量によって影響を受けることとなろう。
さらに、APPの細胞内の位置を調節している別のファクターも、APPのプロセシングに影響を及ぼしうるが、それはAPPが細胞内へエンドサイトーシスされることをブロックする部分であるAPPの細胞質ドメイン内のYENPモチーフに変異があればβアミロイド産生が低減する、との知見(Perezら, 1999, J. Biol. Chem, 274(27):18851-6)によって示されている。KKQN保持モチーフを付加してER(小胞体)内でAPP-β-CTFを保持させると、トランスフェクトされた細胞内でのアミロイド産生を低減させる(Malteseら, 2001, J. Biol. Chem., 276(23):20267-20279)。逆に、Rab5の過剰発現によってエンドサイトーシスの上昇が起これば、トランスフェクトされた細胞からのアミロイド分泌が増加する(Grbovicら, 2003, J. Biol. Chem., 278(33):31261-31268)。
これらの知見と一致して、さらに別の複数の研究では、細胞内コレステロール量の低下は(これはADの危険因子としてよく知られている)、βアミロイドの形成を低下させることが示されている。このような変化は、ダイナミンの優性ネガティブ変異体(K44A)の使用とRab 5 GTPase活性化タンパク質RN-Treの過剰発現によって示されるとおり、エンドサイトーシスの程度の変化に依存して変わる(Ehehaltら, 2003, J. Cell Biol., 160(1):113-123)。
コレステロールに富むミクロドメインまたはラフト(raft)もβアミロイド産生の細胞内部位として重要であり、APP、BACE1、およびγセクレターゼ複合体の構成成分は全て一時的にはラフトの内部に位置することが示されている。APPとBACE1がコレステロールに富むラフトへ抗体で架橋されるとβアミロイド産生を増加させた(Ehehaltら, 2003, J. Cell Biol., 160(1):113-123)。GPIアンカー型BACE1、これは脂質ラフトのみを標的とするものであるが、これもAPPの切断とβアミロイド産生を増加させた(Cordyら, 2003, PNAS, 100(20):11735-11740)。
機能回復の起こる機作については現在のところ不明である。傷害を受けた、または傷害を受けていない軸索の出芽が考えうる機作の1つとして提案されている。しかし、in vivoの研究では神経栄養因子を用いた脊髄損傷や脳卒中の治療で機能回復と軸索の出芽の程度が増強されることが示されてはいるが、それらの研究では軸索の出芽の程度と機能回復との間の直接的な関連性については証明されていない(Jakemanら, 1998, Exp. Neurol. 154: 170-184, Kawamataら, 1997, Proc Natl Acad. Sci. USA., 94:8179-8184, Ribottaら, 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152)。さらに、軸索の出芽には生きているニューロンが必要である。従って、広範な細胞死を伴う脳卒中のような疾患においては、卒中後に投与される薬剤による機能回復の増強は、軸索の出芽以外の機作、例えば内在性の幹細胞の分化、使われていなかった経路の活性化、受容体の分布の変化またはニューロンやグリア細胞の興奮性の変化などの機作を介するものであろう(FawcettとAsher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391, HornerとGage, 2000, Nature 407:963-970)。
中枢神経系(CNS)が傷害を受けた後に修復を行う能力は限定的であるが、それはある程度は軸索の出芽(神経突起の伸長)に対して阻害効果を有するCNS環境内の分子によるものと考えられている(Schwab, M.EとCaroni, P., (1988), J. Neurosci., 8:2381-2193)。ミエリン関連糖タンパク質(MAG)とNOGOという2種類のミエリンタンパク質がクローン化されており、神経突起の伸長の阻害剤ではないかと推定されている(Sato S.ら, (1989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163:1473-1480; McKerracher, L.ら, (1994) Neuron 13:805-811; Mukhopadhyay, G.ら, (1994) Neuron 13:757-767; Torigoe, K.とLundborg, G. (1997) Exp. Neurology 150: 254-262; Schaferら,(1996) Neuron 16:1107-1113; WO9522344; WO9701352; Prinjha, R.ら, (2000) Nature 403:383-384; Chen MSら, (2000) Nature 403: 434-439; GrandPre, T.ら,(2000) Nature 403:439-444; 米国特許第005250414A号; WO200005364A1; WO0031235)。
ヒトNOGOは3種類の形態が同定されている：1192個のアミノ酸残基を有するNOGO-A(GenBankアクセッション番号AJ251383)；細胞外ドメインと推定される、ドメイン中にある186から1004番目の残基が欠失したスプライス変異体であるNOGO-B(GenBankアクセッション番号AJ251384)；およびこれも186番目から1004番目の残基を欠失しており、より小さな別のアミノ末端ドメインを有している、さらに短いスプライス変異体であるNOGO-C(GenBankアクセッション番号AJ251385)(Prinjhaら, (2000), 上述の文献)。
NOGOなどのCNS阻害性タンパク質を阻害することは、ニューロンの損傷を改善しニューロンの修復と生育を促進して、脳卒中で被ったものなどのニューロンの損傷からの回復を助けるような治療方法を提供することとなろう。そのようなNOGO阻害剤の例としては、小分子、ペプチド、および抗体が挙げられる。
抗体は一般的にはジスルフィド結合で連結された2本の重鎖と2本の軽鎖からなる。軽鎖の各々はジスルフィド結合によってそれぞれ1本の重鎖と連結されている。重鎖の各々はその一端に1つの可変ドメインがありその続きに多数の定常ドメインがある。軽鎖の各々はその一端に1つの可変ドメインがあり、もう一方の端に1つの定常ドメインがある。軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと平行して並んでいる。軽鎖定常ドメインは重鎖の第1の定常ドメインと平行して並んでいる。重鎖と軽鎖の定常ドメインはその抗体の抗原との結合に直接的には関与していない。
軽鎖と重鎖の各ペアの可変ドメインは抗原結合部位を形成している。軽鎖と重鎖上の可変ドメインは同一の一般構造を有しており、各ドメインは4つの領域からなるフレームワークを含んでおり、それらの配列は比較的保存されており、超可変領域と呼ばれることの多い3つの相補性決定領域(CDR)によって接続されている。これらの4つのフレームワーク領域はその大部分がβシートのコンフォメーションを取っており、CDRはβシート構造と接続している、あるいは場合によってはその一部を形成している、ループを形成する。それらのCDRはフレームワーク領域の近傍に置かれ、他のドメインからのCDRとともに抗原結合部位の形成に寄与している。抗体のCDRとフレームワーク領域はKabatらの文献を参照することによって定めることができる(「免疫学的に重要なタンパク質の配列」"Sequences of proteins of immunological interest", US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987)。
抗MAGモノクローナル抗体については報告がなされており(Poltorak ら,(1987) Journal of Cell Biology 105:1893-1899, DeBellardら,(1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101; Tangeら,(1997) Mol. Cell. Neurosci. 9:333-346; Torigoe, K.とLundborg, G. (1997) Exp. Neurology 150: 254-262)、市販(MAB1567(Chemicon))もされているものであるが、ラットの巣状脳虚血(脳卒中のモデル)後にこれを直接的に脳内へ、または静脈内に投与すると、神経防護を示し、機能回復を強める(PCT/EP 03/08749)。
従って、抗MAG抗体は脳卒中後の急性期の神経防護ならびに機能回復の促進の双方作用を有する治療用薬剤となる可能性がある。この抗体はマウス抗体である。マウス抗体は診断用剤としてはよく用いられているが、治療用剤としての有用性が証明されたのは2、3の場合にすぎない。マウス抗体の応用が限定されていることは、ある程度は、ヒトへのマウスモノクローナル抗体の反復投与によって通常はそれらの抗体分子に対するヒトの免疫応答が引き起こされるためである。マウス抗体のこれらの本質的な望ましくない性質を克服するために、ヒト抗体中の領域を組み入れた「改変された」(altered)抗体が開発され、当業界では十分に確立されている。例えば、ヒト化抗体はヒト以外の起原の相補性決定領域(CDR)を含み、その抗体の構造の残りの大部分はヒト抗体由来である。
マウスモノクローナル抗体であるIN-1はNI-220/250(神経突起伸長の強力な阻害剤であるミエリンタンパク質(それは後にNOGO-Aの断片であることが示された))に対して作製されたものであるが、その抗体が軸索の再生を促進することも報告されている(Caroni, P and Schwab, ME (1988) Neuron 1 85-96; Schnell, L. とSchwab, ME. (1990) Nature 343:269-272; Bregman, BSら,(1995) Nature 378:498-501およびThallmair, M.ら(1998) Nature Neuroscience 1：124-131)。また、NOGO-AがIN-1に対して抗原となることも報告されている(Chenら, (2000), Nature, 403:434-439)。脊髄を離断させたラットにIN-1 Fabフラグメントまたはヒト化IN-1の投与を行うと、回復が増強された(Fiedler, M.ら, (2002), Protein Eng., 15:931-941; Brosamle, C.ら, (2000), J. Neuroscience, 20:8061-8068)。しかし、あるモノクローナル抗体がヒトの脳卒中および神経変性性疾患などのNOGOがメディエートする疾患や障害の治療に有用であるためにはヒトNOGO-Aと結合してそれを阻害することが必要とされるが、現在までのところ、それらの文献中でIN-1またはそのヒト化したものがヒトNOGO-Aと結合してそれを阻害することができることを示唆する証拠はない。
従って、ヒトNOGOと結合してその活性を阻害する、治療上有用なモノクローナル抗体を単離し、開発することは、依然として非常に望ましいゴールである。神経変性のプロセスは多くの神経疾患/障害を引き起こすが、それらとしては限定はされないが、脳卒中(虚血性または出血性)、外傷性脳損傷、および脊髄損傷などの急性疾患、ならびにアルツハイマー病、前頭側頭葉性認知症(タウオパチー)、末梢性ニューロパチー、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多発性硬化症、ハンチントン病、多発性硬化症、および封入体性筋炎などの慢性疾患が挙げられる。
従って抗NOGOモノクローナル抗体はそれらの疾患/障害の治療に有用なものとなる可能性がある。上述の疾患/障害の治療用のそのような抗体が本発明によって提供され、それについては下記に詳述する。
本特許明細書中に開示されている公表文献は全て、雑誌の論文および特許の双方とも本明細書中に参照によりその全体を組み入れる。
本発明の簡潔な要旨
本発明は、NOGO、好ましくはヒトNOGO、より好ましくはヒトNOGO-Aと結合しその活性を中和する抗体またはその機能を有するフラグメント(本明細書中では時に「抗NOGO抗体」とも呼ぶ)を提供する。そのような抗体は、例えば、表1から6に示したCDRの1個以上を含んでおり、それらの表は独立に単離された3種類のそのような特性を有する抗体2A10/3、2C4/1、および15C3/3のCDRを示している。それらのCDRはKabatによって報告されている方法で同定されたものである(Kabatら, (1991), 「免疫学的に重要なタンパク質の配列」"Sequences of proteins of immunological interest", 第5版, US Department of Health and Human Services, NIH publication No.91-3242)。CDRはKabatが定義したとおりのものであるが、ChothiaとLesk(Crothiaら, (1989),「免疫グロブリン超可変領域のコンホメーション」"Conformation of immunoglobulin hypervariable regions", Nature, 342, 0877-883)が定義しているタンパク質の構造と折り畳みの原則に従ったものであることが好ましく、さらに別の残基も抗原結合領域の一部と考えることもでき、それらも本発明に包含される。
表1 抗体2A10/3 ("2A10")軽鎖CDR
CDR Kabatによって示されている配列
L1 RSSKSLLYKDGKTYLN (配列番号1)
L2 LMSTRAS (配列番号2)
L3 QQLVEYPLT (配列番号3)
表2 抗体2A10/3 重鎖CDR
CDR Kabatによって示されている配列
H1 SYWMH (配列番号4)
H2 NINPSNGGTNYNEKFKS (配列番号5)
H3 GQGY (配列番号3)
表3 抗体2C4/1 ("2C4")軽鎖CDR
CDR Kabatによって示されている配列
L1 RSSQSLVHSNGNTYLH (配列番号7)
L2 KVSNRFS (配列番号8)
L3 SQSTHVPLT (配列番号9)
表4 抗体2C4/1 重鎖CDR
CDR Kabatによって示されている配列
H1 FSCYAMS (配列番号10)
H2 SISDGGSYTYYPDNVKG (配列番号11)
H3 ELLFDY (配列番号12)
表5 抗体15C3/3 ("15C3")軽鎖CDR
CDR Kabatによって示されている配列
L1 RSSKSLLHSNGNTYLY (配列番号13)
L2 RMSNLAS (配列番号14)
L3 MQHLEYPLT (配列番号15)
表6 抗体15C3/3 重鎖CDR
CDR Kabatによって示されている配列
H1 SYWMN (配列番号16)
H2 QIYPGDGDTNYNGKFKG (配列番号17)
H3 RFDY (配列番号18)
本発明の第1の態様においては、本発明は次のものを提供する：
(a) NOGO、好ましくはヒトNOGO、より好ましくはヒトNOGO-Aと結合しその活性を中和する抗体またはその機能を有するフラグメントであって、その抗体または抗体の機能を有するフラグメントは、表2のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変ドメイン、および表1のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変ドメインを含んでなる、抗体またはその機能を有するフラグメント。
(b) NOGO、好ましくはヒトNOGO、より好ましくはヒトNOGO-Aと結合しその活性を中和する抗体またはその機能を有するフラグメントであって、その抗体または抗体の機能を有するフラグメントは、表4のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変ドメイン、および表3のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変ドメインを含んでなる、抗体またはその機能を有するフラグメント。
(c) 抗体またはその機能を有するフラグメントであって、表6のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変領域、および表5のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変ドメインを含んでなる、抗体またはその機能を有するフラグメント。
我々はさらに、次のものを含んでなる抗NOGO抗体もしくはその機能を有するフラグメント：
a) 表2のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3をその順で含んでなる1つの重鎖可変ドメイン(VH)、
および/もしくは
b) 表1のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3をその順で含んでなる1つの軽鎖可変ドメイン(VL)；
次のものを含んでなる抗NOGO抗体もしくはその機能を有するフラグメント：
a) 表4のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3をその順で含んでなる1つの重鎖可変ドメイン(VH)、
および/もしくは
b) 表3のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3をその順で含んでなる1つの軽鎖可変ドメイン(VL)；または、
次のものを含んでなる抗NOGO抗体もしくはその機能を有するフラグメント：
a) 表6のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3をその順で含んでなる1つの重鎖可変ドメイン(VH)、
および/もしくは
b) 表5のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3をその順で含んでなる1つの軽鎖可変ドメイン(VL)、を提供する。
該抗体はキメラ抗体、完全にヒト型の抗体、またはヒト化抗体とすることができる。
別の態様においては、本発明は、上述の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体が結合するものと同一の(またはオーバーラップする)NOGOポリペプチド上のエピトープと結合する抗NOGO抗体に関する。好ましくは、そのエピトープは586から785(NOGO-Aのアミノ酸番号、GenBankアクセッション番号AJ251383)の領域内、より好ましくはそのエピトープは586から685、または686から785領域内のものを含んでなる。競合阻害アッセイを抗原上のエピトープのマッピングに用いる。また、ヒトNOGO-Aのアミノ酸586から685、または686から785に結合し、NOGO-Aの活性を中和する抗NOGO抗体も提供される。そのような抗体は下記の方法に従って作成することができる。さらに別の1態様においては、NOGO、好ましくはヒトNOGO、最も好ましくはヒトNOGO-Aに対する上述のCDRを有する抗体の結合を競合的に阻害する抗NOGO抗体も提供される。
より具体的には、完全にヒト型であるか、ヒト化されたものであるか、またはキメラの抗体で、NOGO、特にヒトNOGO、より特別にはヒトNOGO-Aと結合し、その活性を中和する抗体で、表2のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変領域、および表1のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変領域を有する抗体のヒトNOGO-Aへの結合を、等モル濃度で競合的に阻害する抗体が提供される。
別の実施形態においては、完全にヒト型であるか、ヒト化されたものであるか、またはキメラの抗体で、NOGO、特にヒトNOGO、より特別にはヒトNOGO-Aと結合し、その活性を中和する抗体で、表4のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変領域、および表3のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変領域を有する抗体のヒトNOGO-Aへの結合を、競合的に阻害する抗体が提供される。
別の1実施形態においては、完全にヒト型であるか、ヒト化されたものであるか、またはキメラの抗体で、NOGO、特にヒトNOGO、より特別にはヒトNOGO-Aと結合し、その活性を中和する抗体で、表6のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変領域、および表5のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変領域を有する抗体のヒトNOGO-Aへの結合を、競合的に阻害する抗体が提供される。
典型的な実施形態においては、該競合抗体はIgGクラスのものであり、より典型的にはIgG1またはIgG4である。
キメラ抗体
また、NOGO、好ましくはヒトNOGO、より好ましくはヒトNOGO-Aと結合し、その活性を中和するキメラ抗体で、表1から6に開示されているものなどのCDRを含んでなる抗体も提供される。好ましくはそのキメラ抗体はマウス配列およびヒト配列(例えばマウス可変領域とヒト定常領域)を含んでなる。さらに、表2のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変領域、および表1のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変領域を含んでなるキメラ抗体も提供される。
また、表4のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変領域、および表3のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変領域を含んでなるキメラ抗体も提供される。
また、表6のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変領域、および表5のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変領域を含んでなるキメラ抗体も提供される。
典型的な実施形態においては、該競合抗体はIgGクラスのもので、より典型的にはヒトIgG1またはIgG4でκタイプのヒト軽鎖を有するものである。
ヒト化抗体
さらに、本発明はNOGO、好ましくはヒトNOGO、より好ましくはヒトNOGO-Aと結合し、その活性を中和するヒト化抗体を提供する。
より具体的には、表2のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変領域、および表1のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体が提供される。
また、表4のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変領域、および表3のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体も提供される。
