EA010159B1

EA010159B1 - Способы лечения боли введением антагониста фактора роста нервов и нестероидного противовоспалительного средства и содержащие их композиции

Info

Publication number: EA010159B1
Application number: EA200501319A
Authority: EA
Inventors: Дэвид Л. Шелтон; Джерман Дж. Вергара; Кэрол М. Лоо
Original assignee: Ринат Ньюросайенс Корп.
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2004-02-19
Publication date: 2008-06-30
Also published as: US8034346B2; WO2004073653A8; WO2004073653A3; DE602004030535D1; KR20050111598A; AU2004213044A1; EP2191846A1; JP2006525960A; ATE491444T1; MXPA05008815A; NZ541750A; US20100143355A1; CA2516454A1; US20040253244A1; PL379983A1; WO2004073653A2; EA200501319A1; EP1594441B1; NO20054292L; EP1594441A2

Abstract

Настоящее изобретение освещает способы лечения или профилактики боли, предусматривающие введение некоторого количества антагониста фактора роста нервов (такого как антитело против NGF) и некоторого количества НСПВС так, что вместе они обеспечивают эффективное облегчение боли. Изобретение также описывает композиции, включающие антагонист фактора роста нервов и НСПВС, и наборы, содержащие их.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По этой заявке испрашивается приоритет предварительных заявок на выдачу патента США № 60/448823, поданной 19 февраля 2003 г., и 60/448853, поданной 19 февраля 2003 г., содержания которых полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам и композициям для профилактики или лечения боли у пациента введением комбинации антагониста фактора роста нервов и НСПВС.

Предшествующий уровень техники

В настоящее время для облегчения боли рекомендуется ряд способов лечения, предусматривающих введение нестероидных противовоспалительных средств (НСПВС). Было показано, что введение НСПВС проявляет свойства облегчения боли. Однако известны недостатки лечения НСПВС, включающие нежелательные побочные эффекты, такие как раздражение желудочно-кишечного тракта и почек и токсическое действие на печень. Более того, НСПВС не могут достичь адекватного облегчения боли даже в их максимальных терапевтически допустимых дозах при некоторых болезненных состояниях.

Фактор роста нервов (ΝΟΡ) представлял собой первый идентифицированный нейротропин, и его роль в развитии и выживании и периферических, и центральных нейронов была достаточно охарактеризована. Было показано, что ΝΟΡ представляет собой решающий фактор выживания и поддержания при развитии периферических симпатических и эмбриональных сенсорных нейронов и холинергических нейронов основания переднего мозга (8тсупс, с! а1., №1Шгс 368:246-249 (1994); Сгсо\т1су. с! а1., Сс11 76:1001-1011 (1994)). ΝΟΡ оказывает стимулирующую регуляцию на экспрессию нейропептидов в сенсорных нейронах (Ыпбзау, с! а1., №ιΙι.ιιό 337:362-364 (1989)), и его активность опосредована через 2 различных рецептора, связанных с мембраной, рецептор ТгкА тирозинкиназы и рецептор р75, который структурно связан с другими членами семейства рецепторов фактора опухолевого некроза (Сйао, с! а1., 8аспсс 232:518-521 (1986)).

В дополнение к его воздействиям на нервную систему, ΝΟΡ все больше вовлекался в процессы вне нервной системы. Например, было показано, что экзогенно введенный ΝΟΡ усиливает проницаемость сосудов (О!!сп, с! а1., Еиг. 1. Рйагтасо1. 106:199-201 (1984)), усиливает Т- и В-клеточные иммунные ответы (Ойсп, с! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А, 86:10059-10063 (1989)), вызывает дифференцировку лимфоцитов и пролиферацию тучных клеток и вызывает высвобождение растворимых биологических сигналов из тучных клеток (Ма!8иба, с! а1., Ргос. №111. Асаб. 8ск И8А, 85:6508-6512 (1988); Рсагсс, с! а1., 1.Рйу8ю1 372:379-393 (1986); В18сйо11, с! а1., В1ооб 79:2662-2669 (1992); Нопдотс, с! а1., 1. Бю1 Сйст. 268:1488114887 (1993)).

ΝΟΡ продуцируется рядом типов клеток, включая тучные клетки (Есой, с! а1., Ргос. №Л1. Асаб. 8ск И8А, 91:3739-3743 (1994)), В-лимфоциты (Тотша, с! а1., Сс11 85:345-356 (1996), кератиноциты (Όί Масго, с! а1., 1. Вю1. Сйст. 268:22838-22846)), гладкомышечные клетки (Исуата, с! а1., 1. Нурсйспз. 11:1061-1065 (1993)), фибробласты (Ьтбйо1т, с! а1., Еиг. 1. ΝαιϊΌδα. 2:795-801 (1990)), бронхиальные эпителиальные клетки (Ка88с1, с! а1., С1т. Ехр. А11сгду 31:1432-40 (2001)), почечные мезангиальные клетки (8!стст, с! а1., Ат. 1. Рйузю1. 261:Ρ792-798 (1991)) и трубочки скелетных мышц (8сйтай/, с! а1., 1. Рйо!осйст. Рйо!ойю1. В 66:195-200 (2002)). Рецепторы ΝΟΡ были обнаружены на различных типах клеток вне нервной системы. Например, ТгкА был обнаружен на моноцитах, Т- и В-лимфоцитах и тучных клетках человека.

Связь между повышенными уровнями ΝΟΡ и различными воспалительными состояниями наблюдалась у пациентов, а также в нескольких экспериментальных моделях на животных. Эти воспалительные состояния включают системную красную волчанку (ВтассйЕаибюто, с! а1., №игогсрой 4:563-565 (1993)), рассеянный склероз (Вгаса-Еаибюто, с! а1., №шт8ск Ьс!!. 147:9-12 (1992)), псориаз (Каусйаибйий, с! а1., Ас!а Эспи. Ссисгсок 78:84-86 (1998)), артрит (Еактц с! а1., Апп. Вйсит. Όίδ. 55:745-748 (1996)), интерстициальный цистит (Окгад1у, с! а1., 1. Ито1оду 161:438-441 (1999)) и астму (Вгаип, с! а1., Еиг. 1 1ттипо1. 28:3240-3251 (1998)).

Согласованно повышенный уровень ΝΟΡ в периферических тканях связан с гиперальгезией и воспалением, и он наблюдался при ряде форм артрита. Синовиальная оболочка пациентов, пораженных ревматоидным артритом, экспрессирует высокие уровни ΝΟΡ в то время, как сообщалось, что в невоспаленной синовиальной оболочке ΝΟΡ не выявляется (А1ос, с! а1., Агсй. Вйсит. 35:351-355 (1992)). Аналогичные результаты наблюдались у крыс с экспериментально вызванным ревматоидным артритом (А1ос, с! а1., Сйп. Ехр. Вдсита!о1. 10:203-204 (1992)). Сообщалось о повышенных уровнях ΝΟΡ у трансгенных мышей с артритом наряду с увеличением количества тучных клеток (А1ос, с! а1., 1п!. 1. Т188ис КсасйопзЕхр. Сйп. А8рсс!8 15:139-143 (1993)).

Существуют 2 общие категории лекарственной терапии для лечения боли, причем каждая действует посредством различных механизмов и оказывает различные эффекты, и они обе имеют недостатки. Первая категория включает нестероидные противовоспалительные средства (НСПВС), которые используются для лечения незначительной боли, но терапевтическое применение которых ограничено нежелательными воздействиями на желудочно-кишечный тракт, такими как эрозия слизистой оболочки желудка, образование пептической язвы или воспаление 12-перстной кишки и толстой кишки и токсическое действие на почки при длительном применении. Вторая категория включает опиоидные анальгетики, такие

- 1 010159 как морфин, которые применяются для лечения боли от умеренной до сильной, но терапевтическое применение которых ограничено ввиду нежелательных эффектов, таких как запор, тошнота и рвота, угнетение дыхания, психические нарушения, почечная колика, устойчивость к длительному применению и риск развития зависимости.

Очевидно, что существует необходимость в улучшенном лечении боли, которое обеспечивает улучшенную терапевтическую выгоду (например, сниженную силу и/или частоту боли) и/или снижает частоту возникновения нежелательных побочных эффектов, вызванных многими современными схемами лечения.

Все приведенные в настоящем описании ссылки, включая патентные заявки и публикации, полностью включены в качестве ссылки.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение основано на открытии того, что антагонисты ΝΟΡ эффективны при лечении боли в сочетании с НСПВС. Такая терапия приводит к неожиданно усиленному лечению боли. Кроме того, такая терапия в целом обеспечивает возможность применения сниженной дозировки НСПВС для получения такого же количества уменьшения боли и/или других форм усиления лечения боли НСПВС.

В первом аспекте настоящее изобретение характеризует способ лечения (или в других вариантах осуществления профилактики) боли, включающий введение некоторого количества антагониста фактора роста нервов и некоторого количества НСПВС так, что в сочетании они обеспечивают эффективное облегчение боли. Относительные количества и соотношения антагониста ΝΟΡ и НСПВС могут варьироваться. В некоторых вариантах осуществления вводится количество антагониста ΝΟΡ, достаточное для того, чтобы обеспечить возможность снижения обычной дозы НСПВС, требуемой для получения такой же степени эффекта облегчения боли. В некоторых вариантах осуществления вводится количество антагониста ΝΟΡ, достаточное для того, чтобы обеспечить возможность снижения обычной дозы НСПВС, требуемой для получения такой же степени эффекта облегчения боли по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, или по меньшей мере примерно на 90%, или более. Это уменьшение может отражаться с точки зрения количества, введенного в данное введение, и/или количестве, введенном в течение данного периода времени (сниженная частота).

В другом аспекте изобретение характеризует слособы усиления лечения боли НСПВС, предусматривающие введение эффективного количества НСПВС в сочетании с эффективным количеством антагониста ΝΟΡ. Используемый в настоящем описании термин «введение в сочетании» включает одновременное введение и/или введение в различное время. Введение в сочетании также охватывает введение в виде совместной композиции (т.е. антагонист ΝΟΡ и НСПВС присутствуют (комбинируются) в одной и той же композиции) и/или введение в виде отдельных композиций. Используемый в настоящем описании термин «введение в сочетании» охватывает любое обстоятельство, при котором НСПВС и антагонист ΝΟΡ вводятся в эффективном количестве индивидууму. Как далее обсуждается в настоящем описании, понятно, что антагонист ΝΟΡ и НСПВС могут вводиться с различной частотой и/или интервалами введения. Например, антитело против ΝΟΡ можно вводить 1 раз/нед., тогда как НСПВС можно вводить чаще. Понятно, что антагонист ΝΟΡ и НСПВС могут вводиться одним и тем же путем введения или различными путями введения, и что различные схемы введения могут изменяться в течение хода введения (введений). Введение может происходить перед началом боли.

В другом аспекте изобретение предоставляет способы снижения частоты возникновения боли, облегчения боли, уменьшения боли и/или задержки развития или прогрессирования боли у индивидуума, причем указанные способы предусматривают введение эффективного количества антагониста ΝΟΡ в сочетании с эффективным количеством НСПВС.

Способы изобретения подходят для лечения или профилактики любой боли любой этиологии, включая боль, при которой в целом назначается применение НСПВС. В некоторых вариантах осуществления боль представляет собой послеоперационную боль. В некоторых вариантах осуществления боль представляет собой боль, связанную с ожогом. В других вариантах осуществления боль представляет собой боль, связанную с ревматоидным артритом. В других вариантах осуществления боль представляет собой боль, связанную с остеоартритом.

Антагонист ΝΟΡ, подходящий для применения в способах изобретения, представляет собой любое средство, которое может прямо или косвенно привести к сниженной биологической активности ΝΟΡ. В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ связывает (физически взаимодействует с) ΝΟΡ (например, антитело), связывается с рецептором ΝΟΡ (таким как рецептор 1гкЛ и/или р75) и/или снижает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов от рецепторов ΝΟΡ (например, ингибиторы передачи сигналов киназы или другой нисходящей передачи сигналов, вызванной ΝΟΡ, в клеткемишени). В других вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ ингибирует (снижает) синтез и/или высвобождение ΝΟΡ. В других вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ уменьшает экспрессию или функцию рецепторов ΝΟΡ ТгкА и/или р75. В другом варианте осуществления антагонист ΝΟΡ представляет

- 2 010159 собой антагонист ΝΟΡ, который не является иммуноадгезином ТгкА (т.е. является отличным от иммуноадгезина ТгкА). В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ выбран из любого одного или более из следующих: антитело против ΝΟΡ, антисмысловая молекула, направленная на нуклеиновую кислоту, кодирующую ΝΟΡ (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую ΝΟΡ), антисмысловая молекула, направленная на рецепторы ΝΟΡ (такие как ТгкА и/или р75), вещество, ингибирующее ΝΟΡ, структурный аналог ΝΟΡ, доминантно-негативная мутация рецептора ТгкА и/или р75, которая связывает ΝΟΡ, антитело против ТгкА, антитело против р75 и ингибитор киназы. В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ (такой как антитело против ΝΟΡ) связывает ΝΟΡ (такой как 11ΝΟΕ) и значительно не связывается с родственными нейротропинами, такими как ΝΨ-3, ΝΓ-4/5 и/или ΒΌΝΡ. В другом варианте осуществления антагонист ΝΟΡ представляет собой антитело против ΝΟΡ. В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ специфически связывается с ΝΟΡ. В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ распознает человеческий ΝΟΡ. В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ специфически связывает человеческий ΝΟΡ. В еще одних вариантах осуществления антитело специфически связывает тот же эпитоп 6 ΝΟΡ, что и антитело, выбранное из одного или более из следующих: МаЬ 911, МаЬ 912 и МаЬ 938 (см. Нопдо, е1 а1., НуЬпбота 19:215-227 (2000)). В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ гуманизировано (включая гуманизированное МаЬ 911, такое как антитело Е3, описанное в настоящем описании). В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ представляет собой антитело Е3 (как описано в настоящем описании). В других вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ включает один или более СОВ антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или, в некоторых вариантах осуществления, все 6 СВЭ из Е3). В других вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ является человеческим. В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в табл. 1 (ЗЕО Ш ΝΟ:1), и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в табл. 2 (ЗЕО Ш ΝΟ:2). В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в табл. 1 (ЗЕО Ш ΝΟ:1). В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ включает аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в табл. 2 (ЗЕО Ш ΝΟ:2). В еще одних вариантах осуществления антитело включает модифицированную константную область, такую как константная область, которая является иммунологически инертной, например, не запускает лизис, опосредованный комплементом, или не стимулирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЭСС). В других вариантах осуществления константная область модифицирована, как описано в Еиг. 1. 1ттипо1. (1999) 29:2613-2624; заявке РСТ № РСТ/СВ99/01441; и/или в заявке на патент Великобритании № 9809951.8.

В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ связывается с молекулой ΝΟΡ. В еще одних вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ представляет собой антитело, которое специфически связывается с ΝΟΡ. Однако антагонист ΝΟΡ может альтернативно связываться с рецептором ТгкА. Антагонист ΝΟΡ может представлять собой моноклональное антитело против человеческого ΝΟΡ (анти-ΙιΝΟΕ). которое способно связывать 11ΝΟΕ и эффективно ингибировать связывание 11ΝΟΕ с человеческим ТгкА (ЬТгкА).

Аффинитет связывания антитела против ΝΟΡ с ΝΟΡ (таким как 11ΝΟΕ) может составлять от примерно 0,10 до примерно 0,30 нМ, от примерно 0,15 до примерно 0,75 нМ и от примерно 0,18 до примерно 0,72 нМ. В одном варианте осуществления аффинитет связывания составляет примерно 2 и 22 пкМ. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 10 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее чем примерно 10 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 0,1 или примерно 0,07 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее примерно 0,1 или менее примерно 0,07 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 100, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ, примерно 500, примерно 100 или примерно от 50 до любого из примерно 2 пкМ, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 40 или примерно 50 пкМ. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания составляет любую величину из примерно 100 нМ, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ, примерно 500, примерно 100 или примерно 50 пкМ или менее примерно 50 пкМ. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее, чем любая величина из 100 нМ, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ, примерно 500, примерно 100 или примерно 50 пкМ. В еще одних вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 2, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 40 или более примерно 40 пкМ. Как хорошо известно в данной области, аффинитет связывания может быть выражен в виде К_с или константы диссоциации, и увеличенный аффинитет связывания соответствует сниженной К_с. Аффинитет связывания мышиного моноклонального антитела 911 против ΝΟΡ (Нопдо е1 а1., НуЬпбота 19:215227 (2000)) с человеческим ΝΟΡ составляет примерно 10 нМ, а аффинитет связывания гуманизированного антитела против ΝΟΡ Е3 (описанного в настоящем описании) с человеческим ΝΟΡ составляет примерно 0,07 нМ.

В случаях, когда антагонист ΝΟΡ представляет собой антитело, антитело может представлять собой

- 3 010159 фрагмент антитела, включая фрагмент антитела, выбранный из группы, состоящей из фрагментов ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2, Εν, диател, одноцепочечных молекул антитела и мультиспецифических антител, образованных из фрагментов антитела, и одноцепочечной молкулы Εν (κοΕν).

НСПВС может представлять собой любое нестероидное противовоспалительное соединение. НСПВС классифицируются по их способности ингибировать циклооксигеназу. Циклооксигеназа 1 и циклооксигеназа 2 представляют собой 2 основные изоформы циклооксигеназы, а самые стандартные НСПВС представляют собой смешанные ингибиторы обеих изоформ. Самые стандартные НСПВС относятся к одной из следующих пяти структурных категорий: (1) производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, напроксен, напросин, диклофенак и кетопрофен; (2) производные уксусной кислоты, такие как толметин и слиндак; (3) производные фенамовой кислоты, такие как мефенамовая кислота и меклофенамовая кислота; (4) производные бифенилкарбоновой кислоты, такие как дифлунизал и флуфенизал; и (5) оксикамы, такие как пироксим, судоксикам и изоксикам.

Был описан другой класс НСПВС, которые избирательно ингибируют циклооксигеназу 2. Ингибиторы Сох-2 были описаны, например в патентах США №№ 5616601; 5604260; 5593994; 5550142; 5536752; 5521213; 5475995; 5639780; 5604253; 5552422; 5510368; 5436265; 5409944 и 5130311, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки. Определенные иллюстративные ингибиторы СОХ-2 включают целекоксиб (8С-58635), рофекоксиб, ΌυΡ-697, флозулид (СОР-28238), мелоксикам, 6метокси-2-нафтилуксуную кислоту (6-ΜΝΑ), МК-966, набуметон (пролекарство для 6-ΜΝΑ), нимезулид, N8-398, 8С-5766, 8С-58215, Т-614; или их комбинации.

В некоторых вариантах реализации изобретение предоставляет способы, в которых аспирин /или ацетоминофен применяются в сочетании с антагонистом ΝΟΕ (таким как антитело против ΝΟΕ).

Антагонист ΝΟΕ и/или НСПВС могут вводиться индивидууму любым подходящим путем. Например, их можно вводить вместе или отдельно и/или одновременно, и/или последовательно, перорально, внутривенно, сублингвально, подкожно, внутриартериально, ректально, в спинной мозг, интраторакально, внутрибрюшинно, в желудочки головного мозга, сублингвально, трансдермально или путем ингаляции. Введение может быть системным, т. е. внутривенным или локализованным.

Во втором аспекте настоящее изобретение характеризует композиции, включающие антагонист фактора роста нервов и НСПВС. Антагонист фактора роста нервов и НСПВС могут присутствовать вместе с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями или эксципиентами, или могут присутствовать в отдельных композициях. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет синергическую композицию антагониста ΝΟΕ и НСПВС.

