MXPA06007190A - Inmunoglobulinas neutralizantes nogo-a para tratamiento de enfermedades neurologicas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a anticuerpos para NOGO, formulaciones farmaceuticas que los contienen y al uso de tales anticuerpos en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades/trastornos neurologicos.

Description

INMUNOGLOBULINAS NEUTRALIZANTES NOGO-A PARA TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES NEUROLÓGICAS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a inmunoglobulinas, particularmente a anticuerpos que se unen a NOGO y neutralizan su actividad, polinucleótidos que codifican tales anticuerpos, las formulaciones farmacéuticas que contiene tales anticuerpos y al uso de tales anticuerpos en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades neurológicas. Otros aspectos, objetos y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción que sigue.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El trastorno cerebrovascular es una causa importante de muerte y discapacidad en el mundo occidental. No existe ninguna terapia aprobada para el tratamiento de trastorno cerebrovascular distinta de plasminógeno tisular (t- PA) que tiene que administrarse dentro de 3 horas de la aparición siguiendo un barrido de tomografía computarizada (CT) para excluir hemorragia. Hasta la fecha la mayoría de los agentes terapéuticos se dirige hacia el tratamiento de trastorno cerebrovascular agudo (es decir neuroprotección), han implicado predominantemente la dirección de receptores de glutamato y sus rutas de señalización cadena abajo que se sabe que están implicadas en la muerte celular aguda. Sin embargo, hasta la fecha estas estrategias han probado que no tienen éxito en ensayos clínicos y a menudo están asociadas a efectos secundarios de limitación de dosis (Hill y Hachinski, The Lancet, 352: (supl. l ll) 10-14 (1998)). Por lo tanto existe una necesidad de planteamientos novedosos dirigidos hacia la mejora de la muerte celular que sigue al cese de flujo sanguíneo. La neuroprotección es la capacidad de un tratamiento de prevenir o mejorar la pérdida de células neuronales en respuesta a una lesión o proceso patológico. Esto se puede lograr dirigiendo las neuronas directa o indirectamente mediante la prevención de la pérdida de las células neurogliales (incluyendo oligodendrocito). Después de la aparición del trastorno cerebrovascular, se observa algún grado de recuperación funcional espontánea en muchos pacientes, sugiriendo que el cerebro tiene la capacidad (aunque limitada) de repararse y/o remodelarse después de la lesión. Los agentes que tienen la capacidad de potenciar esta recuperación puede por lo tanto permitir que la intervención se haga mucho más tarde (días potenciales) después de la aparición de isquemia cerebral. Los agentes que son capaces de ofrecer tanto neuroprotección aguda como recuperación funcional potenciada puede proporcionar ventajas significativas sobre las estrategias neuroprotectoras potenciales actuales. La enfermedad de Alzheimer (AD) se caracteriza por la presencia de dos características diagnósticas de patología. Éstas son placas amiloides y marañas neurofibrilares compuestas de péptidos beta amiloides agregados (Aß40 y Aß42) y tau hiperfosforilado respectivamente (Dawbarn y Alien 2001 Neurobiology of Alzheimer's Disease OUP). Un estudio comprensivo ha mostrado una fuerte unión en pacientes entre la acumulación de beta-amiloides y deterioración cognitiva (Naslund y col, JAMA, marzo 22/29, 2000, Vol.283, No;12, páginas 1571 -1577). Esto es consistente con estudios genéticos y epidemiológicos que sugieren que algunas mutaciones en los genes de APP y presenilinas pueden predisponer a una temprana aparición de la AD, cuyas mutaciones también pueden potenciar los niveles de los péptidos Aß40 y Aß42, incluyendo la relación de los mismos. . La escisión de la proteína precursora de amiloides (APP) de transmembrana de tipo 1 mediante dos proteasas distintas denominadas secretasa beta y gamma es necesaria para la formación de péptido beta-amiloide. Se ha confirmado la identidad molecular de la secretasa beta como la aspartil-proteasa Asp/BACE1 (Hussain y col. , Mol. Cell. Neuro. Sci. 16, 609-619 (2000); Vassar y col. , Science (1999), Oct.22; 286 (5440):735-741 ). La naturaleza de la secretasa gamma continúa la fuente de algún debate y probablemente consiste en un complejo de alto peso molecular constituido por al menos las siguientes proteínas: presenilinas, Aph 1 , Pen2 y nicastrina (revisada en Medina y Dotti Cell Signalling 2003 15 (9): 829-41 ). El procesamiento de APP dentro del SNC probablemente se produce dentro de un número de tipos de células que incluyen neuronas, oligodendrocitos, astrocitos, y microglía. Aunque la velocidad global de procesamiento de APP en estas células estará influenciada por el nivel relativo de expresión de APP, BACE1/Asp2, presenilina-1 y -2, Aph1 , Pen2 y nicastrina. Además, los factores adicionales que regulan la localización subcelular de APP también pueden influenciar su procesamiento como se muestra en el hallazgo de que la mutación del motivo YENP en el dominio citoplásmico de APP que bloquea su endocitosis reduce la producción de beta-amiloides (Pérez y col. , 1999 J Biol Chem 274 (27) 18851 -6). La retención de la APP-beta-CTF en el ER mediante la adición del motivo de retención KKQNes suficiente para reducir la producción de amiloides en células transfectadas (Maltese y col., 2001 J Biol Chem 276 (23) 20267-20279). Recíprocamente, la elevación de endocitosis, mediante sobreexpresión de Rab5 es suficiente para elevar la secreción de amiloides por las células transfectadas (Grbovic y col. , 2003 J Biol Chem 278 (33) 31261 -31268). Consistente con estos hallazgos los estudios posteriores han mostrado que la reducción de niveles de colesterol celular (un factor de riesgo bien conocido para la AD) reducía la formación de beta-amiloides. Este cambio era dependiente de la endocitosis alterada como se demostró mediante el uso de mutantes de dinamina negativos dominantes (K44A) y la sobreexpresión de la Rab5 GTPasa que activa la proteína RN-Tre (Ehehalt y col., 2003 J Cell Biol 160 (1 ) 1 13-123). Los microdominios o balsas ricos en colesterol son también un sitio celular importante de producción de beta-amiloides y APP, BACE1 y componentes del complejo gamma-secretasa han mostrado todos residencia transitoria dentro de las balsas. El entrecruzamiento de anticuerpos de APP y BACE1 hacia balsas ricas en colesterol eran capaces de elevar la producción de beta-amiloides (Ehehalt y col., 2003 J Cell Biol 160 (1 ) 1 13-123). La expresión de BACE1 anclado a GP1 , que exclusivamente se dirige a balsas de lípidos, es de una manera similar capaz de elevar la escisión de APP y producción de beta-amiloides (Cordy y col. , 2003 PNAS 100 (20) 1 1735-1 1740). Los mecanismos en los que se basan la recuperación funcional se desconocen actualmente. El rebrote de axones lesionados y no lesionados se ha propuesto como un mecanismo posible. Sin embargo, aunque los estudios in vivo han mostrado que el tratamiento de la lesión de la médula espinal o accidente cerebral con factores neurotróficos dan como resultado la recuperación funcional potenciada y un grado de rebrote axonal, éstos no prueban una relación directa entre el grado de rebrote axonal y el grado de recuperación funcional (Jakeman, y col., 1998, Exp. Neurol. 1 54: 170-184, Kawamata y col. , 1997, Proc Nati Acad. Sci. USA., 94:8179-8184, Ribotta, y col. , 2000, J Neurosci. 20: 5144-5152). Además, el rebrote axonal requiere una neurona viable. En las enfermedades tales como trastorno cerebrovascular que está asociado a una gran muerte celular, la potenciación de la recuperación potencial ofrecida mediante un agente dado después del trastorno cerebrovascular puede por lo tanto ser a través de mecanismos distintos del rebrote axonal tal como la diferenciación de células tronco endógenas, la activación de rutas redundantes, cambios en la distribución de receptores o excitabilidad de las neuronas o neuroglía (Fawcett y Asher, 1999, Brain Res. Bulletin, 49: 377-391 , Horner y Gage, 2000, Nature 407 963-970). La capacidad limitada del sistema nervioso central (SNC) de repararse después de una lesión se cree que se debe en parte a que las moléculas dentro del ambiente del SNC que tienen un efecto inhibidor sobre el rebrote axonal (crecimiento de neuritas). La mielina del SNC se cree que contiene moléculas inhibidoras (Schwab ME y Caroni P (1988) J. Neurosci. 8, 2381 -2193). Dos proteínas de la mielina, glicoproteína asociada a mielina (MAG) y NOGO se han clonado e identificado como supuestos inhibidores del crecimiento de neuritas (Sato S. y col., (1 989) Biochem. Biophys. Res. Comm.163, 1473-1480; McKerracher L y col., (1994) Neuron 13, 805-81 1 ; Mukhopadhyay G y col. , (1 994) Neuron 13, 757-767; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262; Schafer y col. , (1996) Neuron 16, 1 107-1 1 13; documento WO9522344; WO9701352; Prinjha R y col., (2000) Nature 403, 383-384; Chen MS y col., (2000) Nature 403, 434-439; GrandPre T y col., (2000) Nature 403, 439-444; documento US005250414A; documento WO200005364A1 ; documento WO0031235). Se han identificado tres formas humanas de NOGO: NOGO-A que tiene 1 192 residuos de aminoácidos (No de acceso del GenBank AJ251383); NOGO-B, una variante de ayuste que carece de los residuos 186 a 1004 en el supuesto dominio extracelular (No de acceso del GenBank AJ251384) y una corta variante de ayuste, NOGO-C, que también carece de los residuos 186 a 1004 y también tiene un pequeño, dominio amino terminal, (No de acceso del GenBank AJ251385) (Prinjha y col. , (2000) anteriormente). La inhibición de las proteínas inhibitorias del SNC tal como NOGO puede proporcionar un medio terapéutico para mejorar la lesión neuronal y promover la reparación y crecimiento neuronal, por lo tanto, asistiendo potencialmente la recuperación de la lesión neuronal tal como el que se mantiene en el accidente cerebral. Los ejemplos de tales inhibidores de NOGO pueden incluir moléculas pequeñas, péptidos y anticuerpos. Los anticuerpos típicamente comprenden dos cadenas pesadas unidas juntas mediante enlaces disulfuro y dos cadenas ligeras. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada respectiva mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable seguido de numerosos dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo y un dominio constante en su otro extremo. El dominio variable de la cadena ligera se alinea con el dominio variable de las cadenas pesadas. El dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada. Los dominios constantes en la cadena ligera y pesada no están implicados directamente en la unión del antígeno y anticuerpo. Los dominios variables de cada par de las cadenas ligera y pesada forman el sitio de unión de antígenos. Los dominios variables sobre las cadenas ligera y pesada tienen la misma estructura general y cada dominio comprende un Estructura de cuatro regiones, cuyas secuencias están relativamente conservadas, conectadas mediante tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs) a menudo denominadas regiones hipervariables. Las cuatro regiones de estructura adoptan ampliamente una conformación de hoja beta y las CDRs forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de hoja beta. Las CDRs se mantienen en proximidad estrecha mediante las regiones de estructura y, con las CDRs del otro dominio, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígenos. Las CDRs y las regiones de estructura de anticuerpos se pueden determinar mediante la referencia de Kabal y col. , ("Sequences of proteins of immunological interest" US Dept. of Health and Human Services, US Government Printing Office, 1987). Se ha encontrado que los anticuerpos monoclonales anti-MAG, descritos (Poltorak y col. , I (1987) Journal of Cell Biology 105, 1893-1 899, DeBellard y col., (1996) Mol. Cell. Neurosci. 7, 89-101 ; Tang y col. , (1 997) Mol. Cell. Neurosci. 9, 333-346; Torigoe K y Lundborg G (1997) Exp. Neurology 150, 254-262) y comercialmente disponibles (MAB1567 (Chemicon)) cuando se administra bien directamente en el cerebro o por vía intravenosa después de la isquemia cerebral focal en la rata (un modelo de trastorno cerebrovascular), proporciona neuroprotección y potencia la recuperación funcional (documento PCT/EP03/08749).

Por lo tanto, los anticuerpos anti-MAG proporcionan agentes terapéuticos potenciales para tanto la neuroprotección aguda como la promoción de recuperación funcional después del trastorno cerebrovascular. Este anticuerpo es un anticuerpo murino. Aunque los anticuerpos murinos se usan a menudo como agentes de diagnóstico su utilidad como un agente terapéutico se ha probado en solamente unos pocos casos. Su limitada aplicación es en parte debida a que la administración repetida de un anticuerpo monoclonal murino a un ser humano provoca usualmente respuestas inmunes humanas contra estas moléculas. Para superar estas propiedades indeseables intrínsecas de anticuerpos murinos, se han desarrollado los anticuerpos "alterados" diseñados para incorporar regiones de anticuerpos humanos también establecidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado contiene regiones determinantes de complementariedad ("CDRs") de origen no humano y la mayoría del resto de la estructura se deriva de un anticuerpo humano. También se ha descrito que el anticuerpo monoclonal humano, IN-1 , que se indujo contra NI-220/250, una proteína de mielina que es un potente inhibidor del crecimiento de neuritas (y posteriormente mostrado que es un fragmento de NOGO-A), promueve la regeneración anoxal (Caroni, P y Schwab, ME (1988) Neuron 1 85-96; Schnell, L y Schwab, ME (1990) Nature 343 269-272; Bregman, BS y col. , (1995) Nature 378 498-501 y Thallmair, M y col. , (1998) Nature Neuroscience 1 124-131 ). También se ha descrito que NOGO-A es el antígeno para IN-1 (Chen y col., (2000) Nature 403 434-439). La administración del fragmento Fab IN-1 o humanizado IN-1 a ratas que han experimentado corte transversal de la médula espinal, potenciaba la recuperación (Fiedler, M y col. , (2002) Protein Eng 15 931 -941 ; Brosamle, C y col. , (2000) J. Neuroscience 20 8061 -8068). Sin embargo hasta la fecha no existe evidencia en la bibliografía que sugiera que la IN-1 , o su forma humanizada, puede unirse e inhibir NOGO-A humano, un requerimiento necesario para que un anticuerpo monoclonal sea útil en el tratamiento terapéutico de enfermedades mediadas por NOGO y trastornos tales como trastorno cerebrovascular y enfermedades neurodegenerativas en seres humanos. Por lo tanto, permanece un objetivo altamente deseable aislar y desarrollar un anticuerpo monoclonal útil terapéuticamente que se une e inhibe la actividad de NOGO humano. El proceso de neurodegeneración en los que se basan muchas enfermedades/trastornos neurológicos incluyen, pero sin limitación, enfermedades agudas tales como trastorno cerebrovascular (isquémico o hemorrágico), lesión cerebral traumática y lesión de la médula espinal así como enfermedades crónicas que incluyen enfermedad de Alzheimer, demencias fronto-temporales (tauopatías), neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Creutzfeldt -Jakob (CJD), esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), esclerosis múltiple, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y miositis de cuerpos de inclusión. En consecuencia un anticuerpo monoclonal anti-NOGO puede ser útil en el tratamiento de estas enfermedades/anticuerpos. Tales anticuerpos para el tratamiento de las enfermedades/anticuerpos anteriormente mencionados se proporcionan en la presente invención y se describen en detalle a continuación. Todas las publicaciones, tanto revista como patente, descritas en esta presente memoria descriptiva se incorporan expresamente y en su totalidad como referencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une y neutraliza la actividad de NOGO, preferentemente NOGO humano, más preferentemente NOGO-A humano (algunas veces denominado en la presente "anticuerpo anti-NOGO". Tal anticuerpo puede, por ejemplo, comprender una o más CDRs como se muestra en las tablas 1 a 6 que muestran las CDRs de tres de tales anticuerpos aislados independientemente: 2A10/3, 2C4/1 y 15C3/3. Las CDRs se identifican como describe Kabat (Kabat y col. , (1991 ) "Sequences of proteins of immunological interest"; quinta edición; US Department of Health and Human Services; NIH publicación No 91 -3242). Las CDR preferentemente son como se han definido por Kabat pero siguiendo los principios de la estructura y plegamiento de proteínas como han definido Chothia y Lesk, (Chothia y col. , (1989) "Conformations of immunoglobulin hypervariable regions"; Nature 342, póag. 877-883) se apreciará que los residuos adicionales también se pueden considerar que son parte de la región de unión a antígeno y por lo tanto están comprendidos en la presente invención.

Tabla 1 : CDRs de la cadena ligera del anticuerpo 2A1 0/3 ("2A10") Tabla 2: CDRs de la cadena pesada del anticuerpo 2A10/3 Tabla 3: CDRs de la cadena ligera del anticuerpo 2C4/1 ("2C4") Tabla 4: CDRs de la cadena pesada del anticuerpo 2C4/1 Tabla 5: CDRs de la cadena ligera del anticuerpo 1 5C3/3 ("15C3") TablA 6: CDR de la cadena pesada del anticuerpo 1 5C3/3 En un primer aspecto, la presente ¡nvención proporciona: (a) un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a y neutraliza NOGO, particularmente NOGO humano, más particularmente la actividad de NOGO-A humano dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende un domino variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs de la tabla 2, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende cada una de las CDRs de la tabla 1 . (b) un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a y neutraliza NOGO, particularmente NOGO humano, más particularmente la actividad de NOGO-A, humano dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende un domino variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs de la tabla 4 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende cada una de las CDRs de la tabla 3. (c) un anticuerpo o fragmento funcional del mismo, dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo comprende un domino variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs seleccionadas en la tabla 6 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende cada una de las CDRs de la tabla 5. Los autores proporcionan un anticuerpo anti-NOGO o fragmento funcional del mismo que comprende: (a) un dominio variable de la cadena pesada (VH ) que comprende en secuencia CDRH 1 , CDRH2 y CDRH3 de la tabla 1 , y/o (b) un dominio variable de la cadena ligera (V ) que comprende en secuencia CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 de la tabla 4; un anticuerpo anti-NOGO o fragmento funcional del mismo que comprende: (a) un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende en secuencia CDRH 1 , CDRH2 y CDRH3 de ia tabla 2, y /o (b) un dominio variable de la cadena ligera (V ) que comprende en secuencia CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 de la tabla 5; o un anticuerpo anti-NOGO o fragmento funcional del mismo que comprende: a) un dominio variable de la cadena pesada (VH) que comprende en secuencia CDRH 1 , CDRH2 y CDRH3 de la tabla 3, y /o b) un dominio variable de la cadena ligera (V ) que comprende en secuencia CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 de la tabla 6. El anticuerpo puede ser quimérico, totalmente humano, o humanizado. En otro aspecto la presente invención también se refiere a un anticuerpo anti-NOGO que se une al mismo epítope o (o imbricado) sobre el polipéptido NOGO como un anticuerpo que tiene las regiones variables de la cadena pesada y ligera descritas anteriormente.

Preferentemente el epítope esta comprendido dentro de la región 586 a 785 (numeración de aminoácidos de NOGO-A, número de acceso del GenBank AJ251383), más preferentemente el epítope está comprendido dentro de la región 586 a 685 ó 686 a 785. Los ensayos de unión competitiva se usan para mapear los epítopes sobre un antígeno. De esta manera también se proporciona un anticuerpo anti NOGO que se une a la NOGO-A humano entre loa aminoácidos 586 a 685 ó 686 a 785 y neutraliza la actividad de NOGO-A. Tal anticuerpo se puede producir según los procedimientos expuestos más adelante. En un aspecto adicional, también se proporciona un anticuerpo anti- NOGO que inhibe competitivamente la unión del anticuerpo que tiene las CDR descritas anteriormente a NOGO, preferentemente NOGO humano, lo más preferentemente NOGO-A humano. Más específicamente se proporciona un anticuerpo, que puede ser completamente humano, humanizado o quimérico que se une a y neutraliza la actividad de NOGO, particularmente NOGO humano, más particularmente NOGO-A humano que inhibe competitivamente, a concentración equimolecular, la unión a NOGO-A humano de un anticuerpo humano que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs de la tabla 2 y una región variable de la cadena ligera que comprende cada una de las CDRs de la tabla 1 . En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo, que puede ser completamente humano, humanizado o quimérico que se une a y neutraliza la actividad de NOGO, particularmente NOGO humano, más particularmente NOGO-A humano que inhibe competitivamente la unión a NOGO-A humano de un anticuerpo humano que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs de la tabla 4 y una región variable de la cadena ligera que comprende cada una de las CDRs de la tabla 3. En otra modalidad, se proporciona un anticuerpo, que puede ser completamente humano, humanizado o quimérico que se une a y neutraliza la actividad de NOGO, particularmente NOGO humano, más particularmente NOGO-A humano que inhibe competitivamente la unión a NOGO-A humano de un anticuerpo humano que tiene una región variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs de la tabla 6 y una región variable de la cadena ligera que comprende cada una de las CDRs de la tabla 5. En las modalidades típicas, el anticuerpo de competición es de la clase IgG, más típicamente lgG1 o lgG4.

Anticuerpos quiméricos También se proporciona un anticuerpo quimérico que se une y neutraliza NOGO, preferentemente NOGO humano, más preferentemente NOGO-A humano que comprende las CDRs tales como las descritas en las tablas 1 a 6. Preferentemente el anticuerpo quimérico comprende secuencias de ratón y humanas (por ejemplo, región variable de ratón y región constante humana). Además se proporciona un anticuerpo quimérico que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs de la tabla 2 y una región variable de la cadena ligera que comprende cada una de las CDR de la tabla 1 . También se proporciona un anticuerpo quimérico que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs de la tabla 4 y una región variable de la cadena ligera que comprende cada una de las CDRs de la tabla 3.

También se proporciona un anticuerpo quimérico que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs de la tabla 6 y una región variable de la cadena ligera que comprende cada una de las CDRs de la tabla 5. En las modalidades típicas, el anticuerpo de competición es de la clase IgG, más típicamente lgG 1 o lgG4 humanas, con una cadena ligera humana de tipo K.

