TW201625302A - 進行性骨化性纖維發育不良之治療 - Google Patents

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Abstract

提供用於治療進行性骨化性纖維發育不良(FOP)之方法。此類方法包括向患有FOP之受試者投予有效方案之活化素受體類型2A(ACVR2A)及/或活化素受體類型2B(ACVR2B)拮抗劑或活化素受體類型1(ACVR1)拮抗劑。拮抗劑包括ACVR2A、ACVR2B及/或ACVR1之一個或多個細胞外結構域(ECD)與免疫球蛋白重鏈之Fc結構域的融合蛋白，及針對ACVR2A、ACVR2B、ACVR1或活化素A之抗體。

Description

進行性骨化性纖維發育不良之治療
進行性骨化性纖維發育不良(FOP)為一種體染色體顯性病症，其特徵為早發、階段性及骨骼肌及相關結締組織逐漸骨化。FOP係由ACVR1之細胞內結構域(ALK2)的突變驅動，其中大多數將精胺酸206變成組胺酸(R206H)(Pignolo,R.J.等人2011,Orphanet J.Rare Dis.6：80)。ACVR1為骨形態形成性蛋白(BMP)之一種I型受體。咸信R206H突變尤其增加受體對活化之敏感性且使其更不易沉默。尚不知FOP之有效醫學療法。
本發明提供治療進行性骨化性纖維發育不良(FOP)之方法，其包括向患有FOP之受試者投予有效方案之活化素受體類型2A(ACVR2A)及/或活化素受體類型2B(ACVR2B)拮抗劑。在一些方法中，拮抗劑包含ACVR2A或ACVR2B細胞外結構域。在一些方法中，拮抗劑包含ACVR2A或ACVR2B Fc融合蛋白。在一些方法中，Fc融合蛋白之同型為人類IgG1。在一些方法中，拮抗劑包含連接於ACVR2B細胞外結構域之ACVR2A細胞外結構域。在一些方法中，拮抗劑進一步包含Fc結構域。在一些方法中，拮抗劑包含融合於第一Fc結構域之ACVR2A細胞外結構域及融合於第二Fc結構域之ACVR2B細胞外結構域，其中第一及第二Fc結構域彼此複合。在一些方法中，拮抗劑在各融合於Fc結構域之ACVR2A與ACVR2B細胞外結構域之間包含連接子。在一些方法中，拮抗劑為包含ACVR2A細胞外結構域、ACVR2B細胞外結構域及Fc結構域之融合蛋白。在一些方法中，投予有效方案之ACVR2A拮抗劑及ACVR2B拮抗劑。在一些方法中，ACVR2A拮抗劑為ACVR2A Fc融合蛋白且ACVR2B拮抗劑為ACVR2B Fc融合蛋白。 在一些方法中，拮抗劑為ACVR2A或ACVR2B之抗體。在一些方法中，受試者未患II型糖尿病、肌肉萎縮、肌萎縮性側索硬化(ALS)或骨質疏鬆症且不處於該等病症之風險中。
本發明進一步提供治療FOP之方法，其包括向患有FOP之受試者投予有效方案之活化素受體類型1(ACVR1)拮抗劑。在一些方法中，拮抗劑包含ACVR1細胞外結構域。在一些方法中，拮抗劑包含ACVR1融合蛋白。在一些方法中，Fc融合蛋白之同型為人類IgG1。在一些方法中，拮抗劑為ACVR1之抗體。
本發明進一步提供治療進行性骨化性纖維發育不良(FOP)之方法，其包括向患有FOP之受試者投予有效方案之活化素受體類型2A(ACVR2A)及/或活化素受體類型2B(ACVR2B)拮抗劑以及活化素受體類型1(ACVR1)拮抗劑。在一些方法中，拮抗劑包含ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B細胞外結構域。在一些方法中，拮抗劑包含ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B Fc融合蛋白。在一些方法中，Fc融合蛋白之同型為人類IgG1。在一些方法中，拮抗劑為ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B之抗體。
本發明進一步提供治療進行性骨化性纖維發育不良(FOP)之方法，其包括向患有FOP之受試者投予有效方案之針對活化素A之抗體。視情況，抗體與包含名為H4H10446P、H4H10430P或A1之抗體之重鏈及輕鏈可變區的抗體競爭結合。視情況，抗體包含名為H4H10446P、H4H10430P或A1之抗體之重鏈及輕鏈可變區。視情況，抗體為嵌合、鑲飾、人類化或人類抗體。視情況，抗體為完整抗體。視情況，抗體為人類κIgG1抗體。
圖1展示來自小鼠之microCT資料，其展示在進行及不進行ACVR2A-Fc/ACVR2B-Fc處理下開始投予他莫昔芬(tamoxifen)後6週時之異位骨形成。十個對照mFc處理之小鼠中的九個(編號1至9)展示在投予他莫昔芬後6週時異位骨形成。大部分共同位置為後肢、頸區及胸骨。十一個ACVR2A-Fc/ACVR2B-Fc處理之小鼠中的兩個(編號12及14)展示在投予他莫昔芬後6週時異位骨形成。此兩個小鼠中之異位骨骼病變與mFc處理之組 中所見骨骼病變相比尺寸小，且均位於胸骨。
圖2展示來自小鼠之microCT資料，其展示在進行或不進行LDN212854處理下開始投予他莫昔芬後4週時之異位骨形成。編號1至8對應於他莫昔芬+媒劑處理之小鼠。大的異位骨結節已在編號為1、2、3、4、5及7之小鼠中形成，且小的異位骨結節已在編號為6及8之小鼠中形成。編號9-16對應於他莫昔芬+ LDN212854處理之小鼠。小的異位骨骼結節已在編號為9、12及13之小鼠中形成。在編號為10、11、14、15或16之小鼠中無法偵測到異位骨結節。
圖3展示經針對活化素A之抗體、同型匹配之不相關對照抗體及ACVR2A-Fc處理的傾向於異位骨形成之小鼠的microCT資料。針對活化素A之抗體最有效地抑制異位骨結節之形成。
圖4展示經針對活化素A之抗體、同型匹配之不相關對照抗體及針對Acvr2a/Acvr2b之抗體處理的傾向於異位骨形成之小鼠的microCT資料。針對活化素A之抗體及針對Acvr2a/Acvr2b之抗體抑制異位骨結節之形成。
圖5展示與同型匹配之不相關對照抗體比較，經改變劑量之針對活化素A之抗體處理的傾向於異位骨形成之小鼠的microCT資料。展示1mg/kg與25mg/kg之間的劑量有效，其中10mg/kg為測試之最有效劑量。
定義
拮抗劑典型地以分離之形式提供。此意謂拮抗劑典型地為至少50%w/w純，具有由其產生或純化引起之干擾蛋白質及其他污染物，但不排除拮抗劑與過量醫藥學上可接受之載劑或其他意欲促進其使用之媒劑組合的可能性。有時拮抗劑為至少60%、70%、80%、90%、95%或99%w/w純度之來自生產或純化之干擾蛋白質及污染物。
為將胺基酸取代分類為保守或非保守，胺基酸如下分組：組I(疏水性側鏈)：met、ala、val、leu、ile；組II(中性親水性側鏈)：cys、ser、thr；組III(酸性側鏈)：asp、glu；組IV(鹼性側鏈)：asn、gln、his、lys、 arg；組V(影響鏈取向之殘基)：gly、pro；及組VI(芳族側鏈)：trp、tyr、phe。保守取代涉及同類胺基酸之間的取代。非保守取代為此等類別中之一者的成員交換成另一類之成員。
序列一致性百分比係在可變區藉由Kabat編號規定或恆定區藉由EU編號，將抗體序列最大程度比對下確定。對於其他蛋白質，序列一致性可藉由使用諸如Wisconsin Genetics套裝軟體7.0版(Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)中之BESTFIT、FASTA及TFASTA之演算法，使用默認間隙參數，或藉由檢查及最佳比對來比對序列進行確定。比對後，若主題抗體區域(例如重鏈或輕鏈之整個成熟可變區)正與參考抗體之相同區域比較，則主題與參考抗體區域之間的序列一致性百分比為主題與參考抗體區域中相同胺基酸佔據之位置的數目除以兩個區域之比對位置的總數乘以100以轉變成百分比，其中間隙不計數。
「包含」一個或多個所敘述要素之組合物或方法可包括未具體敘述之其他要素。舉例而言，包含抗體之組合物可含有單獨抗體或與其他成分組合之抗體。
人類化抗體為一種進行基因工程改造之抗體，其中來自非人類「供體」抗體之CDR移植至人類「接受體」抗體序列(參見例如Queen，US 5,530,101及5,585,089；Winter，US 5,225,539；Carter，US 6,407,213；Adair，US 5,859,205及6,881,557；Foote，US 6,881,557)。接受體抗體序列可為例如成熟人類抗體序列、此類序列之複合物、人類抗體序列之共同序列或生殖系區域序列。因此，人類化抗體為一些或所有CDR完全或基本上來自供體抗體且可變區構架序列及恆定區(若存在)完全或基本上來自人類抗體序列之抗體。類似地，人類化重鏈具有至少一個、兩個及通常所有三個完全或基本上來自供體抗體重鏈之CDR，及基本上來自人類重鏈可變區構架及恆定區序列之重鏈可變區構架序列及重鏈恆定區(若存在)。類似地，人類化輕鏈具有至少一個、兩個及通常所有三個完全或基本上來自供體抗體輕鏈之CDR，及基本上來自人類輕鏈可變區構架及恆定區序列之輕鏈可變區構架序列及輕鏈恆定區(若存在)。除奈米抗體(nanobodies)及dAb以外，人類化抗體包含人類化重鏈及人類化輕鏈。當相應CDR之間至少85%、 90%、95%或100%之對應殘基(如Kabat所定義)一致時人類化抗體中之CDR基本上來自非人類抗體中之對應CDR。當藉由Kabat定義之對應殘基之至少85%、90%、95%或100%一致時，抗體鏈之可變區構架序列或抗體鏈之恆定區分別基本上來自人類可變區構架序列或人類恆定區。