В третьем аспекте настоящее изобретение характеризует набор для применения в любом из способов, раскрытых в настоящем описании, причем указанный набор предусматривает антагонист ΝΟΕ и НСПВС. Набор может, кроме того, включать инструкции для любого из описанных в настоящем описании способов. Инструкции могут включать введение антагониста ΝΟΕ (такого как антитело против ΝΟΕ) в сочетании с НСПВС (т.е. одновременное введение и/или введение в различное время). В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΕ и НСПВС упакованы вместе, но они могут быть или могут не быть в одном и том же контейнере. Так, в некоторых вариантах осуществления набор включает антагонист ΝΟΕ и НСПВС, присутствующие в одном и том же контейнере, и инструкции по применению в любом из описанных в настоящем описании способов. В других вариантах осуществления набор включает антагонист ΝΟΕ и НСПВС, присутствующие в отдельных контейнерах.

В других вариантах осуществления изобретение предоставляет способ лечения боли у индивидуума, предусматривающий введение индивидууму эффективного количества антитела против фактора роста нервов (ΝΟΕ) и НСПВС. В других вариантах осуществления НСПВС выбран из группы, состоящей из ибупрофена, напроксена, напросина, диклофенака, кетопрофена, толметина, слиндака, мефенамовой кислоты, меклофенамовой кислоты, дифлунизала, флуфенизала, пироксима, судоксикама, изоксикама, целекоксиба, рофекоксиба, ΌυΡ-697, флозулида, мелоксикама, 6-метокси-2-нафтилуксусной кислоты, МК966, набуметона, нимезулида, Ν8-398, 8С-5766, 8С-58215, Т-614. В некоторых вариантах осуществления НСПВС является ибупрофеном. В некоторых вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ связывает человеческий ΝΟΕ. В некоторых вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ связывает человеческий ΝΟΕ с аффинитетом связывания примерно 10 нМ или менее чем примерно 10 нМ. В некоторых вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ представляет собой человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, показанную в 8ЕО Ш ΝΟ:1 и вариабельную область легкой цепи, показанную в 8ЕО Ш ΝΟ:2. В некоторых вариантах осуществления боль представляет собой послеоперационную боль.

В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для лечения боли, включающую эффективное количество антитела против ΝΟΕ и НСПВС и фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет набор для лечения боли, включающий антитело против ΝΟΕ, НСПВС и инструкции по введению антитела против ΝΟΕ в сочетании с

- 4 010159

НСПВС для лечения боли.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует, что кумулятивная оценка боли в баллах снижена у животных, получавших лечение 8[+]ибупрофеном в дозе 10 или 30 мг/кг в комбинации с антагонистом ΝΟΡ (антагонистом против ΝΟΡ МаЬ 911; см. Нопдо, с1 а1., НуЬпйота 19:215-227 (2000)). Животные были разделены на две группы (контрольная и получавшая лечение антителами). Антагонист ΝΟΡ вводили за 15 часов перед операцией, внутрибрюшинно (время = -15 ч) в дозе 1 мг/кг. Операцию выполняли, как описано во время 0. Боль в покое оценивали через 24 ч после операции («0» на графике). Затем всех животных лечили ибупрофеном (300 мг/мл в 45% жидкости бета-циклодекстрина) в концентрации 10 или 30 мг/кг массы тела. Не получавших лечение антителом животных также лечили ибупрофеном в дозе 10, 30, 100 и 300 мг/кг. Ибупрофен доставляли подкожно в заднюю часть шеи. Через 1 ч после введения дозы ибупрофена оценивали боль в покое. Лечение антагонистом против ΝΟΡ плюс ибупрофеном более эффективно в уменьшении боли, чем лечение или одним ибупрофеном, или одним антителом против антагониста ΝΟΡ.

Фиг. 2 представляет собой график, показывающий кумулятивную оценку боли в баллах у животных, получавших лечение диклофенаком в дозе 5 мг/кг, в комбинации с антагонистом ΝΟΡ (антитело МаЬ 911 против антагониста ΝΟΡ; см. Нопдо, с1 а1., НуЬпйота 19:215-227 (2000)). Животные были разделены на две группы (контрольная и получавшая лечение антителами). Антагонист ΝΟΡ вводили за 15 часов перед операцией, внутрибрюшинно (время = -15 ч) в дозе 1 мг/кг. Операцию выполняли, как описано во время 0. Боль в покое оценивали через 24 ч после операции («0» на графике). Затем всех животных лечили диклофенаком в дозе 5 мг/кг массы тела. Не получавших лечение антителом животных также лечили диклофенаком в дозе 5 мг/кг. Диклофенак вводили подкожно в заднюю часть шеи. Через 1 ч после введения диклофенака оценивали боль в покое.

Подробное описание изобретения

Заявители обнаружили, что боль можно предотвратить или лечить введением эффективного количества антагониста ΝΟΡ (такого как антитело против ΝΟΡ) в сочетании с НСПВС. Способы и композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения или профилактики боли, включая любую боль, при которой в целом назначается применение НСПВС. Применением антагониста фактора роста нервов и НСПВС в сочетании, в соответствии с настоящим изобретением, теперь можно лечить боль меньшей дозой НСПВС, снижая посредством этого вероятность побочных эффектов, связанных с лечением НСПВС. В некоторых вариантах осуществления вводится количество антагониста ΝΟΡ, достаточное для того, чтобы обеспечить возможность снижения обычной дозы НСПВС, требуемой для получения такой же степени эффекта облегчения боли, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 90%, или более.

Лечение боли НСПВС можно также усилить, как описано в настоящем описании, введением НСПВС в сочетании с антагонистом ΝΟΡ.

В одном аспекте изобретение предоставляет способы лечения или профилактики боли у индивидуума (такого как млекопитающее, и человека, и не человека), предусматривающие введение эффективного количества антагониста ΝΟΡ в сочетании с эффективным количеством НСПВС. В другом аспекте изобретение предоставляет способы усиления лечения или профилактики Ν8ΑΌ боли у индивидуума, предусматривающие введение эффективного количества антагониста ΝΟΡ (такого как антитело против ΝΟΡ) в сочетании с эффективным количеством НСПВС. В другом аспекте изобретение предоставляет способы профилактики, облегчения и/или профилактики развития или прогрессирования боли.

В некоторых вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ способно связывать ΝΟΡ и эффективно ингибировать связывание ΝΟΡ с его рецептором ТгкА или р75 ίη у1уо, или эффективно ингибировать активацию ΝΟΡ его рецептора ТгкА или р75. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания антитела против ΝΟΡ составляет от примерно 0,01 до примерно 1,00 нМ или от примерно 0,05 до примерно 0,25 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 1, примерно 2, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 50, примерно 100 пкМ, или более. В одном варианте осуществления аффинитет связывания составляет примерно 2 и 22 пкМ. В некоторых вариантах осуществления антитело связывает по существу тот же эпитоп 6 ΝΟΡ, что и антитело, выбранное из одного или более из следующих: МаЬ 911, МаЬ 912 и МаЬ 938 (см. Нопдо, с1 а1., НуЬпйота 19:215-227 (2000)).

Антитело может также представлять собой фрагмент антитела, такой как фрагмент антитела, выбранный из одного или более из следующих фрагментов: ΡаЬ, ΡаЬ', Ρ(30')2. Ρν, диател, одноцепочечных молекул антитела и мультиспецифических антител, образованных из фрагментов антитела, и одноцепочечной молекулы Ρν (δοΡν). Антитело может также быть химерным, и оно может быть гуманизированным или человеческим. Антитело может также быть биспецифическим.

Иллюстративные НСПВС, которые можно применять в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются, (1) производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, напроксен, напросин, диклофенак и кетопрофен; (2) производные уксусной кислоты, такие как толметин и слиндак; (3) произ

- 5 010159 водные фенамовой кислоты, такие как мефенамовая кислота и меклофенамовая кислота; (4) производные бифенилкарбоновой кислоты, такие как дифлунизал и флуфенизал; и (5) оксикамы, такие как пироксим, судоксикам и изоксикам. Был описан другой класс НСПВС, которые избирательно ингибируют циклооксигеназу 2. Ингибиторы Сох-2 были описаны, например, в патентах США №№ 5616601; 5604260; 5593994; 5550142; 5536752; 5521213; 5475995; 5639780; 5604253; 5552422; 5510368; 5436265; 5409944 и 5130311, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки. Определенные иллюстративные ингибиторы СОХ-2 включают целекоксиб (8С-58635), рофекоксиб, ΌυΡ-697, флозулид (СОР28238), мелоксикам, 6-метокси-2-нафтилуксусную кислоту (6-ΜΝΑ), МК-966, набуметон (пролекарство для 6-ΜNΑ), нимезулид, N8-398, 8С-5766, 8С-58215, Т-614; или их комбинации. В некоторых вариантах осуществления аспирин и/или ацетоминофен применяются в сочетании с антагонистом ΝΟΡ (таким как антитело против ΝΟΡ).

Способы и композиции настоящего изобретения можно применять для лечения боли любой этиологии, включая острую и хроническую боль, любую боль с воспалительным компонентом и боль, при которой обычно назначаются НСПВС. Примеры боли включают послеоперационную боль, боль после хирургических вмешательств (включая зубную боль), мигрень, головную боль и невралгию тройничного нерва, боль, связанную с ожогом, раной или почечным камнем, боль, связанную с травмой (включая травматическое повреждение головы), нейропатическую боль, боль, связанную с мышечно-скелетными расстройствами, такими как ревматоидный артрит, остеоартрит, висцеральную боль, колит, панкреатит, гастрит, анкилозирующий спондилит, серо-негативные (неревматоидные) артропатии, не суставной ревматизм и околосуставные расстройства и боль, связанную с раком (включая «приступообразную боль» и боль, связанную с терминальными стадиями рака), периферическую нейропатию, постгерпетическую невралгию и боль, связанную с серповидноклеточным кризом. Примеры боли с воспалительным компонентом (в дополнение к некоторым из видов боли, описанных выше) включают ревматическую боль, боль, связанную с мукозитом, и дисменоррею. В некоторых вариантах осуществления способы и композиции настоящего изобретения используются для лечения или профилактики послеоперационной боли и/или раковой боли. В других вариантах осуществления боль представляет собой болевое показание, по поводу которого НСПВС в целом не назначаются, такую как нейропатическая боль. В других вариантах осуществления способы и композиции, описанные в настоящем описании, используются для лечения и/или профилактики боли, связанной с ожогом. В других вариантах осуществления способы и композиции, описанные в настоящем описании, используются для лечения и/или профилактики боли, связанной с ревматоидным артритом. В других вариантах осуществления способы и композиции, описанные в настоящем описании, используются для лечения и/или профилактики боли, связанной с остеоартритом.

В другом аспекте изобретение предоставляет композиции и наборы для лечения боли, включающие антагонист ΝΟΡ (такой как антитело против ΝΟΡ) и НСПВС, подходящих для применения в любых из способов, описанных в настоящем описании.

Общие методики

При отсутствии других указаний в практике настоящего изобретения должны использоваться обычные методики молекулярной биологии (включая рекомбинантные методики), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, которые находятся в пределах возможностей специалистов в данной области. Такие методики полностью объяснены в литературе, такой как Мо1еси1аг с1ошид: Α ЬаЬога!огу Мапиа1, 8есоий еййюи (8атЬгоок е! а1., 1989) Со1й 8ргтд НагЬог Рге88; О11доиис1ео!1йе 8уи!ке818 (М.1. Сай, ей., 1984); Ме!кой8 ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Нитаиа Рге88; Се11 Вю1оду: Α ЬаЬогаЮгу №1еЬоок (Е. Се1118, ей., 1998) Асайетю Рге88; Ашта1 Се11 Си1!иге (Κ.Ι. Тге8киеу, ей., 1987); 1и!гойисйои !о Се11 аий Т188ие Си1!иге (1.Р. Ма!кег аий Р.Е. РоЬегй. 1998) Р1еиит Рге88; Се11 аий Т188ие Си1!иге: ЬаЬога!огу Ргосейиге8 (А. Иоу1е, 1.В. СпГГйк8, аий Ό.Ο. №\\'е1Г ей8., 1993-8) 1. Айеу аий 8ои8; Ме!кой8 ш Епхуто1оду (Асайетю Рге88, 1ис.); НаийЬоок о! Ехрептеи!а1 1ттиио1оду (И.М. Аей аий С.С. В1аскте11, ей8.); Сеие Тгаи8Гег Уес(ог8 Гог Маттайаи Се118 (1.М. МШег аий М.Р. Са1о8, ей8., 1987); Сиггеи! Рго!осо18 т Мо1еси1аг Вю1оду (Т.М. Аи8иЬе1 е! а1., ей8., 1987); РСК: Тке Ро1утега8е Скат Веасйои, (Ми1Й8 е! а1., ей8., 1994); СиггеШ Рго!осо18 ш 1ттиио1оду (1.Е. СоЕдаи е! а1., ей8., 1991); 8кой Рго!осо18 т Мо1еси1аг Вю1оду (Айеу аий 8ои8, 1999); 1ттииоЬю1оду (С.А. 1аие^ау аий Р. Тгауег8, 1997); Аи!1Ьой1е8 (Р. Ттск, 1997); АийЬой1е8: а ргасйса1 арргоаск (Ό. Сайу., ей., ШБ Рге88, 1988-1989); Моиос1оиа1 аийЬой1е8: а ргас!юа1 арргоаск (Р. 8керкегй аий С. Иеаи, ей8., ОхГогй ишуегайу Рге88, 20 00); и81ид аи!1Ьой1е8: а 1аЬога!огу таииа1 (Е. Наг1оте аий Ό. Ьаие (Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Рге88, 1999); Тке АийЬой1е8 (М. ΖηικΙΙί аий Ι.Ό. Сарга, ей8., Наг\гоой Асайетю РиЬЙ8кег8, 1995).

Определения «Антитело» (взаимозаменяемо используемое во множественной форме) представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углеводород, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., посредством по меньшей мере одного участка распознавания антигена, расположенного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Используемый в настоящем описании термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как ТаЬ, ТаЬ', Т(аЬ')2, Ту, одноцепочечный (8сТу), их мутанты, гибридные белки, включающие антительную часть, гуманизированные антитела, химерные антитела, диатела, ли

- 6 010159 нейные антитела, одноцепочеченые антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности. Антитело включает антитело любого класса, такое как 1дО, 1дА или 1дМ (или его подкласс), и антитело не должно быть из какого-либо конкретного класса. В зависимости от аминокислотной последовательности антитела константного домена его тяжелых цепей, иммуноглобулины могут быть отнесены к различным классам. Существует 5 основных классов иммуноглобулинов: 1дА, Ι§Ό, 1дЕ, 1дО и 1дМ, и несколько из них могут быть, кроме того, разделены на подклассы (изотипы), например 1дО1, 1дО2, 1дО3, 1дО4, 1дА1 и 1дА2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются, соответственно, альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

«Моноклональное антитело» относится к гомогенной популяции антител, в которой моноклональное антитело состоит из аминокислот (естественно встречающихся и неестественно встречающихся), которые участвуют в избирательном связывании антигена. Моноклональные антитела высоко специфичны, причем они направлены против одного антигенного сайта. Термин «моноклональное антитело» охватывает не только интактные моноклональные антитела и моноклональные антитела полной длины, но также их фрагменты (такие как РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')2, Ρν, одноцепочечный (8еРу), их мутанты, гибридные белки, включающие антительную часть, гуманизированные моноклональные антитела, химерные моноклональные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности и способности связываться с антигеном. Нет намерения ограничиваться в отношении источника антитела или способа, которым оно получено (например, гибридомой, фаговой селекцией, рекомбинантной экспрессией, трансгенными животными и т.д.).

«Гуманизированные» антитела относятся к молекуле, имеющей сайт связывания антигена, который по существу лишен иммуноглобулина из нечеловеческих видов, и остальную структуру иммуноглобулина молекулы, основанную на структуре и/или последовательности человеческого иммуноглобулина. Сайт связывания антигена может включать или полные вариабельные домены, слитые на константные домены, или только области, определяющие комплементарность (СЭЯ), трансплантированные на соответствующие каркасные регионы в вариабельных доменах. Сайты связывания антигена могут быть дикого типа или модифицированы одним или более замещениями аминокислот, например, модифицированы для того, чтобы ближе напоминать человеческий иммуноглобулин. Некоторые формы гуманизированных антител сохраняют все последовательности СЭЯ (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все 6 СЭЯ из мышиных антител). Другие формы гуманизированных антител имеют одну или более СЭЯ (1, 2, 3, 4, 5, 6), которые изменены относительно исходного антитела. В некоторых случаях остатки каркасной области (РЯ) или другие остатки человеческого иммуноглобулина, замещенные соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаруживаются в антителе реципиента или в антителе донора.

Используемый в настоящем описании термин «фактор роста нервов» и «ΝΟΡ» относится к фактору роста нервов и его вариантам (включая, например, сплайсинговые варианты и варианты белковой переработки), которые удерживают по меньшей мере часть активности ΝΟΡ. Используемый в настоящем описании термин ΝΟΡ включает все виды нативной последовательности ΝΟΡ млекопитающих, включая людей, нечеловекообразных обезьян, собак, кошек, лошадей или коров.

«Рецептор ΝΟΡ» относится к полипептиду, который связан с ΝΟΡ или активирован им. Рецепторы ΝΟΡ включают рецептор ТгкА и рецептор р75 любого вида млекопитающих, включая, но не ограничиваясь, людей, собак, кошек, лошадей, приматов или коров.

«Антагонист ΝΟΡ» относится к любой молекуле, которая блокирует, подавляет или снижает (включая значительно) биологическую активность ΝΟΡ, включая нисходящие пути, опосредованные передачей сигналов ΝΟΡ, такие как связывание с рецепторами и/или вызванная клеточная реакция на ΝΟΡ. Термин «антагонист» не подразумевает какого-либо специфического механизма биологического действия, и считается, что он явно включает и охватывает все возможные фармакологические, физиологические и биохимические взаимодействия с ΝΟΡ, и прямые, и косвенные, или взаимодействующие с ΝΟΡ, его рецептором, или посредством другого механизма, и его последствия, которые могут быть достигнуты различными и химически разнородными композициями. Иллюстративные антагонисты ΝΟΡ включают, но не ограничиваются, антитело против ΝΟΡ, антисмысловую молекулу, направленную на ΝΟΡ (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую ΝΟΡ), соединение, ингибирующее ΝΟΡ, структурный аналог ΝΟΡ, доминантно-негативную мутацию рецептора ТгкА, которая связывает ΝΟΡ, и иммуноадгезин ТгкА, антитело против р75, антисмысловую молекулу, направленную на любой или оба из рецепторов ТгкА и/или р75 (включая, антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую ТгкА или р75) и ингибитор киназы. Для цели настоящего изобретения следует ясно понимать, что термин «антагонист» охватывает все ранее идентифицированные термины и функциональные состояния и характеристики, посредством которых сам ΝΟΡ, биологическая активность ΝΟΡ (включая, но не ограничивая его способность опосредовать любой аспект боли) или по

- 7 010159 следовательности биологической активности по существу аннулируются, уменьшаются или нейтрализуются в любой значительной степени. В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ связывает (физически взаимодействует) с ΝΟΡ (например, антитело), связывается с рецептором ΝΟΡ (таким как рецептор ТгкА или рецептор р75) снижает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептора ΝΟΡ, и/или ингибирует (снижает) синтез, продукцию или высвобождение ΝΟΡ. В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ связывает (физически взаимодействует) с ΝΟΡ (например, антитело), связывается с рецептором ΝΟΡ (таким как рецептор ТгкА или рецептор р75) и/или снижает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептора ΝΟΡ. В другом варианте осуществления антагонист ΝΟΡ связывается с ΝΟΡ и предотвращает димеризацию рецептора ТгкА и/или автофосфорилирование ТгкА. В других вариантах антагонист ΝΟΡ ингибирует или снижает синтез ΝΟΡ. В других вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ ингибирует или снижает синтез и/или продукцию (высвобождение). Примеры типов антагонистов ΝΟΡ предоставлены в настоящем описании.

Используемый в настоящем описании термин «антитело против ΝΟΡ» относится к антителу, которое способно связываться с ΝΟΡ и ингибировать биологическую активность ΝΟΡ и/или нисходящий путь (пути), опосредованный передачей сигналов ΝΟΡ.

