CN115243763A - 治疗进行性骨化性纤维发育不良 - Google Patents

Abstract

提供了用于治疗人类受试者的进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的方法。此类方法涉及向患有FOP的受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂，如针对激活素A的抗体。

Description

治疗进行性骨化性纤维发育不良

相关申请

本申请要求以下申请的优先权：于2020年1月8日提交的美国临时申请第62/958,448号；于2020年9月10日提交的美国临时申请第63/076,691号；以及于2020年9月22日提交的美国临时申请第63/081,428号，所述美国临时申请的全部内容通过引用以其整体明确并入本文。

背景技术

进行性骨化性纤维发育不良(FOP)，也被称为明希迈尔病(Munchmeyer disease)，为特征在于骨骼肌和相关结缔组织的早发性、发作性和进行性骨化的常染色体显性遗传病症。在FOP受试者体内，骨形成于正常骨架之外的软组织中，这是被称为异位骨化(HO)的过程，其可能导致次骨架发育并逐步限制患者移动的能力。去除新骨形成已显示出是无效的并且导致额外新骨生长的发展。

FOP受ACVR1(ALK2)的胞内结构域中的突变驱动，其中大多数突变将精氨酸206变为组氨酸(R206H)(Pignolo,R.J.等人2011,《罕见疾病杂志(Orphanet J.Rare Dis.)》6:80)。ACVR1为骨形态发生蛋白(BMP)的I型受体。据信，R206H突变等增加了受体对激活的敏感度并且使受体对沉默更有耐性。

尽管已使用了某些类型的药物以缓解急性发作(flare-up)期间与FOP相关的疼痛和肿胀，但目前已知没有针对FOP的有效医学治疗。

发明内容

本公开提供了一种治疗进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的方法，所述方法包括向患有FOP的受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂。具体地，本申请的发明者惊人发现，仅在人体内进行II期临床试验之后，用激活素A拮抗剂对FOP受试者进行治疗才会降低和/或预防新异位骨化(HO)骨生长的发展并且降低病变生长和矿化的平均速率。

在本公开的一个方面提供了一种治疗进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的方法，所述方法包括向患有FOP的人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂，由此治疗所述FOP。

在一些实施例中，所述激活素A拮抗剂为抗激活素A抗体或其抗原结合片段。在一些实施例中，所述抗体竞争与包括命名为H4H10446P、H4H10430P或A1的抗体的重链可变区和轻链可变区的所述抗体结合。在一些实施例中，所述抗体包括所述命名为H4H10446P、H4H10430P或A1的抗体的重链可变区和轻链可变区。在一些实施例中，所述抗体为嵌合抗体、饰面(veneered)抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施例中，所述抗体为完整抗体。在一些实施例中，所述抗体为人κIgG1抗体。在一些实施例中，所述抗体以与ACVR1、ACVR2A或ACVR2B胞外结构域-Fc融合蛋白的组合疗法的形式施用。

本公开进一步提供了一种激活素A的拮抗剂，其用于在治疗进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的方法中使用，所述方法包括向患有FOP的受试者施用治疗有效量的所述激活素A的拮抗剂。任选地，所述激活素A拮抗剂为抗激活素A抗体或其抗原结合片段。任选地，本公开提供了一种抗激活素A抗体或其抗原结合片段在制造用于治疗FOP的药物中的用途。任选地，所述抗体为嵌合抗体、饰面抗体、人源化抗体或人抗体。任选地，所述抗体为完整抗体。任选地，所述抗体为人κIgG1抗体。任选地，所述抗体以与ACVR1、ACVR2A或ACVR2B胞外结构域-Fc融合蛋白的组合疗法的形式施用。

一方面，本公开提供了一种减少在患有FOP的人类受试者体内形成新异位骨化病变的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂，由此减少在所述人类受试者体内形成新异位骨化病变。

在一个实施例中，预防在所述人类受试者体内形成新异位骨化病变。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少5％-90％、至少10％-90％、至少20％-90％、至少30％-90％、至少40％-90％、至少50％-90％、至少60％-90％、至少70％-90％、至少80％-90％、至少5％-80％、至少5％-70％、至少5％-60％、至少5％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5％-50％、至少10％-50％、至少20％-50％、至少30％-50％、至少40％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5％-50％、至少10％-50％、至少20％-50％、至少30％-50％、至少40％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5％-50％、至少10％-50％、至少20％-50％、至少30％-50％、至少40％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出所述异位骨化病变的总体病变活性(TLA)降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少5％-80％、至少10％-80％、至少20％-80％、至少30％-80％、至少40％-80％、至少50％-80％、至少60％-80％、至少70％-80％、至少5％-70％、至少5％-60％、至少5％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.2倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、0.2倍到3倍、0.5倍到3倍、1倍到3倍、1.5倍到3倍、2倍到3倍、2.5倍到3倍、0.2倍到2.5倍、0.2倍到2倍、0.2倍到1.5倍、0.2倍到1倍或0.2倍到0.5倍。