雖然人類化抗體常常併有來自小鼠抗體之所有六個CDR(較佳如Kabat所定義)，但其亦可用少於全部CDR(例如來自小鼠抗體之至少3、4或5個CDR)製成(例如Pascalis等人，J.Immunol.169：3076,2002；Vajdos等人，Journal of Molecular Biology,320：415-428,2002；Iwahashi等人，Mol.Immunol.36：1079-1091,1999；Tamura等人，Journal of Immunology,164：1432-1441,2000)。
嵌合抗體為其中非人類抗體(例如小鼠)之輕鏈及重鏈之成熟可變區與人類輕鏈及重鏈恆定區組合的抗體。此類抗體基本上或完全保留小鼠抗體之結合特異性，且為約三分之二人類序列。
鑲飾(veneered)抗體為一種類型人類化抗體，其保留非人類抗體之一些及通常所有CDR及一些非人類可變區構架殘基，但用來自人類抗體序列之對應位置的殘基置換可影響B或T細胞抗原決定基之其他可變區構架殘基，例如暴露殘基(Padlan,Mol.Immunol.28：489,1991)。結果為其中CDR完全或基本上來自非人類抗體且非人類抗體之可變區構架藉由取代而更像人類之抗體。
人類抗體可與人類分離，或以其他方式由人類免疫球蛋白基因之表現(例如在轉殖基因小鼠中、活體外或藉由噬菌體呈現)產生。用於產生人類抗體之方法包括Oestberg等人，Cys muoma 2：361-367(1983)；Oestberg，美國專利第4,634,664號；及Engleman等人，美國專利4,634,666之三源雜交瘤法。單株抗體亦可藉由載有人類免疫系統基因之轉殖基因小鼠產生，諸如來自Regeneron Pharmaceuticals,Inc.之VelocImmune®小鼠(Murphy,PNAS 111期號14,5153-5158(2014),Xenomouse,Jakobovits,Nature Biotechnology 25,1134-1143(2007))或來自Medarex,Inc.之HuMAb小鼠(Lonberg,Handbook Exp.Pharmacol.181,69-97(2008)；Lonberg等人，WO93/12227(1993)；US 5,877,397、US 5,874,299、US 5,814,318、US 5,789,650、US 5,770,429、US 5,661,016、US 5,633,425、US 5,625,126、US 5,569,825、US 5,545,806；Nature 148,1547-1553(1994)；Nature Biotechnology 14,826(1996)；Kucherlapati，WO 91/10741(1991))。人類抗體亦可藉由噬菌體呈現方法產生(參見例如Dower等人，WO 91/17271及McCafferty等人，WO 92/01047、US 5,877,218、US 5,871,907、US 5,858,657、US 5,837,242、US 5,733,743及US 5,565,332)。
聲稱拮抗劑保留其來源於之親本抗體之特性時，該保留可為完全或部分的。活性完全保留意謂拮抗劑之活性與其來源於之分子之活性相同(在實驗誤差範圍內)或超過其來源於之分子之活性。活性部分保留意謂活性顯著超過陰性對照之背景水準(亦即超過實驗誤差)且較佳為其所源自之分子的對應活性之至少50%。
若減少或消除一種抗體之結合的抗原之全部胺基酸突變減少消除另一抗體之結合，則兩個抗體具有相同的抗原決定基。若減少或消除一種抗體之結合的抗原之一些胺基酸突變減少消除另一抗體之結合，則兩個抗體具有重疊抗原決定基。
抗體之間的競爭藉由其中測試抗體抑制參考抗體與共同抗原之特異性結合的分析來確定(參見例如Junghans等人，Cancer Res.50：1495,1990)。若如競爭性結合分析中量測，過量測試抗體(例如至少2x、5x、10x、20x或100x)抑制參考抗體之結合至少50%，但較佳75%、90%或99%，則測試抗體與參考抗體競爭。藉由競爭分析(競爭抗體)鑒別之抗體包括結合於與參考抗體相同之抗原決定基的抗體及結合於與參考抗體所結合之抗原決定基足夠接近而出現位阻之鄰近抗原決定基的抗體。
I. 概述
提供用於治療進行性骨化性纖維發育不良(FOP)之方法。此類方法包括向患有FOP之受試者投予有效方案之活化素受體類型2A(ACVR2A)及/或活化素受體類型2B(ACVR2B)拮抗劑以及活化素受體類型1(ACVR1)拮抗劑及/或活化素A拮抗劑。此類拮抗劑包括包含ACVR2A、ACVR2B及/或ACVR1之一個或多個細胞外結構域(ECD)及免疫球蛋白重鏈之Fc結構域的融合蛋白。亦提供ACVR2A、ACVR2B、ACVR1或活化素A 之抗體拮抗劑。
II. ACVR1、ACVR2A、ACVR2B及活化素A
配位體之轉型生長因子β(TGFβ)超家族包括例如骨形態生成蛋白(BMP)及生長及分化因子(GDF)。此等配位體之受體為由I型及II型跨膜絲胺酸/蘇胺酸激酶受體組成之異聚受體複合物。I型受體之實例包括活化素受體類型IA(ACTRIA、ACVR1或ALK2)、BMP受體類型IA及BMP受體類型IB。II型受體之實例包括活化素受體類型IIA及IIB(ACTRIIA或ACVR2A及ACTRIIB或ACVR2B)及BMP受體類型II。TGFβ超家族之配位體各對不同I型及II型受體具有不同親和力。
I型與II型受體具有細胞外配位體結合結構域(ECD)及細胞內絲胺酸/蘇胺酸激酶結構域。另外，I型受體在激酶結構域之前具有富含甘胺酸/絲胺酸之區域(GS-盒)，且在激酶結構域內具有L45環。兩種受體一起作用於配位體以活化下游信號傳導路徑，諸如Smad及非Smad信號傳導路徑。活化包括配位體結合、配位體-受體寡聚及II型受體激酶使I型受體之GS盒轉磷酸化。II型受體激酶為組成性活性且在I型受體之配位體結合及活化中起作用。
ACVR1亦稱活化素受體類型I、ACVR1A、ACVRLK2或ALK2，為配位體之TGFβ超家族之I型受體。ACVR1具有絲胺酸/蘇胺酸激酶活性且使Smad蛋白質磷酸化且活化下游信號傳導路徑。在包括骨骼肌及軟骨之許多身體組織中發現ACVR1且其幫助控制骨骼及肌肉之生長與發育。如在本文中的其他地方描述，ACVR1基因之某些突變引起FOP。ACVR1活性之實例包括結合於配位體之能力、與II型受體形成複合物之能力或活化下游信號傳導路徑，諸如Smad路徑之能力。
ACVR2亦稱活化素受體類型II，為配位體之TGFβ超家族之II型受體。存在至少兩種ACVR2受體，例如活化素受體類型IIA(ACVR2A或ACTRIIA)及活化素受體類型IIB(ACVR2B或ACTRIIB)。對ACVR2之提及包括ACVR2A及ACVR2B中之任一者或兩者。ACVR2A及ACVR2B可在許多組織中表現，包括骨骼肌、胃、心臟、子宮內膜、睪丸、前列腺、卵巢及神經組織。
在配位體結合時，ACVR2受體與I型受體，諸如ACVR1形成複合物，且使I型受體之GS盒磷酸化，因此增強I型受體之激酶活性。ACVR2A及ACVR2B活性之實例包括結合於配位體之能力、與I型受體形成複合物之能力或使I型受體磷酸化之能力。
人類ACVR2A之一種例示性形式具有Swiss Prot寄存編號P27037。殘基1-19為信號肽，殘基20-135為細胞外結構域，殘基59-116為活化素類型I及II受體結構域，殘基136-161為跨膜結構域且殘基162-513為細胞質域。分配人類ACVR2B之一種例示性形式Swiss Prot寄存編號Q13705。殘基1-18為信號序列，殘基19-137為細胞外結構域，殘基27-117為活化素類型I及II受體結構域，殘基138-158為跨膜結構域且殘基159-512為細胞質域。人類ACVR1之一種例示性形式具有Swiss Prot寄存編號Q04771。殘基1-20為信號序列，殘基21-123為細胞外結構域，殘基33-104為活化素類型I及II受體結構域，殘基124-146為跨膜結構域且殘基147-509為細胞質域。對ACVR1、ACVR2A及ACVR2B任一者之提及包括此等例示性形式、其已知之同功異型物及多態現象，諸如Swiss Prot資料庫中列出之彼等形式、來自其他物種之同源形式及與例示形式具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之其他變異體。
除以上界定之例示序列以外的ACVR2A、ACVR2B及ACVR1之形式之殘基藉由與對應例示序列之最大比對來編號，因此比對之殘基分派相同的編號。例示序列之取代可為保守或非保守取代。對ACVR1、ACVR2A或ACVR2B之提及亦包括完整細胞外結構域(例如分別ACVR2A、ACVR2B及ACVR1之殘基20-135、19-137或21-123)或不含或基本上不含跨膜及細胞質部分之其一部分。細胞外結構域之部分保留完整細胞外結構域之足夠殘基以結合至少一種結合於完整細胞外結構域之配位體或反受體且由此拮抗相關受體(例如分別ACVR2A、ACVR2B及ACVR1之殘基59-116、27-117或33-104)。
人類中之活化素A可呈同二聚體或異二聚體蛋白質形式存在。同二聚體蛋白質含有同二聚體βA次單元對。異二聚體蛋白質含有β次單元及βB、βC或βE次單元(亦即βAβB、β AβC或βAβE)。該等次單元各表現為 包括信號肽、前肽及成熟多肽之前驅多肽。人類βA次單元前驅多肽之一種例示性形式為稱為Swiss Prot P08476之426個胺基酸長之多肽，其中殘基1-20為信號肽，殘基21-310為前肽，且殘基311-426為成熟多肽。βB次單元前驅多肽之一種例示性形式稱為Swiss Prot P09529，其中殘基1-28為信號肽，殘基29-292為前肽，且殘基293-407為成熟多肽。βC次單元之一種例示性形式稱為Swiss Prot P55103，其中殘基1-18為信號肽，殘基19-236為前肽，且殘基237-352為成熟多肽。βE次單元前驅多肽之一種例示性形式稱為Swiss Prot P58166，其中殘基1-19為信號肽，殘基20-236為前肽，且殘基237-350為成熟多肽。已知此等序列之若干變異體描述於Swiss Prot資料庫。對活化素A之提及包括βA同二聚體、βAβB、β AβC及βAβE異二聚體形式之任一者，以及其次單元，以及其中次單元附接於由所提供之例示性Swiss Prot序列定義之前肽及/或信號肽之其前驅多肽，或此等序列之其他天然存在之人類形式。活化素A經由結合於ACVR2A或ACVR2B進行信號傳導，但不知其為ACVR1之配位體。