«Иммуноадгезин ТгкА» относится к растворимой химерной молекуле, включающей фрагмент рецептора ТгкА, например, внеклеточный домен рецептора ТгкА и последовательность иммуноглобулина, которая сохраняет специфичность связывания рецептора ТгкА.

«Биологическая активность» ΝΟΡ в целом относится к способности связывать рецепторы ΝΟΡ и/или активировать пути передачи сигналов рецепторов ΝΟΡ. Без ограничения биологическая активность включает любую одну или более из следующих: способность связывать рецепторы ΝΟΡ (такие как р75 и/или ТгкА); способность содействовать димеризации и/или автофосфорилированию рецепторов ТгкА; способность активировать пути передачи сигналов рецепторов ΝΟΡ; способность содействовать клеточной дифференцировке, пролиферации, выживанию, росту и другим изменениям клеточной физиологии, включая (в случае нейронов, включая периферические и центральные нейроны) изменение морфологии нейронов, синаптогенез, синаптическую функцию, высвобождение нейромедиаторов и/или нейропептидов и регенерацию после повреждения и способность опосредовать боль.

Термин «эпитоп» используется для обозначения сайтов связывания для (моноклональных или поликлональных) антител на антигенах, таких как белковые антигены.

Используемый в настоящем описании термин «лечение» представляет собой подход для получения благоприятных или желательных клинических результатов. Для целей настоящего изобретения благоприятные или желательные клинические результаты включают, но не ограничиваются, один или более из следующих: ослабление или облегчение любого аспекта боли, включая острую, хроническую, воспалительную, нейропатическую или послеоперационную боль. Для целей настоящего изобретения благоприятные или желательные клинические результаты включают, но не ограничиваются, один или более из следующих: включая уменьшение тяжести, облегчение одного или более симптомов, связанных с болью, включая любой аспект боли (такой как укорочение длительности боли и/или уменьшение болевой чувствительности или болевого ощущения).

«Снижение частоты возникновения» боли значит любое снижение тяжести (которые могут включать снижение необходимости и/или количества (например, воздействия) других средств и/или способов лечения, в целом используемых по поводу этих состояний, длительности и/или частоты (включая, например, задержку или увеличение времени до возникновения боли у индивидуума). Как понятно специалистам в данной области, индивидуумы могут варьироваться с точки зрения их реакции на лечение, и также, например, «способ снижения частоты возникновения боли у индивидуума» отражает введение антагониста ΝΟΡ, описанного в настоящем описании, в сочетании с НСПВС, как описано в настоящем описании, на основании целесообразного ожидания, что такое введение может, вероятно, вызвать такое уменьшение частоты возникновения у этого конкретного индивидуума.

«Облегчение» боли или одного или более симптомов боли означает уменьшение или смягчение одного или более симптомов боли, по сравнению с отсутствием введения антагониста ΝΟΡ в сочетании с НСПВС. «Облегчение» также включает укорочение или уменьшение длительности симптома.

«Смягчение» боли или одного или более симптомов боли означает уменьшение степени одного или более нежелательных клинических проявлений боли у индивидуума или популяции индивидуумов, получавших лечение антагонистом ΝΟΡ в сочетании с НСПВС в соответствии с изобретением.

Используемый в настоящем описании термин «задержка» развития боли означает отсрочку, препятствие, замедление, задержку, стабилизацию и/или отложенное прогрессирование боли. Эта задержка может быть различной длительности, в зависимости от анамнеза заболевания и/или индивидуумов, получающих лечение. Как очевидно для специалиста в данной области, достаточная или значительная задержка может в действительности охватывать профилактику в том, что у индивидуума не развивается боль. Способ, который «задерживает» развитие симптома, представляет собой способ, который снижает вероятность развития симптома в данной временной рамке и/или снижает степень симптомов в данной временной рамке, по сравнению с отсутствием применения способа. Такие сравнения обычно основаны на клинических исследованиях с использованием статистически значимого количества индивидуумов.

- 8 010159 «Развитие» или «прогрессирование» боли означает исходные проявления и/или следующее прогрессирование расстройства. Развитие боли может быть выявлено и оценено с использованием стандартных клинических методик, которые хорошо известны в данной области. Однако развитие также относится к прогрессированию, которое может быть не выявляемым. С целью данного изобретения развитие или прогрессирование относится к биологическому течению симптомов. «Развитие» включает возникновение, рецидив и начало. Используемый в настоящем описании термин «начало» или «возникновение» боли включает исходное начало и/или рецидив.

«Эффективное количество» представляет собой количество, достаточное для получения благоприятных или желательных клинических результатов, включая облегчение или снижение болевого ощущения. Для целей настоящего изобретения, эффективное количество антагониста ΝΟΡ (такого как антитело против ΝΟΡ) и НСПВС включает количество, достаточное для лечения, облегчения, снижения интенсивности или профилактики боли (включая восприятие боли и ощущение боли) любого типа, включая острую, хроническую, воспалительную, нейропатическую или послеоперационную боль. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество НСПВС и антагониста ΝΟΡ, способное модулировать порог чувствительности к внешним стимулам до уровня, сравнимого с уровнем, наблюдающимся у здоровых индивидуумов. В других вариантах осуществления этот уровень может не быть сравнимым с уровнем, наблюдающимся у здоровых индивидуумов, но снижен, по сравнению с индивидуумами, не получавшими комбинированную терапию. Эффективное количество антагониста ΝΟΡ также охватывает количество антагониста ΝΟΡ, достаточное для усиления лечения боли НСПВС (терапевтического эффекта), как описано в настоящем описании, или для снижения дозы НСПВС, необходимой для лечения или профилактики боли, как описано в настоящем описании. В соответствии с представлениями в данной области, эффективное количество антагониста ΝΟΡ в сочетании с НСПВС может варьироваться, наряду с другими причинами, в зависимости от типа боли (и анамнеза пациента, а также других факторов, таких как тип (и/или дозировка) или используемого антагониста ΝΟΡ и/или НСПВС). Эффективное количество в контексте настоящего изобретения может также представлять собой такое количества антагониста ΝΟΡ и НСПВС, при котором достигается синергизм. Эффективное количество антагониста в контексте настоящего изобретения в целом означает количество, достаточное для того, чтобы привести к усилению терапевтического эффекта НСПВС, применяемого по подводу боли (которое, в свою очередь, значит, что снижена дозировка и/или наблюдается какой-либо другой благоприятный эффект) и/или привести к благоприятному эффекту, по сравнению с лечением одним НСПВС. «Эффективное количество» антагониста ΝΟΡ может также привести к синергическому эффекту, по сравнению с введением с одним антагонистом ΝΟΡ или НСПВС.

«Индивидуум» представляет собой позвоночное, предпочтительно млекопитающее, предпочтительнее человека. Млекопитающие включают, но не ограничиваются, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних животных, приматов, лошадей, коров, собак, мышей и крыс.

Термин «НСПВС» относится к нестероидному противовоспалительному соединению. НСПВС делятся на категории в зависимости от их способности ингибировать циклооксигеназу. Циклооксигеназа 1 и циклооксигеназа 2 представляют собой две основных изоформы циклооксигеназы, и большинство стандартных НСПВС представляют собой смешанные ингибиторы этих двух изоформ. Большинство стандартных НСПВС относятся к одной из следующих пяти структурных категорий: (1) производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, напроксен, напросин, диклофенак и кетопрофен; (2) производные уксусной кислоты, такие как толметин и слиндак; (3) производные фенамовой кислоты, такие как мефенамовая кислота и меклофенамовая кислота; (4) производные бифенилкарбоновой кислоты, такие как дифлунизал и флуфенизал; и (5) оксикамы, такие как пироксим, судоксикам и изоксикам.

Был описан другой класс НСПВС, которые избирательно ингибируют циклооксигеназу 2. Ингибиторы Сох-2 были описаны, например, в патентах США №№ 5616601; 5604260; 5593994; 5550142; 5536752; 5521213; 5475995; 5639780; 5604253; 5552422; 5510368; 5436265; 5409944 и 5130311, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки. Определенные иллюстративные ингибиторы СОХ-2 включают целекоксиб (8С-58635), рофекоксиб, ΌυΡ-697, флозулид (СОР-28238), мелоксикам, 6метокси-2-нафтилуксусную кислоту (6-ΜΝΑ), МК-966, набуметон (пролекарство для 6-ΜΝΑ), нимезулид, Ν8-398, 8С-5766, 8С-58215, Т-614; или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления аспирин и/или ацетоминофен применяются в сочетании с антагонистом ΝΟΡ (таким как антитело против ΝΟΡ). Аспирин представляет собой другой тип не стероидного противовоспалительного соединения.

Используемый в настоящем описании термин «в сочетании» включает одновременное введение и/или введение в различное время. Введение в сочетании также охватывает введение в виде совместной композиции (т.е. антагонист ΝΟΡ и НСПВС присутствуют (комбинируются) в одной и той же композиции) и/или введение в виде отдельных композиций. Используемый в настоящем описании термин «введение в сочетании» предназначен охватывать любое обстоятельство, при котором НСПВС и антагонист ΝΟΡ вводятся в эффективном количестве индивидууму, которое может происходить одновременно и/или отдельно. Как далее обсуждается в настоящем описании, понятно, что антагонист ΝΟΡ и НСПВС могут вводиться с различной частотой и/или интервалами введения. Например, антитело против ΝΟΡ можно

- 9 010159 вводить 1 раз/нед., тогда как НСПВС можно вводить чаще. Понятно, что антагонист ΝΟΡ и НСПВС могут вводиться одним и тем же путем введения или различными путями введения.

«Послеоперационная боль» (взаимозаменяемо именуемая «болью после разреза» или «посттравматической болью») относится к боли, возникающей или происходящей от внешней травмы, такой как порез, прокол, разрез, разрыв или рана ткани индивидуума (включая боль, которая возникает в результате хирургических процедур, инвазивных, или не инвазивных). Используемый в настоящем описании термин «послеоперационная боль» не включает боль, которая возникает (появляется или происходит) без внешней физической травмы. В некоторых вариантах осуществления послеоперационная боль является внутренней или внешней (включая периферическую) болью, и рана, порез, травма, разрыв или разрез могут возникнуть случайно (как при травматической ране) или умышленно (как при операционном разрезе). Используемый в настоящем описании термин «боль» включает восприятие боли и ощущение боли, и боль можно оценивать объективно с использованием балльных оценок боли и других способов, хорошо известных в данной области. Используемый в настоящем описании термин «послеоперационная боль» включает аллодинию (т.е. повышенную реакцию (т.е. восприятие боли) в ответ на обычно не болевой раздражитель) и гиперальгезию (т.е. повышенную реакцию на обычно болевой или неприятный раздражитель), которые, в свою очередь, могут быть термическими или механическими (тактильными) по природе. В некоторых вариантах осуществления боль характеризуется термической чувствительностью, механической чувствительностью и/или болью в покое. В некоторых вариантах осуществления послеоперационная боль включает механически вызванную боль или боль в покое. В других вариантах осуществления послеоперационная боль включает боль в покое.

Лечение боли НСПВС «усиливается», когда аспект лечения НСПВС улучшается (по сравнению с введением НСПВС без введения антагониста ΝΟΡ). Например, эффективность лечения НСПВС можно увеличить в присутствии антагониста ΝΟΡ, относительно эффективности НСПВС в отсутствие антагониста ΝΟΡ. В качестве другого примера, лечение или профилактика боли НСПВС может быть «усилена» применением антагониста ΝΟΡ в сочетании с НСПВС, когда это применение обеспечивает возможность лучшего облегчения боли (например, когда применяется доза НСПВС, которая не обеспечивает возможность эффективного лечения или профилактики боли).

Способы изобретения

В отношении всех способов, описанных в настоящем описании, ссылки на антагонисты ΝΟΡ и НСПВС также включают композиции, включающие одно или несколько этих средств. Настоящее изобретение можно применять для лечения боли у индивидуумов, включающих всех млекопитающих, и человека, и не человека.

В одном аспекте изобретение предоставляет способы лечения боли у индивидуума, включающие введение эффективного количества антагониста ΝΟΡ (такого как антитело против ΝΟΡ) в сочетании с эффективным количеством НСПВС. В некоторых вариантах осуществления вводится количество антагониста ΝΟΡ, достаточное для того, чтобы обеспечить возможность снижения обычной дозы НСПВС, требуемой для получения такой же степени эффекта облегчения боли по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80% или по меньшей мере примерно на 90%, или более.

В другом аспекте изобретение предоставляет способы усиления лечения боли НСПВС у индивидуума, предусматривающие введение эффективного количества антагониста ΝΟΡ в сочетании с эффективным количеством НСПВС.

В некоторых вариантах осуществления боль включает одну или несколько из следующих: острую и/или хроническую боль, любую боль с воспалительным компонентом, послеоперационную боль (включая зубную боль), мигрень, головную боль и невралгию тройничного нерва, боль, связанную с ожогом, раной или почечным камнем, боль, связанную с травмой (включая травматическое повреждение головы), нейропатическую боль, боль, связанную с серповидноклеточным кризом, боль, связанную с дисменорреей или кишечной дисфункцией, и боль, связанную с раком (включая «приступообразную боль» и боль, связанную с терминальными стадиями рака). В других вариантах осуществления боль представляет собой боль, которую обычно лечат НСПВС (таким как ибупрофен). В других вариантах осуществления боль связана с ожогом. В других вариантах осуществления боль связана с ревматоидным артритом. В других вариантах осуществления боль связана с остеоартритом.

В другом аспекте изобретение предоставляет способы профилактики, облегчения и/или профилактики развития или прогрессирования боли. Так, в некоторых вариантах осуществления, антагонист ΝΟΡ, такой как антитело против ΝΟΡ, и/или НСПВС вводятся перед болезненным событием (таким как операция). Например, антагонист ΝΟΡ можно ввести за 30 мин, за 1, 5, 10, 15 ч, 24 ч или даже более, например за 1 день, несколько дней или даже 1 неделю, 2 недели, 3 недели или более перед видами активности, которые, вероятно, приведут или связаны с риском вызванной боли, такие как внешняя травма или операция.

Лечение или профилактика боли оценивается с использованием способов, хорошо известных в данной области. Оценку можно выполнять на основании объективного показателя, такого как наблюдение

- 10 010159 поведения, такого как реакция на раздражители, выражения лица и тому подобные. Оценка может быть также основана на субъективных показателях, таких как характеристика пациентом боли с использованием различных шкал боли (см., например, 1<а(х е( а1., 8игд С11п ΝογΙΙι Ат. (1999) 79 (2):231-52; Сагасеш е( а1. Σ Рат 8ут(от Мападе (2002) 23 (3):239-55).

Диагностика и оценка боли при ревматоидном артрите хорошо установлена в данной области. Оценку можно выполнить на основании показателей, известных в данной области, таких как характеристика пациентом боли с использованием различных шкал боли (см., например, Ка(х е( а1., 8игд С11п ΝογΙΙι Ат. (1999) 79 (2):231-52; Сагасеш е( а1. Σ Рат 8ут(от Мападе (2002) 23(3):239-55). Существуют также обычно используемые шкалы измерения патологического состояния, такие как (Не Атепсап Со11еде о£ КНеита!о1оду (АсЯ) (Ге15оп. е( а1., Лг(Нг1(15 апб ЯНеитабкт (1993) 36(6):729-740), (Не Неа1(Н Аккекктеп! Оие5(юппайе (НАО) (Ег1е8, е( а1., (1982) Σ. ЯНепта(о1. 9:789-793), (Не Раи1и8 8са1е (Раи1и8, е( а1., Агйпбк апб ЯНеитаШт (1990) 33: 477-484), апб (Ре Агйгйт 1трас( Меакиге 8са1е (А1М8) (Меепат, е( а1., АйНиШ апб ЯНеита!о1оду (1982) 25:1048-1053).

Диагностика и оценка боли при остеоартрите хорошо установлена в данной области. Оценку можно выполнить на основании показателей, известных в данной области, таких как характеристика пациентом боли с использованием различных шкал боли (см., например, 1<а(х е( а1., 8игд С1т Νογ(Ρ Ат. (1999) 79 (2):231-52; Сагасеш е( а1. Σ Рат 8ут(от Мападе (2002) 23(3):239-55). Например, шкалу ^ОМАС боли при подъеме после операции (включая боль, тугоподвижность и физическую функцию) и 100 мм зрительную аналоговую шкалу (УА8) можно использовать для оценки боли и оценки реакции на лечение.

Понятно, что когда антагонист ΝΟΡ (такой как антитело против ΝΟΡ) и НСПВС вводятся в сочетании, или в виде одной, или отдельной композиции (композиций), антагонист фактора роста нервов и НСПВС представлены в соотношении, которое согласуется с проявлением желательного эффекта. В некоторых вариантах осуществления соотношение по массе между антагонистом фактора роста нервов и НСПВС может составлять примерно 1 к 1. В некоторых вариантах осуществления соотношение может составлять от примерно 0,001 до примерно 1 и от примерно 1000 до примерно 1, от примерно 0,01 до примерно 1 и от примерно 100 до примерно 1, или от примерно 0,1 до примерно 1 и от примерно 10 до примерно 1. Предусмотрены другие соотношения.

Следует понимать, что количество антагониста фактора роста нервов и НСПВС, требуемое для применения при лечении или профилактике боли, будет варьироваться не только в зависимости от выбранных конкретных соединений или композиций, но также от пути введения, природы состояния, подвергающегося лечению, и возраста и состояния пациента, и, в конечном счете, будет выбираться по усмотрению лечащего врача.

Антагонисты ΝΟΡ

В способах изобретения используется антагонист ΝΟΡ, который относится к любой молекуле, которая блокирует, подавляет или снижает (включая значительно) биологическую активность ΝΟΡ, включая нисходящие пути, опосредованные передачей сигналов ΝΟΡ, такие как связывание с рецепторами и/или клеточная реакция, вызванная ΝΟΡ. Термин «антагонист» не подразумевает специфический механизм безотносительного биологического действия, и считается, что он явно включает и охватывает все возможные фармакологические, физиологические и биохимические взаимодействия с ΝΟΡ и их последствия, которые могут быть достигнуты разнообразными различными и химически различающимися композициями. Иллюстративные антагонисты ΝΟΡ включают, но не ограничиваются, антитело против ΝΟΡ, полипептид (включая полипептид, включающий домен, связывающий ΝΟΡ, полученный из антитела против ΝΟΡ, например, связывающий домен, включающий области СОЯ, достаточные для связывания ΝΟΡ), антисмысловую молекулу, направленную на ΝΟΡ (включая антисмысловую молекулу, направленную на нуклеиновую кислоту, кодирующую ΝΟΡ), антисмысловую молекулу, направленную на оба рецептора ТгкА и/или р75 (включая антисмысловые молекулы, направленные на молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую ТгкА или р75), соединение, ингибирующее ΝΟΡ, структурный аналог ΝΟΡ, доминантно-негативную мутацию рецептора ТгкА и/или р75, которая связывает ΝΟΡ, антитело против ТгкА, который связывает ΝΟΡ, иммуноадгезин ТгкА, антитело против ТгкА, антитело против р75 и ингибитор киназы. Для цели настоящего изобретения следует четко понимать, что термин «антагонист» охватывает ранее идентифицированные термины, названия и функциональные состояния и характеристики, посредством которых сам ΝΟΡ, биологическая активность ΝΟΡ (включая, но не ограничиваясь, способность опосредовать любой аспект боли) или последствия биологической активности по существу аннулируется, уменьшается или нейтрализуется в любой значимой степени. В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ (например, антитело против ΝΟΡ) связывает (физически взаимодействует с) ΝΟΡ, связывается с рецептором ΝΟΡ (таким как рецептор ТгкА и/или р75) и/или снижает и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептора ΝΟΡ. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ связывает (физически взаимодействует с) ΝΟΡ. В других вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ связывается с рецептором ΝΟΡ (таким как рецептор ТгкА и/или р75). В других вариантах осуществления антагонист снижает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептора ΝΟΡ (например, передачу сигналов ингибиторов киназы). В других вариантах осуществления антагонист ингибирует (снижает) синтез и/или высвобождение ΝΟΡ. В другом варианте осуществления

- 11 010159 антагонист ΝΟΕ представляет собой иммуноадгезин ТгкА. В другом варианте осуществления антагонист ΝΟΕ отличен от антитела против ΝΟΕ. В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΕ связывает ΝΟΕ (такой как 11ΝΟΕ) и значительно не связывается с родственными нейротропинами, такими как ΝΤ-3, ΝΤ-4/5 и/или ΒΌΝΕ. В некоторых вариантах осуществления антагонист связывает человеческий ΝΟΕ и значительно не связывает ΝΟΕ от других видов позвоночных (в некоторых вариантах осуществления млекопитающих). В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΕ связывает человеческий ΝΟΕ, а также один или несколько ΝΟΕ от других видов позвоночных (в некоторых вариантах осуществления млекопитающих). В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΕ связывает ΝΟΕ, а также по меньшей мере один другой нейротропин. В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΕ связывается с ΝΟΕ видов млекопитающих, таких как лошадь или собака, но значительно не связывается с ΝΟΕ от других видов млекопитающих.

