JP4901051B2 - RNAiを増強する因子を使用することによって遺伝子抑制を媒介する方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、細胞における遺伝子抑制を増強するための方法に関する、そして特にそれは、RNAiに随伴する因子類の操作によりRNAi媒介遺伝子サイレンシングを増強するための改良法に関する。本発明はまた、RNAiを上方制御する(up−regulate)因子類だけでなく、下方制御する(down−regulate)因子類をも、同定するための方法に関する。それはまた、遺伝子サイレンシングを増強またはモジュレートするために有用な遺伝子構築体およびそうした構築体を内蔵する細胞に関する。
【0002】
発明の背景
遺伝子発現を特異的に干渉するための、二本鎖RNA(dsRNA)の使用は、これまで遺伝子的に取扱いにくかったいくつかを含む一連の生物で、その効力が証明されたため、かなり注目されるようになっている。RNA干渉(RNAi)と呼称されるそれは、ウイルス防御、転位(transpositional)エレメントの制御、遺伝的刷込み、および内因性遺伝子調節と関係があるとされてきた。それは、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)、共抑制(co−suppression)、クエリング(quelling)、およびアンチセンスRNA媒介遺伝子抑制における中心機構であると、仮定されてきた。提案されてきた1つのモデルは、dsRNAが、dsRNA特異的ヌクレアーゼ類により21−25ヌクレオチド(nt)分子種へ断片化され、RNA依存性RNAポリメラーゼにより増幅され、次いで解離され、そして自由に、RNAヌクレアーゼ媒介性分解により相同mRNAを攻撃する、というものである。本技術の適用は、遺伝子機能の精査および疾患状態に関与する遺伝子類の確認を、大いに簡易化すると思われる。
【0003】
最近、少なくとも2つの異なる戦略が、dsRNAの認識およびdsRNA媒介遺伝子干渉の活性化に関与する多タンパク質複合体とされるものを構成する細胞タンパク質を同定するために、企てられた。第一のものは、RNAiに対して完全に欠陥性の変異体を分離するための古典的化学突然変異誘発または挿入型突然変異誘発の使用、および相補性を用いる関連遺伝子類のクローニング、を含む。これらの研究は、植物、線虫および真菌のような遺伝子的に扱い易い生物で行われてきた。記載された遺伝的スクリーンは、抑制の程度が完全なRNAi系の使用を含む。該変異誘発は、RNAi効果が完全に逆転される変異体を産生することから、RNAi効果に必要な細胞因子(機能)の消失を示す。したがってこれらの遺伝的スクリーンは、微妙な効果またはRNAiにおける速度制限または速度決定的役割をもつ因子類を、見逃す可能性が非常に高い。
RNAiにおける鍵プレイヤーを見い出すための第二の戦略は、無細胞検定法の使用に関するものであった。ところで、これらのin vitro再構成検定法は、細胞状況の外部でRNAiにインパクトを与える細胞因子類を同定するので、それらの因子類の細胞役割を常に検証しなければならない。
【0004】
しかし、これらの戦略の主要な欠点は、当該遺伝子がその生物に必須である場合には、同定されないか、当該遺伝子が過剰発現された場合、RNAiを増強するであろう遺伝子活性を直接同定しないと思われることである。
したがって、増加および減少の両方の量的活性を選択可能な、一連のRNAi効能を証明できるモデルが必要である。これにより、当該遺伝子サイレンシング効果を増強または低減させることができる因子類の同定が、可能になるだろう。それ故、先行技術の1つまたはそれ以上の欠点を克服するか、あるいは少なくとも軽減すること、または有用な代替方法を提供することが、本発明の目的である。
【0005】
発明の要約
dsRNA媒介遺伝子サイレンシングの研究用の分裂酵母モデルの使用を通じ、またこのプロセスに関与する因子類の探索において、RNAi活性の自然レベルは、RNAi活性または効能に随伴する因子類を操作することによって、増強できることが、意外にも見い出された。このように、対応するアンチセンス配列またはその一部の同一プールの存在下で、標的核酸配列の定常状態レベルを上昇させることにより、当該アンチセンス媒介抑制は、維持されるだけでなく、増強されることが、見い出された。これは遺伝子抑制のRNAi様機構を示している。また、本明細書でRNAi増強配列(res)と名付けられた(本明細書ではアンチセンス増強配列−aesとも呼ばれる)いくつかの配列の過剰発現も、RNAiを増強する能力をもつことが見い出された。
分裂酵母S.pombeで増強されるRNAi活性のこの能力は、RNAiプロセスの分析、およびその活性を上方制御あるいは下方制御する因子類の同定および研究を、可能にするモデル系を提供する。当該系は、それらの結果として生じるタンパク質活性がin vivoで増大される場合、PTGS効能を増加するRNAi増強遺伝子配列を同定するために、さらに使用されてきた。本発明を例示するのに用いられたモデルおよび記載された方法は、遺伝子発現が、より効率的なモジュレートまたはサイレンシングを必要とする障害の治療にも適用可能である。
【0006】
第1の側面に従い、細胞中の標的核酸の発現を阻害するための方法が提供されるが、その方法は、
(i) 当該細胞中でRNAi因子のレベルを上昇させること、そして
(ii) 工程(i)を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までに当該RNAi因子が増加することを可能にする条件下で、当該細胞中へ導入すること、
の工程を含む。
【0007】
第2の側面に従い、標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対する細胞感受性を増加させる方法が提供されるが、その方法は、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までに当該RNAi因子が増加することを可能にする条件下で、当該細胞中へ事前に、同時に、または後に、導入されたという前提で、当該標的核酸を発現する細胞中で当該RNAi因子のレベルを上昇させることを、含む。
【0008】
第3の側面に従い、その緩和が標的核酸の発現を阻害することにより媒介される障害に苦しむ患者を治療するための方法が提供されるが、その方法は、
(i) 当該標的核酸が発現される当該患者の細胞中でRNAi因子のレベルを上昇させること、そして
(ii) 工程(i)を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までに当該RNAi因子が増加することを可能にする条件下で、そうした細胞中へ導入し、それによって当該患者を治療すること、
の工程を含む。
【0009】
第4の側面に従い、その緩和が標的核酸の発現を阻害することにより媒介される障害の発症を患者において阻止するための方法が提供されるが、その方法は、
(i) 当該患者が当該障害に悩んでいる場合に、当該標的核酸が発現されるはずの当該患者の細胞中でRNAi因子のレベルを上昇させること、そして
(ii) 工程(i)を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現、もしそうした発現が起るとしたら、それを阻害するはずの程度までに当該RNAi因子が増加することを可能にする条件下で、そうした細胞中へ導入し、それによって当該患者における当該障害の発症を阻止すること、
の工程を含む。
【0010】
第5の側面に従い、ある特定の標的核酸の発現、またはその産物の活性を阻害することが、ある障害を緩和する可能性があるか否かを決定する方法が提供されるが、その方法は、
(i) その表現型が、当該障害をもつ患者からの細胞のものと相関する細胞中で、RNAi因子のレベルを上昇させること、そして
(ii) 工程(i)を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現を阻害する程度までに当該RNAi因子が増加することを可能にする条件下で、当該細胞中へ導入すること、そして
(iii) 当該細胞の表現型がここで、当該障害が緩和されいてるか又は当該障害が顕著でない患者からの細胞のものと相関するか否かを決定し、それによって、当該標的核酸の発現またはその産物の活性を阻害することが、当該障害を緩和する可能性があるか否かを決定すること、
の工程を含む。
【0011】
好ましい実施態様では、前記標的核酸は内因性核酸またはその一部であるが、それは外因性配列またはその一部であってもよい。
好ましくは、前記RNAi因子のレベルは、当該RNAi因子の付加的コピーまたは当該因子を生じる作用物質を、前記細胞中へ導入することにより上昇させる。それ故、内因性RNAi因子の発現を上方制御することも、同じ結果を達成することになり、本発明の一部として本明細書で意図されることが、理解されよう。
【0012】
好ましくは、前記因子は、遺伝子、cDNA,RNAまたはタンパク質より成る群から選択される。より好ましくは、前記アンチセンス核酸の転写アクチベーター、前記RNAi機械装置の成分、前記DNA複製機械装置の成分、および翻訳機械装置の成分より成る群から選択される因子である。さらに一層好ましくは、res配列であるRNAi因子である。
また好んで、前記因子は、本明細書で定義されるような、ATP依存性RNAヘリカーゼ(ded1),転写因子thi1,DNA複製タンパク質sna41,リボソームタンパク質L7a,伸長因子EF−Tuおよびres1より成る群から選択されてもよい。
【0013】
さらに好ましい因子類は、W18,W20,W21,W23,W27,W28,W30,W32,およびW47と本明細書で称する形質転換細胞から得られるres配列により表される。
好ましくは、前記res配列は、配列番号1から4のいずれか1つにより表される。
