EA009643B1

EA009643B1 - Лечение состояний, включающих амилоидные бляшки

Info

Publication number: EA009643B1
Application number: EA200501620A
Authority: EA
Inventors: Стефен М. Стриттмэттер; Дэниел Х. С. Ли; Вэйвэй Ли
Original assignee: Йейл Юниверсити; Байоджен Айдек Ма Инк.
Priority date: 2003-04-16
Filing date: 2004-04-16
Publication date: 2008-02-28
Also published as: NO20055392L; EA200501620A1; JP2006523708A; CA2522649A1; WO2004093893A3; IS8081A; EP1615654A2; MXPA05011100A; CN1832752A; AU2004231742A1; RS20050774A; AU2004231742A2; ZA200509242B; WO2004093893A2; KR20060023959A; BRPI0409562A; US20070065429A1

Abstract

Изобретение обеспечивает способы лечения заболеваний, включающих нарушенное отложение пептида амилоида-β (Aβ), включая болезнь Альцгеймера, введением антагонистов рецептора Nogo. Изобретение также обеспечивает способ уменьшения уровня пептида Aβ у млекопитающего введением полипептида растворимого рецептора Nogo.

Description

Настоящее изобретение относится к нейробиологии, неврологии и фармакологии. В частности, оно относится к способам лечения заболеваний, включающих нарушенную продукцию и отложение пептида амилоида β (Αβ), включая болезнь Альцгеймера, введением антагонистов рецептора Νοβο.

Предшествующий уровень техники изобретения

Болезнь Альцгеймера (ΑΌ) представляет собой нейродегенеративное расстройство, которое приводит к прогрессивной потери памяти, познавательных способностей, мышления, суждения и эмоциональной стабильности и, в конечном итоге, смерти. Патологическим признаком ΑΌ является присутствие амилоидных бляшек в головном мозге. Однако амилоидные бляшки и сосудистые отложения амилоида (амилоидная ангиопатия) также присутствуют при других состояниях, например при трисомии 21 (синдром Дауна), наследственном внутримозговом кровоизлиянии с амилоидозом датского типа (НСН^А-Э) и церебральной амилоидной ангиопатии (САА). Основным компонентом амилоидных бляшек является пептид Ав, который получается протеолитически из белка предшественника амилоида (АРР) при помощи β-секретазы (РАСЕ) и γ-секретазы (пресенилин-1,2 и связанные белки). АРР также преобразуется в безопасные пептиды и фрагменты белков посредством α-секретаз и γ-секретазы. Генетические исследования человеческой семейной ΑΌ (ΓΑΌ) обнаружили, что мутации в АРР и/или пресенилинах нарушают продукцию общего пептида Αβ или соотношение фибриллогенного пептида Ав 42-3 к другим продуктам расщепления АРР. Кроме того, у мышей, которые экспрессировали мутантные человеческие ΓΑΌ варианты АРР с мутантными пресенилинами или без них, проявлялось отложение амилоидных бляшек и когнитивные нарушения.

Тогда как пептиды Αβ вовлечены в ΑΌ, существует меньше определенности, касающейся того, какая форма пептида Αβ приводит к нейронной дисфункции и как она действует. Преобразование мономерного пептида Αβ в большие отложения амилоидных бляшек проходит через несколько стадий, и промежуточные формы могут быть причиной нейронной дисфункции при ΑΌ. Соответственно, терапевтическое вмешательство фокусируется на уменьшении уровня пептида Аβ и предотвращении образования амилоидных бляшек. Такие подходы имеют некоторый успех и включают, например, иммунизацию пептидом Аβ и пассивное введение антител анти-пептид Αβ. См., например, Вагб е! а1., №11иге Меб. 6: 916-19 (2000); НоНхшап е! а1., Αάν. Эгид ПеБуегу Кеу. 54: 1603-13 (2002); и международные Патентные Заявки №№ \νθ 99/27944, νΟ 00/72876 и νΟ 00/72880. Однако остается неотложная необходимость в изобретении дальнейшего терапевтического лечения для ΑΌ.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение базируется на открытии, что лечение полипептидами растворимого рецептора Νοβο уменьшает уровень пептида Аβ и такое лечение антагонистом рецептора Νοβο, таким как полипептид растворимого рецептора Νοβο, уменьшает продукцию пептида Аβ и отложение бляшек. На основании этих открытий изобретение обеспечивает способы лечения состояний, связанных с отложением амилоидных бляшек, включая болезнь Альцгеймера, введением полипептидов растворимых фрагментов рецептора Νοβο и антагонистов рецептора Νοβο.

В некоторых вариантах воплощения изобретение обеспечивает способ уменьшения уровня пептида Аβ у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества полипептида растворимого рецептора Νοβο. В некоторых вариантах воплощения уровни пептида Аβ повышены в связи с заболеванием, расстройством или состоянием. В некоторых вариантах воплощения изобретения заболеванием, расстройством или состоянием является болезнь Альцгеймера.

В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептид растворимого рецептора Νοβο вводят болюсной инъекцией или хронической инфузией. В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептид растворимого рецептора Νοβο вводят внутривенно. В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептид растворимого рецептора Νοβο вводят непосредственно в центральную нервную систему. В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептид растворимого рецептора Νοβο вводят непосредственно в латеральный желудочек.

В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидом растворимого рецептора Νοβο является растворимая форма ΝβΚ1 млекопитающего. В некоторых вариантах воплощения изобретения растворимая форма ΝβΚ.1 млекопитающего: (а) включает аминокислоты 26-310 человеческого ΝβΚ1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 3) с до десяти стабильных замещений аминокислот; и (Ь) не имеет (1) функционального трансмембранного домена и (ίί) функционального сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения изобретения растворимая форма ΝβΚ1 млекопитающего: (а) включает аминокислоты 26-344 человеческого ΝβΚ1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4) с до десяти стабильных замещений аминокислот; и (Ь) не имеет (1) функционального трансмембранного домена и (ίί) функционального сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения изобретения растворимая форма ΝβΚ1 млекопитающего: (а) включает аминокислоты 27-310 крысиного ΝβΚ1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5) с до десяти стабильных замещений аминокислот; и (Ь) не имеет (ί) функционального трансмембранного домена и (ίί) функционального сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения изобретения растворимая форма ΝβΚ1 млекопитающего: (а) включает аминокислоты 27-344 крысиного ΝβΚ1 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6) с до десяти стабильных замещений аминокислот; и (Ь) не

- 1 009643 имеет (ί) функционального трансмембранного домена и (ίί) функционального сигнального пептида.

В некоторых вариантах воплощения изобретения растворимая форма человеческого Ν§Κ.1 кроме того включает сшитый компонент. В некоторых вариантах воплощения изобретения сшитым компонентом является иммуноглобулиновый компонент. В некоторых вариантах воплощения изобретения иммуноглобулиновым компонентом является компонент Ре.

В некоторых вариантах воплощения изобретения терапевтически эффективное количество составляет от 0,001 до 10 мг/кг. В некоторых вариантах воплощения изобретения терапевтически эффективное количество составляет от 0,01 до 1,0 мг/кг. В некоторых вариантах воплощения изобретения терапевтически эффективное количество составляет от 0,05 до 0,5 мг/кг.

В некоторых вариантах воплощения изобретение обеспечивает способ предотвращения или лечения заболевания, расстройства или состояния, ассоциированных с бляшками пептида ЛЬ у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества антагониста Ν§Κ1. В некоторых вариантах воплощения изобретения бляшки находятся в центральной нервной системе. В некоторых вариантах воплощения изобретения заболеванием, расстройством или состоянием является болезнь Альцгеймера.

В некоторых вариантах воплощения изобретения антагонист Ν§Ρ 1 вводят непосредственно в центральную нервную систему. В некоторых вариантах воплощения изобретения антагонист Ν§Ρ1 вводят непосредственно в латеральный желудочек. В некоторых вариантах воплощения изобретения антагонист Ν§Ρ1 вводят болюсной инъекцией или хронической инфузией.