III. ACVR1、ACVR2A、ACVR2B之拮抗劑
提供I型受體ACVR1及II型受體ACVR2蛋白質(例如ACVR2A及/或ACVR2B)之拮抗劑用於治療FOP。此類拮抗劑尤其可藉由結合於受體直接拮抗受體(關於ACVR1、ACVR2A或ACVR2B之抗體)，或藉由結合於配位體或反受體且抑制配位體或反受體結合於ACVR1、ACVR2A或ACVR2B(關於ACVR1、ACVR2A或ACVR2B之融合蛋白)間接拮抗受體。ACVR2A及ACVR2B之拮抗劑亦可結合於活化素A。
相對於未接收拮抗劑之對照細胞或動物模型，本文中提供之ACVR1、ACVR2A或ACVR2B拮抗劑可抑制或降低ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B之活性至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多。
ACVR1、ACVR2A或ACVR2B之任何拮抗劑可用於治療FOP之方法中。拮抗劑可包含例如ACVR1、ACVR2A或ACVR2B多肽，諸如細胞外結構域、拮抗抗體或小分子抑制劑。
A. ACVR1、ACVR2A及ACVR2B多肽之細胞外結構域
拮抗劑包括分別有效抑制ACVR1、ACVR2A及ACVR2B之至少一種活性的ACVR1、ACVR2A及ACVR2B蛋白質及其片段。此類拮抗劑典型地包括ACVR1、ACVR2A或ACVR2B之細胞外結構域或其一部分。較佳地，此類細胞外結構域完全或基本上不含跨膜及細胞質區域(亦即，來自此等區域之任何剩餘殘基對細胞外結構域之功能均無顯著作用)。換言之，此類拮抗劑之ACVR2A、ACVR2B或ACVR1組分由或基本上如上定義之ACVR2A、ACVR2B或ACVR1之整個細胞外結構域或其一部分組成。此類拮抗劑可能包括或可能不包括如下文進一步描述之不同於ACVR2A、ACVR2B或ACVR1之其他組分。不含或基本上不含跨膜及細胞質域之此類細胞外結構域為可溶的。此類細胞外結構域可藉由結合於可溶配位體或反受體，有效地與配位體或反受體競爭結合於ACVR1、ACVR2A或ACVR2B細胞表面受體，由此調節(降低)配位體或反受體在活體內之可得性來充當拮抗劑。
可溶性細胞外結構域最初可與信號序列一起表現，信號序列在表現過程中裂解。信號序列可為ACVR1、ACVR2A或ACVR2B之天然信號序列，諸如美國專利No.7,709,605(其以引用的方式整體併入本文中)中描述之彼等信號序列，或可為來自諸如蜜蜂蜂毒素(HBM)或組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)之不同蛋白質之信號序列。或者，可溶性細胞外ACVR1、ACVR2A或ACVR2B多肽可在無信號序列下合成或表現。
ACVR1、ACVR2A及ACVR2B之ECD或配位體結合結構域在包括小鼠及人類之物種中高度保守。ECD含有富含半胱胺酸區及C端尾區。ACVR1、ACVR2A及ACVR2B之ECD結合於不同群體之TGFβ家族配位體，包括例如活化素A、肌肉生長抑制素(GDF-8)、GDF-11及BMP。參見例如Souza等人(2008)Molecular Endocrinology 22(12)：2689-2702。
ACVR2A及ACVR2B多肽及可溶性ACVR2A及ACVR2B多肽之實例包括美國專利No.7,842,633、美國專利No.7,960,343及美國專利No.7,709,605中揭示之多肽，各專利以引用的方式整體併入本文中。
ACVR1、ACVR2A或ACVR2B多肽之ECD可突變，使得變異多肽具有改變之配位體結合特性(例如結合特異性或親和力)。一些變異 ACVR1、ACVR2A或ACVR2B多肽具有改變之對特定配位體之結合親和力(例如升高或降低)。變異體與天然存在之ACVR1、ACVR2A或ACVR2B序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性，且保留生物活性，由此具有如在本文中的其他地方描述之ACVR1、ACVR2A或ACVR2B活性。ACVR2A及ACVR2B之活性變異體及片段描述於例如美國專利No.7,842,633、美國專利No.7,960,343及美國專利No.7,709,605中，各專利以引用的方式整體併入本文中。
量測ACVR1、ACVR2A或ACVR2B活性之分析揭示於例如美國專利No.7,842,633、美國專利No.7,960,343及美國專利No.7,709,605中。舉例而言，可針對結合配位體之能力或阻止配位體結合於ACVR1、ACVR2A或ACVR2B受體蛋白之能力篩選ACVR1、ACVR2A或ACVR2B多肽變異體。
B. 融合蛋白
上述ACVR1、ACVR2A及ACVR2B多肽可表現為具有ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B多肽之至少一部分及一個或多個融合結構域的融合蛋白。
融合結構域包括免疫球蛋白重鏈恆定區(Fc)、人類血清白蛋白(HSA)、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、蛋白質A、蛋白質G或可用於穩定化、溶解、分離融合蛋白或使融合蛋白多聚之任何融合結構域。
免疫球蛋白重鏈之Fc結構域為融合蛋白之較佳結構域。與免疫球蛋白之Fc部分的融合賦予各類蛋白質合乎需要的藥物動力學特性(例如增加蛋白質之穩定性及/或血清半衰期)。因此，本發明提供包含融合於免疫球蛋白之Fc結構域的ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B之至少一種ECD的融合蛋白。
用於本發明之方法的Fc結構域可來自於任何免疫球蛋白。可使用各種類別免疫球蛋白中之任一者，包括IgG、IgA、IgM、IgD及IgE。IgG類別內存在不同子類或同型，包括例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。在一個實施例中，Fc融合蛋白包含IgG分子之Fc結構域。在另一個實施例中，Fc結構域來自於IgG1分子。免疫球蛋白分子可具有任何動物類型，包括例如哺乳動 物、囓齒動物、人類、小鼠、大鼠、倉鼠或兔。在一個實施例中，免疫球蛋白Fc結構域來自於哺乳動物。在另一個實施例中，Fc結構域來自於人類。在又一個實施例中，Fc結構域來自於囓齒動物，諸如小鼠或大鼠。在一特定實施例中，融合蛋白之Fc結構域來自於人類IgG1。
本文中提供之Fc-融合蛋白可藉由本領域中已知之任何方法製造。Fc-融合蛋白可包括至少CH2及CH3區，且典型地包括鉸鏈區之至少一部分。雖然CH1區可存在，但其典型地在融合蛋白中省去。
融合可在免疫球蛋白恆定結構域之Fc部分內的任何位點進行。可對恆定結構域之Fc部分的C端，或緊靠重鏈CH1區之N端進行融合。可選擇特定位點以最佳化Fc-融合蛋白之生物活性、分泌或結合特徵。
在一些情況下，編碼ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B之ECD的核酸在C端融合於編碼免疫球蛋白恆定結構域序列之N端的核酸。在其他情況下，N端融合亦為可能的。ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B之ECD亦可融合於免疫球蛋白恆定結構域序列之N端與C端。
關於免疫球蛋白融合之產生，亦參見美國專利No.5,428,130、美國專利No.5,843,725、美國專利No.6,018,026及WO 2005/070966，各以引用的方式整體併入本文中。
融合蛋白可例如藉由編碼融合蛋白之核酸的重組表現產生。舉例而言，融合蛋白可藉由將編碼ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B之ECD的核酸融合於編碼Fc結構域之核酸來製造。ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B ECD核酸可融合於編碼Fc結構域序列之核酸之N端，或可融合於編碼Fc結構域之基因之C端。或者，ECD可在Fc結構域中之任何位置融合。
ECD融合蛋白亦可包括連接子。在Fc融合蛋白之情況下，連接子可位於ACVR1、ACVR2A或ACVR2B ECD與Fc結構域之間，視情況置換鉸鏈區部分或全部。連接子可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50或更多個相對不含二級結構之胺基酸。連接子可富含甘胺酸及脯胺酸殘基，且可例如含有蘇胺酸/絲胺酸及甘胺酸之重複序列(例如TG4或SG4重複序列)。
兩個或超過兩個ECD-Fc融合蛋白可藉由連接子接合在一 起。在此類情況下，連接子可位於ECD之間或連接子可位於Fc結構域之間以將融合蛋白接合在一起。舉例而言，1、2、3、4或更多個ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B Fc融合蛋白可連接在一起。