また、表6のCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変領域、および表5のCDRの各々を含んでなる1つの軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体も提供される。
典型的な実施形態においては、本発明の抗体はそれがキメラ抗体、ヒト化抗体、または完全にヒト型の抗体のいずれであっても、IgGクラスのもので、より典型的にはヒトIgG1またはIgG4でκタイプのヒト軽鎖を有するものである。
本発明のさらに別の態様は、本発明の抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントを、製薬上許容される希釈剤または担体とともに含んでなる医薬組成物を提供する。
さらに別の態様においては、本発明はヒトの脳卒中(特に虚血性脳卒中)、およびその他の神経疾患、特にアルツハイマー病の治療または予防の方法を提供し、その方法は、それらの治療または予防を必要としているヒトに対して本発明の抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントの有効量を投与することを含んでなる。
別の態様においては、本発明は脳卒中(特に虚血性脳卒中)およびその他の神経疾患、特にアルツハイマー病の治療または予防のための医薬品の調製における抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントの使用を提供する。
さらに別の態様においては、本発明は、脳卒中(特に虚血性脳卒中)またはその他の神経疾患、特にアルツハイマー病に罹患しているか、またはその発症の危険性のあるヒト患者における神経変性を阻害するおよび/または機能回復を促進する方法を提供し、その方法は、それらの治療または予防を必要としているヒトに対して、本発明の抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントの有効量を投与することを含んでなる。
さらにまた別の態様においては、本発明は、脳卒中およびその他の神経疾患、特にアルツハイマー病に罹患しているか、またはその発症の危険性のあるヒト患者における神経変性を阻害するおよび/または機能回復を促進するための医薬品の調製における抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントの使用を提供する。
さらに別の態様においては、表1のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3から選択された1つ以上のCDR、好ましくは少なくともCDRH3を含んでなる1つの重鎖可変ドメイン、ならびに/または、表4のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3から選択された1つ以上のCDRを含んでなる1つの軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体またはその機能を有するフラグメント；表2のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3から選択された1つ以上のCDR、好ましくは少なくともCDRH3を含んでなる1つの重鎖可変ドメイン、ならびに/または、表5のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3から選択された1つ以上のCDRを含んでなる1つの軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体またはその機能を有するフラグメント；あるいは表3のCDRH1、CDRH2、およびCDRH3から選択された1つ以上のCDR、好ましくは少なくともCDRH3を含んでなる1つの重鎖可変ドメイン、ならびに/または、表6のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3から選択された1つ以上のCDRを含んでなる1つの軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体またはその機能を有するフラグメントが提供される。
本発明のその他の態様および利点については詳細な説明の項および本発明の好ましい実施形態でさらに説明している。
本発明の詳細な説明
本発明の抗体は典型的にはモノクローナル抗体(mAb)であり、好ましくはキメラ抗体、ヒト化抗体、完全にヒト型の抗体、または再構成(reshaped)抗体である。これらのうちでヒト化抗体および完全にヒト型の抗体が特に好ましい。
本発明の抗体は典型的には天然の抗体またはその機能を有するフラグメントの構造を有する。従ってその抗体は完全長の抗体、1つの(Fab)'2フラグメント、1つのFabフラグメント、1つの軽鎖2量体、または1つの重鎖2量体を含んでなるものとすることができる。該抗体はIgG1、IG2、IgG3、もしくはIgG4；またはIgM；IgA；IgE；もしくはIgD、またはそれらの修飾変異体とすることができる。抗体重鎖の定常ドメインはそれらに応じて選択することができる。軽鎖定常ドメインはκまたはλ定常ドメインとすることができる。さらに、該抗体は全てのクラスのものの修飾体、例えば、IgG 2量体、Fc受容体と結合し得ないかまたはC1q結合をメディエートしないFc変異体などを含んでなるものとすることができる。また、該抗体はWO86/01533中に記載のタイプのキメラ抗体とすることができ、それは1つの抗原結合領域と1つの非免疫グロブリン領域とを含んでなるものである。その抗原結合領域は抗体の軽鎖可変ドメインまたは重鎖可変ドメインである。典型的にはその抗原結合領域は軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの双方を含んでいる。非免疫グロブリン領域はそのC末端が抗原結合領域と融合されている。その非免疫グロブリン領域は典型的には非免疫グロブリンタンパク質であり、酵素、毒素、または既知の結合特異性を有するタンパク質とすることができる。このタイプのキメラ抗体の2つの領域は切断可能なリンカー配列でつなげられている。下記で説明しているCDRを有するイムノアドヘシン(immunoadhesin)も本発明に包含される。
該定常領域は必要とされる機能に応じて選択される。通常は、1つのIgG1が補体との結合を介して溶解能を示すこととなる、および/またはADCC(抗体依存性細胞傷害性)をメディエートすることとなる。細胞傷害性のないブロッキング抗体を必要とする場合にはIgG4が好ましい。しかし、IgG4抗体は作成の際、不安定性を示すことがあるので、一般的により安定であるIgG1を修飾することがより好ましいであろう。勧めうる修飾についてはEP0307434に記載されており、好ましい修飾としては235と237の位置での修飾が含まれる。従って本発明は本発明の抗体の溶解性を有する形態または溶解性を有しない形態を提供する。
従って、好ましい形態においては、本発明の抗体は上述のCDRを有する、完全長の(すなわち、H2L2の4量体)非溶解性のIgG1抗体である。最も好ましい形態においては、配列番号1から6のCDR；配列番号7から12のCDR；または配列番号13から18のCDRを有する完全長の非溶解性IgG1抗体が提供される。
さらに別の態様においては、本発明はCDRをコードするポリヌクレオチドを提供する。例えば、本発明は表1から6に示しているCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDR1、CDRL2、およびCDRL3をコードするポリヌクレオチドを提供する。好ましいポリヌクレオチド配列を下記の表7から12に示す。
表7 抗体2A10/3軽鎖CDR
CDR
L1 AGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAAT
(配列番号19)
L2 TTGATGTCCACCCGTGCATCA (配列番号20)
L3 CAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACG (配列番号21)
表8 抗体2A10/3 重鎖CDR
CDR
H1 AGCTACTGGATGCAC (配列番号22)
H2 AATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGC
(配列番号23)
H3 GGACAGGGCTAC (配列番号24)
表9 抗体2C4/1 軽鎖CDR
CDR
L1 AGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACAT
(配列番号25)
L2 AAAGTTTCCAACCGATTTTCT (配列番号26)
L3 TCTCAGAGTACACATGTTCCGCTCACG (配列番号27)
表10 抗体2C4/1 重鎖CDR
CDR
H1 TTCAGTTGCTATGCCATGTCT (配列番号28)
H2 TCCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAATGTAAAGGGC
(配列番号29)
H3 GAACTACTTTTTGACTAC (配列番号30)
表11 抗体15C3/3 軽鎖CDR
CDR
L1 AGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTAT
(配列番号31)
L2 CGGATGTCCAACCTTGCCTCA (配列番号32)
L3 ATGCAACATCTAGAATATCCGCTCACG (配列番号33)
表12 抗体15C3/3 重鎖CDR
CDR
H1 AGCTACTGGATGAAC (配列番号34)
H2 CAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAACGGAAAGTTCAAGGGC
(配列番号35)
H3 CGCTTTGACTAT (配列番号36)
本発明のさらに別の態様においては、表1、3、5のCDRL1、CDRL2、およびCDRL3から選択された少なくとも1つのCDRを含んでいる、より好ましくは表1の3種のCDRの全てを含んでいるかまたは表3の3種のCDRの全てを含んでいるかまたは表5の3種のCDRの全てを含んでいる抗NOGO抗体の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明のさらに別の態様においては、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3から選択された少なくとも1つのCDRを含んでいる、より好ましくは表2の3種のCDRの全てを含んでいるかまたは表4の3種のCDRの全てを含んでいるかまたは表6の3種のCDRの全てを含んでいる抗NOGO抗体の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明はさらに、NOGO、好ましくはヒトNOGO、より好ましくはヒトNOGO-Aと結合しその活性を中和する抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントを提供し、その抗体またはフラグメントは下記のアミノ酸配列のうちの1つを含んでなる1つの重鎖可変領域を含んでいる：
QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELGQGYWGQGTTLTVSS (配列番号37)；または
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSCYAMSWVRQTPEKRLEWVASISDGGSYTYYPDNVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSHLKSEDTAMYYCAKELLFDYWGQGTTLTVSS (配列番号38)；または
QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGKGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAVRFDYWGQGTTLTVSS (配列番号39)。
本発明はさらに、NOGOと結合しその活性を中和する抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントを提供し、その抗体またはフラグメントは下記のアミノ酸配列のうちの1つを含んでなる1つの軽鎖可変領域を含んでいる：
DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGAGTKLELK (配列番号40)；または
DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK (配列番号41)；または
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPLTFGAGTKLELK (配列番号42)。
本発明のさらに別の1態様においては、NOGO、好ましくはヒトNOGO、より好ましくはヒトNOGO-Aと結合しその活性を中和する抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントが提供され、その抗体またはフラグメントは：
a) 配列番号37の1つの重鎖可変領域を配列番号40のアミノ酸配列を含んでいる1つの軽鎖可変領域とともに含んでなるか；または
ba) 配列番号38の1つの重鎖可変領域を配列番号41のアミノ酸配列を含んでいる1つの軽鎖可変領域とともに含んでなるか；または
a) 配列番号39の1つの重鎖可変領域を配列番号42のアミノ酸配列を含んでいる1つの軽鎖可変領域とともに含んでなる。
本発明のさらに別の1態様においては、抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントが提供され、その抗体またはフラグメントは：
配列番号37を含んでいる1つの重鎖可変フラグメントおよびヒト重鎖の定常部分もしくはそれのフラグメント、ならびに
配列番号40を含んでいる1つの軽鎖可変フラグメントおよびヒト軽鎖の定常部分もしくはそれのフラグメント；
または、
配列番号38を含んでいる1つの重鎖可変フラグメントおよびヒト重鎖の定常部分もしくはそれのフラグメント、ならびに
配列番号41を含んでいる1つの軽鎖可変フラグメントおよびヒト軽鎖の定常部分もしくはそれのフラグメント；
または、
配列番号39を含んでいる1つの重鎖可変フラグメントおよびヒト重鎖の定常部分もしくはそれのフラグメント、ならびに
配列番号42を含んでいる1つの軽鎖可変フラグメントおよびヒト軽鎖の定常部分もしくはそれのフラグメント；
を含んでなる。
さらに別の態様においては、本発明は配列番号37から39のアミノ酸配列を含んでいる重鎖可変領域および配列番号40から42のアミノ酸配列を含んでいる軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。
配列番号37のアミノ酸配列をコードする好ましいポリヌクレオチド配列は：
CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (配列番号43)
である。
配列番号38のアミノ酸配列をコードする好ましいポリヌクレオチド配列は：
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTTGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAATGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAAATGAGCCATCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAAGGAACTACTTTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (配列番号44)
である。
配列番号39のアミノ酸配列をコードする好ましいポリヌクレオチド配列は：
CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATTTCCTGCAAAGCTTCTGGCTACGCATTCAGTAGCTACTGGATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGAAAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAGATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAACGGAAAGTTCAAGGGCAAGGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAGTACGCTTTGACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (配列番号45)
である。
配列番号40のアミノ酸配列をコードする好ましいポリヌクレオチド配列は：
GATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (配列番号46)
である。
配列番号41のアミノ酸配列をコードする好ましいポリヌクレオチド配列は：
GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAGAGTACACATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (配列番号47)
である。
配列番号42のアミノ酸配列をコードする好ましいポリヌクレオチド配列は：
GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGAGTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATGGCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAGCTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGGAGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (配列番号48)
である。
抗NOGO抗体2A10は配列番号37のアミノ酸配列を有する1つの重鎖可変領域と配列番号40のアミノ酸配列を有する1つの軽鎖可変領域を含んでなる。
抗NOGO抗体2C4は配列番号38のアミノ酸配列を有する1つの重鎖可変領域と配列番号41のアミノ酸配列を有する1つの軽鎖可変領域を含んでなる。
抗NOGO抗体15C3は配列番号39のアミノ酸配列を有する1つの重鎖可変領域と配列番号42のアミノ酸配列を有する1つの軽鎖可変領域を含んでなる。
「NOGO」とは全てのNOGOポリペプチドのいずれかを意味し、それには変異体をも含む。NOGOには、限定はされないが、1192個のアミノ酸残基を有するNOGO-A(GenBankアクセッション番号AJ251383)；細胞外ドメインと推定されるドメイン中にある、186から1004番目の残基が欠失したスプライス変異体であるNOGO-B(GenBankアクセッション番号AJ251384)；およびこれも186番目から1004番目の残基を欠失しており、より小さな別のアミノ末端ドメインを有している、さらに短いスプライス変異体であるNOGO-C(GenBankアクセッション番号AJ251385)(Prinjhaら, (2000), 上述の文献)が含まれる。本明細書で「NOGO」と記載しているものは、特別な形態を指定していない限りは、NOGO-Aおよび上述のスプライス変異体などのNOGOの変異体のいかなるものも全て含むものと理解される。
「中和」およびそれの文法的変体語は、NOGOのニューロンとの結合および神経突起伸長の阻害を含むNOGO機能の、総体的または部分的な阻害を意味する。
「改変(altered)抗体」とは改変免疫グロブリンコード領域によってコードされるタンパク質を意味し、それは選択した宿主細胞中での発現によって得ることができる。そのような改変抗体としては、加工された抗体(例えばキメラ抗体、再構成抗体、ヒト化抗体、もしくはベクター化(vectored)抗体)、または免疫グロブリン定常領域の全てもしくは一部を欠失した抗体のフラグメント、例えば、Fv、Fab、もしくはF(ab)2、および類似のものが含まれる。
「改変免疫グロブリンコード領域」とは、改変抗体をコードする核酸配列を意味する。改変抗体がCDR移植抗体またはヒト化抗体である場合には、ヒト以外の動物の免疫グロブリンからの相補性決定領域(CDR)をコードする配列が、ヒト可変フレームワーク配列を含んでなる第1の免疫グロブリンパートナー中に挿入される。任意で、該第1の免疫グロブリンパートナーは第2の免疫グロブリンパートナーと機能しうる形で連結される。
「第1の免疫グロブリンパートナー」とは、天然の(または天然に生じる)CDRをコードする領域をドナーの抗体のCDRをコードする領域と置き換えたヒトフレームワーク領域またはヒト免疫グロブリン可変領域をコードする核酸配列を意味する。そのヒト可変領域は、免疫グロブリン重鎖、軽鎖(またはその双方の鎖)、それらの類似体または機能を有するフラグメントとすることができる。抗体(免疫グロブリン)の可変領域内に位置するCDR領域は当業界では既知の方法で調べることができる。例えば、Kabatら(「免疫学的に重要なタンパク質の配列」"Sequences of proteins of immunological interest", 第4版, US Dept. of Health and Human Services, National Institute of Health, 1987)はCDRの位置を定めるための規則を開示している。さらにCDR領域/構造を同定するために有用なコンピュータープログラムも知られている。
「第2の免疫グロブリンパートナー」とは、該第1の免疫グロブリンパートナーにインフレームで融合されるかまたは任意の従来のリンカー配列を用いることによって融合される(すなわち機能しうる形で連結される)タンパク質またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を意味する。好ましくはそれは免疫グロブリン遺伝子である。該第2の免疫グロブリンパートナーは、対象の抗体と同一の(すなわち、同種の-第1と第2の改変抗体が同一のソース由来である)、または別の(すなわち、異種の)抗体の定常領域全体をコードする核酸配列を含むものとすることができる。それは免疫グロブリン重鎖または軽鎖(または単一のポリペプチドの部分として双方の鎖)とすることができる。該第2の免疫グロブリンパートナーは特定の免疫グロブリンのクラスまたはアイソタイプに限定されない。さらに該第2の免疫グロブリンパートナーは、FabまたはF(ab)2に見られるものなどの免疫グロブリン定常領域の部分を含んでなるものとすることができる(すなわち、適切なヒト定常領域またはフレームワーク領域の不連続の1部分)。そのような第2の免疫グロブリンパートナーはまた、宿主細胞の外表面上に露出している膜内在性タンパク質をコードする配列を、例えばファージディスプレイライブラリーの一部として、または分析的または診断用の検出のためのタンパク質、例えば西洋ワサビのペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼその他を含んでなるものとすることができる。