В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидом растворимого рецептора Νο§ο является растворимая форма Ν§Κ.1. В некоторых вариантах воплощения изобретения растворимая форма Ν§Κ1 млекопитающего: (а) включает аминокислоты 26-310 человеческого Ν§Β1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3) с до десяти стабильных замещений аминокислот; и (Ь) не имеет (1) функционального трансмембранного домена и (ίί) функционального сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения изобретения растворимая форма Ν§Ρ 1 млекопитающего: (а) включает аминокислоты 26-344 человеческого Ν§Ρ1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 4) с до десяти стабильных замещений аминокислот; и (Ь) не имеет (1) функционального трансмембранного домена и (ίί) функционального сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения изобретения растворимая форма Ν§Ρ1 млекопитающего: (а) включает аминокислоты 27-310 крысиного Ν§Κ.1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 5) с до десяти стабильных замещений аминокислот; и (Ь) не имеет (ί) функционального трансмембранного домена и (ίί) функционального сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения изобретения растворимая форма Ν§Ρ1 млекопитающего: (а) включает аминокислоты 27-344 крысиного Ν§Ρ1 (8Е(3 ΙΌ ΝΟ: 6) с до десяти стабильных замещений аминокислот; и (Ь) не имеет (ί) функционального трансмембранного домена и (ίί) функционального сигнального пептида.

В некоторых вариантах воплощения изобретения растворимая форма Ν§Ρ1 млекопитающего кроме того включает сшитый компонент. В некоторых вариантах воплощения изобретения сшитым компонентом является иммуноглобулиновый компонент. В некоторых вариантах воплощения изобретения иммуноглобулиновым компонентом является компонент Рс.

В некоторых вариантах воплощения изобретения антагонист Ν§Κ1 включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с Ν§Ρ1 млекопитающего. В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело выбирают из группы, состоящей из поликлонального антитела, моноклонального антитела, фрагмента РаЬ, фрагмента РаЬ', фрагмента Р(аЬ')2, фрагмента Ρν и фрагмента Еб. диатела и одноцепочечного антитела. В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается полипептидной связью с моноклональным антителом, продуцированным гибридомой, выбираемой из группы, состоящей из: НВ 7Е11 (АТСС® каталожный № РТА-4587), НВ 1Н2 (АТСС® каталожный № РТА-4584), НВ 365 (АТСС® каталожный № РТА-4586), НВ 5В10 (АТСС® каталожный № РТА-4588) и НВ 2Е7 (АТСС® каталожный № РТА-4585). В некоторых вариантах воплощения изобретения моноклональное антитело продуцируется гибридомой НВ 7Е11. В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептид включает последовательность аминокислот из группы, состоящей из: ΑΑΑΕΟΕΤΕΕΕρΕΌΕδΌΝΑρΕΚ. ЛТ) ΙΌ ΝΟ: 7); ΕΙΙΕδΙΙΧΑΟΕΙΙ ЛТ) ΙΌ ΝΟ: 8); ΕΌΕ8ΌΌΑΕΕΒ (δ!Ε) ΙΌ ΝΟ: 9); ΕΙΙΕΑδΙΙΧΑΟΕΙΙ (δ!Ε) ΙΌ ΝΟ: 10); ΕΙ)ΕΑ8Ι)Ι)ΑΕΕΙ1 (8ΕΌ ΙΌ ΝΟ: 11); ΕΌΑΕ8ΌΝΑΡΕΒ (8Е6 ΙΌ ΝΟ: 12); ΕΙ)ΑΕ8Ι)Ι)ΑΕΕΙ1 (δ!Ε) ΙΌ ΝΟ: 13); ΕΟΕδδυΧΑΟΕΗ (δ ЕС) ΙΌ ΝΟ:14); ΕΙΙΕδδΙΙΕΑΕΕΙΙ (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 15); ΌΝΑρΕΒννΌΡΤΤ (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 16); □ΝΑΟΕΙ! (8ЕС) ΙΌ ΝΟ: 17); Α^^δ^ΧΑ^^ΒVV^ΡΤΤ (δ ЕС) ΙΌ ΝΟ: 18); ^Α^δ^ΧΑ^^ΒVV^ΡΤΤ (δ ЕС) ΙΌ ΝΟ: 19); ^^^δ^ΧΑΑ^ΒVV^ΡΤΤ (δ ЕС) ΙΌ ΝΟ: 20); ΕΟΕδΌΝΑΟΕΗ\ΑΌΡΤΤ (δ ЕС) ΙΌ ΝΟ: 21); и ΕΌΕδΌΝΑρΕΑννΌΡΤΤ (δΡΤ) ΙΌ ΝΟ: 22).

- 2 009643

Подробное описание изобретения

Если не определено иначе все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют такие же значения как обычно понимаются специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае конфликта, настоящая заявка включает определения, которые должны контролироваться. Если иначе не требуется по контексту, термины в единственном числе включают множественное и термины во множественном числе включают единственное число. Все публикации, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, включены в виде ссылки полностью для любой цели как будто каждая отдельная публикация или патентная заявка были специфически и отдельно показаны для включения в виде ссылки.

Хотя способы и вещества, подобные или эквивалентные таковым, описанным в данном описании, могут быть использованы в практике или исследовании настоящего изобретения, подходящие методы и материалы описаны ниже. Материалы, методы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены быть ограничивающими. Другие характеристики и преимущества изобретения будут очевидными из подробного описания и из формулы изобретения.

На протяжении этой спецификации и формулы изобретения, слово «включает» или вариации, такие как «включает» или «включающий» показывает включение любого цитированного целого числа или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или группы целых чисел.

С целью дальнейшего определения настоящего изобретения, представлены следующие термины и определения.

В настоящем описании «антитело» обозначает интактный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитела по настоящему изобретению могут быть любого изотипа или класса (например, М, Ό, С и А) или любого подкласса (например, С1-4, А1-2) и могут иметь легкую цепь или каппа (к) или лямбда (λ).

«Гуманизированное антитело» обозначает антитело, в котором, по меньшей мере, часть нечеловеческой последовательности замещена человеческими последовательностями. Примеры получения гуманизированных антител описаны в патентах США №№ 6054297, 5886152 и 5877293.

«Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному, в дозировках и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого терапевтического результата.

«Профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному, в дозировках и в течение необходимых периодов времени, для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, так как профилактическая доза используется у субъектов, перед или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньшим чем терапевтически эффективное количество.

В настоящем описании «пациент» обозначает млекопитающее, например человека.

В настоящем описании «сшитый белок» обозначает белок, включающий первый полипептид, сшитый со вторым гетерологичным полипептидом.

В настоящем описании «антагонист рецептора Νοβο» обозначает молекулу, которая ингибирует связывание рецептора Νοβο-1 с лигандом (например, ΝοβοΛ. ΝοβοΒ, ΝοβοΓ. МАС, ОМ-βρ).

В настоящем описании «полипептид рецептора Νοβο» включает и белок рецептора-1 Νοβο полной длины, и его фрагменты, которые связывают пептид Ав или антагонизируют функции рецептора Νοβο.

Первый аспект изобретения основывается на открытии, что полипептиды растворимого рецептора Νοβο связываются непосредственно с пептидом Ав. Следовательно, без связи с теорией, видимо, полипептиды растворимого рецептора Νοβο могут действовать как поглотитель пептида Ав ίη νίνο. Этот механизм может быть использован для уменьшения уровня пептида Ав в циркулирующей крови, в месте отложения, или в обоих, таким образом ингибируя образование амилоидных бляшек или уменьшая размер существующих бляшек. Так как одним участком действия является кровоток, изобретение благоприятно избегает требований введения полипептидов растворимого рецептора Νοβο в центральную нервную систему (ЦНС). Однако, необходимо отметить, что полипептиды растворимого рецептора Νοβο могут вводиться непосредственно в ЦНС вместо или в добавление к системному введению.

Второй аспект изобретения основан на открытии, что полипептиды растворимого рецептора Νοβο или другие антагонисты рецептора Νοβο, например антитела анти-рецептор Νοβο вмешиваются в функцию рецептора Νοβο в ЦНС. Это приводит к уменьшению уровня пептида Ав и уменьшению отложения бляшек. В этом механизме, место действия полипептидов растворимого рецептора Νοβο или других антагонистов рецептора Νοβο располагается в ЦНС. Без намерений быть связанным с теорией, повидимому, по меньшей мере одним эффектом ингибирования функции ΝβΚ. является уменьшение обработки АРР, который дает пептид Ав.