在一个实施例中，所述对照为从尚未施用所述激活素A拮抗剂的患有FOP的人类受试者的群体采集的平均测量结果或值。

在一个实施例中，相对于对照，所述治疗有效量的激活素A拮抗剂减少了所述人类受试者的急性发作的发生。

在一个实施例中，通过正电子发射断层(PET)扫描、计算机断层(CT)扫描或其组合分析所述新异位骨化病变。在一个实施例中，所述PET扫描分析通过向所述人类受试者施用放射性标记的¹⁸F氟化钠(¹⁸F-NaF)进行。

在一个实施例中，向所述人类受试者施用所述治疗有效量的激活素A拮抗剂，持续至少8周。

在一个实施例中，所述方法进一步包括选择将受益于新异位骨化病变的形成不断减少的患有FOP的受试者。在一个实施例中，所述将受益于新异位骨化病变的形成不断减少的受试者将要经历外科手术。

在一个实施例中，所述人类受试者将要经历针对FOP的治疗性治疗。

在一个实施例中，所述激活素A拮抗剂未减少所述人类受试者体内任何预先存在的病变的数量、体积或大小。

在一个实施例中，所述激活素A拮抗剂为蛋白质或小分子。

在一个实施例中，所述激活素A拮抗剂为抗激活素A抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体、饰面抗体、人源化抗体或人抗体或其抗原结合片段。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段为人κIgG1抗体。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括以下六种CDR序列：(a)与序列GGSFSSHF具有至少约80％同一性的HCDR1；(b)与序列ILYTGGT具有至少约80％同一性的HCDR2；(c)与序列ARARSGITFTGIIVPGSFDI具有至少约80％同一性的HCDR3；(d)与序列QSVSSSY具有至少约80％同一性的LCDR1；(e)与序列GAS具有至少约80％同一性的LCDR2；以及(f)与序列QQYGSSPWT具有至少约80％同一性的LCDR3。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括以下六种CDR序列：(a)具有序列GGSFSSHF的HCDR1；(b)具有序列ILYTGGT的HCDR2；(c)具有序列ARARSGITFTGIIVPGSFDI的HCDR3；(d)具有序列QSVSSSY的LCDR1；(e)具有序列GAS的LCDR2；以及(f)具有序列QQYGSSPWT的LCDR3。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的轻链可变区。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的轻链可变区。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:5的轻链可变区。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:25的重链和包含SEQ ID NO:26的轻链。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的轻链可变区。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段与包括以下六种CDR序列的抗体竞争结合：(a)具有序列GGSFSSHF的HCDR1；(b)具有序列ILYTGGT的HCDR2；(c)具有序列ARARSGITFTGIIVPGSFDI的HCDR3；(d)具有序列QSVSSSY的LCDR1；(e)具有序列GAS的LCDR2；以及(f)具有序列QQYGSSPWT的LCDR3。

在一个实施例中，所述激活素A拮抗剂与第二疗法组合施用。

另一方面，本公开提供了一种预防在患有FOP的人类受试者体内形成新异位骨化病变的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂，由此减少在所述人类受试者体内形成新异位骨化病变。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少5％-90％、至少10％-90％、至少20％-90％、至少30％-90％、至少40％-90％、至少50％-90％、至少60％-90％、至少70％-90％、至少80％-90％、至少5％-80％、至少5％-70％、至少5％-60％、至少5％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5％-50％、至少10％-50％、至少20％-50％、至少30％-50％、至少40％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5％-50％、至少10％-50％、至少20％-50％、至少30％-50％、至少40％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5％-50％、至少10％-50％、至少20％-50％、至少30％-50％、至少40％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出所述异位骨化病变的总体病变活性(TLA)降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少5％-80％、至少10％-80％、至少20％-80％、至少30％-80％、至少40％-80％、至少50％-80％、至少60％-80％、至少70％-80％、至少5％-70％、至少5％-60％、至少5％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

在一个实施例中，相对于对照，所述人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.2倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、0.2倍到3倍、0.5倍到3倍、1倍到3倍、1.5倍到3倍、2倍到3倍、2.5倍到3倍、0.2倍到2.5倍、0.2倍到2倍、0.2倍到1.5倍、0.2倍到1倍或0.2倍到0.5倍。

在一个实施例中，所述对照为从尚未施用所述激活素A拮抗剂的患有FOP的人类受试者的群体采集的平均测量结果或值。

在一个实施例中，相对于对照，所述治疗有效量的激活素A拮抗剂减少了所述人类受试者的急性发作的发生。

在一个实施例中，通过正电子发射断层(PET)扫描、计算机断层(CT)扫描或其组合分析所述新异位骨化病变。在一个实施例中，所述PET扫描分析通过向所述人类受试者施用放射性标记的¹⁸F氟化钠(¹⁸F-NaF)进行。