Антитела против ΝΟΡ

В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист ΝΟΕ включает антитело против ΝΟΕ. Антитело против ΝΟΕ должно проявлять любую одну или несколько из следующих характеристик: (а) связывание с ΝΟΕ и ингибирование биологической активности ΝΟΕ и/или нисходящего пути (путей), опосредованного функцией передачи сигналов ΝΟΕ; (Ь) лечение или профилактика любого аспекта боли, в частности, в сочетании с НСПВС; (с) блокада или уменьшение активации рецепторов ΝΟΕ (включая димеризацию и/или автофосфорилирование рецепторов 1гкА); (б) увеличение выведения ΝΟΕ; (е) усиление лечения боли НСПВС.

Антитела против ΝΟΕ известны в данной области (см., например, заявки РСТ №№ АО 02096458; АО 01/78698, АО 01/64247, патенты США №№ 5844092, 5877016 и 6153189; Нопдо е1 а1., НуЬпбота, 19:215-227 (2000); Се11. Мо1ес. Βΐοΐ. 13:559-568 (1993); номера доступа ОепВапк И39608, И39609, Ш7078 или Ш7077.

В некоторых вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ специфически связывается с ΝΟΕ. В еще одних вариантах осуществления антитело является гуманизированным (таким как описанное в настоящем описании антитело Е3). В некоторых вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ представляет собой антитело Е3 (как описано в настоящем описании). В других вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ включает один или более СОВ антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или, в некоторых вариантах осуществления, все 6 СВЭ из Е3). В других вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ является человеческим. В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в табл. 1 (8ЕО Ш ΝΟ:1), и аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в табл. 2 (8ЕО Ш ΝΟ:2). В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ включает аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, показанную в табл. 1 (8ЕО Ш ΝΟ:1). В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ включает аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, показанную в табл. 2 (8ЕО Ш ΝΟ:2). В еще одних вариантах осуществления антитело включает модифицированную константную область, такую как константная область, которая является иммунологически инертной, например, не запускает лизис, опосредованный комплементом, или не стимулирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЭСС). В других вариантах осуществления константная область модифицирована, как описано в Еиг. 1. 1ттипо1. (1999) 29:2613-2624; заявке РСТ № РСТ/ОВ99/01441; и/или в заявке на патент Великобритании № 9809951.8. В других вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ представляет собой любое антитело, описанное в заявке на патент США под серийным № 10/745775.

В некоторых вариантах осуществления антитело против ΝΟΕ представляет собой гуманизированное мышиное моноклональное антитело против ΝΟΕ, называемое антителом «Е3», которое включает константную область тяжелой цепи человеческого 1дС2а, содержащую следующие мутации: от А330Р331 до 83308331 (нумерация аминокислот со ссылкой на последовательность 1дО2а дикого типа; см. Еиг. 1. 1ттипо1. (1999) 29:2613-2624); каппа константной области человеческой легкой цепи и вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, показанные в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Вариабельная область тяжелой цепи ОУОЕОЕ86Р6ЬУКР8ЕТ13ЕТСТУ86ГШ6¥ОЬВХИКОРРОКСЬЕОДОПМГООТТ ΟΥΝ5ΑνΚ8ΚνΤΙ8ΚϋΤ5ΚΝΟΕ8ΕΚΕ88νΤΛΛϋΤΑνΥΥεΛ1«ίΓΐΥ\νΥΑ'ί8ΥΥΡΟΥΧν 60ОТ1.УТУ8(8Е0 ГО N0:1).

Таблица 2. Вариабельная область легкой цепи ϋΙ0Μ308Ρ88Ε8Α8νθΟΚνΤΙΤ0ΒΑ8φ818ΝΝΕΝΑΥ00ΚΡΟΚΑΡΚΕυΥΥ1·8ΚΕΗ5 θνΐ>8ΕΡ8Ο8α8ΟΤΟΓΤΕΓΙ88Ε0ΡΕΟΙΑΤΥΥί:00ΕΗΓΕΡΥΤΕ00€>ΊΚ1ΑΙΚΚ.Γ(.8Ε0

ГО N0:2).

Следующие полинуклеотиды, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи Е3 или легкой цепи Е3 были депонированы в АТСС 8 января 2003 г.:

- 12 010159

Материал		№ доступа АТСС	Дата депонирования
Вектор ЕЬ.911.3Е	вариабельная область легкой цепи ЕЗ	РТА-4893	8 января 2003 г.
Вектор ЕЬ.риг.911.3Е	вариабельная область легкой цепи ЕЗ	РТА-4894	8 января 2003 г.
Вектор ИЬ.911.3Е	вариабельная область тяжелой цепи ЕЗ	РТА-4895	8 января 2003 г.

Вектор ЕЬ.911.3Е представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, показанной в табл. 2; Вектор ЕЬ.риг.911.3Е представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи, показанной в табл. 2, и Вектор ИЬ.911.3Е представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, показанной в табл. 1. Эти полинуклеотиды также кодируют константные домены.

Существует по меньшей мере две методики для определения СИР: (1) подход, основанный на перекрестно-видовой изменчивости последовательностей (т.е. КаЬа! с1 а1. Зсциспсск οί Рго1еш5 οί Ιιηιηιιποίοβίса1 ΙπΙοΓΟδΙ, (5‘^ь еб., 1991, Ναΐίοπαί 1п5Йи1.ек οί НеаИб, ВеШекба Мб)); и (2) поход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (СЬи!^ е1 а1. (1989) №1Шге 342:877; А11;·ιζί1<;·ιηί е1 а1. (1997) 1. Μο^. Βίο1. 273:927-948)). Используемый в настоящем описании термин «СИР» может относиться к СИР, определенным любым подходом или комбинацией обоих подходов.

В другом варианте осуществления антитело против ΝΟΒ включает один или несколько СИР антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или в некоторых вариантах осуществления все 6 СИР из Е3). Определение областей СИР достаточно известно в данной области. СИР могут представлять собой КаЬа1, Сйοΐй^а или комбинацию КаЬа! и Сйοΐй^а.

Антитела, которые можно применять в настоящем изобретении, могут охватывать моноклональные антитела, поликлональные антитела, фрагменты антител (например, ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')2, Εν, Ес и т.д.), химерные антитела, биспецифические антитела, гетероконъюгатные антитела, одноцепочечные ^Εν), их мутанты, гибридные белки, включающие антительную часть, гуманизированные антитела и любую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая включает сайт распознавания антигена требуемой специфичности, включая варианты гликозилирования антител, варианты аминокислотной последовательности антител и ковалентно модифицированные антитела. Антитела могут быть мышиными, крысиными, человеческими или любого другого происхождения (включая химерные и гуманизированные антитела). Для целей настоящего изобретения антитело взаимодействует с Ν6Ε таким образом, который ингибирует Ν6Ε и/или нисходящие пути, опосредованные функцией передачи сигналов Ν6Ε. В одном варианте осуществления антитело представляет собой человеческое антитело, которое распознает один или несколько эпитопов на человеческом Ν6Ε. В другом варианте осуществления антитело представляет собой мышиное или крысиное антитело, которое распознает один или несколько эпитопов на человеческом Ν6Ε. В другом варианте осуществления антитело распознает один или несколько эпитопов на Ν6Ε, выбранном из группы, состоящей из: грызунов, собак, кошек, лошадей и коров. В другом варианте осуществления антитело включает модифицированную константную область, такую как константная область, которая является иммунологически инертной (т.е. не запускает опосредованный комплементом лизис) или не стимулирует антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АИСС). Активность АИСС можно оценить с использованием способов, раскрытых в патенте США № 5500362. В других вариантах осуществления константная область модифицирована, как описано в Еиг. 1. Iттиηο1. (1999) 29:2613-1624; публикации РСТ № РСТ/6В99/01441 и/или в заявке на патент Великобритании № 9809951.8.

Аффинитет связывания антитела против Ν6Ε с Ν6Ε (таким как 11ΝΟΒ) может составлять от примерно 0,01 до примерно 1 нМ, от примерно 0,05 до примерно 0,25 нМ, от примерно 0,10 до примерно 0,80 нМ, от примерно 0,15 до примерно 0,75 нМ и от примерно 0,18 до примерно 0,72 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 1, примерно 2, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 40 или более чем примерно 40 пкМ. В одном варианте осуществления аффинитет связывания составляет между примерно 2 нкМ и 22 пкМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее примерно 100, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ, примерно 500, примерно 100, примерно 50, примерно 10 пкМ. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 10 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее примерно 10 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 0,1 или примерно 0,07 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет менее примерно 0,1 или менее примерно 0,07 нМ. В других вариантах осуществления аффинитет связывания составляет любой из от примерно 100, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ, примерно 500 примерно 100, примерно 50 пкМ до любого из примерно 2 пкМ, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20 или примерно 40 пкМ. В некоторых вариантах осуществления аффинитет связывания составляет любой из примерно 100, примерно 50, примерно 10, примерно 1 нМ,

- 13 010159 примерно 500, примерно 100 или примерно 50 пкМ, или менее примерно 50 пкМ. В еще одних вариантах осуществления аффинитет связывания составляет примерно 2, примерно 5, примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 40 пкМ или более примерно 40 пкМ.

Одним способом определения аффинитета связывания антител с ΝΟΕ является измерение аффинитета монофункциональных фрагментов ΕаЬ антитела. Для получения монофункциональных фрагментов ΕаЬ антитело (например, 1§С) можно расщепить папаином или экспрессировать рекомбинантно. Аффинитет фрагмента ΕаЬ против ΝΟΕ антитела можно определить поверхностным резонансом плазмона (устройство для определения поверхностного резонанса плазмона (8РВ) В1Асоге 3000™, В1Асоге, ΙΝΟ. Р18са^ау Ν1). Чипы СМ5 можно активировать гидрохлоридом №этил-№-(3диметиламинопропил)карбодиимида (ЕЭС) и Ν-гидроксисукцинимидом (ΝΗ8) в соответствии с инструкциями поставщика. Человеческий ΝΟΕ можно развести в 10 мМ ацетате натрия при рН 4,0 и инъецировать поверх активированного чипа в концентрации 0,005 мг/мл. Используя вариабельное время потока по отдельным каналам чипа, можно достичь два диапазона плотности антигена: 100-200 единиц реакции (Ви) для детальных кинетических исследований и 500-600 Ви для скрининговых анализов. Чип можно блокировать этаноламином. Исследования регенерации показали, что смесь элюционного буфера Р1егсе (продукт № 21004, Р1егсе В1о1есЬио1оду 1Ь) и 4 М №1С’1 (2:1) эффективно удаляет связанный ΕаЬ, одновременно сохраняя активность 1ΝΟΕ на чипе в течение 200 инъекций. Буфер НВ8-ЕР (0,01 М НЕРЕ8, рН 7,4, 0,15 №С1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% поверхностно-активное вещество Р20) используют в качестве рабочего буфера для анализов В1Асоге. Серийные разведения (0,1-10х определенный К_о) образцов очищенного ΕаЬ инъецируют в течение 1 мин в концентрации 100 мкл/мин и допускаются величины времени диссоциации до 2 ч. Концентрации белков ΕаЬ определяют ЕЫ8А и/или электрофорезом 8Э8-РАСЕ с использованием ΕаЬ известной концентрации (по данным определения аминокислотным анализом) в качестве стандарта. Скорости кинетической ассоциации (к_оп) и скорости диссоциации (к_о££) получают одновременно подгонкой данных к модели связывания Ьапдти1г 1:1 (Кагккоп, В. Вооз, Η. Εаде^8ίат, Ь. Ре1ег88оп, В. (1994). МеШобз Епхуто1оду 6:99-110) с использованием программы оценки В1А. Величины константы равновесной диссоциации (К_с) можно рассчитать в виде к_о££/к_оп. Этот протокол подходит для использования при определении аффинитета связывания антитела с ΝΟΕ любого вида, включая человеческий ΝΟΕ, ΝΟΕ других позвоночных (в некоторых вариантах осуществления, млекопитающих) (такой как мышиный ΝΟΕ, крысиный ΝΟΕ, ΝΟΕ приматов), а также для использования с другими нейротропинами, такими как родственные нейротропины ΝΤ3, ΝΤ4/5 и/или ΕΩΝΕ.

В некоторых вариантах осуществления антитело связывает человеческий ΝΟΕ и значительно не связывает ΝΟΕ от других видов позвоночных (в некоторых вариантах осуществления, млекопитающих). В некоторых вариантах осуществления антитело связывает человеческий ΝΟΕ, а также один или несколько ΝΟΕ от других видов позвоночных (в некоторых вариантах осуществления, млекопитающих, таких как грызуны). В еще одних вариантах осуществления антитело связывает ΝΟΕ и не вступает в значительное перекрестное взаимодействие с другими нейротропинами (такими как родственные нейротропины ΝΤ3, ΝΤ4/5 и/или ΕΩΝΕ). В некоторых вариантах осуществления антитело связывает ΝΟΕ, а также, по меньшей мере, один другой нейротропин. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с ΝΟΕ видов млекопитающих, таких как лошадь или собака, но значительно не связывается с ΝΟΕ от других видов млекопитающих.

Эпитопы могут быть непрерывными или прерывистыми. В одном варианте осуществления антитело связывает по существу тот же эпитоп 1ΝΟΕ, что и антитело, выбранное из группы, состоящей из МАЬ 911, МАЬ 912 и МАЬ 938, как описано в публикации Нопдо, е! а1., НуЬпбота 19:215-227 (2000). В другом варианте осуществления антитело связывает по существу тот же эпитоп 1ΝΟΕ, что и МАЬ 911. В еще одном варианте осуществления антитело связывает по существу тот же эпитоп 1ΝΟΕ, что и МАЬ 909 (см. Нопдо, е! а1., выше). Например, эпитоп может включать один или несколько из: К32, К34 и Е35 в пределах вариабельной области 1 (аминокислоты 23-35) 1ΝΟΕ; остатки Ε79 и Т81 в пределах вариабельной области 4 (аминокислоты 81-88) 1ΝΟΕ; остатки Н84 и К88 в пределах вариабельной области 4; остаток В103 между вариабельной областью 5 (аминокислоты 94-98) 1ΝΟΕ и С-концом (аминокислоты 111-118) 1ΝΟΕ; остаток Е11 в пределах превариабельной области 1 (аминокислоты 10-23) 1ΝΟΕ; Υ52 между вариабельной областью 2 (аминокислоты 40-49) 1ΝΟΕ и вариабельной областью 3 (аминокислоты 59-66) 1ΝΟΕ; остатки Ь112 и 8113 в пределах С-конца 1ΝΟΕ; остатки В59 и В69 в пределах вариабельной области 3 1ΝΟΕ; или остатки У18, У20 и О23 в пределах превариабельной области 1 1ΝΟΕ. Кроме того, эпитоп может включать одну или несколько из вариабельной области 1, вариабельной области 3, вариабельной области 4, вариабельной области 5, Ν-концевой области и/или С-конца 1ΝΟΕ. В еще одном варианте осуществления антитело значительно снижает доступность для растворителя остатка В103 1ΝΟΕ. Понятно, что хотя описанные выше эпитопы относятся к человеческому ΝΟΕ, средний специалист в данной области может совместить структуры человеческого ΝΟΕ с ΝΟΕ других видов и идентифицировать вероятные копии этих эпитопов.

В одном аспекте антитела (например, человеческие, гуманизированне, мышиные, химерные), которые могут ингибировать ΝΟΕ, можно получить использованием иммуногенов, которые экспрессируют

- 14 010159 полную длину или частичную последовательность ΝΟΡ. В другом аспекте можно использовать иммуноген, включающий клетку, которая избыточно экспрессирует ΝΟΡ. Другой пример иммуногена, который можно использовать, представляет собой белок ΝΟΡ, который содержит ΝΟΡ полной длины или часть белка Ν6Ρ.

Антитела против ΝΟΡ можно получить любым способом, известным в данной области. Путь и схема иммунизации животного-хозяина в целом согласуются с принятыми и обычными методиками для стимуляции и продукции антител, как далее описано в настоящем описании. Общие методики для продукции человеческих и мышиных антител известны в данной области и описаны в настоящем описании.

Предусматривается, что можно манипулировать любым млекопитающим индивидуумом, включая людей или полученные у них клетки, продуцирующие антитела, для того, чтобы служить в качестве основы для продукции линии клеток гибридомы млекопитающих, включая человека. Обычно животноехозяин инокулируется внутрибрюшинно, внутримышечно, перорально, подкожно, внутриподошвенно и/или внутрикожно некоторым количеством иммуногена, включая то, как описано в настоящем описании.

Гибридомы можно получить из лимфоцитов и иммортализованных клеток миеломы с использованием общей методики гибридизации соматических клеток КоЫег, В. апй Мййет, С. (1975) №1игс 256:495-497 или в модификации Виск, Ό.^., е! а1. 1п Уйго, 18:377-381 (1982). При гибридизации можно использовать доступные линии миеломы, включая, но не ограничиваясь, Х63-Ад8.653 и линии из 8а1к 1п8!йи!е, Се11 О18(г1Ьи11оп Сеп!ег, 8ап П1едо, Са1й., И8А. В целом, методика включает слияние клеток миеломы и лимфоидных клеток с использованием фузогена, такого как полиэтиленгликоль, или электрическими средствами, хорошо известными специалистам в данной области. После слияния клетки отделяют от среды слияния и выращивают в избирательной ростовой среде, такой как среда гипоксантинааминоптерина-тимидина (НАТ), для удаления негибридизированных родительских клеток. Для культивирования гибридом, которые секретируют моноклональные антитела, можно использовать любую из описанных в настоящем описании сред с добавкой сыворотки или без нее. В качестве другой альтернативы методике слияния клеток, можно использовать В-клетки, иммортализованные ЕВУ (вирусом Эпштейна-Барра), для продукции моноклональных антител против ΝΟΡ настоящего изобретения. При желании, гибридомы распространяются и субклонируются, и надосадочные жидкости анализируют для выявления антииммуногенной активности обычными процедурами иммуноанализа (например, радиоиммуноанализа, ферментного иммуноанализа или флюоресцентного иммуноанализа).

Гибридомы, которые можно использовать в качестве источника антител, охватывают все производные, клетки потомства родительских гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела, специфичные для ΝΟΡ, или их части.

Гибридомы, которые продуцируют такие антитела, можно выращивать ш νίΙΐΌ или ш νί\Ό с использованием известных процедур. При желании, моноклональные антитела можно выделить из культуральной среды или биологических жидкостей обычными процедурами очистки иммуноглобулина, такими как осаждение сульфатом аммония, гель-электрофорез, диализ, хроматография и ультрафильтрация. Нежелательную активность в случае ее присутствия можно удалить, например, проведением получения над адсорбентами, изготовленными из иммуногена, прикрепленного к твердой фазе, и элюированием или высвобождением желательных антител из иммуногена. Иммунизация животного-хозяина человеческим ΝΟΡ или фрагментом, содержащим аминокислотную последовательность-мишень, конъюгированную с белком, который является иммуногенным у видов, подлежащих иммунизации, например, гемоцианин в форме замочной скважины или блюдечка, сывороточный альбумин, бычий тиреоглобулин или ингибитор трипсина соевых бобов с использованием бифункционального или дериватизирующего средства, например, сложного малеимидобензоилового эфира сульфосукцинимида (сопряженное связывание через цистеиновые остатки), Ν-гидроксисукцинимида (через лизиновые остатки), глутаральдегида, янтарного ангидрида, 8ОС1₂ или Κ?Ν^=ΝΚ, где В и В¹ представляют собой различные алкильные группы, может дать популяцию антител (например, моноклональных антител).