Anticuerpos humanizados Además, la invención proporciona un anticuerpo humanizado que se une a y neutraliza NOGO, preferentemente NOGO humana, más preferentemente NOGO-A humano. Más específicamente se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs de la tabla 2 y una región variable de la cadena ligera que comprende las CDRs de la tabla 1 . También se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs de la tabla 4 y una región variable de la cadena ligera que comprende las CDRs de la tabla 3. También se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDR de la tabla 6 y una región variable de la cadena ligera que comprende las CDRs de la tabla 5. En las modalidades típicas, los anticuerpos de competición, tanto si son quiméricos, humanizados o completamente humanizados de la clase IgG, más típicamente lgG 1 o lgG4 humanas, con una cadena ligera humana de tipo K. Un aspecto adicional de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-NOGO de la presente ¡nvención o fragmento funcional del mismo con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento o profilaxis de trastorno cerebrovascular (particularmente trastorno cerebrovascular isquémico) y otras enfermedades neurológicas, en particular enfermedad de Alzheimer, en un ser humano que comprende la administración a dicho ser humano en necesidad del mismo de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NOGO de la invención o fragmentos funcionales del mismo. En otro aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-NOGO de la invención o un fragmento funcional del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de trastorno cerebrovascular (particularmente trastorno cerebrovascular isquémico) y otras enfermedades neurológicas, en particular enfermedad de Alzheimer. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de inhibición de la neurodegeneración y/o promoción de la recuperación funcional en un paciente aquejado de, o con riesgo de desarrollar, un trastorno cerebrovascular (particularmente trastorno cerebrovascular isquémico) u otra enfermedad neurológica, en particular enfermedad de Alzheimer, que comprende la administración a dicho ser humano en necesidad del mismo de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NOGO de la invención o un fragmento funcional del mismo. En todavía otro aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-NOGO de la invención o un fragmento funcional del mismo en la preparación de un medicamento para la inhibición de la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente humano aquejado de, o con riesgo de desarrollar, un trastorno cerebrovascular y otra enfermedad neurológica, en particular enfermedad de Alzheimer. En un aspecto adicional, los autores proporcionan un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una o más de las CDRs seleccionadas entre CDRH 1 , CDRH2 y CDRH3 de la tabla 1 , preferentemente comprendiendo al menos CDRH3, y/o una región variable de la cadena ligera que comprende una o más CDRs seleccionadas entre CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 de la tabla 4; un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una o más CDR seleccionadas entre CDRH 1 , CDRH2 y CDRH3 de la tabla 2, preferentemente comprendiendo al menos CDRH3, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una o más CDRs seleccionadas entre CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 de la tabla 5; o un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una o más CDRs seleccionadas entre CDRH 1 , CDRH2 y CDRH3 de la tabla 3, preferentemente comprendiendo al menos CDRH3, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una o más CDRs seleccionadas entre CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 de la tabla 6. Otros aspectos y ventajas de la presente invención se describen además en la descripción de tallada y las modalidades preferidas de la misma.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el efecto inhibidor de la proteína de fusión CST-NOGO-A56 sobre el crecimiento de neuritas. El eje X la longitud media de neurita/ neurita (NL/N) en unidades arbitrarias. La Figura 2 muestra el efecto bloqueante del sobrenadante del hibridoma 2A10 sobre la actividad inhibidora del crecimiento de neuritas de NOGO-A56 (GST-Nogo5&6). El eje Y es como el de la Figura 1 . La Figura 3 muestra el efecto bloqueante del sobrenadante del hibridoma 2C4 sobre la actividad inhibidora del crecimiento de neuritas de NOGO-A56 (GST-Nogo5&6). El eje Y es como el de la Figura 1 . La Figura 4 muestra el efecto bloqueante del sobrenadante del hibridoma 1 5C3 sobre la actividad inhibidora del crecimiento de neuritas de NOGO-A56 (GST-Nogo5&6). El eje Y es como el de la Figura 1 . La Figura 5 es el sobrenadante del hibridoma control 12G3 que no tiene actividad bloqueante sobre NOGO-A56. El eje Y es como el de la Figura 1. La Figura 6 muestra el efecto bloqueante sobre NOGO- A56-A56 de 2A10 a 4 concentraciones. El eje Y es como el de la Figura 1 . La Figura 7 muestra que el anticuerpo monoclonal IN-1 recombinante no muestra ningún actividad bloqueante hacia NOGO-56 (GST-NOGO5 y 6). El eje Y es como el de la Figura 1 . Para las Figuras 1 a 7 el control negativo es la proteína GST sola. La Figura 8 muestra la unión de los anticuerpos monoclonales 2A1 0, 2C4 y 15C3 a NOGO-A56 humano. El eje X muestra la DO medida a 450 nm, una medición cuantitativa del anticuerpo capturado en los pocilios. El eje X muestra la concentración de anticuerpo usada (ng/ml) por pocilio en cada punto de entrada de datos. La Figura 9 muestra el volumen de lesión como un porcentaje del volumen de cerebro total a diversas concentraciones después del estudio del ejemplo 10. La Figura 1 0 muestra los datos de la puntuación neurológica del ejemplo 10 representados como media ± ETM. Figuras 1 1 A, 1 1 B, 1 1 C, 1 1 D. Datos del cilindro del ejemplo 10 representados como media ± ETM para A) ambas patas, B) pata izquierda, C) pata derecha y D) desgarro de la pata derecha en ratas que recibieron 3 dosis de 15 µg de anticuerpo anti-NOGO, y los que recibieron 4 dosis de anticuerpo anti-NOGO. La Figura 12 muestra los traspiés de las patas delanteras del ejemplo 10 representados como media ± intervalos de confianza al 95%. La Figura 13 muestra los traspiés de las patas traseras del ejemplo 1 0 representados como media ± intervalos de confianza al 95%. La Figura 14 A) muestra pesos corporales representados como media ± ETM. La administración de dosis a animales con 15 µg de anticuerpo produce un incremento en peso corporal a las 24 horas, 1 semana y en cada instante entre la semana 3 y la finalización del estudio. Figura 14 B). El gráfico muestra los pesos corporales para la parte del grupo administrado con dosis de 1 5 µg en animales administrados con dosis 3 veces y los administrados con dosis cuatro veces. Los datos expresados como media ± intervalos de confianza al 95%. * P < 0,05, ANOVA de mediciones repetidas. Figura 14 C) El gráfico muestra los pesos corporales para la parte del grupo administrado con dosis de 15 µg en animales administrados con dosis 3 veces y los administrados con dosis cuatro veces. Comparado con animales administrados con dosis de 5 µg del anticuerpo anti-NOGO y los animales administrados con dosis de anticuerpos control. Los datos expresados como media ± intervalos de confianza al 95%. * P < 0,05, ANOVA de mediciones repetidas. La Figura 15 representa el volumen de lesión como porcentaje de volumen de cerebro total del ejemplo 1 1 . La Figura 16 muestra los datos de puntuación neurológica representados como media ± ETM del ejemplo 1 1 . Figuras 17 A, 17 B y 17 C. Datos del cilindro representados como media + ETM para A) ambas patas, B) pata izquierda, C) pata derecha del ejemplo 1 1 . La Figura 18 muestra los traspiés de las patas delanteras representados como media ± ETM del ensayo de barra de equilibrio ahusada del ejemplo 1 1 . La Figura 1 9 muestra los traspiés de las patas traseras representados como media ± ETM del ejemplo 1 1 . La Figura 20 muestra los traspiés de las patas traseras representados como media ± ETM (ensayo de tiempo de espera para cruzar la barra) Figura 21 : transfección de NOGO A conduce a la elevación de los niveles del péptido Aß 40 en células SHSY5Y-APPwt. Figura 22: transfección de NOGO A conduce a la elevación de los niveles del péptido Aß 42 en células SHSY5Y-APPwt. Figura 23: efecto de la expresión de NOGO A sobre los niveles del péptido Aß 40. Figura 24: efecto de la expresión de NOGO A sobre los niveles del péptido Aß 42. Figura 25: efecto de la expresión de NOGO A, NOGO-B y NOGO-C sobre Aß 40 y Aß 42. Figura 26. El anticuerpo Anti-NOGO A 2A10-BR inhibe la secreción de Aß por las células SHSY5Y-APPwt. Figura 27. Efecto de lgG 1 control sobre la secreción de Aß por las células SHSY5Y-APPwt. Figura 28. Efecto de lgG1 control sobre la secreción de Aß por las células SHSYdY-APPswe. Figura 29. Efecto del anticuerpo anti-NOGO 6D5 control (bloqueo no funcional) sobre la secreción de Aß por las células SHSY5Y-APPwt. Figura 30. Efecto del anticuerpo anti-NOGO 6D5 control (bloqueo no funcional) sobre la secreción de Aß por las células SHSYdY-APPswe. Figura 31 . La función bloqueante del anticuerpo monoclonal anti-NOGO-A 2A10 inhibe secreción de Aß por las células SHSY5Y-APPwt. Figura 32. La función bloqueante del anticuerpo monoclonal anti-NOGO-A 2A10 inhibe secreción de Aß a partir de células SHSY5Y-APPswe. Figura 33. La función bloqueante del anticuerpo monoclonal anti-NOGO-A 2C4 inhibe secreción de Aß por las células SHSY5Y-APPwt. Figura 34. Efecto de preparaciones de anticuerpos de cultivo estático anti NOGO-A y anticuerpos de control adicionales sobre la secreción de Aß por las células SHSY5Y-APPwt. 2A10, 2C4 y 15C3 son los anticuerpos de cultivos estáticos. Todos los otros son controles purificados en BR (biorreactor) o controles disponibles comercialmente. Las Figuras 36 A a C ilustran la unión dependiente de la dosis del anticuerpo humanizado H 1 L1 1 en comparación con la quimera (HcLc) a NOGO-A56 humano en un ensayo ELISA. El eje Y muestra la densidad óptica (DO) medida a 490 nm, una medición cuantitativa de anticuerpo capturado en los pocilios. El eje X muestra la concentración de anticuerpo usada (µg/ml) por pocilio en cada punto de entrada de datos. Figura 36: La expresión aumentada de NogoA eleva los niveles de Aß de una manera dependiente de dosis. El eje Y del gráfico es el % de incremento de Aß40. El eje X muestra el incremento de concentración de cADN de NogoA dirigido por myc. Anteriormente el gráfico es un gel que muestra la cantidad aumentada de expresión de proteína de NogoA como se muestra mediante transferencia de Western usando un anticuerpo anti-NogoA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos de la invención son típicamente anticuerpos monoclonales (mAb) y son preferentemente quiméricos, humanizados, totalmente humanos o reestructurados. De éstos los humanizados y totalmente humanos se prefieren particularmente. Los anticuerpos de la invención tienen típicamente la estructura de un anticuerpo natural o fragmento funcional del mismo.

El anticuerpo puede además comprender un anticuerpo de longitud completa, un fragmento (Fab)2, un fragmento Fab, un dímero de las cadenas ligeras o un dímero de las cadenas pesadas. El anticuerpo puede ser lgG1 , lgG2, lgG3, o lgG4; o IgM; IgA, IgE o IgD o una variante modificada del mismo. El dominio constante de la cadena pesada del anticuerpo se puede seleccionar de acuerdo a lo anterior. El dominio constante de la cadena ligera puede ser un dominio constante kappa o lamda. Además, el anticuerpo puede comprender modificaciones de todas las clases, por ejemplo, dímeros de IgG, los mutantes de Fc que no se unen más a los receptores de Fc o median la unión a Clq. El anticuerpo puede también ser un anticuerpo quimérico o el tipo descrito en el documento WO86/01533 que comprende una región de unión antígeno y una región no-inmunoglobulina. La región de unión a antígeno es un dominio variable de las cadenas ligeras o dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo. Típicamente la región de unión a antígeno comprende los dominios variables tanto de las cadenas ligeras como pesadas. La región no-inmunoglobulina se condensa en su extremo C a la región de unión a antígeno. La región no-inmunoglobulina es típicamente una proteína no-inmunoglobulina y puede ser una enzima, una toxina o proteína que tiene especificidad de unión conocida. Las dos regiones de este tipo de anticuerpo quimérico pueden estar conectadas mediante una secuencia de engarce escindible. Las inmunoadhesinas que tienen las CDRs como se han descrito anteriormente también se contemplan en la presente invención. La región constante se selecciona según la funcionalidad requerida. Normalmente una lgG1 demostrará capacidad lítica mediante la unión a un complemento y/o mediará la ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). Se preferirá una lgG4 si se requiere un anticuerpo de bloqueo no citotóxico. Sin embargo, los anticuerpos de lgG4 pueden demostrar inestabilidad en la producción y por lo tanto puede ser más preferible modificar la lgG1 generalmente más estable. Las modificaciones sugeridas se describen en el documento EP0307434 las modificaciones preferidas se incluyen en las posiciones 23d y 237. La invención por lo tanto proporciona una forma lítica o una no lítica de un anticuerpo según la invención. Por lo tanto en las formas preferidas el anticuerpo de la invención es un anticuerpo de lgG 1 no Utico de longitud completa (es decir, tetrámero H2L2) que tiene las CDRs descritas anteriormente. En las formas más preferidas los autores proporcionan un anticuerpo de lgG1 no Utico de longitud completa que tiene las CDRs de las SEC ID Números 1 a 6; SEC I D Números 7 a 12 o SEC I D Números 13 a 18. En un aspecto adicional, la invención proporciona polinucleótidos que codifican las CDR. Por ejemplo, la invención proporciona polinucleótidos que codifican las CDRH 1 , CDRH2, CDRH3, CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 se describen en las tablas 1 a 6. Las secuencias de polinucleótidos preferidas se muestran en las tablas 7 a 12 más adelante. Tabla 7: CDRs de la cadena ligera del anticuerpo 2A10/3 Tabla 8: CDRs de la cadena pesada del anticuerpo 2A1 0/3 Tabla 9: CDRs de la cadena ligera del anticuerpo 2C4/1 Tabla 10: CDRs de la cadena pesada del anticuerpo 2C4/1 Tabla 1 1 : CDRs de la cadena ligera del anticuerpo 15C3/3 Tabla 12: CDRs de la cadena pesada del anticuerpo 15C/3 En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena ligera de un anticuerpo anti-NOGO que incluye al menos una CDR seleccionada entre CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 en la tabla 1 , 3, 6, más preferentemente incluyendo las 3 CDR en la tabla 1 o las 3 CDR en la tabla 3 o las 3 CDR en la tabla 5. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica una región variable de la cadena pesada de un anticuerpo anti-NOGO que incluye al menos una CDR seleccionada entre CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 en la tabla 1 , 3, 5, más preferentemente incluyendo las 3 CDR en la tabla 2 o las 3 CDR en la tabla 4 o las 3 CDR en la tabla 6. La ¡nvención además proporciona un anticuerpo anti-NOGO, o un fragmento funcional del mismo, que se une a y neutraliza la actividad de NOGO, preferentemente el NOGO humano y más preferentemente NOGO-A humano que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos: QVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGN I NPSNGGT NYN EKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCELGQGYWGQGTTLTVSS (SEC ID No: 37); o EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSCYAMSWVRQTPEKRLEWVASISDGGSYTY YPDNVKGRFTISRADN KNNLYLQMSHLKSEDTAMYYCAKELLFDYWGQGTTLTVSS (SEC I D No: 38); o QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGKGLEWIGQIYPGDGD TNYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAVRFDYWGQGTTLTVSS (SEC I D No: 39).

La ¡nvención además proporciona un anticuerpo anti-NOGO, o un fragmento funcional del mismo, que se une a y neutraliza NOGO que comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una de las siguientes secuencias de aminoácidos: DIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFLQRPGQSPQLLIYLMST RASGVSDRFSGSGSGTDFTLE1SRVKAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGAGTKLELK (SEC ID No: 40) DWMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGAGTKLELK (SEC I D No: 41 ).

DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMS NLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQH LEYPLTFGAGTKLELK (SEC ID No: 42).