已描述ACVR2A及/或ACVR2B ECD融合蛋白之實例，諸如美國專利No.7,842,633、美國專利No.7,960,343及美國專利No.7,709,605中揭示之彼等融合蛋白，各專利以引用的方式整體併入本文中。
ACVR2A拮抗劑之一個實例稱為Sotatercept(亦稱為ACE-011)。Sotatercept含有融合於人類IgG1 Fc結構域之ACVR2A之ECD且詳細描述於Carrancio等人，(2014)British J Haematology.165(6)：870-872，其以引用的方式整體併入本文中。
ACVR2B拮抗劑之一個實例稱為ACE-031。ACE-031含有融合於人類IgG1 Fc結構域之ACVR2B之ECD且詳細描述於Sako等人，(2010)J.Biol.Chem.285(27)：21037-21048，其以引用的方式整體併入本文中。
已知ACVR1 ECD融合蛋白之實例，諸如Berasi等人，(2011)Growth Factors,29(4)：128-139中揭示之彼等融合蛋白，其以引用的方式整體併入本文中。
C. 雜交ECD融合蛋白
亦提供雜交或多特異性ECD融合蛋白拮抗劑。雜交ECD融合蛋白可包含兩個或超過兩個ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B ECD之組合。舉例而言，融合蛋白可包含ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B ECD之1、2、3、4或更多個分子。在一個實施例中，拮抗劑包含連接於ACVR2B ECD之ACVR2A ECD。在另一個實施例中，拮抗劑進一步包含Fc結構域。
在一個實施例中，融合蛋白可包含ACVR2A ECD之一個或多個分子及ACVR2B ECD之一個或多個分子。在另一個實施例中，融合蛋白可包含ACVR1 ECD之一個或多個分子及ACVR2A ECD之一個或多個分子。在另一個實施例中，融合蛋白可包含ACVR1 ECD之一個或多個分子及ACVR2B ECD之一個或多個分子。
在一個實施例中，融合蛋白包含複合在一起之一個或多個ACVR2A ECD-Fc融合蛋白及一個或多個ACVR2B ECD-Fc融合蛋白。在另 一個實施例中，融合蛋白包含複合在一起之一個或多個ACVR1 ECD-Fc融合蛋白及一個或多個ACVR2A ECD-Fc融合蛋白。在另一個實施例中，融合蛋白包含複合在一起之一個或多個ACVR1 ECD-Fc融合蛋白及一個或多個ACVR2B ECD-Fc融合蛋白。在此類情況下，融合蛋白可經由其Fc結構域，例如藉由至少一個二硫鍵或藉由連接子序列接合在一起。或者，融合蛋白之ECD部分可藉由連接子序列接合在一起。
在一個實施例中，拮抗劑包含融合於第一Fc結構域之ACVR2A ECD及融合於第二Fc結構域之ACVR2B ECD。在此類情況下，該等Fc結構域可彼此複合。在另一個實施例中，拮抗劑在各融合於Fc結構域之ACVR2A與ACVR2B ECD之間包含連接子。
融合蛋白可經構築以產生串聯格式之ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑。在一個實施例中，融合蛋白包含兩個或超過兩個來自ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B之串聯ECD，接著為Fc結構域。在一些情況下，串聯排列之ECD藉由連接子序列分離。此類串聯融合蛋白可包含1、2、3、4或更多個ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B ECD。
D. 抗體拮抗劑
ACVR1、ACVR2A或ACVR2B拮抗劑包括針對(換言之，特異性結合於)此等受體中之任一者的抗體，較佳在細胞外結構域內具有抗原決定基之抗體。抗體或融合蛋白特異性結合於其標靶抗原意謂至少106、107、108、109或1010M-1之親和力。特異性結合量值可偵測更高，且可與對至少一個無關標靶所發生之非特異性結合區別開。本領域中已知用於製備抗體之方法。參見例如Kohler & Milstein(1975)Nature 256：495-497；及Harlow & Lane(1988)Antibodies：a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,NY。
可使用抑制或降低ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B之活性的任何抗體(例如拮抗抗體)。此類ACVR2A及ACVR2B抗體包括例如美國專利No.8,486,403、美國專利No.8,128,933、WO2009/137075及Lach-Trifilieff等人，(2014)Mol.Cell Biol.34(4)：606-618中揭示之彼等抗體，各文獻以引用的方式整體併入本文中。包括此等抗體任一者之人類化、嵌合及鑲飾形式， 以及與其競爭結合之抗體。
在一個實施例中，抗體為抗ACVR2A抗體。在另一個實施例中，抗體為抗ACVR2B抗體。在其他實施例中，抗體可為針對ACVR2A與ACVR2B兩者之雙特異性抗體。在另一個實施例中，抗體為抗ACVR1抗體。在其他實施例中，抗體可為針對ACVR1與ACVR2A兩者之雙特異性抗體或針對ACVR1與ACVR2B兩者之雙特異性抗體。
術語「抗體」涵蓋具有兩對重鏈及輕鏈之完整抗體、可結合抗原之抗體片段(例如Fab、F(ab')2、Fv、單鏈抗體、雙功能抗體、抗體嵌合體、雜交抗體、雙特異性抗體、人類化抗體及其類似物)及包含上述之重組肽。
「抗體片段」包含完整抗體一部分，較佳為完整抗體之抗原結合或可變區。抗體片段之實例包括Fab、F(ab')2及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體(Zapata等人(1995)Protein Eng.10：1057-1062)；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體可為單株或多株抗體。「單株抗體」為自基本上均質抗體之群體中獲得之抗體，亦即構成該群體之個別抗體除可少量存在之可能天然存在的突變外均一致。單株抗體常常具有高度特異性，針對單一抗原位點。此外，與典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體之習知(多株)抗體製劑相比，各單株抗體典型地針對抗原上之單一決定子。修飾詞「單株」指示如自基本上均質抗體之群體(諸如藉由B細胞純系群體產生之抗體)獲得之抗體的特徵，且不需要藉由任何特定方法產生抗體。
根據本文中提供之方法使用之單株抗體可藉由Kohler等人(1975)Nature 256：495首先描述之融合瘤方法或其修改來製造。典型地，諸如小鼠之動物用含有抗原(例如ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B多肽，或活化素A，尤其細胞外結構域(受體中)或其一部分)之溶液免疫接種。
免疫接種可藉由將含有抗原之溶液在生理食鹽水中，較佳諸如弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant)之佐劑中混合或乳化且非經腸注射混合物或乳液來進行。動物免疫接種後，移除脾(及視情況若干大淋巴結)且解離成單個細胞。脾細胞可藉由將細胞懸浮液塗覆至塗有相關抗原之 盤或孔來篩選。表現對抗原具有特異性之膜結合免疫球蛋白之B細胞結合於盤且未洗去。接著誘發所得B細胞或全部解離之脾細胞與骨髓瘤細胞融合以形成融合瘤，且在選擇培養基中培養。所得細胞藉由連續稀釋來塗鋪，且分析特異性結合相關抗原(且不結合於無關抗原)之抗體的產生。接著將所選之分泌單株抗體(mAb)之融合瘤活體外(例如組織培養瓶或空心纖維反應器中)或者活體內(如小鼠中腹水)培養。
或者，單株抗體可藉由重組DNA法製造(參見例如美國專利No.4,816,567)。單株抗體亦可自噬菌體抗體文庫使用例如Clackson等人(1991)Nature 352：624-628；Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222：581-597；及美國專利No.5,514,548中描述之技術分離。
「抗體」包括如上定義之針對ACVR1、ACVR2A、ACVR2B及活化素A任一者之嵌合、鑲飾、人類化及人類單株抗體。
視其重鏈之恆定結構域之胺基酸序列而定，免疫球蛋白可分配至不同類別。存在五個免疫球蛋白主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於免疫球蛋白不同類別之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。熟知不同類別免疫球蛋白之次單元結構及三維組態。
本發明之單株抗體或Fc融合蛋白可為各種抗體類別任一者。在一個實施例中，單株抗體為IgG類別抗體。在其他實施例中，單株抗體可具有IgM、IgE、IgD或IgA類別。在特定實施例中，抗體為IgG同型，諸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，尤其人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