При желании, интересующее антитело против ΝΟΡ (моноклональное или поликлональное) можно секвенировать, и полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид антитела против ΝΟΡ, можно затем клонировать в вектор для экспрессии или распространения. Последовательность, кодирующая интересующее антитело, может поддерживать в векторе в клетке-хозяине, и клетку-хозяина можно затем размножить и заморозить для будущего применения. В альтернативе, полинуклеотидную последовательность можно использовать для генетического манипулирования для «гуманизации» антитела или для улучшения аффинитета или других характеристик антитела. Например, константную область можно подвергнуть манипуляциям генной инженерии для того, чтобы она больше напоминала человеческие константные области во избежание иммунной реакции, если антитело используется в клинических испытаниях и способах лечения у людей. Может быть желательно подвергнуть генетическим манипуляциям последовательность антитела для получения большего аффинитета к ΝΟΡ и больше эффективности при ингибировании ΝΟΡ. Для специалиста в данной области будет очевидно, что можно произвести одно или несколько изменений полинуклеотида в антителе против ΝΟΡ и все же сохранить его способность связываться с ΝΟΡ.

- 15 010159

Существует 4 общих стадии для гуманизации моноклонального антитела. Они представляют собой: (1) определение нуклеотида и прогнозируемой аминокислотной последовательности легкого и тяжелого вариабельных доменов исходного антитела, (2) проектирование гуманизированного антитела, т.е. решение, какую каркасную область антитела использовать во время процесса гуманизации; (3) действительные методологии/методики гуманизации; и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела (см., например, патенты США №№ 4816567, 5807715, 5866692, 6331415, 5530101, 5693761, 5693762, 5585089 и 6180370.

Был описан ряд молекул «гуманизированного» антитела, включающих связывающий антиген сайт, полученный из нечеловеческого иммуноглобулина, включая химерные антитела, имеющие области V грызунов или модифицированные области V грызунов и их ассоциированные определяющие комплементарность области (СЭЯ), слитые с человеческими константными доменами (см., например, ^А1п(сг с1 а1. Хпиге 349:293-299 (1991), ЬоЬид1ю е1 а1. Ргос. Ыа1. Асай. 8ск И8А 86:4220-4224 (1989), 81ι;ιχ\ е1 а1. 1. 1ттипо1. 138:4534-4538 (1987) и Вго\уп е1 а1. Сапсег Кез. 47:3577-3583 (1987)). Другие ссылки описывают СЭК грызунов, пересаженный в человеческую опорную каркасную область (БК) перед слиянием с константным доменом соответствующего человеческого антитела (см., например, Кксйтапи е1 а1. Ыа1иге 332:323-327 (1988), Vе^Ьосуеη е1 а1. 8с1спсс 239:1534-1536 (1988) и 1опез е1 а1. Ыа1иге 321:522-525 (1986)). Другая ссылка описывает СЭК грызунов, поддерживаемые рекомбинантно облицованные каркасные области грызунов (см., например, европейскую патентную публикацию № 519596). Эти «гуманизированные» молекулы предназначены для минимизации нежелательной иммунологической реакции в отношении молекул античеловеческих антител грызунов, которая ограничивает длительность и эффективность терапевтических видов применения этих частей у людей-реципиентов. Например, константную область антитела можно сконструировать методами генной инженерии так, что она будет иммунологически инертной (например, не запускает лизис комплементом (см., например, РСТ/СВ99/01441; заявка на патент Великобритании № 9809951.8). Другие способы гуманизации антител, которые можно также использовать, раскрыты ЭандНеПу с1 а1., Ыис1. Ас1йз. Кез. 19:2471-2476 (1991) и в патентах США №№ 6180377, 6054297, 5997867, 5866692, 6210671, 6350861, и в публикации РСТ № 01/27160. Другие способы описаны в заявке на патент США под серийным № 10/745775.

В еще одной альтернативе полностью человеческие антитела можно получить использованием имеющихся в продаже мышей, которые были подвергнуты модификации генной инженерией для экспрессии специфических белков человеческого иммуноглобулина. Трансгенные животные, которые предназначены для продукции более желательных (например, полностью человеческих антител) или более целесообразного иммунного ответа, можно также использовать для генерирования гуманизированных или человеческих антител. Примерами такой технологии являются Хепотоизе™ от АЬдешх, 1пс. (БгетоШ. СА) и НиМАЬ-Моизе® и ТС Моизе™ от Мейагех, 1пс. (Ргтсйоп, N1).

Очевидно, что хотя приведенное выше обсуждение относится к гуманизированным антителам, общие обсужденные принципы применимы для получения антител для использования, например, у собак, кошек, приматов, лошадей и коров. Кроме того, очевидно, что один или несколько описанных в настоящем описании аспектов гуманизации антител могут комбинироваться, например, пересадка СЭК, мутация каркаса и мутация СЭК.

В альтернативе, антитела можно получить рекомбинантно и экспрессировать с использованием любого способа, известного в данной области. В другой альтернативе, антитела можно изготовить рекомбинантно технологией воспроизведения фага (см., например, патенты США №№ 5565332, 5580717, 5733743, 6265150 и ХУйИссг е1 а1., Аппи. Ксу. 1ттипо1. 12:433-455 (1994). Альтернативно, можно использовать технологию воспроизведения фага (МсСайейу е1 а1., №1Шге 348:552-553 (1990) для продукции человеческих антител и фрагментов антител ш уйго из генных репертуаров вариабельного (V) домена иммуноглобулина от иммунизированных доноров. В соответствии с этой методикой, гены домена V антитела клонируются внутрь рамки или в ген или большого, или маленького белка покрытия нитевидного бактериофага, такого как М13 или £й, и проявляются в виде функциональных фрагментов антитела на поверхности частицы фага. Ввиду того, что нитевидная частица содержит копию однонитевой ДНК генома фага, селекции, основанные на функциональных свойствах антитела, также приводят к отбору гена, кодирующего антитело, проявляющего эти свойства. Таким образом, фаг имитирует некоторые из свойств В-клетки. Воспроизведение фага можно выполнить в различных форматах (обзор см., например, в публикации 1ойизоп, Ксуш 8. апй СЫзте11, Эау1й 1., СиггеШ Ор1шоп ш 81гис1ига1 Вю1оду 3, 564-571 (1993). Несколько источников сегментов V гена можно использовать для воспроизведения фага. С1аскзоп е1 а1., №1Шге 352:624-628 (1991) выделили разнообразный ряд антител против оксазолона из маленькой, случайной комбинаторной библиотеки генов V, полученной из селезенок иммунизированных мышей. Можно сконструировать репертуар генов V от иммунизированных людей-доноров, и антитела к разнообразному ряду антигенов (включая аутоантигены) можно выделить, по существу следуя методикам, описанным Магк е1 а1., 1. Мо1. Вю1. 222:581-597 (1991) или СгШйй е1 а1., ЕМВО 1. 12:725-734 (1993). При естественном иммунном ответе гены антитела накапливают мутации с высокой скоростью (соматическая гипермутация). Некоторые из введенных изменений придадут более высокий аффинитет, и В-клетки,

- 16 010159 проявляющие высокоаффинный поверхностный иммуноглобулин предпочтительно реплицируются и дифференцируются во время введения последующей разрешающей дозы антигена. Этот естественный процесс можно имитировать использованием методики, известной как «перетасовка цепи» (Магкк, е! а1., Вю/ТесЬпо1. 10:779-783 (1992)). В этом способе аффинитет «первичных» человеческих антител, полученных воспроизведением фага, можно улучшить последовательным замещением генов области V тяжелой и легкой цепи репертуарами естественно встречающихся вариантов (репертуаров) генов домена V, полученных у неиммунизирозанных доноров. Эта методика обеспечивает возможность продукции антител и фрагментов антител с аффинитетами в диапазоне пкМ-нМ. Стратегия изготовления очень больших репертуаров антител фага (также известных, как «источник всех библиотек») была описана Аа1ег1юике е! а1., Ыис1. Ас16к Век. 21:2265-2266 (1993). Перетасовку гена можно также использовать для получения человеческих антител из антител грызунов, где человеческое антитело имеет аффинитеты и специфичности, аналогичные исходному антителу грызунов. В соответствии с этим способом, который также именуется «впечатыванием эпитопа», ген домена V тяжелой или легкой цепи антител грызунов, полученных методикой воспроизведения фага, замещается репертуаром генов человеческого домена V, создавая химеры грызуна-человека. Отбор на антигене приводит к выделению человеческих, вариабельных областей, способных восстановить сайт, связывающий функциональный антиген, т.е. эпитоп управляет (впечатывает) выбором партнера. Когда процесс повторяется для замещения остающегося домена V грызунов, получается человеческое антитело (см. патентную заявку РСТ АО 9306213, опубликованную 1 апреля 1993г.). В отличие от традиционной гуманизации антител грызунов, которые не имеют каркас или остатки СЭВ, происходящие от грызунов. Очевидно, что хотя приведенное выше обсуждение относится к гуманизированным антителам, общие обсужденные принципы применимы к получению по требованию антител для использования, например, у собак, кошек, приматов, лошадей и коров.

Антитела можно изготовить рекомбинантно сначала выделением антител и клеток, продуцирующих антитела, от животных-хозяев, получая генную последовательность, и используя генную последовательность для рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках СНО). Другой способ, который можно использовать, представляет собой экспрессиюю последовательности антител у растений (например, табака) или трансгенного молока. Были раскрыты способы рекомбинантной экспрессии антител у растений или молока (см., например, Рее!егк, е! а1. Уассше 19:2756 (2001); ЬопЬетд, N. апб Ό. Ннкхаг 1п1.Веу.1шшипо1 13:65 (1995); и Ро11оск, е! а1., 1. 1ттипо1 МеЛобк 231:147 (1999). Способы получения производных антител, например, гуманизированных, одиночноцепочечных и т.д., известны в данной области.

Иммунные анализы и методики сортировки проточной цитометрией, такие как сортировка клеток, активированная флюоресценцией (ЕАС8), можно также использовать для выделения антител, которые специфичны для ΝΟΕ.

Антитела могут быть связаны со многими различными носителями. Носители могут быть активными и/или инертными. Примеры хорошо известных носителей включают полипропилен, полистирол, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, стекло, естественные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, агарозы и магнетит. Природа носителя может быть или растворимой, или нерастворимой для целей изобретения. Специалистам в данной области известны другие подходящие носители для связывания антител или способы установить их с использованием обычного экспериментирования.

ДНК, кодирующая моноклональные антитела, легко изолируется и секвенируется с использованием обычных процедур (например, использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи моноклональных антител). Клетки гибридомы служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. После изоляции ДНК можно поместить в векторы экспрессии, которые затем трансфецируются в клетки-хозяева, такие как клетки Е.со11, обезьяньи клетки СО8, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые иначе не продуцируют белок иммуноглобулина для получения синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК может также быть модифицированной, например, замещением кодирующей последовательности на константные домены тяжелой и легкой цепи человека вместо гомологичных мышиных последовательностей (Моткоп е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8сг 81:6851 (1984) или ковалентным присоединением к иммуноглобулину, кодирующему всю или часть кодирующей последовательности, на неиммуноглобулиновом полипептиде. Таким образом, получаются «химерные» или «гибридные» антитела, которые имеют специфичность связывания описанного в настоящем оплсании моноклонального антитела против ΝΟΕ. ДНК, кодирующую антагонистическое антитело против ΝΟΕ (такое как гуманизированное антагонистическое антитело против человеческого ΝΟΕ), можно использовать для доставки и экспрессии антагонистического антитела против человеческого ΝΟΕ желательной клеткой, как описано в настоящем описании. Методики доставки ДНК далее описаны в настоящем описании.

Антитела против ΝΟΕ можно характеризовать с использованием способов, хорошо известных в данной области. Например, один способ представляет собой идентификацию эпитопа, с которым оно связывается, называемый «картирование эпитопа». Существует много способов, известных в данной области, для картирования и характеристики локализации эпитопов на белках, включая растворение структуры кристалла комплекса антитело-антиген, конкурентные анализы, анализы экспрессии генных фраг

- 17 010159 ментов и анализы на основе синтетических пептидов, как описано, например, в 11 главе Наг1оте апб Ьапе, Иктд АпРЬоФек. а ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, Со1б 8рппд НагЬог, №\у Уогк, 1999. В дополнительном примере картирование эпитопа можно использовать для определения последовательности, с которой связывается атитело против ΝΟΡ. Картирование эпитопа имеется в продаже из многих источников, например, Рерксап 8ук!етк (Ебе111ег1\уед 15, 8219 РН Ье1ук!аб, Т1е №!1ег1апбк). Эпитоп может представлять собой линейный эпитоп, т.е. содержащийся в одном фрагменте секвенирования аминокислот, или конформационный эпитоп, образованный трехмерным взаимодействием аминокислот, которые необязательно могут содержаться в одном фрагменте секвенирования. Пептиды различной длины (например, по меньшей мере, длиной 4-6 аминокислот) можно выделить или синтезировать (например, рекомбинантно) и использовать для анализов связывания с антителом против ΝΟΡ. В другом примере эпитоп, с которым связывается антитело против ΝΟΡ, можно определить при систематическом скрининге использованием перекрывающих пептидов, полученных из последовательности ΝΟΡ, и определением связывания антителом против ΝΟΡ. В соответствии с анализами экспрессии генных фрагментов, открытая рамка считывания, кодирующая ΝΟΡ, фрагментирована или случайно, или специфическими генетическими конструкциями, и определяется реактивность экспрессированных фрагментов ΝΟΡ с подлежащим тестированию антителом. Генные фрагменты могут, например, продуцироваться РСК (полимеразной реакцией синтеза цепи), а затем транскрибироваться и транслироваться в белок ΐπ νίΙΐΌ в присутствии радиоактивных аминокислот. Затем определяется связывание антитела с радиоактивно меченными фрагментами ΝΟΡ иммунопреципитацией и гель-электрофорезом. Определенные эпитопы можно также идентифицировать использованием больших библиотек случайных пептидных последовательностей, проявляемых на поверхности частиц фага (библиотек фагов). Альтернативно, определенную библиотеку перекрывающих фрагментов пептидов можно тестировать на связывание с испытуемым антителом в простых анализах связывания. В дополнительном примере мутагенез домена, связывающего антиген, эксперименты обмена доменов и сканирующий мутагенез аланина можно выполнить для идентификации требуемых остатков, достаточных и/или необходимых для связывания эпитопа. Например, эксперименты обмена доменов можно выполнить с использованием мутантного ΝΟΡ, в котором различные фрагменты полипептида ΝΟΕ были замещены (обменены) последовательностями из близко родственного, но антигенно отличного белка (такого как другой член семейства белков нейротропинов). Оценкой связывания антитела с мутантным ΝΟΡ можно оценить значение определенного фрагмента ΝΟΡ для связывания антитела.

Еще одним способом, который можно использовать для характеристики антитела против ΝΟΡ, является использование конкурентных анализов с другими антителами, которые, как известно, связываются с тем же антигеном, т.е. различными фрагментами на ΝΟΡ, для определения того, связывается ли антитело против ΝΟΡ с тем же эпитопом, что и другие антитела. Конкурентные анализы хорошо известны специалистам в данной области. Примеры антител, которые можно использовать в конкурентных анализах для настоящего изобретения, включают МаЬ 911, 912, 938, как описано в публикации Нопдо, е! а1., НуЬпбота 19:215-227 (2000).

Другие антагонисты ΝΟΓ

Можно использовать антагонисты ΝΟΡ, отличные от антител против ΝΟΡ. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонист ΝΟΡ включает по меньшей мере одну антисмысловую молекулу, способную блокировать или уменьшать экспрессию функционального ΝΟΡ, или функционального рецептора 1гкА и/или р75. Нуклеотидные последовательности ΝΟΡ, 1гкА и р75 известны и легко доступны из общедоступных баз данных (см., например, Вогкаш е! а1., Мс. АсИк Кек. 1990, 18, 4020; Ассеккюп МппЬег ΝΜ 002506; и11г1сЬ е! а1., №1иге 303:821-825 (1983). Общеизвестно получение молекул антисмыслового олигонуклеотида, которые специфически связывают мРНК ΝΟΡ, 1гкА или р75 без перекрестного взаимодействия с другими полинуклеотидами. Иллюстративные сайты нацеливания включают, но не ограничиваются, кодон инициации, регуляторные области 5', кодирующую последовательность и нетранслированную область 3'. В некоторых вариантах осуществления олигонуклеотиды имеют длину примерно от 10 до 100 нуклеотидов, имеют длину примерно от 15 до 50 нуклеотидов, имеют длину примерно от 18 до 25 нуклеотидов, или более. Олигонуклеотиды могут включать модификации каркаса, такие как, например, фосфортиоатные связи, и модификации 2'-О сахаров, хорошо известные в данной области (см., например, Адга\уа1 апб 2Нао (1998), АпО кепке & ШсШс АсИ Эгид Эеуе1ортеЩ 8, 135-139. Иллюстративные антисмысловые молекулы включают антисмысловые молекулы ΝΟΡ, описанные в патентной публикации США № 20010046959; см. также 1Шр://\у\у\у.гпа-1ес.со1п/гера1г.1ип1.

Альтернативно, экспрессия и/или высвобождение ΝΟΡ можно уменьшить с использованием «оглушения» гена, морфолиноолигонуклеотидов, РНКи или рибосом, способов, которые хорошо известны в данной области. См., например, Коккг И е! а1., ебк., 1п!гасе11и1аг КФо/уте АррНсаОопк: Ргтар1ек апб Рго!осо1к, Нопхоп ЗйепШс Ргекк (ОиаПе. СА, 1999); И8 6506559; АО 02/244321; АО 01/192513; АО 01/29058.

В других вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ включает по меньшей мере одно соединение, ингибирующее ΝΟΡ. Используемый в настоящем описании термин «соединение, ингибирующее ΝΟΡ», относится к соединению, отличному от антитела против ΝΟΡ, которое прямо или косвенно снижает, ин

- 18 010159 гибирует, нейтрализует или устраняет биологическую активность ΝΟΡ. Соединение, ингибирующее ΝΟΡ, должно проявлять любую одну или несколько из следующих характеристик: (а) связывание с ΝΟΡ и ингибирование биологической активности и/или нисходящего пути (путей), опосредованного функцией передачи сигналов ΝΟΡ; (Ь) лечение или профилактика любого аспекта боли, в частности, в сочетании с НСПВС; (с) блокирование или уменьшение активации рецепторов ΝΟΡ (включая димеризацию и/или автофосфорилирование рецепторов 1гкА); (й) увеличение выведения ΝΟΡ; (е) ингибирование (снижение) синтеза, продукции или высвобождения ΝΟΡ; (ί) усиление лечения боли НСПВС. Иллюстративные соединения, ингибирующие ΝΟΡ, включают мелкомолекулярные ингибиторы ΝΟΡ, описанные в патентной публикации США № 20010046959; соединения, которые ингибируют связывание ΝΟΡ с р75, как описано в публикации РСТ № АО 00/69829; соединения, которые ингибируют связывание ΝΟΡ с ТгкА/р75, как описано в публикации РСТ № АО 98/17278. Дополнительные примеры соединений, ингибирующих ΝΟΡ, включают соединения, описанные в публикациях РСТ №№ А0 02/17914, АО 02/20479, в патентах США №№ 5342942, 6127401 и 6359130. Другие иллюстративные соединения, ингибирующие ΝΟΡ, представляют собой соединения, которые являются конкурентными ингибиторами ΝΟΡ (см. патент США № 6291247). Кроме того, специалист в данной области может получить другие мелкомолекулярные соединения, ингибирующие ΝΟΡ.