En un aspecto adicional de la ¡nvención se proporciona un anticuerpo anti-NOGO, o fragmento funcional del mismo, que se une y neutraliza la actividad de NOGO, preferentemente NOGO humano, más preferentemente NOGO humano, más preferentemente NOGO-A que comprende: a) una región variable de la cadena pesada de la SEC ID No: 37 junto con una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos la SEC ID No: 40; o b) una región variable de la cadena pesada de la SEC ID No: 38 junto con una región variable de las cadenas ligeras que comprende la secuencia de aminoácidos la SEC ID No: 41 ; o c) una región variable de de la cadena pesada de la SEC I D No: 39 junto con una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos la SEC ID No: 42. En un aspecto adicional de la invención se proporciona un anticuerpo anti-NOGO, o fragmento funcional del mismo, que comprende: un fragmento variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID No: 37 y una parte constante o fragmento de la misma de una cadena pesada humana y un fragmento variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID No: 40 y una parte constante o fragmento de la misma de una cadena ligera humana; o un fragmento variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID No: 38 y una parte constante o fragmento de la misma de una cadena pesada humana; y un fragmento variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID No: 41 y una parte constante o fragmento de la misma de una cadena ligera humana o un fragmento variable de la cadena pesada que comprende la SEC ID No: 39 y una parte constante o fragmento de la misma de una cadena pesada humana y un fragmento variable de la cadena ligera que comprende la SEC ID No: 42 y una parte constante o fragmento de la misma de una cadena ligera humana. En un aspecto adicional, la invención proporciona polinucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Números 37 a 39 y las regiones variables de las cadenas ligeras que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Números 40 a 42. Una secuencia de polinucleótidos preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 37 es CAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTG AAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGG GTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGC AATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAG ACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACT CTGCGGTCTATTATTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACCACTC TCACAGTCTCCTCA (SEC ID No: 43) Una secuencia de polinucleótidos preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC I D No: 38 es GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTC CCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTTGCTATGCCA TGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCC ATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAATGTAAAGGGCCG ATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACAACCTGTACCTGCAAATGA GCCATCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAAGGAACTA CTTTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEC ID No: 44) Una secuencia de polinucleótidos preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 39 es CAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTC AGTGAAGATTTCCTGCAAAGCTTCTGGCTACGCATTCAGTAGCTACTGGA TGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGAAAGGGTCTTGAGTGGATTGGACAG ATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAACTACAACGGAAAGTTCAAGGGCAA GGCCACACTGACTGCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCA GCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTTCTGTGCAGTACGCTTT GACTATTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA (SEC I D No: 45) Una secuencia de polinucleótidos preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC I D No: 40 es GATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGTCACTTCTGGAGA ATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGGATG GGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTCAG CTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTT TAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGA AGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCG CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEC ID No: 46) Una secuencia de polinucleótidos preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC I D No: 41 es GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGA TCAAGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATG GAAACACCTATTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAG CTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTT CAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGG AGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAGAGTACACATGTTCCG CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEC ID No: 47) Una secuencia de polinucleótidos preferida que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 42 es GATATTGTGATGACTCAGGCTGCACCCTCTGTACCTGTCACTCCTGGAGA GTCAGTATCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTGCATAGTAATG GCAACACTTACTTGTATTGGTTCCTGCAGAGGCCAGGCCAGTCTCCTCAG CTCCTGATATATCGGATGTCCAACCTTGCCTCAGGAGTCCCAGACAGGTT CAGTGGCAGTGGGTCAGGAACTGCTTTCACACTGAGAATCAGTAGAGTGG AGGCTGAGGATGTGGGTGTTTATTACTGTATGCAACATCTAGAATATCCG CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA (SEC ID No: 48) El anticuerpo 2A1 0 anti -NOGO comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 37 y una región variable de la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC I D No: 40. El anticuerpo 2C4 anti -NOGO comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC I D No: 38 y una región variable de las cadenas ligeras que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 41 . El anticuerpo 16C3 anti -NOGO comprende una región variable de la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID No: 39 y una región variable de la cadena ligera que tiene ia secuencia de aminoácidos de la SEC I D No: 42. "NOGO" se refiere a cualquier polipéptido NOGO, que incluye las formas variantes. Éste incluye, pero sin limitación, NOGO-A que tiene 1 192 residuos de aminoácidos (No de acceso del GenBank AJ251383); NOGO-B, una variante de ayuste que carece de los residuos 186 a 1004 en el dominio extracelular supuesto (No de acceso del GenBank AJ251384) y una variante de ayuste más corta, NOGO-C, que también carece de los residuos 1 86 a 1004 y también tiene un dominio terminal amino más pequeño, alternativo (No de acceso del GenBank AJ251385) (Prinjha y col. , (2000) anteriormente). Todas las referencias a "NOGO" en la presente se entiende que incluyen cualquiera y todas las formas variantes de NOGO tales como NOGO-A y las variantes de ayuste descritas, salvo que se indique una forma específica. "Neutralizante" y las variaciones gramaticales del mismo se refiere a inhibición, bien total o parcial, de la función de NOGO incluyendo su unión a las neuronas e inhibición del crecimiento de neuritas. "Anticuerpo alterado" se refiere a una proteína codificada mediante una región codificadora de inmunoglobulina alterada, que se puede obtener mediante la expresión en una célula huésped seleccionada. Tales anticuerpos alterados incluyen anticuerpos diseñados por ingeniería genética (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, reestructurados, humanizados o sectorizados) o fragmentos de anticuerpos que carecen de toda o parte de una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, Fv, fab, o F(ab)2 y similares. "Región codificadora de inmunoglobulina alterada" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo alterado. Cuando el anticuerpo alterado es un anticuerpo humanizado o injertado a las CDRs, las secuencias que codifican las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) de una inmunoglobulina no humana se insertan en una primera molécula de inmunoglobulina que comprende secuencias de marcos conservados variables. Opcionalmente, la primera molécula de inmunoglobulina está operativamente unida a una segunda molécula de inmunoglobulina. La "parte inmunoglobulina primera" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifican una región variable de Estructura humano o inmunoglobulina humana en la que las regiones que codifican las CDRs nativas (o de origen natural) se reemplazan con las regiones que codifican las CDRs de un anticuerpo donante. La región variable humana puede ser una cadena pesada de inmunoglobulina, una cadena ligera (o ambas cadenas), un análogo o fragmentos funcionales de las mismas. Tales regiones de las CDRs, localizadas dentro de la región variable de anticuerpos (inmunoglobulinas) se pueden determinar mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo Kabat y col. , (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)) describen las reglas para localizar las CDRs. Además, se conocen programas de ordenador que son útiles para identificar las regiones/estructuras de las CDR. La "parte inmunoglobulina segunda" se refiere a otra secuencia de nucleótidos que codifican una proteína o péptido a la que se condensa la parte inmunoglobulina primera en fase o mediante una secuencia de engarce convencional opcional (es decir, unido operativamente). Preferentemente en un gen de ¡nmunoglobulina. La parte inmunoglobulina segunda puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la región constante entera para la misma (es decir, los anticuerpos homólogos primero y segundo alterados se derivan a partir de la misma fuente) o un anticuerpo adicional (es decir, heterólogo) de interés. Puede ser una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina (o ambas cadenas como parte de un polipéptido individual). La parte inmunoglobulina segunda no se limita a una clase o isotipo particular de inmunoglobulina. Además, la parte ¡nmunoglobulina segunda puede comprender parte de una región constante de inmunoglobulina tal como se encuentra en Fab o F(ab)2 (es decir, una parte discreta de una región constante humana o región de estructura). Tal parte inmunoglobulina segunda también puede comprender una secuencia que codifica una proteína de membrana integral sobre la superficie externa de una célula huésped, por ejemplo, como parte de una genoteca de manifestación de fago, o una secuencia que codifica una proteína para detección analítica o diagnóstica, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, etc. Los términos Fv, Fc, Fab, o F(ab)2 se usan con sus significados habituales (véase, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1 988)). Como se usa en la presente, un "anticuerpo diseñado por ingeniería genética" describe un tipo de anticuerpo alterado, es decir, un anticuerpo sintético de longitud completa (por ejemplo, anticuerpo reestructurado o humanizado opuesto a un fragmento de anticuerpo) en el que una porción de los dominio variables de la cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo aceptor seleccionado se reemplazan por las partes análogas de uno o más anticuerpos donantes que tienen especificidad para el epítope seleccionado. Por ejemplo, tales moléculas pueden incluir anticuerpos caracterizados por una cadena pesada humanizada asociada a una cadena ligera no modificada (o cadena ligera quimérica), o viceversa. Los anticuerpos diseñados por ingeniería genética también se pueden caracterizar mediante alteración de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las regiones de estructura del dominio variable ligero y/o pesado del anticuerpo aceptor con el fin de conservar la especificidad de unión al anticuerpo. Estos anticuerpos pueden comprender el reemplazo de una o más CDRs (preferentemente todas) a partir del anticuerpo aceptor con las CDRs de un anticuerpo donante en la presente. Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un tipo de anticuerpo diseñado por ingeniería genética que contiene una región variable de origen natural (cadena ligera y cadena pesada) derivada de un anticuerpo donante en asociación con las regiones constantes de las cadenas ligera y pesada derivadas de un anticuerpo aceptor. Un "anticuerpo humanizado" se refiere a un tipo de anticuerpo diseñado por ingeniería genética que tiene sus CDRs derivado de una inmunoglobulina donante no humana, las restantes partes derivadas de ¡nmunoglobulina de la molécula que se derivan de una (o más) ¡nmunoglobulina (s) humana (s). Además, los residuos del soporte del Estructura se pueden alterar para preservar la afinidad de unión (véase, por ejemplo, Queen y col. , Proc. Nati Acad Sci USA, 86: 10029-1 0032 (1989), Hodgson y col. , Bio/Technology, 9: 421 (1991 )). Un anticuerpo aceptor humano adecuado se puede seleccionar entre una base de datos convencional, por ejemplo, la base de datos KABAT ®, base de datos de Los Álamos, y base de datos de Swiss Protein, por homología a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del anticuerpo donante. Un anticuerpo humano caracterizado por una homología a las regiones de estructura del anticuerpo donante (o una base de aminoácido) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de la cadena pesada y/o una región de estructura variable de la cadena pesada para la inserción en las CDRs donantes. Un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar las regiones de estructura constantes o variables de la cadena ligera se puede seleccionar de una manera similar. Se debe indicar que la cadena pesada y ligera del anticuerpo 5 aceptor no se requieren para originarse a partir del mismo anticuerpo aceptor. La técnica previa describe varias maneras de producir tales anticuerpos humanizados-véanse por ejemplo, los documentos EP-A- 0239400 y EP-A-054951 . "Anticuerpo humano reestructurado" se refiere a un 0 anticuerpo alterado en el que mínimamente al menos una CDR de un primer anticuerpo donante monoclonal humano se sustituye por una CDR en un segundo anticuerpo aceptor humano. Preferentemente se reemplazan las seis CDRs. Más preferentemente, una región de combinación de antígeno entera (por ejemplo, Fv, Fab o F(ab')2 ) de d un primer anticuerpo monoclonal donante humano se sustituye con la región correspondiente en un segundo anticuerpo monoclonal aceptor humano. Más preferentemente, la región Fab de un primer donante humano se une operativamente a las regiones constantes apropiadas de un segundo anticuerpo aceptor humano para formar un anticuerpo 0 monoclonal de longitud completa. Un "anticuerpo vectorizado" se refiere a un anticuerpo al que se ha unido un agente para mejorar el transporte a través de la barrera hemato-encefálica (BBB). (Para revisión, véase Pardridge; Advanced Drug Delivery revisión 36, 299-321 , 1999). La unión puede d ser química o alternativamente el resto se puede sintetizar por ingeniería genética en el anticuerpo. Un ejemplo es preparar una quimera con un anticuerpo dirigido hacia un receptor de células endoteliales de los capilares del cerebro, por ejemplo, un anticuerpo receptor anti-insulina o anticuerpo receptor anti-transferrina (Saito y col. , (1 996) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92 10227-31 ; Pardridge y col. , (1 996) Pharm. Res. 12 807-816; Broadwell y col. , (1996) Exp. Neurol. 142 47-65; Bickel y col. , (1993) Proc Nati. Acad. Sci. USA 90, 261 8-2622; Friden y col. , (1996) J. Pharm. Exp. Ther. 278 1491 -1498, documentos US5182107, US5164924, US5833988, US5527527). Una vez unido al receptor, ambos componentes del anticuerpo biespecífico pasan a través de la BBB mediante el proceso de transcitosis. Como alternativa, el agente puede ser un ligando que se une a tales receptores de la superficie de las células, por ejemplo insulina, transferrina, o lipoproteína de baja densidad (Descamps y col. , (1996) Am. J. Physiol. 270 H 1 149-H 1 158; Duffy y col., (1987) Brain Res. 420 32-38; Dehouck y col., (1997) J. Cell Biol. 1997 877-889). También se pueden usar los péptidos de origen natural tales como penetratina y SynB 1 y Syn B3 que se sabe que mejoran el transporte a través de la BBB (Rouselle y col. , (2000) Mol. Pharm.57, 679-686 y Rouselle y col. , (2001 ) Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296, 124-131 ). El término "anticuerpo donante" se refiere a un anticuerpo (monoclonal y/o recombinante) que contribuye a las secuencias de aminoácidos de sus regiones variables, CDRs, u otros fragmentos funcionales o análogos de las mismas a una parte ¡nmunoglobulina primera, de manera que proporcione la región codificadora de inmunoglobulina alterada y el anticuerpo alterado expresado resultante con la especificidad antigénica y actividad neutralizante característica del anticuerpo donante. 5 El término "anticuerpo aceptor" se refiere a un anticuerpo (monoclonal y/o recombinante) heterólogo al anticuerpo donante, que contribuye en todo (o cualquier parte, pero preferentemente toda) de las secuencias de aminoácidos que codifican sus regiones de estructura de la cadena pesada y/o ligera y/o sus regiones constantes 0 de la cadena pesada y/o ligera de la parte inmunoglobulina primera. Preferentemente un anticuerpo humano es el anticuerpo aceptor. Las "CDRs" se definen como las secuencias de aminoácidos de la región determinante complementaria de un anticuerpo que son las regiones hipervariables de las cadenas ligera y d pesada de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a Ed. , U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Existen tres CDRs de la cadena pesada y tres regiones de la cadena ligera (o regiones CDR) en la parte variable de 0 una inmunoglobulina. De esta manera, las "CDRs" como se usan en la presente se refiere a las tres CDR de la cadenas pesada, o las tres CDR de la cadena ligera (o las CDRs de la cadenas tanto pesada como ligera, si es apropiado). La estructura y el plegamiento de las proteínas del d anticuerpo pueden significar que se consideran otros residuos parte de la región de unión al antígeno y se entendería así por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Chothia y col. , (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883. Por conveniencia las CDRs como las define Kabat en las SEC ID Números 37-42 están encasilladas. Las CDRs proporcionan la mayoría de los residuos de contacto para la unión del anticuerpo al antígeno o epítope. Las CDRs de interés en esta invención se derivan de las secuencias variables de las cadenas ligera y pesada de anticuerpo donante, e incluyen los análogos de las CDRs de origen natural, dichos análogos también compartes o retienen la misma especificidad de unión a antígeno y/o la capacidad neutralizante que el anticuerpo donante de los que se derivan. Un "fragmento funcional" es una secuencia variable de las cadenas ligera o pesada (por ejemplo, supresiones secundarias en el extremo amino o carboxi de la región variable de inmunoglobulina) que conserva la misma especificidad de unión a antígeno y la misma o similar capacidad neutralizante del anticuerpo del que se derivó el fragmento. Una "análoga" es una secuencia de aminoácidos modificada por al menos un aminoácido, en la que dicha modificación puede ser química o una sustitución o una transposición de unos pocos aminoácidos (es decir, no más de 1 0), dicha modificación permite que la secuencia de aminoácidos conserve las características biológicas, por ejemplo, especificidad de antígeno y alta afinidad, de la secuencia no modificada. Por ejemplo, mutaciones (silenciosas) se pueden construir, mediante sustituciones, cuando se crean ciertos sitios de restricción de endonucleasa dentro o alrededor de las regiones codificadoras de las CDRs. La presente invención contempla el uso de análogos del anticuerpo de la invención. Se sabe bien que cambios menores en las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos pueden conducir por ejemplo a una forma alélica de la proteína original que conserva sustancialmente las propiedades similares. De esta manera, los análogos del anticuerpo de la invención incluyen aquellos en los que las CDRs en la región hipervariable de las cadenas ligera y pesada son al menos 80% homologas, preferentemente al menos 90% homologas y más preferentemente al menos 95% homologas a las CDRs como se han definido anteriormente como CDRH1 , CDRH2, CDRH3, CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 en las tablas 1 a 6 y conservan la actividad neutralizante de NOGO. Las secuencias de aminoácidos son al menos 80% homologas si tienen 80% de residuos de aminoácidos idénticos en una posición similar cuando las secuencias se alinean óptimamente, huecos o inserciones contándose como residuos no idénticos. La invención también contempla análogos de los anticuerpos de la ¡nvención en los que las regiones de estructura son al menos 80%, preferentemente al menos 90% y más preferentemente al menos 95% homologas a las regiones de estructura expuestas en las SEC ID Números 37 a 42. Las secuencias de aminoácidos son al menos 80% homologas si tienen 80% de residuos de aminoácidos idénticos en una posición similar cuando las secuencias se alinean óptimamente, huecos e inserciones contándose como residuos no idénticos. Los análogos también pueden aparecer como variaciones alélicas. Una "variación o modificación alélica" es una alteración en la secuencia de ácidos nucleicos. Tales variaciones o modificaciones se pueden deber a la degeneración del código genético o se pueden diseñar por ingeniería genética para proporcionar las características deseadas. Estas variaciones o modificaciones pueden o no pueden dar como resultado alteraciones en cualquier secuencia de aminoácidos codificada. La expresión "agentes efectores" se refiere a moléculas vehículo no proteicas a las que los anticuerpos alterados, y/o cadenas sintéticas ligeras o pesadas del al anticuerpo donante u otros fragmentos del anticuerpo donante se pueden asociar mediante medios convencionales. Tales vehículos no proteicas pueden incluir vehículos convencionales usados en el campo diagnóstico, por ejemplo, perlas de poliestireno u otro plástico, polisacáridos, por ejemplo, como se usa en el sistema BIAcore [Pharmacia], u otras sustancias no proteicas útiles en el campo médico y seguras para la administración a los seres humanos y animales. Otros agentes efectores pueden incluir un macrociclo, para quelar un átomo de metal pesado, o radioisótopos. Tales agentes efectores también pueden ser útiles para incrementar la semivida de los anticuerpos alterados, por ejemplo, polietilenglicol.

Como alternativa, se pueden construir anticuerpos, anticuerpos alterados y fragmentos, inmunizando una especie no humana (por ejemplo, bovina, ovina, mono, pollo, roedor (por ejemplo, murino y rata), etc.) para generar una inmunoglobulina deseable tras presentación con NOGO nativo a partir de cualquier especie contra las que se puede generar que los anticuerpos reaccionen de manera cruzada con NOGO humano, por ejemplo, ser humano o pollo. Las técnicas de hibridomas convencionales se emplean para proporcionar una línea celular de hibridomas que secretan un mAb no humano para NOVO. Después tales hibridomas se rastrean para unión usando placas de 384 o 96 pocilios recubiertas con NOGO, con NOGO biotinilado unido a una placa recubierta con estreptavidina o en un inmunoensayo homogéneo de europio-APC unidos usando NOGO biotinilado. Un anticuerpo humano nativo se puede producir en un ratón con anticuerpos humano tal como el "Xenomouse ™" (Abgenix) donde los genes de inmunoglobulina de ratón se han eliminado y los genes que codifican las inmunoglobulinas humanas se han insertado en el cromosoma de ratón. Los ratones se inmunizan como es habitual y desarrollan una respuesta de anticuerpos que se deriva de los genes humanos. De esta manera el ratón produce anticuerpos humanos que obvian la necesidad de humanizar la selección posterior de hibridomas positivos. (Véase Green L. L. , J Immunol Methods 1 999 dic. 10; 231 (1 -2): 1 1 -23). La presente invención también incluye el uso de fragmentos Fab o F(ab')2 derivados de los mAB dirigidos contra NOGO. Un fragmento Fab contiene la cadena ligera entera y la porción amino terminal de las cadenas pesadas; y un fragmento F(ab')2 es el fragmento formado por dos fragmentos Fab unidos mediante enlaces bisulfuro. Los fragmentos Fab y F(ab')2 se pueden obtener mediante medios convencionales, por ejemplo, escisión de mAB con las enzimas proteolíticas apropiadas, papaína y/o pepsina, o mediante procedimientos recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')2 son útiles ellos mismos como agentes terapéuticos o profilácticos, y como donantes de secuencias que incluyen las regiones variables y las secuencias de las CDRs útiles en la formación de anticuerpos recombinantes o humanizados como se describe en la presente. Los fragmentos Fab y F(ab')2 también se pueden construir mediante una genoteca de fago combinatoria (véase, por ejemplo, Winter y col. , Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)) o mediante la mezcla de las cadenas de inmunoglobulina (véase, por ejemplo. , Marks y col. , Bio/Technology, 10:779-783 (1992), que se incorporan ambas en la presente como referencia en su totalidad. De esta manera los fragmentos de anticuerpos humanos (Fv, scFv, Fab) específicos para NOGO se pueden aislar usando genotecas de manifestación de fago de fragmentos de anticuerpos humanos. Una genoteca de partículas de bacteriófago, que manifiesta las proteínas de los fragmentos de anticuerpo, se amoldan contra la proteína NOGO. Los fagos que manifiestan los fragmentos de anticuerpo que se unen al NOGO se conservan a partir de la genoteca y se amplifican clonalmente. Los genes de anticuerpos humanos después se eliminan del bacteriófago específico y se insertan en construcciones de expresión de IgG humana que contienen las regiones constantes de la IgG humana para formar la molécula de IgG humana intacta con las regiones variables del bacteriófago aislado específico para NOGO. Los anticuerpos donantes pueden aportar secuencias, tales como secuencias variables de péptidos de las cadenas ligera y/o pesada, secuencias marco conservadas, secuencias de las CDRs, fragmentos funcionales, y los análogos de los mismos, y las secuencias de ácidos nucleicos que las codifican, útiles en el diseño y obtención de de diversos anticuerpos alterados que se caracterizan mediante la especificidad de unión a antígeno del anticuerpo donante. Teniendo en cuenta la degeneración del código genético, se pueden construir diversas secuencias codificadoras que codifican las secuencias variables de aminoácidos de la cadena ligera y pesada, y las secuencias de las CDRs así como fragmentos funcionales y los análogos de los mismos que comparten la especificidad de antígenos del anticuerpo donante. Las secuencias de ácidos nucleicos aisladas, o los fragmentos de las mismas, que codifican las secuencias de de péptidos de las cadenas variables o las CDRs se pueden usar para producir anticuerpos alterados, por ejemplo, anticuerpos quiméricos o humanizados, u otros anticuerpos diseñados por ingeniería genética cuando se combinan operativamente con una parte inmunoglobulina primera. Las moléculas de inmunoglobulinas alteradas pueden codificar anticuerpos alterados que incluyen anticuerpos diseñados por ingeniería genética tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Una región codificadora de inmunoglobulina alterada deseada contiene regiones codificadoras de las CDRs que codifican péptidos que tienen la especificidad antigénica de un anticuerpo anti NOGO, preferentemente un anticuerpo de alta afinidad, insertada en una parte inmunoglobulina primera (un Estructura o región variable de inmunoglobulina humana). Preferentemente, la parte inmunoglobulina primera está unida operativamente a una parte inmunoglobulina segunda se define anteriormente, y puede incluir una secuencia que codifica una segunda región de anticuerpo de interés, por ejemplo, una región Fc. Las partes inmunoglobulina segundas también pueden incluir secuencias que codifican otra inmunoglobulina a la que se condensa la región constante de las cadenas ligera o pesada en fase o por medio de una secuencia de engarce. Los anticuerpos diseñados por ingeniería genética dirigidos contra fragmentos funcionales o los análogos de NOGO se pueden diseñar para provocar una unión potenciada. La parte inmunoglobulina segunda también puede estar asociada a agentes efectores como se han definido anteriormente, incluyendo moléculas vehículo no proteicas, a las que la parte inmunoglobulina segunda se puede unir operativamente mediante medios convencionales. La fusión o unión entre las partes inmunoglobulina segundas, por ejemplo, secuencias de anticuerpos, y el agente efector puede ser mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, mediante enlaces covalentes o iónicos convencionales, proteínas de fusión, o reticulantes hetero-bifuncionales, por ejemplo, carbodiimida, glutaraldehído, y similares. Tales técnicas se conocen en ia técnica se describen fácilmente en la química convencional y textos de bioquímica. Adicionalmente, las secuencias de engarces convencionales que proporcionan simplemente una cantidad desea de espacio entre la parte inmunoglobulina segunda y el agente efector también se puede construir en la región codificadora de la inmunoglobulina alterada. El diseño de tales engarces lo conocen bien los expertos en la materia. En aspectos adicionales de la invención los autores proporcionan diabodies (bivalentes o biespecíficos), triabodies, tetrabodies, y otras especies proteicas scFV multivalentes que tienen una o más CDRs como se ha descrito anteriormente que se unen a y neutralizan la función NOGO. En todavía otra modalidad adicional, el anticuerpo de la invención puede tener unido a él un agente adicional. Por ejemplo, el procedimiento de la tecnolog ía de ADN se puede usar para producir un anticuerpo diseñado por ingeniería genética de la invención en la que el fragmento Fc o domiio CH2-CH3 de una molécula de anticuerpo de longitud completa se ha reemplazado por una enzima u otra molécula detectable (es decir, una molécula efectora o indicadora polipeptídica.) La parte inmunoglobulina segunda se puede unir operativamente a un péptido, proteína de inmunoglobulina o fragmento de la misma heterólogo a la secuencia que contiene CDR que tiene especificidad antigénica del anticuerpo anti-NOGO. La proteína resultante puede exhibir tanto especificidad del antígeno anti-NOGO como características de la no inmunoglobulina después de la expresión. Ese agente de fusión característico puede ser, por ejemplo, una característica funcional tal como otro dominio de unión o receptor, o una característica terapéutica si el agente de fusión es él mismo una proteína terapéutica, o características antigénicas adicionales. Otra proteína deseable de esta invención puede comprender una molécula de anticuerpo de longitud completa que tiene cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, o cualquier fragmento discreto de las mismas, tales como los fragmentos Fab o F(ab')2, un dímero de las cadenas pesadas, o cualquier fragmento recombinante m ínimo del mismo tal como un Fv o un anticuerpo de cadena individual (SCA) o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el mAb donante seleccionado. Tal proteína se puede usar en la forma de un anticuerpo alterado, o se puede usar en su forma no condensada. Siempre que la parte inmunoglobulina segunda se deriva de un anticuerpo diferente del anticuerpo donante, por ejemplo, un isotipo o- clase de regiones de estructura o constantes de inmunoglobulina, se produce un anticuerpo diseñado por ingeniería genética. Los anticuerpos diseñados por ingeniería genética pueden contener regiones constantes de inmunoglobulina (Ig) regiones de estructura variables de una fuente, por ejemplo, el anticuerpo aceptor, y una o más (preferentemente todas) CDS del anticuerpo donante. Además, se pueden hacer alteraciones, por ejemplo, supresiones, sustituciones, o adiciones, de la región de estructura del dominio variable ligero y/o pesado del mAb aceptor en los niveles de ácidos nucleicos o aminoácidos, o las regiones de las CDRs donantes con el fin de conservar la especificidad de unión a antígeno del anticuerpo donante. Tales anticuerpos diseñados por ingeniería genética se diseñan para emplear una (o ambas) de las cadenas variables ligeras y/o pesadas del mAb anti-NOGO o una o más de las CDRs de las cadenas pesadas o ligeras. Los anticuerpos diseñados por ingeniería genética se pueden neutralizar, como se ha definido anteriormente. Tales anticuerpos diseñados por ingeniería genética pueden incluir un anticuerpo humanizado que contiene las regiones de estructura de una inmunoglobulina humana o subtipo seleccionada, o un anticuerpo quimérico que contiene las regiones constaníes de las cadenas pesadas o ligeras humanas condensadas a los fragmentos funcionales del anticuerpo anti-NOGO. Un anticuerpo aceptor humano (o de otro animal) adecuado se puede seleccionar de una base de datos convencional, por ejemplo la base de datos KABAT ®, base de datos de Los Álamos, y base de datos de Swiss Protein, por homología a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del anticuerpo donante. Un anticuerpo humano caracterizado por una homolog ía a las regiones de estructura del anticuerpo donante (o una base de aminoácido) puede ser adecuado para proporcionar una región constante de la cadena pesada y/o una región de estructura variable de la cadena pesada para la inserción en las CDRs donantes. Un anticuerpo aceptor adecuado capaz de donar las regiones de estructura constantes o variables de la cadena ligera se pueden seleccionar de una manera similar. Se debe indicar que las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo aceptor no se requieren para originarse a partir del mismo anticuerpo aceptor. Deseablemente el Estructura heterólogo y las regiones constantes se seleccionan entre clases e isotipos de inmunoglobulinas humanas, tales como IgG (subtipos 1 a 4), IgM, IgA, e IgE. Sin embargo, el anticuerpo aceptor necesita no incluir solamente secuencias de proteínas de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, se puede construir un gen en el que una secuencia de ADN que codifica parte de una cadena de ¡nmunoglobulina humana se condensa a una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina tal como una molécula efectora o indicadora polipéptidica. Preferentemente, en un anticuerpo humanizado, los dominios variables en ambas cadenas pesadas y ligeras se han diseñado por ingeniería genética mediante uno o más reemplazos de las CDRs. Es posible usar las seis CDRs, o diversas combinaciones menores de seis CDRs. Preferentemente se reemplazan las seis CDRs. Es posible reemplazar las CDRs solamente en la cadena pesada humana, usando como cadena ligera la cadena ligera no modificada del anticuerpo aceptor humano. Como alternativa, una cadena ligera compatible se puede seleccionar entre otro anticuerpo humano mediante el recurso a las bases de datos de anticuerpos convencionales. El resto del anticuerpo diseñado por ingeniería genética se puede derivar de cualquier inmunoglobulina humana aceptora adecuada. El anticuerpo humanizado diseñado por ingeniería genética así preferentemente tiene la estructura de un anticuerpo humano natural o un fragmento del mismo, y posee la combinación de las propiedades requeridas para uso terapéutico eficaz. Los expertos en la materia comprenderán que un anticuerpo diseñado por ingeniería genética se pueden además modificar mediante cambios en los aminoácidos del dominio variable sin afectar necesariamente la especificidad y alta afinidad del anticuerpo donante (es decir, un análogo). Se anticipa que los aminoácidos de las cadenas ligeras y pesadas se pueden sustituir por otros aminoácidos bien en los marcos conservados de los dominios variables o las CDRs o ambos. Además, la región constante se puede alterar para potenciar o disminuir las propiedades selectivas de las moléculas de la presente invención. Por ejemplo, dimerización, unión a receptores de Fc, o la capacidad de unirse y activar complemento (véase, por ejemplo, Angal y col. , Mol. Immunol, 30: 105-1 08 (1993), Xu y col., J. Biol. Chem, 269:3469-3474 (1 994), Winter y col., EP 307,434-B). Un anticuerpo alterado que es un anticuerpo dimérico se diferencia de los anticuerpos humanizados descritos anteriormente en que proporciona las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos donantes no humanos enteros, incluyendo regiones de estructura, en asociación con regiones constantes de inmunoglobulina de otras especies, preferentemente humanas para ambas cadenas. Preferentemente, las secuencias variables de las secuencias ligeras y/o pesadas y las CDR de los mAb donantes adecuados, y sus secuencias codificadoras de ácidos nucleicos, se utilizan en la construcción de anticuerpos alterados, preferentemente anticuerpos humanizados, de esta invención, mediante el procedimiento siguiente. Las mismas o técnicas similares también se pueden emplear para generar otras modalidades de esta invención. Un hibridoma que produce un mAb donante seleccionado se clona convenientemente, y el ADN de sus regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras obtenidas mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y col. , (Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Las regiones de las cadenas pesadas y ligeras que contienen al menos las regiones codificadoras de las CDRs y aquellas porciones de las regiones de estructura de los dominios variables ligares y/o pesadas del mAb aceptor requeridas con el fin de conservar la especificidad de unión al mAb donante, así como las restantes partes derivadas de inmunoglobulina de la cadena de anticuerpos derivadas de una inmunoglobulina humana se obtienen usando cebadores de polinucleótidos y la transcriptasa inversa. Las regiones que codifican las CDR se identifican usando bases de datos conocidas y la comparación con otros anticuerpos. Después se puede preparar y ensayar un anticuerpo quimérico de ratón/humano para evaluar la capacidad de unión. Tal anticuerpo quimérico contiene las regiones VH y VL de los anticuerpos donantes no humanos enteros, en asociación con las regiones constantes de la Ig humana para ambas cadenas. Las regiones de estructura homologas de una región variable de las cadenas ligeras de un anticuerpo humano se pueden identificar usando bases de datos computarizadas, por ejemplo KABAT ®, y un anticuerpo humano que tiene homología con el anticuerpo donante se seleccionará como anticuerpo aceptor. Se puede diseñar una región adecuada marco conservada variable de la cadena ligera de una manera similar. Un anticuerpo humanizado se puede derivar del anticuerpo quimérico, o preferentemente, preparado sintéticamente insertando las regiones codificadoras de las CDRs del mAb donante de las cadenas pesadas y ligeras apropiadamente dentro dei Estructura de las cadenas ligeras y pesadas. Como alternativa, se puede preparar un anticuerpo humanizado usando las técnicas habituales de mutagénesis. De esta manera, el anticuerpo humanizado conservante contiene regiones de estructura humanas y regiones codificadoras de las CDRs del mAb donante. Puede haber manipulación posterior de los residuos de los marcos conservados. El anticuerpo humanizado resultante se puede expresar en células huésped recombinantes, por ejemplo, células COS, CHO o de mieloma. Un vector de expresión convencional o plásmido recombinante se produce colocando estas secuencias codificadoras para el anticuerpo en asociación operativa con secuencias de control reguladoras convencionales capaces de controlar la replicación y expresión en, y/o secreción a partir de, una célula huésped. Las secuencias reguladoras incluyen secuencias promotoras, por ejemplo, promotor de CMV, y secuencias señal, que se pueden derivar de otros anticuerpos conocidos. De manera similar, se puede producir un segundo vector de expresión que tenga una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera o pesada de anticuerpo complementaria. Preferentemente este segundo vector de expresión es idéntico al primero excepto en la medida en la que se refiere a las secuencias codificadoras y marcadores seleccionables, para así asegurar tanto como sea posible que cada cadena polipeptídica se expresa funcionalmente. Como alternativa, las secuencias codificadoras de las cadenas pesadas y ligeras para el anticuerpo alterado puede residir en un único vector.