前記好ましい細胞は真核生物細胞であり、そしてさらに一層好ましいのは、哺乳動物細胞である。本明細書に記載の当該発明のいくつかの実施態様において、好ましい細胞は、分裂酵母Schizosaccharomyces pombe細胞である。
【0014】
好ましくは、前記アンチセンス核酸は、前記標的核酸の一部のみに対応する。
第6の側面に従い、
(i) RNAi因子をコードする、またはその発現を増加あるいは減少させることができる、発現可能な核酸;
(ii) 当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子をコードする核酸;そして
(iii) (i)および(ii)の核酸が、同じまたは異なる分子上に位置することがあってもよい、医薬的に許容可能なキャリヤー、
を含む、前掲側面のいずれか1つの方法を実行する際に使用するための医薬組成物が提供される。
【0015】
第7の側面に従い、
(i) 前記標的核酸またはその一部である核酸、または当該標的核酸の細胞内レベルを上昇させることができる因子をコードする発現可能な核酸;
(ii) 当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子をコードする核酸;そして
(iii) (i)および(ii)の核酸が、同じまたは異なる分子上に位置することがあってもよい、医薬的に許容可能なキャリヤー、
を含む、請求項2から17のいずれか1つの方法を実行する際に使用するための医薬組成物が提供される。
【0016】
第8の側面に従い、標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対して感受性が増加した細胞が提供されるが、その細胞は、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現を阻害する程度までに前記RNAi因子が増加することを可能にする条件下で、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該細胞中へ導入されたことを前提として、(i)標的核酸を発現する、そして(ii)上昇したレベルのRNAi因子を含む。
好んで前記細胞は真核生物細胞であるが、より好ましいのは、哺乳動物細胞である。上に指摘されたように、本明細書に記載の当該発明のいくつかの実施態様において、好ましい細胞はSchizosaccharomyces pombe細胞である。
【0017】
第9の側面に従い、細胞中の標的核酸の発現を阻害するための方法が提供されるが、その方法は、
(i) 当該細胞中で当該標的核酸またはその一部のレベルを増大させること、そして
(ii) 工程(i)を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までに増加を可能にする条件下で、当該細胞中へ導入すること、
の工程を含む。
【0018】
第10の側面に従い、標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対する細胞感受性を増加させる方法が提供されるが、その方法は、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までにその増加を可能にする条件下で、当該細胞中へ事前に、同時に、または後に、導入されているという前提で、当該標的核酸を発現する細胞中で当該標的核酸またはその一部のレベルを増大させることを、含む。
【0019】
第11の側面に従い、その緩和が標的核酸の発現を阻害することにより媒介される障害に苦しむ患者を治療するための方法が提供されるが、その方法は、
(i) 当該標的核酸が発現される当該患者の細胞中で当該標的核酸またはその一部のレベルを増大させること、そして
(ii) 工程(i)を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が当該標的核酸の発現を阻害する程度までに増加を可能にする条件下で、そうした細胞中へ導入し、それによって当該患者を治療すること、
の工程を含む。
【0020】
第12の側面に従い、その緩和が標的核酸の発現を阻害することにより媒介される障害の発症を患者において阻止するための方法が提供されるが、その方法は、
(i) 当該患者が当該障害に悩んでいる場合に、当該標的核酸が発現されるはずの当該患者の細胞中で当該核酸またはその一部のレベルを増大させること、そして
(ii) 工程(i)を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現、もしそうした発現が起るとしたら、それを阻害するはずの程度までに増加を可能にする条件下で、そうした細胞中へ導入し、それによって当該患者における当該障害の発症を阻止すること、
の工程を含む。
【0021】
第13の側面に従い、ある特定の標的核酸の発現、またはその産物の活性を阻害することが、ある障害を緩和する可能性があるか否かを決定する方法が提供されるが、その方法は、
(i) その表現型が、当該障害をもつ患者からの細胞のものと相関する細胞中で、当該標的核酸のレベルを増大させること、
(ii) 工程(i)を実行する前に、と同時に、または後に、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子を、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現を阻害する程度までに増加を可能にする条件下で、当該細胞中へ導入すること、そして
(iii) 当該細胞の表現型がここで当該障害が緩和されているか又は当該障害が顕著でない患者からの細胞のものと相関するか否かを決定し、それによって、当該標的核酸の発現またはその産物の活性を阻害することが、当該障害を緩和する可能性があるか否かを決定すること、
の工程を含む。
【0022】
好ましい実施態様では、前記標的核酸は内因性核酸またはその一部であるが、それは外因性配列またはその一部であってもよい。
好ましくは、前記標的核酸のレベルは、当該標的核酸の付加的コピー、またはその細胞内過剰発現を誘導できる作用物質を、前記細胞中へ導入することにより増大させる。過剰発現は、内因性ならびに外因性の標的核酸について達成可能である。好ましくは、当該標的核酸の量を増大するために用いられる核酸は、当該標的核酸の断片、誘導体または類似体である。しかし、当該標的核酸のそっくりそのままの配列を用いてもよいことは理解されよう。
好都合には、前記標的核酸は選択可能なマーカーに連結させてもよい。
好ましい細胞は真核生物細胞であり、そしてさらに一層好ましいのは、哺乳動物細胞である。本明細書に記載の当該発明のいくつかの実施態様において、好ましい細胞はSchizosaccharomyces pombe細胞である。
【0023】
好ましくは、前記アンチセンス核酸は、前記標的核酸の一部のみに対応する。
第14の側面に従い、標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対して感受性が増加した細胞が提供されるが、その細胞は、当該アンチセンス核酸が、当該標的核酸の発現を阻害する程度までに前記RNAi因子が増加することを可能にする条件下で、当該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に対して向けられたアンチセンス核酸である、または生じる、分子が、当該細胞の中へ導入されたことを前提として、(i)当該標的核酸を発現する、そして(ii)上昇したレベルの当該核酸を含む。
好ましい細胞は真核生物細胞であり、そしてより一層好ましいのは、Schizosaccharomyces pombe細胞である。
第15の側面に従い、標的核酸、および当該標的核酸またはその一部のアンチセンスである核酸、をもつ細胞中で当該標的核酸の発現を、実効すること、および/またはモジュレートすることができる細胞因子を同定する方法が提供されるが、その方法は当該細胞中で当該因子を過剰発現することを含み、そしてそこでの当該標的核酸の発現は増強されるか、または部分的に抑制されることも可能である。
【0024】
第16の側面に従い、前記15番側面の方法により同定された因子が提供される。
好ましい因子類は、遺伝子、cDNA,RNAまたはタンパク質より成る群から選択可能である。より好ましいのは、転写アクチベーターまたは前記アンチセンス核酸、前記RNAi機械装置の成分、前記DNA複製機械装置の成分、および翻訳機械装置の成分より成る群から選択される因子である。さらに一層好ましいのは、res配列をもつ因子である。
好ましい因子類はまた、本明細書で定義されるような、ATP依存性RNAヘリカーゼ(ded1),転写因子thi1,DNA複製タンパク質sna41,リボソームタンパク質L7a,伸長因子EF−Tuおよびres1より成る群から選択することも可能である。
【0025】
第17の側面に従い、W18,W20,W21,W23,W27,W28,W30,W32,およびW47と本明細書で称する形質転換細胞から得られるres配列であるRNAi因子が提供される。
第18の側面に従って、配列番号1から4により表されるres配列であるRNAi因子が提供される。
【0026】
第19の側面に従い、標的核酸またはその一部、および当該標的核酸またはその一部に対応するアンチセンス核酸またはその一部をもつSchizosaccharomyces pombe細胞が提供されるが、そこでの当該標的核酸の発現は増強されるか、または部分的にのみ抑制されることが可能である。
用語「標的核酸の発現を阻害すること」は、本発明の関係において用いられる場合、当該標的核酸が細胞に導入された遺伝子またはその一部であるか、あるいはそれが内因性遺伝子であるか、否かを問わず、遺伝子発現の低減または排除を、非限定的に包含することが意図される。
【0027】
用語「RNAi因子」は、RNAi活性を増強することが可能な、任意の、天然に存在する、修飾された、または合成の、分子をその範疇に含むことが意図される。この定義は、本明細書でRNAi増強配列(res)と呼ばれる因子類をその範疇に含む。用語resは、用語aes(アンチセンス増強配列)と互換的に、本明細書では用いられてもよい。