Антагонисты рецептора Мщо

Любой антагонист рецептора Νοβο может быть использован в способах по изобретению. Например, антагонисты рецептора Νοβο, которые могут быть использованы в способах по изобретению, включают, но не ограничиваются, полипептиды растворимого рецептора-1 Νοβο; антитела, которые связываются с белком рецептора Νοβο и антиген-связывающие фрагменты таких антител; и низкомолекулярные анта- 3 009643 гонисты.

Растворимые полипептиды рецептора-1 Νοβο

В некоторых вариантах воплощения изобретения используют полипептид растворимого рецептора1 Νοβο (рецептор-1 Νοβο также по-разному называют как «рецептор Νοβο», «ΝοβοΚ», «ΝοβοΡ-1», «ΝβΡ» и «Ν§Β-1»). Рецептор-1 Νοβο полной длины состоит из сигнальной последовательности, Ν-концевого участка (ΝΤ), восьми обогащенных лейцином повторов (ЬВК), участка ЬВКСТ (домен богатых лейцином повторов на С-конце восьми обогащенных лейцином повторов), С-концевого участка (СТ) и якоря СР1.

Последовательности человеческого и крысиного полипептидов рецептора Νοβο показаны в табл. 1. Таблица 1. Последовательности человеческого и крысиного полипептидов рецептор-1 Νοβο

Человеческий полипептид рецептора Иодо: 5Е<2 Ю N0: 1

МККАЗАСОЗКИАЧУУЫУиЗАУУрУААРСРОАСУСУНВРКУТГ 5СКг001^АУРУО1РАА50ШРШО1®15НУРАА5П1АСКМЬТ1Ъ 1¥1ЖЫУЬА1Ш>АААБтаЕА1ЕЕ91ПС8ППАОи15УОРАТРНОЬ ОКиГГиШЖСОиЗЕГйРбЕЕКСГЛАЬрУЪУЪрОНАЬрАЬРПП ΊΤΊωΕΟ^ΤΗΠ⁷ΙΛΟΝΜ58νΡΕΚΑΕΕΟΕΗ5ΕΟΚΕΕΕΗ6ΝΚνΑΗ νΗΡΗΑί^ΙΧ®ΙΜΓΕΥΙΈΑΜ4Ι5ΑΙΡΤΕΑΙΛΡΕΚΑΙΛ3ΥΕΚΙ44ϋ ЦРУГУСДХЖА11РЫ1?А1ИЛ}КНЮ888ЕУРС8ЕРОКЕА<ЭМ>иКК1А АТ®Ь06САУАТС1РУНР£\МТСЙАТПЕЕРЬСЕРК:СС0₽0ААОКА

Крысиный полипептид рецептора Иодо: 5Е<2 Ю ΝΟ: 2

МККА58ба8КЕРТУЛЩ\¥ЬрАУЛ1УАТРСРСАСУС¥ХЕРКУТТ5 ВР00С1Х}АУ₽АО1РА5801Ш^,11К£ЫК15УУРАА5Р08СМ41.Т1ЬУ^ Ш8ИА1АОГОАААРТСЕТЕ1^ЕОЕ5ЬМАрЕВ.УУОРТТРКСЕСН 1ШЕСМЕТНиТНСКК1Р8УРЕНАРКОЕН5ЕОКЕЕЕНрЧНУАКУН РНА1Ла>1ЛЯГОИГ1ЪУЕРАННЬ8Ми>АЕУЬУРПЩи2¥ЕК1М)КР ПШК^УА»даВ1ТОП«?ЕТОЕЕ1ХОЕРКСС9РОААОКА

Растворимые полипептиды рецептора Νοβο, применимые в способах по изобретению, включают ΝΤ домен; 8 ЬВК и домен ШРОТ и не имеют сигнальной последовательности и функционального якоря СР1 (т.е. не имеют якоря СР1 или имеют якорь СР1, который не может эффективно связываться с клеточной мембраной). Подходящие полипептиды включают, например, аминокислоты 26-310 (8Еф ГО ΝΟ: 3) и 26344 (8ЕС ГО ΝΟ: 4) человеческого рецептора Νοβο и аминокислоты 27-310 (8Еф ГО ΝΟ: 5) и 27-344 (8Еф ГО ΝΟ: 6) крысиного рецептора Νοβο (табл. 2). Дополнительные полипептиды, которые могут быть использованы в способах по изобретению, описаны, например, в Международных Патентных Заявках РСТ/и802/32007 и РСТ/и803/25004.

Таблица 2. Растворимые полипептиды рецептора Νοβο от человека и крысы

Человеческий 26-310 ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 3	РСРОАСУСИШРКУТТ8СР00<ЯХ2АУРУС1РАА50К1ГЕН(ЗЫК18 Н¥РААЯИ1АСдаП,т1Ми13ГШ,АКГОАААЕГС1Л1ХЕ911)Е8О ЫАр1Д5УОРАТта<а(ЯШГП1ПаЭкСОЕЧЕ1ЛРОЕРК.О1ААЕ0 ¥ЬУиЛ>ЦАЕ0А1Д№ТТВСЕСЙ4ЕТНЕри1СЬЩ158УРЕКАГК.ОЕ НЗиЗК£ЬШ(^УАНУНРНАНШиЖ1ГП.¥ЪРА»®<Е8АЕРТВ А1ЛИЯАЕ5У1КЕМЗ»<Р1УУСОСВАКРЕ^ГА^1ЛЗКЯ1О388ЕУРС 3ΙΤΟΚ1ΛΟΜ>ΕΚΐαΛΑΝΤ>ΕΟ<1€Α
Человеческий 26-344 8Е<2 Ю ΝΟ: 4	Ра^>ОАСУСУЧЕРКУТГ8СР00О1Х2АУРУО1РАА59К1РЬНО1ЩВ ЯУРАА5ЕЮ^СКМ,ТП,1Ш181тЛКГОАААГТ0ЕА11В(}и5Е8О ΝΑςΐ318νϋΡΑΤΡΗαΐΧ;ΚΕΗΤ1ΗΙ13Β.ΟΟΕρΕΙΌΡΟΗ^:καΕΑ?4.9 ΥΕΥΙΧ2ΟΝΑΙΧ)ΑΙ1Τ3θτΠ»^ΝΕΤΗΕΓΕΗαΝΜ85νΡΕΚΑΓΚΟί Н51ЛШХ1Я<^УАНУНРНАЯФ1ХЖ1Лт.¥ЬРАМ4Е8А1РТВ А1ЛР11^Щ}У11ШЮМР^УС1КЖАКРЬ1*ГА¥П>ЭКИ1.О883ВУРС 81Х!К1А<^и®1ААКОиХЗСАУАТ<ЭРУНР1«ТСКАТОЕетЬ СЬРКССрРРААРКА
Крысиный 27- 310 ЗЕО Ю N0: 5	€Ρ6Α€νσΥ№3ΡΚνΊ3·8ΚΡ000ΕρΑνΡΑαΐΡΑ380№·ΕΗΟΝ'ΚΙδΎ УРААЖ(8СЯМЕТ1Е«гН8МАЬА0Е>АААГТСЕТЕ1^Е0150К Ар1ЩУУ01ЧТРКЩОНитД113ЭкС01ЮЕЕОРаШ<СЬАА1>рУ Г.У1Х1ОИИЕрАЕЮИТРКО1Х7ЧТ.ТН1ЪТ.Н(ЗИКП'8УРЕНАГКОЕЯ ЗИЖШШрННУАКУНРНАРКРЦОКТМТЬУЕРАИЯЬЗМЕР.АЕУ ΕνΡΙΛ^ΥΠΚίΠ>ΝΡνν€ΙΧ!ΚΑΚΡΕ\νΑ5νΐΛ2ΚΡΚΟ858σνΡ8Ν ЦРОКЪАОМтККТАТЗОШССА
Крысиный 27- 344 ЗЕО ЮНО: 6	СРОАСУСУКЕРКУТгаКРООбЬрАУРАСгРАЗЗрЮЕЦНОКККУ УРААЗРрЗСККЫТЬ'ЙТЛЯМАЕАОГОАЛАКГОЫТЪЕрЕОЬдОН АЦ1ЯУ7ЦРТП^аЛЖЬНТЕНи>КСО1ХгЕиЯЧЗи^С1ЛА1Л}У ΕΥΕΡϋΝΝΕφΑΕΡΟΝΤΡΚηΕΟί^ΤΗΕΓΕΗΟΡΠυΡδνΡΕΗΑΕΚΟΕΗ ЗШИ^ЕШЦЫНУАКУНРИАГКРЕСКЕМТЕУЕРАКЧЕЗМЕРАЕУ ΕνΡΕΚ5Ε<3ΥΕΚΕ№ΝΡ\ννσΡΓΚΑΚΡΕΧνΑ'Λ4Τ3ΚΡΚ6δ83θνΡ8Ν ЬР21ЦАС№1КМАТ8ОЕЕ(Х1АУА5аРЕК1Т0П«2ЬТРЕЕШЗЕ РКСССЗРЦДАРКА