Una célula huésped seleccionada se co-transfecta mediante técnicas convencionales con tanto el primero como el segundo vector (o simplemente transfectado mediante un único vector) para crear la célula huésped transfectada de la invención que comprende las cadenas sintéticas tanto ligeras como pesadas. Después la célula transfectada se cultiva mediante técnicas convencionales para producir el anticuerpo diseñado por ingeniería genética de la ¡nvención. El anticuerpo que incluye la asociación de tanto la cadena pesada como o la cadena ligera recombinantes se selecciona a partir de un cultivo mediante el ensayo apropiado, tal como ELISA o RÍA. Se pueden emplear técnicas convencionales para construir otros anticuerpos y moléculas alteradas. Los vectores adecuados para las etapas de clonación y subclonación empleadas en los procedimientos y construcción de las composiciones de esta invención se pueden seleccionar por los expertos en la materia. Por ejemplo, se puede usar la serie pUC convencional de clonación de vectores. Un vector, pUC19, está comercialmente disponible de casas proveedoras, tales como Amersham (Buckinghamshire, Reino Unido) o Pharmacia (Uppsala, Suecia). Adicionalmente, cualquier vector que es capaz de replicarse fácilmente, tiene una abundancia de sitios de clonación y genes seleccionables (por ejemplo, resistencia a antibióticos), y se manipula fácilmente se puede usar para clonación. De esta manera, la selección del vector de clonación no es un factor limitante en esta invención.

De manera similar, los vectores empleados para expresión de los anticuerpos ios pueden seleccionar los expertos en la materia a partir de cualquier vector convencional. Los vectores también contienen secuencias reguladoras (tales como los promotores de CMV o RSV) que dirigen la replicación y expresión de secuencias de ADN heterólogas en células huésped seleccionadas. Estos vectores contienen las secuencias de ADN descritas anteriormente que codifican el anticuerpo o la región inmunoglobulina alterada. Además, los vectores pueden incorporar las secuencias de inmunoglobulinas seleccionadas modificadas mediante la inserción de sitios de restricción deseables para la manipulación fácil. Los vectores de expresión también se pueden caracterizar mediante genes adecuados para amplificar la expresión de las secuencias de ADN heterólogas, por ejemplo, el gen de la dihidrofolato reductasa de mamíferos (DHFR). Otras secuencias de vector preferibles incluyen una secuencia señal de poli A, tal como de hormona de crecimiento bovina (BHG) y la secuencia promotora de betaglobina (betaglopro). Los vectores de expresión útiles en la presente se pueden sintetizar mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Los componentes de tales vectores, por ejemplo, replicones, genes de selección, potenciadores, promotores, secuencias señal y similares, se pueden obtener a partir de fuentes comerciales o naturales o sintetizarse mediante procedimientos conocidos para uso en la dirección de la expresión y/o secreción del producto del ADN recombinante en un huésped seleccionado. Se pueden también seleccionar para este propósito otros vectores de expresión apropiados de los que se conocen en la técnica numerosos tipos para la expresión en mamíferos, bacterias, insectos, levaduras, y hongos. La presente invención también abarca una línea celular transfectada con un plásmido recombinante que contiene las secuencias codificadoras de los anticuerpos o moléculas de inmunoglobulinas alteradas de los mismos. Las células huésped útiles para la clonación y otras manipulaciones de estos vectores de clonación son también convencionales. Sin embargo, más deseablemente, las células de diversas cepas de E. coli se usan para la replicación de los vectores de clonación y otras etapas en la construcción de anticuerpos alterados de esta invención. Las células huésped o líneas celulares adecuadas para la expresión del anticuerpo de la ¡nvención son preferentemente células de mamíferos tales como NSO, Sp2/0, CHO (por ejemplo, DG44), COS, COS, una célula de fibroblasto (por ejemplo, 3T3), y células de mieloma, y más preferentemente una CHO o una célula de mieloma. Se pueden usar células humanas, que permiten así que la molécula se modifique con patrones de glicosilación humanos. Como alternativa, se pueden emplear otras líneas celulares eucarióticas. Se conocen en la técnica la selección de células huésped de mam íferos y procedimientos para la transformación, cultivo, amplificación, selección y producción y purificación de productos. Véase por ejemplo, Sambrook y col. , citado anteriormente. Las células bacterianas pueden demostrar utilidad como células huésped para la expresión de los Fab recombinantes de la presente invención (véase, por ejemplo, Plückthun, A. , Immunol. Rev., 130: 151 -188 (1992)) . Sin embargo, debido a la tendencia de proteínas expresadas en células bacterianas que están en una forma no plegada o plegada no apropiadamente o en una forma no glicosilada, cualquier Fab recombinante producido en una célula bacteriana se tendrá que seleccionar para retención de la capacidad de unión a antígenos. Si la molécula expresada mediante la célula bacteriana se produjo en una forma plegada apropiadamente, la célula bacteriana sería un huésped deseable. Por ejemplo, diversas cepas de E. coli usadas para la expresión se conocen bien como células huésped en el campo de la biotecnología. En este procedimiento también se pueden usar diversas cepas de B. subtilis, Streptomyces, otros bacilos y similares. Si se desea, las cepas de levaduras conocidas por los expertos en al técnica están también disponibles como células huésped, así como células de insecto, por ejemplo, Drosophila y Lepidópteros y sistemas de expresión virales. Véase, por ejemplo, Miller y col. , Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986) y las referencias citadas en la presente. Los procedimientos generales mediante los que se pueden construir los vectores, los procedimientos de transfección requeridos para producir las células huésped de la invención, y los procedimientos de cultivo necesarios para producir el anticuerpo de la invención a partir de tal célula huésped son todos técnicas convencionales. Típicamente, el procedimiento de cultivo de la presente invención es un procedimiento de cultivo exento de suero, usualmente cultivando las células en suspensión exentas de suero. De manera similar, una vez producidos, los anticuerpos de la invención se pueden purificar a partir de los contenidos de los cultivos celulares según los procedimientos habituales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato amónico, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis sobre gel y similares. Tales técnicas están dentro de la experiencia en la técnica y no limita esta invención. Por ejemplo, la preparación de anticuerpos alterados se describe en los documentos WO 99/58679 y WO 96/16990. Todavía otro procedimiento de expresión de los anticuerpos puede utilizar la expresión en un animal transgénico, tal como se describe en la patente de Estados Unidos No 4.873.316. Ésta se refiere a un sistema de expresión que usa el promotor de caseína en animales que cuando se incorpora transgénicamente en un animal permite que la hembra produzca la proteína recombinante deseada en su leche. En un aspecto adicional de la invención se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo dicho procedimiento comprende la etapa de cultivo de una célula huésped transformada o transfectada con un vector que codifica la cadena ligera y/o pesada del anticuerpo de la ¡nvención y recuperando por lo tanto el anticuerpo.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento de producción de un anticuerpo anti-NOGO que específicamente se une a y neutraliza la actividad de NOGO-A humano dicho procedimiento comprende las etapas de: (a) proporcionar un primer vector que codifica una cadena pesada del anticuerpo; (b) proporcionar un segundo vector que codifica ia cadena ligera del anticuerpo; (c) transformar una célula huésped de mam ífero (por ejemplo, CHO) con dichos primer y segundo vector; (d) cultivar la célula huésped de la etapa (c) en condiciones que conducen a la secreción del anticuerpo a partir de dicha célula huésped en dichos medios de cultivos; (e) recuperar el anticuerpo secretado de la etapa (d). Una vez expresado mediante el procedimiento deseado, el anticuerpo después se examina para evaluar la actividad in vitro mediante el uso de un ensayo apropiado. En la actualidad se emplean formatos de ensayo de ELISA convencionales para determinar la unión cualitativa y cuantitativa del anticuerpo para NOGO. Adicionalmente, también se pueden usar otros ensayos in vitro para verificar la eficacia de neutralización antes de los posteriores estudios clínicos humanos para evaluar la persistencia del anticuerpo en el cuerpo a pesar de los mecanismos de eliminación usuales. Los agentes terapéuticos de esta invención se pueden administrar como un profiláctico o después del episodio de trastorno cerebrovascular/establecimiento de síntomas clínicos, o como se necesite de otra manera. La dosis y duración de tratamiento se refiere a la duración relativa de las moléculas de la presente invención en la circulación humana, y la pueden ajustar los expertos en la materia dependiendo de la afección que se está tratando y la salud general del paciente. Se contempla que se puede requerir dosificación repetida (por ejemplo, una vez a la semana o una vez cada dos semanas) durante un período amplio de tiempo (por ejemplo, cuatro a seis meses) para lograr la máxima eficacia terapéutica. El procedimiento de administración del agente terapéutico de la invención puede ser cualquier vía adecuada que distribuya el agente al huésped. Los antagonistas y anticuerpos, y las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente útiles para la administración parenteral, es decir, por vía subcutánea, intratecal, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, o intranasal, de las cuales se prefiere particularmente la intravenosa. Los agentes terapéuticos de la invención se pueden preparar como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del antagonista o anticuerpo de la ¡nvención como ingrediente activo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En el agente profiláctico de la ¡nvención, se prefiere una suspensión o solución acuosa que contiene el anticuerpo diseñado por ingeniería genética, preferentemente tamponado a un pH fisiológico, en una forma lista para inyección. Las composiciones para la administración parenteral comprenderán comúnmente una solución del antagonista o anticuerpo de la invención o un cóctel de los mismos disueltos en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente un vehículo acuoso. Se puede emplear una diversidad de vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina al 90%, glicina al 0,3%, y similares. Estas soluciones son estériles y en general exentas de materia particulado. Estas soluciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requieran para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como ajuste agentes de pH y de tamponación, etc. La concentración del antagonista o anticuerpo de la invención en tal formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, entre menos de aproximadamente 0,5%, usualmente a o al menos aproximadamente 1 % hasta como mucho 15 ó 20% en peso y se seleccionará principalmente basándose en volúmenes de fluido, viscosidades, etc. , según el modo particular de administración seleccionado. De esta manera, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular se podría preparar para que contenga 1 ml de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 100 mg, por ejemplo, entre aproximadamente 50 ng y aproximadamente 30 mg o más preferentemente, entre aproximadamente 5 mg y aproximadamente 25 mg, de un antagonista o anticuerpo de la invención. De manera similar, una composición farmacéutica de la invención para infusión intravenosa se podría preparar para que contenga aproximadamente 250 ml de solución Ringer estéril, y aproximadamente entre 1 y 30 y preferentemente entre 5 mg y aproximadamente 25 mg de un anticuerpo diseñado por ingeniería genética de la invención. Los procedimientos reales para preparar composiciones administrables por vía parenteral se conocen bien o serán evidentes para los expertos en la materia y se describen en más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Science, 15a ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pensilvana. Para la preparación de formulaciones de anticuerpos administrables por vía intravenosa de la invención véase Lasmar U y Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci. Tech. today, páginas 129-1 37, Vol.3 (3 de abril 2000), Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A y B ed Ahern T.J. , Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992), Akers. M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K y col., "Effects of types of sugar on stabilization of Protein ¡n the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274, Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1 033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922. Ha, E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J . Pharm Sci, 91 , 2252-2264, (2002) los contenidos enteros de los cuales se incorporan en la presente como referencia y a las que el lector se refiere específicamente. Se prefiere que el agente terapéutico de la invención, en una preparación farmacéutica, esté presente en formas de dosificación unitaria. La dosis terapéuticamente eficaz apropiada la pueden determinar los expertos en la materia. Para tratar eficazmente el trastorno cerebrovascular y otras enfermedades neurológicas en un ser humano, una dosis de hasta 700 mg por 70 kg de peso corporal de un antagonista o anticuerpo de esta invención se debe administrar por vía parenteral, preferentemente i. v. o i. m. (vía intramuscular). Tal dosis puede, si es necesario, repetirse a intervalos de tiempo apropiados seleccionados apropiadamente por un médico. Como se describe en los ejemplos, los presentes inventores han sido capaces de demostrar un efecto positivo sobre la recuperación funcional en el modelo de ratas cuando los anticuerpos de la invención se administraron por vía intravenosa. Los anticuerpos descritos en la presente se pueden liofilizar para almacenamiento y reconstituirse en un vehículo adecuado antes de uso. Esta técnica se ha mostrado que es eficaz las inmunoglobulinas convencionales y se pueden emplear técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. Los anticuerpos de la invención también se pueden usar en combinación (por ejemplo, simultáneamente, secuencialmente o separadamente) con un factor neurotrófico tal como factor de crecimiento neural, por ejemplo factor neurotrófico derivados del cerebro (BDNF), agentes antiinflamatorios tales como corticosteroides y/o tPA. Las combinaciones de un anticuerpo NOGO de la ¡nvención y por ejemplo, tPA se pueden determinar en el modelo MCAO expuesto en los ejemplos más adelante. En otro aspecto, la ¡nvención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-NOGO de la presente invención o un fragmento funcional del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable para el tratamiento o profilaxis de trastorno cerebrovascular y otras enfermedades neurológicas. En todavía otro aspecto, la ¡nvención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-NOGO de la presente ¡nvención y un fragmento funcional del mismo para inhibir la neurodegeneración y/o promoción de la recuperación funcional en un paciente humano que sufre, o en riesgo de desarrollar, un trastorno cerebrovascular u otra enfermedad neurológica. La invención además proporciona un procedimiento de tratamiento o profilaxis de trastorno cerebrovascular (particularmente trastorno cerebrovascular isquémico) y otras enfermedades/trastornos neurológicos, en particular enfermedad de Alzheimer, en un ser humano que comprende la administración a dicho ser humano en necesidad del mismo de una cantidad de anticuerpo anti-NOGO o un fragmento funcional del mismo. Los anticuerpos de la invención se pueden usar en procedimientos de tratamiento para reducir o detener la progresión y/o aparición de la enfermedad de Alzheimer además de (o como alternativa para) tratar la enfermedad establecida en un paciente humano. Además la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-NOGO, o un fragmento funcional del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de trastorno cerebrovascular y otras enfermedades/trastornos neurológicos, en particular enfermedad de Alzheimer. La invención también proporciona un procedimiento de inhibición de la neurodegeneración y/o promoción de la recuperación funcional en un paciente humano que sufre, o en riesgo de desarrollar, un trastorno cerebrovascular u otra enfermedad/trastorno neurológico, en particular enfermedad de Alzheimer, que comprende la administración a dicho ser humano en necesidad del mismo de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NOGO o un fragmento funcional del mismo. Además la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-NOGO, o un fragmento funcional del mismo, en la preparación de un medicamento para inhibir la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un paciente humano aquejado de, o en riesgo de desarrollar, un trastorno cerebrovascular y otra enfermedad/trastorno neurológico, en particular enfermedad de Alzheimer. La invención además proporciona un procedimiento de tratamiento o de profilaxis de trastorno cerebrovascuiar u otra enfermedad/trastorno neurológico, en particular enfermedad de Alzheimer, en un ser humano que comprende la etapa de administración parenteral de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-NOGO. Preferentemente el anticuerpo anti-NOGO se administra por vía intravenosa. Las enfermedades neurológicas o trastornos como se han usado anteriormente en la presente incluye, pero sin limitación, lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal demencias fronto-temporales (tautopatías) neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y en particular enfermedad de Alzheimer. La invención también proporciona un procedimiento de promoción del rebrote axonal que comprende la etapa de poner en contacto un axón humano con un anticuerpo anti-NOGO. Este procedimiento se puede realizar in vitro o in vivo, preferentemente el procedimiento se realiza in vivo. En un aspecto adicional por lo tanto se proporciona el uso de un anticuerpo anti-NOGO o un fragmento funcional del mismo de la invención que comprende las CDRs de la tabla 1 y 2; las CDRs de la tabla 3 y 4; o las CDRs de la tabla 5 y 6 en forma administrable por vía intravenosa en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastorno cerebrovascular (particularmente trastorno cerebrovascular isquémico), lesión cerebral, lesión de la médula espinal, demencia fronto-temporal (tautopatías), neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y en particular enfermedad de Alzheimer en un paciente humano. En un aspecto adicional por lo tanto se proporciona un procedimiento de tratamiento de trastorno cerebrovascular (particularmente trastorno cerebrovascular isquémico), lesión cerebral, lesión de la médula espinal, demencia fronto-temporal (tautopatías), neuropatía periférica, Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y en particular enfermedad de Alzheimer en un paciente humano, dicho procedimiento comprende la administración por vía intravenosa de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-NOGO de la invención. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento de promoción del rebrote de neuronas dentro del sistema nervioso central de un sujeto humano (por ejemplo un paciente) dicho procedimiento comprende la administración (por ejemplo la administración por vía intravenosa) de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-NOGO que comprende las CDRs como se ha expuesto en la presente). En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona el uso de un anticuerpo anti-NOGO (por ejemplo, un anticuerpo anti-NOGO que comprende las CDRs expuestas en la presente) en la fabricación de un medicamento administrable por vía intravenosa para el tratamiento de accidente cerebro vascular (particularmente trastorno cerebrovascular isquémico), lesión cerebral, lesión de la médula espinal, demencia fronto-temporal (tautopatías), neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y en particular enfermedad de Alzheimer en un paciente humano. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un procedimiento para regenerar los procesamientos de axones en las neuronas del sistema nervioso central en un paciente humano aquejado de (o susceptible a) trastorno cerebrovascular (particularmente trastorno cerebrovascular isquémico), lesión cerebral, lesión de la médula espinal, demencia fronto-temporal (tautopatías), neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple y en particular enfermedad de Alzheimer dicho procedimiento comprende la etapa de administrar (por ejemplo, por vía intravenosa) una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-NOGO (por ejemplo, un anticuerpo anti-NOGO que tiene las CDRs expuestas en la presente). En un aspecto adicional de la invención se proporciona el uso de un anticuerpo anti-NOGO (por ejemplo, un anticuerpo anti-NOGO que comprende las CDRs expuestas en la presente) en la fabricación de una composición farmacéutica para regenerar los procesamientos de axones en neuronas del sistema nervioso central en un paciente aquejado de (o susceptible) de trastorno cerebrovascular (particularmente trastorno cerebrovascular isquémico), lesión cerebral, lesión de la médula espinal, demencia fronto-temporal (tautopatías), neuropatía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y en particular enfermedad de Alzheimer.