在一个实施例中，向所述人类受试者施用所述治疗有效量的激活素A拮抗剂，持续至少8周。

在一个实施例中，所述方法进一步包括选择将受益于新异位骨化病变的形成不断减少的患有FOP的受试者。在一个实施例中，所述将受益于新异位骨化病变的形成不断减少的受试者将要经历外科手术。

在一个实施例中，所述人类受试者将要经历针对FOP的治疗性治疗。

在一个实施例中，所述激活素A拮抗剂未减少所述人类受试者体内任何预先存在的病变的数量、体积或大小。

在一个实施例中，所述激活素A拮抗剂为蛋白质或小分子。

在一个实施例中，所述激活素A拮抗剂为抗激活素A抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体、饰面抗体、人源化抗体或人抗体或其抗原结合片段。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段为人κIgG1抗体。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括以下六种CDR序列：(a)与序列GGSFSSHF具有至少约80％同一性的HCDR1；(b)与序列ILYTGGT具有至少约80％同一性的HCDR2；(c)与序列ARARSGITFTGIIVPGSFDI具有至少约80％同一性的HCDR3；(d)与序列QSVSSSY具有至少约80％同一性的LCDR1；(e)与序列GAS具有至少约80％同一性的LCDR2；以及(f)与序列QQYGSSPWT具有至少约80％同一性的LCDR3。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括以下六种CDR序列：(a)具有序列GGSFSSHF的HCDR1；(b)具有序列ILYTGGT的HCDR2；(c)具有序列ARARSGITFTGIIVPGSFDI的HCDR3；(d)具有序列QSVSSSY的LCDR1；(e)具有序列GAS的LCDR2；以及(f)具有序列QQYGSSPWT的LCDR3。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的轻链可变区。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的轻链可变区。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:5的轻链可变区。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:25的重链和包含SEQ ID NO:26的轻链。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的轻链可变区。

在一个实施例中，所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段与包括以下六种CDR序列的抗体竞争结合：(a)具有序列GGSFSSHF的HCDR1；(b)具有序列ILYTGGT的HCDR2；(c)具有序列ARARSGITFTGIIVPGSFDI的HCDR3；(d)具有序列QSVSSSY的LCDR1；(e)具有序列GAS的LCDR2；以及(f)具有序列QQYGSSPWT的LCDR3。

在一个实施例中，所述激活素A拮抗剂与第二疗法组合施用。

附图说明

图1示出了用于评估抗激活素A拮抗剂在异位骨的总体病变活性和体积方面的影响的双盲研究。

图2A和2B示出了PET成像，其展示了FOP疾病进展(图2A)和激活素A拮抗剂对异位骨化(HO)病变的影响(图2B)。

图3A示出了，如通过PET成像分析的，用激活素A拮抗剂进行治疗将总体病变活性降低了大约25％(p＝.074)；通过CT分析也观察到相似降低。

图3B示出了来自PET/CT成像分析的结果，其展示了在将现有(“靶标”)病变与新病变分开检查时，激活素A拮抗剂的影响更明显。

图4描绘了在活跃HO分析组(AHO)中通过¹⁸F-NaF PET得到的总体病变活性相对于基线的变化百分比。

图5描绘了在活跃HO分析组(AHO)中通过数字评定量表(NRS)得到的每周平均疼痛相对于基线的变化。

图6描绘了在活跃HO分析组(AHO)中在第28周时通过¹⁸F-NaF PET得到的在双盲时间段具有新病变的患者的新病变的总体病变活性。

图7描绘了在活跃HO分析组(AHO)中通过¹⁸F-NaF PET得到的具有新HO病变的患者的百分比。

图8描绘了在活性HO分析组(AHO)中在第28周时通过CT得到的在双盲时间段具有新病变的患者的总体新病变体积。

图9描绘了在活跃HO分析组(AHO)中通过CT得到的具有新HO病变的患者的百分比。

图10示出了示例性抗激活素A单克隆抗体的重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列(分别为SEQ ID NOs:25和26)。

定义

拮抗剂通常以单独形式提供。这意味着拮抗剂通常为至少50w/w％纯的干扰蛋白质和由干扰蛋白质的产生或纯化产生的其它污染物，但不排除拮抗剂与过量的药学上可接受的载体或旨在促进其使用的其它媒剂组合的可能性。有时，拮抗剂为至少60w/w％、70w/w％、80w/w％、90w/w％、95w/w％或99w/w％纯的干扰蛋白质和由产生或纯化产生的污染物。