В некоторых вариантах осуществления соединение, ингибирующее ΝΟΡ, связывает ΝΟΡ. Иллюстративные сайты нацеливания (связывания) включают, но не ограничиваются, часть ΝΟΡ, которая связывается с рецептором ТгкА и/или рецептором р75, и те части ΝΟΡ, которые прилегают к связывающей рецепторы области и которые частично ответственны за правильную трехмерную форму части, связывающей рецепторы. В другом варианте осуществления соединение, ингибирующее ΝΟΡ, связывается с рецепторами ΝΟΡ (такими как ТгкА и/или р75) и ингибирует биологическую активность ΝΟΡ. Иллюстративные сайты нацеливания включают те части ТгкА и/или р75, которые связываются с ΝΟΡ.

В варианте осуществления, включающем маленькую молекулу, маленькая молекула может иметь молекулярную массу примерно любой величины от 100 до 20000 дальтон, от 500 до 15000 дальтон или от 1000 до 10000 дальтон. Библиотеки маленьких молекул имеются в продаже. Маленькие молекулы можно вводить с использованием любых средств, известных в данной области, включая ингаляцию, введение внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, подоболочечно, в желудочки головного мозга, перорально, энтерально, парентерально, интраназально или дермально. В некоторых вариантах осуществления, когда антагонист ΝΟΡ представляет собой маленькую молекулу, он вводится в количестве от 0,1 до 300 мг/кг массы пациента, разделенном на 1-3 или более доз. Для взрослого пациента с нормальной массой тела можно вводить дозы в диапазоне от 1 мг до 5 г на 1 дозу.

В других вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ включает по меньшей мере один структурный аналог ΝΟΡ. «Структурные аналоги ΝΟΡ» в настоящем изобретении относятся к соединениям, которые имеют одинаковую трехмерную структуру в виде части структуры ΝΟΡ и которые связываются с рецептором ΝΟΡ в физиологических условиях ίη νίίτο или ίη νίνο. В одном варианте осуществления структурный аналог ΝΟΡ связывается с рецептором ТгкА и/или р75. Иллюстративные структурные аналоги ΝΟΡ включают, но не ограничиваются, бициклические пептиды, описанные в публикации РСТ № АО 97/15593; бициклические пептиды, описанные в патенте США № 6291246; циклические соединения, описанные в патенте США № 6017878, и пептиды, полученные из ΝΟΡ, описанные в публикации РСТ № АО89/09225. Подходящие структурные аналоги ΝΟΡ могут также конструироваться и синтезироваться посредством молекулярного моделирования связывания рецепторов ΝΟΡ, например, способом, описанным в публикации РСТ № АО 98/06048. Структурные аналоги ΝΟΡ могут представлять собой мнономеры или димеры/олигомеры в любой желательной комбинации их или других структур для получения улучшенных аффинитетов и биологических эффектов.

В других вариантах осуществления изобретение предоставляет антагонист ΝΟΡ, включающий по меньшей мере один доминантно-негативный мутант рецептора ТгкА и/или рецептора р75. Специалист в данной области может получить доминантно-негативные мутанты, например, рецептора ТгкА, так что рецептор будет связывать ΝΟΡ, и, таким образом, действовать в качестве «слива» для захвата ΝΟΡ. Однако доминантно-негативные мутанты не будут иметь нормальной биологической активности рецептора (такого как рецептор ТгкА) после связывания с ΝΟΡ. Иллюстративные доминантно-негативные мутанты включают, но не ограничиваются, мутанты, описанные в следующих ссылках: Ь1 е! а1, Ргос. №111 Асай. δα, И8А 1998, 95, 10884; Е1йе е! а1., 1. Кешозск 1996,16, 3123; Ьш е! а1., 1. Хенгов 1997, 17, 8749; К1еш е! а1., Се11 1990, 61, 647; Уа1епхпе1а е! а1., Кеигоп 1993, 10, 963; ТбюиИаз е! а1., №игоп 1993, 10, 975; и ЬашЬа11е е! а1., ЕМВО 1 1993, 12, 3083, каждая из которых полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Доминантно-негативные мутанты можно вводить в белковой форме или в форме вектора экспрессии, так что доминантно-негативный мутант (например, мутантный рецептор ТгкА) экспрессирован ίη νίνο. Белок или вектор экспрессии можно вводить с использованием любого средства, известного в данной области, такого как введение внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, подоболочечно, в желудочки головного мозга, перорально, энтерально, парентерально, интраназально, дермально или путем ингаляции. Например, введение вектора экспрессии включает локальное или системное введение, включая инъекцию, пероральное введение, введение в виде частиц с использованием инъ

- 19 010159 екционного пистолета или катетера и местное введение. В других вариантах осуществления белок или вектор экспрессии вводится прямо в симпатический или сенсорный ствол или ганглий. Специалист в данной области знаком с введением векторов экспрессии для получения экспрессии экзогенного белка ίη νίνο (см., например, патенты США №№ 6436908; 6413942; 6376471).

Можно также использовать нацеленную доставку терапевтических композиций, содержащих антисмысловой полинуклеотид, вектор экспрессии или субгеномные полинуклеотиды. Опосредованные рецепторами методики доставки ДНК описаны, например, в публикациях Ρίηάβίδ с1 а1., Тгепбк Βίοίοοίιιηοΐ (1993) 11:202; Οιίοιι е! а1. Сепе ТЬегареибск: Мебюбк Апб Аррбсабопк ОГ 01гес1 Сепе ТгапкГег (ΙΑ. ’ΨοΙίΤ, еб.) (1994); Аи е1 а1., I. Бю1 СЬет. 1988) 263:621; Аи е1 а1., I. Бю1. СЬет. (1994) 269:542; 2епке е1 а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. (υδΑ) (1990) 87:3655; Аи е! а1., I. Βίο1. СЬет. (1991) 266:338. Терапевтические композиции, содержащие полинуклеотид, вводятся в диапазоне от примерно 100 нг до примерно 200 мг (или более) ДНК для локального введения в протоколе генной терапии. В некоторых вариантах осуществления в ходе протокола генной терапии можно также использовать диапазоны концентрации менее примерно 500 нг, от примерно 500 нг до примерно 50 нг, от примерно 1 мкг до примерно 2 мг, от примерно 5 мкг до примерно 500 мкг и от примерно 20 мкг до примерно 100 мкг или более ДНК. Терапевтические полинуклеотиды и полипептиды настоящего изобретения можно доставить с использованием носителей генной доставки. Носители генной доставки могут быть вирусного или невирусного происхождения (см. в целом ίο11ν. Сапсег Сепе Тбегару (1994) 1:51; К1тига, Нитап Сепе Тбегару (1994) 5:845; ^п^Пу, Нитап Сепе Тбегару (1995) 1:185; и Карбй, №11иге Сепебск (1994) 6:148). Экспрессию таких кодирующих последовательностей можно вызвать с использованием эндогенных промотеров и/или усилителей млекопитающих или гетерологичных промотеров и/или усилителей. Экспрессия кодирующей последовательности может быть или констутивной, или регулируемой.

Векторы на вирусной основе для доставки желательного полинуклеотида и экспрессии в желательной клетке хорошо известны в данной области. Иллюстративные векторы на вирусной основе включают, но не ограничиваются, рекомбинантные ретровирусы (см., например, публикации РСТ №№ АО 90/07936; АО 94/03622; АО 93/25698; АО 93/25234; АО 93/11230; АО 93/10218; АО 91/02805; патенты США №№ 5219740, 4777127; патент Великобритании № 2200651 и патент Испании № 0345242), векторы на основе альфа-вируса (например, векторы на основе вируса Синдбис, вируса леса Семлики (АТСС УК67; ΑТСС УК-1247), вируса реки Росс (АТСС УК-373; ΑТСС УК-1246) и вируса венесуэльского лошадиного энцефалита (АТСС УК-923; ΑТСС УК-1250; ΑТСС УК-1249; АТСС УК-532), и аденоассоциированного вируса ^Α^ (см., например, публикации РСТ №№ АО 04/12649, АО 93/03769, АО 93/19191; АО 94/28938; АО 95/11984 и АО 95/00655). Можно также использовать введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано в публикации Сипе1, Нит. Сепе ТЬег. (1992) 3:147.

Можно также использовать невирусные носители доставки, включая, но не ограничиваясь, поликатионную, конденсированную ДНК, соединенную с одним убитым аденовирусом (см., например, Сибе1, Нит. Сепе ТЬег. (1992) 3:147); ДНК, соединенную с лигандом (см., например, Аи, ί. Βίο1. СЬет. (1989) 264:16985); клетки-носители доставки эукариотических клеток (см., например, патент США № 5814482; публикации РСТ №№ АО 95/07994; АО 96/17072; АО 95/30763; и АО 97/42338) и нейтрализацию нуклеинового заряда или слияние с клеточными мембранами. Можно также использовать депротеинизированную ДНК. Иллюстративные способы введения депротеинизированной ДНК описаны в публикации РСТ № АО 90/11092 и в патенте США № 5580859. Липосомы, которые могут действовать в качестве носителей генной доставки, описаны в патенте США № 5422120; публикациях РСТ №№ АО 95/13796; АО 94/23697; АО 91/14445 и патенте Испании № 0524968. Дополнительные подходы описаны в публикации РЬШр, Μο1. Се11. Βίο1. (1994) 14:2411 и в публикации АοΓΓеηб^η. Ргос. №111. Αсаб. δα. (1994) 91:1581.

Также очевидно, что вектор экспрессии можно использовать для направления экспрессии любого из антагонистов NСΡ на основе белка, описанных в настоящем описании (например, антитело против NСΡ, иммуноадгезин ТгкЛ и т.д.). Например, полинуклеотид, кодирующий антагонистическое антитело против NСΡ, можно также использовать для доставки и экспрессии антагонистического антитела против NСΡ в желательной клетке. Очевидно, что вектор экспрессии можно использовать для направления экспрессии антагонистического антитела против NСΡ. Вектор экспрессии можно вводить внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, подоболочечно, в желудочки головного мозга, перорально, энтерально, парентерально, интраназально, дермально или путем ингаляции. Например, введение векторов экспрессии включает локальное или системное введение и местное введение. Как далее обсуждается в настоящем описании, специалист в данной области знаком с введением векторов экспрессии для получения экспрессии экзогенного белка т νίνο (см., например, патенты США №№ 6436908; 6413942 и 6376471. В данной области известны другие фрагменты рецептора Т^Ж которые способны блокировать NСΡ (от частичной до полной блокады) и/или биологическую активность NСΡ.

В другом варианте осуществления антагонист NСΡ включает по меньшей мере один иммуноадгезин ТбЖ. Используемые в настоящем описании иммуноадгезины ТбЖ относятся к растворимым химерным молекулам, включающим внеклеточный домен рецептора ТбЖ (или его часть), и последовательности иммуноглобулина, которая сохраняет специфичность связывания (в некоторых вариантах осуществле

- 20 010159 ния, по существу сохраняет специфичность связывания) рецептора ТгкА и способна связываться с Ν6Ε. Иммуноадгезин ТгкА способен блокировать (снизить и/или подавить) биологическую активность Ν6Ε, как описано в настоящем описании.

Иммуноадгезины ТгкА известны в данной области, и было обнаружено, что они блокируют (снижают или подавляют) связывание Ν6Ε с рецептором ТгкА (см., например, патент США № 6153189). В одном варианте осуществления иммуноадгезин ТгкА включает слияние аминокислотной последовательности рецептора ТгкА, способной связывать Ν6Ε (или аминокислотную последовательность, которая по существу сохраняет специфичность связывания рецептора ТгкА) и последовательность иммуноглобулина (или аминокислоту, которая по существу сохраняет специфичность связывания рецептора ТгкА). В некоторых вариантах осуществления рецептор ТгкА представляет собой последовательность человеческого рецептора ТгкА, и слияние происходит с последовательностью константного домена иммуноглобулина. В других вариантах осуществления последовательность константного домена иммуноглобулина представляет собой последовательность константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина. В других вариантах осуществления ассоциация двух слияний рецептора ТгкА-тяжелой цепи иммуноглобулина (например, через ковалентное соединение дисульфидной связью (связями)) приводит к структуре, подобной гомодимерному иммуноглобулину. Легкая цепь иммуноглобулина может, кроме того, быть ассоциирована с одной или обеими химерами иммуноглобулина рецептора ТгкА в связанный дисульфидом димер для получения гомотримерной или гомотетрамерной структуры. Примеры подходящих иммуноадгезинов ТгкА включают иммуноадгезины, описанные в патенте США № 6153189.

В другом варианте осуществления антагонист Ν6Ε включает по меньшей мере одно антитело против ТгкА, способное блокировать, подавлять, изменять и/или снижать физическое взаимодействие Ν6Ε с рецептором ТгкА и/или нисходящую передачу сигналов, посредством чего биологическая активность Ν6Ε снижается и/или блокируется. Антитела против ТгкА известны в данной области. Иллюстративные антитела против ТгкА включают антитела, описанные в публикациях РСТ №№ XVО 97/21732, XVО 00/73344, ΧνΟ 02/15924 и патентной публикации США № 20010046959. В другом варианте осуществления антагонист Ν6Ρ включает по меньшей мере одно антитело против р75, способное блокировать, подавлять и/или снижать физическое взаимодействие Ν6Ρ с рецептором р75 и/или нисходящую передачу сигналов, посредством чего биологическая активность Ν6Ρ снижается и/или блокируется.

В другом варианте осуществления антагонист Ν6Ρ включает по меньшей мере один ингибитор киназы, способный ингибировать нисходящую передачу сигналов киназы, связанных с активностью рецепторов ТгкА и/или р75. Иллюстративные ингибиторы киназы представляют собой К252а или К252Ь, которые известны в данной области и описаны в публикациях Кпизе1 е! а1., I. №игос11ст. 59:715-722 (1992); Кии8е1 е! а1., I. №пгосйетЫгу 57:955-962 (1991); 1<οίζι.ιιηί е! а1., I №иго8С1епсе 8:715-721 (1988); Н1га!а е! а1., Сйетюа1 АЬЧгас® 111:728, ХР00204135, см. резюме и 12^!Ь СоПесНуе Сйетюа1 8иЬз1апсе 1пбех, р. 34237, с 3 (5-7), (55-60,66-69), р. 34238, с.1 (41-44), с.2 (25-27, 32-33), р. 3423, с.3 (48-50, 52-53); патент США № 6306849.

Ожидается, что клиницист при поиске сможет идентифицировать ряд других категорий антагонистов Ν6Ρ.

Идентификация антагонистов Ν6Ε

Антитела против Ν6Ρ и другие антагонисты Ν6Ρ можно идентифицировать или охарактеризовать с использованием способов, известных в данной области, посредством чего выявляется и/или измеряется снижение, облегчение или нейтрализация биологической активности Ν6Ρ. Например, анализ активации рецепторов киназы (К1КА), описанный в патентах США №№ 5766863 и 5891650, можно использовать для идентификации средств против Ν6Ρ. Этот анализ типа ЕЫ8А подходит для качественного или количественного измерения активации киназы измерением автофосфорилирования домена киназы тирозинкиназы белка рецептора (далее именуемого гРТК), например, рецептора ТгкА, а также для идентификации и характеристики потенциальных антагонистов выбранного гРТК, например ТгкА. Первая стадия анализа включает фосфорилирование домена киназы рецептора киназы, например, рецептора ТгкА, причем рецептор присутствует в клеточной мембране эукариотической клетки. Рецептор может представлять собой эндогенный рецептор или нуклеиновую кислоту, кодирующую рецептор, или конструкт рецептора может быть трансформирован в клетку. Обычно первая твердая фаза (например, лунка первой аналитической планшеты) покрывается по существу однородной популяцией таких клеток (обычно линии клеток млекопитающих) так, что клетки прилипают к твердой фазе. Часто клетки являются прикрепленными к субстрату, и, посредством этого они естественно прикрепляются к первой твердой фазе. Если используется «конструкт рецептора», он обычно включает слияние рецептора киназы и сигнальный полипептид. Сигнальный полипептид распознается средством захвата, часто антителом захвата, в части ЕЫ8А анализа. Анализируемое вещество, такое как перспективное антитело против Ν6Ε или другой антагонист Ν6Ε, затем добавляется вместе с Ν6Ε в лунки, имеющие прикрепленные клетки, так что рецептор тирозинкиназы (например, рецептор ТгкА) подвергается воздействию (или контактирует) с Ν6Ε и анализируемым веществом. Этот анализ обеспечивает возможность идентификацию антител (или другого антагониста Ν6Ε), которые ингибируют активацию ТгкА его лигандом Ν6Ε. После контакта с Ν6Ε и анализируемым веществом прикрепленные клетки солюбилизируются с использованием буфера лизиса

- 21 010159 (который содержит в себе солюбилизирующий детергент) и осторожного перемешивания, высвобождая посредством этого клеточный лизат, который может быть подвергнут непосредственно части ЕЬ13А анализа без необходимости концентрации или осветления клеточного лизата.

Полученный таким образом клеточный лизат затем готов быть подвергнутым стадии ЕЬ13А анализа. В качестве первого этапа стадии ЕЬ13А вторую твердую фазу (обычно лунку титровочной планшеты ЕЫЗА) покрывают средством захвата (часто антителом захвата), которое специфически связывается с рецептором тирозинкиназы или, в случае конструкта рецептора, с сигнальным полипептидом. Покрытие второй твердой фазы проводится так, что средство захвата прикрепляется ко второй твердой фазе. Средство захвата представляет собой в целом моноклональное антитело, но, как описано в примерах в настоящем описании, могут также использоваться поликлональные антитела. Полученный клеточный лизат затем подвергается воздействию или контактирует с прикрепляющим средством захвата так, что рецептор или конструкт рецептора прикрепляется ко (или захватывается во) вторую твердую фазу. Затем проводится этап промывания с тем, чтобы удалить несвязанный клеточный лизат, оставляя захваченный рецептор или конструкт рецептора. Прикрепившийся или захваченный рецептор или конструкт рецептора затем подвергается воздействию или контактирует с антителом против фосфотирозина, которое идентифицирует фосфорилированные остатки тирозина в рецепторе тирозинкиназы. В одном варианте осуществления антитело против фосфотирозина сопряженно связано (прямо или косвенно) с ферментом, который катализирует изменение цвета нерадиоактивного цветового реактива. Соответственно, фосфорилирование рецептора можно измерить последующим изменением цвета реагента. Фермент может быть непосредственно связан с антителом против фосфотирозина, или конъюгирующая молекула (например, биотин) может быть конъюгирована с антителом против фосфотирозина, и фермент может быть в последующем связан с антителом против фосфотирозина посредством конъюгирующей молекулы. Наконец, измеряют связывание антитела против фосфотирозина с захваченным рецептором или конструктом рецептора, например, изменением цвета у цветного реагента.

Антагонисты ΝΟΕ можно также идентифицировать инкубацией перспективного средства с ΝΟΕ и мониторингом любой одной или нескольких из следующих характеристик:

(a) связывание с ΝΟΕ и ингибирование биологической активности ΝΟΕ и/или нисходящего пути (путей), опосредованного функцией передачи сигналов ΝΟΕ;

(b) блокирование или уменьшение активации рецепторов ΝΟΕ;

(c) увеличение выведения ΝΟΕ;

(б) ингибирование активации рецепторов ΝΟΕ (включая димеризацию и/или автофосфорилирование ТгкА);

(е) лечение, облегчение или профилактика любого аспекта боли, в частности, в сочетании с НСПВС;

(ί) ингибирование (снижение) синтеза, продукции или высвобождения ΝΟΕ;

(д) усиление лечения боли НСПВС.