En un aspecto adicional de la invención se proporciona un procedimiento de modulación de la producción de un péptido amiloidogénico que comprende poner en contacto una célula que expresa el precursor a partir del que se deriva el péptido amiloidogénico y un polipéptido NOGO (por ejemplo NOGO-A humano) con un anticuerpo anti-NOGO (por ejemplo, un anticuerpo anti-NOGO que comprende las CDRs expuestas en la presente, particularmente 2A10 y versiones totalmente humanas o humanizadas de los mismos). En las modalidades típicas, el precursor es APP. En las modalidades típicas adicionales el péptido amiloidogénico es Aß, lo más preferentemente Aß40, Aß42 o una combinación de ambos. Como se usa en la presente, la expresión "recuperación funcional" se refiere a una mejora motora y/o sensorial y/o conductual en un sujeto después de, por ejemplo, un episodio isquémico o lesión o aparición de síntomas clínicos. La recuperación funcional en seres humanos se puede evaluar mediante instrumentos diseñados para medir las funciones elementales neurológicas tales como resistencia, sensación y coordinación motora, funciones cognitivas tales como memoria, leguaje y la capacidad de seguir instrucciones, y las capacidades funcionales tales como actividades básicas de la vida diaria o actividades instrumentales. La recuperación de la función neurológica elemental se puede medir con instrumentos tales como la escala de trastorno cerebrovascular del NIH (NI HSS), recuperación de la función cognitiva se puede medir con ensayos neuropsicológicos tales como ensayo de denominación de Boston Naming, ensayos del trazo, y ensayo de aprendizaje verbal de California, y actividades de la vida diaria se pueden medir con instrumentos tales como la escala ADCS/ADL (estudios clínicos de la enfermedad de Alzheimer/actividades de la vida diaria) o ias actividades de Bristol de la escala de la vida diaria, todos los ensayos y escalas se conocen en la técnica. Los siguientes ejemplos ¡lustran pero no limitan la invención.

Ejemplificación Ejemplo 1 -Preparación y selección de los hibridomas Los anticuerpos monoclonales anti-NOGO se producen mediante células de hibridoma, el resultado de la fusión de células de mieloma de ratón con linfocitos B de ratones inmunizados con el antígeno diana. La célula de hibridoma se inmortaliza mediante el agente de fusión de mieloma aunque la capacidad de producir anticuerpos se proporciona por el linfocito B. Cada célula de hibridoma produce solamente un anticuerpo individual especificidad única, por lo tanto, el término monoclonal. Ratones SLJ se inmunizaron con 10 µg de de proteína total (1 : 1 , ayuste NOGO-A humano (aminoácidos 186 a 1004) y ayuste NOGO-A de rata (aminoácidos 173-975), producidos como proteínas de fusión GST en E. coli BL31 ) usando adyuvantes tanto CFA como RI BI por vía subcutánea. Después los ratones se reinmunizaron con 5 µg de de las mismas proteínas usando adyuvante RIBI después de 4 y 8 días. Después de 3 días adicionales, se recogieron células inmunes a partir del drenaje local de ganglios linfáticos y condensados con células de mieloma de ratón usando PEG 1500 para generar hibridomas. Las líneas celulares individuales de células de hibridoma se clonaron mediante dos rondas de dilución limitante. Inmunizando los ratones con NOGO-A humano y de rata, se pueden inducir anticuerpos para que tengan buena especificidad de unión y/o afinidad de unión para NOGO-A tanto de rata como humano. Esto a su vez permite la evaluación de tales anticuerpos en modelos de rata y/o de roedores antes de la administración a un ser humano. La selección inicial de anticuerpos de hibridomas fue basándose en la unión directa a la (s) proteína (s) NOGO sobre placas de microtitulación. Posteriormente se seleccionaron aproximadamente 60 hibridomas basándose en la capacidad de proteína soluble (constituida por una secuencia de NOGO-A humano escindida del resto GST usando la proteasa Precission ™) para competir para esta actividad de unión en ensayos ELISA.

Ejemplo 2-Clonación de las regiones variables Se extrajo ARN total de las células de hibridomas 2A10/3, 2C4/1 y 15C3/3 seguido de transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) para extraer la secuencia de cADN del dominio variable pesado y ligero. El cebador delantero para la RT-PCR era una mezcla de cebadores degenerados específicos para las secuencias guías de los genes de inmunoglobulina murina y el cebador inverso era un anticuerpo específico de isotipo dirigido a las regiones constantes. Los cebadores de la PCR se diseñaron para llevar los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción para permitir la clonación en pUC19 para la secuenciación de ADN. Extracción de ARN Se extrajo ARN total a partir de sedimentos de 106 células de cada clon de hibridoma usando el sistema de aislamiento de ARN total SV de Promega según las instrucciones del fabricante.

Transcripción inversa El ARN se transcribió de manera inversa para producir cADN de los dominios variables pesados y ligeros usando cebadores delanteros específicos para las secuencias guías murinas y cebadores inversos para las regiones constantes de lgG?. El cebador inverso IgGyl se usó para los hibridomas 2C4/1 y 15C3/3; y el lgG?2b para 2A10/3. Los cebadores delanteros llevan un sitio de reconocimiento de las enzimas de restricción Salí en el extremo 5', con cuatro nucleótidos extra añadidos en 5' a éste para la eficaz digestión de restricción. Estos cebadores se adaptaron a partir de Jones ST y Bendig MM 1991 (Biotechnology 9, 88-89). Los cebadores inversos llevan un sitio de reconocimiento de las enzimas de restricción Xmal adicional y cuatro nucleótidos extra en los extremos 5'.

Cebadores Cebadores delanteros de las secuencias guías VH de tipo murino: AG77: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA ATG CAG CTG GGT CAT STT CTT C-3' (SEC ID No: 51) AG78: 5'-ACT AGT CGA CAT GGG ATG GAG CTR TAT CAT SYT CTT-3' (SEC ID No: 52) AG79: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA GWT GTG GTT AAA CTG GGT TTT T-3' (SEC ID No: 53) AG80: 5'-ACT AGT CGA CAT GRA CTT TGG GYT CAG CTT GRT TT-3" (SEQ. I.D.NO:54) AG81 : 5'-ACT AGT CGA CAT GGA CTC CAG GCT CAA TTT AGT TTT CCT T-3' (SEC ID No: 55) AG82: 5'-ACT AGT CGA CAT GGC TGT CYT RGS GCT RCT CTT CTG C-3' (SEC ID No: 56) AG83: 5'-ACT AGT CGA CAT GGR ATG GAG CKG GRT CTT TMT CTT-3' (SEC ID No: 57) AG84: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG AGT GCT GAT TCT TTT GTG-3' (SEC ID No: 58) AG85: 5'-ACT AGT CGA CAT GGM TTG GGT GTG GAM CTT GCT ATT CCT G- 3' (SEC ID No: 59) AG86: 5'-ACT AGT CGA CAT GGG CAG ACT TAC ATT CTC ATT CCT G-3' SEC ID No: 60) AG87: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA TTT TGG GCT GAT TTT TTT TAT TG-3' (SEC ID No: 61 ) AG89: 5'-ACT AGT CGA CAT GAT GGT GTT AAG TCT TCT GTA CCT G-3' (SEC ID No: 62) Cebadores delanteros de las secuencias guías VL de tipo murino: AG90: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA GTT GCC TGT TAG GCT GTT GGT GCT G-3' (SEC ID No: 63) AG91 : 5'-ACT AGT CGA CAT GGA GWC AGA CAC ACT CCT GYT ATG GGT-3' (SEC ID No: 64) AG92: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG TGT GCT CAC TCA GGT CCT GGC GTT G-3' (SEC ID No: 65) AG93: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG GRC CCC TGC TCA GWT TYT TGG MWT CTT G-3' (SEC ID No: 66) AG94: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C-3' (SEC ID No: 67) AG95: 5'-ACT AGT CGA CAT GAG GTK CYY TGY TSA GYT YCT GRG G-3' (SEC ID No: 68) AG96: 5'-ACT AGT CGA CAT GGG CWT CAA GAT GGA GTC ACÁ KWY YCW GG-3' (SEC ID No: 69) AG97: 5'-ACT AGT CGA CAT GTG GGG AYC TKT TTY CMM TTT TTC AAT TG-3" (SEC ID No: 70) AG98: 5'-ACT AGT CGA CAT GGT RTC CWC ASC TCA GTT CCT TG- 3' (SEC ID No: 71 ) AG99: 5'-ACT AGT CGA CAT GTA TAT ATG TTT GTT GTC TAT TTC T-3" (SEC ID No: 72) AG 100: 5'-ACT AGT CGA CAT GGA AGC CCC AGC TCA GCT TCT CTT CC-3' (SEC ID No: 73) MKV12: 5'-ACT AGT CGA CAT GAA GTT TCC TTC TCA ACT TCT GCT C-3' (SEC ID No: 74) Cebador inverso de la región constante y1 de tipo murino: AG102: 5'-GGA TCC CGG GCC AGT GGA TAG ACÁ GAT G-3' (SEQ. I .D.NO:75) Cebador inverso de la región constante y2b de tipo murino: AG 104: 5'-GGA TCC CGG GAG TGG ATA GAC TGA TGG-3' (SEQ. I.D.NO:76) Cebador inverso de la región constante K de tipo murino: AG101: 5'-GGA TCC CGG GTG GAT GGT GGG AAG ATG-3' (SEQ.I.D.NO:77) Conjuntos de cebadores delanteros de las secuencias guías VH O VL se prepararon a 50µM. Las soluciones de los cebadores inversos de las regiones constantes y o K también se prepararon a 50µM.

Transcriptasa inversa PCR (RT-PCR). La transcripción inversa del ARN que codifica las regiones variables pesadas y ligeras se llevaron a cabo por duplicado usando el sistema Access RT-PCR de Promega según las instrucciones del fabricante. Aproximadamente 200 ng de ARN se incluyó en 50 µl de reacción que contenía tampón RT-PCR suministrado, dNTPs 0,2 mM, 1 µM de cada conjunto de cebadores, MgS04 1 µM y 5U de cada una de las AMV transcriptasa inversa y Tfl ADN polimerasa. Ciclo RT-PCR: 1 -48°C durante 45 min 2-94°C durante 2 min 3-94°C durante 30 seg 4-50°C durante 1 min 5-68°C durante 2 min 6-68°C durante 7 min etapas 3 a 5: repetidas 30 veces.

Clonación de pUC 19 Los productos de RT-PCR de las regiones variables se purificaron usando el kit de Qiagen MinElute Qiagen PCR Purifcation kít según sus instrucciones y se digirieron secuencialmente con Xmal y Salí de New England Biolabs según las instrucciones del fabricante.

Después se cargaron sobre un gel de agarosa al 1 % preparativo conteniendo bromuro de etidio al 0,5% y se desarrollaron en tampón TAE a 50 mA durante 1 hora y las bandas de la región V se cortaron bajo luz ultravioleta. Los fragmentos de ADN se purificaron a partir del gel usando el kit de extracción MinElute Gel de Qiagen según las instrucciones del fabricante. Los brazos del vector pUC19 se prepararon digiriendo pUC19 con Salí y Xmal , después se purificaron usando el kit MinElute Reaction Clean up de Qiagen y se desfosforilaron usando la fosfatasa alcalina de Shrimp (USB) según las instrucciones de los fabricantes. La concentración de los brazos del vector y los fragmentos de la región V se estimó a partir de un gel de agarosa al 1 %/bromuro de etidio, se mezclaron a una relación molar de 1 :2 y se ligaron usando el kit Promega's Quick Ligation según las instrucciones del fabricante. Los plásmidos ligados se transformaron en células DH5a (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las colonias que se crecieron sobre placas de L-agar conteniendo 100 µg/ml de ampicilina se seleccionaron para análisis de secuencias de ADN.

Secuenciación de las regiones variables Las colonias se cultivaron durante toda una noche a 37oC en 5 ml de medio LB suplementado con 100 µg/ml de ampicilina y el ASDN de plásmido se extrajo y se purificó usando el kit Qiagen QlAprep Spin Miniprep según las instrucciones del fabricante. El ADN de las regiones VH y VL se secuenció usando cebadores delanteros e inversos M13 habituales. Los resultados se la determinación de la secuenciación se muestran en las SEC ID números 43 a 48.

Ejemplo 3-Antíqenos anti-NOGO recombinantes Los anticuerpos recombinantes que tienen las regiones constantes 2a/k se podrían purificar a partir de células transfectadas con plásmidos que comprenden las regiones variables ligeras y pesadas clonadas en los segmentos génicos de la región constante lgG2a/k de ratón. Las regiones V murinas clonadas se amplificaron mediante OCR para introducir los sitios de restricción requeridos para la clonación en vectores de expresión de mamíferos Rld y Rln. Los sitios Hind l ll y Spe I se diseñaron en fase con el dominio VH para permitir la clonación en un vector Rld conteniendo la región constante ?2a de ratón. Los sitios Hind lll y BsiW I se diseñaron en fase con el dominio VL y se permitió la clonación en un vector Rln modificado conteniendo la región constante K de ratón. Cebadores de la PCR Cebador delantero 2A1 0 de VH: d'-ACTCATAAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTT TTTGGTAG -3' (SEC ID No: 78) Cebador inverso de VH: 5'-ACTATGACTAGTGTGCCTTGGCCCCAGTAG-3' (SEQ. I. D. NO.79) Cebador delantero de VL: 5'- ACTCATAAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTG-3' (SEC ID No: 80) Cebador inverso de Vi : 5'- ACTATGCGTACGTTTCAGCTCCAGCTTGG -3' (SEC ID No: 81 ) La PCR se realizó usando Hercules (Stratagene) según las instrucciones del fabricante en 50 µl de volumen conteniendo aproximadamente 1 0 ng de la miniprep. de pUC19 conteniendo la región V-, DMSO al 2%, dNTPs 400 µM, 1 µM de cada cebador y tampón suministrado. La PCR se llevó a cabo como sigue 1 -95 °C 2 mins, 2-95°C 1 min, 3-56 °C 1 min, 4-72°C 1 min. Etapas 2-4 30 ciclos.

Clonación en los vectores de expresión Los vectores de la PCR se purificaron usando el kit MinElute PCR Purification Qiagen según las instrucciones de los fabricantes. El producto de la PCR de VH y el vector de expresión de mamífero Rld (lgG2a) se digirieron con Hind lll-Spe I . El producto de la PCR de V y el vector de expresión de mamífero Rln (k) se digirieron con Hind 111-BsiW I (NEB) según las instrucciones del fabricante. Los vectores se ligaron a inserciones en una relación molar 1 :2 usando el kit Promega Quick Ligation. Las mezclas de ligación transfectaron en células DHda y las colonias que se desarrollaron tras selección en ampicilina se crecieron y se enviaron para verificar la secuencia de ADN.

Secuenciación de anticuerpo 2A10/3 anti-NOGO La secuencia de la cadena pesada de 2A10 entre los sitios de clonación Hindlll y EcoRI se determinó que era: AAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAGC AGCTACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAAC TGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTAC ACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGG CCTTGAGTGGATTGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACA ATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGC ACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTA TTATTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAAGGCACACTAGTCACCG TCTCCTCAGCCAAAACAACAGCCCCATCGGTCTATCCACTGGCCCCTGTG TGTGGAGATACAACTGGCTCCTCGGTGACTCTAGGATGCCTGGTCAAGGG TTATTTCCCTGAGCCAGTGACCTTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCA GTGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACCCTC AGCAGCTCAGTGACTGTAACCTCGAGCACCTGGCCCAGCCAGTCCATCAC CTGCAATGTGGCCCACCCGGCAAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTG AGCCCAGAGGGCCCACAATCAAGCCCTGTCCTCCATGCAAATGCCCAGCA CCTAACCTCCTGGGTGGCCCATCCGTCTTCATCTTCCCTCCAAAGATCAA GGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATAGTCACATGTGTGGTGGTGG ATGTGAGCGAGGATGACCCAGATGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAAC GTGGAAGTACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAG TACTCTCCGGGTGGTCAGTGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGA GTGGCAAGGAGTTCAAATGCAAGGTCAACAACAAAGACCTCCCAGCGCCC ATCGAGAGAACCATCTCAAAACCCAAAGGGTCAGTAAGAGCTCCACAG GT ATATGTCTTGCCTCCACCAGAAGAAGAGATGACTAAGAAACAGGTCACTC TGACCTGCATGGTCACAGACTTCATGCCTGAAGACATTTACGTGGAGTGG ACCAACAACGGGAAAACAGAGCTAAACTACAAGAACACTGAACCAGTCCT GGACTCTGATGGTTCTTACTTCATGTACAGCAAGCTGAGAGTGGAAAAGA AGAACTGGGTGGAAAGAAATAGCTACTCCTGTTCAGTGGTCCACGAGGGT CTGCACAATCACCACACGACTAAGAGCTTCTCCCGGACTCCGGGTAAATG AGAATTC (SEC ID No: 49) La secuencia de la cadena ligera de 2A1 0 entre los sitios de clonación H indi 11 y EcoRI se determinó que era: AAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTT CTGGATCTCTGGAGTCAGTGGGGATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCT CCAATCCTGTCACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGT AAGAGTCTCCTATATAAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCA GAGACCAGGACAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTG CATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAGTGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTC ACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGAGGATGTGGGTGTGTATTACTG TCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGG AGCTGAAACGTACGGATGCTGCACCGACTGTATCCATCTTCCCACCATCC AGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAA CTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAAC GACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGC ACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACG ACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCA TTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAAGAATTC (SEC I D No: 60) Una quimera de 2A10 también se construyó como se menciona en la presente como HcLc.

Ejemplo 4 - Anticuerpo anti-NOGO de ratón se une to NOGO GST-humano NOGO-A66 a d µg/ml en dOmM Tris pH 9,5 se recubrió en placas Nunc Immunosorp (100 µl por pocilio) a 4 °C durante toda una noche. Los pocilios se enjuagaron una vez con PBS después se incubaron con BSA al 1 % en PBS para bloquear los sitios de unión no específica a temperatura ambiente durante 1 hora. Los anticuerpos se diluyeron en PBS hasta 2 µg/ml y se realizaron diluciones 1 /3 a partir de esto. Los anticuerpos se añadieron a los pocilios por triplicado y se incubaron a 4oC durante toda una noche. Los pocilios se lavaron tres veces con PBS después se incubaron con anti-ratón-HRP (1 : 1000) durante 1 hora. Se lavaron cinco veces con PBS y después se incubaron con 100 µl de sustrato de TMB (Sigma) por pocilio durante 10 minutos. La reacción coloreada se detuvo mediante la adición de 160 µl de HCl concentrado. Se midió la densidad óptica a 460 nm usando un lector de placas. Se sustrajeron los valores de fondo leídos de los pocilios sin anticuerpo. La Figura 8 muestra la unión dependiente de la dosis de los tres anticuerpos monoclonales anti-NOGO-A, 2A10, 2C4 y 16C3, a NOGO-A56 humano en un ensayo ELISA. El eje Y muestra la densidad óptica medida (DO) a 450 nm, una medición cuantitativa de anticuerpo capturado en los pocilios. El eje X muestra la concentración de anticuerpo usado (ng/ml) por pocilio a cada punto de entrada de datos. El anticuerpo 2A10 muestra la señal más alta a un intervalo de concentraciones sugerentes de una afinidad más alta para el NOGO-A humano.

Ejemplo 5 - Producción de fragmento NOGO-A inhibidor (NOGO-A56. SEC ID No: 87) Una secuencia de cADN que codifica los aminoácidos 586-785 (MQESLYPAAQLCPSFEESEATPSPVLPDIVMEAPLNSAVPSAGASVIQP SSSPLEASSVNYESIKHEPENPPPYEEAMSVSLKKVSG IKEEIKEPENINA ALQETEAPYISIACDLIKETKLSAEPAPDFSDYSEMAKVEQPVPDHSELVE DSSPDSEPVDLFSDDSIPDVPQKQDETVMLVKESLTETSFESMIEYENKE - SEC ID No: 87) de NOGO-A humano se clonó en los sitios BamHi-Xhol de pGEX-6P1 para generar una proteína de fusión dirigida por GST denominada NOGO-A56. El plásmido se expresó en células BL21 en medio 2XTY con 100 µg/ml de ampicilina después de la inducción con I PTG a 0,6 mM a 37oC durante 3 horas. Los sedimentos celulares se lisaron mediante sonicación y la proteína de d fusión se purificó usando Glutatión-sefarosa (Amersham Pharmacia) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. La proteína purificada se eluyó usando glutatión reducido y se dializó de manera extensiva contra PBS, se cuantificó usando patrones de BSA y un ensayo de proteínas a base de BioRad coomassie y después se almacenó en 0 alícuotas a -80oC. De esta manera la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a NOGO-A, particularmente NOGO-A humano en el que dicho anticuerpo o fragmento funcional del mismo neutraliza la actividad de una proteína NOGO que comprende el polipéptido codificado por la SEC ID No: 87 d en el que dicho anticuerpo se une a la SEC ID No: 87 de dicha proteína. En las formas típicas, los anticuerpos de la invención se unen entre los aminoácidos 586-785 de NOGO-A humano y neutraliza la actividad de NOGO-A. 0 Ejemplo 6 - Ensayo de crecimiento de neuritas Solamente GST o las proteínas de fusión GST-NOGOA56 se congelaron en hielo y se diluyeron en 0,5 x de cultivo de tejidos de calidad PBS a 3 pmol/µl. Las manchas de 5 µl se secaron en el centro de cada pocilio de placas de 96 pocilios recubiertos con BD- Biocoat poli-d-lisina en la vitrina de cultivo de tejidos. Una vez secos, los anticuerpos purificados, los sobrenadantes de cultivos de tejidos reacondicionados o los compuestos se diluyeron en HBSS (Life Technologies) y 50 µl se aplicaron a los pocilios en réplicas de entre 4 y 8 pocilios. Los pocilios de control de GST solo y GST-NOGO-A56 se trataron con HBSS sin suplementos. Después de 2 horas de tratamiento previo a 37oC las neuronas de los granulos cerebelares purificados, disociados de los cerebros de ratas de 8 días después del nacimiento se añadieron a 20-40.000 neuronal por pocilio en un volumen de 100 µl y se incubaron a 37oC durante 24 horas. Los cultivos se fijaron usando paraformaldehído al 4%/scarosa al 10% en PBS durante 1 hora después la neuritas se tiñeron usando un anticuerpo policlonal anti-beta-l l l-tubulina. El crecimiento de neuritas se cuantificó usando captura de imagen automática y análisis en el sistema Cellomics Arrayscan. Los resultados se muestran en las Figuras 1 a 6. La Figura 1 muestra el efecto inhibidor de NOGO-A56 sobre el crecimiento de neuritas comparado con el GST proteico de control solo. Las Figuras 2 a d muestran la identificación de la función bloqueante de los anticuerpos 2A10/3, 2C4/1 y 16C3/3 anti-NOGO junto con una función no bloqueante del anticuerpo de control 12G3. El anticuerpo 12G3 se une a NOG066 pero no inhibe la actividad de crecimiento de neuritas. Los gráficos muestran la longitud media de neuritas en los cultivos expuestos a anticuerpos no purificados (en sobrenadantes), Los datos muestran el efecto bloqueante de 2A10/3, 2C4/1 y 15C3/3 de la actividad inhibidora de crecimiento de neuritas de NOGO-56. El control es GST solo. La Figura 6 muestra el bloqueo del efecto inhibidor de crecimiento de neuritas de NOGO-A66 por 2A10/3 purificado, Ejemplo 7-IN-1 no tiene actividad blogueante contra NOGO humano El ensayo de crecimiento de neuritas como se describe en el ejemplo d, cuando se lleva a cabo con el anticuerpo IN-1 , muestra que IN-1 no bloquea la actividad inhibidora de NOGO-A humano (Figura 7).