Сшитый белок, который включает растворимый полипептид рецептора Νοβο, может быть использован в способах по изобретению. В некоторых вариантах воплощения изобретения гетерологичным

- 4 009643 компонентом сшитого белка является постоянный домен иммуноглобулина. В некоторых вариантах воплощения изобретения постоянным доменом иммуноглобулина является постоянный домен тяжелой цепи. В некоторых вариантах воплощения изобретения гетерологичным полипептидом является фрагмент Ре. В некоторых вариантах воплощения изобретения Ре присоединен к С-терминальному концу полипептида растворимого рецептора Νο§ο. В некоторых вариантах воплощения изобретения сшитый белок рецептора Νο§ο является димером, например сшитым димером Рс.

Антитела

В некоторых способах по изобретению используют антагонист рецептора Νο§ο. который является антителом или его антиген-связывающим фрагментом. который специфически связывается с иммуногенным полипептидом рецептора-1 Νο§ο и ингибирует связывание рецептора-1 Νο§ο с лигандом (например. ΝοβοΛ. ΝοβοΒ. Νοβοί’. МАС. ОМ-др). Антитело или антиген-связывающий фрагмент. применимые в таких способах по изобретению. могут быть получены ίη νίνο или ίη νίΐτο. В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело анти-рецептор-1 Nοдο или его антиген-связывающий фрагмент является мышиным или человеческим. В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело анти-рецептор1 Nοдο или его антиген-связывающий фрагмент является рекомбинантным. сконструированным. гуманизированным и/или химерным. В некоторых вариантах воплощения изобретения антитело выбирают из антител. описанных в Международной Патентной заявке № РСТ/И803/25004. Антитела. применимые в настоящем изобретении. могут использоваться с модификацией или без модификации.

Примерными антиген-связывающими фрагментами антител. которые могут быть использованы в способах по изобретению. являются РаЬ. РаЬ'. Р(аЬ')₂. Ρν. Рб. бАЬ и фрагменты. содержащие фрагменты региона. определяющего комплементарность (СПЯ). одноцепочечные антитела (5сРу). химерные антитела. диатела и полипептиды. которые содержат по меньшей мере часть иммуноглобулина. которая является достаточной для придавания специфического связывания антигена полипептиду (например. иммуноадгезины).

Как используется в настоящем описании. Рб обозначает фрагмент. который состоит из доменов ν_Ηи С_н; Ρν обозначает фрагмент. который состоит из доменов VI, и ν_Η одного плеча антитела; и бАЬ обозначает фрагмент. который состоит из домена ν_Η (\Уагб е! а1.. Ыа!иге 341: 544-46 (1989)). Как используется в настоящем описании. одноцепочечное антитело (5сРу) обозначает антитело. в котором участок VI, и участок ν_Η спарены с образованием одновалентных молекул посредством синтетического связующего звена. который позволяет их сделать в виде одиночной белковой цепи (В1гб е! а1.. 8с1епсе 242: 423-26 (1988) и Ηπδΐοη е! а1.. Ргос. №11. Асаб. δα. И8А 85: 5879-83 (1988)). Как используется в настоящем описании. диатело обозначает биспецифическое антитело. в котором домены ν_Η и V экспрессируются на одиночной полипептидной цепи. но с использованием связующего звена. которое является слишком коротким. чтобы позволить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи. таким образом. способствуя тому. чтобы домены спаривались с комплементарными доменами другой цепи и образовывали два антиген-связывающих участка (см.. например. ^Шдет е! а1.. Ргос. №11. Асаб. δα. И8А 90: 644448 (1993) и Ρο1|3Κ е! а1.. 8!гис!ите 2: 1121-23 (1994)).

Иммунизация

Антитела для использования в способах по изобретению могут быть созданы иммунизацией подходящего хозяина (например. позвоночных. включая людей. мышей. крыс. овец. коз. свиней. крупного рогатого скота. лошадей. рептилий. рыб. амфибий и в яйцах птиц. рептилий и рыб). Такие антитела могут быть поликлональными или моноклональными. Для обзора способов получения таких антител см.. например. Ηοίοιν апб Ьапе (1988). Аηί^Ьοб^е8. А ^аЬο^а!ο^у Мапиа1; Уе1Юп е! а1.. Апп. Рем. οί Вюсйет.. 50: 657-80 (1981); и АисиЬе1 е! а1. (1989). Сиггеп! Ρτοίο^Π ш Μο^υ^ Βίο1ο§ν (№\ν Υο6<: 6ο1ιιτ \Убеу & δοπδ). Иммунореактивность антитела с иммуногенным полипептидом рецептором Nοдο может быть определена любым подходящим методом. включая. например. иммуноблоттинговый анализ и ЕЫ8А. Моноклональные антитела для использования в способах по изобретению могут быть сделаны обычными методиками. как описано. например. в Ηοίοιν апб Ьапе (1988). кирга.

Хозяин может быть иммунизирован иммуногенным полипептидом рецептором-1 Nοдο. с или без добавки. Подходящие полипептиды описаны в. например. Международных Патентных Заявках РСТ/И801/31488. РСТ/И802/32007 и РСТ/И803/25004. Хозяин также может быть иммунизирован рецептором-1 Nοдο. ассоциированным с клеточной мембраной интактной или нарушенной клетки. и антитела идентифицировали связыванием с полипептидом рецептора-1 Nοдο. Другие подходящие методики для получения антител включают обработку лимфоцитов ш νίΐτο рецептором-1 Nοдο. или иммуногенным полипептидом по изобретению. или. альтернативно. выбором библиотек антител в фаге или подобных векторах. См. Ηυ^ е! а1.. 8аепсе 246: 1275-81 (1989).

Антитела анти-рецептор-1 Nοдο. применимые в способах по изобретению. также могут быть выделены скринингом библиотеки рекомбинантных комбинаторых антител. Методологии для получения и скрининга таких библиотек известны в области техники. Существуют коммерчески доступные способы и материалы для получения библиотек воспроизведения фагов (например. 1Пе Рйаттааа ЯесοтЬ^ηаη! Рйаде Апб^бу 8уйет. са!а^д πο. 27-9400-01; набор воспроизведения фагов !йе 8!та!адепе 8ит12АР™. са!а^д πο. 240612; и другие от ΜοΓρΙιοδλ'δ). После скрининга и выделения антитела анти-рецептор Nοдο 1 из

- 5 009643 библиотеки воспроизведения рекомбинантного иммуноглобулина, нуклеиновая кислота, кодирующая выбранное антитело, может быть восстановлена из экспозиционной упаковки (например, из генома фага) и субклонирована в другие векторы экспрессии посредством стандартных ДНК методик. Для экспрессии антитела, выделенного скринингом комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую тяжелую цепь и легкую цепь антитела или его различные участки, клонируют в рекомбинантном векторе экспрессии и вводят в клетку-хозяин.

