ES2355558T3

ES2355558T3 - Procedimiento para tratar el dolor administrando un antagonista del factor de crecimiento neuronal y un aine y la composición que contiene los mismos.

Info

Publication number: ES2355558T3
Application number: ES04712940T
Authority: ES
Inventors: David L. Shelton; German J. Vergara; Carole M. Loo
Original assignee: Rinat Neuroscience Corp
Current assignee: Rinat Neuroscience Corp
Priority date: 2003-02-19
Filing date: 2004-02-19
Publication date: 2011-03-28
Anticipated expiration: 2024-02-19
Also published as: ZA200506509B; UA81299C2; CN1871028A

Abstract

Un anticuerpo antagonizante anti-factor de crecimiento neuronal (NGF) e ibuprofeno para uso en combinación en el tratamiento del dolor postquirúrgico en un individuo.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para prevenir o tratar el dolor en un paciente por medio de la administración de una combinación de un antagonista del factor de crecimiento neuronal y un fármaco antiinflamatorio no esteroide (AINE). 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En la actualidad, para aliviar el dolor se recomienda el uso de una serie de tratamientos que implican a la administración de fármacos antiinflamatorios no esteroides (AINE). Se ha demostrado que la administración de AINE presenta propiedades de alivio del dolor. Sin embargo, el tratamiento con AINE tiene desventajas conocidas, que incluyen efectos secundarios indeseados tales como la irritación del 10 tracto gastrointestinal y la toxicidad renal y hepática. Por otra parte, los AINE no logran alcanzar el alivio adecuado del dolor incluso en sus dosis máximas terapéuticamente autorizadas en algunos estados del dolor.

El factor de crecimiento neuronal (NGF) fue la primera neurotrofina que se identificó, y su función en el desarrollo y la supervivencia tanto de las neuronas periféricas como de las centrales se ha caracterizado 15 bien. Se ha mostrado que el NGF es un factor fundamental de supervivencia y de mantenimiento en el desarrollo de las neuronas sensoriales simpáticas periféricas y embrionarias y de las neuronas colinérgicas del prosencéfalo basales (Smeyne, y col., Nature 368: 246-249 (1994); Crowley, y col., Cell 76: 1001-1011 (1994)). El NGF regula positivamente la expresión de los neuropéptidos en las neuronas sensoriales (Lindsay, y col., Nature 337: 362-364 (1989)), y su actividad está mediada a través de dos 20 receptores de unión a membrana diferentes, el receptor de la tirosina cinasa TrkA y el receptor p75, que está estructuralmente relacionado con otros miembros de la familia del receptor del factor de necrosis tumoral (Chao, et al., Science232: 518-521 (1986)).

Además de sus efectos en el sistema nervioso, el NGF ha estado en gran medida implicado en los procesos del exterior del sistema nervioso. Por ejemplo, se ha mostrado que la administración exógena 25 de NGF potencia la permeabilidad vascular (Otten, y col., Eur. J. Farmacol. 106: 199-201 (1984)), potencia las respuestas inmunitarias de las células T y B (Otten, y col., Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 86: 10059-10063 (1989)), induce la diferenciación de linfocitos y la proliferación de mastocitos y provoca la liberación de señales biológicas solubles de los mastocitos (Matsuda, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 6508-6512 (1988); Pearce, y col., J. Physiol. 372: 379-393 (1986); Bischoff, y col., 30 Blood 79: 2662-2669 (1992); Horigome, y col., J. Biol. Chem. 268: 14881-14887 (1993)).

El NGF es producido por una serie de tipos de células que incluyen los mastocitos (Leon, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 3739-3743 (1994)), los linfocitos B (Torcia, y col., CelI 85: 345-356 (1996), los queratinocitos (Di Marco, y col., J. Biol. Chem. 268: 22838-22846)), las células del músculo liso (Ueyama, y col., J. Hypertens. 11: 1061-1065 (1993)), los fibroblastos (Lindholm, y col., Eur. J. Neurosci. 2:795-801 35 (1990)), las células epiteliales bronquiales (Kassel, y col., Clin, Exp. Allergy 31: 1432-40 (2001)), las células mesangiales renales (Steiner, y col., Am. J. Physiol. 261: F792-798 (1991)) y los miotubos del músculo esquelético (Schwartz, y col., J Photochem, Photobiol. B 66: 195-200 (2002)). Se ha encontrado receptores de NGF en una diversidad de tipos de células fuera del sistema nervioso. Por ejemplo, TrkA se ha encontrado en monocitos humanos, linfocitos T y B y en mastocitos. 40

Se ha observado una asociación entre los niveles elevados de NGF y una diversidad de afecciones inflamatorias en pacientes humanos así como en varios modelos animales. Éstos incluyen el lupus eritematoso sistémico (Bracci-Laudiero, y col., Neuroreport 4: 563-565 (1993)), la esclerosis múltiple (Bracci-Laudiero, y col., Neurosci. Lett. 147: 9-12 (1992)), la psoriasis (Raychaudhuri, y col., Acta Derm. l’enereol 78: 84-86 (1998)), la artritis (Falcimi, y col., Ann. Rheum. Dis. 55: 745-748 (1996)), la cistitis 45 intersticial (Okragli, y col., J. Urology 161: 438-441 (1991)) y el asma (Braun, y col., Eur. J Immunol 28: 3240-3251 (1998)).

De manera coherente, un nivel elevado de NGF en los tejidos periféricos está asociado con inflamación e hiperalgesia y ha sido observado en numerosas formas de artritis. La sinovia de los pacientes afectados por artritis reumatoide expresa niveles altos de NGF mientras que en la sinovia no inflamada se ha 50 informado que el NGF no es detectable (Aloe, y col., Arch. Rheum. 35: 351-355 (1992)). Similares resultados se observaron en ratas con artritis reumatoide inducida experimentalmente (Aloe, y col., Clin. Exp. Rheumatol. 10: 203-204 (1992)). Se han informado niveles elevados de NGF en ratones artríticos transgénicos, junto con un incremento en el número de mastocitos (Aloe, y col., lnt. J. Tissue Reactions-

Exp. Clin. Aspects 15: 139-143 (1993)). Safieh-Garabedian. B, y col., (British Journal of Pharmacology (1995) 115: 1265-1275) dan a conocer que los anticuerpos monoclonales anti NGF impiden el establecimiento de la hiperalgesia mecánica y neutralizan la hipersensibilidad térmica posterior a la inyección intraplantar de adyuvante completo de Freund (CFA).

Hay dos categorías generales de medicamentos para el tratamiento del dolor, cada una actúa a través de 5 diferentes mecanismos y tienen efectos diferentes, ambas tienen también desventajas. La primera categoría incluye los fármacos antiinflamatorios no esteroides (AINE) que se utilizan para tratar el dolor leve, pero cuyo uso terapéutico está limitado por los efectos gastrointestinales indeseables tales como la erosión gástrica, la formación de úlcera péptica o la inflamación del duodeno y del colon y la toxicidad renal con el uso prolongado. La segunda categoría incluye los analgésicos opioides, tales como la 10 morfina, que se utilizan para tratar el dolor moderado a grave, pero cuyo uso terapéutico está limitado debido a los efectos indeseables, tales como el estreñimiento, náuseas y vómitos, la depresión respiratoria, confusión mental, el cólico renal, la tolerancia frente al uso prolongado y el riesgo de adicción.

Resulta evidente que existe una necesidad de un mejor tratamiento del dolor que proporcione un mayor 15 beneficio terapéutico (por ejemplo, menor gravedad y/o frecuencia del dolor) y que reduzca la incidencia de los efectos secundarios no deseados causados por muchos de los regímenes actuales.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en el descubrimiento de que los antagonistas del NGF son eficaces en el tratamiento del dolor en combinación con un AINE. Esta terapia da como resultado un tratamiento del 20 dolor inesperadamente mejor. Además, tal terapia permite por lo general utilizar una dosis reducida del AINE para lograr el mismo efecto de reducción del dolor y/u otras formas de mejora del tratamiento del dolor con AINE.

En un primer aspecto, la presente invención ofrece un anticuerpo antagonista anti-factor de crecimiento neuronal (NGF) e ibuprofeno en combinación en el tratamiento del dolor posquirúrgico en un individuo. 25 Las cantidades y relaciones relativas de anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno pueden variar. En algunas formas de realización, se administrará suficiente anticuerpo anti-NGF para permitir la reducción de la dosis normal de ibuprofeno necesario para lograr el mismo grado de mejora del dolor. En algunas formas de realización, se administrará suficiente anticuerpo anti-NGF para reducir la dosis normal de ibuprofeno requerida para lograr el mismo grado de mejora del dolor en al menos aproximadamente el 5%, en al 30 menos aproximadamente el 10%, en al menos aproximadamente el 20%, en al menos aproximadamente el 30%, en al menos aproximadamente el 40%, en al menos aproximadamente el 60%, en al menos aproximadamente el 70%, en al menos aproximadamente el 80% o en al menos aproximadamente el 90% o más. Esta reducción puede verse reflejada en términos de la cantidad administrada en una administración determinada y/o la cantidad administrada durante un período de tiempo determinado 35 (frecuencia reducida).

La administración en combinación, como se usa en el presente documento, comprende la administración simultánea y/o la administración en momentos diferentes. La administración en combinación también abarca la administración en forma de co-formulación (es decir, el anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno 40 están presentes (combinados) en la misma composición) y/o la administración en forma de composiciones separadas. Como se usa en el presente documento, “administración en combinación” pretende abarcar cualquier circunstancia en la que el ibuprofeno y el anticuerpo anti-NGF se administran a un individuo en una cantidad eficaz. Como se describe además en el presente documento, se entiende que el anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno se pueden administrar a frecuencias y/o intervalos de 45 dosificación diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF puede administrarse semanalmente, mientras que el ibuprofeno puede administrarse más frecuentemente. Se entiende que el anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno pueden administrarse usando la misma vía de administración o vías de administración diferentes, y que regímenes de dosificación diferentes pueden variar durante el transcurso de la(s) administración(es). La administración puede ser antes del comienzo del dolor. 50

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF se une específicamente al NGF. En otras formas de realización más, el anticuerpo anti-NGF reconoce el NGF humano. En otras formas más de realización, el anticuerpo anti-NGF se une específicamente al NGF humano. En otras formas más de realización más, el anticuerpo se une esencialmente al mismo epítopo 6 del NGF que un anticuerpo seleccionado de uno cualquiera o más de los siguientes anticuerpos monoclonales: MAb 911, MAb 912 y 55

MAb 938 (véase Hongo, y col., Hybridoma 19: 215-227 (2000)). En otras formas de realización más, el anticuerpo anti-NGF está humanizado (incluyendo Mab 911 humanizado, tal como el anticuerpo E3 descrito en el presente documento). En otras formas de realización más, el anticuerpo anti-NGF es el anticuerpo E3 (como se describe en el presente documento). En otras formas de realización, el anticuerpo anti-NGF comprende una o más CDR del anticuerpo E3 (tal como una, dos, tres, cuatro, 5 cinco, o, en algunas formas de realización, las seis CDR de E3). En otras formas de realización, el anticuerpo anti-NGF es humano. En otras formas de realización más, el anticuerpo anti-NGF comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en la Tabla 1 (ID. SEC. Nº 1) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera mostrada en la Tabla 2 (ID. SEC. Nº 2). En otras formas de realización más, el anticuerpo anti-NGF comprende la secuencia de 10 aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en la Tabla 1 (ID. SEC. Nº 1). En otras formas de realización más, el anticuerpo anti-NGF comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera mostrada en la Tabla 2 (ID. SEC. Nº 2). En otras formas de realización más, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inmunológicamente inerte, por ejemplo, no desencadena la lisis mediada por el complemento, o no 15 estimula la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). En otras formas de realización, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624; Solicitud PCT Nº PCT/GB99/01441; y/o la Solicitud de Patente de Reino Unido Nº 9809951.8.

En algunas formas de realización, el antagonista del NGF se une a la molécula de NGF. En otras formas más de realización, el antagonista del NGF es un anticuerpo que se une específicamente al NGF. Sin 20 embargo, el antagonista del NGF puede unirse de manera alternativa al receptor TrkA. El antagonista del NGF puede ser un anticuerpo monoclonal anti-NGF humano (antihNGF) que es capaz de unirse a hNGF e inhibir de manera eficaz la unión de hNGF a TrkA humana (hTrkA).

La afinidad de unión de un anticuerpo anti-NGF a NGF (tal como hNGF) puede ser de aproximadamente 0,10 nM a aproximadamente 0,80 nM, de aproximadamente 0,15 a aproximadamente 0,75 nM y de 25 aproximadamente 0,18 a aproximadamente 0,72 nM. En una forma de realización, la afinidad de unión está entre aproximadamente 2 pM y 22 pM. En algunas formas de realización, la afinidad de unión es de aproximadamente 10 nM. En otras formas de realización, la afinidad de unión es inferior a aproximadamente 10 nM. En otras formas de realización, la afinidad de unión es de aproximadamente 0,1 nM o aproximadamente 0,07 nM. En otras formas de realización, la afinidad de unión es inferior a 30 aproximadamente 0,1 nM, o inferior a aproximadamente 0,07 nM. En otras formas de realización, la afinidad de unión es cualquiera de aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM a cualquiera de aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 40 pM o 35 aproximadamente 50 pM. En algunas formas de realización, la afinidad de unión es cualquiera de aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM, o inferior a aproximadamente 50 pM. En algunas formas de realización, la afinidad de unión es inferior a cualquiera de aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 40 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM. En todavía otras formas de realización, la afinidad de unión es de aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 40 pM o superior a aproximadamente 40 pM. Como se conoce bien en la técnica, la afinidad de unión puede expresarse como KD, o constante de disociación, y una afinidad de unión aumentada corresponde a una 45 KD disminuida. La afinidad de unión de anticuerpo monoclonal 911 anti-NGF de ratón (Hongo y col., Hybridoma 19: 215-227 (2000)) para el NGF humano es de aproximadamente 10 nM, y la afinidad de unión del anticuerpo humanizado anti-NGF E3 (descrito en el presente documento) para el NGF humano es de aproximadamente 0,07 nM.

El anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo, incluyendo un fragmento de anticuerpo 50 seleccionado del grupo que consiste en fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo, y una molécula Fv de cadena sencilla (scFv).

El anticuerpo anti-NGF y/o el ibuprofeno puede administrarse a un individuo por cualquier vía adecuada. Por ejemplo pueden administrarse juntos o por separado, y/o simultáneamente y/o secuencialmente, por 55 vía oral, intravenosa, sublingual, subcutánea, intraarterial, intramuscular, rectal, intraespinal, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular, sublingual, transdérmica y/o por inhalación. La administración puede ser sistémica, por ejemplo intravenosa, o localizada.

En un segundo aspecto, la presente invención ofrece composiciones que comprenden un anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno. El anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno pueden estar presentes junto con uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables, o pueden estar presentes en composiciones separadas. En otro aspecto, la invención proporciona una composición sinérgica de un anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno. 5

En un tercer aspecto, la presente invención ofrece un kit para su uso en el tratamiento del dolor postquirúrgico, comprendiendo dicho kit un anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno. El kit además puede comprender instrucciones para cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. Las instrucciones pueden comprender la administración de un anticuerpo anti-NGF en combinación con ibuprofeno (es decir, la administración simultánea y/o administración en momentos diferentes). En 10 algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno están envasados juntos, pero pueden estar, o no, en el mismo contenedor. Por consiguiente, en algunas formas de realización, el kit comprende un anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno presentes en el mismo contenedor, e instrucciones para su uso en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. En otras formas de realización, el kit comprende un anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno presentes en envases separados. En 15 algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF se une a NGF humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF se une a NGF humano con afinidad de unión de aproximadamente 10 nM o inferior a aproximadamente 10 nM. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF es un anticuerpo humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF es un anticuerpo humanizado. En algunas formas de realización, el anticuerpo humanizado es un anticuerpo que 20 comprende la región variable de la cadena pesada mostrada en ID. SEC. Nº 1 y la región variable de la cadena ligera mostrada en ID. SEC. Nº 2.

En algunas formas de realización, la invención proporciona una composición farmacéutica para tratar el dolor postquirúrgico que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 25

En algunas formas de realización, la invención proporciona un kit para tratar el dolor postquirúrgico que comprende un anticuerpo anti-NGF, ibuprofeno e instrucciones para administrar el anticuerpo anti-NGF en combinación con el ibuprofeno para tratar el dolor postquirúrgico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIGURA 1 demuestra que la puntuación de dolor acumulativo se reduce en los animales tratados con 30 C[+] ibuprofeno en dosis de 10 ó 30 mg/kg, en combinación con un antagonista del NGF (antagonista anti-NGF Mab 911; véase Hongo y col., Hybridoma 19: 215-227 (2000)). Los animales se separaron en dos grupos (control y tratados con anticuerpos). El antagonista del NGF se administró 15 horas antes de la cirugía, por vía intraperitoneal (tiempo = -15 horas) a una dosis de 1 mg/kg. La cirugía se realizó tal como se describe en el tiempo 0. El dolor en reposo se valoró 24 horas después de la cirugía (“0” en el 35 gráfico). Todos los animales se trataron a continuación con ibuprofeno (300 mg/ml en betaciclodextrina líquida al 45%) en dosis de 10 mg/kg o 30 mg/kg de peso corporal. Los animales de control no tratados con anticuerpo también fueron tratados con ibuprofeno en dosis de 10 mg/kg, 30 mg/kg, 100 mg/kg y 300 mg/kg. El ibuprofeno se administró por vía subcutánea en el pescuezo. Una hora después de la dosis de ibuprofeno, se probó el dolor en reposo. El tratamiento con el anticuerpo antagonista anti-NGF más 40 ibuprofeno es más eficaz en la reducción del dolor en reposo que el tratamiento con ibuprofeno solo o con anticuerpo antagonista anti-NGF solo.