Ejemplo 8-Humanización de 2A1 0 Las construcciones de VH y VL humanizadas se prepararon de novo mediante la construcción de oligonucleótidos de solapamiento incluyendo sitios de restricción para clonar en los vectores de expresión de mamíferos Rld y Rln así como una secuencia señal humana. Los sitios de restricción Hind l l l y Spe I se introdujeron para componer el dominio VH conteniendo la secuencia señal CAMPATH-1 H para la clonación en Rld conteniendo la región constante mutada ?1 .

Los sitios de restricción Hind l l l y BsiW I se introdujeron para componer el dominio VL conteniendo la secuencia señal CAMPATH-1 H para la clonación en Rln conteniendo la región constante kappa humana. Secuencia señal CAMPATH-1 H: MGWSCI ILFLVATATGVHS (SEC ID No: 82) Cadena pesada Se identificó una secuencia de línea germinal humana con 66%o de identidad con la secuencia de aminoácidos 2A1 0 de VH. Se seleccionó para humanización la secuencia Estructura de U84162: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEW MGI INPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYC ARGQWLVILNFDYWGQGTLVTVSS (SEC ID No: 83). La presente invención por lo tanto proporciona el uso de la SEC ID No: 83 (o un Estructura con menos de 10 diferencias de aminoácidos con la SEC I D No: 83 por ejemplo, menos de 8 diferencias de aminoácidos, preferentemente menos de 6 diferencias de aminoácidos, más preferentemente menos de 4 diferencias de aminoácidos por ejemplo, 1 ó 2 diferencia (s) de aminoácidos) en la producción de un anticuerpo anti-NOGO humanizado (particularmente un anticuerpo anti-NOGO que se une a NOGO-A humano y comprende las CDRs expuestas en la tabla 2 y/o se une al epítope expuesto anteriormente) Las posiciones 93 y 94 se identificaron como residuos potencialmente importantes en el mantenimiento de conformación de las CDRs. Posición (No Kabat) 2A10 VH U84162 93-94 EL AR Se indicó que el motivo EL en estas posiciones son inusuales. Se diseñó la siguiente construcción humanizada: Construcción H 1 de VH humanizada: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMHWVRQAPGQGLEW MGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYC ELGQGYWGQGTTVTVSS (SEC ID No: 84).

Cadena ligera Se identificaron unas secuencias de línea germinal humana con 66% de identidad con la secuencia de aminoácidos de 2A10 de VL. Se seleccionó para humanización la secuencia marco conservada de CAA85593: Estructura: CAA85693 DIVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQGLVYSDGDTYLNWFQQRPGQSP RRLIYKVSNRDSGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGTH WPYTFGQGTKLEIK (SEC ID No: 85). De esta manera, la presente invención proporciona el uso de la SEC ID No: 85 (o un Estructura con menos de 8 diferencias de aminoácidos por ejemplo, 6 diferencias de aminoácidos, preferentemente menos de 4 diferencias de aminoácidos, por ejemplo, 1 ó 2 diferencia (s) de aminoácidos) en la producción de un anticuerpo anti-NOGO humanizado dicho anticuerpo humanizado se une a NOGO-A (particularmente un anticuerpo que comprende la cadena ligera de una o más (por ejemplo todas) las CDRs expuestas en la tabla 1 anterior y/o se une al epítope de NOGO-A expuesto anteriormente) y neutraliza la actividad de NOGO- A, particularmente NOGO-A humano. Los siguientes residuos Estructuras se identificaron como potencialmente importantes en la afinidad de recuperación: Posición (No Kabat) 2A10 VL AAK9481 1 4 I M 45 R Q 46 R L Se diseñó una construcción de V humanizada: Construcción Molde Estructura Ami noácido posición (No Kabat) humano ratón L1 1 5693 4 M I 46 R Q 46 R L Construcción L1 1 de VL humanizada: DIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNWFQQRPGQSPQ LLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQLVEY PLTFGQGTKLEIK (SEC ID No: 86) Los plásmidos que codifican las SEC ID No: 84 y 86 se co-transfectaron transitoriamente en células y se expresaron a pequeña escala para producir el anticuerpo A1 L1 1 . Los plásmidos que codifican las SEC ID No: 92 y 86 también se pueden co-transfectar transitoriamente en células CHO y se expresan a pequeña escala para producir el anticuerpo H7L1 1 .

De esta manera la invención proporciona un anticuerpo humanizado que se une a y neutraliza la actividad de NOGO, particularmente NOGO humano, más particularmente NOGO-A humano, dicho anticuerpo humanizado comprende una región variable de la cadena pesada de la SEC ID No: 84 y una región variable de la cadena ligera de la SEC ID No: 86. En un aspecto adicional de la invención se proporciona un anticuerpo (particularmente un anticuerpo totalmente humano o humanizado) que se une a y neutraliza la actividad de NOGO, particularmente NOGO humano, más particularmente NOGO-A humano, dicho anticuerpo inhibe competitivamente la unión del anticuerpo humanizado que comprende una región variable de la cadena pesada de la SEC ID No: 85 y una región variable de la cadena ligera de la SEC ID No: 86, a concentración equimolecular, a NOGO-A humano. Preferentemente el anticuerpo de competición inhibe al menos 50% de la unión del anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada de la SEC ID No: 85 y la región variable de la cadena ligera de la SEC ID No: 86 a NOGO-A humano. De acuerdo con la presente invención se proporciona un anticuerpo anti-NOGO que específicamente se une a y neutraliza la actividad de NOGO-A humano dicho anticuerpo comprende una cadena pesada de la SEC ID No: 88 y una cadena ligera de la SEC ID No: 89. La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dicho anticuerpo y procedimientos de tratamiento un paciente humano, particularmente un paciente aquejado de trastorno cerebrovascular (tal como trastorno cerebrovascular isquémico) o enfermedad de Alzheimer. Será evidente para los expertos en la materia que la SEC ID No: 88 y la SEC ID No: 89 representan la cadena pesada y la cadena ligera respectivamente antes de cualquier procesamiento (por ejemplo, procesamiento mediado por células huésped) para la eliminación de una secuencia señal. Típicamente la forma elaborada de la SEC ID No: 88 comenzará en la posición 20 y la forma elaborada de la SEC I D No: 89 comenzará en la posición 20.

SEC I D No: 88 MGWSCI ILFLVATATGVHSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT SYWMHWVRQAPGQGLEWMGNINPSNGGTNYNEKFKSRVTMTRDTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLA PSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELAGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.

SEC I D No: 89 MGWSCI ILFLVATATGVHSDIVITQSPLSLPVTLGQPASISCRSSKSLLYK DGKTYLNWFQQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGGGSGTDFTLKIS RVEAEDVGVYYCQQLVEYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

Un polinucleótido que codifica la SEC ID No: 88 se expone en la SEC ID No: 90: AAGCTTTACAGTTACTCAGCACACAGGACCTCACCATGGGATGGAGC TGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCCAG GTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCT CAGTGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCAGCTACT GGATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGAT GGGAAATATTAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTT CAAGAGCAGAGTCACCATGACCAGGGACACGTCCACGAGCACAGTCT ACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTAC TGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCAGGGAACACTAGTCACAG TCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCC TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGG TCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGC GCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTC AGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCT TGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAAC ACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCA CACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCGCGGGGGCACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAA TGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAA GGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCG AGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTG TACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAG CCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGG AGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCC TCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCA CCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCT CCCTGTCTCCGGGTAAATGAATTC (SEC ID No:_90) Un polinucleótido que codifica la SEC ID No: 89 se expone como la SEC ID No:_91 : AAGCTTTACAGTTACTCAGCACACAGGACCTCACCATGGGATGGAGC TGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAT ATTGTGATAACCCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCTTGGACA GCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATATAAGG ATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCAGCAGAGGCCAGGCCAATCT CCACAGCTCCTAATTTATTTGATGTCCACCCGTGCATCTGGGGTCCCA GACAGATTCAGCGGCGGTGGGTCAGGCACTGATTTCACACTGAAAAT CAGCAGGGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGCCAACAAC TTGTAGAGTATCCGCTCACGTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATC AAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAAC TTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCCT CCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG GACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGA CTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCC TGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGAA TTC (SEC I D No: 91 ) Ejemplo 9-Aná isis BiaCore del anticuerpo monoclonal H1 L11 Anti NOGO La cinética de ensayo del anticuerpo monoclonal anti-NOGO (mAb) para el NOGO-A (humano recombinantemente expresado (hNOGO) se analizó usando el biosensor Biacore3000. La metodología era como sigue: Procedimiento hNOGO se inmovilizó a un procesador CM5 mediante un acoplamiento de amina primaria usando el programa Biacore Wizard diseñado para niveles de inmovilización dirigida. La superficie sensora de CM5 se activó pasando una solución de N-hidroxisuccinimida 50 mM (NHS) y carburo de N-etil-N'- dimetillaminopropilo (EDC). Después usando una solución 300 nM de hNOGO en acetato de sodio 5 mM, pH 5,0, se inmovilizaron una gama de concentraciones entre 50-200 unidades de resonancia de hNOGO. Después de completar la inmovilización cualquier éster activado todavía se bloqueó mediante una inyección de clorhidrato de etanolamina 1 M, pH 8,5. El mAb H 1 H1 1 (véase el ejemplo 8) se diluyó en HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCI 150 mM, EDTA 3 mM, y tensioactivo P-20 al 5%) y se llevaron a cabo estudios de unión un intervalo de concentraciones entre 0, 1 y 100 nM. Para análisis cinético se usó un caudal de 60 µl/minuto, sin observar efectos de transferencia de masa. Todas las concentraciones se realizaron por duplicado, en un orden al azar con blancos de tampón incluidos. La regeneración se llevó a cabo bien mediante la inyección individual de un pulos de 15 µl de hidróxido sódico 50 mM solo o la inyección de 15 µl de H3PO4 1 00 mM, seguido de una inyección posterior de 15 µl de hidróxido sódico 50 mM. Ambos protocolos de regeneración se llevaron a cabo a un caudal de 30 µl/minuto; y ambos procedimientos dieron como resultado la eliminación completa de H1 L1 1 unido pero no dieron como resultado ninguna pérdida de capacidad de unión de la superficie sensora de hNOGO. Todos los desarrollos se referenciaron contra una superficie sensora en blanco (una que se había activado y bloqueado como se ha descrito anteriormente pero que no tenía la adición de ligando). El análisis de unión se llevó a cabo usando el análisis de Biacore, versión 4.1 del software de análisis cinético de evaluación BIA de otros anticuerpos de la invención esencialmente seguido del mismo protocolo como se ha descrito en la presente.

Resultados Un análisis similar se llevó a cabo usando NOGO-A de rata. Resultados:- Ejemplo 10 - Efecto de anticuerpo anti-NOGO (2C4) sobre el volumen de lesión y recuperación funcional después de tMCAO.

Objetivo: El objetivo de este estudio era investigar la eficacia de un anticuerpo monoclonal anti-NOGO (mab) administrada la dosis por vía intracerebroventricular (ICV) sobre el volumen de lesión y la recuperación funcional de ratas después de la oclusión arterial del cerebro medio transitoria (tMCAO). Ensayo de cilindro, barra de equilibrio ahusada y tareas de puntuación neurológicas se utilizaron para determinar la recuperación funcional a largo plazo después de 90 minutos de isquemia transitoria y se recogieron los cerebros para evaluación histoquímica de los procesos regenerativos y determinación del volumen de la lesión.

Procedimientos Preparación quirúrgica Ratas macho Sprague-Dawley (300-350 g) suministradas por Charles River, se usaron en el estudio. Se posicionaron cánulas ventriculares intracerebrales (i. c. v.) en el ventrículo cerebral lateral izquierdo bajo anestesia general. Después de al menos 4 días de recuperación de la cirugía, se confirmó la colocación de las cánulas mediante exposición con Angiotensina II administrada ICV.

Inducción de isquemia focal Todos los animales se sometieron a tMCAO bajo anestesia con halotano/oxígeno/óxido nitroso como describen Longa y colaboradores (Stroke, 1 989, 20, 84-91 ). Se controló la temperatura del cuerpo a lo largo de todo el procedimiento quirúrgico mediante un termómetro rectal, y los animales se mantuvieron normotémicos (37 + 0,50oC) mediante una manta calentadora controlada por el termómetro. Los valores de la temperatura central se registraron en el momento de la oclusión de la arteria cerebral media izquierda (MCA) y en la reperfusión. Noventa minutos después de la oclusión de la MCA, las ratas se volvieron a anestesiar y se retiró el filamento lenta y completamente para permitir la reperfusión. Se cierra la arteriotomia con diatermia, se volvió a comprobar la hemostasis, y se cerró por sutura la herida cervical.

Recuperación después de la oclusión: Después de la oclusión de la MCA, se discontinuó la anestesia y se dejó que los animales recuperaran la conciencia y los reflejos correctos en estricta observación en un incubador (23-25oC) durante 1 hora. Después los animales se alojaron individualmente en la habitación de recuperación post-operatoria, donde se controló estrechamente a lo largo de todo el periodo de supervivencia su estado de salud global.

Tareas conductuales 1 . Determinación neurológica: Se determinaron los cambios motores y conductuales después de la oclusión de la MCA usando una escala de graduación de 28 puntos en los momentos 1 hora, 24 horas y después semanalmente durante 8 semanas después de la oclusión de la MCA.

Detalles de la determinación neurológica ("puntuación neurológica") usada: Puntuación neurológica de los animales MCAO cuando se comparan con otras ratas dentro del mismo estudio-Máxima puntuación 28 puntos Colocación de las patas Mantener el animal longitudinalmente en el borde del banco, conectando tu mano sobre su cabeza y, una a una, tomar cada pata y colocarla sobre el borde del banco. Mirar para observar la retracción de la pata, y posición del dorso sobre el banco. Puntuación: 1 para cada posición de la pata correcta (puntuación máxima = 4) Recuperación de reflejos Agarrar firmemente el animal, y girarlo hasta que yazca sobre su dorso en la palma de tu mano. Soltar el agarre y observar si el animal se mantiene derecho él mismo. Puntuación: 1 para recuperación correcta Barra horizontal Colocar las patas delanteras del animal sobre una barra estriada y dejar que se suspenda. Puntuación : 3 si ambos miembros posteriores se levantan sobre la barra 2 si un miembro posterior se levanta sobre la barra 1 si el animal sólo se suspende 1 si el animal se cae (debido a la falta de agarre) Plataforma inclinada Mantener la tapa de la jaula a 45oC. Colocar el animal "cuesta abajo" sobre la tapa. Puntuación: 3 si el animal gira para colocarse "cuesta arriba" dentro de 15 segundos. 2 si tarda 15-30 segundos 1 si tarda más de 30 segundos 0 si el animal se cae de la tapa debido al agarre débil/ausente, o queda apuntando "cuesta abajo" Rotación contralateral Mantener el animal por la base de la cola y girar el animal en sentido de las agujas del reloj después en sentido contrario a las agujas del reloj. Observar la capacidad del animal para girar contralateralmente a la dirección de rotación. Puntuación: 1 para cada lado (puntuación máxima = 2) Alcance visual de las patas delanteras Mantener el animal por la base de la cola con su cabeza justo por debajo del nivel de la parte superior del banco. Aproximar el banco hasta que las cerdas del animal están casi tocándolo. El animal debe arquearse y tratar de colocar las patas delanteras sobre la superficie del banco. Puntuación: 1 para cada colocación correcta de la pata (puntuación máxima = 2) Descripción de círculos Colocar el animal en el suelo y mirar si hace círculos. Puntuación: 4 para no descripción de círculos 3 tiende hacia un lado 2 para grandes círculos > 50 cm de radio 1 para círculos medios > 15 < 50 cm de radio 0 para giros/círculos cerrados < 15 cm de radio Reflejo contralateral Mantener el animal por la base de la cola Puntuación: 0 para un reflejo 1 para ningún reflejo Resistencia al agarre Dejar a animal que se mantenga encima de las barras sobre la jaula con las patas frontales solamente. Arrastrar al animal hacia atrás por la cola Puntuación: 2-fuerza de agarre normal 2-fuerza de agarre débil 0-sin agarre Mobilidad Observar mientras está en el suelo para evaluar la actividad de hacer círculos Puntuación: 3-para movilidad normal 2-si está animado pero describe círculos 1 -si vacila 0-s¡ está poco dispuesto Condición general Puntuación: 3-normal (buena condición de pelaje, alerta, se mueve, ganancia de peso normal) 2-muy buena pero ganancia de peso menor de los normal 1 -buena 0-aceptable (por ejemplo, pelaje sucio, puede no estar muy aseado, postura encorvada, agresivo, tono muscular débil Puntuación máxima (es decir, rata normal) = 28 2. Ensayo del cilindro: Los animales se evaluaron semanalmente en el ensayo del cilindro para la colocación de las patas delanteras. Los animales se colocaron dentro de un cilindro Perspex® transparente de 20 cm de diámetro y 30 cm de altura durante un período de 3 minutos. El número de posicionamientos de las patas delanteras derechas e izquierda se evaluaron en este período. El ensayo se llevó a cabo en condiciones de luz roja. 3. Caminar sobre una barra delgada: Para este ensayo todas las ratas se entrenaron en una habitación de luz roja para cruzar una barra de equilibrio ahusada de sección cuadrada de 1 m de longitud y un ángulo de aproximadamente 40 grados corriendo hacia arriba de su jaula de alojamiento. Esta tarea se hace progresivamente más difícil a medida que la rata se mueve hacia arriba de la barra se equilibrio ya que la anchura de la barra de equilibrio disminuye. La barra de equilibrio se marca de manera que se divide en 3 secciones para propósitos de análisis, se gradúa fácilmente en la sección más ancha (6 cm) hasta la más difícil en el extremo delgado (2 cm) Entrenamiento preoperativo-durante 2 días cada rata se sacó de su jaula y se colocó en la barra de equilibrio a distancias crecientes (aproximadamente 4 veces al día en total). Cuando cada rata pudo cruzar la barra de equilibrio sin coacción y con pocas faltas de pie se clasifica como entrenada. Cualquier comportamiento pobre se excluyó del ensayo. Ensayo-cada rata se colocó en la barra de equilibrio 3 veces por sesión de ensayo y el tiempo de espera para cruzar, número de traspiés, definidos como una colocación de las patas que no logra contacto con la superficie superior de la barra de equilibrio, (pata trasera y delantera) se registró manualmente y después se recogió la media de éstas. En las semanas 5 para el lote 1 y la semana 4 para el lote dos de los animales, el análisis se cambió a registro en video del ensayo. El análisis del ensayo registrado después se llevó a cabo con el fin de incrementar la sensibilidad.

Las sesiones del ensayo para los animales de la MCAO fueron previas a la cirugía, después del post-operativo el día 7 y semanalmente hasta el sacrificio en la semana 8.

Régimen de dosificación Los anticuerpos se administraron a la hora, 24 horas, 1 semana y 2 semanas después de la oclusión. Grupos: control lgG1 (5 µg) (grupo D) anticuerpo 2C4 (5 µg) (grupo F) anticuerpo 2C4 (15 µg) (grupo E) Todas las preparaciones se realizaron en solución salina estéril. Los grupos eran ciegos antes de la administración. Para evitar el sesgo introducido por el orden de las ratas usadas, se empleó un diseño de cuadrado latino. Los anticuerpos se administraron en un volumen de 5 µl de solución madre (1 mg/ml y 3 mg/ml) distribuidos durante 2 minutos con la ayuda de una bomba de infusión (2,5 µl/min). Después de la inyección, las cánulas continuaron en su lugar durante 2 minutos adicionales.

Neuropatología y cuantificación de lesión isquémica 8 semanas después de la oclusión de la MCA, las ratas se perfundieron fijadas con paraformaldehído al 4% enfriado con hielo.

Después los animales se decapitaron y los cerebros de almacenaron in situ en paraformaldehído al 4% enfriado con hielo, antes de la disección y procesamiento para inclusión en parafina y posterior histoquímica. Para análisis de volumen del cerebro los cerebros se cortaron en rodajas en serie desde el polo anterior al cerebelo para procesamiento en parafina a intervalos de 2 mm usando una matriz de cerebro. Después los cerebros se trataron con parafina y se incluyeron en cera. Se recogieron secciones de 4 mieras que corresponden a planos coronales estereotácticamente predeterminados desde + 3 mm anterior a -7,5 mm posterior con relación al bregma. Se montaron las secciones sobre portaobjetos cubiertos con polilisina antes de teñir con hematoxilina y eosina. Se analizaron las secciones para evaluar el volumen de lesión e inflamación usando un sistema de análisis de imágenes basado en ordenador (Datacell, hardware. Óptimas Software). Las áreas lesionadas comprenden tejido que no se ha teñido por la hematoxilina y eosina. Las lesiones se miden trazando alrededor los límites de las áreas lesionadas y se expresan como % del área lesionada comparado con el contralateral no lesionado del cerebro.