【0028】
「RNAi因子レベルを増強すること」は、トランスフェクション、
上方制御、または技術分野で知られる他の手段により達成可能なことは、当業者により理解されるであろう。
【0029】
用語「アンチセンス核酸分子」は、本発明の関係において用いられる場合、RNAまたはDNAを包含し、そして特定の標的RNA転写産物またはその遺伝子に関係する領域(類)含むことが、意図される。また、逆向き反復、センスRNAなどを含む、アンチセンス配列を生じる分子を含むことも意図される。
用語「当該アンチセンス核酸分子が当該遺伝子の発現を阻害する程度までに当該RNAi因子が増加することを可能にする条件」は、有効であるのに十分高いが、当該細胞を害するほどには高くない、遺伝子発現の阻害の概念を含むことが意図される。その有効濃度範囲は、技術分野で知られる日常的な方法論を用いて決定可能である。
【0030】
「患者(subject)」に対する基準は、ヒト、動物(マウス)、植物、または他の生物形態を含むことが意図される。
「細胞」に対する基準は、酵母、哺乳動物、植物などのような、真核生物細胞を包含することが意図される。
【0031】
用語「障害(disorder)」は、ウイルス感染(HIV,HPV,など)、癌、自己免疫疾患および他の慢性および急性疾患を含むことが、理解されるだろう。
用語「表現型」は、本発明の関係において用いられる場合、細胞染色、形態学、成長、および同じような特徴を含むことが意図される。
【0032】
好ましい実施態様の説明
in vivoでアンチセンスRNA技術の特徴を研究するためにlacZ分裂酵母モデルを用いて(1−4)、標的遺伝子抑制の程度はアンチセンスRNAのレベルに依存性であることが明らかにされている(図2A)(1)。このモデルを開発する過程で、アンチセンスRNAの同一プールの存在下で、前記lacZ標的mRNAの定常状態レベルを20倍に増加させることにより、そのアンチセンス媒介抑制は、維持されるだけでなく、増強されることが、意外にも見い出された(図2B)。この効果は前記標的mRNAに非依存性であったことを証明するために、フレームシフト変異を含むlacZ遺伝子(βガラクトシダーゼ酵素を翻訳することを不能にする)を、アンチセンス発現株で共発現させた。やはり、lacZ阻害の付加的促進が観察された(図2B)。これらの観察は、付加的dsRNAの潜在的形成および結果としての遺伝子サイレンシングの促進と符合する。それらはまた、当該dsRNA媒介遺伝子サイレンシングが、本系で用量依存的なことを示している。dsRNAが分裂酵母における標的遺伝子阻害で鍵成分であったことをさらに示すために、lacZ標的mRNAの存在下で2.5kbの内部相補性をもつlacZ逆向き反復を発現させることによりdsRNAを産生した。この構築体の発現も、lacZ発現株におけるβガラクトシダーゼ活性を、完全長アンチセンスRNAに対するのと同様なレベルまで低減させた(図2C)。全体としてこれらのデータは、dsRNAの潜在的形成、しかし必ずしもアンチセンスRNA:標的mRNAハイブリッドではない、を増加させると、S.pombeにおける標的遺伝子発現の効率的干渉をもたらすことを示唆した。
【0033】
分裂酵母におけるもう1つの標的配列を特異的に干渉するためのdsRNAの能力をテストするため、組込みc−myc−lacZ融合カセットを含む株でセンスおよびアンチセンスc−myc配列を共発現させた(3)。ヒトc−myc遺伝子のエキソン2からの792塩基対(bp)アンチセンスc−myc断片は、当該c−myc−lacZ融合標的株内のβガラクトシダーゼ活性を47%抑制することが、以前見い出された(3)。βガラクトシダーゼ検定は、前記標的株中の当該アンチセンスおよびセンスc−myc構築体の共発現が、当該アンチセンスc−mycベクター単独と比較して、c−myc抑制を増強することを、証明した(図2D)。前記アンチセンスおよびセンスc−myc構築体で、lacZ標的のみを発現する株の形質転換は、βガラクトシダーゼ活性の下方制御を全くもたらさなかったことから、dsRNAの作用は配列特異的であることを示した(図2D)。上記の観察のすべて、ならびに、追加のdsRNAに応答した標的mRNAレベルの低減(データ不掲示)は、RNAiに随伴する特徴に一致する。これは、酵母におけるdsRNA媒介遺伝子調節の最初の事例であり、そしてゼブラフィッシュ以外のすべての他の生物でのRNAiと異なり、細胞内dsRNAの濃度に依存性のようである。生物間のRNAi効力における変動は、RNAi経路のいくつかの成分の欠如または低発現またはRNAi阻害物質の存在によると思われる。本出願人ら(we)は、RNAiに関与する因子類の同定のためのこの遺伝的モデルを、このたびさらに開発した。
【0034】
何ら特定の機構に拘束されることを願わずに、RNAi中の標的mRNAの転写後分解を媒介する多タンパク質複合体が存在する可能性がある。当該RNAi現象に関与するいくつかの遺伝子が、パンカビ属(Neurospora)および線虫類(nematodes)における遺伝的スクリーンを通じて明らかにされている。これらの遺伝子は、RNA依存性RNAポリメラーゼ(qde−1,ego−1),RecQ DNAヘリカーゼ(qde−3),RNアーゼD相同体(mut−7),および推定翻訳開始因子(rde−1,qde−2)を含む。遺伝子類mut−2,rde−2,rde−4,およびrde−7も、RNAiの開始または維持のいずれかに関与することが明らかにされている。加えて、ショウジョウバエ(Drosophila)無細胞検定は、RNAiが、標的されたmRNAのヌクレアーゼ分解により媒介されるのに対して、21−25ntRNA分子種が、特定の転写後遺伝子干渉に対して内在性らしいことを、示した。RNAiは、dsRNAの鎖解離に必要と思われるATPに依存性であることも、明らかにされている。しかし、前記RNAi経路における提唱された多タンパク質複合体で見つからない成分は、恐らくRNAヘリカーゼである。
【0035】
上記の分裂酵母におけるdsRNA媒介遺伝子サイレンシングの用量依存性は、RNAiに関与する遺伝子の同定に、過剰発現戦略を用いることを可能にした。突然変異誘発戦略に比較して、過剰発現は、もしそうでなければ細胞生存に不可欠な遺伝子の同定を可能にしている。また、RNAi活性を量的に増強または低減する細胞因子類の決定も可能である。本モデルにおいてRNAi活性の媒介でテストされた最初の遺伝子は、nmt1転写因子thi1であった。この遺伝子は、分裂酵母で過剰発現されると、nmt1発現を特異的に上方制御することが明らかにされている。アンチセンスRNA媒介遺伝子抑制はS.pombeで用量依存性であることを、本出願人らが以前明らかにしているように(1)、thi1の過剰発現は、nmt1駆動アンチセンスlacZRNAの産生増加およびそれによる標的遺伝子抑制の増強をもたらすであろうと、仮定された。thi1オープンリーディングフレームをPCR増幅し、そしてBamHI断片としてpREP4中へサブクローン化した。このベクターは次いで、RB3−2/pGT2中へ形質転換し、そしてβガラクトシダーゼ検定を実施した。予測されたように、アンチセンスRNAだけを発現する株に比較して、lacZ抑制が増強された(図7)。この結果は、分裂酵母におけるdsRNA媒介遺伝子抑制の強さに影響する宿主コード因子類が存在することを示し、そしてまた当該過剰発現戦略を有効とした。
【0036】
研究された2番目の遺伝子は、S.pombeのATP依存性RNAヘリカーゼ遺伝子、ded1であった。Ded1は、不妊性のサプレッサー、チェックポイントおよびストレス応答のサプレッサー、および一般的翻訳開始因子として既に特徴づけられた必須遺伝子である。dsRNA媒介遺伝子調節の現行モデルに従えば、ATP依存性RNAヘリカーゼは、標的mRNAを特異的に分解する短い一本鎖RNA断片の生成のために、dsRNA依存性RNAポリメラーゼと共に、必要らしい。それ故、分裂酵母におけるこの遺伝子の過剰発現は、dsRNAの巻き戻しを促進することによって、dsRNA媒介遺伝子サイレンシングの効率を増強可能と論証された。前記アンチセンスlacZベクターとded1ベクターとの共発現は、前記アンチセンス発現株に比較して、さらに50%もdsRNA媒介lacZ阻害を顕著に増強した(図6A)。当該アンチセンスlacZベクターの不在下にded1が過剰発現された場合、βガラクトシダーゼ活性は対照株と同程度だったことは、その効果がdsRNAの存在に依存的であること示した(図6A)。当該ded1ベクターは、完全長アンチセンス遺伝子より効果が低いことが既に明らかにされている短いアンチセンスlacZベクター(16)と共に、共発現も行われた。やはり、ded1の過剰発現は、dsRNA媒介lacZ阻害を促進した(図6B)。このように、ATP依存性RNAヘリカーゼの過剰発現は、分裂酵母におけるRNAiを大いに増強することが明らかにされた。
【0037】
dsRNA分裂酵母モデルにおいてcDNAライブラリーを過剰発現させることにより、本出願人らは、前記RNAi経路で役目をもつ可能性がある4つの新規遺伝子を同定した。同定された既知遺伝子はいずれも必須であり、DNA,RNAまたは核酸結合タンパク質と自然会合しており、RNAi細胞因子の予測と一致している。加えて、当該3つの既知cDNAのうちの2つは、翻訳の過程に関与するタンパク質をコードした。これらの知見は、ATP依存性RNAヘリカーゼの本出願人らの以前の同定(RaponiおよびArndt,投稿中)および、RNAiにおける翻訳開始因子の関与およびリボソーム画分とのリボヌクレアーゼ活性の共精製の報告類と共に、これは、RNAiが機能する1つの部位らしいことを示唆している。あるいは、DNAヘリカーゼ類および翻訳成分類のような種々のタンパク質が当該RNAi機械装置の部分として同定されたことは、特定の細胞タンパク質類が1つ以上の多タンパク質複合体中へ補給される可能性を意味している。後者の条件下で、これらの特定タンパク質の過剰発現は、dsRNAを認識し、そして標的遺伝子抑制を媒介するRNAi複合体の生成をもたらす可能性がある。これらのタンパク質のいくつかは、RNAiにおいて速度制限または速度決定性であると思われ、これらの因子の補足を通じてのみ、RNAiにおけるそれらの役割が明らかにされる。RNAi多タンパク質複合体(類)中の以前に同定されたコア(core)タンパク類に加えて、EF Tu,L7a,sna41およびres1のようなさらなる因子類も、dsRNA媒介遺伝子抑制における役割について編入される可能性があることが、何ら特定の機構に拘束されることを願わずに、提議される。