La FIGURA 2 es un gráfico que muestra la puntuación de dolor acumulativo en animales tratados con diclofenac en dosis de 5 mg/kg, en combinación con un antagonista del NGF (antagonista anti-NGF Mab 911; véase Hongo y col., Hybridoma 19:215-227 (2000)). Los animales se separaron en dos grupos 45 (control y tratados con anticuerpos). El antagonista del NGF se administró 15 horas antes de la cirugía, por vía intraperitoneal (tiempo = -15 horas) a una dosis de 1 mg/kg. La cirugía se realizó tal como se describe en el tiempo 0. El dolor en reposo se valoró 24 horas después de la cirugía (“0” en el gráfico). Todos los animales se trataron a continuación con diclofenac en dosis de 5 mg/kg de peso corporal. Los animales de control no tratados con anticuerpo también fueron tratados con diclofenac en dosis de 5 50 mg/kg. El diclofenac se administró por vía subcutánea en el pescuezo. Una hora después de la dosis de diclofenac, se probó el dolor en reposo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los inventores han descubierto que el dolor puede prevenirse o tratarse mediante la administración de una cantidad eficaz de un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo anti-NGF) en combinación con un 55

AINE. Los procedimientos y composiciones de la presente invención son útiles para el tratamiento o la prevención del dolor, que incluye cualquier dolor en el que se prescriba generalmente la utilización de un AINE. Mediante el uso de un antagonista del factor de crecimiento neuronal y en combinación con un AINE, de acuerdo con la presente invención, ahora es posible tratar el dolor con una dosis más baja de un AINE, reduciendo de este modo la posibilidad de efectos secundarios asociados con el tratamiento 5 con AINE. En algunas formas de realización, se administrará suficiente antagonista del NGF de manera de permitir la reducción de la dosis normal requerida de AINE para producir el mismo grado de disminución del dolor en al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70% o al menos aproximadamente 90%, o más. 10

El tratamiento del dolor con un AINE también puede mejorarse como se describió en el presente documento, mediante la administración del AINE en combinación con un antagonista del NGF.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti factor de crecimiento neuronal (NGF) antagonizante en combinación con ibuprofeno para usar en el tratamiento del dolor postquirúrgico en un individuo. 15

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF es capaz de unirse a NGF y de inhibir de manera eficaz la unión de NGF a su receptor TrkA o p75 in vivo o de inhibir de manera eficaz el NGF a partir de la activación de su receptor TrkA o p75. En algunas formas de realización, la afinidad de unión del anticuerpo al NGF es de aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 1,00 nM, o aproximadamente 0,05 hasta aproximadamente 0,25 nM. En otras formas de realización, la afinidad de 20 unión es aproximadamente 1 pM, aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 100 pM, o más. En una forma de realización, la afinidad de unión está aproximadamente entre 2 pM y 22 pM. En algunas formas de realización, el anticuerpo une esencialmente el mismo epítopo 6 de NGF que un anticuerpo seleccionado de uno o más de los siguientes: MAb 911, MAb 912 y MAb 938. Véase Hongo, y 25 col, Hybridoma 19: 215-227 (2000).

El anticuerpo puede ser también un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo seleccionado de uno o más de los siguientes: Fab, Fab’, F(ab’)2, fragmentos Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpo de cadena única y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos y una molécula Fv de cadena única (ScFv). El anticuerpo puede ser quimérico y puede ser 30 humanizado o humano. El anticuerpo puede ser biespecífico.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones y kits para tratar el dolor postquirúrgico que comprenden un anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno adecuados para su uso como se describe en el presente documento.

Técnicas generales 35

La práctica de la presente invención utilizará, salvo que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de los conocimientos de la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook, y col., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 40 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Ind.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. 45 Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, y col., eds., 1987); PCR: The Polimerase Chain Reaction, (Mullis, y col., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan y col., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 50 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definiciones 55

Un “anticuerpo” (usado indistintamente en forma plural) es una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse de manera específica a una diana, tal como un carbohidrato, polinucleótido, lípido, polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno, localizado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Como se usa en el presente documento, el término no solamente abarca anticuerpos policlonales o monoclonales intactos sino también fragmentos de los mismos (tales como 5 Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), cadena única (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una parte de anticuerpo, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida. Un anticuerpo 10 incluye un anticuerpo de cualquier clase, tales como IgG, IgA, o IgM (o subclase de los mismos), y el anticuerpo no necesita ser de cualquier clase particular. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas pueden además separarse en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 15 IgA1e IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman alfa, delta, épsilon, gamma, y mu, respectivamente. Son bien conocidas las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas.

Un “anticuerpo monoclonal” se refiere a una población de anticuerpos homogénea en la que el anticuerpo 20 monoclonal está comprendido por aminoácidos (que se presentan en la naturaleza y que no se presentan en la naturaleza) que están implicados en la unión selectiva de un antígeno. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un sitio antigénico único. La expresión “anticuerpo monoclonal” abarca no solamente anticuerpos monoclonales intactos y anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab’, 25 F(ab’)2, Fv), cadena individual (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida y la capacidad de unirse a un antígeno. No se pretende que esté limitado con relación al origen del anticuerpo o la manera en la que se prepara (por 30 ejemplo, mediante hibridoma, selección de fago, expresión recombinante, animales transgénicos, etc.).

El término anticuerpos “humanizados” se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión del antígeno que se obtiene sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana y la estructura de la inmunoglobulina restante de la molécula está basada en la estructura y/o la secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión del antígeno puede comprender los dominios variables 35 completos fusionados sobre los dominios constantes o solamente las regiones determinantes de complementariedad (CDR) injertadas sobre las regiones marco apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión del antígeno pueden ser de tipo natural o pueden estar modificados por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, modificado para asemejarse más a la inmunoglobulina humana. Algunas formas de anticuerpos humanizados conservan todas las secuencias de las CDR (por 40 ejemplo, un anticuerpo humanizado de ratón que contiene las seis CDR de los anticuerpos de ratón). Otras formas de anticuerpos humanizados tienen una o más CDR (una, dos, tres, cuatro, cinco, seis) que están alteradas con respecto al anticuerpo original. A veces, los residuos de la región marco (FR) u otros residuos de la inmunoglobulina humana están reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en 45 el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donador.

Como se usa en el presente documento, la expresión “factor de crecimiento neuronal” y el término “NGF” se refieren al factor de crecimiento neuronal y sus variantes (que incluyen por ejemplo, variantes de empalme y variantes de procesamiento de proteínas) que retienen al menos parte de la actividad de NGF. Como se usa en el presente documento, NGF incluye todas las especies de mamíferos de NGF de 50 secuencia nativa, incluyendo ser humano, primate no humano, canino, felino, equino, o bovino.

“Receptor de NGF” se refiere a un polipéptido que está unido por o activado por NGF. Los receptores de NGF incluyen el receptor TrkA y el receptor p75 de cualquier especie de mamífero, que incluyen, pero no se limitan a, ser humano, canino, felino, equino, primate o bovino.

Un “antagonista del NGF” se refiere a cualquier molécula que bloquea, suprime o reduce (incluyendo de 55 manera significativa) la actividad biológica de NGF, incluyendo rutas aguas abajo mediadas por la señalización de NGF, tales como unión del receptor y/o provocación de una respuesta celular a NGF. El término “antagonista” no implica mecanismo específico de acción biológica en absoluto, y se considera

que expresamente incluye y abarca todas las interacciones posibles farmacológicas, fisiológicas, y bioquímicas con NGF bien directas o indirectas, o bien que interactúan con NGF, su receptor, o a través de otro mecanismo, y sus consecuencias que pueden lograrse mediante una diversidad de composiciones diferentes, y químicamente divergentes. Los antagonistas del NGF de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo anti-NGF, una molécula antisentido dirigida a un NGF (incluyendo una 5 molécula antisentido dirigida a un ácido nucleico que codifica NGF), un compuesto inhibidor de NGF, un análogo estructural de NGF, una mutación negativa dominante de un receptor TrkA que se une a un NGF, una inmunoadhesina de TrkA, un anticuerpo anti-TrkA, un anticuerpo anti-p75, una molécula antisentido dirigida a cualquiera o a ambos receptores TrkA y/o p75 (que incluyen moléculas antisentido dirigidas a una molécula de ácido nucleico que codifica TrkA o p75) y un inhibidor de cinasa. Para los 10 fines de la presente invención, se entenderá explícitamente que el término “antagonista” abarca todos los términos, títulos, y estados funcionales identificados previamente, y características por las que el propio NGF, una actividad biológica de NGF (que incluye pero no limitada a su capacidad para mediar cualquier aspecto del dolor), o las consecuencias de la actividad biológica, están sustancialmente anuladas, disminuidas, o neutralizadas en cualquier grado significativo. En algunas formas de realización, un 15 antagonista del NGF se une a (interactúa físicamente con) NGF (por ejemplo, un anticuerpo), se une a un receptor de NGF (tal como el receptor TrkA o receptor p75), reduce (impide y/o bloquea) aguas abajo la señalización de receptor de NGF y/o inhibe (reduce) la síntesis, producción o liberación de NGF. En algunas formas de realización, un antagonista del NGF se une a (interactúa físicamente con) NGF (por ejemplo, un anticuerpo), se une a un receptor de NGF (tal como el receptor TrkA o receptor p75), y/o 20 reduce (impide y/o bloquea) aguas abajo la señalización de receptor de NGF. En otras formas de realización, un antagonista del NGF se une a NGF y evita la dimerización del receptor TrkA y/o la autofosforilación de TrkA. En otras formas de realización, un antagonista del NGF inhibe o reduce la síntesis y/o la producción (liberación) de NGF. En el presente documento se proporcionan ejemplos de los tipos de antagonista del NGF. 25

Como se usa en el presente documento, un “anticuerpo anti-NGF” se refiere a un anticuerpo que es capaz de unirse a NGF e inhibir la actividad biológica de NGF y/o la(s) ruta(s) aguas abajo mediadas por la señalización de NGF.

Una “inmunoadhesina de TrkA” se refiere a una molécula quimérica soluble que comprende un fragmento de un receptor TrkA, por ejemplo, el dominio extracelular de un receptor TrkA y una secuencia de 30 inmunoglobulina, que retiene la especificidad de unión del receptor TrkA.

“Actividad biológica” de NGF en general se refiere a la capacidad de unirse a los receptores de NGF y/o activar las rutas de señalización del receptor de NGF. Sin limitación, una actividad biológica incluye una cualquiera o más de las siguientes: la capacidad de unirse a un receptor de NGF (tal como p75 y/o TrkA); la capacidad de promover la dimerización y/o autofosforilación del receptor TrkA; la capacidad de activar 35 una ruta de señalización del receptor de NGF; la capacidad para promover la diferenciación, proliferación, supervivencia, crecimiento celular y otros cambios en la fisiología celular, incluyendo (en el caso de las neuronas, incluyendo neurona periférica y central) cambio en la morfología neuronal, sinaptogénesis, función sináptica, liberación de neurotransmisores y/o neuropéptidos y regeneración después del daño; y la capacidad de mediar dolor. 40

El término “epítopo” se usa para referirse a los sitios de unión para anticuerpos (monoclonales y policlonales) en antígenos tales como antígenos proteicos.

Como se usa en el presente documento, “tratamiento” es un planteamiento para la obtención de resultados clínicos beneficiosos o deseados. Para el propósito de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: mejora o alivio de 45 cualquier aspecto del dolor incluyendo dolor agudo, crónico, inflamatorios, neuropático o postquirúrgico. Para el propósito de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: incluido la disminución de la gravedad, el alivio de uno o más síntomas asociados con el dolor incluyendo cualquier aspecto de dolor (tal como acortamiento de la duración de dolor y/o reducción de la sensibilidad o sensación de dolor). 50

“Reducción de la incidencia” de dolor significa cualquier reducción de la gravedad (que puede incluir la reducción de la necesidad y/o cantidad de (por ejemplo, exposición a) otros fármacos y/o terapias en general usadas para estas afecciones), duración y/o frecuencia (incluyendo, por ejemplo retraso o incremento del tiempo hasta el dolor en un individuo). Como entienden los expertos en la técnica, los individuos pueden variar en términos de su respuesta al tratamiento y, como tal, por ejemplo, un 55 “procedimiento de reducción de la incidencia de dolor en un individuo” refleja la administración del antagonista del NGF descrito en el presente documento en combinación con un AINE según se describe

en el presente documento, basándose en una expectativa razonable de que tal administración puede probablemente provocar tal reducción en la incidencia en el individuo particular.

“Mejora” de dolor o de uno o más síntomas del dolor significa una disminución o mejora de uno o más síntomas de un dolor cuando se compara con la no administración de un antagonista del NGF en combinación con un AINE. “Mejora” también incluye el acortamiento o reducción en la duración de un 5 síntoma.

“Paliación” de dolor o de uno o más síntomas del dolor significa la disminución del grado de una o más manifestaciones clínicas no deseables de dolor en un individuo o población de individuos tratados con un antagonista del NGF en combinación con un AINE de acuerdo con la invención.

Como se usa en el presente documento, “retraso del” desarrollo del dolor significa que difiere, impide, 10 ralentiza, retrasa, estabiliza, y/o pospone la progresión del dolor. Este retraso puede ser de longitudes de tiempo variables, dependiendo de la historia de la enfermedad y/o de los individuos que se están tratando. Como es evidente para los expertos en la técnica, un retraso suficiente o significativo puede, de hecho, abarcar la prevención, en la que el individuo no desarrolla dolor. Un procedimiento que “retrasa” el desarrollo del síntoma es un procedimiento que reduce la probabilidad de desarrollar el síntoma en un 15 intervalo de tiempo dado y/o reduce el grado de los síntomas en un intervalo de tiempo dado, cuando se compara con el no uso del procedimiento. Tales comparaciones se basan típicamente en estudios clínicos, que usan una cantidad de sujetos suficiente para proporcionar un resultado estadísticamente significativo.

20

“Desarrollo” o “progresión” de dolor significa manifestaciones iniciales y/o progresión resultante del trastorno. El desarrollo de dolor puede detectarse y valorarse usando técnicas clínicas convencionales bien conocidas en la técnica. Sin embargo, el desarrollo también se refiere a la progresión que puede ser indetectable. Para el propósito de esta invención, desarrollo o progresión se refiere al curso biológico de los síntomas. “Desarrollo” incluye aparición, recurrencia, y comienzo. Como se usa en el presente 25 documento “comienzo” o “aparición” de dolor incluye el comienzo inicial y/o recurrencia.

Una “cantidad eficaz” es una cantidad suficiente para efectuar resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyendo alivio o reducción en la sensación de dolor. Para el propósito de esta invención, una cantidad eficaz de un antagonista del NGF (tal como un anticuerpo anti-NGF) y un AINE incluye una cantidad suficiente para tratar, mejorar, reducir la intensidad de o evitar el dolor (incluyendo nocicepción y 30 la sensación de dolor) de cualquier tipo, incluido el dolor agudo, crónico, inflamatorio, neuropático o postquirúrgico. En algunas formas de realización, una “cantidad eficaz” de un AINE y un antagonista del NGF es una cantidad del antagonista del NGF y del AINE capaz de modular el umbral de sensibilidad a los estímulos externos hasta un nivel comparable al que se observa en los sujetos sanos. En otras formas de realización, este nivel puede no ser comparable al observado en los sujetos sanos, pero es 35 reducido en comparación a la ausencia de la terapia de combinación. Una cantidad eficaz de un antagonista del NGF también abarca una cantidad de un antagonista del NGF suficiente para potenciar el tratamiento con AINE (efecto terapéutico) del dolor, según se describe en el presente documento, o para reducir a dosis de AINE necesaria para tratar o evitar el dolor, según se describe en el presente documento. Como es sabido en la técnica, una cantidad eficaz de un antagonista del NGF en 40 combinación con AINE puede variar, dependiendo de, entre otros, el tipo de dolor (y el historial del paciente) así como de otros factores tales como el tipo (y/o la dosificación) o el antagonista del NGF y/o del AINE usado. Una cantidad eficaz, en el contexto de la presente invención, también pueden ser cantidades de un antagonista del NGF y de un antagonista de AINE tal que se consigue un efecto sinérgico. Una cantidad eficaz de un antagonista en el contexto de la presente invención generalmente 45 significa una cantidad suficiente para conseguir una mejora del efecto terapéutico de un AINE para el dolor (que puede, a su vez, significar que se reduce la dosificación y/o se observa algún otro efecto beneficioso) y/o que da como resultado un efecto beneficioso comparado con el tratamiento con AINE solo. Una “cantidad eficaz” de un antagonista del NGF también puede dar como resultado un efecto sinérgico comparado con la administración de un antagonista del NGF o un AINE solo. 50

Un “individuo” es un vertebrado, de preferencia un mamífero, de más preferencia un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a, animales de granja, animales de deporte, mascotas, primates, caballos, vacas, perros, gatos, ratones y ratas.

El término “AINE” se refiere a un compuesto antiinflamatorio no esteroide. Los AINE se clasifican en virtud de su capacidad de inhibir la ciclooxigenasa. Ciclooxigenasa 1 y ciclooxigenasa 2 son dos de las 55

principales isoformas de la ciclooxigenasa y la mayoría de los AINE convencionales son inhibidores mixtos de las dos isoformas. La mayoría de los AINE convencionales están dentro de una de las siguientes cinco categorías estructurales: (1) derivados de ácido propiónico, tales como ibuprofeno, naproxeno, naprosin, diclofenac, y ketoprofeno; (2) derivados de ácido acético, tales como tolmetin y slindac; (3) derivados de ácido fenámico, tales como ácido mefenámico y ácido meclofenámico; (4) 5 derivados de ácido bifenilcarboxílico, tales como diflunisal y flufenisal; y (5) oxicams, tales como piroxim, sudoxicam, e isoxicam.