Análisis estadístico: La puntuación neurológica y los datos de los pesos corporales se analizaron usando un planteamiento ANOVA de mediciones repetidas con el tiempo como la medición repetida. Se analizó el volumen de lesión usando un planteamiento ANOVA de 1 vía y ANCOVA y se analizó el área lesionada usando un planteamiento ANCOVA de mediciones repetidas. Los datos de los traspiés se analizaron separadamente para las patas delanteras y traseras, con el fin de observar el efecto de un grupo, usando el planteamiento ANOVA de mediciones repetidas con semana y dificultad de la barra como las mediciones repetidas. Para observar las diferencias entre las patas delanteras y traseras, los datos de los traspiés de las patas se analizaron también usando un planteamiento ANOVA de mediciones repetidas con la semana y pata como mediciones repetidas, se promediaron a través de la dificultad. Tres animales del grupo E (grupo de dosis alta de Ab) recibieron una dosis menor que los otros animales en este grupo (véase más adelante). Aunque, el análisis se llevó acabo con y sin estos animales y se mostró que no había efecto significativo sobre los resultados y los animales después se incluyeron en el análisis, es importante indicar que en el caso del ensayo del cilindro y los perfiles de peso corporal, cuando se comparan animales administrados con la dosis 3 veces y animales administrados con la dosis 4 veces con controles, solamente los animales administrados con la dosis 4 veces son significativamente diferentes a los animales administrados con la dosis de anticuerpo control. Se debe hacer notar que durante el curso de este estudio, un número de ratas murieron debido a una supuesta infección. Como consecuencia, tres animales en el grupo de la dosis más alta (grupo E) recibieron una dosis menor que otros animales en este grupo, Resultados Tres animales del grupo E (grupo de dosis más alta de Ab) recibieron una dosis menor que los otros animales en este grupo. Los datos se analizaron con y sin estos animales y no hubo efecto significativo sobre los resultados del análisis salvo que se establezca en el texto. La Figura 9 muestra el volumen de lesión como porcentaje del volumen de cerebro total en el control y los grupos de ensayo de 5 µg y 15 µg . El anticuerpo no tuvo ningún efecto sobre el volumen de lesión cuando se compara con el grupo control.

Figura 10. La Figura muestra los datos de la puntuación neurológica representados en forma de medias ± ETM. Debido al gran intervalo de datos observados el análisis paramétrico se consideró válido. Hubo diferencias significativas entre el grupo administrado con dosis de 15 µg y los controles en las semanas 1 , 4, 7 y 8. Existen diferencias significativas entre el grupo administrado con dosis de15 µg y control en las semanas 7 y 8 cuando se analiza de esta manera.

Ensayo del cilindro Véanse las Figuras 1 1A, 1 1 B, 1 1 C, 1 1 D. Los datos del cilindro representados en forma de medias ± ETM para A) ambas patas, B) pata izquierda, C) pata derecha y C) desgarro de la pata derecha en ratas que recibieron 3 dosis de 15 µg de anticuerpo anti-NOGO, y los que recibieron 4 dosis de anticuerpo anti-NOGO. La dosis de 15 µg de del anticuerpo produjo un incremento significativo en el uso de la pata derecha. Cuando el grupo de dosis alta se divide en ratas que reciben las cuatro dosis frente a ratas que reciben solamente tres dosis de anticuerpo, no se observa diferencia significativa entre los dos subgrupos. Sin embargo como se muestra en la Figura 1 1 D, cuando el grupo de 4 dosis se compara con el grupo control se compara con el grupo control existe una diferencia significativa que no se observa cuando el grupo de 3 dosis se compara con el control. El análisis estadístico usó la prueba LSD de Fisher sobre datos de mediciones repetidas.

Barra de equilibrio ahusada Véase la Figura 12. La Figura 12 muestra traspiés de las patas delanteras representadas como media ± 95% de los límites de confianza. * En la semana 6, grupo F, la dosis de 5 µg aumenta el número de traspiés de las patas delanteras comparado con el grupo D, control (p = 0,0305). Aunque no se muestra aquí, el número de traspiés de las patas delanteras se incrementó con el aumento de la dificultad a lo largo de la barra de equilibrio. Véase la Figura 13 La Figura 13 muestra los traspiés de las patas traseras representadas como media ± 95% de los límites de confianza. * Grupo F, la dosis de 5 µg aumenta significativamente el número de traspiés de las patas traseras comparado con el grupo D, control (p = 0,0488) durante el curso del estudio. En las semanas 6 y 7, el grupo F aumenta significativamente el número de traspiés de las patas traseras comparado con el grupo D, (p = 0,0098 y p = 0,0370 respectivamente). Aunque no se muestra aquí, el número de traspiés de las patas traseras se incrementó con el incremento de la dificultad a lo largo de la barra de equilibrio. Los datos de tiempo de espera para los animales para cruzar la barra de equilibrio muestra que el tiempo de espera de la semana inicial disminuye a medida que los animales se recuperan, sin embargo no se observa ningún efecto del tratamiento. Figura 14A) muestra pesos corporales representados como medias ± ETM. La dosificación a los animales con dosis de 15 µg de anticuerpo produce un incremento en peso corporal a las 24 horas, 1 semana y en cada instante entre la semana 3 y la finalización del estudio. Figura 14 B). El gráfico muestra los pesos corporales para la parte del grupo dosificado con 15 µg en animales administrados con dosis 3 veces y los administrados con dosis cuatro veces. Los datos expresados como media ± intervalos de confianza al 95%. * P < 0,05, ANOVA de mediciones repetidas. Figura 14 C.) El gráfico muestra los pesos corporales para la parte del grupo administrado con dosis de 15 µg en animales dosificados 3 veces y los administrados con dosis cuatro veces. Comparado con animales administrados con dosis de 5 µg del anticuerpo anti-NOGO y los animales administrados con dosis de anticuerpo control. Los datos expresados como media ± intervalos de confianza al 95%. * P < 0,05, ANOVA de mediciones repetidas. Aunque no significativamente mayor que los otros grupos, el grupo de dosis más alta tuvo una alta proporción de animales eliminados por eutanasia o muerte. Esto podría ser responsable del incremento medio de peso corporal cuando se compara con el grupo control.

Conclusiones Este estudio observó el efecto de dos dosis del anticuerpo 2C4 anti-NOGO sobre el volumen de lesión y recuperación funcional después de 90 minutos de tMCAO cuando se administra ICV a la hora, 24 horas, 1 semana y 2 semanas. • El tratamiento con anticuerpos no tuvo ningún efecto sobre el volumen de la lesión. • El tratamiento con anticuerpos tuvo un efecto modesto, pero significativo sobre la puntuación neurológica a la dosis más alta de 15 µg de ICV. Esta dosis incrementó significativamente la puntuación neurológica en las semanas 1 , 4, 7 y 8 usando la puntuación media (usada como datos cuando la distribución es sobre un rango grande, por lo tanto justificando el análisis paramétrico). • El tratamiento con anticuerpos tuvo un efecto significativo sobre el uso correcto de las patas en el ensayo del cilindro a la dosis más alta, 15 µg de ICV. Esta dosis produjo un incremento significativo en le uso correcto de las patas comparado con el control durante el período entero del estudio, también hubo incrementos significativos en el uso correcto de las patas específicamente en las semanas 2 y 6.

• El tratamiento con anticuerpos no tuvo un efecto positivo sobre el ensayo de caminar en la barra de equilibrio ahusada. Sin embargo, parece que el grupo de dosis baja de anticuerpo (5 µg de ICV) incremento el número de traspiés, especialmente en la semana 6. Sin embargo no se observó ninguna diferencia cuando se analizó el número de traspiés por sección de dificultad, ni cuando se analizó el tiempo de espera para cruzar la barra de equilibrio. • El tratamiento con anticuerpos tuvo un efecto significativo sobre el peso corporal a la dosis más alta, 15 µg de ICV. Este grupo de anticuerpo tuvo un incremento significativo de peso corporal cuando se compara a los controles de 3 semanas en adelante. Aunque no un resultado funcional, el peso corporal es un buen reflejo del estado general y este incremento reflejaría una mejora de la recuperación fisiológica después de la tMCAO. Las 3 últimas ratas en el grupo que recibió la dosis más alta del anticuerpo no recibieron la cuarta ni la dosis final por las razones dadas anteriormente. Con el fin de determinar la importancia de esta dosis final se llevó a cabo una comparación de las ratas en el grupo de dosis más alta de anticuerpo que recibía 3 dosis en oposición a las 4 dosis.

Duración de la administración de dosis Los animales administrados con dosis 4 veces aumentaron significativamente el número de posicionamientos correctos mientras que los animales administrados con dosis 3 veces no lo hacían. Además, la administración de dosis en la segunda semana parece acelerar el incremento en peso corporal cuando se compara con los animales administrados con dosis 3 veces. La administración de dosis 4 veces también produce un incremento significativo en peso corporal comparado con los controles mientras que la administración de dosis 3 veces no lo hace. La administración de dosis no afectó el volumen de lesión, puntuación neurológica o comportamiento en el ensayo de caminar sobre la barra de equilibrio ahusada.

Resumen En resumen, aunque el tratamiento no tuvo efecto sobre el volumen de lesión, la dosis más alta de anticuerpo 2C4 anti-NOGO (15 µg) tuvo un efecto positivo sobre la recuperación funcional, como se determinó mediante la puntuación neurológica expuesta en la presente, después de 3 ó 4 dosis y colocación de las patas y peso corporal después de la administración de 4 dosis.

Ejemplo 1 1 -Efecto de los anticuerpos monoclonales anti-NOGO administrados por vía intravenosa sobre el volumen de lesión y recuperación funcional después de tMCAO.

Objetivo El objetivo de este estudio era investigar la eficacia de los anticuerpos monoclonales 2A10 y 2C4 anti-NOGO (mabs) administrados por vía intravenosa (IV) sobre el volumen de lesión y la recuperación funcional de ratas después de la oclusión arterial del cerebro medio izquierdo transitoria (tMCAO). El ensayo de cilindro, la barra de equilibrio ahusada y tareas de puntuación neurológicas se utilizaron para determinar la recuperación funcional a largo plazo después de 90 minutos de isquemia transitoria y se recogieron los cerebros para evaluación histoquímica de los procesos regenerativos y determinación del volumen de la lesión.

Procedimientos Inducción de isquemia focal Todos los animales se sometieron a tMCAO bajo anestesia con halotano/oxígeno/óxido nitroso como describen Longa y colaboradores (Stroke, 1989, 20, 84-91 ). Se controló la temperatura del cuerpo a lo largo de todo el procedimiento quirúrgico mediante un termómetro rectal, y los animales se mantuvieron normotémicos (37 + 0,50oC) mediante una manta calentadora controlada por el termómetro. Los valores de la temperatura central se registraron en el momento de la oclusión de la MCA y en la reperfusión. Noventa minutos después de la oclusión de la MCA, las ratas se volvieron a anestesiar y se retiró el filamento lenta y completamente para permitir la reperfusión. Se cierra la arteriotomia con diatermia, se volvió a comprobar la hemostasis, y se cerró por sutura la herida cervical.

Recuperación después de la oclusión: Después de la oclusión de la MCA, se discontinuó la anestesia y se dejó que los animales recuperaran la conciencia y los reflejos correctos en estricta observación en un incubador (23-25oC) durante 1 hora. Después los animales se alojaron individualmente en la habitación de recuperación post-operatoria, donde se controló estrechamente a lo largo de todo el periodo de supervivencia su estado de salud global.

Tareas conductuales Determinación neurológica: Se determinaron los cambios motores y conductuales después de la oclusión de la MCA usando una escala de graduación de 28 puntos ("puntuación neurológica", véase el ejemplo 10 para detalles) en los momentos 1 hora, 24 horas y después semanalmente durante 8 semanas después de la oclusión de la MCA.

Ensayo del cilindro: Los animales se evaluaron semanalmente en el ensayo del cilindro de la colocación de las patas delanteras. Los animales se colocaron dentro de un cilindro Perspex® transparente de 20 cm de diámetro y 30 cm de altura durante un período de 3 minutos. Los números de posicionamientos de las patas delanteras derecha e izquierda se evaluaron en este período. El ensayo se llevó a cabo en condiciones de luz roja.

Caminar sobre una barra delgada: Para este ensayo todas las ratas se entrenaron en una habitación de luz roja para cruzar una barra de equilibrio ahusada de sección cuadrada de 1 m de longitud y un ángulo de aproximadamente 40 grados corriendo hacia arriba de su jaula de alojamiento. Esta tarea se hace progresivamente más difícil a medida que la rata se mueve hacia arriba de la barra se equilibrio ya que la anchura de la barra de equilibrio disminuye. Entrenamiento preoperativo-durante 2 días cada rata se sacó de su jaula y se colocó en la barra de equilibrio a distancias crecientes (aproximadamente 4 veces al día en total). Cuando cada rata pudo cruzar la barra de equilibrio sin coacción y con pocas faltas de pie se clasifica como entrenada. Cualquier comportamiento pobre se excluyó del ensayo.

Ensayo-cada rata se colocó en la barra de equilibrio 3 veces por sesión de ensayo y el tiempo de espera para cruzar, número de traspiés, definidos como una colocación de las patas que no logra contacto con la superficie superior de la barra de equilibrio, (pata trasera y delantera) se registró mediante video, se determinó en una fecha posterior y después se tomó la media de éstos. Las sesiones del ensayo para los animales de la MCAO fueron previas a la cirugía, después del post-operativo el día 7 y semanalmente hasta el sacrificio en la semana 8.

Régimen de dosificación (IV) El anticuerpo se administró por vía intravenosa a la hora, 24 horas, 1 semana y 2 semanas después de la oclusión. Grupos: A-3 mg/kg de 2C4 (4,7 mg/kg ajustado debido a las fracciones bajas de control PM) B-3 mg/kg de 2C4 C-3 mg/kg de lgG2a control D-10 mg/kg de 2A10 Todas las preparaciones se realizaron en solución salina estéril. Los grupos eran ciegos antes de la administración. Para evitar el sesgo introducido por el orden de las ratas usadas, se empleó un diseño de cuadrado latino. Los animales se distribuyeron al azar y los operadores eran ciegos antes del tratamiento. Neuropatología v cuantificación de lesión isquémica 8 semanas después de la oclusión de la MCA, las ratas se perfundieron fijados con paraformaldehído al 4% enfriado con hielo. Después los animales se decapitaron y los cerebros de almacenaron in situ en paraformaldehído al 4% enfriado con hielo durante 48 horas, antes de la disección y procesamiento para inclusión en parafina y posterior histoquímica. Para análisis de volumen del cerebro los cerebros se cortaron en rodajas en serie desde el polo anterior al cerebelo para procesamiento en parafina a intervalos de 2 mm usando una matriz de cerebro. Después los cerebros se trataron con parafina y se incluyeron en cera. Se recogieron secciones de 4 mieras que corresponden a planos coronales estereotácticamente predeterminados desde + 3 mm anterior a -7,5 mm posterior con relación al brega. Se montaron las secciones sobre portaobjetos cubiertos con polilisina antes de teñir con hematoxilina y eosina. Se analizaron las secciones para volumen de lesión usando un sistema de análisis de imágenes basado en ordenador (hardware Datacell, Software Óptimas). Las áreas lesionadas se delinearon por las áreas tejido con reducción de hematoxilina y eosina. Las lesiones se miden trazando alrededor los límites de las áreas lesionadas y se expresan como % del área lesionada comparado con el lado contralateral no lesionado del cerebro.

Análisis estadístico: La puntuación neurológica y los datos de los pesos corporales se analizaron usando un planteamiento ANOVA de mediciones repetidas con el tiempo como la medición repetida. Se analizó el volumen de lesión usando un planteamiento ANOVA de 1 vía y ANCOVA y se analizó el área lesionada usando un planteamiento ANCOVA de mediciones repetidas. Los traspiés de las patas se analizaron separadamente para las patas delanteras y traseras, para observar el efecto de un grupo, usando un planteamiento ANOVA de mediciones repetidas con semana y dificultad de la barra como las mediciones repetidas. Para observar las diferencias entre las patas delanteras y traseras, los datos de los traspiés de las patas se analizaron también usando un planteamiento ANOVA de mediciones repetidas con la semana y pata como mediciones repetidas, se promediaron a través de la dificultad.

Resultados Volumen de lesión La Figura 15 representa el volumen de lesión como porcentaje de volumen de cerebro total. El anticuerpo no tuvo ningún efecto sobre el volumen de lesión cuando se compara con el grupo control.

Puntuaciones neurolóqicas La Figura 16 muestra los datos de puntuación neurológica representados como media ± ETM. Debido al gran intervalo de datos observados el análisis paramétrico se consideró que era válido. * P < 0,05 comparado con el grupo control, ANOVA de mediciones repetidas.

Ensayo del cilindro Véanse las Figuras 1 7 A, 17 B y 1 7 C. Datos del cilindro representados como media ± ETM para A) ambas patas, B) pata izquierda, C) pata derecha * P < 0,05, ** P < 0,01 frente al anticuerpo control, ANOVA de mediciones repetidas.

Barra de equlibrio ahusada Traspiés de las patas delanteras Véase la Figura 18. Los traspiés de las patas delanteras representados como media ± ETM. * P < 0,05, ** P < 0,01 frente al anticuerpo control, ANOVA de mediciones repetidas.

Traspiés de las patas traseras Véase la Figura 19. Los traspiés de las patas traseras representados como media ± ETM. * P < 0,05, ** P < 0,01 frente al anticuerpo control, ANOVA de mediciones repetidas.

Tiempo de espera para cruzar la barra de equilibrio ahusada Véase la Figura 20. Los traspiés de las patas traseras representados como media ± ETM * P < 0,05 frente al anticuerpo control, ANOVA de mediciones repetidas. Conclusiones Este estudio observó el efecto de dos dosis del anticuerpo 2A10 anti-NOGO (3 y 10 mg/kg) y una dosis de 2C4 (3 mg/kg) sobre el volumen de lesión y recuperación funcional después de 90 minutos de tMCAO cuando se administra IV a la hora, 24 horas, 1 semana y 2 semanas. • El tratamiento con anticuerpos no tuvo ningún efecto sobre el volumen de la lesión. • El tratamiento con anticuerpos tuvo un efecto significativo sobre la puntuación neurológica a la dosis más alta de 2A10 (10 mg/kg) a las 24 horas • El tratamiento con anticuerpos 2A10 (3 mg/kg) tuvo un efecto significativo sobre el uso correcto de las patas en el ensayo del cilindro específicamente en las semanas 1 y 2. • 2A10 (3 mg/kg) tuvo un efecto claro en la reducción del número de traspiés de las patas delanteras en las semanas 1 y 2 después de la tMCAO, 2A1 0 (10 mg/kg) tuvo el efecto de reducir el número de traspiés de las patas a las 2 semanas después de la tMCAO, y ambas concentraciones de 2A1 0 redujeron el tiempo de espera para cruzar la barra de equilibrio en la semana 1 después de la tMCAO. 2C4 (3 mg/kg) redujo los traspiés de las patas delanteras a las 3 semanas después de la tMCAO con relación al anticuerpo control.

Resumen En resumen, aunque el tratamiento no tuvo efecto sobre el volumen de lesión, la inyección intravenosa de los anticuerpos monoclonales tanto 2A10 como 2C4 anti-NOGO tuvo un efecto positivo sobre la recuperación funcional, como se determinó mediante la puntuación neurológica, colocación de las patas y barra de equilibrio ahusada predominantemente en las dos primeras semanas después de la tMCAO.

Ejemplo 12-Transfección de cADN de NOGO en células SHSY5Y-APP. El día antes de de las transfección las células SHSY5Y-APP se tripsinizaron, se contaron y se volvieron a sembrar a entre 200.000 y 1 millón de células por pocilio de placa de 6 pocilios (Nunc). La construcción de expresión NOGO (cADN de NOGO-A dirigido a FLAG en pCDNA3 (Invitrogen); NOGO-B dirigido a MYC y NOGO-C en pADN3.1 A) se complejo con reactivo Plus TM diluyendo el ADN en medio libre de suero (OptiMEM-1 ), añadiendo reactivo Plus TM, mezclando e incubando a temperatura ambiente durante 15 minutos. (6 µl de reactivo Plus en un volumen total de 100 µl con 2 µg de DNA y OptiMEM-1 por pocilio) Reactivo LipofectAMI NETM se diluyó en medio exento de suero (Optimem-I) en un segundo tubo y se mezcló (4 µl de Lipofectamine en 100 µl volumen por pocilio). ADN complejado previamente (de antes) se combinó con el lipofectAMINE, diluido se mezcló y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Mientras tanto las células se lavaron con medio exento de suero (OptiMEM-l) y después medio reciente exento de suero se añadió a las células (800 µl por pocilio). Después los complejos de reactivos ADN-Plus- LipofectAMINE se añadieron a las células (200 µl), se mezclaron suavemente y las células se incubaron a 37oC durante 5 horas en C02 al 5%. Después de 5 horas 1 ml de medio de crecimiento que contenía suero se añadió a las células y las células se incubaron durante toda la noche o 2 horas. Después de 14 horas (o 2 horas) se retiró todo el medio y se reemplazó con 1 ml (OptiMEM-1 ) por pocilio. Después de 48 horas de reacondicionameinto se recogió el medio y se ensayó para evaluar el contenido de amiloide como se describe en el ejemplo 13.