【0038】
上記の過剰発現戦略は、RNAiにおいて役割をもつ必須遺伝子類を同定することにより、突然変異誘発に伴ういくつかの限界を克服する。加えて、この戦略は、in vivoにおけるRNAiの効力を修飾する細胞因子類の単離を可能にすることにより、これらの他のシステムを補完する。RNAiのこれらのモジュレーターの役割は、多様と思われ、当該dsRNAの認識および増幅、低分子21−25nt dsRNAの標的mRNAへの送達、アンチセンスおよび標的mRNA鎖間の会合、およびRNAi複合体形成を含む。あるいは、これらのモジュレーターは、RNAiの速度または、細胞型内の、あるいは異なる型の転写後遺伝子サイレンシングのための異なる複合体の形成を、制御する可能性がある。特定のRNAiモジュレーター類の過剰発現が分裂酵母においてdsRNA媒介遺伝子調節を増強したという事実は、同様なアプローチが、他の生物におけるRNAiモジュレーター類を同定するのに使用可能なことを示す。加えて、共抑制、クエリングおよびアンチセンスRNAを含む異なる型の転写後遺伝子サイレンシングと共に、これらの因子の共発現は、これらの方法の効能を増強する1つの方途と考えられる。哺乳動物細胞および組織に対して、あるいはこの型の調節に多少とも反抗的であった遺伝子に対して、RNAiを適用するためには、このことは特に大切と思われる。
【0039】
本発明は、ATP依存性RNAヘリカーゼの内在性関与を、RNAiにおける鍵成分として、初めて証明している。さらに、その過剰発現は、本系におけるRNAi活性の増加をもたらすので、それは律速的な可能性がある。当該ded1コード化RNAヘリカーゼのこの能力は、ATPアーゼ,RNAヘリカーゼおよびRNA結合活性のそれら3つのコアドメインとともに、ヘリカーゼ類のDEADボックスファミリーのメンバーとしてのその活性と符合する。これらは、当該酵素が、以下のように遺伝子抑制を増強できるようにする可能性がある:(i)解離的機構では、それは、RNA依存性RNAポリメラーゼと共に、cDNAを産生するためのdsRNAの巻き戻しか、あるいは相同性転写産物への結合を増強するための断片化dsRNAの鎖分離か、のいずれかを媒介する可能性がある、および/または(ii)会合機構では、それは、短いdsRNAのセンス鎖と標的mRNAとのATP依存性交換を触媒する可能性がある。RNAiを示す他の生物におけるded1相同体の存在は、当該RNAi機械装置における本成分の全般的関与をさらに支持している。
【0040】
本発明はまた、RNAiに関与する必須細胞因子類を迅速に同定するために、S.pombeに基づく新規のそして定量性の遺伝的システムを初めて提供する。本モデルの使用は、効率的なRNAi活性への極めて重要な貢献体として、RNAヘリカーゼ活性を証明することを可能にし、そしてEF Tu,L7a,sna41および未同定遺伝子res1を含む新規RNAi因子類を単離した。本発明はまた、遺伝子サイレンシングが、その種のRNAi因子類の併存発現により増強される可能性があることも、証明している。
本発明はここで、本発明のいくつかの好ましい実施態様の非限定的実施例に関して、より詳しく説明される。
【0041】
【実施例】
実施例1:本発明を例示するために使われる材料および方法
S.pommbe培地および操作
すべての酵母株は標準YESおよびEMM培地(6)で維持した。nmt1転写の抑制は、EMM培地にチアミンを4μMの終濃度に添加することにより、達成した(7)。酵母細胞はエレクトロポレーションによりプラスミドDNAで形質転換し(8)、そして安定な組込み体は既述のように同定した(6)。ガラスビーズ処置(9)を使ってゲノムDNAを単離し、それをサザン分析およびPCR診断に用いた。全RNAは既述のように抽出した(10)。
【0042】
S.pommbe株およびプラスミド構築
低発現lacZ株,KC4−6(h-,ura4::SV40−lacZ,leu1−32)の構築は既述されている(2)。より高いレベルのβガラクトシダーゼを発現する株RB3−2(h-,ura4::adh1−lacZ,leu1−32)も既述されている(1)。c−myc:lacZ融合を含む標的株は既述されている(3)。
【0043】
長いlacZアンチセンスを含むエピソームプラスミドpGT2および対応する対照プラスミド類の構築は、記載されている(2)。プラスミドpREP4−Asは、pGT2中に含まれるlacZ BamHI断片をプラスミドpREP4中へサブクローニングすることにより、作製した(11)。pREP4は、S.cerevisiae LEU2遺伝子がS.pombe ura4選択マーカーで置換されていることを除いて、pREP1と同一である。エピソーム的に発現されるアンチセンスlacZの定常状態レベルを減少させるために、pGT2からのlacZ BamHI断片をそれぞれpREP42およびpREP82中へサブクローニングすることにより、プラスミドpREP42−AsおよびpREP82−Asを構築した。これらのプラスミドは、nmt1プロモーターのTATAボックス中に突然変異をもつpREP4の誘導体である(12)。不具の(crippled)lacZベクターpGT62は、pGT2のClaI部位を末端充填し、そして再連結することにより作製した(2)。このフレームシフト化断片は、次いで、pREP4のBamHI部位中へサブクローン化し、プラスミドpM54−3を作製した。
【0044】
lacZパンハンドル(panhandle)組込みベクターpM30−8は、pL121−14を作製するために、自己相補的リンカー5´CCGGGCGGCCGC3´を用い、NotI部位をpRIP1/sのXmaI部位へまず導入して(11)、産生した。次いで、そのフレームシフト化lacZ遺伝子の5´端の2.5kb配列(2)をPCR増幅し、フォワード(forward)プライマー5´ATGCGGCCGCAATTCCCGGGGATCGAAAGA3´およびリバース(reverse)プライマー5´ATGCGGCCGCAATGGGGTCGCTTCACTTA3´を用い、それをNotI末端に与えた。この産物は、TAクローニングキット(TOPO:Invitrogen,サンディエゴ、カリフォルニア、米国)を用いてクローン化し、そして次に、アンチセンス配向でpL121−14のNotI部位中へサブクローン化した。当該組込みベクターを、sup3−5/ade6−704相補系(13)を用いることにより、単一コピーで標的株中へ導入した。次いで、当該完全長フレームシフト化lacZ断片を、前記2.5kbアンチセンス断片の上流にセンス配向で、本ベクターのBamHI部位中へ導入し、pM30−8を作製した。本ベクターのエピソーム版(pM53−1)は、Pst1 sup3−5断片を除き、そしてEcoRI断片のような自己複製配列を導入することにより作製した(11)。当該パンハンドル構築体がin vivoでdsRNAを形成する能力をテストするため、前記フレームシフト化lacZ断片を、ベクター類pM54−3およびpM53−1中の機能性lacZ断片と置換して、それぞれベクター類pM85−1およびpM81−2を作製した。lacZパンハンドル転写産物を形成できないベクターpM91−1は、pM81−2から2.5kbNotI lacZ断片を除き、そしてそれをセンス配向に再導入することにより、作製した。
【0045】
c−mycアンチセンス構築体pCM−17の作製は、別途記載されている(3)。pCM−17からの792bp BglII c−myc断片を、センス配向でpREP4のBamHI部位中へサブクローン化し、pN12−1を作製した。
ded1およびthi1オープンリーディングフレーム類は、分裂酵母ゲノムDNA(1913株)から増幅した。ded1を増殖し、フォワードプライマー5´ATGGGATCCCAACCAAACACTTCAAACTCAG3´およびリバースプライマー5´ATGGGATCCTCAGAAGCCTGTGCATAACAC3´を用いて、それをBamHI末端に与えた。thi1を増殖し、フォワードプライマー5´ATGAGATCTGTGGTTGGTATTCTAGAGAGA3´およびリバースプライマー5´ATGAGATCTAACAAAGACCTGCAAAAAACC3´を用いて、それをBglII末端に与えた。PCR産物は精製し(Qiagen PCR精製キット)、BamHIまたはBglIIのいずれかで消化し、ゲル精製し(Qiagen)、そしてセンス配向でpREP4のBamHI部位中へサブクローン化した。
【0046】
サザンおよびノーザン分析
核酸電気泳動および膜転移は、記載(14)のように実施した。サザンおよびノーザンブロットは、製造会社の説明書(Clontech Laboratories)に従って、ExpressHyb溶液を用いハイブリッド形成させた。DNAプローブ類は、Megaprime標識キット(Amersham)を用い32P標識した。プローブ類は、pI2−1からの960bp BamHI/ClaI lacZ断片(1),pGT113からの570bp HindIII/EcoRI ura4−3´断片(15)、およびpRIP1/sからの2.2kb PstI/SacI nmt1断片を、含んでいた。放射性シグナルは、オートラジオグラフィーにより検出し、りん光画像分析により定量した(ImageQuant;Molecular Dynamics).