Fv、Fc、Fd、Fab、またはF(ab)2という用語はそれらの標準的な意味で用いられている(例えば、Harlowら, 「抗体：実験室マニュアル」"Antibody A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)を参照せよ)。
本明細書中の「加工(engineered)抗体」とは、改変された抗体の1タイプを意味しており、すなわち、完全長の合成抗体(例えば、抗体フラグメントとは対立するものとしてキメラ、再構成、またはヒト化抗体)で、その抗体では、ある選択されたアクセプター抗体の軽鎖および/または重鎖可変ドメインの一部分が、選択されたエピトープに対しての特異性を有する1つ以上のドナー抗体由来の類似の部分によって置換されている。例えば、そのような分子としては、非修飾軽鎖(またはキメラ軽鎖)と結合させたヒト化重鎖、またはその逆の状態によって特徴付けられる抗体を含むことができる。また、加工抗体は、ドナー抗体の結合特異性を保持させるためにアクセプター抗体の軽鎖および/または重鎖可変ドメインフレームワーク領域をコードする核酸配列の改変によっても特徴付けられる。それらの抗体はアクセプター抗体由来の1つ以上のCDR(好ましくは全て)を、本明細書記載のドナー抗体由来のCDRで置換したものを含むものとすることができる。
「キメラ抗体」とは、あるアクセプター抗体由来の軽鎖および重鎖定常領域と結合した、あるドナー抗体由来の天然の可変領域(軽鎖および重鎖)を含んでいる加工抗体の1タイプを意味する。
「ヒト化抗体」とは、加工抗体の1タイプであって、そのCDRがヒト以外のドナーの免疫グロブリン由来であり、その分子の残りの免疫グロブリン由来の部分が1つ以上のヒト免疫グロブリン由来であるものを意味する。さらに、フレームワークをサポートする残基を結合アフィニティーを保持するために改変することができる(例えば、Queenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,:10029-10032 (1989), Hodgsonら, Bio/Technology, 9:421 (1991)を参照せよ)。適切なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同性に基づいて、従来のデータベース、例えば、KABAT(登録商標)データベース、Los Alamosデータベース、およびSwiss Proteinデータベースから選択したものとすることができる。該ドナー抗体のフレームワーク領域に対しての相同性(アミノ酸ベースで)によって特徴付けられるヒト抗体はおそらく、ドナーCDRの挿入のための重鎖定常領域および/または重鎖可変フレームワーク領域を提供するものとして適切であろう。軽鎖定常領域または可変フレームワーク領域を提供することのできる、適切なアクセプター抗体も同じようなやり方で選択することができる。該アクセプター抗体の重鎖および軽鎖が同一のアクセプター抗体起源のものである必要はないことに留意すべきである。従来技術では、そのようなヒト化抗体を作成するいくつかの方法が述べられている−例えば、EP-A-0239400およびEP-A-054951を参照せよ。
「再構成(reshaped)ヒト抗体」とは、第1のヒトモノクローナルドナー抗体由来のCDRの最小限少なくとも1つを、第2のヒトアクセプター抗体中のCDRの代わりに入れた改変抗体を意味する。好ましくは6つのCDRを全て置換する。より好ましくは、第1のヒトドナーモノクローナル抗体の抗原結合領域全体(例えばFv、Fab、またはF(ab')2)を、第2のヒトアクセプターモノクローナル抗体中の対応する領域の替わりに置換させる。最も好ましくは、第1のヒトドナー抗体のFab領域を第2のヒトアクセプター抗体の適切な定常領域と機能しうる形で連結させて完全長のモノクローナル抗体を形成させる。
「ベクター化抗体」とは、血液脳関門(BBB)を通過する輸送を向上させるために作用物を付着させた抗体を意味する(Pardridge, Advanced Drug Deliverly Review, 36:299-321 (1999)の総説を参照せよ)。その付着させるものは化学物質とすることができ、あるいはまた抗体中に加工してそのような部分を作ることができる。1例としては、脳毛細血管内皮細胞受容体に対する抗体、例えば抗インスリン受容体抗体または抗トランスフェリン受容体抗体を用いてキメラを作成することである(Saitoら, (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10227-31; Pardridgeら, (1995) Pharm. Res. 12:807-816; Broadwellら,(1996) Exp. Neurol. 142:47-65; Bickelら(1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90:2618-2622; Fridenら, (1996) J. Pharm. Exp. Ther. 278:1491-1498, 米国特許第5182107号, 米国特許第5154924号, 米国特許第5833988号, 米国特許第5527527号 )。受容体と結合した後、その双特異的抗体の2つのコンポーネントは双方ともトランスサイトーシスのプロセスによってBBBを通過する。あるいはまた、その薬剤は、そのような細胞表面の受容体、例えばインスリン、トランスフェリン、または低密度リポタンパク質などの受容体と結合するリガンドとすることができる(Descamps ら,(1996) Am. J. Physiol. 270 :H1149-H1158; Duffyら,(1987) Brain Res. 420 :32-38; Dehouckら,(1997) J. Cell Biol. 1997 :877-889)。BBBを横切る輸送を改善することが知られているペネトラチン、SynB1、およびSynB3などの天然のペプチドも用いることができる(Rouselleら,(2000) Mol. Pharm.57:679-686およびRouselleら,(2001) Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296:124-131)。
「ドナー抗体」という用語は、ある抗体(モノクローナルおよび/または組換え)であって、その抗体の可変領域、CDR、もしくはそれらの他の機能を有するフラグメントまたはそれらの類似体を第1の免疫グロブリンパートナーに提供し、改変された免疫グロブリンコード領域およびその結果として発現された改変抗体が、該ドナー抗体の特徴である抗原特異性および中和活性を有しているようにする、抗体を意味する。
「アクセプター抗体」という用語は、ドナー抗体とは異種の抗体(モノクローナルおよび/または組換え)であって、それの重鎖および/もしくは軽鎖フレームワーク領域、ならびに/または、それの重鎖および/もしくは軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列の全て(または何らかの部分でも良いが、好ましくは全て)を、第1の免疫グロブリンパートナーに提供する抗体を意味する。ヒト抗体がアクセプター抗体であることが好ましい。
「CDR」は抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義され、それは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の超可変領域である。例えば、Kabatら, 「免疫学的に重要なタンパク質の配列」"Sequences of proteins of immunological interest", 第3版, US Department of Health and Human Services, National Institute of Health (1987)を参照せよ。免疫グロブリンの可変部分中には3つの重鎖CDRと3つの軽鎖CDR(またはCDR領域)がある。従って、本明細書中で「CDR」とは3つの重鎖CDRの全て、または3つの軽鎖CDRの全て(またはそれが適切な場合には、重鎖CDRと軽鎖CDRの全て)を意味する。抗体の構造とタンパク質の折り畳みによっては他の残基が抗原結合部位の一部分と考えらることもでき、そのような場合には当業者であればそのことが理解されるであろう。例えば、Chothiaら, 「免疫グロブリン超可変領域のコンフォメーション」"Conformation of immunoglobulin hypervariable region", Nature, 342:877-883を参照せよ。便宜的に配列番号37-42中でKabatによって定義されたCDRを四角で囲んである。
CDRは抗体が抗原またはエピトープと結合するための接触する残基の大多数を提供している。本発明で対象としているCDRは、ドナー抗体の可変重鎖および軽鎖配列由来のもので、天然のCDRの類似体を含んでおり、その類似体もそれの元となったドナー抗体と同じ抗原結合特異性および/または中和活性を共有または保持している。
「機能を有するフラグメント」は、そのフラグメントの元となった抗体と同じ抗原結合特異性と、同じまたは類似の中和活性を保持している、重鎖または軽鎖可変配列の1部分(例えば、免疫グロブリン可変領域のアミノ末端またはカルボキシル末端の小さな欠失)である。
「類似体」は、少なくとも1個のアミノ酸が修飾されているアミノ酸配列であって、その修飾は、化学的または置換または数個のアミノ酸(すなわち10個未満)の再構成とすることができ、その修飾が行われてもそのアミノ酸配列が、非修飾の配列の生物学的特性、例えば、抗原特異性および高アフィニティーなどを保持しているような、アミノ酸配列である。例えば、CDRコード領域内またはその周囲に何らかのエンドヌクレアーゼ制限切断部位が作られる場合には、置換によって、(サイレント)変異を構築することができる。本発明は、本発明の抗体の類似体の使用を意図している。アミノ酸配列または核酸配列に小さな変化を起こると、例えば、実質的に類似の性質を保持している、元のタンパク質の対立形質を有する形態(allelic form)をもたらす可能性があることはよく知られている。従って、本発明の抗体の類似体としては、重鎖および軽鎖の超可変領域のCDRが、上記の表1から6のCDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2、およびCDRL3で定義したCDRと少なくとも80%相同な、好ましくは少なくとも90%相同な、より好ましくは少なくとも95%相同であり、NOGO中和活性を保持しているものが含まれる。アミノ酸配列については、それらの配列を最適に整列させた場合に、ギャップや挿入を同一でない残基として数えて、同じような位置のアミノ酸残基が80%同一である場合には少なくとも80%相同であるとする。本発明はまた、フレームワーク領域が少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、配列番号37から42に示したフレームワーク領域と相同であるような、本発明の抗体の類似体をも意図している。アミノ酸配列については、それらの配列を最適に整列させた場合に、ギャップや挿入を同一でない残基として数えて、同じような位置のアミノ酸残基が80%同一である場合には少なくとも80%相同であるとする。
類似体はまた、対立遺伝子変異としても生ずる。「対立遺伝子変異または修飾」とは、核酸配列の変化である。そのような変異または修飾は遺伝暗号の縮重による可能性があり、または任意に加工して所望の特性を持つようにすることができる。それらの変異または修飾は、コードされるアミノ酸配列の変化をもたらすこともあるがそうでないこともある。
「エフェクター作用薬」とは、改変抗体、および/またはドナー抗体の天然のもしくは合成の軽鎖もしくは重鎖、またはドナー抗体のその他のフラグメントを従来の方法で結合することのできる非タンパク性の担体分子を意味する。そのような非タンパク性担体には診断の分野で用いられている従来の担体、例えばポリスチレンもしくはその他のプラスチックビーズ、BIAcore [Pharmacia]システム中に用いられているものなどのポリ多糖、または医学分野で有用でヒトおよび動物への投与で安全なその他の非タンパク性物質を含むことができる。その他のエフェクター作用薬としては、重金属原子をキレートさせるための大員環化合物、または放射性同位体が含まれる。そのようなエフェクター作用薬は改変抗体の半減期を増加させるために有用なもの、例えばポリエチレングリコールなどとすることもできる。
あるいはまた、ヒト以外の動物種(例えば、ウシ、ヒツジ、サル、ニワトリ、げっ歯類(例えばマウスおよびラット)に、何らかの動物種から得た天然のNOGO、それに対してヒトNOGOと交差反応する様な抗体を作成することのできるような天然の、例えばヒトまたはニワトリのNOGOを提示して免疫し所望の免疫グロブリンを作成して、抗体、改変抗体、およびフラグメントを構築することができる。NOGOに対するヒト以外の動物のmAbを分泌するハイブリドーマ細胞系統を提供するためには、従来のハイブリドーマ技法が用いられる。そのハイブリドーマはその後、NOGOをコートした384ウエルまたは96ウエルのプレートを用いて、ストレプトアビジンをコートしたプレートに結合させたビオチニル化したNOGOとの結合性をスクリーニングするか、またはビオチニル化したNOGOを用いた均一ユーロピウム-APC linkedイムノアッセイでスクリーニングする。
天然のヒト抗体は「Xenomouse TM」(Abgenix)などのヒト抗体マウスで産生させることができるが、そのようなマウスでは、マウス免疫グロブリン遺伝子が除去され、ヒト免疫グロブリンをコードする遺伝子がマウスの染色体中に挿入されている。そのマウスを通常どおり免疫し、そのマウスはヒト遺伝子に由来する免疫応答を示す。このようにしてそのマウスはヒト抗体を産生し、陽性のハイブリドーマの選択後のヒト化の必要性がなくなる(Green, L.L., J. Immunol. Methods, 1999, Dec.10; 231(1-2):11-23を参照せよ)。
本発明はまた、NOGOに対するmAbに由来するFabフラグメントまたはF(ab')2フラグメントの使用をも含む。Fabフラグメントは軽鎖の全てと重鎖のアミノ末端部分を含んでおり、F(ab')2フラグメントはジスルフィド結合で結合した2つのFabフラグメントによって形成されるフラグメントである。FabフラグメントとF(ab')2フラグメントは従来の方法、例えば、適切なタンパク分解酵素であるパパインおよび/またはペプシンでmAbを切断することによって、または組換え法によって得ることができる。FabとF(ab')2はそれら自体が治療または予防剤として有用であり、また本明細書に記載の組換えまたはヒト化抗体の形成に有用な可変領域およびCDR配列を含んでいる配列のドナーとして有用である。
FabおよびF(ab')2フラグメントはコンビナトリアルファージディスプレイライブラリー(例えば、Winterら, Ann. Rev. Immunol., 12:433-455(1994)を参照せよ)、または免疫グロブリン鎖シャフリング(例えば、Marksら, Bio/Technology, 10:779-783(1992)を参照せよ)を介して構築することもでき、これらの文献はその全体を本明細書中に参照により組み入れる。
NOGOに対して特異的なヒト抗体フラグメント(Fv、scFv、Fab)はヒト抗体フラグメントファージディスプレイライブラリーを用いて単離することができる。バクテリオファージの粒子のライブラリー、それはヒト抗体フラグメントタンパク質をディスプレイしているものであるが、それをNOGOタンパク質に対してパニングする。NOGOと結合する抗体フラグメントをディスプレイしているファージをライブラリーから取ってクローンを増幅する。次いでヒト抗体遺伝子をその特定のバクテリオファージから切り出して、ヒトIgGの定常領域を含んでいるヒトIgG発現構築物中に挿入して、NOGOに特異的な単離バクテリオファージからの可変領域を有するインタクトなヒトIgG分子を形成させる。
ドナー抗体は、可変重鎖および/または軽鎖ペプチド配列、フレームワーク配列、CDR配列、ならびにそれらの機能を有するフラグメントおよび類似体などの配列、ならびにそれらをコードする核酸配列であって、そのドナー抗体の抗原結合特異性で特徴付けられる種々の改変抗体をデザインし入手することに有用なものを、与えることができる。
遺伝暗号の縮重を考慮に入れて、ドナー抗体の抗原特異性を共有するような可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列、CDR配列、およびそれらの機能を有するフラグメントおよび類似体をコードする種々のコード配列を構築することができる。可変鎖ペプチド配列またはCDRをコードする単離された核酸配列またはそれのフラグメントは、第2の免疫グロブリンパートナーと機能しうる形で組み合わせて、改変抗体、例えばキメラもしくはヒト化抗体、またはその他の加工抗体を産生させるために用いることができる。
改変免疫グロブリン分子は改変抗体をコードすることができ、その抗体としては、キメラ抗体およびヒト化抗体などの加工抗体が含まれる。望ましい改変免疫グロブリンコード領域は、抗NOGO抗体、好ましくは高アフィニティー抗体の抗原特異性を有しているペプチドをコードするCDRコード領域で、第1の免疫グロブリンパートナー(ヒトフレームワークまたはヒト免疫グロブリン可変領域)中に挿入されたものを含んでいる。
好ましくは、該第1の免疫グロブリンパートナーは機能しうる形で第2の免疫グロブリンパートナーに連結される。該第2の免疫グロブリンパートナーは上記で定義され、対象とする第2の抗体領域、例えばFc領域をコードする配列を含むことができる。第2の免疫グロブリンパートナーはまた、もう一つの別の免疫グロブリン、それはそれに対して軽鎖または重鎖定常領域がインフレームで融合されるか、またはリンカー配列によって連結されることとなるものであるが、その免疫グロブリンをコードする配列を含むことができる。NOGOの機能を有する断片または類似体に対するものとして作られた加工抗体は結合が増強されるようにデザインすることができる。
該第2の免疫グロブリンパートナーも上述のエフェクター作用薬と会合させるることができ、そのエフェクター作用薬としては非タンパク質担体分子が含まれ、それに対して第2の免疫グロブリンパートナーを従来法によって機能しうる形で連結することができる。
該第2の免疫グロブリンパートナー、例えば抗体配列と、該エフェクター作用薬との間の融合または連結は、何らかの適切な方法、例えば、従来の共有結合もしくはイオン結合、タンパク質の融合、またはヘテロ二機能性架橋剤、例えばカルボジイミド、グルタールアルデヒド、および類似のもので行うことができる。そのような技法は当業界では既知であり、従来の化学および生化学の教科書中に述べられている。
さらに、第2の免疫グロブリンパートナーとエフェクター作用薬との間に所望の量のスペースを提供することのみを行う従来のリンカー配列も、改変免疫グロブリンコード領域中に構築することができる。そのようなリンカーのデザインは当業者にはよく知られている。本発明のさらに別の態様においては、NOGOと結合しNOGOの機能を中和する、上述のCDRの1個以上を有する、二重特異性抗体(diabody)(2価または二重特異性)、三重特異性抗体(triabody)、四重特異性抗体(tetrabody)、およびその他の多価のscFvタンパク質分子種が提供される。
さらに別の実施形態においては、本発明の抗体はそれに付着させた別の薬剤を有する。例えば、組換えDNA技術の方法を、本発明の加工抗体を作成するために用いることができ、その加工抗体では、抗体の完全長の分子のFcフラグメントまたはCH2-CH3ドメインは酵素またはその他の検出可能な分子(すなわち、ポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子)で置換されている。
第2の免疫グロブリンパートナーはまた、抗NOGO抗体の抗原特異性を有しているCDR含有配列とは異種の、免疫グロブリンでないペプチド、タンパク質またはそれらの断片に機能しうる形で連結させることができる。この結果得られたタンパク質は発現されると抗NOGO抗原特異性と免疫グロブリンでないものの特性の双方を示すことができる。融合のパートナーの特性は、例えば、別の結合もしくは受容体ドメインなどの機能的特性、またはその融合パートナー自体が治療用タンパク質であるような場合には治療的特性、または別の抗原性を追加することができる。
本発明の別の望ましいタンパク質は、完全長の重鎖および軽鎖またはFabもしくはF(ab'2)などのそれらの何らかの個別のフラグメント、重鎖2量体またはFvもしくは単鎖抗体(SCA)などのその2量体の最少の組換えフラグメント、あるいは選択されたドナーmAbと同じ特異性を有する何らかの他の分子を含むものとすることができる。そのようなタンパク質は改変抗体の形態で用いることができ、またはそのタンパク質の融合していない形態で用いることができる。
第2の免疫グロブリンパートナーがドナー抗体とは異なる抗体、例えば免疫グロブリンフレームワークまたは定常領域の何らかのアイソタイプまたはクラスから由来したものである場合には常に、加工抗体がもたらされる。加工抗体は、1つのソース、例えば、アクセプター抗体からの免疫グロブリン(Ig)定常領域および可変フレームワーク領域、ならびにドナー抗体由来の1つ以上の(好ましくは全ての)CDRを含んでなるものとすることができる。さらに、ドナー抗体の抗原結合特異性を保持するために、アクセプターmAbの軽鎖および/もしくは重鎖可変ドメインフレームワーク領域、またはドナーCDR領域の、核酸レベルもしくはアミノ酸レベルでの、例えば欠失、置換、もしくは付加などの改変を行うことができる。
そのような加工抗体は、抗NOGO mAbの可変重鎖および/もしくは軽鎖の一方(または双方)、または重鎖もしくは軽鎖CDRのうちの1つ以上を用いるようにデザインされる。その加工抗体は上記で定義したとおり、中和抗体とすることができる。
そのような加工抗体としては、選択したヒト免疫グロブリンもしくはサブタイプのフレームワーク領域を含んでいるヒト化抗体、または抗NOGO抗体の機能を有するフラグメントに融合させたヒト重鎖および軽鎖定常領域を含んでいるキメラ抗体が含まれる。適切なヒト(またはその他の動物)のアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列との相同性に基づいて、従来のデータベース、例えば、KABAT(登録商標)データベース、Los Alamosデータベース、およびSwiss Proteinデータベースから選択したものとすることができる。ドナー抗体のフレームワーク領域に対する相同性(アミノ酸ベースで)で特徴付けられるヒト抗体はおそらくドナーCDRの挿入のための重鎖定常領域および/または重鎖可変フレームワーク領域を提供することに適しているであろう。軽鎖定常領域または可変フレームワーク領域を提供することのできる適切なアクセプター抗体は類似の方法で選択することができる。該アクセプター抗体の重鎖および軽鎖が同一のアクセプター抗体を起源とするものである必要がないことに注目すべきである。