Применение антагонистов рецептора Νθ§θ

Настоящее изобретение относится к способам лечения заболеваний, включающих нарушенное отложение пептида Άβ , введением антагонистов рецептора Νο§ο. Антагонисты рецептора Νο§ο. применимые в способах по изобретению, включают, но не ограничиваются ими, полипептиды растворимого рецептора Νο^ο, антитела к белку рецептора Νο§ο и его антиген-связывающие фрагменты и низкомолекулярные антагонисты. В некоторых вариантах воплощения изобретения нарушенное отложение пептида Αβ связано с заболеванием, расстройством или состоянием, например болезнью Альцгеймера.

Применение полипептидов растворимого рецептора Νθ§θ

Настоящее изобретение также относится к способам уменьшения уровня пептида Αβ введением полипептидов растворимого рецептора Νο§ο. В некоторых из таких вариантов воплощения изобретения уровень пептида Αβ повышен в связи с заболеванием, расстройством или состоянием, например болезнью Альцгеймера.

Фармацевтические композиции

Полипептиды растворимого рецептора Νο§ο и антагонисты рецептора Νο§ο, используемые в способах по изобретению, могут быть составлены в фармацевтические композиции для введения млекопитающим, включая людей. Фармацевтические композиции, применимые в способах по настоящему изобретению, включают фармацевтически приемлемые носители.

Фармацевтически приемлемые носители, используемые в таких фармацевтических композициях включают, например, ионобменные смолы, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки плазмы, такие как альбумин человеческой сыворотки, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, динатрий фосфат, дикалий фосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основании целлюлозы, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлозу натрия, полиакрилаты, воски, блокполимеры полиэтилена-полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.

Композиции, используемые в способах по настоящему изобретению, могут вводиться любым подходящим способом, например парентерально, интравентрикулярно, перорально, посредством ингаляции спрея, местно, ректально, назально, буккально, вагинально или посредством имплантированного резервуара. Термин «парентеральный», как используется в настоящем описании, включает методики подкожных, внутривенных, внутримышечных, внутрисуставных, интрасиновиальных, внутригрудинных, интратекальных, внутрипеченочных, в место повреждения и интракраниальных инъекции или инфузии. Как описано ранее, антагонисты рецептора Νο§ο, применимые в способах по изобретению, действуют в ЦНС, что приводит как к уменьшению уровня пептида Άβ, так и уменьшению отложений бляшек. Соответственно, в способах по изобретению, в которых используются антагонисты рецептора Νο§ο, антагонист рецептора Νο§ο должен проходить гематоэнцефалический барьер. Такое прохождение может происходить в результате физико-химических свойств, свойственных самой молекуле антагониста рецептора Νο^ο, других компонентов в фармацевтической композиции или применения механического устройства, такого как игла, канюля или хирургические инструменты для нарушения гемато-энцефалического барьера. Когда антагонист рецептора Νο§ο является молекулой, которая самостоятельно не проникает через гемато-энцефалический барьер, подходящими путями введения являются, например, интратекальный или интракраниальный, например, непосредственно в латеральный желудочек. Когда антагонист рецептора Νο§ο является молекулой, которая самостоятельно проникает через гемато-энцефалический барьер или когда полипептид растворимого рецептора Νο§ο используется в способе по изобретению, где непосредственное связывание с пептидом Άβ приводит к уменьшению уровня пептида Άβ - путь введения может быть посредством одного или более из различных путей, описанных ниже.

Стерильными инъекционными формами композиций, применимых в способах по настоящему изобретению, могут быть водные или масляные суспензии. Такие суспензии могут быть получены в соответствии с методиками, известными в данной области, с использованием подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов. Стерильным инъекционным препаратом также может быть стерильный инъекционный раствор или суспензия в нетоксическом парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, как раствор в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть использованы, находятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла обычно применяют в качестве растворителя или суспендирующей среды. С этой целью любое легкое нелетучее масло может быть использовано, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая ки

- 6 009643 слота и ее глицеридовые производные являются применимыми в получении инъекций, как и естественные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированных вариантах. Такие масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или дисперсант, такой как карбоксиметилцеллюлоза или подобные диспергирующие агенты, которые обычно используют в получении фармацевтически приемлемых лекарственных форм, включая эмульсии и суспензии. Другие обычно используемые поверхностноактивные вещества, такие как Т\уссп. 8рап и другие эмульгирующие агенты или усилители биодоступности, которые обычно используют в производстве фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм, также могут быть использованы для целей рецептирования.

Парентеральные композиции могут быть однократной болюсной дозой, инфузией или нагрузочной болюсной дозой с последующей поддерживающей дозой. Такие композиции могут вводиться один раз в день или «при необходимости».

Определенные фармацевтические композиции, используемые в способах по настоящему изобретению, могут вводиться перорально в любой перорально доступной лекарственной форме, включая, например, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. Определенные фармацевтические композиции также могут вводиться посредством назального аэрозоля или ингаляции. Такие композиции могут быть получены в виде растворов в солевом растворе, с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, усилителей всасывания для усиления биодоступности, фторуглеродов и/или других обычных растворяющих или диспергирующих агентов.

Количество полипептида растворимого рецептора Νο§ο или антагониста рецептора Νο^ο, которое может быть комбинировано с веществами носителями для получения однократной лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от организма, получающего лечение и определенного типа введения. Композицию можно вводить как однократную дозу, множественные дозы или в течение установленного периода времени в инфузии. Схема введения также может быть установлена для получения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа).

В способах по изобретению применяют «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» полипептида растворимого рецептора Νο§ο или антагониста рецептора Νο§ο. Такое терапевтически или профилактически эффективное количество может варьироваться в соответствии с факторами, такими как состояние болезни, возраст, пол и вес пациента. Терапевтически или профилактически эффективным количеством является также таковое, в котором любые токсические или вредные эффекты перевешиваются терапевтически полезными эффектами.

Специфическая дозировка и схема лечения для любого определенного пациента будет зависеть от множества факторов, включая определенный используемый полипептид растворимого рецептора Νο§ο или антагонист рецептора Νο^ο, возраст пациента, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету, и времени введения, скорости экскреции, комбинации лекарственных средств и тяжести определенного состояния, подвергаемого лечению. Определение таких факторов медицинским персоналом находится в рамках обычного умения в области техники. Количество также будет зависеть от определенного пациента, получающего лечение, пути введения, типа композиции, характеристик используемого соединения, тяжести заболевания и желаемого эффекта. Используемое количество может быть определено посредством фармакологических и фармакокинетических принципов, хорошо известных в области техники.

В способах по изобретению антагонисты рецептора Νο§ο обычно вводят непосредственно в ЦНС, в желудочки головного мозга или интратекально, например, в латеральный желудочек. В способах по изобретению, где полипептид растворимого рецептора Νο§ο используют для уменьшения уровня пептида Αβ, полипептиды растворимого рецептора Νο§ο обычно вводят внутривенно. Композиции для введения по способам по изобретению могут быть изготовлены таким образом, чтобы вводить дозу 0,001-10 мг/кг массы тела в день антагониста рецептора Νο§ο. В некоторых вариантах воплощения изобретения доза составляет 0,01-1,0 мг/кг массы тела в сутки. В некоторых вариантах воплощения изобретения доза составляет 0,05-0,5 мг/кг массы тела в сутки.

Дополнительные активные соединения также могут быть включены в композиции, применимые в способах по изобретению. Например, антитела к рецептору Νο§ο или его антиген связывающие фрагменты или полипептид растворимого рецептора Νο§ο или сшитый белок могут быть совместно рецептированы с и/или совместно введены с одним или более дополнительными терапевтическими агентами.

Изобретение охватывает любой подходящий способ доставки для полипептида растворимого рецептора Νο§ο или антагониста рецептора Νο§ο к выбранной ткани-мишени, включая болюсную инъекцию водного раствора или имплантацию системы с регулируемым высвобождением. Применение имплантата с регулируемым высвобождением уменьшает необходимость в повторных инъекциях.