Se ha descrito otra clase de AINE que de manera selectiva inhibe la ciclooxigenasa 2. Se han descrito inhibidores de Cox-2, por ejemplo, en las Patentes de EEUU Nº 5.616.601; 5.604.260; 5.593.994; 5.550.142; 5.536.752; 5.521.213; 5.475.995; 5.639.780; 5.604.253; 5.552.422; 5.510.368; 5.436.265; 10 5.409.944; y 5.130.311.

Ciertos inhibidores de la COX-2 de ejemplo incluyen celecoxib (SC-58635), DUP-697, flosulida (CGP-28238), meloxicam, ácido 6-metoxi-2-naftilacético (6-MNA), rofecoxib, MK-966, nabumetona (profármaco para 6-MNA), nimesulida, NS-398, SC-5766, SC-58215, T-614; o sus combinaciones.

En algunas formas de realización comparativas, se toma aspirina y/o acetominofeno en combinación con 15 el antagonista del NGF (tal como un anticuerpo anti-NGF). La aspirina es otro tipo de compuesto antiinflamatorio no esteroide.

Como se usa en el presente documento, la administración “en combinación” incluye la administración simultánea y/o la administración en momentos diferentes. La administración en combinación también abarca la administración en forma de co-formulación (es decir, el antagonista del NGF y el AINE están 20 presentes en la misma composición) o la administración en forma de composiciones separadas. Como se usa en el presente documento, se entiende que administración en combinación abarca cualquier circunstancia en la que un AINE y un antagonista del NGF se administren a un individuo, que puede tener lugar simultáneamente y/o por separado. Como se describe posteriormente en el presente documento, se entiende que el antagonista del NGF y el AINE pueden administrarse a frecuencias en intervalos de 25 dosificación diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF puede administrarse semanalmente, mientras que un AINE puede administrarse más frecuentemente. Se entiende que el antagonista del NGF y el AINE pueden administrarse usando la misma vía de administración o vías de administración diferentes.

“Dolor post-quirúrgico” (denominado indistintamente “dolor post-incisional” o “dolor postraumático”) se 30 refiere al dolor que surge o resulta de un traumatismo externo tal como un corte, punción, incisión, desgarro, o herida en el tejido de un individuo (incluyendo el que surge de todos los procedimientos quirúrgicos, sean invasivos o no invasivos). Como se usa en el presente documento, dolor post-quirúrgico no incluye el dolor que se produce (surge o se origina) sin un traumatismo físico externo. En algunas formas de realización, el dolor post-quirúrgico es dolor interno o externo (incluyendo dolor periférico), y la 35 herida, corte, traumatismo, desgarro o incisión puede producirse accidentalmente (como con una herida traumática) o deliberadamente (como con una incisión quirúrgica). Como se usa en el presente documento, “dolor” incluye nocicepción y la sensación de dolor, y el dolor puede valorarse objetiva y subjetivamente, usando puntuación del dolor y otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Dolor post-quirúrgico, como se usa en el presente documento, incluye alodinia (es decir, respuesta 40 incrementada (es decir, una percepción nociva) a un estímulo normalmente no nocivo) e hiperalgesia (es decir, respuesta incrementada a un estímulo normalmente nocivo o desagradable), que a su vez, puede ser de naturaleza térmica o mecánica (táctil). En algunas formas de realización, el dolor se caracteriza por sensibilidad térmica, sensibilidad mecánica y/o dolor en reposo. En algunas formas de realización, el dolor post-quirúrgico comprende dolor inducido mecánicamente o dolor en reposo. En otras formas de 45 realización, el dolor post-quirúrgico comprende dolor en reposo.

El tratamiento del dolor con AINE se “mejora” cuando se mejora un aspecto del tratamiento con AINE (comparado con la administración de AINE sin la administración de un antagonista del NGF). Por ejemplo, la eficacia del tratamiento del dolor con AINE puede incrementarse en presencia de un antagonista del NGF en relación a la eficacia de un AINE en ausencia de un antagonista del NGF. Como 50 un ejemplo más, el tratamiento o la prevención del dolor con un AINE se puede “mejorar” mediante el uso de un antagonista del NGF en combinación con el AINE cuando ese uso permite un mejor alivio del dolor (por ejemplo, cuando se usa una dosis de AINE que no permite el tratamiento o la prevención eficaz del dolor).

Procedimientos de la invención 55

Con respecto a todos los procedimientos descritos en el presente documento, la referencia a un antagonista del NGF y a los AINE también incluye composiciones que comprenden uno o más de estos agentes. La presente invención es útil para el tratamiento del dolor en individuos, incluyendo todos los mamíferos, tanto humanos como no humanos.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo antagonizante anti-factor de crecimiento neuronal 5 (NGF) e ibuprofeno para uso en combinación en el tratamiento del dolor postquirúrgico en un individuo. En algunas formas de realización, se administrará suficiente anticuerpo anti-NGF para así permitir la reducción de la dosis normal de ibuprofeno necesaria para lograr el mismo grado de mejora del dolor en al menos aproximadamente un 5%, al menos aproximadamente un 10%, al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, al menos aproximadamente un 50%, al menos 10 aproximadamente un 60%, al menos aproximadamente un 70%, al menos aproximadamente un 80%, o al menos aproximadamente un 90%, o superior.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo antagonizante anti-NGF e ibuprofeno para su uso en la mejora del tratamiento del dolor postquirúrgico con ibuprofeno en un individuo que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NGF en combinación con una cantidad eficaz de 15 ibuprofeno.

En algunas formas de realización, dolor comprende uno cualquiera o más de los siguientes: dolor agudo y/o crónico, cualquier dolor con un componente inflamatorio, dolor posoperatorio (incluyendo dolor dental), migraña, dolor de cabeza y neuralgia trigeminal, dolor asociado a quemaduras, heridas o cálculos renales, dolor asociado a traumatismos (incluyendo traumatismos craneoencefálicos), dolor 20 neuropático, dolor asociado a crisis de células falciformes, dolor asociado con dismenorrea o disfunción intestinal y dolor asociado a cáncer (incluyendo “dolor irruptivo” y dolor asociado a cáncer terminal). En otras formas de realización, el dolor es cualquier dolor que normalmente se trata con un AINE (tal como ibuprofeno). En otras formas de realización, el dolor es asociado a quemaduras. En otras formas de realización, el dolor es asociado a artritis reumatoide. En otras formas de realización, el dolor es asociado 25 a osteoartritis.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo antagonizante anti-factor de crecimiento neuronal (NGF) e ibuprofeno para su uso en la prevención, mejora y/o prevención del desarrollo o progresión del dolor. Por consiguiente, en algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF y/o el ibuprofeno se administran antes de un evento doloroso (tal como cirugía). Por ejemplo, el anticuerpo anti-30 NGF puede administrarse 30 minutos, una hora, 5 horas, 10 horas, 15 horas, 24 horas o aún más, tal como 1 día, varios días, o incluso una semana, 2 semanas, 3 semanas o más antes de la actividad que probablemente dé como resultado, o con riesgo de causar, dolor (tal como traumatismo externo o una operación).

El tratamiento o la prevención del dolor se valora usando procedimientos muy conocidos en la técnica. La 35 valoración puede realizarse basándose en mediciones objetivas, tales como la observación de comportamientos como la reacción a los estímulos, expresiones faciales y similares. La valoración también puede estar basada en mediciones subjetivas, tales como la caracterización del dolor por parte del paciente usando diversas escalas de dolor. Véase, por ejemplo, Katz y col., Surg Clin North Am. (1999) 79 (2):231-252; Caraceni y col. J Pain Symptom Manage (2002) 23 (3): 239-255. 40

El diagnóstico o valoración del dolor de la artritis reumatoide está bien establecido en la técnica. La valoración puede realizarse basándose en mediciones conocidas en la técnica, tales como la caracterización del dolor del paciente usando diversas escalas de dolor. Véase, por ejemplo, Katz y col, Surg Clin North Am. (1999) 79 (2):231-252; Caraceni y col. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3): 239-255. Existen también escalas comúnmente usadas para medir estados de enfermedad tales como la del 45 American College of Rheumatology (ACR por sus siglas en inglés) (Felson, y col., Arthritis and Rheumatism (1993) 36(6): 729-740), el Cuestionario de valoración de salud (HAQ por sus siglas en inglés) (Fries, y col., (1982) J. Rheumatol. 9: 789-793), la escala de Paulus (Paulus, y col., Arthritis and Rheumatism (1990) 33: 477-484), y la Escala de medición de impacto de la artritis (AIMS por sus siglas en inglés) (Meenam, y col., Arthritis and Rheumatology (1982) 25: 1048-1053). 50

El diagnóstico o valoración del dolor de la osteoartritis está bien establecido en la técnica. La valoración puede realizarse basándose en mediciones conocidas en la técnica, tales como la caracterización del dolor del paciente usando diversas escalas de dolor. Véase, por ejemplo Katz y col, Surg Clin North Am. (1999) 79 (2): 231-252; Caraceni y col. J Pain Symptom Manage (2002) 23(3): 239-255. Por ejemplo, para valorar el dolor y evaluar la respuesta al tratamiento puede usarse la escala ambulatoria de dolor 55 WOMAC (que incluye dolor, rigidez, y función física) y la Escala visual analógica de 100 mm (VAS por

sus siglas en inglés).

Se entiende que cuando un anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno se administran en combinación, ya sea como una composición única o como composiciones separadas, el anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno se presentan en una relación que es coherente con la manifestación del efecto deseado. En algunas formas de realización, la relación en peso del anticuerpo anti-NGF al ibuprofeno puede ser de 5 aproximadamente 1 a 1. En algunas formas de realización, esta relación puede estar entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 1 y aproximadamente 1000 hasta aproximadamente 1, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 1 y aproximadamente 100 hasta aproximadamente 1, o entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1 y aproximadamente 10 y aproximadamente 1. También están contempladas otras relaciones. 10

Se apreciará que la cantidad de un anticuerpo anti-NGF y del ibuprofeno necesaria para su uso en el tratamiento o la prevención del dolor variará no sólo con los compuestos o composiciones particulares seleccionados, sino también con la vía de administración, la naturaleza de la afección a tratar, y la edad y estado del paciente, y en último caso estará a discreción del médico que realiza el tratamiento.

Antagonistas del NGF 15

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-NGF como antagonistas del NGF. Se describen con fines comparativos otros antagonistas del NGF, que se refieren a cualquier molécula que bloquee, suprima o reduzca (incluyendo significativamente) la actividad biológica del NGF, incluyendo las vías aguas abajo mediadas por la señalización del NGF, tales como la unión del receptor y/o la provocación de una respuesta celular al NGF. El término “antagonista” implica un mecanismo no específico de 20 cualquier acción biológica, y se considera que incluye y abarca expresamente todas las posibles interacciones farmacológicas, fisiológicas, y bioquímicas con el NGF y sus consecuencias que pueden conseguirse con una variedad de composiciones diferentes, y químicamente divergentes. Antagonistas del NGF de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo anti-NGF, un polipéptido (incluyendo un polipéptido que comprende un dominio de unión de NGF obtenido a partir de un anticuerpo anti-NGF, por 25 ejemplo, un dominio de unión que comprende las regiones CDR suficientes para unir el NGF), una molécula antisentido dirigida a un NGF (incluyendo una molécula antisentido dirigida a un ácido nucleico que codifica el NGF), una molécula antisentido dirigida a uno o ambos receptores, TrkA o p75 (incluyendo moléculas antisentido dirigidas a una molécula de ácido nucleico que codifica TrkA o p75), un compuesto inhibidor del NGF, un análogo estructural del NGF, una mutación negativa dominante de un 30 receptor TrkA que se une a un NGF, una inmunoadhesina TrkA, un anticuerpo anti-TrkA, un anticuerpo anti-p75, y un inhibidor de cinasa. Para los propósitos de la presente invención, se entenderá explícitamente que el término “antagonista” abarca todos los términos, títulos, y estados y características funcionales identificados previamente por lo que el propio NGF, una actividad biológica del NGF (incluyendo, pero no limitado a, su capacidad para mediar en cualquier aspecto del dolor), o las 35 consecuencias de la actividad biológica, son sustancialmente anulados, reducidos, o neutralizados en cualquier grado significativo. En algunas formas de realización, un antagonista del NGF (por ejemplo, un anticuerpo) se une al (interactúa físicamente con) NGF, se une a un receptor NGF (tal como el receptor TrkA y/o el receptor p75), y/o reduce (impide y/o bloquea) la señalización del receptor NGF aguas abajo. Por consiguiente, en algunas formas de realización, un antagonista del NGF se une al (interacciona 40 físicamente con) NGF. En otra forma de realización, un antagonista del NGF se une a un receptor de NGF (tal como el receptor TrkA o p75). En otras formas de realización, un antagonista del NGF reduce (impide y/o bloquea) la señalización del receptor NGF aguas abajo (por ejemplo, señalización de los inhibidores de cinasa). En otras formas de realización, un antagonista del NGF inhibe (reduce) la síntesis y/o liberación de NGF. En otra forma de realización, el antagonista del NGF es una inmunoadhesina 45 TrkA. En otra forma de realización, el antagonista del NGF es distinto de un anticuerpo anti-NGF. En alguna forma de realización, el antagonista del NGF se une al NGF (tal como hNGF) y no se une significativamente a neurotrofinas relacionadas, tales como la NT-3, NT 4/5, y/o BDNF. En algunas formas de realización, el antagonista del NGF se une al NGF humano, y no se une significativamente a un NGF de otras especies de vertebrados (en algunas formas de realización, mamíferos). En algunas 50 formas de realización, el antagonista del NGF se une al NGF humano así como a uno o más NGF de otras especies de vertebrados (en algunas formas de realización, mamíferos). En algunas formas de realización, el antagonista del NGF se une al NGF así como al menos a otra neurotrofina. En algunas formas de realización, el antagonista del NGF se une a un NGF de una especie de mamífero, tal como caballo o perro, pero no se une significativamente al NGF de otras especies de mamíferos. 55

Anticuerpos anti-NGF

En algunas formas de realización de la invención, el antagonista del NGF comprende un anticuerpo anti-

NGF. Un anticuerpo anti-NGF debe presentar una cualquiera o más de las siguientes características: (a) unirse al NGF e inhibir la actividad biológica del NGF y/o las vías aguas abajo mediadas por la función de señalización del NGF; (b) tratar o prevenir cualquier aspecto del dolor, en particular en combinación con un AINE; (c) bloquear o reducir la activación del receptor NGF (incluyendo la dimerización y/o autofosforilación del receptor TrkA); (d) incrementar el aclaramiento del NGF; (e) mejorar el tratamiento 5 del dolor con AINE.

Los anticuerpos anti-NGF son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, los documentos Publicación PCT Nº WO 02/096458; WO 01/78698, WO 01/64247, patentes de EE.UU. Nº 5.844.092, 5.877.016 y 6.153.189; Hongo y col., Hybridoma, 19: 215-227 (2000); Cell. Molec. Biol. 13: 559-568 (1993); Nº de acceso de GenBank U39608, U39609, L17078 o L17077. 10

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF se une específicamente al NGF. En aún otras formas de realización, el anticuerpo anti-NGF está humanizado, (tal como el anticuerpo E3 descrito en el presente documento). En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF es el anticuerpo E3 (según se describe en el presente documento). En otras formas de realización, el anticuerpo anti-NGF comprende una o más CDR del anticuerpo E3 (tal como una, dos, tres, cuatro, cinco, o, en algunas 15 formas de realización, las seis CDR de E3). En otras formas de realización, el anticuerpo es humano. En otras formas de realización más, el anticuerpo anti-NGF comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en la Tabla 1 (ID. SEC. Nº 1) y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera mostrada en la Tabla 2 (ID. SEC. Nº 2). En otras formas de realización más, el anticuerpo anti-NGF comprende la secuencia de aminoácidos de la región 20 variable de la cadena pesada mostrada en la Tabla 1 (ID. SEC. Nº 1). En otras formas de realización más, el anticuerpo anti-NGF comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera mostrada en la Tabla 2 (ID. SEC. Nº 2). En otras formas de realización más, el anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inmunológicamente inerte, por ejemplo, no desencadena la lisis mediada por el complemento, o no estimula la citotoxicidad 25 mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). En otras formas de realización, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624; Solicitud PCT Nº PCT/GB99/01441; y/o solicitud de patente del RU Nº 9809951.8. En otras formas de realización, el anticuerpo anti-NGF es cualquiera de los anticuerpos descritos en el documento de EEUU Nº de serie 10/745.775. 30

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF es un anticuerpo monoclonal anti-NGF de ratón humanizado denominado anticuerpo “E3”, que comprende la región constante IgG2a de la cadena pesada humana que contiene las siguientes mutaciones: A330P331 a S330S331 (numeración de los aminoácidos con referencia a la secuencia IgG2a de tipo natural; véase Eur. J. Immunol. (1999) 29: 2613-2624); la región constante kappa de la cadena ligera humana; y las regiones variables de las 35 cadenas pesada y ligera mostradas en las Tablas 1 y 2.