Ejemplo 13-Detección del péptido Aß mediante IGEN ELISA. Las células SHSY5Y que sobreexpresan el APPwt humano o la secuencia variante sueca de la proteína precursora de amiloide (APPswe) se sembraron en placas Nunc de 6 pocilios o 96 pocilios a la densidad requerida. Después de 24 horas los reactivos (por ejemplo, anticuerpo, péptidos, compuestos, etc.) para ensayo se añadieron a las células en un volumen final de 120 µl y se incubaron las células durante 24 horas. Se retiró el medio de las células y se ensayaron 50 µl para Aß x-40 y 50 µl ' para Aß x-42 en un inmunoensayo ORIGEN durante toda una noche empleando anticuerpos específicos de Aß. C-terminal. En resumen, péptidos Aß se capturaron usando 6E10 biotinilado (Signet Labs). Se usaron anticuepos específicos Aß C-terminal marcados con dirigido a Ori para detectar las especies Aß x-40 y Aß x-42. Se capturaron los complejos anticuerpo-Aß con perlas dina recubiertas con estreptavidina y se ensayaron en un analizador IGEN M8. La viabilidad de las células se comprobó usando reactivo MTT bromuro de (3-[4,5-dimetilltiazol-2- ¡l]-2,5-difeniltetrazoIio; azul de tiazolilo). En resumen, reactivo MTT (5 mg/ml en solución salina tamponada con fosfatos) se diluyó 1 : 10 in en medio de cultivo y se añadieron 1 00 µl a cada pocilio. Después de la incubación a 37oC durante 4 horas, se añadieron 1 00 µl de solución solubilizante (SDS al 20%/dimetilformamida al 50%). Se leyó la absorbancia de las placas usando un lector de placas Delfia Wallac a 590 nM. Los resultados se muestran en las Figuras 21 a 34. Las células SHSY5Y-APPwt expresan APP de tipo salvaje. Las células SHSY5Y-APPswe expresan la forma de la mutación sueca de APP.

Ejemplo 14-EI efecto de la expression de NOGO-A sobre los niveles de péptido Aß 40 y Aß 42 secretados. Cuando una construcción de expresión que expresa NOGO-A se introduce en bien las células SHSY5Y-APPwt o las células SHSY5Y-APPswe los niveles de Aß 40 y Aß 42 se observa que aumentan significativamente sugiriendo que NOGO-A está de alguna manera modulando, directa o indirectamente, el proceso proteolítico de APP y/o la degradación de los péptidos Aß. El hecho de que el producto de este proceso de APP alterado sea el péptido Aß40 podría sugerir que el efecto de NOGO podría ser a nivel de modular la actividad de la secretasa ß. La Figura 21 muestra el incremento en el nivel de Aß40 secretado cuando NOGO-A se expresa a partir de un vector de expresión. Las dos barras a la izquierda son los controles (vector solo y el vector que lleva una proteína control, proteína fluorescente verde (GFP)), que muestra los niveles de fondo de la producción de Aß40 en esta línea celular. Las barras restantes muestran que niveles significativamente incrementados del péptido Aß40 se detectan cuando NOGO-A, condensado a un péptido FLAG, se expresa en las células y también que una elevación similar, aunque menos marcada, cuando se expresa NOGO-B condensado a myc. El mismo experimento se repitió usando un ELISA específico para Aß42. Los resultados mostraban una elevación similar en los niveles de la secreción del péptido Aß42 como se observó en el experimento anterior usando ELISA de Aß40. De nuevo NOGO-B también mostró un aumento de secreción del péptido Aß42 y de nuevo el incremento era menos marcado que con NOGO-A. Los resultados se muestran en la Figura 22.

Los experimentos repetidos que comparan los niveles de péptido secretado de células transfectadas con NOGO-A comparados con el vector pCADN solo, se muestran en las Figuras 23 (para Aß 40) y 24 (para Aß42). Una comparación directa de los niveles de péptido Aß 40 y Aß 42 se muestra en la Figura 25. La Figura 25 es la media de tres a cinco experimentos separados que confirman la consistencia de NOGO. De esta manera la ¡nvención proporciona el uso de un anticuerpo anti-NOGO (particularmente un anticuerpo anti-NOGO-A y/o anti NOGO-B) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Ejemplo 15-el anticuerpo anti NOGO-A inhibe la secreción de los péptidos Aß 40 y A6 42 por las células SHSY5Y-APPwt y SHSY5Yswe La Figura 26 muestra la drástica reducción en los niveles de los péptidos Aß 40 y Aß 42 secretados por las células SHSY5Y-APPwt que expresan NOGO-A cuando el anticuerpo 2A10 anti-NOGO se introduce en el medio de cultivo. El efecto se observa de una manera dependiente de la dosis, a 30 µg/ml alcanzando niveles de inhibición de casi 90%. No existe diferencia aparente en el efecto entre los péptidos Aß 40 y Aß 42 (barras blancas y barras negras respectivamente en la Figura 26), en otras palabras cualquier efecto del anticuerpo del anticuerpo anticuerpo anti-NOGO sobre el procesamiento de APP no es preferente para cualquiera de los péptidos Aß 40 y Aß 42. La Figura 27 muestra el mismo experimento que en la Figura 26 pero con un anticuerpo lgG1 no relacionado. Como se puede observar claramente en la Figura, un anticuerpo monoclonal no relacionado (no anti-NOGO A) no tiene efecto inhibidor sobre los niveles de la secreción de péptidos Aß 40 y Aß 42 por las células. La Figura 28 muestra que el mismo anticuerpo igG 1 no relacionado muestra de manera similar poco o ningún efecto inhibidor sobre los niveles de la secreción de péptidos Aß 40 y Aß 42 por las células SHSYdY-APPswe que expresan anti-NOGO-A. De manera similar la Figura 29 muestra los resultados del mismo experimento descrito anteriormente para la Figura 26 pero usando un anticuerpo monoclonal anti-NOGO que se une a NOGO-A pero no es una función bloqueante (6D5). La función no bloqueante del anticuerpo monoclonal 2A10 anti-NOGO-A tiene un efecto mínimo (menos del 10%) sobre la secreción de los péptidos por las células SHSYdY-APPwt que expresan NOGO-A. Este resultado sugiere que los resultados mostrados en la Figura 26 son un resultado de la inhibición de la actividad funcional de NOGO por el anticuerpo anti-NOGO. La Figura 30 muestra los resultados del mismo experimento que para la Figura 29, usando la función no bloqueante del anticuerpo monoclonal anti-NOGO (6Dd) pero con las células SHSY5Y-APPswe que expresan NOGO-A endógeno. Como antes (Figura 29) existe un mínimo efecto sobre los niveles de Aß 40 y Aß 42 que se secretan por esta línea celular, siendo inferior a un 10% de inhibición. La Figura 31 muestra los resultados de un experimento d que amplia los resultados del experimento de la Figura 26. La Figura 31 muestra que el efecto dependiente de la concentración del efecto inhibidor mostrado por la función bloqueante del anticuerpo 2A10/3 continúa a una alta concentración, lográndose un nivel mayor de 90% de inhibición a una concentración de anticuerpo se 60 µg/ml. 0 La Figura 32 muestra los resultados de un experimento idéntico al de la Figura 31 excepto que se usan las células SHSYdYswe. El efecto inhibidor dependiente de la concentración del anticuerpo 2A1 0/3 continúa observándose a la concentración más alta de 60 µg/ml. 5 La Figura 33 muestra el efecto de una indiferente función bloqueante del anticuerpo anti-NOGO-A, 2C4, sobre la secreción de los péptidos Aß 40 y Aß 42 por las células SHSYdY-APPwt. Los resultados muestran un efecto inhibidor dependiente de la concentración sobre los niveles de la secreción de los péptidos Aß 40 y Aß 42 hasta un nivel de 36% a una concentración de 20 µg/ml. De nuevo se observa el efecto sobre los péptidos tanto Aß 40 como Aß 42. La Figura 34 compara el efecto inhibidor de la función bloqueante de los anticuerpos 2A1 0, 2C4 y 1 dC3 anti-NOGO-A (a las concentraciones mostradas en la Figura) con otros anticuerpos control 10A4, lgG2b y 14D 12. La Figura muestra que el efecto sobre la inhibición de la secreción de Aß 40 y Aß 42 es específica para la función bloqueante de los anticuerpos anti-NOGO-A.

Ejemplo 16 - El aumento de expresión de NogoA eleva los niveles de Aß de unamanera dependiente de la dosis Para investigar el efecto de la expresión de NogoA sobre los niveles de Aß, células SHSYdY-APPwt se trasnfectaron transitoriamente con cantidades crecientes de cADN de NogoA dirigido por myc C-terminal. La cantidad de cADN (6 ug) se mantuvo constante para cada transfección usando cADN de pcDNA3.1 myc cDNA. 48 horas después de la transfección, se retiró el medio de cultivo y se ensayó para Aß40. Además, las células se recogieron y se lisaron en Tris/HCI 10 mM conteniendo Tritón X-100 al 1 % e inhibidores completos de la proteasa (Roche). Los lisados celulares se resolvieron sobre geles Novex Tris-glicina y se sometieron a análisis de transferencia de Western con un anticuerpo anti-NOGOA. Un incremento en la expresión de la proteína NogoA se observó con concentraciones crecientes de cADN de NogoA. Esto era simultáneo con un incremento correspondiente en los niveles de Aß40 en el medio de estas células. De esta manera, el aumento de expresión de NogoA produce un incremento dependiente de la dosis en los niveles de Aß40. Véase la Figura 36.

Ejemplo 17-2A10 quimérico (HcLc) Un anticuerpo quimérico constituido por regiones V murinas precursoras injertadas en regiones C de tipo salvaje lgG1/k se diseñó para usarse como referencia cuando se ensayan construcciones humanizadas. El dominio NOGO 2A10 de VH en el plásmido Rld recombinante se cortó con Hind lll-Spe y se ligó en el vector Rld que contiene hC?1 wt. El dominio NOGO 2A10 de V| en el plásmido Rln recombinante se cortó con Hind HI-BsiW I y se ligó en el vector Rln que contiene hCk. La SEC ID No: 92 expone la secuencia de cadena pesada para HcLc MGWSCI I LFLVAAATGVHSQVQLQQPGTELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWV KQRPGQGLEW IGN I N PSNGGTNYN EKFKSKATLTVDKSSSTAYMQ LSSLTSEDSAV YYCELGQGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEP VTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVN H KPSNTK VDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL GGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALH NH YTQKSLSLSPGK (SEC I D No: 92) Un polinucleótido que codifica la SEC ID No: 92 se expone como la SEC ID No: 93.

AAGCTTGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTTTTGGTAGCAGCAGCTAC AGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGGGACTGAACTGGTGAAGCCT GGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACT GGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAAATAT TAATCCTAGCAATGGTGGTACTAACTACAATGAGAAGTTCAAGAGCAAGGCCACAC TGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAGCTCAGCAGCCTGAC ATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTATTGTGAACTGGGACAGGGCTACTGGGGCCA AGGCACACTAGTCACAGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCC CCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCC TGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCC TGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACT CCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACA TCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGC CCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCT GGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGA CAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCA ACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGC CCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGA ACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCC GTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTG CACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAATTC (SEC I D No: 93).

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de HcLc expone como la SEC ID No: 94: MRCSLQFLGVLMFWISGVSGDIVITQDELSNPVTSGESVSISCRSSKSLLYKDGKTY LNWFLQRPGQSPQLLIYLMSTRASGVS DRFSGSGSGTDFTLEISRVKAEDVGVYYC QQLVEYPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC (SEQ.I .D . NO :94) Un polinucleótido que codifica la SEC ID No: 94 se expone como la SEC ID No: 95: AAGCTTGCCACCATGAGGTGCTCTCTTCAGTTTCTGGGGGTGCTTATGTTCTGGA TCTCTGGAGTCAGTGGGGATATTGTGATAACCCAGGATGAACTCTCCAATCCTGT CACTTCTGGAGAATCAGTTTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTAAGAGTCTCCTATAT AAGGATGGGAAGACATACTTGAATTGGTTTCTGCAGAGACCAGGACAATCTCCTC AGCTCCTGATCTATTTGATGTCCACCCGTGCATCAGGAGTCTCAGACCGGTTTAG TGGCAGTGGGTCAGGAACAGATTTCACCCTGGAAATCAGTAGAGTGAAGGCTGA GGATGTGGGTGTGTATTACTGTCAACAACTTGTAGAGTATCCGCTCACGTTCGGT GCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGC TGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGACAACGCCC TCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCA CCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACA AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGA GCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGGAATTC (SEC ID No: 95) Ejemplo 18 - Anticuerpos anti-NOGO humanizados se unen a NOGO humano GST- NOGO-A56 humano a 1 µg/ml en Tris 50mM pH 9,5 se recubrió en placas Nunc Immunosorp (100 µl por pocilio) a 4oC durante toda una noche. Los pocilios se enjuagaron una vez con TBS + tween al 0,5% después se incubaron con BSA al 2% en TBS + tween al 0,06% para bloquear los sitios de unión no específicos a temperatura ambiente durante 1 hora. Los anticuerpos se diluyeron en TBS + tween al 0,06% + BSA al 2% hasta 1 0 µg/ml y se hicieron diluciones 1 /2 a partir de ésta. Los anticuerpos se añadieron a los pocilios por duplicado y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Los pocilios se lavaron tres veces con TBS + tween al 0,5% después se incubaron con conjugado peroxidasa kappa anti-humana (1 :2000) durante 1 hora. Se lavaron tres veces con TBS + tween al 0,6% y después se incubaron con 1 00 µl de sustrato de peroxidasa OPD (Sigma) por pocilio durante 10 minutos. La reacción de color se detuvo mediante la adición de 26 µl de H2S04. La densidad óptica a 490 nm se midió usando un lector de placas. Se sustrajeron los valores de fondo leídos de los pocilios sin anticuerpo. Las Figuras 35A a C ilustran la unión dependiente de la dosis del anticuerpo humanizado H 1 L1 1 en comparación con la quimera (HcLc) a NOGO-A56 humano en un ensayo ELISA. El eje X muestra la densidad óptica medida (DO) a 490 nm, una medición cuantitativa del anticuerpo capturado en los pocilios. El eje X muestra la concentración del anticuerpo usado (ug/ml) por pocilio en cada punto de entrada de datos. Los anticuerpos H 1 L1 1 y HcLc proporcionan valores de CE50 de 0, 1 18 µg/ml y 0,022 µg/ml respectivamente.

Claims (1)

1. REIVI NDICACIONES 1 . Un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une con (por ejemplo a) y neutraliza NOGO humano. 2. Un anticuerpo según la reivindicación 1 que se une a una región de la proteína NOGO-A humana entre los aminoácidos 586 a 785. 3. Un anticuerpo según la reivindicación 2 que se une a una región de NOGO-A humano entre los aminoácidos 586 y 685. 4. Un anticuerpo según la reivindicación 2 que se une a una región de NOGO-A humano entre los aminoácidos 686 y 785. 5. Un anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende cada una de las siguientes CDRs: las CDRs de la cadena ligera: SEC I D números: 1 , 2 y 3 las CDR de la cadena pesada: SEC I D números: 4, 5 y 6. 6. Un anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende cada una de las siguientes CDRs: las CDRs de cadena ligera: S EC I D números: 7, 8 y 9. las CDRs de cadena pesada: SEC I D números: 1 1 , 12 y 13. 7. Un anticuerpo según la reivindicación 1 que comprende cada una de las sig uientes CDRs: las CDRs de cadena ligera: SEC I D números: 13, 14 y 1 5. las CDRs de cadena pesada: SEC I D números: 1 6, 17 y 1 8. 8. Un anticuerpo según la reivindicación 5 que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende cada una de las CDRs seleccionadas entre CDRH 1 , CDRH2 y CDRH3 y un dominio variable de la cadena pesada que comprende una o más de las CDRs seleccionadas entre CDRL1 , CDRL2 y CDRL3. 9. Un anticuerpo según la reivindicación 6 que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende d cada una de las CDRs seleccionadas entre CDRH 1 , CDRH2 y CDRH3 y un dominio variable de la cadena pesada que comprende una o más de las CDRs seleccionadas entre CDRL1 , CDRL2 y CDRL3. 1 0. Un anticuerpo según la reivindicación 7 que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende 0 cada una de las CDRs seleccionadas entre CDRH 1 , CDRH2. y CDRH3 y un dominio variable de la cadena pesada que comprende una o más de las CDRs seleccionadas entre CDRL1 , CDRL2 y CDRL3. 1 1 . Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que es un anticuerpo monoclonal. d 12. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 3 que es un anticuerpo humanizado o quimérico. 1 3. Un anticuerpo según la reivindicación 8 en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC I D No: 37. 0 14. Un anticuerpo según la reivindicación 9 en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID No: 38. 1 5. Un anticuerpo según la reivindicación 1 0 en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC I D No: 39. 1 6. Un anticuerpo según la reivindicación 8 ó 13 en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID No: 40. 1 7. Un anticuerpo según la reivindicación 9 ó 14 en el d que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC I D No: 41 . 18. Un anticuerpo según la reivindicación 10 ó 15 en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC I D No: 42. 1 9. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento funcional del mismo anti-NOGO según cualquier reivindicación precedente junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. 20. Un procedimiento de tratamiento o profilaxis de trastorno cerebrovascular u otras enfermedades/trastornos neurológicos en un ser humano que comprende la administración a dicho ser humano en necesidad del mismo de una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NOGO, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -18 que incluye anticuerpos alterados o un fragmento funcional de los mismos. 21 . El uso de un anticuerpo anti-NOGO, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 8, que incluye anticuerpos alterados o un fragmento funcional de los mismos en la preparación de un medicamento para el íratamiento o profilaxis de trasíorno cerebrovascular y oirás enfermedades/írasíornos neurológicos. 22. Un procedimiento de inhibición de la neurodegeneración y/o recuperación funcional en un paciente humano que padece, o en riesgo de desarrollar, un írasíorno cerebrovascular u oirás enfermedad/írastorno neurológico que comprende la adminisíración a dicho ser humano en necesidad del mismo de una caníidad eficaz de un aníicuerpo aníi-NOGO, según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 8, q ue incluye aníicuerpos alíerados o un fragmenio funcional de los mismos. 23. El uso de un aníicuerpo aníi-NOGO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 8, que incluye aníicuerpos alíerados o un fragmenío funcional de los mismos en la preparación de un medicamenío para inhibir la neurodegeneración y/o promover la recuperación funcional en un pacieníe humano aquejado, o en riesgo de desarrollar, un írasíorno cerebrovascular y oíra enfermedad/írasíorno neurológico. 24. Un procedimienío de íraíamienío o profilaxis de írasíorno cerebrovascular u oíra enfermedad/írasíorno neurológico en un ser humano que comprende la eíapa de adminisíración pareníeral de una caníidad lerapéuíicameníe eficaz de un aníicuerpo anti-NOGO según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 8 a dicho ser humano. 25. El procedimiento de la reivindicación 24 en el que el anticuerpo anti-NOGO se administra por vía iníravenosa. 26. El procedimienío de una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24 en el que la oíra enfermedad/írastorno neurológico se selecciona eníre el grupo consíiíuido por; lesión cerebral íraumáíica , lesión de la médula espinal, enfermedad de Alzheimer, demencias fronío-íemporales (íauopaíías), neuropaíía periférica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huníingíon y esclerosis múlíiple. 27. Un procedimienío de promoción del rebroíe axonal que comprende la eíapa de poner en coníacío un axón humano con un aníicuerpo aníi-NOGO de las reivindicaciones 1 a 1 8. 28. El procedimienío de la reivindicación 27 en el que el procedimienío es in vitro. 29. Un procedimienío de producción de un aniicuerpo aníi-NOGO de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 8 que específicameníe se une a y neuíraliza la acíividad de NOGO-A humano dicho procedimienío comprende las eíapas de: (a) proporcionar un primer vecíor que codifica una cadena pesada del aníicuerpo; (b) proporcionar un segundo vecíor que codifica la cadena ligera del aníicuerpo; (c) co-transfecíar una célula huésped de mamífero con dichos primer y segundo vector; (d) cultivar la célula huésped de la etapa (c) en medios de cultivo (preferentemeníe exeníos de suero) en condiciones que permiten la secreción del anticuerpo por dicha célula huésped en dichos medios de cultivos; (e) recuperar el anticuerpo secreíado de ia eíapa (d). 30. Un procedimienío de producción de un anficuerpo aníi-NOGO que inhibe compeíiíivameníe la unión del aníicuerpo de una cualq uiera de las reivindicaciones 1 a 1 8 dicho procedimienío comprende las eíapas de: (a) proporcionar un primer vecíor que codifica una cadena pesada del aníicuerpo; (b) proporcionar un segundo vecíor que codifica la cadena ligera del aníicuerpo; (c) co-íransfectar una célula huésped de mam ífero con dichos primer y segundo vecíor; (d) culíivar la célula huésped de la eíapa (c) en medios de culíivo (prefereníemeníe exeníos de suero) en condiciones que permiíen la secreción del aníicuerpo por dicha célula huésped en dichos medios de culíivos; (e) recuperar el aníicuerpo secreíado de la eíapa (d). 31 . Un procedimienío de producción de una composición farmacéuíica adminisírable por vía iníravenosa que comprende un anficuerpo aníi-NOGO que se une a y neuíraliza ia acíividad de NOGO-A dicho procedimienío comprende ias eíapas de: (a) proporcionar un primer vecíor que codifica una cadena pesada del anílcuerpo; (b) proporcionar un segundo vecíor q ue codifica la cadena ligera del aníicuerpo; (c) iníroducir (por ejemplo, co-íransfecíar) dicho primer y segundo vector en una célula huésped de mam ífero; (d) culíivar la célula huésped de la eíapa (c) en medios de culíivo (prefereníemeníe exeníos de suero) en los que dicha célula huésped secreía en dicho medio de culíivo un aníicuerpo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada; (e) recuperar (y opcionalmeníe purificar) el aníicuerpo secreíado de la eíapa (d); (f) incorporar el aníicuerpo de la eíapa (e) en una composición farmacéufica adminisírable por vía iníravenosa. 32. Un procedimienío de producción de un aníicuerpo aníi-NOGO que se une a NOGO-A eníre los aminoácidos 686-786, paríicularmeníe 686-686 ó 686-785 y neuíraliza la acíividad de dicho NOGO-A dicho procedimienío comprende las eíapas de: (a) proporcionar un primer vecíor q ue codifica una cadena pesada del aníicuerpo; (b) proporcionar un segundo vecíor que codifica la cadena ligera del aníicuerpo; (c) inírod ucir (por ejemplo, co-íransfecíar) dichos primer y segundo vecíor en una célula huésped de mam ífero; (d) culíivar la célula huésped de la eíapa (c) en medios de culíivo (prefereníemenfe exeníos de suero) en los que dicha célula huésped secreía en dicho medio de culíivo un aníicuerpo q ue comprende una cadena ligera y una cadena pesada; (e) recuperar (y opcionalmeníe purificar) el aníicuerpo secreíado de la eíapa (d). 33. Un procedim ienío según la reivindicación 29 a 32 en el que la célula huésped se selecciona entre el grupo constiíuido por NSO Sp2/o, CHO, COS, una célula de fibroblasío íal como 3T3, paríicularmeníe CHO.