Полипептид растворимого рецептора Νο§ο или антагонисты рецептора Νο^ο, применимые в способах по изобретению, могут быть непосредственно введены в головной мозг. Различные имплантаты для непосредственной инфузии соединений в головной мозг известны и являются эффективными в доставке терапевтических соединений людям, страдающим от неврологических расстройств. Они включают хроническую инфузию в головной мозг с использованием насоса, стереотаксически имплантированного, временных интерстициальных катетеров, постоянных имплантатов интракраниальных катетеров и хи

- 7 009643 рургически имплантированных биоразлагаемых имплантатов. См., например, СШ е! а1., кирга; 8с11агГеп е! а1., Шдй ΑοΙίνίΙν 1обше-125 1п(сг5(1Па1 1тр1ап! Рог С1ютак, 1п!. 1. ΡαάίαΙίοη Опсо1оду Βίο1. Рйук. 24(4):583-91 (1992); Сакраг е! а1., Регтапеп! ¹²⁵Ι 1тр1ап!к Гог Весштеп! Майдпап! С1ютак, Ιηΐ. 1. Ваб1а!1оп Опсо1оду Вю1. РНук. 43(5):977-82 (1999); сйар!ег 66, радек 577-580, Ве11е//а е! а1., 8!егео1ас!ю 1п!егк!йа1 Вгасйу!йегару ш СйбепЬегд е! а1., ТехЛоок оГ 8!егео1ас!1с апб Рипс!юпа1 Иеигокигдегу, МсСга^-НШ (1998); апб Вгет е! а1., Тйе 8аГе1у оГ 1п!егк!1!1а1 Сйето1йегару χνίΐΐι ВСИи-Ьоабеб Ро1утег Ро11о\\'еб Ьу Ваб1а!юп 1йегару т !йе Тгеа1теп! оГ Ие\\1у О1адпокеб МаИдпап! СКотак: Рйаке I Тпа1, 1.Иеиго-Опсо1оду 26:111-23 (1995).

Композиции могут также включать полипептид растворимого рецептора Иодо или антагонист рецептора Подо, диспергированный в биосовместимом веществе-носителе, который действует как подходящая система доставки или поддержки для соединений. Подходящие примеры носителей замедленного высвобождения включают полупроницаемые полимерные матрицы в форме штампованных изделий, таких как суппозитории или капсулы. Имплантируемые или микрокапсулярные матрицы замедленного высвобождения включают полилактиды (патент США № 3773319; ЕР 58481), сополимеры Ь-глютамовой кислоты и гамма-этил-Ь-глютамата (81бтап е! а1., Вюро1утегк 22: 547-56 (1985)); поли(2гидроксиэтилметакрилат), этиленвинилацетат (Ьапдег е! а1., 1.Вютеб.Ма!ег.Век. 15:167-277 (1981); Ьапдег, Сйет. Тесй. 12:98-105 (1982)) или поли-О-(-)-3-гидроксимасляную кислоту (ЕР 133988).

В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептид растворимого рецептора Иодо или антагонист рецептора Иодо вводят пациенту непосредственной инфузией в соответствующий участок головного мозга. См., например, С111 е! а1., Опес! Ьгаш Шикюп оГ дйа1 се11 Кпе-бептеб пеигйгорЫс Гас!ог 1п Рагкшкоп б1кеаке, Иа!иге Меб. 9:589-95 (2003). Альтернативные методики доступны и могут применяться для введения полипептида растворимого рецептора Иодо или антагониста рецептора Иодо по изобретению. Например, стереотаксическое помещение катетера или имплантата может быть выполнено с использованием модуля Взесйеп-Мипбтдег и многоцелевого ограничивающего модуля ΖΌ (2атогапоОщо\'пу).

Сканирование усиленной контрастной компьютерной томографии (КТ) с инъекцией 120 мл омнипака, 350 мг йода/мл с толщиной среза 2 мм может сделать возможным трехмерное многослойное планирование лечения (8ТР, Р1кйег, РгеФигд, Сегтапу). Такое оборудование позволяет планировать на основании исследования магнитно-резонансных изображений, соединяя целевую информацию КТ и МРТ для ясного подтверждения цели.

Стереотаксическая система Ьекке11 (Оо\\'пк 8игдюа1, 1пс. Оеса!иг, СА), модифицированная для использования с КТ сканером СЕ (Сепега1 Е1ес!пс Сотрапу, Мй^аикее, ^Ι), а также стереотаксическая система Вго^п-ВоЬег1к-^е11к (ВВ^) (Вабюшск, Вй1тд!оп, МА) могут быть использованы для этой цели. Следовательно, в начале имплантации, круглое кольцевое основание стереотаксической рамки ВВ^ может быть прикреплено к черепу пациента. Серийные КТ сечения могут быть получены с 3 мм интервалами на протяжении (целевая ткань) участка с рамкой локализатора графитового нагревательного стержня, прижатого к основной пластинке. Компьютеризованная программа планирования лечения может быть запущена на компьютере УАХ 11/780 (01Ц11а1 Ес.|шртеп1 Согрогабоп, Маупагб, Макк.) с использованием КТ координат изображений графитового стержня для составления схемы между КТ пространством и пространством ВВ^.

Примеры

Пример 1. Внутриклеточная локализация ИдВ и Иодо нарушена при болезни Альцгеймера

Авторы получали образцы ткани головного мозга человека с болезнью Альцгеймера (АО) и контрольные образцы из И1Н Нагтагб Вгаш Т1ккие Векоигсе Сеп!ег и исследовали их гистологически для определения локализации ИодоА и ИдВ с использованием антител анти-ИодоА и анти-ИдВ (см. ^апд е! а1., ТИенгоксг 22:5505-15 (2002). Ткань из гиппокампа и области Бродмана 44 исследовали в шести контрольных случаях и шести случаях АО. Специфичность окрашивания подтверждали блокадой антигена и присутствием одиночной иммунореактивной полоски на иммуноблотах.

В контрольном головном мозге взрослого человека, иммунореактивность ИодоА определялась в диффузном гранулярном рисунке в нейропиле этих участков головного мозга с небольшим клеточным окрашиванием. Наоборот, во всех случаях АО был резкий переход ИодоА в тела нейрональных клеток. Локализация ИдВ менялась противоположным образом. В контрольных случаях наибольшую концентрацию белка ИдВ обнаруживали в теле клеток, тогда как в случаях АО в головном мозге наблюдали диффузную иммунореактивность нейропилей и небольшое окрашивание клеток. Иммуноблоттинговый анализ с антителами анти-ИдВ подтвердил, что это было не из-за нарушенного уровня ИдВ и одновременное окрашивание антителами анти-ИодоА ясно показывало, что это не было из-за отсутствия нейронов. В добавление к переходу ИдВ из тела клеток, авторы наблюдали, что ИдВ концентрировался в амилоидных бляшках и двойная иммуногистохимия в отношении Ав и ИдВ демонстрировала, что два белка совместно располагались в этих отложениях. Такие находки предполагают, что путь ИодоА/ИдВ играет роль в патологии АО.

- 8 009643

Пример 2. АРР и множественные формы пептида Αβ взаимодействуют с ЫдК

На основании этих наблюдений авторы исследовали, взаимодействуют ли ЫодоА или ЫдК непосредственно с АРР. Меченные эпитопом конструкты ЫдК (ЫдК-тус создавали, как описано в Ьш е! а1., 8с1еисе 297:1190-93 (2002)) и АРР (АРР-У5; 1.М.А.О.Е. клон №5259793 субклонировали в рсЭЫА3.1У5Н18 для создания С-концевой сшивки с АРР-695) экспрессировали в клетках СО8-7 и проводили иммунопреципитацию с антителами анти-У5 и анти-тус. Иммуноблоты иммунопреципитированного материала затем метили антителами анти-У5, анти-тус и анти-ЫдК. Исследования иммунопреципитации продемонстрировали специфическую ассоциацию АРР с ЫдК. ЫодоА не определялся в иммунопреципитированном материале с использованием анти-ЫодоА. Авторы также отслеживали расположение меченных эпитопом АРР в трансфицированных клетках СО8-7 и обнаружили, что большая часть белка в контроле располагалась внутриклеточно в участках около ядра, но такая совместная экспрессия ЫдК с АРР перемещала большую часть АРР к поверхности клетки. Кроме того, расположение АРР и ЫдК было одинаковым в экспериментах двойной метки в трансфицированных клетках. Общий уровень клеточной экспрессии АРР не нарушался совместной экспрессией ЫдК. Более того, естественные белки АРР и ЫдК также были совместно локализованы в первичных нейронах, что определяли меткой антителами антиАРР (8ал1а Сги/ Вю1есйпо1оду) и анти-ЫдК. Такие результаты подтверждают физическую ассоциацию ЫдК с АРР.