Tabla 1: Región variable de la cadena pesada

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Tabla 2: Región variable de la cadena ligera

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Los siguientes polinucleótidos que codifican la región variable de la cadena pesada de E3 o la región variable de la cadena ligera de E3 se depositaron en la ATCC el 8 de enero de 2003:

Material: Nº de acceso ATCC Fecha de depósito

Vector Eb.911.3E: Región V de cadena ligera de E3 PTA-4893 8 de enero de 2003

Vector Eb.pur.911.3E: Región V de cadena ligera de E3 PTA-4894 8 de enero de 2003

Vector Db.911.3E: Región V de cadena pesada de E3 PTA-4895 8 de enero de 2003

El vector Eb.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena ligera mostrada en la Tabla 2; el vector Eb.pur.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena ligera mostrada en la Tabla 2 y el vector Db.911.3E es un polinucleótido que codifica la región variable de la cadena pesada mostrada en la Tabla 1. Estos polinucleótidos también codifican los dominios constantes. 5

Existen al menos dos técnicas para determinar las CDR: (1) un enfoque basado en la variabilidad de la secuencia de especies cruzadas (es decir, Kabat y col. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5ª ed., 1991, Nacional Institutes of Health, Bethesda MD)); y (2) un enfoque basado en estudios cristalográficos de complejos antígeno-anticuerpo (Chothia y col. (1989) Nature 342: 877; Al-Iazikani y col. (1997) J. Molec. Biol. 273: 927-948)). Como se usa en el presente documento, una CDR se refiere a 10 las CDR definidas mediante cualquier enfoque o mediante una combinación de ambos enfoques.

En otra forma de realización, el anticuerpo anti-NGF comprende una o más CDR(s) del anticuerpo E3 (tal como una, dos, tres, cuatro, cinco, o, en algunas formas de realización, las seis CDR de E3). La determinación de las regiones de CDR está también dentro del conocimiento de la técnica. La (las) CDR(s) puede(n) ser Kabat, Chothia, o una combinación de Kabat y Chothia. 15

Los anticuerpos útiles en la presente invención pueden abarcar anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc, etc.), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos heteroconjugados, de una sola cadena (ScFv), mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una parte de anticuerpo, anticuerpos humanizados, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que 20 comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida, incluyendo variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencia de aminoácidos de anticuerpos, y anticuerpos modificados de manera covalente. Los anticuerpos pueden ser de tipo murino, rata, humano, o de cualquier otro origen (incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados). Para el propósito de la presente invención, el anticuerpo reacciona con NGF de una manera que inhibe NGF y/o las rutas aguas 25 abajo mediadas por la función de señalización de NGF. En una forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano que reconoce uno o más epítopos sobre NGF humano. En otra forma de realización, el anticuerpo en un anticuerpo de ratón o rata que reconoce uno o más epítopos sobre NGF humano. En otra forma de realización, el anticuerpo reconoce uno o más epítopos sobre un NGF seleccionado entre del grupo que consiste en primate, canino, felino, equino y bovino. En otra forma de realización, el 30 anticuerpo comprende una región constante modificada, tal como una región constante que es inmunológicamente inerte (es decir, no desencadena la lisis mediada por complemento), o no estimula la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). La actividad de ADCC puede valorarse usando los procedimientos dados a conocer en la Patente de EEUU Nº 5.500.362. En otras formas de realización, la región constante se modifica como se describe en Eur. J. Immunol. (1999) 29: 35 2613-2624; Solicitud PCT Nº PCT/GB99/01441; y/o la Solicitud de Patente de Reino Unido Nº 9809951.8.

La afinidad de unión de un anticuerpo anti-NGF a NGF (tal como hNGF) puede ser desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 1 nM, desde aproximadamente 0,05 hasta aproximadamente 0,25 nM, desde aproximadamente 0,10 hasta aproximadamente 80 nM, desde aproximadamente 0,15 hasta aproximadamente 0,75 nM y desde aproximadamente 0,18 hasta 40 aproximadamente 0,72 nM. En algunas formas de realización, la afinidad de unión es de aproximadamente 1 pM, aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 40 pM o mayor que aproximadamente 40 pM. En una forma de realización, la afinidad de unión está entre aproximadamente 2 nM y 22 pM. En otras formas de realización, la afinidad de unión es inferior a aproximadamente 100 45 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 10 pM. En algunas formas de realización, la afinidad de unión es de aproximadamente 10 nM. En otras formas de realización, la afinidad de unión es inferior a aproximadamente 10 nM. En otras formas de realización, la afinidad de unión es de aproximadamente 0,1 nM o aproximadamente 0,07 nM. En otras formas de realización, la 50 afinidad de unión es inferior a aproximadamente 0,1 nM o inferior a aproximadamente 0,07 nM. En otras formas de realización, la afinidad de unión es cualquiera de aproximadamente 100 nM, aproximadamente

50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM hasta cualquiera de aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM o aproximadamente 40 pM. En algunas formas de realización, la afinidad de unión es cualquiera de aproximadamente 100 nM, aproximadamente 50 nM, aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 pM, 5 aproximadamente 100 pM o aproximadamente 50 pM o inferior a aproximadamente 50 pM. En otras formas de realización más, la afinidad de unión es de aproximadamente 2 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 15 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 40 pM o mayor que aproximadamente 40 pM.

Una forma de determinar la afinidad de unión de anticuerpos al NGF es mediante la medida de afinidad 10 de unión de fragmentos monofuncionales Fab del anticuerpo. Para obtener los fragmentos monofuncionales Fab, un anticuerpo (por ejemplo, IgG) se puede escindir con papaína o se puede expresar de manera recombinante. La afinidad de un fragmento Fab de anti-NGF de un anticuerpo puede determinarse mediante resonancia de plasmón de superficie (sistema de resonancia de plasmón de superficie (SPR)BIAcore3000TM, BIAcore, INC, Piscaway NJ). Los procesadores CM5 pueden activarse 15 con clorhidrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodiinida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El NGF humano puede diluirse en acetato de sodio 10 mM pH 4,0 e inyectarse sobre el procesador activado a una concentración de 0,005 mg/ml. Usando tiempo de flujo variable a través de los canales del procesador individuales, pueden lograrse dos intervalos de densidad de antígeno: unidades de respuesta (RU) 100-200 para los estudios cinéticos detallados y RU 20 500-600 para los ensayos de selección. El procesador puede bloquearse con etanolamina. Estudios de regeneración han mostrado que una mezcla de tampón de elución de Pierce (Producto Nº 21004, Pierce Biotechnology, Rockford IL) y NaCl 4 M (2:1) elimina de manera eficaz el Fab unido mientras se mantiene la actividad de hNGF sobre el procesador durante 200 inyecciones. El tampón HBS-EP (HEPES 0,01 M, pH 7,4, NaCl 0,15, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,005%) se usa como tampón de desarrollo para los 25 ensayos BIAcore. Se inyectan diluciones en serie (0,1-10 x KD estimada) de muestras de Fab purificadas durante 1 min a 100 μl/min y se permitieron tiempos de disociación de hasta 2 horas. Las concentraciones de las proteínas Fab se determinan mediante ELISA y/o electroforesis SDS-PAGE usando un Fab de concentración conocida (como se determina por el análisis de aminoácidos) como un patrón. Las tasas de asociación cinética (kon) y de disociación (koff) se obtienen de manera simultánea 30 mediante ajuste de los datos hasta un modelo de unión de Langmuir 1:1 (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6: 99-110) usando el programa BIAevaluation. Los valores de constante de disociación de equilibrio (KD) se calculan como koff/kon. Este protocolo es adecuado para el uso en la determinación de afinidad de unión de un anticuerpo al NGF de cualquier especie, incluyendo NGF humano, NGF de otro vertebrado (en algunas formas de realización, mamífero) 35 (tal como NGF de ratón, NGF de rata, NGF de primate), así como para el uso con otras neurotrofinas, tales como las neurotrofinas relacionadas NT3, NT4/5, y/o BDNF.

En algunas formas de realización, el anticuerpo se une a NGF humano, y no se une de manera significativa a un NGF de otras especies de vertebrados (en algunas formas de realización, mamífero). En algunas formas de realización, el anticuerpo se une a NGF humano así como a uno o más NGF de 40 otras especies de vertebrados (en algunas formas de realización, mamífero), tales como roedores. En otras formas de realización más, el anticuerpo se une a NGF y no reacciona de manera significativa de manera cruzada con otras neurotrofinas (tales como las neurotrofinas relacionadas, NT3, NT4/5, y/o BDNF). En algunas formas de realización, el anticuerpo se une a NGF así como al menos a otra neurotrofina. En algunas formas de realización, el anticuerpo se une a un NGF de una especie de 45 mamífero, tal como caballo o perro, pero no se une de manera significativa a NGF de otra especie de mamífero.

El (los) epítopo(s) puede(n) ser continuo(s) o discontinuo(s). En una forma de realización, el anticuerpo se une esencialmente a los mismos epítopos de hNGF como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en MAb 911, MAb 912 y MAb 938 como se describe en Hongo y col., Hybridoma, 19: 215-227 50 (2000). En otra forma de realización, el anticuerpo se une esencialmente al mismo epítopo de hNGF que MAb 911. En todavía otra forma de realización, el anticuerpo se une esencialmente al mismo epítopo que MAb 909. Hongo y col., supra. Por ejemplo, el epítopo puede comprender uno o más de: restos K32, K34 y E35 dentro de la región variable 1 (aminoácidos 23-35) de hNGF; restos F79 y T81 dentro de la región variable 4 (aminoácidos 81-88) de hNGF; restos H84 y K88 dentro de la región variable 4; resto R103 55 entre la región variable 5 (aminoácidos 94-98) de hNGF y el extremo C terminal (aminoácidos 111-118) de hNGF; resto E11 dentro de la pre-región variable 1 (aminoácidos 10-23) de hNGF; Y52 entre la región variable 2 (aminoácidos 40-49) de hNGF y la región variable 3 (aminoácidos 59-66) de hNGF; restos L112 y S113 dentro del extremo C terminal de hNGF; restos R59 y R69 dentro de la región variable 3 de

hNGF; o restos V18, V20 y G23 dentro de la pre-región variable 1 de hNGF. Además, un epítopo puede comprender una o más de la región variable 1, región variable 3, región variable 4, región variable 5, la región del extremo N terminal, y/o el extremo C terminal de hNGF. En todavía otra forma de realización, el anticuerpo reduce de manera significativa la accesibilidad del disolvente del resto R103 de hNGF. Se entiende que aunque los epítopos descritos anteriormente están relacionados con el NGF humano, los 5 expertos en la técnica pueden alinear las estructuras de NGF humano con el NGF de otra especie e identificar las parejas similares a estos epítopos.

En un aspecto, los anticuerpos (por ejemplo, humano, humanizado, de ratón, quimérico) que pueden inhibir NGF pueden prepararse mediante el uso de inmunógenos que expresan la secuencia de longitud completa o parcial de NGF. En otro aspecto, puede usarse un inmunógeno que comprende una célula 10 que sobreexpresa NGF. Otro ejemplo de un inmunógeno que puede usarse es la proteína NGF que contiene NGF de longitud completa o una parte de la proteína NGF.

Los anticuerpos anti-NGF pueden prepararse mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica. La vía y programa de inmunización del animal huésped están en general en custodia con técnicas establecidas y convencionales para la estimulación y producción del anticuerpo, como se describe 15 adicionalmente en el presente documento. Las técnicas generales para la producción de anticuerpos humanos y de ratón se conocen en la técnica y están descritos en el presente documento.

Se contempla que cualquier sujeto mamífero incluyendo seres humanos o células productoras de anticuerpos de los mismos pueden manipularse para que sirvan como la base de producción de líneas celulares de mamífero, incluyendo ser humano, líneas celulares de hibridoma. Típicamente, el animal 20 huésped se inocula por vía intraperitoneal, intramuscular, oral, subcutánea, intraplantar y/o intradérmica con una cantidad de inmunógeno, incluyendo como se describe en el presente documento.

Los hibridomas pueden prepararse a partir de linfocitos y células inmortalizadas de mieloma usando la técnica de hibridación de células somáticas general de Kohler, B. y Milstein, C. (1975) Nature 256: 495-497 o como se ha modificado por Buck, D. W., y col., In Vitro, 18: 377-381 (1982). Líneas celulares de 25 mieloma disponibles, que incluyen pero no se limitan a X63-Ag8.653 y las de Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., Estados Unidos, pueden usarse en la hibridación. En general, la técnica implica la fusión de células de mieloma y células linfoides que usan un fusógeno tal como polietilenglicol, o mediante medios eléctricos bien conocidos por los expertos en la técnica. Después de la fusión, las células se separan del medio de fusión y se desarrollan en un medio de crecimiento selectivo, 30 tal como medio de hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT), para eliminar las células precursoras no hibridizadas. Cualquiera de los medios descritos en el presente documento, suplementados con o sin suero, pueden usarse para cultivar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales. Como otra alternativa de la técnica de fusión de células, pueden usarse células B inmortalizadas por EBV para producir los anticuerpos monoclonales anti-NGF de la presente invención. Los hibridomas se expanden y 35 se subclonan, si se desea, y los sobrenadantes se ensayan para actividad anti-inmunógeno mediante procedimientos de inmunoensayos convencionales (por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo enzimático, o inmunoensayo de fluorescencia).

Los hibridomas que pueden usarse como fuente de anticuerpos abarcan todos los derivados, células de progenie de los hibridomas precursores que producen anticuerpos monoclonales específicos para NGF, o 40 una porción de los mismos.

Los hibridomas que producen tales anticuerpos pueden cultivarse in vitro o in vivo usando procedimientos conocidos. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse del medio de cultivo o de fluidos corporales, mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como precipitación por sulfato de amonio, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía y ultrafiltración, si se desea. La actividad 45 no deseada si está presente, puede eliminarse, por ejemplo, desarrollando la preparación sobre adsorbentes hechas de inmunógeno unidas a una fase sólida y eluyendo o liberando los anticuerpos deseados del inmunógeno. La inmunización de un animal huésped con un NGF humano, o un fragmento que contiene la secuencia de aminoácidos diana conjugada a una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina sérica, tiroglobulina 50 bovina, o inhibidor de la tripsina de soja usando un agente bifuncional o de derivatización, por ejemplo éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de restos de cisteína), N-hidroxisuccinimida (a través de restos de lisina), glutaradehído, anhídrido succínico, SOCl2, o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes, pueden producir una población de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales). 55

Si se desea, el anticuerpo anti-NGF (monoclonal o policlonal) de interés puede secuenciarse y la

secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido del anticuerpo anti-NGF puede a continuación clonarse en un vector para expresión o propagación. La secuencia que codifica el anticuerpo de interés puede mantenerse en vector en una célula huésped y la célula huésped puede a continuación expandirse y congelarse para el uso futuro. En una alternativa, la secuencia de polinucleótidos puede usarse para la manipulación genética para “humanizar” el anticuerpo o para mejorar la afinidad, u otras características 5 del anticuerpo. Por ejemplo, la región constante puede modificarse por ingeniería genética para que se parezca a más regiones constantes humanas para evitar la respuesta inmune si el anticuerpo se usa en ensayos clínicos y tratamientos en seres humanos. Puede ser deseable manipular genéticamente la secuencia de anticuerpos para obtener mayor afinidad a NGF y mayor eficacia en la inhibición de NGF. Será evidente para los expertos en la técnica que pueden realizarse uno o más cambios de 10 polinucleótidos al anticuerpo anti-NGF y todavía mantener su capacidad de unión a NGF.

Existen cuatro etapas para humanizar un anticuerpo monoclonal. Éstas son: (1) determinar la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos predicha de los dominios variables ligeros y pesados del anticuerpo de partida, (2) diseñar el anticuerpo humanizado, es decir, decidir qué región marco conservada de anticuerpo usar durante el procedimiento de humanización, (3) las metodologías/técnicas de 15 humanización reales y (4) la transfección y expresión del anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 4.816.567; 5.807.715; 5.866.692; 6.331.415; 5.530.101; 5.693.761; 5.693.762; 5.585.089 y 6.180.370.

Se han descrito un número de moléculas de anticuerpo “humanizado” que comprende un sitio de unión al antígeno de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V 20 de roedor o de roedor modificadas y sus regiones determinantes de complementariedad asociadas (CDR) fusionadas a dominios constantes humanos. Véase, por ejemplo, Winter y col. Nature 349: 293-299 (1991), Lobuglio y col. Proc. Nat. Acad. Sci USA 86: 4220-4224 (1989), Shaw y col. J Immunol. 138: 4534-4538 (1987), y Brown y col. Cancer Res. 47: 3577-3583 (1987). Otras referencias describen CDR de roedores injertadas en una región marco conservada (FR) que soporta un ser humano antes de la 25 fusión con un dominio constante de anticuerpo apropiado humano. Véase, por ejemplo, Riechmann y col. Nature 332: 323-327 (1988), Verhoeyen y col. Science 239: 1534-1536 (1988), y Jones y col. Nature 321: 522-525 (1986). Otra referencia describe las CDR de roedor soportadas por regiones marco conservadas de roedor de manera recombinante chapada. Véase, por ejemplo, Publicación de Patente Europea Nº 519596. Estas moléculas “humanizadas” se diseñan para minimizar la respuesta inmunológica no 30 deseada hacia moléculas de anticuerpo antihumano de roedor que limita la duración y eficacia de aplicaciones terapéuticas de esos restos en receptores humanos. Por ejemplo, la región constante de anticuerpo se puede modificar por ingeniería genética de manera que sea inmunológicamente inerte (por ejemplo, no desencadena lisis por complemento). Véase, por ejemplo, Solicitud PCT Nº PCT/GB99/01441; Solicitud de patente de Reino Unido Nº 9809951.8. Otros procedimientos de 35 humanización de anticuerpos que también pueden utilizarse se dan a conocer por Daugherty y col., Nucl. Acids Res. 19: 2471-2476 (1991) y en las Patentes de EEUU Nº 6.180.377; 6.054.297; 5.997.867; 5.866.692; 6.210.671; 6.350.861; y en la Publicación PCT Nº WO 01/27160. Otros procedimientos están descritos en el documento U.S. Nº de serie 10/745.775.