В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΕ идентифицируется инкубацией перспективного средства с ΝΟΕ и мониторингом связывания и сопутствующего уменьшения или нейтрализации биологической активности ΝΟΕ. Анализ связывания можно выполнить очищенным полипептидом (полипептидами) ΝΟΕ или клетками, естественно экспрессирующими или трансфецированными для экспрессии полипептида (полипептидов) ΝΟΕ. В одном варианте осуществления анализ связывания представляет собой анализ конкурентного связывания, где оценивается способность перспективного антитела конкурировать с известным антагонистом ΝΟΕ за связывание ΝΟΕ. Анализ можно выполнять в различных форматах, включая формат ЕЫЗА. В других вариантах осуществления антагонист ΝΟΕ идентифицируется инкубацией перспективного средства с ΝΟΕ и мониторингом сопутствующего ингибирования димеризации и/или автофосфорилирования рецептора ТгкА.

После первоначальной идентификации активность перспективного антагониста против ΝΟΕ можно далее подтвердить и уточнить биологическими анализами, которые, как известно, тестируют нацеленные виды биологической активности.

Альтернативно, биологические анализы можно использовать для прямого скрининга кандидатов. Например, ΝΟΕ способствует ряду морфологически распознаваемых изменений в реагирующих клетках. Они включают, но не ограничиваются, содействие дифференцировке клеток РС12 и усиление роста нейритов из этих клеток (ИгГег е! а1., ВюсЬет. 36:4775-4781 (1997); Ткоибак е! а1., Ыеигоп 10:975-990 (1993)), содействие разрастанию нейритов из эксплантатов, реагирующих сенсорных и симпатических ганглиев, (Ьеу1-Моп1а1с1ш, В. апб Апде1еШ, Р. Ыегуе дго\\111 Гас!ог. РЬу§ю1. Веу. 48, 534-569, 1968) и содействие выживанию нейронов, зависимых от ΝΟΡ, таких как нейроны эмбрионального дорсального корневого ганглия, тройничного ганглия или симпатического ганглия (например, С.'1шп & Рабегкоп, Эеу. Вю1. 75:705-711, (1977); ВисЬтап & Оау1е8, Эеуе1ортеп1 118:989-1001, (1993). Таким образом, анализ на ингибирование биологической активности ΝΟΕ влечет за собой культивирование клеток, реагирующих на ΝΟΡ, с ΝΟΕ плюс анализируемое вещество, такое как перспективное антитело против ΝΟΕ и перспективный антагонист ΝΟΕ. После соответствующего времени нужно анализировать реакцию клеток (дифференцировку клеток, разрастание нейритов или выживание клеток).

- 22 010159

Определение способности антагониста перспективного ΝΟΡ блокировать или нейтрализовать биологическую активность ΝΟΡ можно также проводить мониторингом способности перспективного средства ингибировать опосредованное ΝΟΡ выживание в биологическом анализе выживания эмбриональных крысиных дорсальных корневых ганглиев, как описано в публикации Нопдо, с! а1., НуЬпбота 19:215-227 (2000). Способ идентификации модуляторов активности Ν6Ρ описан в РСТ/И82004/01609.

Композиции

Композиции изобретения включают эффективное количество антагониста ΝΟΡ (такого как антитело против ΝΟΡ) и НСПВС, как описано в различных вариантах осуществления, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления композиции, кроме того, содержат фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых вариантах осуществления композиция предназначена для применения в любом из способов, описанных в настоящем описании (таких как способы лечения послеоперационной боли). Примеры таких композиций, а также то, как их составлять, также описаны в предыдущем разделе и ниже. Антагонист ΝΟΡ и НСПВС могут присутствовать в одной композиции или присутствовать в виде отдельных композиций. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ и НСПВС присутствуют в одной и той же композиции. В других вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ и НСПВС присутствуют в отдельных композициях.

В другом аспекте изобретение предоставляет синергическую композицию антагониста ΝΟΡ и НСПВС.

В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет фармацевтические композиции, включающие антагонист ΝΟΡ, для применения при лечении боли (такой как послеоперационная боль), причем указанное применение включает одновременное и/или последовательное введение НСПВС. В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет фармацевтические композиции, включающие НСПВС для лечения боли, причем указанное применение включает одновременное и/или последовательное введение антагониста ΝΟΡ. В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет фармацевтические композиции, включающие антагонист ΝΟΡ и НСПВС для отдельного, одновременного и/или последовательного применения для лечения боли. В некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ представляет собой антитело против ΝΟΡ (такое как антитело Е3, как описано в настоящем описании). В других вариантах осуществления НСПВС представляет собой ибупрофен. В еще одних вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ представляет собой антитело против ΝΟΡ, и НСПВС представляет собой ибупрофен.

Понятно, что композиция может включать более одного антагониста ΝΟΡ. Например, композиция может включать более одного члена класса антагонистов ΝΟΡ (например, смесь антител против ΝΟΡ, которые распознают различные эпитопы ΝΟΡ), а также члены различных классов антагонистов ΝΟΡ (например, антитела против ΝΟΡ и соединения, ингибирующего ΝΟΡ). Другие иллюстративные композиции включают более одного антитела против ΝΟΡ, которые распознают один и тот же эпитоп (эпитопы), различные виды антител против ΝΟΡ, которые связываются с различными эпитопами ΝΟΡ, или различные соединения, ингибирующие ΝΟΡ. В других вариантах осуществления композиция включает один или несколько антагонистов ΝΟΡ, выбранных из группы, состоящей из антагониста, который связывает (физически взаимодействует с) ΝΟΡ (например, антитело), антагонист, который связывается с рецептором ΝΟΡ (таким как рецептор ТгкА или рецептор р75), и антагонист, который снижает (тормозит и/или блокирует) нисходящую передачу сигналов рецептора Ν6Ρ.

Композиция, применяемая в настоящем изобретении, может, кроме того, включать фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы (Всттд!оп: Тйс 8сюпсс апб РгасВсс о£ Рйагтасу 20111 Еб. (2000) Ырртсой АПНапъ апб Айктк, Еб. К. Е. Нооусг), в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и могут включать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); полипептиды низкой молекулярной массы (менее примерно 10 остатков), белки, такие как сывороточный альбумин, желатин, или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводороды, включая глюкозу, маннозу или декстраны; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; образующие соль противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Ζιι-белок); и/или неионные поверхностноактивные вещества, такие как ТАЕЕК™ , РЕиВОМСЗ™ или полиэтиленгликоль (РЕС). Фармацевтически приемлемые эксципиенты, кроме того, описаны в настоящем описании.

Композиции, описанные в настоящем описании, могут содержать дополнительные соединения, которые, как известно, можно использовать для лечения боли. Антагонист ΝΟΕ и НСПВС и их композиции можно также применять в сочетании с другими средствами, которые служат для усиления и/или дополнения эффективности средств.

- 23 010159

В других вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет композиции (описанные в настоящем описании) для применения в любом из способов, описанных в настоящем описании, или в контексте применения в качестве лекарственного средства, и/или использования для изготовления лекарственного средства.

Наборы

Изобретение также предоставляет наборы для применения в настоящих способах. Наборы изобретения включают один или несколько контейнеров, включающих антагонист ΝΟΡ (такой как антитело против ΝΟΡ), НСПВС и в некоторых вариантах осуществления, кроме того, включают инструкции по применению в соответствии с любым из способов, описанных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления набор включает антитело против ΝΟΡ (такое как антитело Е3, описанное в настоящем описании). В других вариантах осуществления набор включает антитело против ΝΟΡ, включающее один или несколько СЭВ антитела Е3 (например, 1, 2, 3, 4, 5 или, в некоторых вариантах осуществления, все 6 СОЕ из Е3). Набор может, кроме того, включать описание отбора индивидуума, подходящего для лечения, на основе идентификации того, есть ли у индивидуума боль или есть ли у индивидуума риск боли. В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет наборы для применения с любым из способов, описанных в настоящем описании, причем указанный набор включает антагонист ΝΟΡ. В еще одних вариантах осуществления набор включает антитело против ΝΟΡ. В еще одних вариантах осуществления набор включает гуманизированное антитело против ΝΟΡ (такое как антитело Е3, описанное в настоящем описании). В еще одних вариантах осуществления инструкции включают описание введения антагониста ΝΟΡ в сочетании с НСПВС для лечения, профилактики и/или облегчения любой боли (такой как послеоперационная боль, боль, связанная с ожогом, ревматоидным артритом или остеоартритом).

В некоторых вариантах осуществления набор включает антагонист ΝΟΡ (такой как антитело против ΝΟΡ), НСПВС и инструкции по введению антагониста ΝΟΡ и НСПВС одновременно и/или последовательно для эффективного лечения боли. В другом варианте осуществления набор включает антагонист ΝΟΡ (такой как антитело против ΝΟΡ) и инструкции по введению антагониста ΝΟΡ (такого как антитело против ΝΟΡ) и НСПВС в сочетании друг с другом для эффективного лечения боли. В других вариантах осуществления набор включает антагонист ΝΟΡ (такой как антитело против ΝΟΡ), и НСПВС (такой как ибупрофен) и инструкции по введению антагониста ΝΟΡ и НСПВС в сочетании друг с другом для эффективного лечения боли. Соответственно, любые способы, описанные в настоящем описании, могут быть отражены в инструкциях.

В некоторых вариантах осуществления набор включает антитело против ΝΟΡ. В других вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ представляет собой антитело, включающее вариабельную область тяжелой цепи, показанную в табл. 1, и вариабельную область легкой цепи, показанную в табл. 2. В еще одних вариантах осуществления антитело против ΝΟΡ представляет собой антитело Е3, как описано в настоящем описании.

Антагонист ΝΟΡ (такой как антитело против ΝΟΡ) и НСПВС могут присутствовать в отдельных контейнерах или в одном контейнере. Понятно, что набор может включать одну отдельную композицию или две или более композиций, причем одна композиция включает антагонист ΝΟΡ и одна композиция включает НСПВС.

Наборы данного изобретения находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, но не ограничивается, флакончики, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, запаянные мешочки Му1аг или пластиковые мешочки) и им подобные. Наборы могут необязательно предоставлять дополнительные компоненты, такие как буферы и интерпретационная информация.

Инструкции, относящиеся к применению антагониста ΝΟΡ, в целом включают информацию по дозировке, схеме введения и пути введения для предполагаемого лечения. Контейнеры могут представлять собой стандартные дозы, насыпные упаковки (например, многодозовые упаковки) или субстандартные дозы. Инструкции, поставляемые в наборах изобретения, представляют собой обычно письменные инструкции на этикетке или вкладыше упаковки (например, лист бумаги, включенный в набор), но также приемлемы инструкции, считываемые машиной (например, инструкции на магнитном или оптическом диске хранения информации).

Этикетка или вкладыш упаковки указывает, что композиция применяется для лечения, облегчения и/или профилактики боли (включая послеоперационную боль). Инструкции могут быть предоставлены для осуществления любого из способов, описанных в настоящем описании.

Наборы настоящего изобретения находятся в подходящей упаковке. Подходящая упаковка включает, но не ограничивается, флакончики, бутылки, банки, гибкую упаковку (например, запаянные мешочки Му1аг или пластиковые мешочки) и им подобные. Предусмотрены также упаковки для использования в комбинации со специальным устройством, таким как ингалятор, устройство для интраназального введения (например, распылитель) или инфузионное устройство, такое как мининасос. Набор может иметь стерильный канал доступа (например, контейнер может представлять собой мешочек или флакончик с раствором для внутривенного введения, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций). Контейнер может также иметь стерильный канал доступа (например, контейнер может представ

- 24 010159 лять собой мешочек или флакончик с раствором для внутривенного введения, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере одно активное средство в композиции представляет собой антагонист ΝΟΡ, такой как антитело против ΝΟΡ. Контейнер может, кроме того, включать второе фармацевтически активное средство.

Наборы могут необязательно предоставлять дополнительные компоненты, такие как буферы и интерпретационная информация. Обычно набор включает контейнер и этикетку или вкладыш (вкладыши) упаковки на контейнере или связанные с ним.

В некоторых вариантах осуществления изобретение предоставляет изготовленные изделия, включающие содержимое описанных выше наборов. В некоторых вариантах осуществления наборы включают антагонист ΝΟΡ (такой как антитело против ΝΟΡ) и/или НСПВС с информацией, указывающей применение для лечения боли (в сочетании друг с другом).

Введение антагониста ΝΟΕ и НСПВС и оценка лечения

Антагонист ΝΟΡ и НСПВС можно вводить индивидууму любым подходящим путем. Например, их можно вводить вместе или отдельно, перорально, внтуривенно, сублингвально, подкожно, внутриартериально, внтуримышечно, интраназально, ректально, интраторакально, внутрибрюшинно, в желудочки головного мозга, трансдермально или путем ингаляции. Их можно вводить перорально, например, в форме таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, вафель, жевательной резинки, леденцов на палочке, суппозиториев или им подобных, полученных процедурами, признанными в настоящей области. Для специалиста в данной области будет очевидно, что описанные в настоящем описании примеры не предназначены быть ограничивающими, но лишь иллюстрируют имеющиеся методики.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления антагонист ΝΟΡ, такой как антитело против ΝΟΡ, вводится индивидууму в соответствии с известными способами, такими как внутривенное введение, например, в виде болюса или непрерывным вливанием в течение периода времени, внутримышечным, внутрибрюшинным, в спинной мозг, подкожным, внутрисуставным, внутрисиновиальным, подоболочечным, пероральным, ингаляционным или местным путями. Имеющиеся в продаже распылители для жидких композиций, включая струйные распылители и ультразвуковые распылители, можно использовать для введения. Жидкие композиции могут распыляться непосредственно, а лиофилизированный порошок может распыляться после растворения. Альтернативно, антагонист ΝΟΡ (такой как антитело против ΝΟΡ) может быть введен в виде аэрозоля с использованием фторкарбоновой композиции и ингалятора отмеренной дозы, или ингаляционно в виде лиофилизированного и молотого порока.

Методики сайт-специфической или нацеленной локальной доставки можно также использовать для введения. Примеры методик сайт-специфической или нацеленной локальной доставки включают различные имплантированные депонированные источники антагониста ΝΟΡ и/или НСПВС, или катетеры локальной доставки, такие как инфузионные катетеры, имплантируемый катетер или игольный катетер, синтетические трансплантаты, адвентиционные обертки, шунты или другие имплантируемые устройства, сайт-специфические носители, прямую инъекцию, использование методики или устройства анальгезии, управляемой пациентом (РСА), и/или прямое нанесение (см., например, публикацию РСТ № АО 00/5 3211 и патент США № 5981568).

Для введения можно применять различные композиции средств (антагонистов ΝΟΡ), таких как антитела против ΝΟΡ, или их фрагменты. В некоторых вариантах осуществления средства, такие как антитела против ΝΟΡ, или их фрагменты, можно вводить без добавок. В некоторых вариантах осуществления средства, включающие антитело против ΝΟΡ, могут быть в различных композициях, включая композиции, включающие фармацевтически приемлемый эксципиент. Фармацевтически приемлемые эксципиенты известны в данной области и представляют собой относительно инертные вещества, которые способствуют введению фармакологически активного вещества. Например, эксципиент может придать форму или консистенцию или действовать в качестве разбавителя. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничиваются, стабилизирующие средства, смачивающие и эмульгирующие средства, соли для изменения осмолярности, инкапсулирующие средства, буферы и усилители проницаемости кожи. Эксципиенты, а также композиции для парентеральной и непарентеральной доставки лекарственных средств изложены в руководстве Вет1ид!ои, е! а1., Тке 8с1еисе аий Ргасйсе оГ Ркагтасу 20^1к Ей. Маск РиЬ118к1ид (2000).

В некоторых вариантах осуществления эти средства (антагонисты ΝΟΡ) составлены в композиции для введения инъекцией (например, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Соответственно, эти средства можно комбинировать с фармацевтически приемлемыми носителями, такими как солевой раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и им подобные. Конкретная схема дозировки, т. е. доза, время введения и повторение, будут зависеть от конкретного индивидуума и медицинского анамнеза этого индивидуума. Схема введения (включая используемый антагонист (антагонисты) ΝΟΡ) может варьироваться с течением времени.

Антитела против ΝΟΡ можно вводить с использованием любого подходящего способа, включая инъекцию (например, внутрибрюшинно, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Антитела против ΝΟΡ можно вводить ингаляцией, как описано в настоящем описании. В целом, для введения антител против ΝΟΡ исходная возможная дозировка может составлять примерно 0,2 или примерно 2 мг/кг. В не

- 25 010159 которых вариантах осуществления обычная суточная дозировка может находиться в диапазоне примерно от 3 до 30 мкг/кг, до 300 мкг/кг, до 3 мг/кг, до 30 мг/кг, до 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. Для повторных введений в течение нескольких дней или больше, в зависимости от состояния, лечение продолжается до тех пор, пока не произойдет желательное подавление симптомов заболевания или до тех пор, пока не будут достигнуты терапевтические уровни, достаточные для уменьшения боли. Иллюстративная схема введения включает введение исходной дозы примерно 2 мг/кг с последующей еженедельной поддерживающей дозой примерно 1 мг/кг антитела против Ν6Ε или с последующей поддерживающей дозой примерно 1 мг/кг каждую вторую неделю. Однако можно использовать другие схемы введения, в зависимости от типа фармакокинетического распада, которого желает достичь врач. Другие схемы введения включают схему до 1 раза в день, от 1 до 4 раз в неделю, или менее часто. В некоторых вариантах осуществления соединения вводятся примерно однократно в неделю, примерно от 1 до 4 раза в месяц. Дозировки антител против Ν6Ε описаны в настоящем описании. Ход лечения легко контролируется обычными методиками и анализами.

В некоторых вариантах осуществления, когда он не представляет собой антитело, антагонист Ν6Ε в соответствии с изобретением можно вводить в количестве от 0,1 до 300 мг/кг массы тела пациента, разделенной на 1-3 дозы или как раскрыто в настоящем описании. У некоторых взрослых пациентов с нормальной массой тела можно вводить дозы в диапазоне примерно от 0,3 до 5,00 мг/кг. Конкретная схема дозировки, т. е. доза, время введения и повторение, будут зависеть от конкретного индивидуума и медицинского анамнеза этого индивидуума, а также от свойств отдельных средств (таких как период полувыведения средства и другие соображения, хорошо известные в данной области).

НСПВС можно вводить на уровни дозировки до обычных уоовней дозировки для таких анальгетиков. В некоторых вариантах осуществления НСПВС вводится в на сниженном уровне. Подходящие уровни дозировки будут зависеть от обезболивающего эффекта выбранного НСПВС, но обычно подходящие уровни составляют примерно от 0,001 до 25 мг/кг/день, примерно от 0,005 до 10 мг/кг/день, или примерно от 0,05 до 1 мг/кг/день, или менее. Соединение можно вводить по схеме до 6 раз в день (или более), 14 раза в день, или его можно вводить менее часто. В некоторых вариантах осуществления НСПВС вводится непрерывно или очень часто (например, как при РСА).

При введении в комбинации или в виде одной, или в виде отдельной композиции (композиций), антагонист фактора роста нервов и НСПВС присутствуют в соотношении, которое согласуется с проявлением желательного эффекта. В некоторых вариантах осуществления соотношение по массе между антагонистом фактора роста нервов и НСПВС составит приблизительно 1 к 1. В некоторых вариантах осуществления это соотношение может составлять между примерно 0,001 к примерно 1 и примерно 1000 к примерно 1, примерно 0,01 к примерно 1 и 100 к примерно 1, или примерно 0,1 к примерно 1 и примерно 10 к примерно 1. Предусмотрены другие соотношения. Следует понимать, что количество антагониста фактора роста нервов и НСПВС, требуемое для применения при лечении или профилактике боли, будет варьироваться не только в зависимости от конкретных выбранных соединений или композиций, но также от пути введения, природы состояния, подвергаемого лечению, и возраста и состояния пациента, курса или стадии лечения, и в конечном итоге, оно будет определяться по усмотрению лечащего врача. Например, соответствующая дозировка антагониста Ν6Ε (такого как антитело против Ν6Ε) будет зависеть от используемого антагониста (антагонистов) Ν6Ε (или их композиций), типа и тяжести боли, которую предстоит лечить, от того, вводится ли средство в профилактических или терапевтических целях, предшествующей терапии, клинического анамнеза пациента и реакции на средство и по усмотрению лечащего врача. Обычно клиницист будет вводить антагонист Ν6Ε (такой как антитело против Ν6Ε) до тех пор, пока не будет достигнута дозировка, которая получает желательный результат.