在輕鏈及/或重鏈之胺基或羧基端之一個或若干個胺基酸，諸如重鏈之C端離胺酸可在一定比例或所有分子中缺失或衍生。可在恆定區中進行取代以減少或增加效應功能，諸如補體介導之細胞毒性或ADCC(參見例如Winter等人，美國專利No.5,624,821；Tso等人，美國專利No.5,834,597；及Lazar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103：4005,2006)或延長人類中之半衰期(參見例如Hinton等人，J,Biol.Chem.279：6213,2004)。例示性取代包括位置250之Gln及/或位置428之Leu(EU編號)以增加抗體之半衰期。位置234、235、236及/或237中任一者之取代降低對Fcγ受體，尤其FcγRI 受體之親和力(參見例如US6,624,821)。視情況，人類IgG2中之位置234、236及/或237經丙胺酸取代且位置235經麩醯胺酸取代(參見例如US 5,624,821)。效應功能亦可藉由位置232-236上EFLG經PVA取代來降低(參見WO14/121087)。視情況，位置428上之S可經P置換，尤其在人類IgG4中，以減少內源性及外源性免疫球蛋白之間的交換。其他變異可添加或移除轉譯後修飾之位點，諸如N-X-S/T模體之N連接之糖基化。變異亦可包括引入杵型結構(亦即一個或多個胺基酸經較大胺基酸置換)或臼型結構(亦即一個或多個胺基酸經較小胺基酸置換)以促進不同重鏈之間異二聚體之形成以產生雙特異性抗體。形成杵及臼對之例示性取代分別為T336Y及Y407T(Ridgeway等人，Protein Engineering第9卷第7期第617-621頁，1996)。變異亦可包括EU編號系統中降低蛋白質A互相作用(例如H435R及Y436F)之突變。其中一個重鏈具有此類變異且另一個不具有的雙特異性抗體可與其親本抗體藉由蛋白質A親和層析法分離。
抗體亦可包括特異性結合於活化素A之抗體。此類抗體可特異性結合於活化素A之βAβA、βAβB、βAβC及βAβE形式之任一者或全部。一些抗體僅僅特異性結合於此等形式(亦即βAβA、βAβB、βAβC或βAβE)中之一者。對βAβB、βAβC及βAβE形式之特異性可分別藉由βB、βC或βE次單元內之抗原決定基，或針對異二聚體之兩個組分影響之抗原決定基賦予。對βAβ之特異性可藉由受同型二聚體內兩個分子影響(例如在次單元界面)之抗原決定基賦予。一些抗體特異性結合於活化素A之所有此等形式，在此情況下抗原決定基典型地在βA次單元上。抗體典型地在前驅蛋白質之成熟多肽組分內具有抗原決定基。一些抗體特異性結合於活化素A之任一或全部形式而不結合於以α(Swiss Prot P05111)βA或αβB異二聚體形式存在之人類抑制素。一些抗體特異性結合於活化素A之任一或全部形式且結合於人類抑制素之任一或兩種形式。雖然咸信此類抗體經由一個或多個其反受體ACVR2A及/或ACVR2B及/或BMPR2抑制活化素A之信號轉導，但在治療FOP之方法中使用此類抗體無需對機制的理解。
已報導針對活化素A之大量抗體。舉例而言，US2015/00373339揭示名為H4H10423P、H4H10424P、H4H10426P、 H4H10429P、H4H10430P、H4H10432P2、H4H10433P2、H4H10436P2、H4H10437P2、H4H10438P2、H4H10440P2、H4H10442P2、H4H10445P2、H4H10446P2、H4H10447P2、H4H10447P2、H4H10448P2、H4H10452P2之人類抗體。US 8,309,082揭示人類抗體A1-A14。針對活化素A之小鼠抗體可得自若干供應商，諸如MAB3381來自R & D Systems或9H16來自Novus Biologicals或MM0074-7L18(ab89307)來自AbCam。
較佳抗體對活化素A具有至少108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1之親和力(如US2015/00373339之實例3中在25℃下量測)。一些抗體具有在109-1012M-1範圍內之親和力。較佳抗體以小於4nM且較佳小於400pM或40pM之IC50抑制活化素A之信號轉導。一些抗體以在4nM至10pM或3.5nM至35pM範圍內之IC50抑制信號轉導。
信號轉導抑制可如US20150037339之實例6中量測，其如下所概述。將人類A204橫紋肌肉瘤細胞株用Smad 2/3-螢光素酶報導基因質粒轉染以產生A204/CAGAx12-Luc細胞株。將A204/CAGAx12-Luc細胞維持於補充有10%胎牛血清、青黴素/鏈黴素/麩醯胺酸及250μg/mL G418之McCoy's 5A中。對於生物分析，將A204/CAGAx12-Luc細胞於低血清培養基、0.5%FBS及OPTIMEM中以10,000個細胞/孔接種至96孔分析盤上，且在37℃及5%CO2下培育隔夜。將活化素A以1：3自100nM連續稀釋至0.002nM且與不含活化素之對照一起添加至細胞。抗體以1：3連續稀釋，自100至0.002nM、1000至0.02nM或300至0.005nM，包括含有適當同型對照抗體或不含抗體之對照樣品，且在100pM活化素A之恆定濃度下添加至細胞。
如受體自細胞表現或細胞外結構域與Fc結構域融合成融合蛋白且固定融合蛋白以支撐(例如Biacore感測器晶片)時所量測，一些抗體抑制活化素A結合於ACVR2A及/或ACVR2B及/或BMPR2至少1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%。在此類量測中，抗體及活化素A應以等莫耳量存在且受體或細胞外結構域過量存在。
一些抗體結合於全長活化素A之殘基321-343或391-421內之抗原決定基，該等殘基對應於成熟蛋白質之C11-S33及C81-E111。
用於本發明實例之一種例示性抗體在US2015037339中稱為 H4H10446P。其重鏈可變區及重鏈CDR1、CDR2及CDR3分別具有US2015/00373339之SEQ ID NO：162、164、166及168之胺基酸序列(分別為本發明之SEQ ID NO：1-4)。其輕鏈可變區及輕鏈CDR CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有US2015/0037339之SEQ ID NO：146、148、150及152之胺基酸序列(分別為本發明之SEQ ID NO：5-8)。H4H10446P抑制活化素A介導之經由ACVR2A及/或ACVRIIB之信號傳導，但不強烈抑制(即使有)活化素A與ACRIIA或ACVR2B之結合。亦包括與H4H10446P競爭結合於人類活化素A或結合於人類活化素A上與H4H10446P相同之抗原決定基且共享其對信號傳導之抑制的其他抗體。
用於本發明之方法的另一例示性抗體在US2015037339中稱為H4H10430P。其重鏈可變區及重鏈CDR CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有US2015/00373339之SEQ ID NO：66、68、70及72之胺基酸序列(分別為本發明之SEQ ID NO：9-12)。其輕鏈可變區及輕鏈CDR CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有US2015/0037339之SEQ ID NO：74、76、78及80之胺基酸序列(分別為本發明之SEQ ID NO：13-16)。此抗體抑制活化素A結合於ACRV2A及/或ACVR2B且抑制經由此等受體中之一者或兩者的信號轉導。亦包括與H4H10430P競爭結合於活化素A或結合於活化素A上與H4H10430P相同抗原決定基且共享其抑制活化素A結合於ACVR2A及ACVR2B且抑制經由ACVR2A及ACVR2B之信號傳導的特性的其他抗體。
用於本發明之方法的另一例示性抗體為US 8,309,082中稱為A1之抗體，其特徵為US8,309,082中具有序列SEQ ID NO：9及10之輕鏈及重鏈可變區(分別為本發明之SEQ ID NO：17及18)。其輕鏈CDR CDRL1、CDRL2及CDRL3分別具有US8,309,082中序列SEQ ID NO：11、12及13(分別為本發明SEQ ID NO：19-21)，且其重鏈CDR CDRH1、CDRH2及CDRH3分別具有US8,309,082中序列SEQ ID NO：62、63及64(分別為本發明SEQ ID NO：22-24)。亦包括與H4H10430P競爭結合於活化素A或結合於活化素A上與H4H10430P相同抗原決定基且共享其抑制活化素A結合於ACVR2A及/或ACVR2B且抑制經由ACVR2A及/或ACVR2B之信號傳導的特性的其他抗體。
其他抗體可藉由編碼上述抗體任一者之重鏈及輕鏈之cDNA的突變誘發來獲得。本發明亦包括在成熟重鏈及/或輕鏈可變區之胺基酸序列中與上述抗體任一者至少90%、95%或99%一致且維持其功能特性，及/或與相應抗體之不同在於少量功能上不重要之胺基酸取代(例如保守取代)、缺失或插入的單株抗體。亦包括具有與任何例示之抗體之對應CDR 90%、95%、99%或100%一致之至少1、2、3、4、5及較佳全部六個CDR的單株抗體。CDR較佳如Kabat所定義，但可藉由任何習知替代定義，諸如Chothia、複合Kabat-Chothia、接觸定義或AbM定義(參見world wide web bioinf.org.uk/abs)定義。
E. 小分子拮抗劑
ACVR1、ACVR2A及ACVR2B之拮抗劑亦可為小分子拮抗劑。此類小分子拮抗劑可抑制ACVR1、ACVR2A、ACVR2B或活化素A之活性。ACVR1之小分子拮抗劑包括例如LDN-212854，其描述於以引用的方式整體併入本文中之Mohedas等人，(2013)ACS Chem.Biol.8：1291-1302中。