望ましくは、異種のフレームワークおよび定常領域はヒト免疫グロブリンのクラスおよびアイソタイプ、例えばIgG(サブタイプ1から4)、IgM、IgA、およびIgEから選択される。しかし、そのアクセプター抗体は、ヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含んだものである必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリンの鎖の一部をコードしているDNA配列がヒト以外の免疫グロブリンのアミノ酸配列、例えばポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子などをコードするDNAと融合している遺伝子を構築することができる。
好ましくは、ヒト化抗体においては、ヒト重鎖および軽鎖の双方の可変ドメインは、1つ以上のCDRを置換することによって加工される。6つのCDRの全て、または6つ未満のCDRを様々に組み合わせて用いることができる。好ましくは6個のCDR全てが置換される。ヒトアクセプター抗体由来の軽鎖を非修飾のまま軽鎖として用い、ヒト重鎖中のCDRのみを置換することができる。あるいはまた、両立しうる軽鎖を別のヒト抗体から従来の抗体データベースを利用して選択することができる。加工抗体の残りの部分は何らかの適切なアクセプターヒト免疫グロブリン由来のものとすることができる。
加工ヒト化抗体は好ましくは、天然のヒト抗体またはそのフラグメントの構造を有し、効果的な治療用とのために必要な性質の組み合わせを有しているものである。
ドナー抗体の特異性と高アフィニティーに影響を及ぼすことなく可変ドメインのアミノ酸に変化を与えることによって加工抗体をさらに修飾できること(すなわち、類似体)は当業者であれば理解されよう。重鎖のアミノ酸と軽鎖のアミノ酸はそれらが可変ドメインフレームワーク中、またはCDR中、またはその双方のいずれにあっても、他のアミノ酸で置換することができるものと考えられる。
さらに、定常領域は本発明の分子の選択された特性を増強または低減させるために改変することができる。それらの特性とは例えば、2量体化、Fc受容体への結合、または補体の結合能および活性化能である(例えば、Angalら, Mol. Immunol., 30:105-108 (1993), Xuら, J. Biol. Chem., 269:3469-3474 (1994), Winterら, EP 307,434-Bを参照せよ)。
キメラ抗体であるような改変抗体は上述のヒト化抗体とは異なり、ヒト以外の動物のドナー抗体の重鎖および軽鎖可変領域全体、それにはフレームワーク領域が含まれるが、それを他の動物種(好ましくは双方の鎖がヒトのものであるが)由来の免疫グロブリン定常領域と結合させたものである。
好ましくは、適切なドナーmAbの可変軽鎖および/もしくは重鎖配列およびCDR、ならびにそれらをコードする核酸配列が、下記のプロセスで、本発明の改変抗体、好ましくはヒト化抗体の構築に用いられる。本発明のその他の実施形態ものの作成にも同一のまたは類似の技法を用いることができる。
選択されたドナーmAbを産生するハイブリドーマは、従来法でクローン化され、そのmAbの重鎖および軽鎖可変領域のDNAは同業者には既知の技法で得られるが、その技法については例えば、Sambrookら(「分子クローニング、実験室マニュアル」"Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory(1989))に記載されている。ドナーmAbの結合特異性を保持するために必要な、少なくともCDRコード領域とアクセプターmAbの軽鎖および/または重鎖可変ドメインフレームワーク領域を含んでいる可変重鎖領域と可変軽鎖領域、ならびにヒト免疫グロブリン由来の抗体鎖の残りの免疫グロブリン由来部分は、ポリヌクレオチドプライマーおよび逆転写酵素を用いて得られる。CDRコード領域は既知のデータベースを用い、他の抗体と比較することによって同定される。
次いで、マウス/ヒトキメラ抗体を調製し結合活性をアッセイすることができる。このようなキメラ抗体は、ヒト以外の動物のドナー抗体VHおよびVL領域の完全長のものがそれぞれの鎖のヒトIg定常領域と結合したものを含んでいる。
ヒト抗体由来の重鎖可変領域の相同なフレームワーク領域は、コンピュータ化したデータベース、例えば、KABAT(登録商標)を用いて同定することができ、そのドナー抗体と相同なヒト抗体はアクセプター抗体として選択されることとなる。適切な軽鎖可変フレームワーク領域は類似の方法でデザインすることができる。
ヒト化抗体は、キメラ抗体由来のもの、または好ましくは、ドナーmAbの重鎖および軽鎖から由来したCDRコード領域を、選択された重鎖および軽鎖フレームワーク内に適切に挿入することによって合成で作成したものとすることができる。あるいはまた、ヒト化抗体は標準的な突然変異誘発法を用いて作成することができる。従って、この結果得られたヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域とドナーmAbのCDRコード領域を含んでいる。その後に、フレームワーク領域の操作を行うことができる。この結果得られたヒト化抗体は組換え宿主細胞、例えばCOS、CHO、または骨髄腫細胞中で発現させることができる。
従来から用いられている発現ベクターまたは組換えプラスミドは、該抗体をコードするコード配列を、宿主細胞中での複製と発現および/または宿主細胞からの分泌を調節することのできる従来の調節配列と、機能しうる形で結合するように置くことによって作成する。調節配列としては、プロモーター配列、例えばCMVプロモーター、およびシグナル配列が含まれ、それらは他の既知の抗体由来のものとすることができる。同様に、相補的抗体軽鎖または重鎖をコードするDNA配列を有する第2の発現ベクターを作成することができる。この第2の発現ベクターは、各ポリペプチド鎖の機能を有する形での発現が可能な限り確保できるように、該コード配列と選択マーカーに関するもの以外は第1のベクターと同一であることが好ましい。あるいはまた、該改変抗体のための重鎖と軽鎖コード配列は単一のベクター上にあるようにすることができる。
選択された宿主細胞は従来の技法で、該第1のベクターと第2のベクターで同時トランスフェクトされて(または単一のベクターのみでトランスフェクされて)、組換えまたは合成軽鎖および重鎖を含んでなる、本発明のトランスフェクトされた宿主細胞を作る。次いでこのトランスフェクトされた細胞を従来の技法で培養して本発明の加工抗体を作成する。該組換え重鎖および/または軽鎖の双方の結合したものを含んでいる抗体は、培養液から適切なアッセイ法、例えばELISAまたはRIAによって、スクリーニングされる。同様の従来技法を、他の改変抗体および分子の構築に用いることができる。
本発明の方法と組成物の構築に用いられるクローニングとサブクローニングのための適切なベクターは、当業者であれば選択することができる。例えば、従来のpUCシリーズのクローニングベクターを用いることができる。そのうちの1つであるpUC19ベクターは、Amersham(Buckinghamshire, United Kingdom)またはPharmacia(Uppsala, Sweden)などの供給者から市販されている。さらに、容易に複製させることができ、クローニング部位と選択しうる遺伝子(例えば抗生物質耐性)を豊富に有し、取り扱いが容易なベクターならどれでもクローニングに用いることができる。従って、クローニングベクターの選択は本発明の限定要因ではない。
同様に、該抗体の発現のために用いるベクターは当業者であれば従来のベクターのいずれかのものを選択することができる。該ベクターには、選択された宿主細胞中での異種DNA配列の複製と発現を指示する、選択された調節配列(例えば、CMVまたはRSVプロモーター)も含ませることができる。これらのベクターは、該抗体または改変免疫グロブリンコード領域をコードする上述のDNA配列を含んでいる。さらに、該ベクターには、取り扱いを容易にするために所望の制限酵素切断部位を挿入することによって修飾された、選択した免疫グロブリン配列を組み入れることができる。
該発現ベクターはまた、異種DNA配列の発現を増幅するために適した遺伝子(例えば哺乳類ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(DHFR))によって特徴付けられるものとすることができる。その他の好ましいベクター配列としては、例えばウシ成長ホルモン(BGH)由来のポリAシグナル配列、およびβグロビンプロモーター配列(betaglopro)が含まれる。これらの本発明に有用な発現ベクターは、当業者にはよく知られた技法によって合成することができる。
選択された宿主中での該組換えDNAのサンプルの発現および/または分泌の指令に用いるためのそのようなベクターの構成成分、例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサー、プロモーター、シグナル配列、および類似のものは、市販のものまたは天然のソースから、または既知の方法で合成したものから得ることができる。哺乳類、細菌、昆虫、酵母、および真菌での発現のためのその他の適切な発現ベクターは当業界では多数のタイプのものが知られており、それらもこの目的のために選択することができる。
本発明はまた、該抗体またはそれの改変免疫グロブリン分子のコード配列を含んでいる組換えプラスミドでトランスフェクトされた細胞系統をも包含する。クローニングに有用な宿主細胞およびそれらのクローニングベクターのその他の操作も従来の方法である。しかし、最も望ましいのは、大腸菌(E.coli)の種々の株からの細胞を、本発明の改変抗体の構築において該クローニングベクターの複製およびその他のステップに用いることである。
本発明の抗体の発現用として適切な宿主細胞または細胞系統は、好ましくはNS0、Sp2/0、CHO(例えばDG44)、COS、線維芽細胞(例えば3T3)、および骨髄腫細胞などの哺乳類細胞で、より好ましくはCHOおよび骨髄腫細胞である。ヒト細胞を用いることができ、それによって該分子がヒトの糖鎖付加パターンで修飾されることとなる。あるいはまた、その他の真核細胞系統を用いることができる。適切な哺乳類宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、および産物の産生と精製の方法は当業界では公知である。例えば、Sambrookら, 上述の文献を参照せよ。
本発明の組換えFabの発現に適した宿主細胞としては細菌細胞が有用であり得る(例えば、Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188(1992)を参照せよ)。しかし、細菌細胞中で発現されるタンパク質は、折り畳まれていないか不適切に折り畳まれた形態であるか、または糖鎖が付加されていない形態であるので、細菌細胞内で産生された組換えFabは全て抗原結合能の保持についてスクリーニングしなければならないであろう。細菌細胞によって発現された分子が適切に折り畳まれた形態であるならば、その細菌細胞は望ましい宿主であろう。例えば、発現用に用いられる大腸菌(E.coli)の種々の株はバイオテクノロジーの分野で宿主細胞としてよく知られている。枯草菌(B.subtilis)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、その他の桿菌および類似のものもこの方法に用いることができる。
所望により、当業者には既知の酵母細胞の株も宿主細胞として用いることができ、また、昆虫細胞、例えば、DrosphilaおよびLepidopteraとウイルス発現系も用いることができる。例えば、Millerら, Genetic Engineering, 8;277-298, Plenum Press (1986)およびその論文中の参照文献を参照せよ。
該ベクターを構築する一般的な方法、本発明の宿主細胞を作成するために必要なトランスフェクション方法、およびその宿主細胞から本発明の抗体を産生させるために必要な培養方法は、全て従来の技法である。典型的には、本発明の培養方法は無血清培養法であり、通常は細胞を無血清で懸濁して培養する。同様に、産生後は本発明の抗体は、培養の内容物から当業界の標準的な方法、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および類似の方法に従って精製することができる。そのような技法は当業界で用いられているものであり、本発明を制限しない。例えば、改変抗体の調製法はWO 99/58679およびWO 96/16990に述べられている。
該抗体のまた別の発現方法では、米国特許第4,873,316号に記載されているものなどのトランスジェニック動物での発現を利用することができる。この特許は動物のカゼインプロモーターを用いる発現系に関し、哺乳類中にトランスジェニックとして組み入れられれば、雌の動物がその乳汁中にその所望の組換えタンパク質を産生することができるようになる。
本発明のさらに別の態様においては、本発明の抗体を産生する方法が提供され、その方法は、本発明の抗体の軽鎖および/または重鎖をコードするベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を培養し、それによって産生された抗体を回収することを含んでなる。
本発明では、ヒトNOGO-Aと特異的に結合しその活性を中和する抗NOGO抗体を産生する方法を提供し、その方法は次のステップを含んでなる；
(a)該抗体の重鎖をコードする第1のベクターを提供し、
(b)該抗体の軽鎖をコードする第2のベクターを提供し、
(c)哺乳類の宿主細胞(例えばCHO)を該第1と第2のベクターで形質転換し、
(d)ステップ(c)の宿主細胞を、その宿主細胞が該培地中にその抗体を分泌するような条件下で培養し、
(e)ステップ(d)の分泌された抗体を回収すること。
所望の方法で発現させた後、適切なアッセイを用いることによって該抗体のin vitroの活性について調べる。該抗体のNOGOに対する結合を定性的および定量的に調べるために、現在は、従来のELISAアッセイフォーマットが用いられている。さらに、該抗体の通常のクリアランス機作にかかわらずどの程度生体内で持続するかを評価するために行われるヒト臨床試験の前に中和活性を確認するために、その他のin vitroアッセイも、用いることができる。
本発明の治療用薬剤は予防として投与することができ、または脳卒中のイベント/臨床症状の発症後に、またはその他の必要とされる場合に投与することができる。ヒトの循環血液中の本発明の分子の相対的な持続期間は治療の投与量と期間に関連し、当業者であれば治療しようとする状態とその患者の一般的健康状態の如何によって調製することができる。最大の治療効果を達成するためには、長期間にわたる(例えば4から6ヶ月間)反復投与(例えば、週1回または2週間に1回)がおそらく必要であろうと考えられる。
本発明の治療用薬剤の投与方法は、その治療用薬剤を宿主に送達するどのような経路でも取ることができる。本発明のアンタゴニストと抗体、および医薬組成物は、非経口投与、すなわち、皮下、髄腔内、腹腔内、筋肉内、静脈内、または鼻腔内への投与に特に有用であり、そのうち静脈内が特に好ましい。
本発明の治療用薬剤は、製薬上許容される担体中に活性成分として本発明のアンタゴニストまたは抗体の有効量を含有する医薬組成物として調製することができる。本発明の予防用薬剤では、加工抗体を含有する水性懸濁液または溶液で、好ましくは生理学的pHで緩衝化され、直ちに注射できる形態のものが好ましい。非経口投与用の組成物は通常は、製薬上許容される担体、好ましくは水性の担体中に溶解させた本発明のアンタゴニストもしくは抗体の溶液、またはそれらのカクテルを含んでなる。種々の水性担体を用いることができ、例えば、0.9%食塩液、0.3%グリシン、および類似のものを用いることができる。これらの溶液は無菌であり、通常は微粒子を含まない。これらの溶液は従来のよく知られた滅菌法(例えばろ過)で滅菌することができる。該組成物には、pH調製や緩衝剤その他など、生理学的条件に近似させるために必要であれば製薬上許容される添加剤を含有させることができる。そのような医薬品製剤中の本発明のアンタゴニストまたは抗体の濃度は広い範囲、すなわち、重量比で約0.5%未満、通常は少なくとも約1%から15または20%に至るまでとすることができ、選択した特定の投与方法に従って、主として液量、粘度、その他に基づいて選択される。
筋肉内注射用の本発明の医薬組成物は、1mLの滅菌緩衝水、および本発明のアンタゴニストまたは抗体の約1 ngから約100 mg、例えば約50 ngから約30 mg、より好ましくは約5 mgから約25 mgを含有するように調製しうる。同様に、静脈内注入用の本発明の医薬組成物は、約250 mLの滅菌リンゲル液、および本発明の加工抗体の約1から30 mg、好ましくは5 mgから25 mgを含有するように調製しうる。非経口的に投与可能な組成物の実際の調製方法は、当業者にはよく知られているかまたは明白であり、より詳細には、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 第15版, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaに記載されている。本発明の抗体製剤で静脈内投与できるものの調製については、Lamar, U.とParkins, D., 「生物医薬製剤の製剤化」“The formulation of Biopharmaceutical products”, Pharma. Sci.Tech.today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000), Wang, W.「液状タンパク質医薬品の不安定性、安定化、および製剤化」“Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals”, Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B,Ahern T.J.編, Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992); Akers,M.J.「非経口投与用製剤中の添加剤-薬剤相互作用」“Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations”, J.Pharm. Sci, 91(2002) 2283-2300; Imamura, K.「乾燥状態のタンパク質の安定化に及ぼす糖のタイプの影響」“Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state”, J Pharm Sci 92 (2003) 266-274;Izutsu, Kkojima, S.,「凍結乾燥の際の添加剤の結晶性とそのタンパク質構造安定化作用」“Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying”, J Pharm. Pharmacol, 54 (2002):1033-1039, Johnson, R,「マンニトール-ショ糖混合物−タンパク質の凍結乾燥のための多用途剤型」“Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization”, J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922、Ha,E Wang W, Wang Y.j.「ポリソルベート80中の過酸化物の形成およびタンパク質の安定性」“Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability”, J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)、を参照のこと。
これらの文献の全体を本明細書中に参照により組み入れ、それらに対して読者は明確に参照しうる。
本発明の治療用薬剤は医薬品製剤中ではユニット投与量の形態であることが好ましい。適切な治療上有効な投与量は当業者であれば容易に決定できる。ヒトでの脳卒中およびその他の神経疾患を効果的に治療するためには、70 kg体重あたり本発明のアンタゴニストまたは抗体を最高700 mgまで、非経口的に、好ましくは静脈内または筋肉内に、投与すべきである。このような投与量は、必要に応じて、医師が適切であると選択した適切な時間間隔で反復することができる。実施例中で開示しているとおり、本発明の発明者らは、本発明の抗体を静脈内に投与したとき、ラットモデルにおいて機能回復に良い影響を及ぼすことを示すことができた。
本明細書に記載の抗体は保存のために凍結乾燥することができ、使用前に適切な担体で溶解することができる。この方法は従来の免疫グロブリン製剤で有効であることが示されており、当業界で既知の凍結乾燥法と溶解法を用いることができる。
本発明の抗体はまた、神経成長因子(NGF)などの神経栄養因子、例えば脳由来神経栄養因子(BDNF)など、コルチコステロイドなどの抗炎症剤、および/またはtPAと組み合わせて(すなわち同時に、順次、または別々に)用いることができる。本発明のNOGO抗体と例えばtPAとの組み合わせは下記の実施例で説明しているMCAOモデルで評価することができる。
別の態様においては、本発明は、脳卒中およびその他の神経疾患の治療または予防のための、本発明の抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメント、および製薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
さらにまた別の態様においては、本発明は、脳卒中およびその他の神経疾患に罹患している、または発症の危険性のある患者における神経変性の阻害および/または機能回復の促進のための、本発明の抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメント、および製薬上許容される担体を含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明はさらに、ヒトにおける脳卒中(特に虚血性脳卒中)およびその他の神経疾患/障害、特にアルツハイマー病の治療または予防の方法を提供し、その方法はそのような治療または予防を必要とするヒトに抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントの有効量を投与することを含んでなる。本発明の抗体は、患者の既に定着した疾患の治療に加えて(またはそれの代替として)、アルツハイマー病の進行および/または発症を遅らせるかもしくは停止させるための治療方法で用いることができる。
さらに本発明は脳卒中およびその他の神経疾患/障害、特にアルツハイマー病の治療または予防のための医薬品の調製における、抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントの使用を提供する。
本発明はまた、脳卒中およびその他の神経疾患/障害、特にアルツハイマー病に罹患している、または発症の危険性のある患者における神経変性を阻害する、および/または機能回復を促進する方法を提供し、その方法はそのような治療または予防を必要とするヒトに抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントの有効量を投与することを含んでなる。
さらに、本発明は抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントの、脳卒中およびその他の神経疾患/障害、特にアルツハイマー病に罹患している、または発症の危険性のある患者における神経変性の阻害および/または機能回復の促進のための医薬品の調製における使用を提供する。