【0047】
プラスミド分布分析
RB3−2株のプラスミド共形質転換体は、選択的条件下で1−2x107細胞/mlの細胞密度まで増殖させた。各培養の段階希釈を行い、細胞は単一コロニーについて3回、YES,EMM,EMM+ロイシン、およびEMM+ウラシル寒天培地のそれぞれの上にプレートした。YES上に増殖したコロニーの数は生細胞の総数として数え、一方、EMM上に増殖しているコロニーは、ura4含有(pREP4基盤)およびLEU2含有(pREP1基盤)プラスミドの両方を含むサンプル集団中の細胞を表した。ura4含有プラスミドまたはLEU2含有プラスミドのいずれか一方を含む細胞は、それぞれEMM+ロイシンおよびEMM+ウラシルプレートから同定した。選択培地上に増殖させたコロニーの数の、生コロニーの総数の対する比を、プラスミドを含んだ、選択下で増殖させた、集団中の細胞の比率の量的尺度として使用した。
【0048】
βガラクトシダーゼ検定法
当該lacZ遺伝子コード化産物であるβガラクトシダーゼの発現を、既述のように(Raponiら、2000)細胞透過性化プロトコルを用いて定量した。半定量オーバーレイ検定法も、酵母形質転換体の迅速スクリーニングに採用した(3)。
【0049】
アンチセンスRNA効力を変えるS.pombe cDNAクローン類の単離
S.pombe cDNAライブラリーを、Bruce EdgarおよびChris Norbury(5)によりpREP3Xho中に最初に構築した。当該ベクターpREP3Xhoは、LEU2マーカーを含むpREP3由来であり、そして挿入体類はnmt1プロモーターの制御下にある(11)。全部で5μgのライブラリーDNAを、エピソームアンチセンスlacZベクターpREP4−lacZASを含むRB3−2株中へ形質転換し、対数中期までEMM液体培地中で増殖させた。次いで形質転換体は、EMM固形培地上にプレートし、そして30℃で3日間増殖させた。コロニーは、0.5Mリン酸ナトリウム、0.5%アガロース、2%ジメチルホルムアミド,0.01%SDS,および500μg/ml X−GAL(Progen,オーストラリア)を含む培地でオーバーレイした。次いで、プレートは37℃で3時間インキュベートし、目的のコロニーを回収して、βガラクトシダーゼ活性を検定した。
【0050】
プラスミド分離
制限ウラシルおよび1mg/ml 5−フルオロオロト酸を含むEMM上に、株をプレートした(6)。次いで株を、選択および非選択培地上にレプリカプレートした。選択培地上で増殖しなかったコロニーは、ura4含有アンチセンスプラスミドを消失したとものと同定された。pREP基盤プラスミドの有糸分裂安定性を決定するため、出願人らは、既述のプラスミド分離法を用いた(16)。この方法は、選択培地で増殖させた細胞の30%までが、常在性プラスミドを含まないことを、示した。
【0051】
実施例2:アンチセンス効力への標的mRNAおよびアンチセンスRNAの定常状態レベルの影響
アンチセンス媒介遺伝子抑制における標的mRNA定常状態レベルの役割を明らかにするために、本出願人らは、弱および強両構成的プロモーターの制御下で、lacZ標的遺伝子類を調節するための長いlacZアンチセンスRNA(2)の能力を、検討した。低レベル発現株KC4−6は、染色体III中のura4遺伝子座に組込まれているSV40初期プロモーターにより駆動されるlacZ遺伝子を含んでいた(図1A;(2))。高レベルlacZ発現株RB3−2は、強分裂酵母adh1プロモーターおよびura4遺伝子からの3´プロセシングシグナルの制御下に当該lacZ遺伝子を置き、そしてこの発現カセットを前記ura4遺伝子座に組込むことによって、構築した(図1B;(1))。両株の特性解明は、RB3−2がKC4−6より20倍も多くlacZmRNAを発現し、一方、βガラクトシダーゼに約40倍の増加も検出された(データ不掲示)。両株は、lacZアンチセンス遺伝子含有プラスミド(pGT2)およびその対応センス対照プラスミド(pGT62)で形質転換した。βガラクトシダーゼ検定は、当該アンチセンスRNAが、KC4−6でβガラクトシダーゼ活性を45%抑制したのに対し、同じRNAが、RB3−2でβガラクトシダーゼ活性を52%低減させたことを、示した(図2B)。lacZの不具版を発現する対照プラスミドpGT62で形質転換した場合、いずれの株においてもβガラクトシダーゼ活性の低減は全く見られなかった。これらの結果は、RB3−2において当該lacZ標的mRNAの定常状態レベルが20倍増加したにもかかわらず、アンチセンス媒介下方制御の効力は、維持されるだけでなく増強されることを、示した。RB3−2株で証明された遺伝子抑制の増加は、当該lacZ標的遺伝子の小領域を標的したアンチセンス分子を用いた場合にも見られたが、それほど顕著ではなかった。これらのデータは、標的mRNAにおける増加が、標的遺伝子抑制の増強をもたらすことがあることを、示唆した。
【0052】
安定に組込まれたアンチセンスlacZ遺伝子は用量依存的に作用し、またアンチセンスRNAの定常状態レベルは、ゲノム位置効果および導入遺伝子コピー数に依存することが、既に証明されている(1)。ここで、低lacZ発現標的株KC4−6および高lacZ発現標的株RB3−2の両方において、エピソーム的に発現されたアンチセンスRNAの定常状態レベルの役割を検討した。それぞれが、nmt1プロモーターの制御下のlacZアンチセンス遺伝子を含むが、異なる選択マーカーを含む、プラスミドpGT2およびpREP4−Asで、KC4−6およびRB3−2を共形質転換することにより、lacZアンチセンスRNAの発現を増加させた。アンチセンスRNAの定常状態レベルを減少させるために、プラスミドpREP42−AsおよびpREP82−ASを採用した。これらのベクター中のnmt1プロモーターはTATAボックス配列中に欠失を含み、それらは、転写のレベルに影響するが、転写開始またはチアミン抑制性の部位には何のインパクトも与えない(12)。異なるアンチセンス遺伝子含有プラスミドのそれぞれを、適切な場合には、栄養要求性を補完するために対照プラスミドで共形質転換した。これにより、それぞれが、同じlacZアンチセンス遺伝子を含むが、異なるプロモーター能力をもつ、RB3−2およびKC4−6両方の一群の共形質転換体が得られた。各共形質転換体は、アンチセンスRNA定常状態レベルおよびβガラクトシダーゼ活性について、分析された。表1は、両株共に、標的抑制の程度が、アンチセンスlacZ RNA発現の増加と共に増強することを、示す。
【0053】
【表1】
【0054】
これらのデータは、アンチセンスRNA媒介遺伝子阻害が、S.pombeで用量依存性であるという既報(1)と合致する。しかし、各共形質転換体について、βガラクトシダーゼ抑制の程度は、低lacZ発現株KC4−6より、高lacZ発現株RB3−2で10−15%大きく、低レベルの標的mRNAがアンチセンス効力を制限する可能性があることを、ここでも証明した。
【0055】
実施例3: アンチセンスRNA媒介標的遺伝子抑制へのセンスRNA増加の影響
遺伝子抑制の増加が、アンチセンスRNA:標的mRNAハイブリッドまたはアンチセンスRNA:センスRNAハイブリッドの形成によるか否かを決定するために、機能性βガラクトシダーゼへ翻訳不能なlacZ版を、lacZアンチセンス遺伝子を発現する株で共発現させた。もし当該遺伝子発現経路の阻害のために、アンチセンスRNAが標的mRNAにハイブリッド形成することが必要であれば、その場合、当該センスRNAの過剰発現が、利用可能なアンチセンス分子に対する標的と競合するはずで、その結果、lacZ遺伝子抑制に減少が起るはずである。最初に、アンチセンスおよびセンス両lacZベクターを、別々の標的株に単一コピーで組込み、次いで相互に交雑させた。当該アンチセンス遺伝子だけを含む株では、βガラクトシダーゼ活性は約40%低減したが(図3;(1))、センスlacZだけを発現する株では低減はなかった(データ不掲示)。しかし、両相補的転写産物を発現する株(M62−1)では、βガラクトシダーゼ活性は50%低減した(図3)。これらの結果は、アンチセンスRNAの存在下でセンスRNAの細胞内濃度を増加すること、したがって、さらに多くのdsRNAを潜在的に生成させることは、標的遺伝子抑制を促進することを、示唆している。
【0056】
細胞内dsRNAの潜在的形成をさらに増加させるため、エピソームのセンスlacZプラスミド(pM54−3;図2B)を、エピソームのアンチセンスlacZプラスミドpGT2で、標的株RB3−2中へ共形質転換した。これらの配列は両方共、強条件nmt1プロモーターにより発現され、そしてRNA分析は、各転写産物が、チアミンの不在下で増殖した時に、高レベルで発現されていたことを明らかにした(図4A)。両RNAがRB3−2中で共発現された場合、当該標的lacZは、前記アンチセンスプラスミドだけを発現する株での50%に比べて、65%抑制された(図2B)。ノーザン分析は、エピソーム的に発現されたnmt1駆動導入遺伝子類の全相対的レベルが、いずれかのベクターが単独で発現された場合より、約60%高いことを、証明した(図4A)。これらの相補的RNA転写産物の発現は、単一コピー組込み体と比べて、高レベルにあるが、追加の15%抑制が観察されたに過ぎなかった。
【0057】
より高いレベルの標的遺伝子抑制の欠如に対する1つの説明は、プラスミド分離(segregation)である。S.pommbeは不対称分離を受けるため、その結果、有糸分裂は、分離するプラスミドを欠く娘細胞を産生する(17)。それ故、全集団で見られた前記65%抑制レベルを、ura4基盤およびLEU2基盤プラスミドを含む細胞だけについて補正した場合、抑制のレベルはほぼ100%に近づく(データ不掲示)。全体として、これらのデータは、必ずしもアンチセンスRNA:標的mRNAハイブリッドでなくてもよい、dsRNAの潜在的形成を増加させることが、S.pommbeにおける標的遺伝子発現の効率的干渉に必要なことを、示唆している。しかし、植物および線虫で見られるRNAiの現象と違い、分裂酵母で証明されたdsRNA媒介遺伝子抑制は、細胞内dsRNAの濃度に依存的であるようで、あるいは強力な遺伝子サイレンシングを誘発するためには、閾値レベルのdsRNAが必要である。
【0058】
実施例4: lacZ遺伝子発現へのlacZ逆向き反復の影響