En todavía otra alternativa, pueden obtenerse anticuerpos completamente humanos mediante el uso de 40 ratones comercialmente disponibles que se han modificado por ingeniería genética para expresar proteínas de inmunoglobulina humana específicas. También pueden usar animales transgénicos que se diseñan para producir una respuesta inmune más deseable (por ejemplo, anticuerpos totalmente humanos) o más robusta para la generación de anticuerpos humanizados o humanos. Los ejemplos de tal tecnología son XenomouseTM de Abgenix, Inc. (Fremont, CA) y HuMAb-Mouse® y TC MouseTM de 45 Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

Es evidente que aunque la descripción anterior pertenece a anticuerpos humanizados, los principios generales descritos son aplicables a la personalización de anticuerpos para uso, por ejemplo, en perros, gatos, primates, equinos y bovinos. Además es evidente que uno o más aspectos de humanización de un anticuerpo descritos en el presente documento pueden combinarse, por ejemplo, injerto de CDR, 50 mutación de marco conservado y mutación de CDR.

En una alternativa, los anticuerpos pueden prepararse de manera recombinante y expresarse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica. En otra alternativa, los anticuerpos pueden prepararse de manera recombinante mediante tecnología de presentación en fago. Véase, por ejemplo, Patentes de EEUU Nº 5.565.332; 5.580.717; 5.733.743; 6.265.150; y Wintery col., Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 55 (1994). Como alternativa, puede usarse la tecnología de presentación en fago (McCafferty y col., Nature 348: 552-553 (1990)) para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpo humanos in vitro, de repertorios génicos de dominio variable de inmunoglobulina (V) de donantes no inmunizados. De acuerdo

con esta técnica, los genes del dominio de anticuerpo V se clonan en fase en o bien una proteína principal o secundaria de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presenta como fragmentos de anticuerpo funcional sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de una sola cadena del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el 5 anticuerpo que muestra estas propiedades. De este modo, el fago imita a alguna de las propiedades de la célula B. La presentación en fago puede llevarse a cabo en una diversidad de formatos; para revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Varias fuentes de los segmentos del gen V pueden usarse para presentación en fago. Clackson y col., Nature 352: 624-628 (1991) aislaron una disposición diversa de anticuerpos anti-10 oxazolona a partir de una pequeña biblioteca de genes de combinación al azar de genes V derivada de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse anticuerpos para una disposición diversa de antígenos (incluyendo auto-antígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Mark y col., J Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), o Griffith y col., EMBO J. 12: 725-734 (1993). En una respuesta inmune natural, los genes de 15 anticuerpo acumulan mutaciones a una alta velocidad (hipermutación somática). Alguno de los cambios introducidos conferirán una alta afinidad, y las células B que presentan inmunoglobulina de superficie de alta afinidad se replican de manera preferente y se diferencian durante la exposición al antígeno posterior. Este procedimiento natural se puede imitar mediante la técnica conocida por “recomposición de cadena” (Marks, y col., BiolTechnol. 10: 779-783 (1992)). En este procedimiento, la afinidad de 20 anticuerpos humanos “primarios” obtenidos mediante presentación en fago puede mejorarse mediante reemplazo de manera secuencial de los genes de la región V de cadena pesada y ligera con repertorios de variantes de origen natural (repertorios) de los genes del dominio V obtenidos a partir de donantes no inmunizados. Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos con afinidades en el intervalo pM-nM. Una estrategia para preparar repertorios de anticuerpo de fago muy 25 grandes (también conocidos como “la madre de todas las bibliotecas”) ha descrita por Waterhouse y col., Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993). La recomposición de genes también puede usarse para obtener anticuerpos humanos de anticuerpos de roedor, donde el anticuerpo humano tiene afinidades y especificidades similares al anticuerpo de roedor de partida. De acuerdo con este procedimiento, que también se llama “marca de epítopo”; el gen del dominio V de cadena pesada o ligera V de anticuerpos 30 de roedor obtenido mediante la técnica de presentación de fago se reemplaza con un repertorio de genes del dominio V humanos, creando quimeras de roedor-humano. La selección sobre el antígeno da como resultado el aislamiento de regiones variables humanas capaces de reestablecer un sitio de unión al antígeno funcional, es decir, el epítopo gobierna (marca) la elección del participante. Cuando el proceso se repite con el fin de reemplazar el dominio V del roedor remanente, se obtiene un anticuerpo humano 35 (véase la solicitud de patente PCT WO 93/06213, publicada el 1 de abril de 1993). A diferencia de la humanización tradicional de anticuerpos de roedor mediante injerto de CDR, esta técnica proporciona anticuerpos completamente humanos, que no tienen restos de marco conservado o de CDR de origen de roedor. Es evidente que aunque la descripción anterior pertenece a anticuerpos humanizados, los principios generales descritos son aplicables a la personalización de anticuerpos para uso, por ejemplo, 40 en perros, gatos, primates, equinos y bovinos.

Los anticuerpos pueden prepararse de manera recombinante primero mediante aislamiento de los anticuerpos y células que producen anticuerpo de animales huésped, que se obtienen de la secuencia de genes, y usando la secuencia de genes para expresar el anticuerpo de manera recombinante en células huésped (por ejemplo, células CHO). Otro procedimiento que puede utilizarse es expresar la secuencia 45 de anticuerpo en plantas (por ejemplo, tabaco) o leche transgénica. Se han descrito los procedimientos para expresar anticuerpos de manera recombinante en plantas o leche. Véanse, por ejemplo, Peeters, y col. Vaccine 19: 2756 (2001); Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13: 65 (1995); y Pollock, y col., J Inmunol Methods 231: 147 (1999). Los procedimientos para preparar derivados de anticuerpos, por ejemplo, humanizados, de una sola cadena, etc. se conocen en la técnica. 50

También pueden utilizarse inmunoensayos y técnicas de clasificación de citometría de flujo tal como clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar los anticuerpos que son específicos para NGF.

Los anticuerpos pueden unirse a muchos vehículos diferentes. Los vehículos pueden ser activos y/o inertes. Los ejemplos de los vehículos bien conocidos incluyen polipropileno, poliestireno, polietileno, 55 dextrano, nylon, amilasas, vidrio, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble o insoluble para los propósitos de la invención. Los expertos en la técnica conocerán otros vehículos adecuados para unir anticuerpos, o serán capaces de determinarlos usando experimentación de rutina.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aísla fácilmente y se secuencia usando procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que sean capaces de unirse de manera específica a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales). Las células de hibridoma sirven como una fuente de preferencia de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión que después se transfectan en 5 células huésped tales como células de E. coli, células COS de simio, células de ovario de hámster Chino (CHO), o células de mieloma que de otra manera no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, mediante la sustitución de la secuencia codificadora para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias homólogas de tipo murino, 10 Morrison y col., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851 (1984), o mediante la unión de manera covalente a toda o parte de la secuencia codificadora de la inmunoglobulina de la secuencia codificadora para un polipéptido de inmunoglobulina. De esa manera, los anticuerpos “quiméricos” o “híbridos” se preparan para que tengan la especificidad de unión de un anticuerpo monoclonal anti-NGF en el presente documento. El ADN que codifica un anticuerpo antagonista anti-NGF (tal como un anticuerpo antagonista humanizado 15 anti-NGF humano) puede usarse para administrar y expresar el anticuerpo antagonista anti-NGF por medio de una célula deseada, como se describe en el presente documento. Las técnicas de administración de ADN se describen además en el presente documento.

Los anticuerpos Anti-NGF pueden caracterizarse usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un procedimiento es identificar el epítopo al que se une, o “mapeo de epítopo”. Existen 20 muchos procedimientos conocidos en la técnica para el mapeo y caracterización de la localización de epítopos sobre las proteínas, incluyendo la resolución de la estructura cristalina de un complejo anticuerpo-antígeno, ensayos de competición, ensayos de expresión de fragmentos de gen, y ensayos basados en péptidos sintéticos, como se describe, por ejemplo, en el capítulo 11 de Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva 25 York, 1999. En un ejemplo adicional, puede usarse el mapeo de epítopo para determinar la secuencia a la que se une un anticuerpo anti-NGF. El mapeo de epítopo está comercialmente disponible a partir de diversas fuentes, por ejemplo, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, Holanda). El epítopo puede ser un epítopo lineal, es decir, contenido en un tramo individual de aminoácidos, o un epítopo conformacional formado por una interacción de tres dimensiones de aminoácidos que no 30 necesariamente pueden estar contenidos en un solo tramo. Péptidos de longitudes variables (por ejemplo, al menos de 4-6 aminoácidos de longitud) pueden aislarse o sintetizarse (por ejemplo, de manera recombinante) y usarse para ensayos de unión con un anticuerpo anti-NGF. En otro ejemplo, el epítopo al que se une el anticuerpo anti-NGF puede determinarse en una selección sistemática mediante el uso de péptidos de superposición derivados de la secuencia de NGF y determinar la unión por el 35 anticuerpo anti-NGF. De acuerdo con los ensayos de expresión de fragmentos de genes, el marco de lectura abierto que codifica NGF se fragmenta al azar o mediante construcciones genéticas específicas y se determina la reactividad de los fragmentos expresados de NGF con el anticuerpo a ensayar. Los fragmentos de genes pueden, por ejemplo, producirse mediante PCR y a continuación transcribirse y traducirse en proteína in vitro, en la presencia de aminoácidos radiactivos. La unión del anticuerpo a los 40 fragmentos de NGF marcados radiactivamente se determina a continuación mediante inmunoprecipitación y electroforesis en gel. También pueden identificarse ciertos epítopos mediante el uso de grandes bibliotecas de secuencias de péptidos al azar presentadas sobre la superficie de la superficie de las partículas de fago (bibliotecas de fago). Como alternativa, una biblioteca definida de superposición de fragmentos de péptido puede probarse para la unión al anticuerpo de ensayo en 45 ensayos de unión simples. En un ejemplo adicional, pueden realizarse la mutagénesis de un dominio de unión a antígeno, experimentos de intercambio de dominios y mutagénesis de exploración de alanina para identificar los restos requeridos, suficientes y/o necesarios para la unión a epítopo. Por ejemplo, los experimentos de intercambio de dominios pueden realizarse usando un NGF mutante en el que diversos fragmentos del polipéptido de NGF han sido reemplazados (intercambio) con secuencias de una proteína 50 distinta estrechamente relacionada pero antigénicamente distinta (tal como otro miembro de la familia de proteínas de neurotrofina). Mediante la valoración de la unión del anticuerpo al NGF mutante, puede determinarse la importancia del fragmento de NGF particular a la unión al anticuerpo.

Todavía otro procedimiento que puede usarse para caracterizar un anticuerpo anti-NGF es usar ensayos de competición con otros anticuerpos que se sabe que se unen al mismo antígeno, es decir, diversos 55 fragmentos sobre NGF, para determinar si el anticuerpo anti-NGF se une al mismo epítopo que otros anticuerpos. Los ensayos de competición son bien conocidos por los expertos en la técnica. Ejemplos de anticuerpos que se pueden usar en los ensayos de competición para la presente invención incluyen MAb 911, 912, 938, como se describe en Hongo, y col, Hibridoma 19: 215-227 (2000).

Otros Antagonistas del NGF

Antagonistas del NGF distintos de los anticuerpos anti-NGF están descritos en el presente documento para propósitos comparativos. En algunas formas de realización, el antagonista del NGF comprende al menos una molécula antisentido capaz de bloquear o disminuir la expresión de un NGF funcional, o de un receptor TrkA y/o p75 funcional. Las secuencias de nucleótidos del NGF, TrkA y p75 funcional se 5 conocen y están fácilmente disponibles de las bases de datos disponibles públicamente. Véase, por ejemplo, Borsani y col., Nuc. Acids Res. 1990, 18, 4020; Número de Acceso NM 002506; Ullrich y col., Nature 303: 821-825 (1983). Es una tarea de rutina preparar moléculas de oligonucleótidos antisentido que se unirán de manera específica al ARNm de NGF, TrkA o p75 funcional sin reacción cruzada con otros polinucleótidos. Los sitios de ejemplo de dirección incluyen, pero no se limitan a, el codón de inicio, 10 las regiones reguladoras en 5’, la secuencia codificadora y la región sin traducir en 3’. En algunas formas de realización, los oligonucleótidos tienen aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de longitud, aproximadamente 15 a 50 nucleótidos de longitud, aproximadamente 18 a 25 nucleótidos de longitud, o más. Los oligonucleótidos pueden comprender modificaciones de la estructura central tales como, por ejemplo, enlaces fosforotioato, y modificaciones de azúcar 2’-O bien conocidas en la técnica. Véase por 15 ejemplo, Agrawal and Zhao (1998), Antisense & Nucleic Acid Drug Development 8, 135-139. Las moléculas antisentido de ejemplo incluyen las moléculas antisentido de NGF descritas en la Publicación de US Nº 20010046959; véase también
http://www.ma-tec.com/repair.htm .

Como alternativa, la expresión y/o liberación de NGF puede disminuirse usando la eliminación del gen, oligonucleótidos de morfolino, RNAi, o ribozimas, procedimientos que son bien conocidos en la técnica. 20 Véase, por ejemplo Rossi, J.J. y col., eds., "Intracellular Ribozyme Applications: Principles and Protocols," Horizon Scientific Press (Duarte, CA, 1999); Documento US 6.506.559; WO 02/244321; Documentos WO 01/192513; WO 01/29058.

En otras formas de realización, un antagonista del NGF comprende al menos un compuesto inhibidor de NGF. Como se usa en el presente documento, “compuesto inhibidor de NGF” se refiere a un compuesto 25 distinto de un anticuerpo anti-NGF que directa o indirectamente reduce, inhibe, neutraliza, o anula la actividad biológica de NGF. Un compuesto inhibidor de NGF mostrará una cualquiera o más de las siguientes características: (a) unión a NGF e inhibición de la actividad biológica de NGF y/o las rutas aguas abajo mediadas por la función de señalización de NGF; (b) tratamiento o prevención de cualquier aspecto de dolor, en particular en combinación con un AINE; (c) bloqueo o disminución de la activación 30 del receptor de NGF (incluyendo dimerización y/o autofosforilación del receptor TrkA); (d) incremento del aclaramiento de NGF; (e) inhibición (reducción) de la síntesis, producción o liberación de NGF; (f) potenciación del tratamiento del dolor con AINE. Los compuestos inhibidores de NGF de ejemplo incluyen los inhibidores de NGF de pequeña molécula descritos en la Publicación US Nº 20010046959; los compuestos que inhiben la unión de NGF a p75, como se describe en la Publicación PCT Nº WO 35 00/69829; los compuestos que inhiben la unión de NGF a TrkA/p75, como se describe en la Publicación PCT Nº WO 98/17278. Otros ejemplos de compuestos inhibidores de NGF incluyen los compuestos descritos en las Publicaciones PCT Números WO 02/17914 y WO 02/20479, y en las Patentes de EEUU Números 5.342.942; 6.127.401 y 6.359.130. Otros compuestos inhibidores de NGF de ejemplo son compuestos que son inhibidores competitivos de NGF. Véase la Patente de EEUU Nº 6.291.247. 40 Además, los expertos en la técnica pueden preparar otros compuestos inhibidores de NGF de molécula pequeña.

En algunas formas de realización, un compuesto inhibidor de NGF se une a NGF. Los sitios de dirección (unión) de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, la parte de NGF que se une al receptor TrkA y/o receptor p75, y las partes de NGF que son adyacentes a la región de unión del receptor y que son 45 responsables, en parte, de la forma correcta de tres dimensiones de la parte de unión al receptor. En otra forma de realización, un compuesto inhibidor de NGF se une a un receptor de NGF (tal como TrkA y/o p75) e inhibe una actividad biológica de NGF. Los sitios de dirección de ejemplo incluyen las partes de TrkA y/o p75 que se unen a NGF.

En una forma de realización que comprende molécula pequeña, una molécula pequeña puede tener un 50 peso molecular de aproximadamente cualquiera de 100 a 20.000 daltons, 500 a 15.000 daltons, o 1.000 a 10.000 daltons. Las bibliotecas de moléculas pequeñas están comercialmente disponibles. Las moléculas pequeñas pueden administrarse usando cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo inhalación, vía intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intraventricular, oral, entérica, parenteral, intranasal, o dérmica. En algunas formas de realización, cuando el antagonista del 55 NGF es una molécula pequeña, se administrará en una proporción de 0,1 a 300 mg/kg de peso del paciente dividido en una a tres o más dosis. Para un paciente adulto de peso normal, pueden administrarse dosis que varían desde 1 mg hasta 5 g por dosis.

En otras formas de realización, el antagonista del NGF comprende al menos un análogo estructural de NGF. “Análogos estructurales de NGF” se refiere en la presente invención a compuestos que tienen una estructura de tres dimensiones similar como parte de la de NGF y que se une a un receptor de NGF en condiciones fisiológicas in vitro o in vivo. En una forma de realización, el análogo estructural de NGF se une a un receptor TrkA y/o a un receptor p75. Los análogos estructurales de NGF de ejemplo incluyen, 5 pero no se limitan a, los péptidos bicíclicos descritos en la Publicación PCT Nº WO 97/15593; los péptidos bicíclicos descritos en la Patente de EEUU Nº 6.291.247; los compuestos cíclicos descritos en la Patente de EEUU Nº 6.017.878; y los péptidos derivados de NGF descritos en la Publicación PCT Nº WO 89/09225. Los análogos estructurales de NGF adecuados también pueden diseñarse y sintetizarse mediante la modelación molecular de la unión de receptor de NGF, por ejemplo mediante el 10 procedimiento descrito en la Publicación PCT Nº WO 98/06048. Los análogos estructurales de NGF pueden ser monómeros o dímeros/oligómeros en cualquier combinación deseada de estructuras iguales o diferentes para obtener afinidades y efectos biológicos mejorados.