本発明はさらに、脳卒中およびその他の神経疾患/障害、特にアルツハイマー病の患者を治療または予防する方法を提供し、その方法は抗NOGO抗体の治療上有効な量の非経口的投与のステップを含んでなる。好ましくは該抗NOGO抗体は静脈内に投与される。
上述の神経疾患または障害としては、限定はされないが、外傷性脳損傷、脊髄損傷、側頭前頭葉性認知症(タウオパチー)、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、および特にアルツハイマー病が含まれる。
本発明はまた、軸索の出芽を促進する方法を提供し、その方法は、ヒトの軸索を抗NOGO抗体と接触させるステップを含んでなる。この方法はin vitroまたはin vivoで行うことができ、好ましくはその方法はin vivoで行われる。
従って、さらに別の態様においては、静脈内に投与可能な形態の、表1および2のCDR；表3および4のCDR；または表5および6のCDRを含んでなる本発明の抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントの、ヒトの患者の脳卒中(特に虚血性脳卒中)、脳損傷、脊髄損傷、側頭前頭葉性認知症(タウオパチー)、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、および特にアルツハイマー病の治療のための医薬品の製造における使用が提供される。
従って、さらに別の態様においては、ヒトの患者の脳卒中(特に虚血性脳卒中)、脳損傷、脊髄損傷、側頭前頭葉性認知症(タウオパチー)、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、および特にアルツハイマー病を治療する方法が提供され、その方法には本発明の抗NOGO抗体の治療上有効な量の静脈内投与を含んでなる。
本発明のさらに別の態様においては、ヒト(例えば患者)の中枢神経系内のニューロンの軸索の出芽を促進する方法が提供され、その方法は、抗NOGO抗体(例えば、本明細書で説明しているCDRを含んでいる抗NOGO抗体)の治療上有効な量を投与すること(例えば、静脈内投与)を含んでなる。
本発明のさらに別の態様においては、抗NOGO抗体(例えば、本明細書で説明しているCDRを含んでいる抗NOGO抗体)の、ヒトの患者の脳卒中(特に虚血性脳卒中)、脳損傷、脊髄損傷、側頭前頭葉性認知症(タウオパチー)、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、および特にアルツハイマー病の治療のための、静脈内に投与可能な医薬品の製造における使用を提供する。
本発明のさらに別の態様においては、脳卒中(特に虚血性脳卒中)、脳損傷、脊髄損傷、側頭前頭葉性認知症(タウオパチー)、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、および特にアルツハイマー病に罹患しているヒトの患者において中枢神経系のニューロン中の軸索プロセスを再生させる方法が提供され、その方法は抗NOGO抗体(例えば、本明細書で説明しているCDRを有する抗NOGO抗体)の治療上有効な量を投与する(例えば、静脈内に)ステップを含んでなる。
本発明のさらに別の態様においては、抗NOGO抗体(例えば、本明細書で説明しているCDRを有する抗NOGO抗体)の、脳卒中(特に虚血性脳卒中)、脳損傷、脊髄損傷、側頭前頭葉性認知症(タウオパチー)、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、および特にアルツハイマー病に罹患しているヒトの患者において中枢神経系のニューロン中の軸索プロセスを再生させるための、静脈内に投与可能な医薬組成物の製造における使用を提供する。
本発明のさらに別の態様において、アミロイド生成性ペプチドの産生を調節する方法を提供し、その方法は、アミロイド生成性ペプチドの元となった前駆体を発現している細胞およびNOGOポリペプチド(例えばヒトNOGO-A)を、抗NOGO抗体(例えば、本明細書で説明しているCDRを有する抗NOGO抗体、特に2A10および完全にヒト型のまたはそれのヒト化したもの)と接触させることを含んでなる。典型的な実施形態においては、該前駆体はAPPである。さらに典型的な実施形態においては、このアミロイド原性ペプチドはAβであり、より好ましくはAβ40、Aβ42、またはその2つの組み合わせである。
本明細書で用いている「機能回復」とは、例えば、虚血イベントまたは損傷または臨床症状の発症後の患者における運動および/または感覚および/または行動の改善を意味する。ヒトにおける機能回復は、運動の強さ、感覚と協調、記憶、言語および指示に従う能力などの認知機能、および日常生活の基礎的アクティビティーまたは道具的アクティビティーのような機能的能力(functional capacities)などの基礎的な神経機能を測定するためにデザインされた装置によって評価することができる。基礎的神経機能の回復はNIH Stroke Scale(NIHSS)などの装置を用いて測定することができ、認知機能の回復は、神経心理学的試験、例えばBoston Naming Test、Trail-making Test、およびCalifornia Verbal Leaming Testなどで測定することができ、日常生活のアクティビティーについては、ADCS/ADL(Alzheimer's Disease Clinical Studies/Activities of Daily Living)スケールまたは、Bristol Activities of Daily Living Scaleを用いて測定することができ、これら全ての試験とスケールは当業界では既知である。
下記の実施例は本発明を説明するものであるが、限定するものではない。
実施例1 ハイブリドーマの調製と選択
抗NOGOモノクローナル抗体はハイブリドーマ細胞によって産生され、その細胞はマウス骨髄腫細胞を、標的とする抗原で免疫されたマウスから得られたBリンパ球と融合して得られるものである。そのハイブリドーマ細胞は、融合相手である骨髄腫細胞により無限に分裂可能となり、一方、抗体を産生する能力はBリンパ球によって提供される。各々のハイブリドーマ細胞はユニークな特異性を有する1種の個別の抗体のみを作製するので、モノクローナルと呼ばれている。
SJLマウスを、CFAとRIBIの双方をアジュバントとして用いて総蛋白質量が10μgのタンパク質(ヒトNOGO-Aスプライス(アミノ酸186-1004)とラットNOGO-Aスプライス(アミノ酸173-975)を1：1としてE.Coli BL21株中でGST融合タンパク質として産生させたもの)を皮下に投与して免疫した。4日後および8日後にそのマウスを同じタンパク質でRIBIをアジュバントとして用いてブーストした。さらに3日後、リンパ節をその場所でドレインさせて免疫細胞を採取しPEG 1500を用いてマウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製した。2ラウンドの限界希釈によって個々のハイブリドーマ細胞系統をクローン化した。ヒトNOGO-AおよびラットNOGO-Aの双方を用いてマウスを免疫することによってラットとヒトとの双方のNOGO-Aに良好な結合特異性および/または結合アフィニティーを有する抗体を作成することができる。このことによってヒトに投与する前にラットおよび/またはげっ歯類モデル動物でそのような抗体を評価することができるようになる。
ハイブリドーマで産生される抗体の選択はまず、マイクロタイタープレート上でNOGOタンパク質との直接的結合に基づいて行った。次いで、ELISAアッセイでこの結合活性と競合する可溶性タンパク質(PrescissionTM プロテアーゼを用いてGST部分から切り出したヒトNOGO-A配列からなる)の能力に基づいて約60個のハイブリドーマを選択した。
実施例2 可変領域のクローニング
総RNAを選択した2A10/3、2C4/1、および15C3/3ハイブリドーマ細胞から抽出した後、逆転写とポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて重鎖と軽鎖の可変ドメインcDNA配列を抽出した。RT-PCRのためのフォワードプライマーは、マウス免疫グロブリン遺伝子リーダー配列に特異的な変性プライマーの混合物であり、リバースプライマーは定常領域に向けられたアイソタイプ特異的抗体とした。PCRプライマーは、DNA配列分析のためにpUC19中にクローニングしうるように5'制限酵素認識部位を有するようにデザインした。
RNA抽出
総RNAは各ハイブリドーマクローンの106個の細胞のペレットから、Promega社のSV Total RNA Isolation Systemを、製造者の使用説明書に従って用いて抽出した。
逆転写
マウスリーダー配列に特異的なフォワードプライマーとマウスIgGκ定常領域に特異的なリバースプライマーを用い、RNAを逆転写して重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインのcDNAを作成した。ハイブリドーマ2C4/1と15C3/3にはIgGγ1リバースプライマーを用い、2A10/3にはIgGγ2bリバースプライマーを用いた。フォワードプライマーはその5'末端にSalI制限酵素認識部位を有するようにし、制限酵素切断を効果的に行うためにその5'末端にさらに4つのヌクレオチドを付加した。これらのプライマーはJones, S.T.とBending, M.M.(Biotechnology, 9:88-89)の報告しているものを改変したものである。リバースプライマーはその5'末端にXmaI制限酵素認識部位を有しさらに4個のヌクレオチドを付加した。
プライマー
マウスVHリーダー配列フォワードプライマー：
AG77: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA ATG CAG CTG GGT CAT STT CTT C-3' (配列番号51)
AG78: 5'-ACT AGT CGA CAT GGG ATG GAG CTR TAT CAT SYT CTT-3' (配列番号52)
AG79: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA GWT GTG GTT AAA CTG GGT TTT T-3' (配列番号53)
AG80: 5'-ACT AGT CGA CAT GRA CTT TGG GYT CAG CTT GRT TT-3' (配列番号54)
AG81: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA CTC CAG GCT CAA TTT AGT TTT CCT T-3' (配列番号55)
AG82: 5'-ACT AGT CGA CAT GGC TGT CYT RGS GCT RCT CTT CTG C-3' (配列番号56)
AG83: 5'-ACT AGT CGA CAT GGR ATG GAG CKG GRT CTT TMT CTT-3' (配列番号57)
AG84: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG AGT GCT GAT TCT TTT GTG-3' (配列番号58)
AG85: 5'-ACT AGT CGA CAT GGM TTG GGT GTG GAM CTT GCT ATT CCT G-3' (配列番号59)
AG86: 5'-ACT AGT CGA CAT GGG CAG ACT TAC ATT CTC ATT CCT G-3' (配列番号60)
AG87: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA TTT TGG GCT GAT TTT TTT TAT TG-3' (配列番号61)
AG89: 5'-ACT AGT CGA CAT GAT GGT GTT AAG TCT TCT GTA CCT G-3' (配列番号62)
マウスV L リーダー配列フォワードプライマー：
AG90: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT GGT GCT G-3' (配列番号63)
AG91: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA GWC AGA CAC ACT CCT GYT ATG GGT-3' (配列番号64)
AG92: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG TGT GCT CAC TCA GGT CCT GGC GTT G-3' (配列番号65)
AG93: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG GRC CCC TGC TCA GWT TYT TGG MWT CTT G-3' (配列番号66)
AG94: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C-3' (配列番号67)
AG95: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG GTK CYY TGY TSA GYT YCT GRG G-3' (配列番号68)
AG96: 5'-ACT AGT CGA CAT GGG CWT CAA GAT GGA GTC ACA KWY YCW GG-3' (配列番号69)
AG97: 5'-ACT AGT CGA CAT GTG GGG AYC TKT TTY CMM TTT TTC AAT TG-3' (配列番号70)
AG98: 5'-ACT AGT CGA CAT GGT RTC CWC ASC TCA GTT CCT TG-3' (配列番号71)
AG99: 5'-ACT AGT CGA CAT GTA TAT ATG TTT GTT GTC TAT TTC T-3' (配列番号72)
AG100: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA AGC CCC AGC TCA GCT TCT CTT CC-3' (配列番号73)
MKV12: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA GTT TCC TTC TCA ACT TCT GCT C-3' (配列番号74)
マウスγ1定常領域リバースプライマー：
AG102: 5'-GGA TCC CGG GCC AGT GGA TAG ACA GAT G-3' (配列番号75)
マウスγ2b定常領域リバースプライマー：
AG104: 5'-GGA TCC CGG GAG TGG ATA GAC TGA TGG-3' (配列番号76)
マウスκ定常領域リバースプライマー：
AG101: 5'-GGA TCC CGG GTG GAT GGT GGG AAG ATG-3' (配列番号77)
マウスVHまたはVLリーダー配列フォワードプライマーのプールを50μMの濃度に調製した。マウスγまたはκ定常領域リバースプライマーも50μMに調製した。
逆転写PCR(RT-PCR)
重鎖および軽鎖の可変領域をコードするRNAの逆転写はPromega社のAccess RT-PCR Systemを製造者の使用説明書に従って用いて重複して行った。そのシステムで提供されているRT-PCRバッファー、0.2 mM dNTP、1μMの各プライマーのセット、1μM MgSO4、およびAMV 逆転写酵素およびTfl DNAポリメラーゼをそれぞれ5U含有している50μLの反応液中に約200 ngのRNAを含むようにした。
RT-PCRサイクル 1- 48℃で45分間
2- 94℃で2分間
3- 94℃で30秒間
4- 50℃で1分間
5- 68℃で2分間
6- 68℃で7分間
ステップ3から5を30回繰り返す。
pUC19クローニング
可変領域のRT-PCR産物をQiagen MinElute Qiagen PCR Purificationキットを使用説明書に従って用いて精製し、New England Biolabsから入手したXmaIおよびSalIを製造者の使用説明書に従って順次用いて消化した。その後それらの産物を0.5%臭化エチジウムを含有する調製用1% アガロースゲル上にロードし、TAEバッファー中で50mAで1時間泳動させ、V領域のバンドを紫外線下で切り出した。そのゲルからDNA断片をQiagenのMinElute Gel抽出キットを製造者の使用説明書に従って用いて精製した。pUC19ベクターアームはpUC19をSalIおよびSmaIで消化した後、QiagenのMinElute Reaction Clean upキットを用いて精製し、エビ(Shrimp)アルカリホスファターゼ(USB)を製造者の使用説明書に従って用いて脱リン酸化して調製した。そのベクターアームとV領域フラグメントの濃度は、1:2のモル比で混合した分析用1%アガロース/臭化エチジウムゲルで推定し、PromegaのQuick Ligation キットを製造者の使用説明書に従って用いて連結させた。連結させたプラスミドをDH5α細胞(Invitrogen)中に製造者の使用説明書に従って形質転換した。100μg/mLのアンピシリン含有のL-寒天プレート上で増殖したコロニーを選択してDNA配列分析を行った。
可変領域の配列分析
コロニーを100μg/mLのアンピシリンを添加した5mLのLB培地中で37℃で一晩培養し、プラスミドDNAを抽出してQiagen QIAprep Spin Miniprepキットを製造者の使用説明書に従って用いて精製した。VHおよびVL領域のDNA配列を標準的なM13フォワードプライマーとリバースプライマーを用いて分析した。
配列分析の結果は配列番号43から48に示している。
実施例3 組換え抗NOGO抗体
マウスの2a/k定常領域を有する組換え抗体は、マウスIgG2a/k定常領域遺伝子セグメント上にクローン化させた軽鎖および重鎖可変領域を含んでいるプラスミドを用いてトランスフェクトさせた細胞から精製することができた。そのクローン化したマウスV領域をPCRで増幅して哺乳類の発現ベクターであるRIdおよびRIn中にクローニングするために必要な制限酵素切断部位を導入した。Hind IIIとSpe I制限酵素切断部位は、VHドメインとインフレームとなるようにデザインして、マウスγ2a定常領域を含んでいる改変RIdベクター中へのクローニングができるようにした。Hind IIIおよびBsiW I部位はVLドメインとインフレームとなるようにデザインし、マウスκ定常領域を含んでいる改変RInベクター中にクローニングできるようにした。
PCRプライマー
2A10 V H フォワードプライマー：
5’- ACTCATAAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAG -3’ (配列番号78)
V H リバースプライマー：
5’-ACTATGACTAGTGTGCCTTGGCCCCAGTAG-3’ (配列番号79)
V L フォワードプライマー：
5’- ACTCATAAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTG -3’ (配列番号80)
V L リバースプライマー：
5’- ACTATGCGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGG -3’ (配列番号81)
PCRは、V領域、2% DMSO、400μM dNTPs、各1μMのプライマーおよび添付のバッファーを含んでいる約10 ngのpUC19 miniprep含有の50μl中で、Hercules(Stratagene)を製造者の使用説明書に従って用いて行った。PCRは次のとおり行った。1−95℃2分間、2−95℃1分間、3−56℃1分間、4−72℃1分間。ステップ2から4を30サイクル行った。
発現ベクター中へのクローニング
PCR産物をQiagenのMinElute PCR Purificationキットを製造者の使用説明書に従って用いて精製した。VHのPCR産物とRId (IgG2a)哺乳類発現ベクターはHind III-Spe Iで消化した。VLのPCR産物とRIn (k)哺乳類発現ベクターはHind III-BsiW I (NEB)で、製造者の使用説明書に従って消化した。Promega Quick Ligationキットを用いてベクターをインサートと1:2のモル比で連結させた。連結混合物をDH5α細胞中にトランスフェクトし、アンピシリンでの選択で増殖するコロニーを増殖させてDNA配列の確認した。
組換え抗NOGO抗体2A10/3の配列の分析
2A10重鎖のHind IIIとEcoRIクローニング部位間の配列は次のとおりであった：
AAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAGCAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACACTAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTGTGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGGTTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTCAGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCACCTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGAGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCACCTAACCTCCTGGGTGGCCCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCCATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTCTGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGGACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGAAGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATGAGAATTC (配列番号49)
2A10軽鎖のHind IIIとEcoRIクローニング部位間の配列は次のとおりであった：
AAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTTCTGGATCTCTGGAGTCAGTGGGGATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGATGCTGCACCGACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAAGAATTC (配列番号50)
2A10のキメラも構築し、それは本明細書中ではHcLcと呼んでいる。
実施例4 マウス抗NOGO抗体はNOGOと結合する