分裂酵母における遺伝子発現を阻害するdsRNAの能力をさらに検討するため、本出願人らは、2.5kb逆向き反復をもつ完全長3.5kbフレームシフト化lacZ配列を含むベクターを、作製した。この構築体は、おそらく強い分子内RNA二重鎖を形成するはずの、2.5kbの自己相補性をもつ長さ約7kbの転写産物を生成する。この遺伝子は、単一コピーで分裂酵母中へ先ず組込まれ、そして次に、RB3−2株と交雑された。得られた株は、当該単一コピー逆向き反復遺伝子および標的lacZを含み、当該逆向き反復の転写が活性化された時、βガラクトシダーゼ活性の低減を全く示さなかった。サザン分析は、当該カセットが無傷であること(データ不掲示)を、確認し、一方、RNA分析は、前記7kb転写産物が生成されていたが、エピソーム的に発現されたアンチセンスlacZより10分の1ほどに少ないことを、示した(図4AおよびB)。当該逆向き反復RNAの定常状態レベルを増加するため、本出願人らは、このカセットを含むエピソーム性プラスミドpM53−1を作製した。RNA分析は、このベクターがエピソーム的に発現されたアンチセンスlacZと同じようなレベルに発現されることを、証明した(図4A)。RB3−2中で発現された場合、pM53−1は、βガラクトシダーゼ活性を40%阻害したが(図2C)、一方、培養培地へのチアミンの添加は、βガラクトシダーゼ活性を対照レベルに戻した。
【0059】
遺伝子阻害がRNA二重鎖を形成するこの構築体によったことを確認するために、dsRNAに対するin vivo検定法を開発した。この目的のため、lacZ単独(pM85−1),lacZ逆向き反復(pM81−2),およびセンス配向で両配列をもつlacZ反復(pM91−1)を含め、機能性lacZ配列を含む一連のベクターを作製した(図5A)。次いでこれらのベクターは組込み標的配列を欠く株(NCYC2037;h+,ura4−D18)中に導入し、そして得られた形質転換体をX−GAL含有アガロースでオーバーレイした。対照ベクター類を含む両株は、高レベルのβガラクトシダーゼを生成したが、一方、lacZ逆向き反復を発現する株は、生成しなかった(図5B)。いずれの場合にも、ノーザン分析は、株が当該導入遺伝子を発現していることを、証明した。これらの結果は、βガラクトシダーゼを産生するために、前記逆向き反復RNAが、効率的に翻訳されなかったことを示しており、強い分子内ヘアピン構造の形成による可能性が非常に高い。まとめると、これらの結果は、分子内ハイブリッド形成によりdsRNAを形成する能力をもつ構築体が、高レベルで発現されると、標的遺伝子発現を干渉することを明らかにしており、dsRNAは、分裂酵母で、用量依存的に標的遺伝子抑制を媒介することを、やはり示している。
【0060】
実施例5: 分裂酵母におけるdsRNA媒介遺伝子サイレンシングの遺伝子特異性
分裂酵母においてdsRNAが、他の標的配列を特異的に干渉する能力をテストするため、センスおよびアンチセンスc−myc配列を、組込みc−myc−lacZ融合カセットを含む株で共発現させた(図1D;(3))。ヒトc−myc遺伝子のエキソン2からの792bpアンチセンスc−myc断片(CM−17と命名)は、c−myc−lacZ融合標的株(AML1)内でβガラクトシダーゼ活性を47%抑制することが、既に見い出されている(3)。CM−17は次にセンス配向でpREP4中へサブクローン化し、pN12−1を作製した。当該アンチセンスc−mycベクター(pCM−17)および当該センスc−mycベクターは、独立にまた一緒に、AML1中へ形質転換した。βガラクトシダーゼ検定は、当該アンチセンスおよびセンス構築体の共発現が、当該アンチセンスc−mycベクター単独に比べて、c−myc抑制を付加的に13%増強することを証明した(図2D)。当該アンチセンスおよびセンスc−myc構築体によるRB3−2の形質転換は、βガラクトシダーゼ活性の下方制御を全くもたらさなかったことから、dsRNAの作用は遺伝子特異的であることが示された(図2D)。これらの結果は、dsRNAが、ヒト起源のものを含め分裂酵母での複数の標的を特異的に干渉できることを、証明している。
【0061】
実施例6: 翻訳因子の過剰発現は分裂酵母におけるRNAiを増強することがある
上記の分裂酵母におけるdsRNA媒介遺伝子サイレンシングの用量依存性は、RNAiに関与する遺伝子を同定するための、過剰発現戦略の使用を可能にした。突然変異誘発戦略に比べて、過剰発現は、別のやり方では細胞生存に必須の遺伝子類の同定を可能にする。また、RNAi活性を量的に増強または低減する細胞因子類も決定可能である。本モデルでRNAi活性の媒介についてテストした最初の遺伝子は、S.pombe ATP依存性RNAヘリカーゼ遺伝子ded1であった。Ded1は、不妊性のサプレッサー、チェックポイントおよびストレス応答のサプレッサー、および一般的翻訳開始因子として従来特徴づけられた必須遺伝子である。dsRNA媒介遺伝子調節の現行モデルに従えば、ATP依存性RNAヘリカーゼは、標的mRNAを特異的に分解する短い一本鎖RNA断片の形成のために、dsRNA依存性RNAポリメラーゼと共に、必要らしい。それ故、本出願人らは、分裂酵母における本遺伝子の過剰発現は、dsRNAの巻き戻しを促進することによって、dsRNA媒介遺伝子サイレンシングの効率を増強可能と論証した。アンチセンスlacZベクターとded1ベクターとの共発現は、アンチセンス発現株に比較して、さらに50%もdsRNA媒介lacZ阻害を有意に増強した(図6A)。当該アンチセンスlacZベクターの不在下にded1が過剰発現された場合、βガラクトシダーゼ活性は対照株と同程度だったことは、その効果がdsRNAの存在に依存的であること示した(図6A)。当該ded1ベクターも、前記完全長アンチセンス遺伝子より効果が低いことが既に明らかにされている短いアンチセンスlacZベクターと共に、共発現された(2)。やはり、ded1の過剰発現は、dsRNA媒介lacZ阻害を促進した(図6B)。このように本出願人らは、ATP依存性RNAヘリカーゼの過剰発現が、分裂酵母におけるRNAiを大いに増強することを明らかにした。ATP依存性RNAヘリカーゼはRNAiにおける鍵成分であると最近示唆されてきたが、その内在的関与を証明したのは今回が初めてである。さらに、その過剰発現は、本系におけるRNAi活性の増加をもたらすので、それは明らかに律速的な可能性がある。当該ded1コード化RNAヘリカーゼのこの能力は、ATPアーゼ,RNAヘリカーゼおよびRNA結合活性のそれら3つのコアドメインとともに、ヘリカーゼ類のDEADボックスファミリーのメンバーとしてのその活性と符合する。これらは、当該酵素が、以下のように遺伝子抑制を増強できるようにすると、考えられる:(a)解離的機構では、それは、RNA依存性RNAポリメラーゼと共に、cDNAを産生するためのdsRNAの巻き戻しか、あるいは相同性転写産物への結合を増強するため断片化dsRNAの鎖分離か、のいずれかを媒介する可能性がある、および/または(b)会合機構では、それは、短いdsRNAのセンス鎖と標的mRNAとのATP依存性交換を触媒する可能性がある。RNAiを示す他の生物におけるded1相同体の存在は、当該RNAi機械装置における本成分の全般的関与をさらに支持している。
【0062】
実施例7: 転写因子の過剰発現は分裂酵母におけるRNAiを増強することがある
【0063】
検討された2番目の遺伝子はnmt1転写因子thi1であった。この遺伝子は、分裂酵母で過剰発現されると、nmt1を特異的に上方制御することが明らかにされている。アンチセンスRNA媒介遺伝子抑制はS.pombeで用量依存性であることを、本出願人らが以前明らかにしているように(1)、thi1の過剰発現は、nmt1駆動アンチセンスlacZ RNAの産生増加およびそれによる標的遺伝子抑制の増強をもたらすであろうと、仮定された。当該thi1オープンリーディングフレームをPCR増幅し、そしてBamHI断片としてpREP4中へサブクローン化した。このベクターは次いで、RB3−2/pGT2中へ形質転換し、そしてβガラクトシダーゼ検定を実施した。予測されたように、アンチセンスRNAを単独に発現する株に比較して、lacZ抑制が増強された(図7)。この結果は、分裂酵母におけるdsRNA媒介遺伝子抑制の効力を調整する宿主コード因子類が存在することを示し、そしてまた当該過剰発現戦略を実証した。
【0064】
実施例8: 新規RNAi調整因子類のスクリーニング
アンチセンスlacZ発現株における分裂酵母cDNAライブラリー(5)の過剰発現は、βガラクトシダーゼ活性が、アンチセンスRNA発現株単独で証明されたものより有意に低減された、一連の形質転換体を明らかにした。当該スクリーニング戦略を図8に示す。形質変換体は、選択プレート上で増殖させ、X−GAL含有培地でオーバーレイし、半定量的仕方で視覚的に分析可能な青色の表現型を作製した(図9A)(3)。スクリーンした12,000の形質転換体から、バックグラウンドの形質転換体と比較して、48が低減した青色表現型をもつと最初に同定された。これらのうち、25が、液体βガラクトシダーゼ検定により定量された場合、アンチセンスRNA媒介lacZ抑制で再現可能な増強を証明した(図9B)。観察された効果が前記cDNA挿入断片の転写によったことを証明するため、形質転換体をチアミンの存在下で増殖させた。nmt1プロモーターのこの抑制は、すべての形質転換体でβガラクトシダーゼ活性の対照レベルへの帰還をもたらした(図9B)。このことは、その抑制増強が、lacZレポーター突然変異のような他の遺伝的事象ではなく、cDNAの発現によることを、示した。当該作用がdsRNAの存在に依存していたか否かを決定するために、当該アンチセンスプラスミドを当該形質転換体から分離し、そして当該株について再度βガラクトシダーゼ活性を検定した。前記25形質転換体のうち9体は、親株で見られたβガラクトシダーゼのレベルへの帰還を証明したことから、当該作用はdsRNAに依存性であることを示した(図9B)。これらの形質転換体で発現されるcDNA類は、RNAi増強配列(res)と名付けられた。すべての形質転換体は、正常な増殖表現型を示したことから、当該常在性cDNA類は、当該細胞の一般的生物学に影響しなかったことを示した。アンチセンスRNAの不在下では、前記残り16形質転換体は、低減βガラクトシダーゼ活性を保留したことから、遺伝子サイレンシングの増強は、dsRNAの存在に依存性でなかったことが示された。このことは、これらの株におけるcDNAコード化タンパク質類が、転写のレベルまたは当該タンパク質の安定性あるいは機能で、lacZに影響していた可能性を、示唆している。