En otras formas de realización, la invención proporciona un antagonista del NGF que comprende al menos un mutante dominante-negativo del receptor TrkA y/o receptor p75. Los expertos en la técnica 15 pueden preparar mutantes dominantes-negativos de, por ejemplo, el receptor TrkA de manera que el receptor se una al NGF y, de este modo, actúe como un “captador” para capturar los NGF. Los mutantes dominantes-negativos, sin embargo, no tendrán la bioactividad normal del receptor (tal como el receptor TrkA) tras la unión a NGF. Los mutantes dominantes-negativos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, los mutantes descritos en las siguientes referencias: Li y col., Proc. Natl. Acad Sct. Estados Unidos 1998, 20 95, 10884; Eide y col., J. Neurosci. 1996, 16, 3123; Liu y col., J. Neurosci 1997, 17, 8749; Klein y col., Cell 1990, 61, 647; Valenzuela y col., Neuron 1993, 10, 963; Tsoulfas y col., Neuron 1993, 10, 975; y Lamballe y col., EMBO J. 1993, 12, 3083. Los mutantes dominantes-negativos pueden administrarse en forma de proteína o en la forma de un vector de expresión de manera que el mutante dominante-negativo (por ejemplo, un receptor Trka mutante) se exprese in vivo. La proteína o vector de expresión puede 25 administrarse usando cualquier medio conocido en la técnica, tales como por vía intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intraventricular, oral, entérica, parenteral, intranasal, dérmica, o mediante inhalación. Por ejemplo, la administración, de los vectores de expresión incluye administración local o sistémica, incluyendo inyección, administración oral, pistola de partículas, administración por catéter y administración tópica. En otras formas de realización, la proteína o el vector 30 de expresión se administran directamente al tronco sensorial o simpático o al ganglio. Los expertos en la técnica están familiarizados con la administración de los vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 6.436.908; 6.413.942; 6.376.471.

También se puede usarse la distribución dirigida de las composiciones terapéuticas que contienen un 35 polinucleótido anti-sentido, vector de expresión, o polinucleótidos subgenómicos. Las técnicas de administración de ADN mediada por receptor se describen en, por ejemplo, Findeis y col., Trends Biotechnol. (1993) 11: 202; Chiou y col., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994); Wu y col., J. Biol. Chem. (1988) 263: 621; Wu y col., J. Biol. Chem. (1994) 269: 542; Zenke y col., Proc. Natl. Acad Sci. (USA) (1990) 87: 3655; Wu y col., J. Biol. Chem. 40 (1991) 266: 338. Las composiciones terapéuticas que contienen un polinucleótido se administran en un intervalo de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 200 mg (o más) de ADN para la administración local en un protocolo de terapia génica. En algunas formas de realización, los intervalos de concentración inferiores a aproximadamente 500 ng, aproximadamente 500 ng hasta aproximadamente 50 mg, aproximadamente 1 μg hasta aproximadamente 2 mg, aproximadamente 5 μg 45 hasta aproximadamente 500 μg, y aproximadamente 20 μg hasta aproximadamente 100 μg o más de ADN también pueden usarse durante un protocolo de terapia génica. Los polinucleótidos y polipéptidos terapéuticos de la presente invención pueden administrarse usando vehículos de administración génica. El vehículo de administración génica puede ser de origen viral o no viral (véase en general, Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1: 51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5: 845; Connelly, Human Gene 50 Therapy (1995) 1: 185; y Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6: 148). La expresión de tales secuencias codificadoras pueden inducirse usando mamíferos endógenos o promotores y/o potenciadores heterólogos. La expresión de la secuencia codificadora puede ser constitutiva o estar regulada.

Los vectores de base viral para la administración de un polinucleótido deseado y la expresión en una célula deseada se conocen bien en la técnica. Los vehículos de base viral de ejemplo incluyen, pero no 55 se limitan a, retrovirus recombinantes (véase, por ejemplo, Publicaciones PCT Números WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; las Patentes de EEUU Nº 5.219.740; 4.777.127; la Patente de Gran Bretaña Nº 2.200.651; y Patente EP Nº 0345242), vectores basados en alfavirus (por ejemplo, vectores de virus Sindbis, virus del bosque Semliki (ATCC

VR-67; ATCC VR-1247), Virus Ross River (ATCC VR373; ATCC VR-1246) y virus de encefalitis equino de Venezuela (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), y vectores de virus adeno asociados (AAV) (véase, por ejemplo, Publicaciones PCT Nº WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 y WO 95/00655). También puede utilizarse la administración de ADN ligado a adenovirus inactivado como se describe en Curiel, Hum. Gene Ther (1992) 3: 147. 5

También pueden utilizarse vehículos y procedimientos de administración no viral, incluidos, pero no limitados a, ADN policatiónico condensado ligado o no ligado a adenovirus inactivado solo (véase, por ejemplo, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3: 147); ADN ligado a ligando (véase, por ejemplo, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985); células vehículo de administración de células eucariotas (véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 5.814.482; Publicaciones PCT Nº WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; y 10 WO 97/42338) y neutralización o fusión de carga nucleica con membranas celulares. También puede utilizarse ADN desnudo. Los procedimientos de introducción de ADN desnudo de ejemplo se describen en la Publicación PCT Nº WO 90/11092 y la Patente de EEUU Nº 5.580.859. Los liposomas que pueden actuar como vehículos de administración génica se describen en la Patente de EEUU Nº 5.422.120; Publicaciones PCT Números WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; y la Patente EP Nº 0524968. 15 Otros enfoques están descritos en Philip, Mol. Cell Biol. (1994) 14: 2411, y en Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 1581.

Resulta también evidente que puede utilizarse un vector de expresión para dirigir la expresión de cualquiera de los antagonistas del NGF basados en proteína descritos en el presente documento (por ejemplo, anticuerpo anti-NGF, inmunoadhesina de TrkA, etc.). Por ejemplo, también puede utilizarse un 20 polinucleótido que codifica un anticuerpo antagonista anti-NGF para administrar y expresar el anticuerpo antagonista anti-NGF en una célula deseada. Resulta evidente que puede usarse un vector de expresión para dirigir la expresión de un anticuerpo antagonista anti-NGF. El vector de expresión puede administrarse usando por vía intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratecal, intraventricular, oral, entérica, parenteral, intranasal, dérmica, o mediante inhalación. Por ejemplo, la 25 administración, de los vectores de expresión incluye administración local o sistémica, incluyendo inyección, administración oral, pistola de partículas, administración por catéter y administración tópica. Como se analiza a continuación en el presente documento los expertos en la técnica están familiarizados con la administración de los vectores de expresión para obtener la expresión de una proteína exógena in vivo. Véase, por ejemplo, las Patentes de EEUU Nº 6.436.908; 6.413.942; 6.376.471. También son 30 conocidos en la técnica otros fragmentos del receptor TrkA que son capaces de bloquear (bloqueo parcial a completo) NGF y/o una actividad biológica de NGF.

En otra forma de realización el antagonista del NGF comprende al menos una inmunoadhesina de TrkA. Las inmunoadhesinas de TrkA como se usan en el presente documento se refieren a moléculas quiméricas solubles que comprenden el dominio extracelular de un receptor TrkA (o una parte del mismo) 35 y una secuencia de inmunoglobulina, que retiene la especificidad de unión (en algunas formas de realización, retiene sustancialmente la especificidad de unión) del receptor TrkA y es capaz de unirse a NGF. Una inmunoadhesinas de TrkA es capaz de bloquear (reducir y/o suprimir) una actividad biológica de NGF, como se describe en el presente documento.

Las inmunoadhesinas de TrkA se conocen en la técnica, y se ha encontrado que bloquean (reducen o 40 suprimen) la unión de NGF al receptor TrkA. Véase, por ejemplo, la Patente de EEUU Nº 6.153.189. En una forma de realización la inmunoadhesina de TrkA comprende una fusión de una secuencia de aminoácidos del receptor TrkA capaz de unirse a NGF (o una secuencia de aminoácidos que retiene sustancialmente la especificidad de unión del receptor TrkA) y una secuencia de inmunoglobulina (o una secuencia de aminoácidos que retiene sustancialmente la especificidad de unión del receptor TrkA). En 45 algunas formas de realización, el receptor TrkA es una secuencia del receptor TrkA humano, y la fusión es con una secuencia del dominio constante de inmunoglobulina. En otras formas de realización, la secuencia del dominio constante de inmunoglobulina es una secuencia del dominio constante de la cadena pesada de inmunoglobulina. En otras formas de realización, la asociación de dos fusiones de cadena pesada de receptor TrkA-inmunoglobulina (por ejemplo, mediante enlace covalente por enlace(s) 50 disulfuro da como resultado una estructura de tipo inmunoglobulina homodimérica. Una cadena ligera de inmunoglobulina puede además estar asociada con una o ambas de las quimeras del receptor TrkA-inmunoglobulina en el dímero unido por disulfuro para producir una estructura homotrimérica u homotetramérica. Los ejemplos de inmunoadhesinas de TrkA adecuadas incluyen los descritos en la Patente de EEUU Nº 6.153.189. 55

En otras formas de realización, el antagonista del NGF comprende al menos un anticuerpo anti-TrkA capaz de bloquear, suprimir, alterar y/o reducir la interacción física de NGF con el receptor TrkA y/o la señalización aguas abajo, por lo que una actividad biológica de NGF se reduce y/o se bloquea. Los

anticuerpos anti-TrkA se conocen en la técnica. Los anticuerpos anti-TrkA de ejemplo incluyen los descritos en las Publicaciones PCT Números WO 97/21732, WO 00/73344, WO 02/15924, y la Publicación US Nº 20010046959. En otra forma de realización, el antagonista del NGF comprende al menos un anticuerpo anti-p75 capaz de bloquear, suprimir, alterar y/o reducir la interacción física de NGF con el receptor p75 y/o la señalización aguas abajo, por lo que una actividad biológica de NGF se reduce 5 y/o se bloquea.

En otra forma de realización, el antagonista del NGF comprende al menos un inhibidor de cinasa capaz de inhibir la señalización de la cinasa aguas abajo asociado a la actividad del receptor TrkA y/o p75. Los inhibidores de cinasa de ejemplo sib K252a o K252b, que se conocen en la técnica y se describen en Knusel y col., J. Neurochem. 59: 715-722 (1992); Knusel y col., J. Neurochemistry 57: 955-962 (1991); 10 Koizumi y col., J. Neuroscience 8: 715-721 (1988); Hirata y col., Chemical Abstracts 111: 728, documento XP00204135, véase el resumen y 12º Collective Chemical Substance Index, pág. 34237, C. 3 (5-7), 55-60, 66-69), pág. 34238, c. 1 (41-44), c. 2 (25-27, 32-33), pág. 3423, c. 3 (48-50, 52-53); y Patente de EEUU Nº 6.306.849.

Se espera que se identifique una serie de otras categorías de antagonistas del NGF si son buscadas por 15 el médico clínico.

Identificación de antagonistas del NGF

Los anticuerpos anti-NGF y otros antagonistas del NGF pueden identificarse o caracterizarse usando procedimientos conocidos en la técnica, mediante lo que se detecta y/o se mide la reducción, mejora, o neutralización de una actividad biológica de NGF. Por ejemplo, pueden usarse los ensayo de activación 20 del receptor de cinasa (KI RA) descritos en las Patentes de EEUU Nº 5.766.863 y 5.891.650, para identificar agentes anti-NGF. Este ensayo de tipo ELISA es adecuado para la medición cualitativa o cuantitativa de la activación de la cinasa mediante la medición de la autofosforilación del dominio de cinasa de una proteína tirosina cinasa del receptor (de aquí en adelante “rPTK”), por ejemplo, el receptor TrkA, así como para la identificación y caracterización de antagonistas potenciales de una rPTK 25 seleccionada, por ejemplo, TrkA. La primera etapa del ensayo implica la fosforilación del dominio cinasa de un receptor de cinasa, por ejemplo, un receptor TrkA, en el que el receptor está presente en la membrana celular de una célula eucariota. El receptor puede ser un receptor endógeno o un ácido nucleico que codifica el receptor, o una construcción del receptor y puede transformarse en la célula. Típicamente, una primera fase sólida (por ejemplo, un pocillo de una primera placa de ensayo) se reviste 30 con una población sustancialmente homogénea de tales células (usualmente una línea celular de mamífero) de manera que las células se adhieren a la fase sólida. A menudo, las células son adherentes y por lo tanto se adhieren de manera natural a la primera fase sólida. Si se usa una “construcción del receptor”, usualmente comprende una fusión de un receptor de cinasa y un polipéptido señalizador. El polipéptido señalizador se reconoce mediante el agente de captura, a menudo un anticuerpo de captura, 35 en la parte ELISA del ensayo. Se añade a continuación un analito, tal como un anticuerpo anti-NGF candidato u otro antagonista del NGF, conjuntamente con NGF a los pocillos que tienen las células adherentes, de manera que el receptor de la tirosina cinasa (por ejemplo, receptor TrkA) se expone a (o se pone en contacto con) NGF y el analito. Este ensayo permite la identificación de anticuerpos (u otro antagonista del NGF) que inhiben la activación de TrkA mediante su ligando NGF. Siguiendo la 40 exposición a NGF y el analito, las células adherentes se solubilizan usando un tampón de lisis (que tiene un detergente solubilizante en el mismo) y agitación moderada, liberando por lo tanto el lisado de células que puede someterse a la parte de ELISA del ensayo directamente, sin necesidad de concentración o clarificación del lisado celular.

El lisado celular preparado de ese modo está listo para someterse a la etapa de ELISA del ensayo. Como 45 una primera etapa en la fase de ELISA, una segunda fase sólida (usualmente un pocillo de una placa de microvaloración ELISA) se recubre con un agente de captura (a menudo un anticuerpo de captura) que se une de manera específica al receptor de la tirosina cinasa, o, en el caso de una construcción del receptor, al polipéptido señalizador. El recubrimiento de la segunda fase sólida se lleva a cabo de manera que el agente de captura se adhiere a la segunda fase sólida. El agente de captura es en general un 50 anticuerpo monoclonal, pero, como se describe en los ejemplos en el presente documento, también se pueden usar anticuerpos policlonales. El lisado celular obtenido se expone a continuación a, o se pone en contacto con, el agente de captura adherente de manera que el receptor o la construcción del receptor se adhiere a (o se captura en) la segunda fase sólida. Posteriormente se lleva a cabo una etapa de lavado, de manera que se retire el lisado de células no unido, dejando el receptor capturado o la 55 construcción del receptor. El receptor adherente o capturado o la construcción del receptor se expone a continuación a, o se pone en contacto con, un anticuerpo antifosfotirosina que identifica los restos de tirosina fosforilados en el receptor de la tirosina cinasa. En una forma de realización, el anticuerpo anti-

fosfotirosina se conjuga (directamente o indirectamente) a una enzima que cataliza un cambio de color de un reactivo de color no radiactivo. Por consiguiente, la fosforilación del receptor puede medirse mediante un cambio de color posterior del reactivo. La enzima puede unirse al anticuerpo anti-fosfotirosina directamente, o una molécula de conjugación (por ejemplo, biotina) puede conjugarse al anticuerpo anti-fosfotirosina y la enzima puede unirse posteriormente al anticuerpo anti-fosfotirosina mediante la 5 molécula de conjugación. Finalmente, la unión del anticuerpo anti-fosfotirosina al receptor capturado o a la construcción del receptor se mide, por ejemplo, mediante un cambio de color en el reactivo de color.

Los antagonistas del NGF también se pueden identificar mediante incubación de un agente candidato con NGF y controlando una cualquiera o más de las siguientes características: (a) unión a NGF e inhibición de la actividad biológica de NGF y/o rutas aguas abajo mediadas por la función de señalización 10 de NGF; (b) bloqueo o disminución de la activación del receptor de NGF; (c) incremento del aclaramiento de NGF; (d) inhibición de la activación del receptor de NGF (incluyendo dimerización y/o autofosforilación del receptor TrkA); (e) tratamiento, mejora, o prevención de cualquier dolor, particularmente en combinación de un AINE; (f) inhibición (reducción) de la síntesis, producción o liberación de NGF; (g) potenciación del tratamiento del dolor con AINE. En algunas formas de realización, un antagonista del 15 NGF se identifica mediante la incubación de un agente candidato con NGF y controlando la unión y la reducción o neutralización acompañante de una actividad biológica de NGF. El ensayo de unión puede realizarse con el (los) polipéptido(s) de NGF purificado(s), o con células que se expresan o se transfectan de manera natural, el (los) polipéptido(s) de NGF. En una forma de realización, el ensayo de unión es un ensayo de unión competitiva, en el que se evalúa la capacidad del anticuerpo candidato para competir 20 con un antagonista del NGF conocido por la unión de NGF. El ensayo se puede realizar en diversos formatos, incluyendo el formato ELISA. En otras formas de realización, un antagonista del NGF se identifica mediante la incubación de un agente candidato con NGF y controlando la inhibición acompañante de la dimerización y/o autofosforilación del receptor TrkA.