Эмпирические соображения, такие как период полувыведения, в целом будут влиять на определение дозировки. Например, антитела, которые совместимы с иммунной системой человека, такие как гуманизированные антитела или полностью человеческие антитела, можно применять для удлинения периода полувыведения антитела и для профилактики атаки антитела иммунной системой хозяина. Частоту введения можно определить и подобрать в течение курса лечения, и она в целом, но необязательно, основана на лечении и/или подавлении, и/или облегчении, и/или задержке возникновения боли. Альтернативно, могут быть целесообразны композиции антагониста Ν6Ε и/или НСПВС продолжительного непрерывного высвобождения. В данной области известны различные композиции и устройства для достижения продолжительного высвобождения.

В одном варианте осуществления дозировки для антагониста Ν6Ε можно определить эмпирически у индивидуумов, которым было произведено одно или несколько введений средства, которое ингибирует активность Ν6Ε, для лечения боли. Индивидуумам вводят возрастающие дозировки средства, которое ингибирует Ν6Ε, например, антитела против Ν6Ε, в сочетании с НСПВС. Для оценки эффективности лечения можно следить за показателем боли.

Введение антагониста Ν6Ε и/или НСПВС в соответствии со способом настоящего изобретения может быть непрерывным или прерывистым, в зависимости, например, от физиологического состояния реципиента. От того, является ли цель введения терапевтической или профилактической, и от других факторов, известных опытным практикам. Введение антагониста Ν6Ε может быть по существу непре

- 26 010159 рывным в течение заранее выбранного периода времени, или оно может производиться в виде серии доз, вводимых через промежуток времени, например, или до, во время или после развития боли; до и после; во время и после; до и во время; или до, во время и после развития боли. Например, введение может осуществляться до, во время и/или после ранения, пореза, травмы, операции и любого другого явления, которое, вероятно, вызовет развитие боли.

В некоторых вариантах осуществления могут присутствовать более одного антагониста ΝΟΡ, такого как антитело. Антагонисты могут быть одинаковыми или отличными друг от друга. Могут присутствовать по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или более различных антагонистов ΝΟΡ. В целом, эти антагонисты ΝΟΡ обладают дополнительной активностью, которая не оказывает их неблагоприятного эффекта друг на друга. Антагонисты ΝΟΡ можно также применять в сочетании с другими средствами, которые служат для усиления и/или дополнения эффективности средств.

В некоторых вариантах осуществления могут присутствовать более одного НСПВС. НСПВС могут быть одинаковыми или отличными друг от друга. Могут присутствовать по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или более различных НСПВС. В целом, эти НСПВС обладают дополнительной активностью, которая не оказывает их неблагоприятного эффекта друг на друга. НСПВС можно также применять в сочетании с другими средствами, которые служат для усиления и/или дополнения эффективности средства (средств).

Терапевтические композиции антагониста ΝΟΡ (такого как антитело) и НСПВС, применяемые в соответствии с настоящим изобретением, готовят для хранения смешиванием антитела, имеющего желательную степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Веттд!оп е! а1., ТНе 8с1епсе апй РгасНсе о£ РНагтасу 20'¹' Ей. Маск РиЫкЫпд (2000)) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и могут включать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия, антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); полипептиды низкой молекулярной массы (менее примерно 10 остатков), белки, такие как сывороточный альбумин, желатин, или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводороды, включая глюкозу, маннозу или декстран; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; образующие соль противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Ζπ-белок); и/или не ионные поверхностно-активные вещества, такие как Τ^ΕΕΝ™, РРРРОМС8 ™ или полиэтиленгликоль (РЕС).

Липосомы, содержащие антагонист ΝΟΡ (такой как антитело) получают способами, известными в данной области, такими как описано в публикациях Ерйет, е! а1., Ргос. №!1. Асай. 8ск И8А 82:3688 (1985); Н^апд, е! а1., Ргос. ЫаЙ Асай. δα. И8А 77:4030 (1980); и патентах США №№ 4485045 и 4544545. Липосомы с увеличенным временем циркуляции раскрыты в патенте США № 5013556. Особенно полезные липосомы можно генерировать способом выпаривания в обращенной фазе липидной композицией, включающей фосфатидилхолин, холестерин и дериватизированный РЕС фосфатидилэтаноламин (РЕСРЕ). Липосомы подвергают экструзии через фильтры с определенным размером пор для получения липосом с желательным диаметром.

Активные ингредиенты могут также заключаться в микрокапсулы, полученные, например, методиками коацервации или межповерхностной полимеризации, например, соответственно гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметацилатные) микрокапсулы, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методики раскрыты в руководстве Веттд!оп, е! а1., ТНе 8с1епсе апй Ргасйсе о£ РНагтасу 20'¹' Ей. Маск РиЫкЫпд (2000).

Можно получить средства пролонгированного высвобождения. Подходящие примеры средств пролонгированного высвобождения включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем матрицы представлены в виде изделий, имеющих определенную форму, например, пленки или микрокапсулы. Примеры матриц пролонгированного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и 7-этил-Ь-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, такие как РиРРОХ ЭЕРОТ™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислотыгликолевой кислоты и ацетата лейпролида), ацетатизобутират сахарозы и поли-Э-(-)-3-гидроксимасляная кислота.

Композиции, подлежащие применению для введения ш у|уо, должны быть стерильными. Это легко

- 27 010159 осуществляется, например, фильтрацией через мембраны стерилизующей фильтрации. Терапевтические композиции антагониста ΝΟΡ (такого как антитело против ΝΟΡ) в целом помещаются в контейнер, имеющий канал стерильного доступа, например, мешочек с раствором для внутривенных инъекций или флакончик, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций.

Композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть представлены в виде стандартных лекарственных форм, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии или суппозитории, для перорального, парентерального или ректального введения, или введения ингаляцией или инсуффляцией.

Для получения твердых композиций, таких как таблетки, основной активный ингредиент смешивают с фармацевтическим носителем, например, обычными таблетирующими ингредиентами, таким как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, дикальцийфосфат или смолы, и другими фармацевтическим разбавителями, например, водой, для образования твердой предварительно составленной композиции, содержащей однородную смесь соединения настоящего изобретения или его нетоксичную фармацевтически приемлемую соль. При названии этих фармацевтических композиций «однородными» подразумевается, что активный ингредиент равномерно диспергирован по всей композиции так, что композицию можно легко подразделить на одинаково эффективные стандартные лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Эту твердую предварительно составленную композицию затем подразделяют на стандартные лекарственные формы описанного выше типа, содержащие от примерно 0,01 до примерно 0,1 мг до примерно 500 мг активного ингредиента настоящего изобретения. Таблетки или пилюли новой композиции можно покрыть или компаундировать другим образом для предоставления лекарственной формы, придающей преимущество пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может включать компонент внутренней дозировки и внешней дозировки, причем последний представлен в форме оболочки вокруг первого. Эти два компонента могут отделяться энтеросолюбильным слоем, который служит для противодействия разрушению в желудке и обеспечивает возможность внутреннему компоненту проходить интактным в 12-перстную кишку или отсрочить освобождение. Для таких энтеросолюбильных слоев или покрытий можно использовать разнообразные материалы, причем такие материалы включают ряд полимерных кислот и смесей полимерных кислот с такими материалами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

Жидкие формы, в которых композиции настоящего изобретения могут быть включены для перорального введения или инъекцией, включают водные растворы, подходящим образом ароматизированные сиропы, водные или масляные суспензии и ароматизированные эмульсии с пищевыми маслами, такими как масло семян хлопка, кунжутное масло, кокосовое масло или арахисовое масло, а также эликсиры и аналогичные фармацевтические носители. Подходящие диспергирующие или суспендирующие средства для водных суспензий включают синтетические и естественные смолы, такие как трагакант, акация, альгинат, декстран, карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, поливинилпирролидон или желатин. Активные ингредиент могут также быть включены в имеющие высокую вязкость продукты контролируемого высвобождения, такие как ацетатизобутират сахарозы или другие. Эти композиции можно использовать или для перорального введения, или для инъекций.

Инъекция может привести к образованию локального депо средства, который высвобождается локально в течение периода от 1 дня до 3 месяцев.

Композиции для введения инъекцией включают композиции, содержащие антагонист ΝΟΡ и НСПВС в качестве активных ингредиентов в сочетании с поверхностно-активным агентом (или смачивающим агентом, или поверхностно-активным веществом) или в форме эмульсии (в виде эмульсии воды в масле или масла в воде). Подходящие поверхностно-активные агенты включают, в частности, неионные агенты, такие как полиоксиэтиленсорбитаны (например, Т\гееп™ 20, 40, 60, 80 или 85) и другие сорбитаны (например, 8раи™ 20, 40, 60, 80 или 85). Композиции с поверхностно-активным агентом могут содержать от 0,05 до 5% поверхностно-активного агента, или от 0,1 до 2,5%. Следует понимать, что при необходимости можно добавлять другие ингредиенты, например, маннит или другие фармацевтически приемлемые носители.

Подходящие эмульсии можно получить с использованием имеющихся в продаже жировых эмульсий, таких как 1пба11р1б™, Ырокуп™, ШопитоЕ™, ЫроГипбт™ и Ыр|рНу5ап™. Активный ингредиент может быть или растворен в предварительно смешанной эмульсионной композиции, или, альтернативно, он может быть растворен в масле (например, масле соевых бобов, масле сафлора, масле семян хлопка, кунжутном масле, кукурузном масле или миндальном масле) и эмульсии, образованной после смешивания с фосфолипидом (например, яичными фосфолипидами, фосфолипидами соевых бобов или лецитином соевых бобов) и водой. Следует понимать, что можно добавить другие ингредиенты, например, глицерин или глюкозу, для доведения тоничности эмульсии. Подходящие эмульсии обычно должны содержать до 20% масла, например от 5 до 20%. Жировая эмульсия может включать капельки жира от 0,1 до 1,0 мкм, в частности, от 0,1 до 0,5 мкм, и иметь рН в диапазоне от 5,5 до 8,0.

В некоторых вариантах осуществления композиции представляют собой композиции, полученные смешиванием антагониста фактора роста нервов с 1п!гаНр1б™ или его компонентов (масла соевых бобов,

- 28 010159 яичных фосфолипидов, глицерина и воды).

Композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых, водных или органических растворителях, или их смеси и порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты, как изложено выше. Композиции вводят пероральным или интраназальным респираторным путем для локального или системного эффекта. Композиции в предпочтительно стерильных фармацевтически приемлемых растворителях могут распыляться использованием газов. Распыленные растворы могут вдыхаться непосредственно из распыляющего устройства, или распыляющее устройство может быть прикреплено к лицевой маске, тенту или аппарату периодической искусственной вентлляции легких под положительным давлением. Композиции в виде раствора, суспензии или порошка можно вводить (включая перорально или интраназально) из устройств, которые доставляют композицию соответствующим образом.

Эффективность лечения можно оценить способами, хорошо известными в данной области.

Следующие примеры представлены для иллюстрации, а не ограничения изобретения.

Примеры

Пример 1.

Лечение моноклональным антителом против ΝΟΕ в сочетании с НСПВС по поводу послеоперационной боли

Заявители использовали модель боли, которая имитирует послеоперационную боль, для оценки эффективности антитела против ΝΟΕ в сочетании с НСПВС, ибупрофеном. Для каждого эксперимента 16 самцов взрослых крыс 8ргадие Эа\\'1еу с массой тела от 200 до 220 г (Наг1ап; 1пб1апаро118, ΙΝ) содержали в нормальных световых условиях в течение по меньшей мере 1 недели перед использованием при доступе без ограничений к пище и воде. После 2-часового периода акклиматизации в камерах тестирования в день операции крыс делили на две группы: одна получала антитело за 15 ч перед операцией, другая в это время получала носитель (5% декстрозу/0,45% солевой раствор по Фармакопее США). Антитело 911 против антагониста ΝΟΕ (см. Нопдо, е! а1., НуЬпбота 19:215-227 (2000)) вводили в дозе 1 мг/кг массы тела. Ибупрофен вводили в различных концентрациях в диапазоне от 10, 30, 100 до 300 мг/кг (подкожно) через 24 ч после операции всем животным.

Операция была основана на процедуре, описанной Вгеппап, е! а1., Раш 64:493-501 (1996). Животных анестезировали 2% изофлюраном и воздушной смесью, которую поддерживали во время операции, через носовую воронку. Подошвенную поверхность правой задней лапы готовили тампоном с повидономйодом, производили центральный продольный разрез длиной 1 см через кожу и фасцию, начиная в 0,5 см от края пятки и продолжая к пальцам стопы. Измерения производили линейкой при стопе, удерживаемой в согнутом положении. Подошвенную мышцу поднимали с использованием пинцета с изогнутыми браншами, и в ней производили продольный разрез. Мышцу разрезали на полную глубину, между местом ее отхождения и участком прикрепления. Кровотечение останавливали во время всей операции давлением, оказываемым посредством марлевого тампона. Рану закрывали двумя матрацными швами (черная одноволоконная нить Е!Ысоп 5-0). Эти шовные нити завязывали узлами 5-6 раз при первом узле, затянутом неплотно. Участок раны протирали раствором бацитрацина. Животным давали возможность восстановиться и находиться в покое в чистых клетках в течение 22 ч перед тем как начиналось поведенческое тестирование.

Для каждого эксперимента животных делили на две группы (контрольную и получавшую лечение антителом). Антитело лротив ΝΟΕ вводили за 15 ч перед операцией. Боль в покое оценивали через 22 ч после операции в обеих группах («исходное состояние» в следующих графиках). Через 20 ч после операции всех животных затем лечили ибупрофеном в дозе 10, 30, 100 или 300 мг/кг (подкожно). Боль в покое оценивали, начиная через 1 ч после лечения ибупрофеном.

Боль в покое оценивали в различное время после операции с использованием кумулятивной балльной оценки боли. Крыс помещали на пластиковую сетку (решетку: 8 мм²) в прозрачной пластиковой клетке и давали возможность акклиматизироваться в течение 15-20 мин. Поведение оценивали по шкале от 0 до 2. Балльную оценку 0 давали, если животное опиралось на разрезанную лапу, по данным оценки, если отмечалось, что лапа бледнела или упиралась в решетку. Балльную оценку 1 давали, если животное щадило лапу при коже, лишь касающейся решетки без побледнения или углублений кожи. Балльную оценку 2 давали, если лапа удерживалась, полностью не касаясь решетки. Каждое животное наблюдали в течение 1 мин через каждые 5 мин в течение 30 мин. Сумму из 6 баллов (всего 0-12), полученную в течение 1/2 ч, использовали для оценки боли в разрезанной стопе.

Результаты этих экспериментов показаны в таблице и на фиг. 1.

Таблица 1.

Кумулятивная балльная оценка боли у животных после лечения антителом против антагониста ΝΟΕ в дозе 1 мг/кг и ибупрофеном в дозе 0, 10, 30, 100 или 300 мг/кг через 1 день после операции. Данные показаны в виде средней величины (± стандартное отклонение). Данные анализировали с использованием однофакторного дисперсионного анализа, а затем отдельные пары анализировали с использованием коррекции Воп£епош для множественных сравнений с использованием программного обеспечения Рпхт.

- 29 010159

	Исходный уровень	10 мг/кг	30 мг/кг	100 мг/кг	300 мг/кг
МаЬ 911	5,4(0,8)	3 (0,87)	3,4 (0,68)	Ν/ϋ	Ν/ϋ
Контроль	8,2 (0,72)	7,3 (0,73)	6,1 (1,08)	5 (0,82)	4,4 (0,78)
	р<0,001	р<0,001	р<0,05

Как показано в таблице, балльная оценка боли в покое для крыс, получавших лечение МаЬ 911 (в дозе 1 мг/кг), была значимо ниже, чем в контроле без ибупрофена (р<0,001). Аналогичным образом, балльная оценка боли в покое при лечении МаЬ 911 в дозе 1 мг/кг и 10 мг/кг ибупрофена была значимо ниже, чем при лечении одним ибупрофеном в дозе 10 мг/кг (р<0,001); и балльная оценка боли в покое при лечении МаЬ 911 в дозе 1 мг/кг и 30 мг/кг ибупрофена была значимо ниже, чем при лечении одним ибупрофеном в дозе 30 мг/кг (р<0,05). На фиг. 1 представлена балльная оценка боли в покое, измеренная у животных при лечении антителом против Ν6Ε в дозе 1 мг/кг и без него и при лечении различными дозами ибупрофена и без него. Предоперационное лечение антителом против Ν6Ε и ибупрофеном более эффективно в уменьшении боли в покое, чем один ибупрофен или лечение одним антителом. Считается, что лечение МаЬ 911 (1 мг/кг) в комбинации с ибупрофеном в дозе 10 мг/кг, по меньшей мере, также эффективно, как один ибупрофен в дозе 300 мг/кг.

Для испытания эффекта лечения моноклональным антителом 911 против Ν6Ε в сочетании с диклофенаком для лечения послеоперационной боли эксперименты проводили, как описано выше, за исключением того, что животным вводили носитель или диклофенак в дозе 5 мг/кг вместо ибупрофена. Результаты показаны на фиг. 2. Уменьшение балльной оценки боли наблюдалось для средней величины при лечении и 911 в дозе 1 мг/кг, и диклофенаком в дозе 5 мг/кг, по сравнению с лечением одним диклофенаком в дозе 5 мг/кг.

Хотя представленное выше изобретение было описано с определенными деталями в качестве иллюстрации и примера в целях ясности понимания, описания и примеры не должны рассматриваться как ограничивающие диапазон изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения боли у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела против фактора роста нервов (Ν6Ε) и НСПВС, при котором антитело против Ν6Ε и НСПВС в сочетании обеспечивают эффективное облегчение боли.
2. Способ по п.1, в котором НСПВС выбран из группы, состоящей из ибупрофена, напроксена, напросина, диклофенака, кетопрофена, толметина, сулиндака, мефенамовой кислоты, меклофенамовой кислоты, дифлунизала, флуфенизала, пироксикама, судоксикама, изоксикама, целекоксиба, рофекоксиба, ΌυΡ-697, флозулида, мелоксикама, 6-метокси-2-нафтилуксусной кислоты, МК-966, набуметона, нимезулида, Ν8-398, 8С-5766, 8С-58215, Т-614.
3. Способ по п.1, в котором НСПВС представляет собой ибупрофен.
4. Способ по пп.1, 2 или 3, в котором указанное антитело связывает человеческий Ν6Ε.
5. Способ по п.4, в котором указанное антитело имеет аффинность связывания с Ν6Ε человека примерно 10 или менее чем примерно 10 нМ.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором указанное антитело представляет собой человеческое антитело.
7. Способ по любому из пп.1-5, в котором указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело.
8. Способ по п.7, в котором указанное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕО Ш ΝΟ:1 и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕО Ш ΝΟ:2.
9. Способ по любому из пп.1-8, в котором боль представляет собой послеоперационную боль.
10. Способ по п.1, в котором индивидуум является человеком.
11. Фармацевтическая композиция для лечения боли у индивидуума, включающая эффективное количество антитела против Ν6Ε и НСПВС и фармацевтически приемлемый носитель.
12. Фармацевтическая композиция по п.11, в которой указанное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕО Ш ΝΟ:1 и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕО Ш ΝΟ:2.
13. Фармацевтическая композиция по п.11, где индивидуум является человеком.
14. Набор для лечения боли у индивидуума, включающий антитело против Ν6Ε и НСПВС и инструкции по введению антитела против Ν6Ε в сочетании с НСПВС для лечения боли у индивидуума.
15. Набор по п.14, в котором указанное антитело включает вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕО Ш ΝΟ:1 и вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью 8ЕО Ш ΝΟ:2.
16. Набор по п.14, где индивидуум является человеком.