【0065】
前記ライブラリープラスミド類がaes含有株(res含有株ともいう)から回収され、そしてそれらのcDNA挿入断片の配列が決定された。BLASTNおよびBLASTP分析は、ミトコンドリア伸長因子Tu(EF Tu)のドメイン2および3の相同体としてクローンW18,W20,およびW30(aes2と命名)を同定した。EF Tuは、ペプチド伸長のためにリボソーム中のA部位へtRNAを輸送するのに一役買っている必須タンパク質である。形質転換体W21,W23,およびW32(aes3と命名)中のcDNAは、分裂酵母ORFsのスクリーンで同定された推定タンパク質に相同的であった。興味深いことに、当該cDNA挿入断片は、DNA複製に関与することが既に示されている分裂酵母遺伝子sna41の3´UTRのアンチセンス鎖にも相同的であった。したがって、aes3は、アンチセンスRNA活性の増強に1つ以上の機構で作動する可能性がある。形質転換体W47(aes4と命名)中のcDNAは、60Sリボソームサブユニットの成分であるリボソームタンパク質L7aのアンチセンス鎖に相同的であった。aesはまた、生物機能未知の小ORFを含んでいた。形質転換体W27およびW28(aes1と命名)中の挿入断片は、細胞増殖に必須の遺伝子のスクリーンで同定されたC.albicansからの推定タンパク質と相同性を共有した。これらのユニークな因子類を共発現するアンチセンスlacZ株中における遺伝子サイレンシング増強の正確なレベルを知るために、三次定量βガラクトシダーゼ検定を実施した(図9C)。この分析は、これらの因子が、アンチセンス抑制を50%まで増強することを示した。これらの結果は、cDNAライブラリーの過剰発現が、アンチセンスRNAにより媒介される抑制効果を拡大する新規補因子類を同定するための有効な方法であることを、証明した。
【0066】
aes1はC.albicansの仮定タンパク質(AJ390519)のアミノ酸4から202と43%の同一性を共有した。 aes2は翻訳伸長因子EF Tu(AL049769)のヌクレオチド10452から9484と99%の同一性を共有した。aes3は、D89239 S.pombe ORF(D89239)のヌクレオチド776から1145と94%の同一性を、そしてDNA複製因子sna41(AB001379)のアンチセンス鎖のヌクレオチド3246から2876と93%の同一性を、共有した。aes3はまた、その3´末端にGA反復配列の220ntストレッチも含有した。aes4は、リボソームタンパク質L7aのアンチセンス鎖(AJ001133)のヌクレオチド9678から8897と99%の同一性を、そしてリボソームタンパク質L4のアンチセンス鎖(AB005750)のヌクレオチド1365から584と99%の同一性を、共有した。括弧内の検索数字は、GeneBankデータベース中のアクセス番号を指す(GeneBankデータベースは、次のウエッブサイトからアクセスできる:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
【0067】
EF Tuは真核生物EF1αに類似しており、ペプチド伸長のためにリボソーム中のA部位へtRNAを輸送することにより作用する。EF1αは、アクチン結合、微小管切断、細胞形質転換、細胞老化、タンパク質ユビキチン化、およびタンパク質折りたたみを含む多様な細胞活動にも関係するとされている必須タンパク質である。EF Tu発現株の詳細な分析は、それが、アンチセンスRNA媒介lacZサイレンシングをさらに15%増強することを、示した(図9C)。dsRNAは、dsRNA特異的ヌクレアーゼにより21−25nt分子種へ断片化され、RNA依存性RNAポリメラーゼにより増幅され、そしてATP依存性RNAヘリカーゼにより解離されると、されている。次いでそれらの低分子アンチセンス断片は、RNAヌクレアーゼ媒介分解により、自由に相同性mRNAを攻撃する。会合機構は、短いdsRNAのセンス鎖と標的mRNAとのATP依存性交換を触媒する可能性があると、最近示唆されている。これは、断片化dsRNAのリボソームへの輸送を含む可能性があり、そこで、tRNA複合体と競合的に反応して、相補的アンチセンス鎖がmRNAに結合する。これは、当該dsRNAのアンチセンス鎖の標的mRNAとの会合を可能にするだろうが、それは、後者が構造的に露出された状態にあり、両者が翻訳を阻害し、リボヌクレアーゼ分解のために当該mRNAを標的にする場合である。何ら特定の作用機構に拘束されることを願わずに、EF Tuは、RNAi依存性の短いdsRNA分子種に結合することにより作用し、それらを当該作用部位へもたらす可能性がある。
【0068】
sna41によりコードされるタンパク質は、DNA複製に関与することが以前に示されている。sna41は、CDC45と相同性が低く、相補的配列の発現を容易にできるDNAヘリカーゼの性質をもつ可能性もある。当該アンチセンスプラスミドと標的DNA配列とは、分子間相補性により、異所的に対形成することも考えられる。そのような対形成は、RNA発現を阻害し、結果として細胞内dsRNAのレベルを低減することもありえる。同様に、逆向き反復DNA配列の分子内対形成も、RNA発現に干渉する可能性もある。DNAヘリカーゼ性質をもつタンパク質の過剰発現は、さらに多くのdsRNA生成を容易にし、それが今度はRNAi効果を増強することもありえる。さらに、CDC45変異体は、プラスミド分離の速度増加を示す。プラスミド損失がsna41の過剰発現により阻止されるならば、その時にはさらに多くのdsRNAが生成され、本系における、より有効なRNAiをもたらすと思われる。こうしてみると、通常はDNAおよび/またはRNA代謝および機能に関与する他のタンパク質も、RNAi調整および/または増強に一役買う可能性があると、予想するのもあながち不合理ではない。
【0069】
L7aタンパク質は60sリボソームサブユニットの一部である。何ら特定の作用機構に拘束されることを願わずに、このタンパク質の過剰発現によるRNAi増強は合理的であるが、それは短いdsRNA分子種がリボソームにおいて標的mRNAと鎖置換を受ける可能性があると仮定されるからである。当該L7aリボソームタンパク質は、i)dsRNAまたはその巻き戻された型の、リボソームのA部位へのドッキングを媒介すること、ii)アンチセンス鎖の標的mRNAとの会合を助けること、および/またはiii)dsRNAをリボソーム複合体へシャトルすること、によりRNAiで働く可能性もある。
上で言及されたaes因子類の代表的なヌクレオチド配列は、下記に提示され、そして配列番号1から4と同定される:
【0070】
【化1】
【0071】
【化2】
【0072】
【化3】
【0073】
【化4】
【0074】
実施例9: 新規RNAi因子類のアンチセンスRNAおよびdsRNA媒介遺伝子調節への影響
アンチセンスRNA、共抑制、およびdsRNA媒介干渉が同様な機構を共有する可能性を示唆するPTGSについての最近の研究によって、本出願人らは、aes因子の過剰発現も、dsRNA媒介調節を増強するか否かを、明らかにしたいと考えた。dsRNAが、本分裂酵母モデルで遺伝子抑制を媒介できることを証明したので、アンチセンス増強配列のdsRNA媒介調節への作用をテストした。この目的のために、前記aes2遺伝子を、lacZ標的遺伝子を含む酵母株中でlacZパンハンドル構築体と共発現させた。これらの条件下で、本形質転換体は、パンハンドルlacZ RNAのみを発現する形質転換体と比べると、βガラクトシダーゼ活性のさらに30%抑制を示した(図10参照)。この結果は、ミトコンドリア伸長因子EF Tuの2つのドメインをコードする当該aes2遺伝子が、アンチセンスRNA媒介遺伝子阻害だけでなく、dsRNA媒介の遺伝子阻害も促進することを示す。
【0075】
さらに、これら2つの形の調節は、lacZアンチセンスRNAの存在下でATP依存性RNAヘリカーゼded1を過剰発現すること、およびこのヘリカーゼが、対照株に比較してさらに50%遺伝子抑制を増強したことを示すことにより、関係づけられることが示された(実施例6)。ded1は活性および不活性の両方のアンチセンスプラスミドについてテストされ、そして遺伝子サイレンシングのded1増強は活性アンチセンスRNAのみに依存性であることが証明された(図11参照)。これは、不活性アンチセンスRNAとのRNA二重鎖形成の欠如、およびその結果としてのRNAヘリカーゼに対する基質の欠如、による可能性がある。
【0076】
本発明の方法は、一連のRNAi効力の証明に、遺伝子サイレンシングを増強または低減する新しい因子類の同定に、遺伝子発現の阻害または遺伝子発現のアンチセンス阻害に対する感受性の増加に、遺伝子発現の阻害または下方制御を必要とする障害の治療または予防に、役立つ。
本発明を、特定の実施例および好ましい実施態様に関して、説明したが、本明細書に記載の本発明の概念および精神から逸脱しない変更および修正も、本発明の範疇にあると考えるのは、当業者には明瞭であろう。
【0077】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、標的遺伝子およびアンチセンス断片。a,KC4−6株は低レベルのlacZ RNAを発現することを示す。当該lacZ発現カセットは、染色体III上のura4遺伝子座に組込まれ、そしてSV40初期プロモーター,E.coli lacZ遺伝子およびSV40 3´プロセシングシグナルで構成されている。ura4遺伝子座の5´および3´フランキングDNA配列は、指示のとおりである。b,高レベルのlacZ RNAを発現するRB3−2株は、S.pombe adh1プロモーター,lacZコード領域,およびS.pombe ura4 3´プロセシングシグナルを含む発現カセットを含む。c,完全長3.5kbアンチセンスlacZ断片を示す。不具(crippled)センス断片は、ClaIカット(cut)lacZベクターを末端充填し、それ自身に再連結することにより作製した。d,AML1株は、ura4遺伝子座に組込まれたc−myc−lacZ融合カセットを含む。ヒトc−myc遺伝子のエキソン2および3を標的として採用した。c−mycアンチセンス断片の相対的位置を示す。転写開始部位は曲矢印で示す。直矢印は、特定のDNA断片についての転写の正常方向を表す。