Después de la identificación inicial, la actividad del antagonista anti-NGF candidato se puede además 25 confirmar y refinar mediante bioensayos, conocidos para probar las actividades biológicas dirigidas. Como alternativa, pueden usarse bioensayos para seleccionar candidatos directamente. Por ejemplo, NGF promueve una serie de cambios morfológicamente reconocibles en las células sensibles. Éstos incluyen, pero no se limitan a, la promoción de diferenciación de células PC 12 y potenciación del crecimiento de neuritas a partir de estas células (Urfer y col., Biochem. 36: 4775-4781 (1997); Tsoulfas y 30 col., Neuron 10: 975-990 (1993)), promoción del crecimiento hacia afuera de neuritasa partir de explantes de ganglios sensoriales y simpáticos sensibles (Levi-Montalcini, R. y Angeletti, P. Nerve growth factor. Physiol. Rev. 48, 534-569, 1968) y promoción de la supervivencia de neuronas dependientes de NGF tales como neuronas del ganglio de la raíz embrionaria dorsal, del ganglio del trigémino, o del ganglio simpático (por ejemplo, Chun & Patterson, Dev. Biol. 75: 705-711, (1977); Buchman and Davies, 35 Development 118: 989-1001, (1993)). Por consiguiente, el ensayo para la inhibición de la actividad biológica de NGF supone el cultivo de las células sensibles a NGF con NGF más un analito, tal como un anticuerpo anti-NGF candidato y un antagonista del NGF candidato. Después de un tiempo apropiado se ensayará la respuesta celular (diferenciación celular, crecimiento hacia fuera de neuritas o supervivencia de células). 40

La capacidad de un antagonista del NGF candidato para bloquear o neutralizar una actividad biológica de NGF también puede determinarse mediante el control de la capacidad del agente candidato para inhibir la supervivencia mediada por NGF en el bioensayo de supervivencia de los ganglios de la raíz dorsal de rata de tipo embrionario como se describe en Hongo y col., Hibridoma 19: 215-227 (2000). En el documento PCT/US2004/01609 se describe un procedimiento para identificar moduladores de la 45 actividad de NGF.

Composiciones

Las composiciones de la invención comprenden una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno, como se describe en las diversas formas de realización del presente documento. En algunas formas de realización, las composiciones comprenden además un excipiente farmacéuticamente 50 aceptable. En algunas formas de realización, la composición es para su uso en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento (tales como los procedimientos para el tratamiento del dolor postquirúrgico). Ejemplos de tales composiciones, así como la manera de formularlas, también se describen en la sección previa y a continuación. El anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno pueden estar presentes en una sola composición o pueden estar presentes como composiciones separadas. Por 55 consiguiente, en algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno están presentes en la misma composición. En otras formas de realización, el anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno están presentes en composiciones separadas.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición sinérgica de un anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno.

En algunas formas de realización, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-NGF para su uso en el tratamiento del dolor postquirúrgico, en el que dicho uso comprende la administración simultánea y/o secuencial de ibuprofeno. En algunas formas de 5 realización, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden ibuprofeno para su uso en el tratamiento del dolor postquirúrgico, en el que dicho uso comprende la administración simultánea y/o secuencial de un anticuerpo anti-NGF. En algunas formas de realización, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno para su uso separado, simultáneo y/o secuencial para el tratamiento del dolor. En algunas formas de realización, 10 el anticuerpo anti-NGF es el anticuerpo E3 como se describe en el presente documento. En otras formas de realización, el AINE es ibuprofeno.

Se entiende que las composiciones pueden comprender más de un antagonista del NGF. Por ejemplo, una composición puede comprender más de un miembro de una clase de antagonista del NGF (por ejemplo, una mezcla de anticuerpos anti-NGF que reconocen diferentes epítopos de NGF), así como 15 miembros de diferentes clases de antagonistas del NGF (por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF y un compuesto inhibidor de NGF). Otras composiciones de ejemplo comprenden más de un anticuerpo anti-NGF que reconoce el (los) mismo(s) epítopo(s), diferentes especies de anticuerpos anti-NGF que se unen a diferentes epítopos de NGF, o compuestos inhibidores de NGF diferentes. En otras formas de realización, la composición comprende uno más antagonistas del NGF seleccionados del grupo que 20 consiste en un antagonista que se une (interactúa físicamente con) NGF (por ejemplo, un anticuerpo), un antagonista que se une a un receptor de NGF (tal como el receptor TrkA o el receptor p75) y un antagonista que reduce (impide y/o bloquea) la señalización aguas abajo del receptor de NGF.

La composición usada en la presente invención puede además comprender vehículos, excipientes, o estabilizantes farmacéuticamente aceptables (Remington: The Science and Practice of Farmacy 20ª Ed. 25 (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover.), en la forma de soluciones acuosas o formulaciones liofilizadas. Los vehículos, excipientes, o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones usadas, y pueden comprender tampones tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de 30 benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos 35 incluyendo glucosa, manosa, o dextranos; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tal como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN TM, PLURONICS TM o polietilenglicol (PEG). Los excipientes farmacéuticamente aceptables se describen además en el presente documento. 40

Las composiciones descritas en el presente documento pueden contener compuestos adicionales conocidos por ser útiles para el tratamiento del dolor. El antagonista del NGF y el AINE, y sus composiciones también pueden usarse en combinación con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia de los agentes.

En otras formas de realización, la invención proporciona composiciones (descritas en el presente 45 documento) para su uso en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento, ya sea en el contexto de un uso como medicamento y/o para el uso en la fabricación de un medicamento.

Kits

La invención también proporciona kits para uso en los presentes procedimientos. Los Kits de la invención incluyen uno o más contenedores que comprenden un anticuerpo anti-NGF, ibuprofeno, y en algunas 50 realizaciones, además comprenden instrucciones para uso de acuerdo con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. En alguna forma de realización, el kit comprende un anticuerpo anti-NGF (tal como anticuerpo E3 descrito en el presente documento). En otras formas de realización, el kit comprende un anticuerpo anti-NGF que comprende una o más CDR(s) de anticuerpo E3 (tal como una, dos, tres, cuatro, cinco, o, en algunas formas de realización, las seis CDR de E3). El kit 55 puede además comprender una descripción de la selección de un individuo adecuado para el tratamiento

basado en la identificación de si el individuo tiene dolor o si el individuo está en riesgo de padecer dolor. En algunas formas de realización, la invención proporciona kits para uso con cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. En todavía otras formas de realización, el kit comprende un anticuerpo anti-NGF. En todavía otras formas de realización, el kit comprende un anticuerpo anti-NGF humanizado (tal como el anticuerpo E3 descrito en el presente documento). En 5 todavía otras formas de realización, las instrucciones comprenden una descripción de la administración de un anticuerpo anti-NGF en combinación con ibuprofeno para tratar, prevenir y/o mejorar cualquier dolor (tal como el dolor postquirúrgico, el dolor asociado a quemaduras, artritis reumatoide u osteoartritis).

En algunas formas de realización, el kit comprende un anticuerpo anti-NGF, ibuprofeno e instrucciones 10 para administrar el anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno simultáneamente y/o secuencialmente, para el tratamiento eficaz del dolor. En otra forma de realización, el kit comprende un anticuerpo anti-NGF, e instrucciones para la administración del anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno, uno en combinación con el otro, para el tratamiento eficaz del dolor. En otras formas de realización, el kit comprende un anticuerpo anti-NGF, e ibuprofeno e instrucciones para la administración del anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno, 15 uno en combinación con el otro, para el tratamiento eficaz del dolor. Por consiguiente, cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento puede verse reflejado en las instrucciones.

En algunas formas de realización, el kit comprende un anticuerpo anti-NGF. En otras formas de realización, el anticuerpo anti-NGF es un anticuerpo que comprende la región variable de la cadena pesada mostrada en la Tabla 1 y la región variable de la cadena ligera mostrada en la Tabla 2. En otras 20 formas de realización más, el anticuerpo anti-NGF es un anticuerpo E3 como se describe en el presente documento.

El anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno pueden presentarse en contenedores separados o en un único contendor. Se entiende que el kit puede comprender una composición distinta o dos o más composiciones en las que una composición comprende un anticuerpo anti-NGF y una composición 25 comprende el ibuprofeno.

Los kits de la presente invención están en envases adecuados. Los envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, viales, frascos, jarras, envases flexibles (por ejemplo, bolsas Mylar o de plástico selladas), y similares. Los kits opcionalmente pueden proporcionar componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa. 30

Las instrucciones que se refieren al uso de un anticuerpo anti-NGF generalmente incluyen información sobre la posología, calendario de dosificación, y vía de administración para el tratamiento previsto. Los contenedores pueden ser de monodosis, paquetes a granel (por ejemplo, paquetes multidosis) o dosis subunitarias. Las instrucciones suministradas en los kits de la invención normalmente son instrucciones escritas en una etiqueta o en un prospecto (por ejemplo, una hoja de papel incluida en el kit), pero 35 también son aceptables instrucciones legibles por máquinas (por ejemplo, instrucciones contenidas en un disco de almacenamiento óptico o magnético).

La etiqueta o el prospecto indican que la composición se usa para tratar, mejorar y/o prevenir el dolor (incluido el dolor postquirúrgico). Las instrucciones pueden proporcionarse para llevar a la práctica cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. 40

Los kits de la presente invención están en envases adecuados. Los envases adecuados incluyen, pero no se limitan a, viales, frascos, jarras, envases flexibles (por ejemplo, bolsas Mylar o de plástico selladas), y similares. También están contemplados envases para su uso en combinación con un dispositivo específico, tal como un inhalador, un dispositivo de administración nasal (por ejemplo, un atomizador) o un dispositivo de infusión tal como una minibomba. Un kit puede tener un puerto de acceso 45 estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa con disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con la aguja de una inyección hipodérmica). El contenedor también puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el contenedor puede ser una bolsa con disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable con la aguja de una inyección hipodérmica). Al menos un agente activo de la composición es un anticuerpo anti-NGF. El contenedor además puede comprender un segundo 50 agente farmacéuticamente activo.

Los kits opcionalmente pueden proporcionar componentes adicionales tales como tampones e información interpretativa. Normalmente, el kit comprende un contenedor y una etiqueta o prospectos asociados al contenedor.

En algunas formas de realización, la invención proporciona artículos de fabricación que comprenden el contenido de los kits descritos anteriormente. En algunas formas de realización, los kits comprenden un anticuerpo anti-NGF y/o ibuprofeno con información que indica el uso para tratar el dolor (uno en combinación con el otro).

Administración de un anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno, y valoración del tratamiento 5

El anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno pueden administrarse a un individuo a través de cualquier vía adecuada. Por ejemplo, pueden administrarse juntos o por separado, por vía oral, intravenosa, sublingual, subcutánea, intraarterial, intramuscular, intraespinal, rectal, intratorácica, intraperitoneal, intraventricular, sublingual, transdérmica o por inhalación. Pueden administrarse por vía oral, por ejemplo, en forma de comprimidos, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, gomas de mascar, 10 caramelos, supositorios o similares preparados mediante procedimientos reconocidos en la técnica. Será evidente para una persona experta en la técnica que no se pretende que los ejemplos descritos en el presente documento sean limitantes sino ilustrativos de las técnicas disponibles.

Por consiguiente, en algunas formas de realización, el anticuerpo anti-NGF se administra a un individuo de acuerdo con procedimientos conocidos, tales como administración por vía intravenosa, por ejemplo, 15 en forma de bolo o mediante infusión continua durante un periodo de tiempo, a través de la vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratecal, oral, por inhalación o por vía tópica. Los nebulizadores disponibles comercialmente para formulaciones líquidas, que incluyen nebulizadores a propulsión y nebulizadores ultrasónicos son útiles para la administración. Las formulaciones líquidas se pueden nebulizar directamente y el polvo liofilizado se 20 puede nebulizar después de su reconstitución. Como alternativa, el anticuerpo anti-NGF puede convertirse en aerosol usando una formulación fluorocarbonada y un inhalador de dosis medida, o puede ser inhalado en forma de polvo liofilizado y molido.

También son útiles para la administración las técnicas de administración local dirigida o específica de sitio. Ejemplos de técnicas de administración local dirigidas o específicas de sitio incluyen diversas 25 fuentes de depósitos implantables de anticuerpo anti-NGF y/o el ibuprofeno, o catéteres de administración local, tales como catéteres para infusión, un catéter de aspiración, o un catéter de aguja, injertos sintéticos, espiras, derivaciones y endoprótesis adventicias u otros dispositivos implantables, vehículos específicos de sitio, inyección directa, uso de una técnica o dispositivo de analgesia controlada en el paciente (PCA), y/o aplicación directa. Véase, por ejemplo, Publicación PCT Nº WO 00/53211 y 30 patente de EE.UU. Nº 5.981.568.

Para la administración pueden usarse diversas formulaciones de anticuerpos anti-NGF o fragmentos de los mismos. En algunas formas de realización, el(los) agente(s) tales como los anticuerpos anti-NGF o los fragmentos del mismo pueden administrarse puros. En algunas formas de realización, los agentes comprenden un anticuerpo anti-NGF, y puede estar en diversas formulaciones, incluyendo formulaciones 35 que comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son conocidos en la técnica, y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración de una sustancia farmacológicamente eficaz. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como diluyente. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes estabilizadores, agentes humectantes y emulsivos, sales de osmolaridad variable, agentes de 40 encapsulación, tampones, y potenciadores de penetración cutánea. Los excipientes, así como las formulaciones para la administración parenteral y no parenteral de fármacos, se exponen en Remington, y col., The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

En algunas formas de realización, estos agentes (los antagonistas del NGF) se formulan para su administración mediante inyección (por ejemplo, por vía intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, 45 intramuscular, etc.). Por consiguiente, estos agentes pueden combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables tales como disolución salina, disolución de Ringer, disolución de dextrosa, y similares. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, el tiempo y la repetición, dependerán del individuo particular y del historial clínico del individuo. El régimen de dosificación (incluyendo el(los) antagonista(s) del NGF usado(s)) puede variar a lo largo del tiempo. 50

Un anticuerpo anti-NGF puede administrarse usando cualquier procedimiento adecuado, incluyendo mediante inyección (por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc.). Los anticuerpos anti-NGF también pueden administrarse por inhalación, como se describe en el presente documento. En general, para la administración de anticuerpos anti-NGF, una dosificación candidata inicial puede ser de aproximadamente 0,2 mg/kg o aproximadamente 2 mg/kg. En algunas formas de 55 realización, una dosificación diaria típica puede variar entre cualquiera de aproximadamente 3 μg/kg a 30

μg/kg a 300 μg/kg a 3 mg/kg a 30 mg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para las administraciones repetidas a lo largo de varios días o más tiempo, dependiendo de la afección, el tratamiento se mantiene hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas o hasta que se consigan niveles terapéuticos suficientes para reducir el dolor. Un régimen de dosificación de ejemplo comprende la administración de una dosis inicial de aproximadamente 2 mg/kg, seguida por 5 el mantenimiento de la dosis durante una semana a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg del anticuerpo anti-NGF, o seguido por el mantenimiento de la dosis de aproximadamente 1 mg/kg semana por medio. No obstante, pueden ser útiles otros regímenes de dosificación, dependiendo del patrón de caída farmacocinética que el facultativo desee conseguir. Por ejemplo, está contemplada una dosificación de una-cuatro veces por semana. Otros regímenes de dosificación incluyen un régimen de hasta 1 vez al 10 día, de 1 a 4 veces por semana, o menos frecuentemente. En algunas formas de realización, los compuestos se administran aproximadamente una vez por semana, aproximadamente de 1 a 4 veces al mes. En el presente documento se describe la dosificación de anticuerpos anti-NGF. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.

En algunas formas de realización, cuando no es un anticuerpo, puede administrarse un antagonista del 15 NGF a una tasa de 0,1 a 300 mg/kg de peso corporal del paciente separado en una a tres dosis o como se describe en el presente documento. En algunos pacientes adultos de peso normal, pueden administrarse en dosificaciones que varían desde aproximadamente 0,3 hasta 5,00 mg/kg. El régimen de dosificación particular, es decir, la dosis, el tiempo y la repetición, dependerán del individuo particular y del historial clínico del individuo, así como las propiedades de los agentes individuales (tales como la 20 semivida del agente, y otras consideraciones bien conocidas en la técnica).

El AINE (ibuprofeno) puede administrarse a un nivel de dosificación hasta los niveles de dosificación convencionales para tales analgésicos. En alguna forma de realización, el AINE se administra a un nivel reducido. Los niveles de dosificación adecuados dependerán del efecto analgésico del AINE elegido, pero normalmente los niveles adecuados serán de aproximadamente 0,001 a 25 mg/kg al día, de 25 aproximadamente 0,005 a 10 mg/kg al día, o de aproximadamente 0,05 a 1 mg/kg al día, o menos. El compuesto puede administrarse en un régimen de hasta 6 veces al día (o superior), 1 a 4 veces al día, o puede administrarse con menor frecuencia. En algunas formas de realización, el AINE se administra continuamente, o muy frecuentemente (como con, por ejemplo, PCA).

Cuando se administran en combinación, ya sea como composición única o como composiciones 30 separadas, el anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno se presentan en una relación que es coherente con la manifestación del efecto deseado. En algunas formas de realización el peso del anticuerpo anti-NGF al ibuprofeno será de 1 a 1 aproximadamente. En algunas formas de realización, esta relación puede estar entre aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1 y aproximadamente 1000 a aproximadamente 1, entre aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1 y entre 100 a aproximadamente 1, o entre 35 aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 y entre aproximadamente 10 a aproximadamente 1. También están contempladas otras relaciones.