Затем авторы исследовали, вовлечен ли Αβ участок АРР в его взаимодействие с ЫдК - включая связывает ли фибриллогенный пептид Ав 42-3 ЫдК. Авторы создали два конструкта сшитых белка, содержащие щелочную фосфатазу (ЩФ) и гидрофильный участок Ав (аминокислоты 1-28) сшивкой кодирующей последовательности в рамке с сигнальной последовательностью-6хН18-плацентарной щелочной фосфатазы (ЩФ) последовательности вектора рАР-6 (Ыакатига е! а1., Ыеигоп 2: 1093-1100, 1988). Белки АР-Λβ и Λβ-АР оба связывались с клетками СО8, экспрессирующими ЫдК, но не с клетками СО8, трансфицированными вектором. Такое взаимодействие определяли с использованием очищенного биотин-Аβ (1-40) в анализе типа ЕЬ18А с иммобилизованным ЫдК. Наоборот, перевернутый пептид 40-1 не взаимодействовал с иммобилизованным ЫдК в любом из этих экспериментов. Авторы также инкубировали Ε^^β 42 в течение 2 ч при 4°С с человеческими клетками 8ΚΝΜΟ. экспрессирующими человеческий ЫдК-1, и обнаружили, что фибриллогенный пептид Аβ 42 связывается с такими клетками.

Авторы также тестировали связывание пептида Αβ с полипептидом растворимого ЫдК, 8ЫдК310 (см., например, РСТ/и803/25004), как указано далее. 8ЫдК310 иммобилизовали на пластине микротитратора и наносили биотин-Аβ 1-40 или биотин-Аβ 40-1 в течение 16 ч при 4°С. После удаления несвязавшегося пептида, связанные биотин-Аβ определяли стрептавидин-конъюгированным НКР. Как с ЫдК полной длины авторы наблюдали, что биотин-Аβ 1-40, но не биотин-Аβ 40-1 связывается с §ЫдК310. Авторы также проводили такие эксперименты в присутствии антител анти-ЫдК, таких как моноклональное антитело НВ 7Е11 (описанное в РСТ/и803/25004) и обнаружили, что связывание биотин-Аβ 40-1 может быть ингибировано антителами анти-ЫдК. В отдельных экспериментах авторы подтвердили, что антитела анти-ЫдК также ингибировали связывание биотин-Аβ 40-1 и с клетками СО87, экспрессирующими крысиный ЫдК1 и с клетками 8КЫМС, экспрессирующими человеческий ЫдК1. Совместно эти данные подтверждают, что АРР и естественные формы пептида Аβ взаимодействуют непосредственно с ЫдК.

Специфичность и селективность взаимодействия Αβ (1-28) с ЫдК определяли несколькими путями. Взаимодействие было специфичным для ЫдК1, так как ни ЫдК2 или ЫдК3 - которые разделяли схожесть последовательности с ЫдК - не связывали Аβ-АР. Кроме того, авторы наблюдали видовую специфичность: человеческий ЫдК связывал человеческий Αβ в большей степени, чем мышиный ЫдК связывал человеческий Αβ или человеческий ЫдК связывал мышиный Αβ, или мышиный ЫдК связывал мышиный Аβ. Наконец, авторы исследовали нейроны, культивированные от мышей пдг-/-, созданных в лаборатории авторов (такие мыши имели делецию экзона II ЫдК и не продуцировали белка ЫдК) и обнаружили, что они не связывают ни Ыодо-66 фрагмент ЫодоА (см., например, международную патентную заявку РСТ/и801/01041 и РСТ/и802/32007), ни пептид Αβ.

Эти данные демонстрируют, что ЫдК является первичным участком связывания на поверхности нейрональных клеток для Αβ (1-28).

Для дальнейшего определения, какие остатки требуются для взаимодействия с ЫдК, авторы создали сшивки АР нескольких делеций в пептиде Αβ (1-28) и мониторировали связывание с ЫдК, экспрессируемым в клетках СО8-7, оценкой активности АР. Делеция 7 аминоконцевых остатков не нарушала связывание с ЫдК и делеция 14 аминоконцевых остатков умеренно уменьшала связывание ЫдК. Однако делеция аминокислот 1-16 отменяла связывание ЫдК. На карбокси-конце Αβ (1-28), мутант с усечением семи аминокислот не проявлял аффинности к ЫдК. Следовательно, аминокислоты 7-28 вовлечены в аффинность к ЫдК и аминокислоты 15-28 являются особенно важными. Согласуясь с такими наблюдениями, авторы обнаружили, что пептидные продукты естественной β-секретазы (содержащие аминокислоты 8-21), но не продукты расщепления α-секретазы (протеолизированные на аминокислоте 17) связывали

- 9 009643

Ν§Β.

Пример 3.

Αβ связывает сайт Ν§Κ отдельно от того, который связан миелиновыми лигандами. Авторы анализировали, является ли связывание Αβ (1-28) конкурентным для связывания ЫдВ с другими известными лигандами для ЫдВ, позволяя 250 мМ растворимого АР-Ав (1-28) или ΑΡ-Νο§ο (1-33) связываться с ячейками, покрытыми очищенным §Ν§Κ310-Εε в присутствии различных концентраций конкурирующего свободного Αβ.

В подобном эксперименте авторы также тестировали, связывается ли биотин-Ав (1-40) с крысиным δΝ§Κ344-Ρε. Авторы наблюдали, что пептид Αβ связывается и с δΝ§Κ310-Ρε и с δΝ§Κ344-Ρε. Следовательно, пептиды Αβ - как другие лиганды Ν§Ρ - требуют полного участка ЬКВ белка Ν§Ρ для связывания, но не требует карбоксильного конца из остатков 310-450. Однако Αβ (1-28) замещает связывание Аβ -АР, но не связывание ΑΡ-Νο§ο-66(1-33) или АР-ОМдр в конкурентных анализах. Пептид Αβ мог начинать замещать АР-ΜΑΟ очень немного при высоких концентрациях в экспериментах авторов. Следовательно, участок, связывающий Αβ на Ν§Ρ кажется значительно удаленным от такового для миелиновых лигандов Νο§οΑ. ОМдр и ΜΑΟ. Согласуясь с этим, присутствие Αβ имеет небольшой эффект на ингибирование миелином или Νο^ο-66 невритного роста.

Пример 4. Ν§Ρ усиливает продукцию Αβ

Так как одной из критических стадий в развитии ΑΌ является протеолитическая продукция Αβ из АРР, авторы оценивали эффект Ν§Ρ на этот процесс. Авторы трансфицировали клетки НЕК2 93Т Ν§Ρ и наблюдали, что кондиционированная среда из этих клеток содержит низкий, но определяемый уровень Аβ, который является сравнимым с таковым, наблюдаемым в клетках, экспрессирующих ΕΑΌ мутант ΑΡΡδν, показывая увеличенную обработку β-секретазой. Присутствие Ν§Ρ также увеличивало обработку α-секретазой, что показано фактом, что уровень δΑΡΡα также был увеличен экспрессией Ν§Ρ.

Для оценки значимости взаимодействия Ν§Ρ/Αβ на обработку АРР ίη νίνο, трансген ΑΡΡδν от мышей ΑΡΡ5\ν/Ρ5>ΕΝ-1(Όο11αΕ9) выращивали на чистом от Ν§Ρ фоне. Экстракты головного мозга оценивали в отношении уровня Αβ и δΑΡΡα в возрасте 3 месяцев, как указано ниже. Передний мозг экстрагировали 0,1М муравьиной кислотой, нейтрализовали Τπδ и очищали центрифугированием при 10000 х д. Уровень δΑΡΡα измеряли в экстрактах головного мозга иммунопреципитацией с антителом анти-аминоконцевымАРР 22С11 (Οιαηίοοη). При сравнении с контрольными мышами, подобранными из одного помета, отсутствие Ν§Ρ значительно уменьшало продукцию и Αβ, и δΑΡΡα в физиологических условиях. Такие результаты подтверждают, что Ν§Ρ играет роль в увеличенном образовании Αβ ίη νίνο.