【図2】 図2は、分裂酵母におけるdsRNA媒介遺伝子サイレンシングを示す。a,強力なadh1lプロモーターの制御下で組込まれたlacZ遺伝子を含む分裂酵母株を、lacZアンチセンスベクターで形質転換した。当該アンチセンス遺伝子は、弱nmt41プロモーター(低アンチセンス)、単一コピーで強nmt1プロモーター(15)(中アンチセンス)、または多コピーでnmt1プロモーター(高アンチセンス)の制御下にあった。最大アンチセンスRNAを発現する株について、異なる選択マーカーを含む2つのエピソームnmt1駆動アンチセンスベクターを標的株中へ共形質転換した。b,弱SV40プロモーター(低標的)または強adh1プロモーター(高標的)の制御下で組込まれたlacZ遺伝子を含む分裂酵母株を、アンチセンスlacZベクターまたはアンチセンスlacZおよびセンスlagZベクターで形質転換した。適切な選択マーカーを含むベクターで株を形質転換し、栄養要求性を補完した。c,lacZ逆向き反復ベクターを、高発現lacZ標的株中で発現させた。当該アンチセンス構築体だけを発現する株も示してある。d,組込みc−myc−lacZ融合遺伝子を含む分裂酵母株を、前記センス構築体、アンチセンス構築体、または両者で形質転換した。アンチセンスおよびセンス構築体は、高発現lacZ株中でも発現させた。すべての株は、適切な対照プラスミドで形質転換し、栄養要求性を補完した。
【図3】 図3は、センスおよびアンチセンス遺伝子の単一コピーの共発現の影響を示す。標的lacZ単独(RB3−2)、標的およびアンチセンス遺伝子の単一コピー(K40−7)、および標的およびアンチセンスおよびフレームシフト化lacZ両遺伝子(M62−1)を含む株について、βガラクトシダーゼ活性を検定した。pREP2およびpREP4は、それぞれLEU2およびura4選択マーカーを含む親プラスミドである。株は、適切な対照プラスミドで形質転換し、栄養要求性を補完した。各試料につき、3つの独立コロニーを3回検定した。
【図4】 図4は、分裂酵母株におけるRNA発現プロファイルを示す。a,標的株RB3−2を、lacZ逆向き反復ベクター(pM53−1)で形質転換し、またはアンチセンス(pGT2)およびセンス(pM54−3)ベクターで共形質転換し、そしてチアミンの不在下で対数中期まで増殖させた。各株から全RNAを1%変性アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に移し、そして放射能標識した2.2kb nmt1断片でプローブした。エピソームlacZシグナルは、内因性nmt1転写産物に標準化し、りん光画像分析により定量した。エピソームlacZ発現の相対的レベルを示す。b,安定に組込まれたlacZ逆向き反復遺伝子の単一コピーを含むM38−1株を、チアミンの不在下で対数中期まで増殖させ、そのRNAを単離し、そしてノーザンブロット法で分析した。“パンハンドル”lacZ RNAの相対的定常状態レベルを、エピソーム発現されたアンチセンスlacZ RNAに比較して、示す。
【図5】 図5は、in vivo dsRNA検定法を示す。a,lacZ逆向き反復が分子内RNA二重鎖を形成する能力を検定するために用いた構築体を示す。各ベクターは、X−GALの存在下で増殖させた場合、形質転換株に青色表現型を与える機能性lacZ断片を含む。pM81−2生成転写産物の推定二次構造を示す。b,2037株を、チアミンの不在下にベクターpM85−1,pM91−1およびpM81−2で形質転換した。単一コロニーを最小培地プレート上にストリークし、500μg/ml X−galおよび0.01%SDSを含む0.5%アガロース培地でオーバーレイした。
【図6】 図6は、dsRNA媒介遺伝子調節へのded1の影響を示す。a,ded1遺伝子を組込みlacZ遺伝子を含む分裂酵母株で共発現させた。アンチセンスlacZベクターで、およびそれ無しで形質転換された株のβガラクトシダーゼ活性を示す。b,標的株は、短いlacZアンチセンス遺伝子を発現するベクターで、または短いアンチセンスlacZベクターおよびded1発現ベクターの両方で、形質転換した。株は、適切な対照プラスミドで形質転換し、栄養要求性を補完した。
【図7】 図7は、アンチセンスlacZ発現株におけるthi1の過剰発現を示す。アンチセンスlacZベクターで、およびそれ無しで形質転換された標的株RB3−2のβガラクトシダーゼ活性を示す。アンチセンス発現株におけるthi1遺伝子の過剰発現も示す。株は、適切な対照プラスミドで形質転換し、栄養要求性を補完した。
【図8】 図8は、RNAiモジュレート因子類に対する過剰発現スクリーニング法を示す。adh1プロモーターの制御下で組込まれたlacZ遺伝子およびnmt1駆動lacZアンチセンス遺伝子を含むエピソームベクターとを含む標的株を、S.pombe cDNAライブラリーで形質転換する。ライブラリー断片は、nmt1プロモーターにより駆動する。形質転換体は、lacZコード化青コロニー色表現型の変化について、個々にスクリーンする。次いでこれらの形質変換体は、チアミンの存在および不在下に、βガラクトシダーゼ活性を定量的に検定される。次いで、当該アンチセンスベクターは、lacZ抑制のcDNA依存性修飾を示す形質転換体から分離する。その作用がdsRNAの存在に依存するか否かを決定するために、三次βガラクトシダーゼ検定を行う。cDNAベクターを、関心株から回収し、配列決定し、そしてBLASTN分析にかける。
【図9】 図9は、S.pombe cDNAライブラリーの過剰発現スクリーンを示す。a,形質転換体を、最小培地プレート上で増殖し、X−GAL含有培地でオーバーレイした。青色表現型の低減を示したもの(黒矢印)は、さらに分析した。青色表現型の増強を示した形質転換体も、同定した(白矢印)。b,青色表現型に視覚的低減を示した形質転換体は、チアミンの不在下で液体培養中のβガラクトシダーゼ活性を検定した。チアミンは、当該増強lacZ抑制がRNA発現に依存性であったことを証明するために、培地に添加した。形質転換体は、アンチセンスベクター分離後に、βガラクトシダーゼ活性を再び検定した。c,dsRNA発現株におけるユニークなres遺伝子の過剰発現。
【図10】 図10は、lacZパンハンドル媒介遺伝子サイレンシングを示す。(A)lacZパンハンドル構築体は、逆向き5´2.5kb lacZ断片が続く、完全長不具lacZ遺伝子を含む。分子内ハイブリッド形成は、2.5kb RNA二重鎖および1kbループをもつRNAを産生する。(B)エピソーム的に発現されたパンハンドルlacZ RNA(7.0kb)の相対的定常状態レベルを、エピソーム的に発現されたアンチセンスlacZ RNA(4.5kb)に比較して示す。当該lacZシグナルは、内因性nmt1転写産物(1.3k)に標準化し、りん光画像分析により定量した。(C)当該標的株は、エピソーム的に発現されたlacZパンハンドルで形質転換し、そしてβガラクトシダーゼ活性を分析した。適切なプラスミドを共導入し、栄養要求性を補完した。少なくとも3つの独立したコロニーを、各株につき3回検定した。当該パンハンドルRNA(陰影線づけ)の発現を撤廃するため、チアミンの存在下で形質転換体を検定した。(D)当該標的lacZ株は、パンハンドルベクター単独で、またはパンハンドルおよびaes2ベクターの両方で、形質転換した。
【図11】 図11は、ded1およびlacZアンチセンス遺伝子の共発現を示す。ded1遺伝子およびアンチセンスlacZベクターで共形質転換した標的株のβガラクトシダーゼ活性を示す。ded1はura4基盤プラスミドpREP4から発現され、一方当該アンチセンス遺伝子はLEU2基盤プラスミドpREP2から発現された。アンチセンスRNAsまたはded1 RNA単独を発現する株も示す。株は、適切な対照プラスミドで形質転換し、栄養要求性を補完した。3つの独立したコロニーを、各株につき3回検定した。
【図12】 図12は、aes1因子についてのDNA配列を示す。
【図13】 図13は、aes2因子についてのDNA配列を示す。
【図14】 図14は、aes3因子についてのDNA配列を示す。
【図15】 図15は、aes4因子についてのDNA配列を示す。
【配列表】
Claims (6)
- 標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対して感受性が増加した単離Schizosaccharomyces pombe細胞であって、該細胞は(i)標的核酸を発現し、且つ(ii)上昇したレベルの配列番号1により表されるヌクレオチド配列からなる核酸を含み、そしてそこへ導入される分子であって該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に向けられたアンチセンス核酸であるかまたはそれを生じる分子を有し、該配列番号1により表されるヌクレオチド配列が、該アンチセンス核酸が該標的核酸の発現を阻害する度合いを増加することを可能にする、
前記細胞。 - 細胞調製物中のSchizosaccharomyces pombe細胞中の標的核酸の発現を阻害するための方法であって、
(i) 該細胞中で配列番号1により表されるヌクレオチド配列の発現を増加させること、及び
(ii) 工程(i)を実行する前、それと同時又はそれに続けて、該細胞中へ、該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に向けられたアンチセンス核酸であるか又はそれを生じさせる分子を導入すること、
の工程を含む、前記方法。 - 標的核酸発現のアンチセンス媒介阻害に対する細胞感受性を増加させる方法であって、該標的核酸を発現する細胞調製物中のSchizosaccharomyces pombe細胞中で配列番号1により表されるヌクレオチド配列の発現を増加させること、及びその前に、それと同時に又はそれに続けて該標的核酸のRNA転写産物の少なくとも一部に向けられたアンチセンス核酸であるか又はそれを生じる分子を該細胞中へ導入することを含む、前記方法。
- 前記標的核酸が外因性核酸である、請求項2又は3に記載の方法。
- 配列番号1により表されるヌクレオチド配列の発現が、該配列の付加的コピー又は該配列を生じる作用物質を該細胞中へ導入することにより増加する、請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 配列番号1により表されるres配列からなる核酸であるRNAi因子。
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