IV. 篩選分析
本文中提供之各種ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑及其變異體或片段之活性可在多種分析中篩選。舉例而言，可針對結合於配位體或結合於ACVR1、ACVR2A或ACVR2B受體之能力、抑制配位體結合於ACVR1及/或ACVR2多肽之能力及/或抑制ACVR1或ACVR2受體之活性之能力篩選ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑及其變異體。
ACVR1或ACVR2拮抗劑或其變異體或片段之活性可在活體外或基於細胞之分析中測試。熟知活體外結合分析及量測受體活性抑制之分析。量測ACVR1、ACVR2A或ACVR2B拮抗劑之活性之各種分析詳細描述於例如以引用的方式整體併入本文中之美國專利No.7,842,663中。
拮抗劑調節ACVR1或ACVR2多肽與其結合蛋白之間的複合物形成之能力可藉由多種技術偵測。舉例而言，可使用例如可偵測標記之蛋白質，諸如放射性標記(例如32P、35S、14C或3H)、螢光標記(例如FITC)或酶標記之ACVR1或ACVR2多肽或其結合蛋白，藉由免疫分析或藉由層析偵測來定量複合物形成之調節。
可監測ACVR1或ACVR2拮抗劑抑制ACVR1或ACVR2受體介導之信號傳導的能力。舉例而言，可使用Smad反應性報導基因監測諸如Smad活化之對下游信號傳導之作用。
亦可在活體內分析中針對活性篩選ACVR1及/或ACVR2拮抗劑及其變異體或片段。舉例而言，可在FOP小鼠模型中針對治療FOP之能力(例如減少異位骨形成之能力)篩選ACVR1或ACVR2拮抗劑或其變異體。已研發轉殖基因敲入小鼠，其攜帶編碼Acvr1[R206H]之條件性對偶基因。此等Acvr1 [R206H]COIN/+小鼠描述於以引用的方式整體併入本文中之US 14/207,320及PCT/US2014/026582中。此對偶基因僅僅在藉由Cre重組酶活化後表現R206H變異體。此允許在特定組織及特定時間藉由使用不同類型之Cre驅動譜系對Acvr1[R206H]表現之Cre依賴性活化。以此方式，所得小鼠亦繞過圍產期死亡率，此在Acvr1[R206H]之未經調節之敲入對偶基因下觀測到。幼年或成年小鼠中Acvr1[R206H]表現之活化引起異位骨形成。舉例而言，Acvr1 [R206H]COIN/+ ；Gt(ROSA26)Sor CreERt2/+小鼠(其中CreERt2為已引入Gt(ROSA26)Sor基因座中之他莫昔芬可調節的重組酶(參見Feil等人(1997)Biochem Biophys Res Commun.237(3)：752-7)，且由此其組成性且整體表現)在暴露於他莫昔芬後出現FOP。簡言之，缺乏他莫昔芬的情況下，CreERt2為非活性。他莫昔芬活化Cre之表現，接著其作用於Acvr1 [R206H]COIN/+以使其轉變成Acvr1 [R206H]/+，由此轉變小鼠之基因型從而反映ACVR1[R206H]FOP患者之基因型。Acvr1 [R206H] 對偶基因表現Acvr1[R206H]，且足以驅動Acvr1 [R206H]/+ ；Gt(ROSA26)Sor CreERt2/+小鼠中FOP之出現。此繞過在習知Acvr1 [R206H] 敲入小鼠Acvr1 tm1Emsh 下經歷之胚胎致死(http：//www.informatics.jax.org/allele/key/828153)。他莫昔芬處理後，ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑或對照可投予Acvr1 [R206H]COIN/+ ；Gt(ROSA26)Sor CreERt2/+小鼠且監測動物之異位骨形成。參見Chakkalakal SA等人，(20120 An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva.J Bone Miner Res.27(8)：1746-56)。此分析詳細描述於以下實例中。
V. 進行性骨化性纖維發育不良(FOP)
FOP為一種罕見之可遺傳病症，其中異位骨化在諸如結締組織之骨骼外位點形成組織學及生物醫學上「正常」之骨骼。此病症雖然為階段性的，但為累積的，且導致嚴重程度漸增之永久殘廢。
FOP之全世界發病率為大概1/2,000,000。FOP無人種、種族、性別或地區偏好。其不僅僅為一種極端致殘疾病，而且亦為一種相當大地縮短壽命之病狀。
FOP之特徵包括例如拇趾之先天畸形、特徵為頭、頸及/或背部上痛苦軟組織腫脹與發炎的發作及異位骨骼經由軟骨內骨化之逐漸形成。
在臨床上可基於拇趾畸形之存在懷疑FOP。諸如x射線或骨骼掃描之診斷測試可證明拇趾異常且證實異位骨化之存在。FOP診斷亦可藉由遺傳測試，例如藉由偵測ACVR1基因中617G至A(R206H)突變來證實。
FOP常常誤診為若干其他病症，包括異位骨化之其他病狀。FOP應與包括例如以下之病症區別診斷：孤立性先天畸形、淋巴水腫、軟組織肉瘤、硬纖維瘤腫瘤、侵襲性幼年纖維瘤病、幼年拇囊炎、孤立性短指崎形、進行性骨發育異常及異位骨化。拇趾先天畸形之存在及痛苦的軟組織發作可用於區分FOP與其他病症。
患有FOP之患者具有拇趾之先天畸形，但在出生時在別的方面看起來正常。與FOP相關聯之發作始於生命頭十年期間。發作可藉由例如軟組織損傷、跌倒、疲勞、病毒感染或肌肉內注射觸發。發作之結果為諸如韌帶、骨骼肌或腱之軟組織轉變成異位骨骼。
FOP先前無治療性治療。FOP藉由預防性措施管理，諸如提高安全性及使損傷減至最少之策略，避免肌肉內注射且在接收牙齒護理時小心。在發作頭24小時內開始之高劑量皮質類固醇治療可幫助減少與發作相關之發炎及浮腫。不建議移除異位骨骼之外科手術策略，因為其起反作用且引起新的外傷誘發之異位骨化。
FOP由似乎使GS結構域與抑制分子FKBP12之相互作用不穩定之ACVR1突變(亦稱ALK2)引起(Groppe,J.等人，2011,Cells Tissues Organs,194：291-295)。FKBP12為ACVR1之負調節劑且用以使受體呈非活性 構形而穩定化(Huse,M.等人，1999,Cell,96：425-436)。參見Kaplan,F.S.等人，2012,Disease Models & Mechanisms,5：756-762。
與FOP相關之ACVR1突變之一個實例為細胞內結構域中精胺酸206至組胺酸(R206H)之突變。
處於發展FOP風險之中的受試者包括具有ACVR1 R206H突變或其他與FOP相關之突變的任何受試者、生來拇趾畸形之受試者或具有FOP家族史但尚未出現足夠由本領域所公認之準則診斷為FOP之FOP症狀的受試者。
VI. 治療方法
本文中提供治療FOP之方法，其包括向患有FOP之受試者投予有效方案之ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑。在一個實施例中，投予有效方案之ACVR2A拮抗劑及ACVR2B拮抗劑。在另一個實施例中，ACVR2A拮抗劑為Fc融合蛋白且ACVR2B拮抗劑為Fc融合蛋白。在另一個實施例中，FOP藉由投予有效方案之針對活化素A之抗體來治療。
用FOP「治療」受試者意謂向患有FOP之受試者投予有效方案之ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑，或針對活化素A之抗體，其中目的為治癒、醫治、減輕、緩和、改變、補救、改善、改良或影響FOP之一個或多個症狀的病狀。
「受試者」為其中希望治療FOP之任何動物(亦即哺乳動物)，諸如人類、靈長類動物、囓齒動物(諸如小鼠及大鼠)、農畜及家畜，諸如犬、貓、牛、馬、豬、綿羊及其類似動物。在任何本發明之方法中，受試者可為哺乳動物且較佳為人類。
有效方案之活化素A、ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑或針對活化素A之抗體意謂在FOP之至少一個徵象或症狀中產生陽性反應的拮抗劑之劑量、頻率及投藥途徑之組合。陽性反應可包括FOP之至少一個徵象或症狀的減少、消除、改善、惡化抑制或延遲。可進行陽性反應之FOP的徵象或症狀包括例如異位或異位骨形成、FOP發作或與發作相關之疼痛及腫脹。可在單個患者中，藉由比較治療前後之徵象及症狀來評估方案。若在治療後至少一個徵象或症狀得到陽性反應，則方案視為有效。或 者或另外，方案可藉由將用本發明之一或多種拮抗劑治療的受試者群體的徵象及症狀與未接收治療之對照受試者群體比較來評估。此類比較之受試者可為動物模型，或臨床試驗中之人類受試者(例如I期、II期、IIa期、IIb期或III期)。若至少一個徵象或症狀中群體之間存在統計上顯著之陽性反應，則方案視為有效。
在治療FOP之一些方法中，受試者未患可用針對ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B之拮抗劑或針對活化素A之抗體治療的其他病狀且不處於該等其他病狀風險之中。舉例而言，受試者可無任何或所有II型糖尿病、肌肉萎縮、肌萎縮性側索硬化(ALS)及骨質疏鬆症。
A. 投予方法
ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑或針對活化素A之抗體通常呈蛋白質或小分子形式直接投予，但在蛋白質情況下，亦可呈編碼此類蛋白質之核酸形式投予。此類拮抗劑可藉由各種方法投予，諸如細胞轉染、基因療法、與傳遞媒劑或醫藥學上可接受之載劑一起直接投予、藉由提供包含編碼本文中提供之ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑或針對活化素A之抗體的核酸之重組細胞間接傳遞。