50mM Tris pH9.5中に5μg/mLの濃度としたGST-ヒトNOGO-A56をNunc Immunosorpプレート上に(100μL/ウエル)4℃で一晩かけてコーティングした。ウエルをPBSで一度洗った後、PBS中に1% BSA含有の液と室温で1時間インキュベートして非特異的結合部位をブロックした。抗体をPBSで2μg/mLに希釈し、この液から1/3希釈を作成した。抗体をウエルに添加し(3回重複測定)、4℃で一晩インキュベートした。ウエルをPBSで3回洗った後、抗マウス-HRP (1:1000)と1時間インキュベートした。PBSで5回洗った後、1ウエルあたり100μLのTMB基質(Sigma)と10分間インキュベートした。呈色反応は50μLの濃HClを添加することによって停止させた。450nmの吸光度をプレートリーダーを用いて測定した。抗体を含まないウエルで測定したバックグラウンド値を差し引いた。
図8は、ELISAアッセイで3種類の抗NOGO-Aモノクローナル抗体、2A10、2C4、および15C3が全てヒトNOGO-A56と用量依存性に結合することを示している。
Y軸は、ウエル内に捕捉された抗体の定量的測定である450nmでの吸光度(OD)の測定値を示している。X軸は各データポイントでの1ウエルあたりの用いた抗体の濃度(ng/mL)を示している。抗体2A10は、ヒトNOGO-Aに対するアフィニティーが高いことを示唆する濃度範囲でもっとも高いシグナルを示している。
実施例5 阻害性NOGO-Aフラグメントの産生(NOGO-A56, 配列番号87)
ヒトNOGO-Aのアミノ酸586-785をコードするcDNA配列
MQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQPSSSPLEASSVNYESIKHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSGIKEEIKEPENINAALQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPAPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVEDSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETVMLVKESLTETSFESMIEYENKE 配列番号87
をpGEX-6P1のBamHI-XhoI部位中にクローン化してGSTをタグした融合タンパク質を作成しそれをNOGO-A56と名付けた。プラスミドは100μg/mLのアンピシリンを加えた2XTY培地中のBL21細胞で、IPTGで誘発させた後37℃で3時間発現させて0.5mMとした。細胞ペレットを超音波処理で溶解させ、グルタチオン−セファロース(Amersham Pharmacia)を製造者の使用説明書に従って用いて融合タンパク質を精製した。精製したタンパク質を還元型グルタチオンを用いて溶出させ、PBSに対して長時間透析し、BSA標準品とBioRadのクーマシーをベースとしたタンパク質アッセイを用いて定量した後、アリコートに分けて−80℃で保管した。このように、本発明は、NOGO-A、特にヒトNOGO-Aと結合する抗体またはその機能を有するフラグメントを提供し、該抗体またはその機能を有するフラグメントは、配列番号87によってコードされるポリペプチドを含んでいるNOGOタンパク質の活性を中和するが、その際に該抗体は該タンパク質の配列番号87と結合する。典型的な形態においては、本発明の抗体はヒトNOGO-Aのアミノ酸586-785の間に結合し、NOGO-Aの活性を中和する。
実施例6 神経突起伸長アッセイ
対照のGSTのみのものまたはGST-NOGOA56融合タンパク質を氷上で融解させ、0.5 xの組織培養グレードのPBSで希釈して3 pmol/μLとした。BD-Biocoat ポリ-d-リジンをコートした96ウエルのプレートの各ウエルの中心に5μLスポットして組織培養キャビネット中で乾燥した。乾燥後、精製抗体、ハイブリドーマ馴化組織培養上清または化合物をHBSS (Life Technologies)で希釈し、50μLを4ウエルから8ウエル重複させてウエルにアプライした。GST単独の対照のウエルをGST-NOGO-A56のウエルを添加していないHBSSで処理した。37℃で2時間、前処理した後、生後8日目のラット脳から精製し解離させた小脳顆粒ニューロンを、1ウエルあたり100μLに20-40,000個のニューロンとなるように添加し、37℃で24時間インキュベートした。PBS中の4%パラホルムアルデヒド/10%ショ糖を用いて培養したものを1時間固定した後、ポリクローナル抗β-III-チューブリン抗体を用いて神経突起を染色した。神経突起の伸長は、Cellomics Arrascanシステムで自動画像捕捉および分析を用いて定量した。結果は図1から6に示している。
図1はNOGO-A56の神経突起伸長に及ぼす影響を対照のタンパク質であるGST単独と比較して示している。
図2から5は、機能をブロックする抗体である抗NOGO抗体2A10/3、2C4/1、および15C3/3と、機能をブロックしない対照の抗体12G3を調べたものである。抗体12G3はNOGO56と結合はするが、神経突起伸長活性を阻害しない。グラフは未精製の抗体(上清中の抗体)に暴露された培養液中の神経突起の平均の長さを示している。これらのデータは2A10/3、2C4/1、および15C3/3がNOGO-A56の神経突起伸長阻害活性をブロックする効果を有していることを示している。対照はGST単独である。
図6は精製2A10/3によるNOGO-A56の神経突起伸長阻害作用のブロックを示している。
実施例7 IN-1はヒトNOGOに対してブロッキング活性を有さない
実施例5に記載の神経突起伸長アッセイを、IN-1抗体を用いて行うと、IN-1はヒトNOGO-Aの阻害活性をブロックしない(図7)。
実施例8 2A10のヒト化
ヒト化VHおよびVL構築物はde novoでオーバーラップするオリゴヌクレオチドを積み重ねることによって調製し、そのオリゴヌクレオチドにはRIdおよびRIn哺乳類発現ベクター中へクローニングするための制限酵素切断部位とヒトシグナル配列が含まれている。Hind IIIとSpe I制限酵素切断部位を導入して、ヒトγ1変異定常領域を含んでいるRId中にクローニングするためのCAMPATH-1Hシグナル配列を含んでいるVHドメインを作った。Hind IIIおよびBsiW I制限酵素切断部位を導入して、ヒトκ定常領域を含んでいるRIn中にクローニングするためのCAMPATH-1Hシグナル配列を含んでいるVLドメインを作った。
CAMPATH-1Hシグナル配列：MGWSCIILFLVATATGVHS (配列番号82)
重鎖
2A10 のVHアミノ酸配列と66%の同一性を有するヒト生殖系列配列(germline sequence)の1つを同定した。ヒト化のためのU84162のフレームワーク配列を選択した：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGQWLVILNFDYWGQGTLVTVSS (配列番号83)
従って本発明は配列番号83の配列(または配列番号83とのアミノ酸の相違が10個未満のフレームワーク、例えば8個未満のアミノ酸の相違、好ましくは6個未満の相違、より好ましくは4個未満のアミノ酸の相違、例えば2個または1個のアミノ酸の相違を有するフレームワーク)の、ヒト化抗NOGO抗体(特にヒトNOGO-Aと結合する抗NOGO抗体で表2に記載のCDRを含んでなる、および/または上述のエピトープと結合する抗体)の産生における使用を提供する。93と94の位置はCDRのコンフォメーションを維持する上で重要である可能性があるとして同定された位置である。
位置(Kabat#) 2A10 VH U84162
93-94 EL AR
これらの位置でのELモチーフは通常見られないことが注目された。
下記のヒト化構築物をデザインした：
ヒト化VH構築物H1：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTTVTVSS (配列番号84)
軽鎖
2A10 のVLアミノ酸配列と66%の同一性を有するヒト生殖系列配列の1つを同定した。ヒト化のためのCAA85593のフレームワーク配列を選択した：
フレームワーク：CAA85593
DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQGLVYSDGDTYLNWFQQRPGQSPRRLIYKVSNRDSGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPYTFGQGTKLEIK (配列番号85)
従って本発明は配列番号85の配列(または配列番号85とのアミノ酸の相違が8個未満のフレームワーク、例えば6個未満のアミノ酸の相違、好ましくは4個未満の相違、例えば2個または1個のアミノ酸の相違を有するフレームワーク)の、ヒト化抗NOGO抗体であって、そのヒト化抗体がNOGO-Aと結合し、NOGO-A、特にヒトNOGO-Aの活性を中和するような抗体(特に表1に記載のCDRを1つ以上有する(例えば全てを有する)軽鎖を含んでいる、および/または上述のNOGO-Aのエピトープと結合する抗体)の産生における使用を提供する。
下記のフレームワーク中の残基はアフィニティーの回復に重要である可能性があるものとして同定された：
位置(Kobat#) 2A10 VL AAK94811
4 I M
45 R Q
46 R L
ヒト化VL構築物をデザインした：
構築物 フレームワーク鋳型 アミノ酸
位置(Kobat#) ヒト マウス
L11 CAA85593 4 M I
45 R Q
46 R L
ヒト化VH構築物L11：
DIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIK (配列番号86)
配列番号84と86をコードするプラスミドを一時的にCHO細胞中に同時トランスフェクトし、小スケールで発現させて抗体H1L11を産生させた。配列番号92と86をコードするプラスミドも一時的にCHO細胞中に同時トランスフェクトし、小スケールで発現させて抗体H7L11を産生させた。
このように本発明は、NOGO、特にヒトNOGO、より特にヒトNOGO-Aと結合しその活性を中和するヒト化抗体を提供し、そのヒト化抗体は配列番号84の重鎖可変領域および配列番号86の軽鎖可変領域を含んでなる。本発明のさらに別の態様においては、NOGO、特にヒトNOGO、より特にヒトNOGO-Aと結合しその活性を中和する抗体(特に完全にヒト型であるかまたはヒト化抗体)を提供し、その抗体は、配列番号85の重鎖可変領域および配列番号86の軽鎖可変領域を含んでなるヒト化抗体のヒトNOGO-Aへの結合を、等モル濃度で競合的に阻害する。好ましくは、該競合抗体は、配列番号85の重鎖可変領域および配列番号86の軽鎖可変領域を含んでなる抗体のヒトNOGO-Aへの結合を少なくとも50%阻害する。
本発明では、ヒトNOGO-Aと特異的に結合しその活性を中和する抗NOGO抗体が提供され、その抗体は配列番号88の重鎖および配列番号89の軽鎖を含んでなる。本発明はまた、該抗体を含んでなる医薬組成物およびヒトの患者、特に脳卒中(虚血性脳卒中など)またはアルツハイマー病に罹患した患者の治療方法にも関する。当業者であれば配列番号88および配列番号89がそれぞれ重鎖および軽鎖の、シグナル配列を除去するための何らかのプロセシング(例えば、宿主がメディエートするプロセシング)を受ける前のものを示していることは明らかであろう。典型的には、配列番号88のプロセスされた形態は20の位置から始まり、配列番号89のプロセスされた形態は20の位置から始まる。
配列番号88
MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
配列番号89
MGWSCIILFLVATATGVHSDIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
配列番号88をコードするポリヌクレオチドは配列番号90で表される：
AAGCTTTACAGTTACTCAGCACACAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAATTC (配列番号90)
配列番号89をコードするポリヌクレオチドは配列番号91で表される：
AAGCTTTACAGTTACTCAGCACACAGGACCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGATATTGTGATAACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCTCCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCAGACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAATCAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGAATTC (配列番号91)
実施例9 H1L11抗NOGOモノクローナル抗体のBiaCore分析
抗NOGOモノクローナル抗体(mAb)の、組換えで発現させたヒトNOGO-A(hNOGO)に対する結合の反応速度を、Biacore3000 バイオセンサーを用いて分析した。方法は次のとおりとした：
方法
hNOGOは目標とした固定化レベルを得るためにデザインされたBiacore Wizardプログラムを用いて、第1級アミンカプリングによってCM5チップに固定化した。CM5センサーの表面は、50mMのN-ヒドロキシスクシニミド(NHS)および200mMのN-エチル-N'-ジメチルアミノプロピルカルボニド(EDC)の溶液を通すことによって活性化した。その後、5mM酢酸ナトリウム, pH5.0中のhNOGOの300nM溶液を用いてhNOGOの50-200レゾナンスユニットの間の濃度範囲のものを固定化した。固定化完了後、残存する活性化されたエステルを全て1Mのエタノールアミン塩酸塩, pH8.5を注入してブロックした。
H1L11 mAb(実施例8参照)をHBS-EP(10mM HEPES, pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、および0.005% P-20界面活性剤)中に希釈し、結合試験は0.1-100nMの間の濃度範囲で行った。反応速度の分析には、60μL/分の流速を用い、物質移動(mass transfer)効果は認められなかった。全ての濃度について重複測定を行い、バッファーのみのブランクを含めランダムな順番で試験した。再生は、50mMの水酸化ナトリウム単独を15μLのパルスで単回注入するかまたは、15μLの100mM H3PO4の注入後に15μLの50mM 水酸化ナトリウム注入するかのいずれかで行った。これらの再生プロトコールの双方とも、流速は30μL/分とした。双方の方法とも結合したH1L11の完全な除去をもたらしたが、hNOGOセンサー表面の結合能には全く損失が見られなかった。全ての測定はブランクのセンサー表面(活性化され上述のとおりブロックされたものであるがリガンドは添加されていない)を対照として行った。結合の分析はBIAevaluation 反応速度分析ソフトウエアversion 4.1を用いて行った。本発明の他の抗体についてのBiacore分析も本質的には上記と同じプロトコールに従って行った。
結果
抗体 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
HcLc 2.23 x 106 2.49 x 10-3 1.26
J1L11 1.0 x 106 2.15 x 10-2 22.16
マウス2A10 2.9 x 106 1.84 x 10-3 0.8
マウス2C4 8.09 x 106 6.44 x 10-4 8
マウス15C3 4.07 x 104 8.28 x 10-4 17.5
NOGO-Aを用いて同様の分析を行った。
結果
抗体 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
マウス2C4 1.62 x 105 5.33 x 10-4 3.9
マウス15C3 4.6 x 104 8.7 x 10-4 24.9
マウス2A10 1.26 x 106 1.01 x 10-3 1
実施例10 tMCAO後の病変の体積および機能回復に及ぼす抗NOGO抗体(2C4)の効果
目的：
本研究の目的は脳室内投与(ICV)された抗NOGOモノクローナル抗体(mAb)の、ラットの一過性中大脳動脈閉塞(tMCAO)後の病変体積と機能回復に及ぼす影響を調べることであった。90分間の一時的虚血後の長期の機能回復を調べるために、シリンダー(cylinder)試験、先細角材歩行試験(tapered beam)、および神経学的スコアを用い、再生プロセスの免疫組織化学的評価および病変体積の評価のために脳を摘出した。
方法：
外科的準備
Charles Riverから供給された雄のSprague-Dawleyラット(300-350g)をこの試験に用いた。全身麻酔下で脳室内(i.c.v.)カニューレを左側脳室中に置いた。手術後少なくとも4日間回復させた後、アンギオテンシンIIを脳室内に投与するチャレンジによってカニューレの留置を確認した。
巣状虚血の誘発
Longaと共同研究者ら(Stroke, 1989, 20, 84-91)が報告している方法で、ハロタン/酸素/亜酸化窒素麻酔下で全ラットにtMCAOを行った。体温はこの外科的操作の間、直腸体温計で常にモニターし、サーモメーターで調節した加温毛布でラットを正常体温(37±0.50℃)に維持した。左中大脳動脈(MCA)閉塞時および灌流時に実際のコア温度値を記録した。 MCA閉塞の90分後にラットを再麻酔し、フィラメントをゆっくりと完全に引き出して再灌流できるようにした。動脈切開はジアテルミーで閉じ、止血の状態を再チェックし、脳の傷を縫合して閉じた。
閉塞後の回復
MCA閉塞後、麻酔をやめ、インキュベーター(23-25℃)中で1時間、詳しく観察しつつラットの意識と立ち直り反射が戻るようにした。次いでそれらのラットを術後回復室内の個別のケージに入れ、生存期間中ラットの総合的健康状態を注意深くモニターした。
行動作業：
1. 神経学的評価
MCA閉塞後の運動および行動の変化を、MCA閉塞後1時間、24時間、およびその後週1回8週間、28ポイントグレーディングスケールを用いて評価した。
用いた神経学的評価("ニューロスコア")の詳細：
同一の試験での他のラットと比較した場合のMCAOラットのニューロスコア−最大スコア28ポイント
脚のプレースメント
ベンチの端にラットを縦方向に固定し、手をかざしてラットを覆い、各脚の各々を１つずつ取ってそれをベンチの端の向こう側に置く。脚の収縮とベンチへと戻す状態を観察する。
スコア：各脚の戻しが成功する毎に1 (最大スコア＝4)
立ち直り反射
ラットをしっかりとつかみ、手のひらの上で仰向けになるまで回転させる。つかんだ手を離し、ラットが立ち直るかを観察する。
スコア：立ち直りに成功すると1
水平の棒
ラットの前足をうねのある横棒に置き、つり下がるようにする。
スコア：両方の後ろ脚がバーの上に上がれば3
片方の脚がバーに上がれば2
ラットがぶら下がったままの場合は1
ラットが下に落ちれば(掴む力の不足により)0
傾斜させたプラットホーム
ケージの蓋を45度に保持する。ラットを蓋の上に下向きに置く。
スコア：15秒以内にラットが回転して顔を上に向けた姿勢になった場合は3
15〜30秒要した場合は2
30秒より長時間要した場合は1
ラットの掴む力が弱いか、または全くないために蓋を滑る落ちるかまたは下向きの姿勢のままであった場合は0
対側性回転
ラットの尾の基部を持ってラットを時計回りに回転させ、次いで反時計回りに回転させる。回転方向とは反対の水平方向にラットが旋回する能力を観察する。
スコア：各方向について1(最大スコア=2)
目で見た前脚のリーチ
ラットの尾の基部を持ち、頭部をベンチの最上部の高さのすぐ下になるようにする。ラットのヒゲ(感覚毛)がほとんど触れるところまでベンチを近づける。ラットは反り返り、その前脚をベンチの表面に置こうとするはずである。
スコア：片脚を上手く置くことができる場合は1(最大スコア=2)
旋回
ラットを床の上に置き、旋回を観察する。
スコア：旋回せず 4
1方向へ旋回する傾向 3
半径50cm以上の大きな旋回 2
半径15<50cmの中程度の旋回 1
半径<15cmのスピン/小旋回 0
対側性反射
ラットの尾の基部で押さえる。
スコア：反射があれば0
反射がなければ 1
掴む力の強さ
ラットをケージ上のバーに前脚のみで掴まらせる。尾を掴んでラットを引っ張る。
スコア：正常な掴む力の強さ 2
掴む力が弱い 1
掴む力がない 0
運動能力
床にラットを置き旋回行動を観察する。
スコア：3−正常な運動能力
2−活発だが旋回する
1−一様でない
0−動きたがらない
一般状態
スコア：3−正常(毛の状態が良好、警戒態勢、動き回り、体重増加が正常)
2−非常によいが体重の増加は正常より少ない
1−良好
0−普通(例えば、毛は汚れ、毛繕いはあまり行わない、うずくまり姿勢、攻撃的、筋肉の緊張が弱い)
最高スコア(すなわち正常ラット)＝28
2. シリンダー試験：
ラットは毎週前脚のプレースメントのシリンダー試験で調べた。ラットは透明なPerspex(登録商標)シリンダーの直径20cm、高さが30cmのものの内部に3分間置かれた。この時間内の左および右の前脚のプレースメント数を調べた。この試験は赤色光下で行った。
3. 先細角材歩行試験
この試験のためにラットは全て赤色光の部屋で1mの長さの四角形の先細の角材を約40度の角度でラットのホームケージから上向きの坂とし、その坂を渡るようにトレーニングされる。この作業はラットがその角材を登って行くにつれて角材の幅が狭くなるので次第に難しくなる。その角材は結果の分析用の3セクションに分けるために印が付けられており、「容易」とされた最も広いセクション(6cm)から「難しい」最も先細りの末端(2cm)までグレード分けする。
試験前のトレーニング−各ラットとも2日間そのホームケージから取り出され、角材の上に距離を次第に増やして置く(合計でほぼ4回)。各ラットがその角材をなだめすかすことなく、ほとんど踏み外さずに渡ることができれば、そのラットは訓練されたものとする。上手くできないラットは試験から除外した。
試験−各ラットを1試験セッションあたり3回、角材上に置き、渡り始めるまでのためらい時間、脚を踏み外した回数、それは角材の上面と接触できないような脚のプレースメントと定義されるが、(前肢と後肢について)それらをマニュアルで記録しそれらの平均をとる。バッチ1のラットについては5週目に、バッチ2と3のラットについては4週目に、分析はビデオによる試験の録画に切り替えた。この録画された試験の分析は感度を上げるために行った。
MCAOのラットの試験セッションは手術前、術後7日目、およびその後は毎週、8週目の屠殺まで行った。
投与計画
抗体は閉塞後1時間、24時間、1週間、および2週間目に投与した。
投与群：
IgG1 対照(5μg)(D群)
抗体2C4(5μg)(F群)
抗体2C4(15μg)(E群)
調製品は全て滅菌食塩水中に溶解した。
各群は投与前にブラインドとした。
用いるラットの順番によって入り込むバイアスを避けるために、ラテン方陣デザインを用いた。
抗体は5μLのストック(1mg/mLと3mg/mL)を2分かけて輸注ポンプ(2.5μL/分)を用いて投与した。注射後、カニューレはさらに2分間、そのままとした。
虚血によるダメージの神経病理学的所見および定量
MCAでの閉鎖の8週間後、ラットに氷冷した4%パラホルムアルデヒドを灌流して固定した。次いで、解剖とパラフィン包埋の前にラットを断頭し脳はin situで氷冷した4%パラホルムアルデヒド中に保存し、次いで免疫組織化学的検査を行った。