Пример 5. Фибриллогенный пептид Аβ 42 способствует связыванию пептида Аβ с Ν§Ρ

Авторы исследовали, играет ли роль взаимодействие между ΝβΚ. и Αβ в образовании агрегатов. δΝ§Κ.31θ иммобилизовали на пластинах микротитратора и наносили биотин-Аβ 40 вместе с пептидом Аβ 42. Авторы определяли количество связанного пептида биотин-Аβ 40 с использованием стрептавидин ΗΚΡ и обнаружили, что увеличение концентрации пептида Аβ 42 усиливало связывание пептида биотинАβ 40 дозо-зависимым образом. Авторы подтвердили такие данные с использованием клеток 8ΚΝΜ0, экспрессирующих человеческий Ν§Κ.1, и обнаружили, что пептид Аβ 42 снова увеличивает связывание пептида биотин-Аβ 40 с клетками дозо-зависимым образом. Авторы также обнаружили, что антитела анти-ЫдВ ингибируют опосредованное пептидом Аβ 42 усиление связывания биотин-Аβ 40 с клетками, экспрессирующими человеческий ЫдК1. Такие результаты показывают, что вмешательство взаимодействия ЫдК/пептида Αβ ингибирует образование агрегатов пептида Аβ.

Пример 6. Лечение антагонистом ЫдВ уменьшает отложение бляшек Аβ

Для изучения роли взаимодействий ^Β/ΑΡΡ/Αβ ίη νίνο, δ^Κ310-Εε (антагонист ЫдВ; см. Международную патентную заявку Ρ0Τ/υδ03/25004) вводили двойным трансгенным мышам ΑΡΡδν/Ρ8ΕΝ1(Эе11аЕ9) (от ΤιοΚδοη ΕαόοηΙοποδ). Белок δ^Κ310-Εε содержит целый лиганд-связывающий БВР ЫдВ, сшитый с Ес частью 1дО. Для введения белка δ^Β310-Εε, 5-месячных мышей анестезировали изофлураном/кислородом и трепанационное отверстие сверлили в черепе. Канюлю (набор для инфузии в головной мозг II ΑΕΖΕΤ, Αίζα 8с1еШШс ΡτοάπΛδ, Ραοί Α1ΐο, ΟΑ) вводили в правый латеральный желудочек со стереотаксическими координатами 0,6 мм кзади и 1,2 мм вбок от темени и 4,0 мм вглубь к поверхности мозговой оболочки. Канюлю удерживали на месте с помощью цианоакрилата и катетер прикрепляли к подкожному осмотическому мининасосу (Α^ΐ 2МЬ4). Насос доставлял 2,5 мкл/ч в течение 28 дней 1,2 мг/мл раствора δ^Β310^ или крысиного 1дО в ΡΒ8 (контрольные мыши получали крысиный 1дО, так как оба компонента ЫдВ и Ес были крысиного происхождения). Насосы заменяли через 28 дней и соединяли с той же самой канюлей. Общая доза введенного белка составила 2,5 мг мыши в течение 56 дней. В конце этого периода мышей умерщвляли и уровень Αβ в головном мозге измеряли с использованием набора ΕΕΙ8Α от Βίοδοιιιτχ Ιη^ΓηαΙίοηαΙ в соответствии с инструкциями производителя. Отложение Αβ в амилоидные бляшки оценивали анти-Аβ иммуногистохимией, как указано далее. Бляшки Αβ в сагиттальном сечении головного мозга, фиксированного 4% формальдегидом, определяли иммуногистохими

- 10 009643 чески с помощью антител анти-Ав (1-17)6Е10 после обработки 0,1М муравьиной кислотой для восстановления антигена. Площадь бляшек подсчитывали количественно с использованием ΝΙΗ [тазе, как процентное отношение площади коры головного мозга для 3 сечений для каждого животного.

У мышей, леченных 5ΝβΚ310-Εο, отложение иммунореактивного Ав в бляшках достоверно уменьшалось. Кроме того, общий уровень и Ав (1-40), и Ав (1-42) снижался на 50% в головном мозге таких мышей. Была тесная корреляция между уровнем Ав и отложением амилоидных бляшек у таких мышей, предполагая, что 5ΝβΚ310-Εο нарушает метаболизм АРР/Ав в большей степени, чем агрегацию Ав. Однако, полученные данные показывают, что присутствие 5ΝβΚ310-Εο уменьшает продукцию Ав, а также его отложение в бляшки. Продукт α-секретазы, кАРРа также измеряли иммунопреципитацией и иммуноблоттинговым анализом. Уровень кАРРа снижен в головном мозге животных, леченых 5Ν§Κ310-Ρο, в такой же степени, как уровень Ав, демонстрируя, что работа α-секретазы и в-секретазы ингибируется κΝβΚ310-Ρο ίη νίνο.

Хотя вышеописанное изобретение было описано в некоторых деталях при помощи иллюстрации и примеров, для специалиста в данной области в свете настоящего изобретения будет очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от общей тенденции или объема приложенной формулы изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение полипептида растворимого рецептора-1 Νοβο для получения лекарственного средства для лечения заболевания, расстройства или состояния, связанного с повышенными уровнями пептида Ав у млекопитающего.
2. Применение полипептида растворимого рецептора-1 Νοβο для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения заболевания, расстройства или состояния, связанного с бляшками пептида Ав у млекопитающего.
3. Применение по п.1 или 2, где указанным заболеванием, расстройством или состоянием является болезнь Альцгеймера.
4. Применение по пп.1-3, где лекарственное средство вводят внутривенно.
5. Применение по пп.1-3, где лекарственное средство вводят подкожно.
6. Применение по любому из пп.1-5, где полипептидом растворимого рецептора-1 Νοβο является растворимая форма ΝβΚ1 млекопитающего.
7. Применение по п.6, где растворимая форма ΝβΚ1 млекопитающего включает пептид, выбранный из группы, состоящей из: (а) аминокислот 26-310 человеческого ΝβΚ1 (ЗЕЦ ГО ΝΟ: 3) содержащей до десяти консервативных замещений аминокислот; (Ь) аминокислот 26-344 человеческого ΝβΚ1 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 4) содержащей до десяти консервативных замещений аминокислот; (с) аминокислот 27-310 крысиного ΝβΚ1 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 5) содержащей до десяти консервативных замещений аминокислот; (ά) аминокислот 27-344 крысиного ΝβΚ1 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 6) содержащей до десяти консервативных замещений аминокислот.
8. Применение по п.7, где растворимая форма ΝβΚ1 млекопитающего включает пептид, выбранный из группы, состоящей из: (а) аминокислот 26-310 человеческого ΝβΚ1 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 3); (Ь) аминокислот 26-344 человеческого ΝβΚ1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 4); (с) аминокислот 27-310 крысиного ΝβΚ1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 5); (ά) аминокислот 27-344 крысиного ΝβΚ1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6).
9. Применение по любому из пп.6-8, где растворимая форма ΝβΚ1 млекопитающего, кроме того, включает сшитый фрагмент.
10. Применение по п.9, где сшитым фрагментом является иммуноглобулиновый фрагмент.
11. Применение по п.10, где иммуноглобулиновым фрагментом является фрагмент Рс.
12. Применение по любому из пп.1-11, где лекарственное средство пригодно для введения млекопитающему полипептида растворимого рецептора-1 Νοβο в дозе от 0,001 до 10 мг/кг.
13. Применение по п.12, где доза полипептида растворимого рецептора-1 Νοβο составляет от 0,01 до 1,0 мг/кг.
14. Применение по п.13, где доза полипептида растворимого рецептора-1 Νοβο составляет от 0,05 до 0,5 мг/кг.