各種傳遞系統可用於投予本文中提供之ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑，或針對活化素A之抗體，例如囊封在脂質體、微粒、微膠囊、能夠表現化合物之重組細胞、受體介導之胞吞作用(參見例如Wu及Wu,1987,J.Biol.Chem.262：4429-4432)、構築核酸作為逆轉錄病毒或其他載體之一部分等等。
投予方法可經腸或非經腸且包括皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、肺、鼻內、眼內、硬膜外及經口途徑。化合物可藉由任何便利途徑，例如藉由輸注或快速注射，藉由經上皮或黏膜與皮膚內層(例如口腔黏膜、直腸及腸黏膜等等)吸收來投予，且可與其他生物活性劑一起投予。投予可為全身性或局部。另外，可需要將本發明之醫藥組合物藉由任何適合途徑，包括心室內及鞘內注射引入中樞神經系統；心室內注射可藉由例如附接至儲槽，諸如Omcana儲槽之心室內導管來推動。亦可採用經肺投予，例如藉由使用吸入器或噴霧器，及用霧化劑調配。
本發明之醫藥組合物可局部投予需要治療之區域；此可例如藉由在手術期間局部輸注、例如藉由注射、藉助於導管或藉助於植入物(該植入物具有多孔、無孔或凝膠狀材料，包括膜，諸如矽橡膠膜、纖維或商業皮膚替代品)局部施用來實現。
在另一個實施例中，活性劑可於微泡、尤其脂質體中傳遞(參見Langer(1990)Science 249：1527-1533)。在另一個實施例中，活性劑可於控制釋放系統中傳遞。在一個實施例中，可使用幫浦(參見Langer(1990)上文)。在另一個實施例中，可使用聚合物材料(參見Howard等人(1989)J.Neurosurg.71：105)。在另一個實施例中，在本發明之活性劑為編碼蛋白質之核酸的情況下，核酸可藉由將其構築為適當核酸表現載體之一部分且例如藉由使用逆轉錄病毒載體投予其使得其變成細胞內(參見例如美國專利第4,980,286號)，或藉由直接注射，或藉由使用微粒轟擊，或用脂質或細胞表面受體或轉染試劑覆蓋，或藉由將其與已知進入核之間源框樣肽連接投予(參見例如Joliot等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1864-1868)等等，在活體內投予以促進其編碼蛋白質之表現。或者，核酸可引入細胞內且併入宿主細胞DNA內以藉由同源重組來表現。
B. 組合療法
本文所提供之ACVR1、ACVR2A及ACVR2B拮抗劑或針對活化素A之抗體可彼此或與其他治療組合投予。在一個實施例中，治療FOP之方法包括共同投予ACVR2A拮抗劑及ACVR2B拮抗劑。在另一個實施例中，治療FOP之方法包括共同投予ACVR1、ACVR2A及ACVR2B拮抗劑。在其他實施例中，ACVR1拮抗劑可與ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑共同投予。ACVR1、ACVR2A及ACVR2B拮抗劑可呈分開醫藥組合物形式投予或可呈包含此等藥劑組合的單一醫藥組合物形式投予。單獨或組合之ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑或針對活化素A之抗體可結合一或多種額外治療化合物投予。組合療法可涵蓋同時或交替投予。另外，組合可涵蓋急性或慢性投予。
C. 醫藥組合物
本發明亦提供包含本文所提供之活化素A、ACVR1、ACVR2A 及/或ACVR2B拮抗劑或針對活化素A之抗體及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。術語「醫藥學上可接受」意謂經聯邦政府或州政府之管理機構批准或在美國藥典或其他一般公認之藥典中列出用於動物且更尤其用於人類中。術語「載劑」係指與治療劑一起投予之稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。此類醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油類，諸如花生油、豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。適合醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇及其類似物。必要時組合物亦可含有少量濕潤或乳化劑或pH值緩衝劑。
此等組合物可採取溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、散劑、持久釋放調配物及其類似物之形式。組合物可用諸如甘油三酸酯之傳統黏合劑及載劑調配為栓劑。口服調配物可包括標準載劑，諸如醫藥等級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等等。適合醫藥載劑之實例描述於E.W.Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中。
在一個實施例中，組合物根據常規程序調配為適合於靜脈內投予人類之醫藥組合物。必要時，組合物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑，諸如利多卡因(lidocaine)以緩解注射部位之疼痛。當組合物藉由輸注投予時，其可與含有無菌醫藥等級水或生理食鹽水之輸液瓶一起分配。當組合物藉由注射投予時，可提供滅菌注射水或生理食鹽水之安瓿以便成分可在投予之前混合。
本文所提供之活化素A、ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑或針對活化素A之抗體可呈中性或鹽形式調配。醫藥學上可接受之鹽包括彼等與游離胺基形成之鹽，諸如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸及其類似物之鹽，及彼等與游離羧基形成之鹽，諸如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙基胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因及其類似物之鹽。
活化素A、ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B拮抗劑或針對活化素A之抗體藉由指定途徑投予的有效治療FOP的量及頻率(例如有效方案)可藉由標準臨床技術，基於本發明之描述來確定。另外，活體外分析可用以幫 助鑒別最佳劑量範圍。用於調配物中之準確劑量亦視投藥途徑及病狀嚴重性而定，且應根據開業醫師之判斷及各受試者之情形決定。然而，適合於非經腸投予、較佳靜脈內或皮下投予之劑量範圍一般為每公斤體重約20-50000微克活性化合物。對於活化素A之抗體，適合劑量範圍包括1-25mg/kg、2-20mg/kg、5-15mg/kg、8-12mg/kg及10mg/kg。
適合於鼻內投予之劑量範圍一般為每公斤體重約0.01pg至每公斤體重1mg。有效劑量可自來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推。
投予頻率亦視病狀之嚴重程度及藥劑之半衰期以及其他因素而改變，但典型地在每日與每季之間，包括例如每週兩次、每週一次、每兩週一次、每月一次、每兩月一次。亦可以對患者病狀或藥劑血清含量降至低於閾值以及其他因素起反應之不定時間間隔投予藥劑。
上文或下文引用之全部專利申請、網址、其他公開案、寄存編號及其類似物均以全文引用的方式併入本文中以達成所有目的，其引用程度如同各個別條款特定且個別地指示以引用的方式併入一般。若不同型式之序列在不同時期與寄存編號相關聯，則意謂在本申請之有效申請日期時與寄存編號相關之型式。有效申請日期意謂早於提及寄存編號之優先申請案之實際申請日期或申請日期(適用時)。同樣，若不同型式之公開案、網址或其類似物在不同時期公開，則除非另外指明，否則意謂在本申請案之有效申請日期時最近公佈之型式。除非另外特別指示，否則本發明之任何特徵、步驟、元件、實施例或方面均可與任何其他組合使用。
實例
實例1：在FOP小鼠模型中使用ACVR2A-Fc/ACVR2B-Fc抑制異位骨形成。
藉由ACVR2A-Fc/ACVR2B-Fc治療保護Acvr1 [R206H]COIN/+ ；Gt(ROSA26)Sor CreERt2/+在他莫昔芬治療後免於異位骨形成。
FOP之小鼠模型(稱為Acvr1 [R206H]COIN/+ ；Gt(ROSA26)Sor CreERt2/+)以每只小鼠1mg劑量腹膜內給與他莫昔芬八天。每週將11只小鼠用10mg/kg ACVR2A-Fc及10mg/kg ACVR2B-Fc處理兩次，且每週將10只小鼠用10 mg/kg對照mFc處理兩次，歷時6週。使用活體內μCT在基線、開始投予他莫昔芬後2、4及6週監測小鼠。6週後，mFc組中10只小鼠中之9只已在至少一個位置中出現異位骨，相比之下，ACVR2A-Fc及ACVR2B-Fc組中11只小鼠中僅僅2只展示出現異位骨且此骨尺寸小。此等結果展示於圖1中。
實例2：在FOP小鼠模型中使用ACVR1激酶小分子抑制劑抑制異位骨形成。
藉由ACVR1激酶抑制劑LDN-212854治療保護Acvr1 [R206H]COIN/+ ；Gt(ROSA26)Sor CreERt2/+在他莫昔芬治療後免於異位骨形成。