脳の体積の分析には、脳マトリクスを用いて2mmの間隔でパラフィンプロセシングするために前頭極から小脳にかけて順次切片化した。次いで脳をパラフィンでプロセスしワックス中に包埋した。ブレグマの位置に対して前方＋3mmから後方−7.5mmまで立体空間的にあらかじめ定めた冠状面に対応した4ミクロンの切片を集めた。それらの切片をポリリジンをコートしたスライド上にマウントした後、ヘマトキシリン-エオジンで染色した。それらの切片を病変体積と腫脹についてコンピューター映像分析システム(Datacell, hardware, Optimas software)を用いて分析した。病変範囲はヘマトキシリン-エオジンで染色されなかった組織を含んでいる。病変は病変部の境界の周囲をトレースして測定し、脳の対側の非病変部と比較した病変部の大きさを%で表した。
統計学的分析
ニューロスコアおよび体重データは、時間をrepeated measures(反復測定)としrepeated measures ANOVAアプローチを用いて分析した。病変体積は、1-way ANOVAおよびANCOVAアプローチを用いて分析し、病変範囲はrepeated measures ANCOVAアプローチを用いて分析した。
足を踏み外した回数のデータは、何週目であったかと角材の難度をrepeated measuresとして、repeated mesures ANOVAアプローチを用いて、グループ効果を調べるために、前脚と後脚を別々に分析した。前脚と後脚の差を調べるために、脚を滑らせた回数のデータも、何週目であったかと脚をrepeated measuresとしてrepeated measures ANOVAアプローチを用いて分析し、難度全体で平均した。
E群(高投与量Ab群)の3匹のラットはこの群の他のラットよりも1段階低い投与量とした(下記参照)。この分析はこれらのラットを含めた形と含めない形で行い、結果には有意差が認められなかったので、これらのラットも分析に加えたが、シリンダー試験と体重の変化の場合には、3回投与したラットと4回投与のラットを対照と比較すると、4回投与したラットのみが対照の抗体を投与されたラットとの間に有意差が認められたことに留意することは重要である。
この研究の間に多数のラットがおそらく感染のために死亡したことは特記すべきである。その結果、最高投与量の群(E群)の3匹のラットはこの群の他のラットよりも1段階低い投与量となった。
結果：
E群(高投与量Ab群)の3匹のラットはこの群の他のラットよりも投与量が1段階低い量であった。データはこれらのラットを含む形と含まない形で分析し、説明文中で特に述べない限りは、結果には有意な影響を与えなかった。
図9は対照群、5μg群、および15μg群での病変体積を脳の総体積のパーセンテージとして示している。該抗体は対照群と比較して病変体積に影響を与えなかった。
図10
この図はニューロスコアデータを平均±SEMで示している。観察されたデータの範囲が大きいのでパラメトリック分析が有効だと考えられた。1、4、7、および8週目で15μg群と対照群との間に有意差が認められた。この方法で分析すると7および8週目に15μg投与群と対照群との間に有意差が認められた。
シリンダー試験
図11A、11B、11C、11Dを参照せよ。シリンダーデータは、A)両脚、B)左脚、C)右脚、およびD)右脚を15μgの抗NOGO抗体の3回の投与を受けたラットと抗NOGO抗体の4回の投与を受けたラットに分けて、平均±SEMとして示している。抗体の15μgの投与では右脚の使用で有意の増加が見られた。高投与量群を4回の投与全てを受けたラットと3回投与のみのラットに分けると、この2つのサブグループ間に有意差は認められなかった。しかし、図11Dに示すとおり、4回投与群を対照群と比較すると3回投与群と対照群との比較では見られなかった有意差が認められた。統計学的解析にはrepeated measures データについてFisher's LSD検定を用いた。
先細角材歩行試験
図12を参照せよ。
図12は前脚の踏み外しを平均±95%信頼区間で示している。
＊6週目、F群(5μgの投与量)はD群(対照)と比較して前脚の踏み外し数が増加していた(p=0.0305)。ここには示していないが、角材に沿って難度が上がるにつれて前脚の踏み外し数は増加した。
図13を参照せよ。
図13は後脚の踏み外しを平均±95%信頼区間で示している。
＊この試験の期間を通じてF群(5μgの投与量)はD群(対照)と比較して後脚の踏み外し数が有意に増加していた(p=0.0488)。6週目と7週目では、F群はD群と比較して後脚の踏み外し数が有意に増加していた(それぞれp=0.0098およびp=00370)。ここには示していないが、角材に沿って難度が上がるにつれて後脚の踏み外し数は増加した。角材を渡るためにラットがためらった時間のデータでは、最初の週のためらい時間はラットが回復するにつれて低減したが治療の効果は観察されていない。
図14 A)は体重を平均±SEMで示している。抗体の15μgの投与を受けたラットでは24時間目、1週間目、および3週目から試験完了までのどの時点でも体重が増加している。
図14 B)。グラフは15μg投与群を3回投与群と4回投与群に分けたときの体重を示している。データは平均±95%信頼区間で示している。＊P<0.05, repeated measures ANOVA。
図14 C)。グラフは15μg投与群を3回投与群と4回投与群に分けたときの体重を示している。抗NOGO抗体の5μgを投与されたラットおよび対照の抗体を投与されたラットと比較した。データは平均±95%信頼区間で示している。＊P<0.05, repeated measures ANOVA。
他の群より有意に高くはなかったが、高投与量群では、安楽死または死亡で除かれたラットの比率が高かった。このことは対照群と比較して体重の平均の上昇を説明するであろう。
結論：
この研究は2段階の投与量で抗NOGO抗体2C4を90分間のtMCAOの後1時間目、24時間目、1週目、および2週目にICV投与した場合の、病変部の体積と機能回復に及ぼす影響を調べたものである。
・抗体治療は病変体積には影響を及ぼさなかった。
・抗体治療は最高投与量の15μg ICVで神経学的スコアに大きくはないが有意な効果を示した。この投与量は平均スコア(もとの値が広範囲に広がっている場合には平均スコアをデータとして用いたが、このことはパラメトリック分析を用いることを正当化している)を用いて分析すると、1、4、7、および8週目に神経学的スコアを有意に増加させた。
・抗体治療はシリンダー試験において最高投与量で右脚の使用に関して有意な効果を示した。この投与量はこの試験期間全体で対照群と比較して右脚の使用の有意な増加を生じさせ、特に2週目と6週目で右脚の使用の増加は有意であった。
・抗体治療は先細角材歩行試験での成績に好影響は与えなかった。しかし、低投与量の抗体群(5μg ICV)は脚の踏み外しの数を、特に6週目に増加させた。しかしながら難度のセクションあたりの踏み外し数を分析すると差は認められず、また角材を渡る際のためらい時間の分析でも差は認められなかった。
・抗体治療は最高投与量の15μg ICVで体重に有意な影響を示した。この投与量の抗体群は対照群と比較すると3週目以降体重が有意に増加した。体重は機能的回復の表れではないとはいえ、体重は一般状態が良いことの反映であり、体重の増加はtMCAO後の生理学的回復度が改善されていることを反映しているのであろう。
抗体の高投与量群の最後の3匹は上述の理由で4回目の投与と最終投与を受けなかった。この最終回の投与の重要性の程度を調べるために、高投与量の群のラットを3回投与のラットと4回投与のものに分けて比較を行った。
投与期間
4回投与のラットは右脚のプレースメント数が有意に増加したが、3回投与では有意な増加は見られなかった。さらに、3回投与のラットと比較すると、第2週目の投与は体重の増加を加速させたように思われる。4回投与はまた、対照群と比較して体重増加の有意な増加をもたらすが、3回投与は有意な差は認められない。
投与回数は病変の体積、神経学的スコア、先細角材歩行試験の成績に影響を与えなかった。
要約
要約すれば、治療は病変の体積に影響を及ぼさなかったが、抗NOGO抗体2C4の最高投与量(15μg)は、ここで説明したニューロスコアで調べると、3回または4回の投与後に機能回復に良い影響を与え、脚のプレースメントおよび体重に4回の投与で良い影響を与えた。
実施例11 tMCAO後に静脈内に投与した抗NOGOモノクローナル抗体の病変体積と機能回復に及ぼす効果
目的
この試験の目的は静脈内(IV)に投与した抗NOGOモノクローナル抗体(mAb)2A10および2C4の、ラットの一過性左中大脳動脈閉塞(tMCAO)後の病変体積と機能回復に及ぼす効果を調べることであった。90分間の一時的虚血後の長期の機能回復を調べるために、シリンダー試験、先細角材歩行試験、および神経学的スコアを用い、再生プロセスの免疫組織化学的評価および病変体積の評価のために脳を摘出した。
方法
巣状虚血の誘発
Longaと共同研究者ら(Stroke, 1989, 20, 84-91)が報告している方法で、ハロタン/酸素/亜酸化窒素麻酔下で全ラットにtMCAOを行った。体温はこの外科的操作の間、直腸体温計で常にモニターし、サーモメーターで調節した加温毛布でラットを正常体温(37±0.50℃)に維持した。MCA閉塞時および灌流時に実際のコア温度値を記録した。 MCA閉塞の90分後にラットを再麻酔し、フィラメントをゆっくりと完全に引き出して再灌流できるようにした。動脈切開はジアテルミーで閉じ、止血の状態を再チェックし、脳の傷を縫合して閉じた。
閉塞後の回復
MCA閉塞後、麻酔をやめ、インキュベーター(23-25℃)中で1時間、詳しく観察しつつラットの意識が戻るようにした。次いでそれらのラットを術後回復室内の個別のケージに入れ、生存期間中ラットの総合的健康状態を注意深くモニターした。
行動作業：
神経学的評価
MCA閉塞後の運動および行動の変化を、MCA閉塞後1時間、24時間、およびその後週1回8週間、28ポイントグレーディングスケール(「ニューロスケール」、詳細は実施例10を参照せよ)を用いて評価した。
シリンダー試験：
ラットは毎週前脚のプレースメントのシリンダー試験で調べた。ラットは透明なPerspex(登録商標)シリンダーの直径20cm、高さが30cmのものの内部に3分間置かれた。環境を調べるための自発的な後脚での立ち上がりを行う間のこの時間内の左および右の前脚のおよび両方の前脚のプレースメント数を調べた。この試験は赤色光下で行った。
先細角材歩行試験
この試験のためにラットは全て赤色光の部屋で1mの長さの四角形の先細の角材を約40度の角度でラットのホームケージから上向きの坂とし、その坂を渡るようにトレーニングされる。この作業はラットがその角材を登って行くにつれて角材の幅が狭くなるので次第に難しくなる。
試験前のトレーニング−各ラットとも2日間そのホームケージから取り出され、角材の上に距離を次第に増やして置く(合計でほぼ4回)。各ラットがその角材をなだめすかすことなく、ほとんど踏み外さずに渡ることができれば、そのラットは訓練されたものとする。上手くできないラットは試験から除外した。
試験−各ラットを1試験セッションあたり3回、角材上に置き、渡り始めるまでのためらい時間、脚を踏み外した回数、それは角材の上面と適切に接触できないような脚のプレースメントと定義されるが、(前肢と後肢について)それらをビデオに録画して後日評価し、それらの平均をとる。
MCAOのラットの試験セッションは手術前、術後7日目、およびその後は毎週、8週目の屠殺まで行った。
投与計画(IV)
抗体は閉塞後1時間、24時間、1週間、および2週間目に静脈内に投与した。
投与群：
A−2C4 3mg/kg (低分子量画分のため4.7mg/kgに調整)
B−2A10 3mg/kg
C−対照 IgG2a 3mg/kg
D−2A10 10mg/kg
調製品は全て滅菌食塩水中に溶解した。
各群は投与前にブラインドとした。
用いるラットの順番によって入り込むバイアスを避けるために、ラテン方陣デザインを用いた。ラットはランダムに選択し、作業者は治療法についてブラインドとした。
虚血によるダメージの神経病理学的所見および定量
MCAでの閉塞の8週間後、ラットを氷冷した4%パラホルムアルデヒドを灌流して固定した。次いで、解剖とパラフィン包埋の前にラットを断頭し脳はin situで氷冷した4%パラホルムアルデヒド中に48時間保存し、次いで組織学的分析を行った。
脳の体積の分析には、脳マトリクスを用いて2mmの間隔でパラフィンプロセシングするために前頭極から小脳にかけて順次切片化した。次いで脳をパラフィンでプロセスしワックス中に包埋した。ブレグマの位置に対して前方＋3mmから後方−7.5mmまで立体空間的にあらかじめ定めた冠状面に対応した4ミクロンの切片を集めた。それらの切片をポリリジンをコートしたスライド上にマウントした後、ヘマトキシリン-エオジンで染色した。それらの切片を病変体積についてコンピューター映像分析システム(Datacell, hardware, Optimas software)を用いて分析した。病変範囲はヘマトキシリン-エオジンの染色の弱い組織の範囲によって輪郭付けられている。病変は病変部の境界の周囲をトレースして測定し、脳の対側の非病変部と比較した病変部の大きさを%で表した。
統計学的分析
ニューロスコアおよび体重データは、時間をrepeated measuresとしrepeated measures ANOVAアプローチを用いて分析した。病変体積は、1-way ANOVAおよびANCOVAアプローチを用いて分析し、病変範囲はrepeated measures ANCOVAアプローチを用いて分析した。
足を踏み外した回数のデータは、何週目であったかと角材の難度をrepeated measuresとして、repeated mesures ANOVAアプローチを用いて、グループ効果を調べるために、前脚と後脚を別々に分析した。前脚と後脚の差を調べるために、脚を滑らせた回数のデータも、何週目であったかと脚をrepeated measuresとしてrepeated measures ANOVAアプローチを用いて分析し、難度全体で平均した。
結果
病変の体積
図15は病変体積を脳の総体積のパーセンテージとして示している。抗体は対照群と比較して病変体積に影響を与えなかった。
ニューロスコア
図16はニューロスコアデータを平均±SEMで示している。観察されたデータの範囲が大きいのでパラメトリック分析が有効だと考えられた。＊P<0.05, 対照の抗体との比較、repeated measures ANOVA。
シリンダー試験
図17A、17B、17Cを参照せよ。シリンダーデータは、A)両脚、B)左脚、C)右脚についての平均±SEMとして示している。＊P<0.05、＊＊P<0.01 対照の抗体に対して、repeated measures ANOVA。
先細角材歩行試験
前脚の踏み外し
図18を参照せよ。前脚の踏み外しを平均±SEMで示している。＊P<0.05、＊＊P<0.01 対照の抗体に対して、repeated measures ANOVA。
後脚の踏み外し
図19を参照せよ。後脚の踏み外しを平均±SEMで示している。＊P<0.05、対照の抗体に対して、repeated measures ANOVA。
角材を渡ることへのためらい時間
図20を参照せよ。ためらい時間を平均±SEMで示している。＊P<0.05、対照の抗体に対して、repeated measures ANOVA。
結論：
この研究は抗NOGO抗体2A10を2段階の投与量で(3および10mg/kg)、抗NOGO抗体2C4を1段階の投与量で(3mg/kg)、90分間のtMCAOの後1時間目、24時間目、1週目、および2週目にIV投与した場合の、病変部の体積と機能回復に及ぼす影響を調べたものである。
・抗体治療は病変体積には影響を及ぼさなかった。
・抗体治療は24時間目に最高投与量の2A10で(10mg/kg)有意な効果を示した。
・2A10抗体(3mg/kg)での治療は特に1週目と2週目においてシリンダー試験で右前脚の使用に有意な効果を示した。
・2A10抗体(3mg/kg)は、tMCAO後1週目と2週目に前脚の踏み外し数の低減に明確な効果を示し、2A10抗体(10mg/kg)はtMCAO後2週目の後脚の踏み外し数低減効果を示し、2A10の2段階の濃度の双方ともtMCAO後1週目の角材を渡る際のためらい時間を低減させた。2C4抗体(3mg/kg)はtMCAO後3週目の前脚の踏み外しを対照の抗体と比較して低減させた。
要約
要約すれば、治療は病変の体積に影響を及ぼさなかったが、抗NOGOモノクローナル抗体2A10および2C4の静脈内投与は、神経学的スコア、脚のプレースメント、および先細角材歩行試験で評価するとき、主としてtMCAO後の最初の2週間に良い影響を与えた。
実施例12 NOGO cDNAのSHSY5Y-APP細胞中へのトランスフェクション
トランスフェクションの前日にSHSY5Y-APP細胞をトリプシン処理し、計数し、6ウエルのプレート(Nunc)に1ウエルあたり200,000個から100万個となるように再プレーティングした。NOGO発現構築物(pCDNA3(Invitrogen)中にFLAGをタグしたNOGO-A cDNAを含むもの；pCDNA3.1A中にMYCをタグしたNOGO-BおよびNOGO-Aを含むもの)を、そのDNAを無血清培地(OptiMEM-1)に希釈し、Plus TM 試薬を添加し、混合し室温で15分間インキュベートすることによって、Plus TM試薬と複合体化した(1ウエルあたり、6 μLのPlus試薬を、2μgのDNAおよびOptiMEM-1を含む液中に入れて総液量を100μLとする)。LipofectAMINE TM試薬を第2の試験管中の無血清培地(OptiMEM-1)中に希釈し、混合した(1ウエルあたり100μLの液量中に4μLのLipofetamine)。あらかじめ複合体化したDNA(上述のもの)を希釈したLipofectAMINEと合わせ、混合し、室温で15分間インキュベートした。一方、細胞は無血清培地(OptiMEM-1)で洗った後、新鮮な無血清培地を細胞に添加した(1ウエルあたり800μL)。そのDNA-＋-LipofectAMINE試薬複合体を細胞(200μL)に添加し、緩徐に混合し、細胞を5% CO2下で37℃で5時間インキュベートした。5時間後に、1mLの血清を含有している増殖培地を細胞に添加し、細胞を一晩、または2時間インキュベートした。14時間(または2時間)後、培地を全て取り除き、1ウエルあたり1mLのOptiMEM-1で置換した。48時間のコンディショニング後、培地を集めアミロイド含量を実施例13に記載のとおりアッセイした。
実施例13 AβペプチドのIGEN ELISAによる検出
ヒトAPPwtまたはAmyloid Precursor Protein Swedish variant sequence (APPSwe)を過剰発現しているSHSY5Y細胞を6ウエルまたは96ウエルのNuncプレートに定められた密度で蒔いた。24時間後に、試験に供する試薬(例えば、抗体、ペプチド、化合物、その他)を最終液量が120μLとなるように細胞に添加し、24時間細胞をインキュベートした。培地を細胞から分け、50μLを用いてAβ x-40とAβx-42について、AβのC末端特異的抗体を用いてORIGENイムノアッセイを一晩行ってアッセイした。簡潔に記せば、Aβペプチドをビオチニル化6E10(Signet Labs)を用いて捕捉した。OriをタグしたAβ C末端特異的抗体をAβx-40とAβx-42を検出するために用いた。抗体−Aβ複合体は、ストレプトアビジンをコートしたダイナビーズで捕捉し、IGDN M8アナライザーでアッセイした。細胞の生存度はMTT(3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド；チアゾールブルー)試薬を用いてチェックした。簡潔に記せば、MTT試薬(リン酸緩衝生理食塩液中に5mg/mL)を培地中に1:10に希釈し、100μLを各ウエルに添加した。37℃で4時間インキュベーションした後、100μLの可溶化液(20%SDS/50%ジメチルホルムアミド)を添加した。プレートの吸光度をDelfia Wallac プレートリーダーを用いて590nmで測定した。
結果は図21から34に示す。
SHSY5Y-APPwt細胞は野生型APPを発現する。SHSY5Y-APPswe細胞はAPPのスウェーデン突然変異型を発現する。
実施例14 NOGO-A発現の、β40およびAβ42ペプチドの分泌量に及ぼす影響
NOGO-Aを発現している発現構築物をSHSY5Y-APPwt細胞またはSHSY5Y-APPswe細胞中に導入すると、β40およびAβ42の量は有意に増加し、そのことはNOGO-Aが何らかの方法でAPPの蛋白分解性のプロセシングの直接的または間接的な変調を行う、および/または、Aβペプチドの分解を行うことを示唆している。この改変されたAPPプロセシングの産物がペプチドAβ40であるという事実は、NOGOの効果がβセクレターゼ活性を変調させるレベルにあることを示唆しているのであろう。
図21は、NOGO-Aが発現ベクターから発現されるとAβ40の分泌量が増加することを示している。2本の左側の棒は対照であり(ベクター単独、および対照のタンパク質として緑色蛍光タンパク質を入れているベクター)、この細胞系統でのAβ40産生量のバックグラウンドを示している。残りの棒は、FLAGペプチドと融合させたNOGO-Aを細胞内で発現させたときにAβペプチド量の有意な増加が検出されることを示し、またこれほど顕著ではないが、同様の上昇が、mycと融合させたNOGO-Bを発現させたときにも見られることを示している。
同じ実験をAβ42に特異的なELISAを用いて繰り返した。結果はAβ42ペプチド分泌量の上昇が、Aβ40 ELISAを用いた以前の実験での上昇と同様であることを示していた。この実験でもNOGO-BでAβ42ペプチドの分泌の増加が認められたが、この場合もその増加はNOGO-Aよりも少なかった。この結果は図22に示している。
NOGO-Aでトランスフェクトした細胞から分泌されるペプチドの量をベクターpCDNA単独の場合と比較した反復実験の結果を図23(Aβ40について)および図24(Aβ42について)に示す。
Aβ40とAβ42ペプチドの分泌量の直接比較を図25に示す。図25はNOGOの一貫性を確認するために3〜5回の別々の実験を平均したものである。
このように本発明は抗NOGO抗体(特に抗NOGO-Aおよび/または抗NOGO-B抗体)のアルツハイマー病の治療用医薬品の製造における使用を提供する。
実施例15 抗NOGO-A抗体はSHSY5Y-APPwt細胞およびSHSY5Y-APPswe細胞からのAβ40およびAβ42ペプチドの分泌を阻害する
図26は、内因性NOGO-Aを発現しているSHSY5Y-APPwt細胞からのAβ40とAβ42ペプチドの分泌量が抗NOGO抗体2A10を培地中に入れると劇的に低減することを示している。この効果は用量依存性に認められ、30μg/mLでほぼ90%の阻害に達した。Aβ40とAβ42ペプチド(それぞれ図26の白棒と黒棒)の間に効果の明白な差は認められず、言い替えるとAPPプロセシングに及ぼす抗NOGO抗体の効果は全て、Aβ40ペプチド、Aβ42ペプチドのいずれかにより強いものではない。
図27は図26と同じ実験だが、NOGOとは無関係のIgG1抗体を用いた。図から明らかに見て取れるとおり、無関係の(抗NOGO-Aではない)モノクローナル抗体は細胞からのAβ40およびAβ42の分泌量に阻害効果を示さなかった。