Se apreciará que la cantidad de un anticuerpo anti-NGF y del ibuprofeno necesarias para su uso en el tratamiento o prevención del dolor variará no sólo con los compuestos y composiciones particulares seleccionados, sino también con la vía de administración, la naturaleza de la afección a tratar, y la edad y 40 condición del paciente, la evolución o la fase del tratamiento, y en último término estará a discreción del médico tratante. Por ejemplo, la dosificación apropiada de un anticuerpo anti-NGF dependerá del (los) anticuerpo(s) anti-NGF (o sus composiciones) utilizados, del tipo y gravedad del dolor a tratar, de si el agente se administra con fines preventivos o terapéuticos, de la terapia previa, del historial clínico del paciente y de la respuesta al agente, y la discreción del médico tratante. Normalmente el médico 45 administrará un anticuerpo anti-NGF, hasta que se alcance una dosificación que consiga el resultado deseado.

Las consideraciones empíricas, tales como la semivida, por lo general contribuirán a la determinación de la dosificación. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos que son compatibles con el sistema inmunitario humano, tales como anticuerpos humanizados o anticuerpos completamente humanos, para prolongar la 50 semivida del anticuerpo y evitar que el anticuerpo sea atacado por el sistema inmunitario del huésped. La frecuencia de administración puede determinarse y ajustarse durante el transcurso de la terapia, y en general se basa, pero no necesariamente, en el tratamiento y/o supresión y/o mejora y/o retraso del dolor. Como alternativa, pueden resultar apropiadas las formulaciones de liberación continua sostenida de un anticuerpo anti-NGF y/o ibuprofeno. En la técnica se conocen diversas formulaciones y dispositivos 55 para conseguir una liberación sostenida. En una forma de realización, las dosificaciones para un anticuerpo anti-NGF pueden determinarse empíricamente en individuos que hayan recibido una o más administraciones de un agente que inhibe las actividades del NGF, para tratar el dolor. Los individuos

reciben dosificaciones crecientes de un agente que inhibe el NGF, por ejemplo, un anticuerpo anti-NGF, en combinación con un AINE. Para valorar la eficacia del tratamiento, puede hacerse el seguimiento de un indicador del dolor.

La administración de un anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno de acuerdo con el procedimiento de la presente invención puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de la condición 5 fisiológica del receptor, de si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y de otros factores conocidos por los médicos expertos. La administración de un anticuerpo anti-NGF puede ser esencialmente continua durante un periodo de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas, por ejemplo, antes, durante o después del desarrollo del dolor; antes y después; durante y después; antes y durante; o antes, durante y después del desarrollo del dolor. Por ejemplo, la 10 administración puede ser antes, durante y/o después de que se produzca una herida, incisión, traumatismo, cirugía y cualquier otro acontecimiento que probablemente dé lugar a dolor.

En algunas formas de realización, puede estar presente más de un antagonista del NGF, tal como un anticuerpo. Los antagonistas pueden ser iguales o diferentes entre sí. Pueden estar presentes al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o más antagonistas del NGF 15 diferentes. Generalmente, esos antagonistas del NGF tienen actividades complementarias que no interfieren adversamente entre sí. Los antagonistas del NGF también puede usarse en combinación con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia de los agentes.

En algunas formas de realización, puede estar presente más de un AINE. Los AINE pueden ser iguales o diferentes entre sí. Pueden estar presentes al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, 20 al menos cinco o más AINE. Generalmente, esos AINE tienen actividades complementarias que no interfieren adversamente entre sí. Uno o más AINE también pueden usarse en combinación con otros agentes que sirven para mejorar y/o complementar la eficacia del (los) agente(s).

Las formulaciones terapéuticas del antagonista del NGF (tal como un anticuerpo) y el AINE (tal como ibuprofeno) usados de acuerdo con la presente invención se preparan para el almacenamiento 25 mezclando un anticuerpo con el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas, y pueden comprender tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos 30 orgánicos; sales tales como cloruro de sodio, antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos aproximadamente); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o 35 inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrina; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones que forman sales tales como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, 40 PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).

Los liposomas que contienen el antagonista del NGF (tal como un anticuerpo) se preparan mediante procedimientos conocidos en la técnica, como se describe en Epstein, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang, y col., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); y las patentes de EE.UU. Nº 4.485.045 y 4.544.545. Liposomas con tiempos de circulación mejorados se dan a conocer en la patente 45 de EE.UU. Nº 5.013.556. Se pueden generar liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruden a través de filtros de tamaño de poro definidos para dar liposomas con el diámetro deseado.

Los principios activos también se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante 50 técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se dan a conocer en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000). 55

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de

liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente de EE.UU. Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de 7-etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, 5 copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), acetato isobutirato de sacarosa y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.

Las formulaciones a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se puede conseguir fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Por ejemplo, las 10 composiciones terapéuticas del antagonista del NGF (tal como el anticuerpo anti-NGF) se colocan por lo general en un contenedor con un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa con disolución intravenosa o un vial con un tapón perforable con la aguja de una inyección hipodérmica.

Las composiciones según la presente invención pueden estar en formas de monodosis tales como comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, gránulos, disoluciones, suspensiones o supositorios, para la 15 administración por vía oral, parenteral o rectal, o para la administración por inhalación o insuflación.

Para la preparación de composiciones sólidas tales como comprimidos, el principio activo principal se mezcla con un vehículo farmacéutico, por ejemplo, ingredientes convencionales de formación de comprimidos tales como almidón de maíz, lactosa, sacarosa, sorbitol, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, fosfato de dicalcio o gomas, y otros diluyentes farmacéuticos, por ejemplo, agua, para formar 20 una composición de preformulación sólida que contiene una mezcla homogénea de un compuesto de la presente invención, o una de sus sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables. Cuando se hace referencia a estas composiciones de preformulación como homogéneas, se entiende que el principio activo se dispersa homogéneamente por toda la composición de manera que la composición se puede subdividir fácilmente en formas de monodosis igualmente eficaces tales como comprimidos, píldoras y 25 cápsulas. Esta composición de preformulación sólida se subdivide a continuación en formas de monodosis del tipo descrito anteriormente que contienen desde aproximadamente 0,01 mg hasta 0,1 mg o hasta aproximadamente 500 mg del principio activo de la presente invención. Los comprimidos o píldoras de la nueva composición pueden recubrirse o pueden componerse de otra forma para proporcionar una forma de dosificación que produzca la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, 30 el comprimido o la píldora puede comprender un componente de dosificación interno y de dosificación externo, estando este último en forma de envoltorio sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica que sirve para resistir la desintegración en el estómago y que permite que el componente interno pase intacto al duodeno o que se retrase su liberación. Se pueden usar una diversidad de materiales para esas capas o cubiertas entéricas, tales materiales incluyen una serie de 35 ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales tales como laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.

Las formas líquidas en las que pueden incorporarse las composiciones de la presente invención para la administración por vía oral o mediante inyección incluyen disoluciones acuosas, jarabes convenientemente aromatizados, suspensiones acuosas u oleosas y emulsiones aromatizadas con 40 aceites comestibles tales como aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de coco o aceite de cacahuete, así como elixires y vehículos farmacéuticos similares. Los agentes dispersantes o de suspensión adecuados para suspensiones acuosas incluyen gomas naturales y sintéticas tales como tragacanto, goma arábiga, alginato, dextrano, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, polivinilpirrolidona o gelatina. Los principios activos también pueden incorporarse en productos de 45 liberación controlada muy viscosos tales como acetato isobutirato de sacarosa u otros. Estas formulaciones pueden usarse para dosificación oral o para inyección. La inyección puede dar como resultado un depósito local del fármaco que se libera localmente durante el transcurso de 1 día a tres meses.

Las composiciones para la administración mediante inyección incluyen las que comprenden un 50 anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno, como principios activos, en asociación con un agente de superficie activa (o agente humectante o tensioactivo) o en forma de emulsión (como una emulsión de agua en aceite o de aceite en agua).

Los agentes tensioactivos adecuados incluyen, en particular, agentes no iónicos, tales como polioxietilensorbitanos (por ejemplo, Tween™ 20, 40, 60, 80 u 85) y otros sorbitanos (por ejemplo, 55 Span™ 20, 40, 60, 80 u 85). Las composiciones con un agente de superficie activa comprenderán de manera conveniente entre el 0,05 y el 5% del agente de superficie activa, o entre el 0,1 y el 2,5%. Se

apreciará que, si fuera necesario, se pueden añadir otros ingredientes, por ejemplo, manitol u otros vehículos farmacéuticamente aceptables.

Las emulsiones adecuadas pueden prepararse usando emulsiones grasas disponibles comercialmente, tales como Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ y Lipiphysan™. El principio activo puede disolverse en una composición en emulsión premezclada o, como alternativa, puede disolverse en un 5 aceite (por ejemplo, aceite de soja, aceite de alazor, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendra) y una emulsión formada tras mezclar con un fosfolípido (por ejemplo, fosfolípidos de huevo, fosfolípidos de soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que pueden añadirse otros ingredientes, por ejemplo, glicerol o glucosa, para ajustar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas normalmente contendrán hasta el 20% de aceite, por ejemplo, entre el 5 y el 20%. 10 La emulsión grasa puede comprender gotículas de grasa de entre 0,1 y 1,0 μm, particularmente entre 0,1 y 0,5 μm, y tener un pH en el intervalo de 5,5 a 8,0.

En algunas formas de realización, las composiciones en emulsión son las preparadas mezclando un antagonista del factor de crecimiento neuronal con Intralipid™ o sus componentes (aceite de soja, fosfolípidos de huevo, glicerol y agua). 15

Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen disoluciones y suspensiones en disolventes orgánicos o acuosos farmacéuticamente aceptables, o sus mezclas, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados como los expuestos anteriormente. Las composiciones se administran mediante vía oral o respiratoria nasal para un efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes farmacéuticamente aceptables estériles de 20 preferencia pueden ser nebulizadas mediante el uso de gases. Las disoluciones nebulizadas pueden inhalarse directamente del dispositivo de nebulización o el dispositivo de nebulización se puede acoplar a una máscara facial, una cabina o una máquina de respiración de presión positiva intermitente. Las composiciones en disolución, suspensión, o en polvo pueden administrarse (incluyendo por vía oral o nasal) desde dispositivos que administran la formulación de una manera apropiada. 25

La eficacia del tratamiento puede valorarse mediante procedimientos muy conocidos en la técnica.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no para limitar, la invención.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-NGF en combinación con un AINE para tratar el dolor 30 postquirúrgico

Se usó un modelo de dolor que mimetiza el dolor posquirúrgico para valorar la eficacia de un anticuerpo anti-NGF en combinación con el AINE, ibuprofeno. Para cada experimento se utilizaron 16 ratas adultas macho Sprague Dawley con un peso de 200 a 220 g (Harlan; Indianápolis, IN) en condiciones de luz normal durante al menos una semana antes de utilizarlas, con alimento y agua a voluntad. Después de 35 un periodo de 2 horas de aclimatación en las cámaras de prueba el día previo a la cirugía, las ratas se separaron en dos grupos: uno que recibió anticuerpo 15 horas antes de cirugía, y el otro que recibió el vehículo (dextrosa al 5% /disolución salina USP al 0,45%) en ese momento. Se administró anticuerpo anti-NGF antagonista MAb 911 (véase, Hongo, y col., Hybridoma 19: 215-227 (2000)) a una concentración de 1 mg/kg de peso corporal. El ibuprofeno se administró en diversas concentraciones que 40 variaban desde 10, 30, 100 y 300 mg/kg (s.c.) 24 horas después de la cirugía a todos los animales.

La cirugía se basó en el procedimiento descrito por Brennan, y col., Pain 64: 493-501 (1996). Se anestesió a los animales con isoflurano al 2% y mezcla de aire que se mantuvo durante la cirugía a través de un cono nasal. La superficie plantar de la pata derecha se preparó con una gasa de povidona yodada, y se realizó una incisión longitudinal central de 1 cm a través de la piel y la fascia, comenzando a 45 0,5 cm del borde del talón y que se extendía hacia los dedos. Se realizaron mediciones con una regla con el pie sujeto en posición flexionada. Los músculos plantares se levantaron usando un fórceps curvado y se realizó una incisión longitudinal. Se hizo una incisión a lo largo de la profundidad completa del músculo, entre el origen y la inserción. El sangrado se controló a lo largo de toda la cirugía mediante presión aplicada con una gasa. La herida se cerró con dos suturas no absorbibles (neurofilamento negro 50 de ethicon 5-0). Estas suturas se anudaron 5-6 veces, con el primer nudo atado flojo. La zona de la herida se lavó con una disolución de bacitracina. Se dejó que los animales se recuperaran y descansaran en jaulas limpias durante 22 horas antes de comenzar las pruebas de comportamiento.

Para cada experimento, se separaron los animales en dos grupos (control y tratados con anticuerpo). El anticuerpo anti-NGF se administró 15 horas antes de cirugía. 22 horas después de la cirugía se valoró el dolor en reposo en ambos grupos (“basal” en los siguientes gráficos). Veinticuatro horas después de la cirugía se trataron los animales con ibuprofeno en concentraciones de 10, 30, 100 o 300 mg/kg (s.c.). Se determinó el dolor en reposo una hora después del tratamiento con ibuprofeno. 5

El dolor en reposo se evaluó en diversos momentos después de la cirugía usando una puntuación del dolor acumulativo. Las ratas se colocaron en una red de plástico (rejilla: 8 mm2) en jaulas de plástico limpias y se dejaron aclimatar durante 15 minutos-20 minutos. Se valoró el comportamiento en una escala de 0 a 2. Se dio una puntuación de 0 si el animal aguantaba el peso sobre la pata con la incisión, según se valoró notando que la pata se blanqueaba o se presionaba contra la red. Se dio una puntuación 10 de 1 si la pata se colocaba con la piel justo tocando la red, sin blanqueo o indentación de la piel. Se dio una puntuación de 2 si la pata se mantenía completamente fuera de la red. Cada animal se observó durante 1 minuto cada 5 minutos durante 30 minutos. La suma de las 6 puntuaciones (total 0-12) durante un periodo de media hora se usó para valorar el dolor en la pata con incisión.

Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla 1 y en la Figura 1. 15

Tabla 1: Puntuación del dolor acumulativo en animales, tras el tratamiento con anticuerpo antagonista anti-NGF en una concentración de 1 mg/kg e ibuprofeno en concentraciones de 0, 10 mg/kg, 30 mg/kg, 100 mg/kg o 300 mg/kg, un día después de la cirugía. Los datos se muestran como media (EEM). Los datos se analizaron por medio de análisis de varianza de una vía y a continuación los pares individuales se analizaron usando la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples usando el programa 20 Prizm.

: Basal 10 mg/kg 30 mg/kg 100 mg/kg 300 mg/kg

MAb 911: 5,4 (0,8) 3 (0,87) 3,4 (0,68) N/D N/D

Control: 8,2 (0,72) 7,3 (0,73) 6,1 (1,08) 5 (0,82) 4,4 (0,78)

: p < 0,001 p < 0,001 p < 0,05

Como se muestra en la Tabla 1, la puntuación del dolor en reposo para las ratas tratadas con MAb 911 (a 1 mg/kg) fue significativamente inferior al control sin ibuprofeno (p < 0,001). De manera similar, la 25 puntuación del dolor en reposo para el tratamiento con MAb 911 1 mg/kg e ibuprofeno 10 mg/kg fue significativamente inferior al tratamiento con ibuprofeno 10 mg/kg solo (p < 0,001); y la puntuación del dolor en reposo para el tratamiento con MAb 911 1 mg/kg e ibuprofeno 30 mg/kg fue significativamente inferior al tratamiento con ibuprofeno 30 mg/kg solo (p < 0,05). La Figura 1 presenta las puntuaciones del dolor en reposo medidas en animales con o sin tratamiento con 1 mg/kg del anticuerpo anti-NGF, y con y 30 sin tratamiento con diversas dosis de ibuprofeno. El tratamiento preoperatorio con anticuerpo anti-NGF e ibuprofeno es más eficaz para reducir el dolor en reposo que el ibuprofeno solo o el tratamiento con el anticuerpo solo. Se aprecia que el tratamiento con MAb 911 (1 mg/kg) en combinación con 10 mg/kg de ibuprofeno es al menos tan eficaz como 300 mg/kg de ibuprofeno solo. Para probar el efecto del tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-NGF 911 en combinación con diclofenac para tratar el 35 dolor postquirúrgico, los experimentos se llevaron a cabo como se describió anteriormente excepto que los animales recibieron una dosis de vehículo o diclofenac 5 mg/kg en lugar de ibuprofeno. Los resultados se muestran en la Figura 2. Se observó una reducción de la puntuación del dolor para la media para el tratamiento con 911 a 1 mg/kg y diclofenac a 5 mg/kg comparado con el tratamiento con diclofenac a 5 mg/kg solo. 40

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo antagonizante anti-factor de crecimiento neuronal (NGF) e ibuprofeno para uso en combinación en el tratamiento del dolor postquirúrgico en un individuo.
2. Un anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo anti-NGF se une al NGF humano. 5
3. Un anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno de la reivindicación 2, en el que el anticuerpo anti-NGF se une al NGF humano con una afinidad de unión de 10 nM o inferior a 10 nM.
4. Un anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo anti-NGF es un anticuerpo humano.
5. Un anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el 10 anticuerpo anti-NGF es un anticuerpo humanizado.
6. Un anticuerpo anti-NGF y el ibuprofeno de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo humanizado es un anticuerpo que comprende la región variable de la cadena pesada mostrada en ID. SEC. Nº 1 y la región variable de la cadena ligera mostrada en ID. SEC. Nº 2.
7. El uso de un anticuerpo antagonizante anti-factor de crecimiento neuronal (NGF) e ibuprofeno para la 15 fabricación de un medicamento para tratar el dolor postquirúrgico en un individuo.
8. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento del dolor postquirúrgico que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo antagonizante anti-NGF e ibuprofeno, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.