16只Acvr1 [R206H]COIN/+ ；Gt(ROSA26)Sor CreERt2/+小鼠以每只小鼠1mg劑量腹膜內給與他莫昔芬八天。每日將八隻小鼠用3mg/kg ACVR1激酶抑制劑LDN-212854(Mohedas等人(2013)ACS Chem.Biol.8：1291-1302)處理兩次，歷時4週。每日將八隻小鼠用媒劑對照處理兩次，歷時4週。使用活體內μCT在基線、開始投予他莫昔芬後2及4週監測小鼠。4週後，媒劑對照組中8只小鼠中之8只展示異位骨形成，此等小鼠中之6只中異位骨病變的尺寸巨大。相比之下，在經LDN-212854處理之組中，8只小鼠中之3只展示異位骨形成，在該3只小鼠中形成之異位骨病變的尺寸比媒劑對照組小。此等結果展示於圖2中。
實例3：在FOP小鼠模型中使用針對活化素A之抗體抑制異位骨形成。
將23只Acvr1 [R206H]COIN/+；Gt(ROSA26) SorCreERt2/+小鼠以每只小鼠1mg劑量腹膜內用他莫昔芬處理八天。每週將七隻小鼠用25mg/kg同型對照抗體處理兩次，每週將八隻小鼠用25mg/kg活化素A抗體(H4H10446P)處理兩次，且每週將八隻小鼠用10mg/kg ACVR2a-Fc處理兩次，歷時3週。用此等試劑處理與開始他莫昔芬治療同時開始。使用活體內微電腦斷層攝影術(μCT)在基線、開始投予他莫昔芬後2及3週監測小鼠。圖3展示3週後，同型對照抗體組中之全部小鼠均在至少一個位置出現異位骨，相比之下，此時活化素A抗體組中無小鼠展示出現異位骨。ACVR2a-Fc組中兩隻小鼠在第3週出現異位骨。
實例4： 藉由活化素A與Acvr2a及Acvr2b阻斷抗體保護Acvr1[R206H]COIN/+； Gt(ROSA26)sorCreERt2/+在他莫昔芬治療後免於異位骨形成。
將26只Acvr1[R206H]COIN/+；Gt(ROSA26)SorCreERt2/+小鼠以每公斤40mg劑量腹膜內給與他莫昔芬八天。八隻小鼠用10mg/kg同型對照抗體(REGN1945)處理，九隻小鼠用10mg/kg活化素A抗體(H4H10446P)(REGN2477)處理，且九隻小鼠用10mg/kg Acvr2a/Acvr2b抗體處理，每週兩次，歷時6週。使用活體內μCT在基線、開始投予他莫昔芬後2、3及4週監測小鼠。圖4展示4週後，同型對照抗體組中8只小鼠中之7只在至少一個位置已出現異位骨，相比之下，活化素A抗體處理組中僅僅一隻小鼠及Acvr2a/Acvr2b抗體處理組中三隻小鼠在第4週出現異位骨。在抗體處理組中形成之異位骨之尺寸小於同型對照處理組。
實例5： 藉由活化素A阻斷抗體保護Acvr1[R206H]COIN/+；Gt(ROSA26)SorCreERt2/+在他莫昔芬治療後免於異位骨形成。
將35只Acvr1[R206H]COIN/+；Gt(ROSA26)SorCreERt2/+小鼠以每公斤40mg劑量腹膜內給與他莫昔芬八天。八隻小鼠用25mg/kg同型對照抗體(REGN1945)處理，九隻小鼠用25mg/kg活化素A抗體(H4H10446P)(REGN2477)處理，九隻小鼠用10mg/kg活化素A抗體(REGN2477)處理，且九隻小鼠用1mg/kg活化素A抗體(REGN2477)處理，一週一次，歷時6週。使用活體內μCT在基線、開始投予他莫昔芬後2、3、4及6.5週監測小鼠。各小鼠中異位骨之體積由μCT影像計算。圖5展示4週後，同型對照抗體組之全部小鼠均在至少一個位置出現異位骨，而各活化素A抗體處理組中僅僅為2只小鼠。在第6.5週，同型處理組中異位骨之平均總體積為65.4mm3，相比之下，25mg/kg活化素抗體處理組中為1.87mm3，10mg/kg活化素抗體處理組中為0.3mm3，且1mg/kg活化素抗體處理組中為7.3mm3。
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Claims (29)

  1. 一種治療進行性骨化性纖維發育不良(FOP)之方法，其包括向FOP患者投予有效方案之活化素受體類型2A(ACVR2A)及/或活化素受體類型2B(ACVR2B)拮抗劑。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該拮抗劑包含ACVR2A及/或ACVR2B細胞外結構域。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該拮抗劑包含ACVR2A或ACVR2B Fc融合蛋白。
  4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該Fc融合蛋白之同型為人類IgG1。
  5. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該拮抗劑包含連接於ACVR2B細胞外結構域之ACVR2A細胞外結構域。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該拮抗劑進一步包含Fc結構域。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中該拮抗劑包含融合於第一Fc結構域之ACVR2A細胞外結構域及融合於第二Fc結構域之ACVR2B細胞外結構域，其中該第一及該第二Fc結構域彼此複合。
  8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該拮抗劑在各融合於Fc結構域之ACVR2A與ACVR2B細胞外結構域之間包含連接子。
  9. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該拮抗劑為包含ACVR2A細胞外結構域、ACVR2B細胞外結構域及Fc結構域之融合蛋白。
  10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中投予有效方案之ACVR2A拮抗劑及ACVR2B拮抗劑。
  11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該ACVR2A拮抗劑為ACVR2A Fc融合蛋白且該ACVR2B拮抗劑為ACVR2B Fc融合蛋白。
  12. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該拮抗劑為ACVR2A或ACVR2B之抗體。
  13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該患者未罹患II型糖尿病、肌肉萎縮、肌萎縮性側索硬化(ALS)或骨質疏鬆症且不處於該等病症之風險中。
  14. 一種治療進行性骨化性纖維發育不良(FOP)之方法，其包括向FOP患者投予有效方案之活化素受體類型1(ACVR1)拮抗劑。
  15. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該拮抗劑包含ACVR1細胞外結構域。
  16. 如申請專利範圍第15項之方法，其中該拮抗劑包含ACVR1融合蛋白。
  17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該Fc融合蛋白之同型為人類IgG1。
  18. 如申請專利範圍第14項之方法，其中該拮抗劑為ACVR1之抗體。
  19. 一種治療進行性骨化性纖維發育不良(FOP)之方法，其包括向FOP患者投予有效方案之活化素受體類型2A(ACVR2A)及/或活化素受體類型2B(ACVR2B)拮抗劑以及活化素受體類型1(ACVR1)拮抗劑。
  20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該拮抗劑包含ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B細胞外結構域。
  21. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該拮抗劑包含ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B Fc融合蛋白。
  22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該Fc融合蛋白之同型為人類IgG1。
  23. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該拮抗劑為ACVR1、ACVR2A及/或ACVR2B之抗體。
  24. 一種治療進行性骨化性纖維發育不良(FOP)之方法，其包括向FOP患者投予有效方案之針對活化素A之抗體。
  25. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該抗體與包含名為H4H10446P、H4H10430P或A1之抗體之重鏈及輕鏈可變區的抗體競爭結合。
  26. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該抗體包含名為H4H10446P、H4H10430P或A1之抗體之重鏈及輕鏈可變區。
  27. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該抗體為嵌合、鑲飾、人類化或人類抗體。
  28. 如申請專利範圍第24項之方法，其中該抗體為完整抗體。
  29. 如申請專利範圍第24項至第28項中任一項之方法，其中該抗體為人類κ IgG1抗體。
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