図28は同じ無関係のIgG1抗体がNOGO-Aを発現しているSHSY5Y-APPswe細胞からのAβ40とAβ42ペプチドの分泌量に対して、同様にほとんどまたは全く阻害効果がないことを示している。
同様に、図29は、上記の図26と同じ実験だが、NOGO-Aと結合するが機能のブロッカーではない抗NOGOモノクローナル抗体(6D5)を用いた結果を示している。この機能をブロックしない抗NOGO-Aモノクローナル抗体は、NOGO-Aを発現しているSHSY5Y-APPwt細胞からのAβ40およびAβ42ペプチドの分泌にごくわずかの効果(10%未満)しか示さなかった。これらの結果は、図26に示した結果が、抗NOGO抗体によりNOGOの機能的活性が阻害された結果であることを示唆している。
図30は図29と同じ実験で機能をブロックしない抗NOGOモノクローナル抗体(6D5)を用いたが、内因性のNOGO-Aを発現しているSHSY5Y-APPswe細胞を用いた結果を示している。前回(図29)と同様にこの細胞系統によって分泌されているAβ40とAβ42の量にはごくわずかの効果しか見られず、それは10%未満の阻害であった。
図31は図26の実験結果を拡張した実験の結果を示している。図31は機能をブロックする抗体2A10/3で示される阻害効果の濃度依存性が、より高濃度でも続くことを示しており、抗体濃度が50μg/mLでは90%を超える阻害が達成される。
図32はSHSY5Y-APPswe細胞を用いたこと以外は図31と全く同一の実験での結果を示している。抗体2A10/3の濃度依存性の阻害効果は50μg/mLという、より高い濃度でも引き続き認められる。
図33は、機能をブロックする別の抗NOGO-A抗体2A4のSHSY5Y-APPwt細胞からのAβ40とAβ42ペプチドの分泌に及ぼす効果を示している。これらの結果は、抗体の20μg/mLの濃度でAβ40とAβ42ペプチド分泌量は36%まで低減させる濃度依存性阻害効果があることを示している。この場合も、効果はAβ40とAβ42ペプチドの双方に対して認められる。
図34は抗NOGO-A機能ブロッキング抗体2A10、2C4、および15C3(図に示した濃度で)の阻害効果を、その他の対照の抗体10A4、IgG2b、および14D12と比較したものである。この図はAβ40とAβ42分泌の阻害効果が機能をブロックする抗NOGO-Aモノクローナル抗体に特異的なものであることを示している。
実施例16 NOGO-A発現の増加はAβの量を用量依存性に上昇させる
NOGO-A発現のAβ量に及ぼす効果を調べるために、C末端にmycをタグしたNOGO-A cDNAの量を徐々に増加させたものを用いて一過性にSHSY5Y-APPwt細胞をトランスフェクトした。pcDNA3.1 myc cDNAを用い、各トランスフェクションでcDNAの総量(5μg)を一定に保った。トランスフェクションの48時間後、培地を分け、Aβ40をアッセイした。さらに、細胞を採取し、1% Triton X-100とComplete プロテアーゼインヒビターを含有する10 mM Tris/HCl中で溶解した。細胞溶解物を10% Novex Tris-グリシンゲル上に置き、抗NOGO-A抗体を用いてウエスタンブロット分析にかけた。NOGO-Aタンパク質発現の増加はNOGO-A cDNA濃度の増加に伴って観察された。このことはこれらの細胞の培地中のAβ40量の対応する増加に伴っていた。このように、NOGO-Aの発現の増加によってAβ40量の用量依存性の増加が起こる。図36を参照せよ。
実施例17 キメラ2A10 (HcLc)
ヒトIgG1/κ野生型C領域上に移植された親のマウスV領域からなるキメラ抗体を、ヒト化構築物を試験する際の参照品として用いるためにデザインした。マウス組換えRIdプラスミド中のNOGO2A10 VHドメインをHind III-Spe Iで切断し、hCγ1wtを含んでいるRIDベクター中に連結した。マウス組換えRInプラスミド中のNOGO2A10 VLドメインをHind III-BsiW Iで切断しhCkを含んでいるRInベクター中に連結した。
配列番号92はHcLcの重鎖配列を表している：
MGWSCIILFLVAAATGVHSQVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNINPSNGGTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号92)
配列番号92をコードするポリヌクレオチドは配列番号93で表される：
AAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAGCAGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAATTC (配列番号93)
HcLcの軽鎖のアミノ酸配列は配列番号94で表される：
MRCSLQFLGVLMFWISGVSGDIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVSDRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (配列番号94)
配列番号94をコードするポリヌクレオチドは配列番号95で表される：
AAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTTCTGGATCTCTGGAGTCAGTGGGGATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGAATTC (配列番号95)
実施例18 ヒト化抗NOGO抗体はヒトNOGOと結合する
50mM Tris pH9.5中に1μg/mL含まれているGST-ヒトNOGO-A56をNunc Immunosorpプレート上に4℃で一晩かけてコートさせた(1ウエルあたり100μL)。ウエルをTBS＋0.05% Tweenで1度洗い、TBS中の2% BSA＋0.05% Tweenと室温で1時間インキュベートして非特異的な結合部位をブロックした。抗体をTBS＋0.05% Tween＋2% BSA中に希釈して10μg/mLとし、これから1/2希釈を作成した。抗体をウエルに重複して入れ室温で1時間インキュベートした。ウエルをTBS＋0.05% Tweenで3回洗った後、抗ヒトκペルオキシダーゼコンジュゲート(1:2000)と1時間インキュベートした。TBS＋0.05% Tweenで3回洗った後、1ウエルあたり100μLのOPD ペルオキシダーゼ基質(Sigma)と10分間インキュベートした。呈色反応は25μLの濃H2SO4の添加で停止させた。490nmの吸光度はプレートリーダーを用いて測定した。抗体を含まないウエルから読み取ったバックグラウンド値を差し引いた。
図35AはELISAアッセイでの、ヒト化抗体H1L11の用量依存性のヒトNOGO-A56との結合をキメラ(HcLc)と比較して示している。Y軸は、測定した490nmの吸光度(OD)、これはウエルに捕捉された抗体の定量的尺度であるが、その吸光度を示している。X軸は各データポイントでの1ウエルあたりの用いた抗体の濃度(μg/mL)を示している。抗体H1L11とHcLcはEC50値がそれぞれ、0.118 μg/mLおよび0.022μg/mLであった。
図1はGST-NOGO-A56融合タンパク質の、神経突起伸長に及ぼす阻害効果を示している。Y軸は1つの神経突起あたりの平均の神経突起の長さ(NL/N)を任意に定めたユニットで示している。 図2はハイブリドーマ2A10の上清の、NOGO-A56(GST-Nogo5&6)の神経突起伸長阻害活性に及ぼすブロッキング効果を示している。Y軸は図1と同様である。 図3はハイブリドーマ2C4の上清の、NOGO-A56(GST-Nogo5&6)の神経突起伸長阻害活性に及ぼすブロッキング効果を示している。Y軸は図1と同様である。 図4はハイブリドーマ15C3の上清の、NOGO-A56(GST-Nogo5&6)の神経突起伸長阻害活性に及ぼすブロッキング効果を示している。Y軸は図1と同様である。 図5はNOGO-A56ブロッキング活性を有していない対照のハイブリドーマ12G3の上清である。Y軸は図1と同様である。 図6は精製した2A10のNOGO-A56ブロッキング効果を4種類の濃度で示したものである。Y軸は図1と同様である。 図7は組換えIN-1モノクローナル抗体がNOGO-A56(GST-Nogo5&6)に対してブロッキング活性を全く持たないことを示している。Y軸は図1と同様である。
図1から図7までは、陰性対照はGSTタンパク質単独である。
図8は2A10、2C4、および15C3モノクローナル抗体のヒトNOGO-A56との結合を示している。Y軸は450nmのODの測定値を示しており、これはウエル中に捕捉された抗体の定量的尺度である。X軸は各データポイントで1ウエルあたりに用いた抗体の濃度(ng/mL)を示している。 図9は実施例10の試験後の種々の濃度での脳の総体積に対する病変体積のパーセンテージを示す。 図10は実施例10のニューロスコアデータを平均±SEMで示す。 図11Aは実施例10のシリンダー試験のデータを両脚について、平均±SEMで示している。 図11Bは実施例10のシリンダー試験のデータを左脚について、平均±SEMで示している。 図11Cは実施例10のシリンダー試験のデータを右脚について、SEMで示している。 図11Dは実施例10のシリンダー試験のデータを右脚に15μgの抗NOGO抗体の3回投与を受けたラットと抗NOGO抗体の4回投与を受けたラットに分けたものについて平均±SEMで示している。 図12は実施例10の前脚の踏み外し回数を平均±95%信頼区間で示している。 図13は実施例10の後脚の踏み外し回数を平均±95%信頼区間で示している。 図14A)は体重を平均±SEMで示している。15μgをラットに投与すると24時間目、1週目、および3週目から試験完了までの全時点で体重の増加が起こる。 図14B)のグラフは15μg投与群の体重を3回投与群と4回投与群に分けて示している。データは平均±95%信頼区間で示している。repeated measures ANOVA。 図14C)のグラフは15μg投与群の体重を3回投与群と4回投与群に分けて示している。抗NOGO抗体5μgの投与を受けたラットおよび対照の抗体の投与を受けたラットと比較している。データは平均±95%信頼区間で示している。 ＊P<0.05 repeated measures ANOVA。 図15は実施例11の、病変体積を脳の総体積のパーセンテージとして示している。 図16は実施例11のニューロスコアデータを平均±SEMで示している。 実施例11のシリンダー試験データを両脚について、平均±SEMで示している。 実施例11のシリンダー試験データを左脚について、平均±SEMで示している。 実施例11のシリンダー試験データを右脚について、平均±SEMで示している。 図18は実施例11の先細角材歩行試験での前脚の踏み外し回数を平均±SEMで示している。 図19は実施例11の後脚の踏み外し回数を平均±SEMで示している。 図20は後脚の踏み外しを平均±SEMで示す(先細角材歩行試験へのためらい) NOGO-AトランスフェクションはSHSY5Y-APPwt細胞内のAβ40ペプチド量の上昇をもたらす。 NOGO-AトランスフェクションはSHSY5Y-APPwt細胞内のAβ42ペプチド量の上昇をもたらす。 NOGO-A発現のAβ40ペプチドレベルに及ぼす影響。 NOGO-A発現のAβ42ペプチドレベルに及ぼす影響。 NOGO-A、NOGO-B、およびNOGO-Cの発現のAβ40およびAβ42に及ぼす影響。 抗NOGO-A抗体2A10-BRはSHSY5Y-APPwt細胞からのAβ分泌を阻害する。 対照のIgG1のSHSY5Y-APPwt細胞からのAβ分泌に及ぼす影響。 対照のIgG1のSHSY5Y-APPswe細胞からのAβ分泌に及ぼす影響。 対照の抗NOGO(機能をブロックしない)抗体6D5のSHSY5Y-APPwt細胞からのAβ分泌に及ぼす影響。 対照の抗NOGO(機能をブロックしない)抗体6D5のSHSY5Y-APPswe細胞からのAβ分泌に及ぼす影響。 機能をブロックする抗NOGO-Aモノクローナル抗体2A10はSHSY5Y-APPwt細胞からのAβ分泌を阻害する。 機能をブロックする抗NOGO-Aモノクローナル抗体2A10はSHSY5Y-APPswe細胞からのAβ分泌を阻害する。 機能をブロックする抗NOGO-Aモノクローナル抗体2C4はSHSY5Y-APPwt細胞からのAβ分泌を阻害する。 抗NOGO-A静置培養抗体標品と対照の抗体のSHSY5Y-APPwt細胞からのAβ分泌に及ぼす影響。2A10、2C4、および15C3は静置培養抗体である。その他は全てBR(バイオリアクター)で精製した対照品、または市販の対照品である。 図35Aは、ELISAアッセイでヒト化抗体H1L11の用量依存性のヒトNOGO-A56への結合をキメラ抗体(HcLc)と比較したものを示している。Y軸は490nmでの吸光度(OD)を示しており、それはウエル中に捕捉された抗体の定量的尺度である。X軸は、各データポイントでの1ウエルあたりの用いた抗体の濃度(μg/mL)を示している。 図35Bは、ELISAアッセイでヒト化抗体H1L11の用量依存性のヒトNOGO-A56への結合をキメラ抗体(HcLc)と比較したものを示している。Y軸は490nmでの吸光度(OD)を示しており、それはウエル中に捕捉された抗体の定量的尺度である。X軸は、各データポイントでの1ウエルあたりの用いた抗体の濃度(μg/mL)を示している。 図35Cは、ELISAアッセイでヒト化抗体H1L11の用量依存性のヒトNOGO-A56への結合をキメラ抗体(HcLc)と比較したものを示している。Y軸は490nmでの吸光度(OD)を示しており、それはウエル中に捕捉された抗体の定量的尺度である。X軸は、各データポイントでの1ウエルあたりの用いた抗体の濃度(μg/mL)を示している。 NOGO-A発現が増加すると用量依存性にAβ量を上昇させる。グラフのY軸はAβ40の増加(%)である。X軸はmycをタグしたNOGO-A cDNAの濃度の増加を示している。グラフの上は、抗NOGO-A抗体を用いてウエスタンブロッティングによってNOGO-Aタンパク質発現量の増加を示しているゲルである。

Claims (33)

  1. ヒトNOGOと結合し中和する抗体またはその機能を有するフラグメント。
  2. ヒトNOGO-Aタンパク質のアミノ酸586から785の間の領域に結合する、請求項1に記載の抗体。
  3. ヒトNOGO-Aのアミノ酸586から685の間の領域に結合する、請求項2に記載の抗体。
  4. ヒトNOGO-Aのアミノ酸686から785の間の領域に結合する、請求項2に記載の抗体。
  5. 請求項1に記載の抗体であって、次のCDRの各々：
    軽鎖CDR：配列番号1、2、および3
    重鎖CDR：配列番号4、5、および6
    を含んでなる、抗体。
  6. 請求項1に記載の抗体であって、次のCDRの各々：
    軽鎖CDR：配列番号7、8、および９
    重鎖CDR：配列番号10、11、および12
    を含んでなる、抗体。
  7. 請求項1に記載の抗体であって、次のCDRの各々：
    軽鎖CDR：配列番号13、14、および15
    重鎖CDR：配列番号16、17、および18
    を含んでなる、抗体。
  8. 請求項5に記載の抗体であって、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3から選択されたCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変ドメイン、ならびにCDRL1、CDRL2、およびCDRL3から選択されたCDRを1つ以上含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体。
  9. 請求項6に記載の抗体であって、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3から選択されたCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変ドメイン、ならびにCDRL1、CDRL2、およびCDRL3から選択されたCDRを1つ以上含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体。
  10. 請求項7に記載の抗体であって、CDRH1、CDRH2、およびCDRH3から選択されたCDRの各々を含んでなる1つの重鎖可変ドメイン、ならびにCDRL1、CDRL2、およびCDRL3から選択されたCDRを1つ以上含んでなる軽鎖可変ドメインを含んでなる抗体。
  11. モノクローナル抗体である、請求項1から10のいずれかに記載の抗体。
  12. ヒト化、またはキメラ抗体である、請求項1から13のいずれかに記載の抗体。
  13. 重鎖可変領域が配列番号37で表されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項8に記載の抗体。
  14. 重鎖可変領域が配列番号38で表されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項9に記載の抗体。
  15. 重鎖可変領域が配列番号39で表されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項10に記載の抗体。
  16. 軽鎖可変領域が配列番号40で表されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項8または13に記載の抗体。
  17. 軽鎖可変領域が配列番号41で表されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項9または14に記載の抗体。
  18. 軽鎖可変領域が配列番号42で表されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項10または15に記載の抗体。
  19. 請求項１〜１８のいずれかに記載の抗NOGO抗体またはその機能を有するフラグメントを、製薬上許容される希釈剤または担体とともに含んでなる、医薬組成物。
  20. ヒトの脳卒中およびその他の神経疾患/障害を治療または予防する方法であって、請求項1から18のいずれかに記載の抗NOGO抗体、その改変抗体またはその機能を有するフラグメントの有効量を、そのような治療または予防を必要としているヒトに投与することを含んでなる、方法。
  21. 脳卒中およびその他の神経疾患/障害の治療または予防のための医薬品の調製における、請求項1から18のいずれかに記載の抗NOGO抗体、その改変抗体またはその機能を有するフラグメントの使用。
  22. 脳卒中またはその他の神経疾患/障害に罹患している、または発症の危険性があるヒトの患者における神経変性を阻害する、および/または機能回復を促進する方法であって、そのような方法を必要としているヒトに対して、請求項1から18のいずれかに記載の抗NOGO抗体、その改変抗体またはその機能を有するフラグメントの有効量を投与することを含んでなる、方法。
  23. 脳卒中およびその他の神経疾患/障害に罹患している、または発症の危険性があるヒトの患者の神経変性を阻害する、および/または機能回復を促進するための医薬品の調製における、請求項1から18のいずれかに記載の抗NOGO抗体、それには改変抗体またはその機能を有するフラグメントを含むが、その抗NOGO抗体の使用。
  24. ヒトの脳卒中またはその他の神経疾患/障害の治療または予防の方法であって、該ヒトに対して請求項1から18のいずれかに記載の抗NOGO抗体の治療上有効な量を非経口投与するステップを含んでなる、方法。
  25. 抗NOGO抗体が静脈内に投与される、請求項24に記載の方法。
  26. その他の神経疾患/障害が次のものからなる群；
    外傷性脳損傷、脊髄損傷、アルツハイマー病、側頭前頭葉性認知症(タウオパチー)、末梢神経障害、パーキンソン病、ハンチントン病、および多発性硬化症、
    から選択されたものである、請求項20から24のいずれかに記載の方法。
  27. ヒトの軸索を請求項1から18に記載の抗NOGO抗体と接触させるステップを含んでなる、軸索の出芽を促進する方法。
  28. 該方法がin vitroで行われる、請求項27に記載の方法。
  29. ヒトNOGO-Aと特異的に結合しヒトNOGO-Aの活性を中和する請求項1から18のいずれかに記載の抗NOGO抗体を産生する方法であって、次のステップ；
    (a)該抗体の重鎖をコードする第1のベクターを提供し；
    (b)該抗体の軽鎖をコードする第2のベクターを提供し；
    (c)該第1と第2のベクターを用いて哺乳類宿主細胞を同時トランスフェクトし；
    (d)ステップ(c)の宿主細胞を培地(好ましくは無血清培地)中で、該抗体が該宿主細胞から該培地中へ分泌されることが可能な条件下で培養し；
    (e)ステップ(d)の分泌された抗体を回収すること、
    を含んでなる、方法。
  30. 請求項1から18のいずれかに記載の抗体の結合を競合的に阻害する抗NOGO抗体を作成する方法であって、次のステップ；
    (a)該抗体の重鎖をコードする第1のベクターを提供し；
    (b)該抗体の軽鎖をコードする第2のベクターを提供し；
    (c)該第1と第2のベクターを用いて哺乳類宿主細胞を同時トランスフェクトし；
    (d)ステップ(c)の宿主細胞を培地(好ましくは無血清培地)中で、該抗体が該宿主細胞から該培地中へ分泌されることが可能な条件下で培養し；
    (e)ステップ(d)の分泌された抗体を回収すること、
    を含んでなる、方法。
  31. NOGO-Aと結合しNOGO-Aの活性を中和する抗NOGO抗体を含んでなる、静脈内に投与可能な医薬組成物を作成する方法であって、次のステップ；
    (a)該抗体の重鎖をコードする第1のベクターを提供し；
    (b)該抗体の軽鎖をコードする第2のベクターを提供し；
    (c)該第1と第2のベクターを、例えば同時トランスフェクションで哺乳類宿主細胞内へ導入し；
    (d)ステップ(c)の宿主細胞を、該宿主細胞が該培地中に1つの軽鎖と1つの重鎖を含んでなる抗体を分泌する好ましくは無血清培地である培地中で培養し；
    (e)ステップ(d)の分泌された抗体を回収し、そして精製するかまたはせず；
    (f)ステップ(e)の抗体を静脈内に投与可能な医薬組成物中に組み入れること、
    を含んでなる、方法。
  32. ヒトNOGO-Aのアミノ酸586-785、特に586-685または686-785と結合し、該NOGO-Aの活性を中和する抗NOGO抗体を作成する方法であって、次のステップ；
    (a)該抗体の重鎖をコードする第1のベクターを提供し；
    (b)該抗体の軽鎖をコードする第2のベクターを提供し；
    (c)該第1と第2のベクターを、例えば同時トランスフェクションで哺乳類宿主細胞内へ導入し；
    (d)ステップ(c)の宿主細胞を、該宿主細胞が該培地中に1つの軽鎖と1つの重鎖を含んでなる抗体を分泌する好ましくは無血清培地である培地中で培養し；
    (e)ステップ(d)の分泌された抗体を回収し、そして精製するかまたはしないこと、
    を含んでなる、方法。
  33. 該宿主細胞が、NS0、Sp2/o、CHO、COS及び3T3などの線維芽細胞からなる群から選択されたもの、特にCHOである、請求項29から32に記載の方法。
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