出于将氨基酸取代分类为保守或非保守的目的，将氨基酸如下分组：第I组(疏水侧链)：met、ala、val、leu、ile；第II组(中性亲水侧链)：cys、ser、thr；第III组(酸侧链)：asp、glu；第IV组(碱侧链)：asn、gln、his、lys、arg；第V组(影响链取向的残基)：gly、pro；以及第VI组(芳香族侧链)：trp、tyr、phe。保守取代涉及同一类别的氨基酸之间的取代。非保守取代构成了用这些类别之一的成员交换另一种类别的成员。

序列同一性百分比用通过针对可变区的Kabat编号规定或针对恒定区的EU编号最大比对的抗体序列确定。对于其它蛋白质，可以通过使用算法，如威斯康星州麦迪逊科学大道575号遗传学计算机集团威斯康星遗传学软件包7.0发行版(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI)中的BESTFIT、FASTA和TFASTA，使用默认缺口参数比对序列，或者通过检查和最佳比对来确定序列同一性。比对之后，如果将受试者抗体区(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区进行比较，则受试者抗体区与参考抗体区之间的序列同一性百分比为被受试者抗体区和参考抗体区两者中的相同氨基酸占据的位置的数量除以两个区的所比对的位置的总数(其中间隙未计数)，乘以100以转化为百分比。

“包括(comprising)”一种或多种所列举的元素的组合物或方法可以包含其它未具体列举的元素。例如，包括抗体的组合物可以含有单独的抗体或与其它成分的组合。

人源化抗体为经遗传工程化的抗体，其中来自非人“供体”抗体的CDR被接枝到人“受体”抗体序列中(参见例如Queen,US 5,530,101和5,585,089；Winter,US 5,225,539；Carter,US 6,407,213；Adair,US 5,859,205和6,881,557；Foote,US 6,881,557)。受体抗体序列可以为例如成熟人抗体序列、此类序列的复合体、人抗体序列的共有序列或胚系区序列。因此，人源化抗体为具有完全或基本上来自供体抗体和可变区框架序列的一些或全部CDR以及完全或基本上来自人抗体序列的恒定区(如果存在的话)的抗体。类似地，人源化重链具有完全或基本上来自供体抗体重链的至少一个、两个和通常所有三个CDR以及基本上来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在的话)。类似地，人源化轻链具有完全或基本上来自供体抗体轻链的至少一个、两个和通常所有三个CDR以及基本上来自人轻链可变区框架和恒定区序列的轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在的话)。除了纳米抗体和dAb之外，人源化抗体包括人源化重链和人源化轻链。当相应CDR之间的对应残基(如通过Kabat所定义的)中的至少85％、90％、95％或100％相同时，人源化抗体中的CDR基本上来自非人抗体中的对应CDR。当通过Kabat定义的对应残基中的至少85％、90％、95％或100％相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区基本上分别来自人可变区框架序列或人恒定区。

尽管人源化抗体通常掺入了来自小鼠抗体的所有六个CDR(优选地如通过Kabat定义的)，但其还可以被制成有少于所有CDR(例如，来自小鼠抗体的至少3个、4个或5个CDR)(例如Pascalis等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》169:3076,2002；Vajdos等人,《分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)》,320:415-428,2002；Iwahashi等人,《分子免疫学(Mol.Immunol.)》36:1079-1091,1999；Tamura等人,《免疫学杂志(Journal ofImmunology)》,164:1432-1441,2000)。

嵌合抗体为其中非人抗体(例如，小鼠)的轻链和重链的成熟可变区与人轻链和重链恒定区组合的抗体。此类抗体基本上或完全保留了小鼠抗体的结合特异性并且为约三分之二人序列。

饰面抗体为一种类型的人源化抗体，其保留了非人抗体的CDR中的一些和通常所有CDR以及非人可变区框架残基中的一些非人可变区框架残基，但用来自人抗体序列的对应位置处的残基取代可以有助于B细胞或T细胞表位的其它可变区框架残基，例如，暴露残基(Padlan,《分子免疫学》28:489,1991)。结果是其中CDR完全或基本上来自非人抗体并且非人抗体的可变区框架通过取代变得更类似于人的抗体。

人抗体可以从人体中分离或可以以其它方式由人免疫球蛋白基因的表达产生(例如，在转基因小鼠体内、在体外或通过噬菌体展示)。用于产生人抗体的方法包含以下的trioma方法：Oestberg等人,《Cys muoma》2:361-367(1983)；Oestberg,美国专利第4,634,664号；以及Engleman等人,美国专利第4,634,666号。单克隆抗体还可以通过承载人免疫系统基因的转基因小鼠产生，如来自再生元制药公司(Regeneron Pharmaceuticals,Inc.)的

小鼠(Murphy,《美国国家科学院院刊(PNAS)》111 14期,5153-5158(2014))Xenomouse(Jakobovits,《自然生物学技术(Nature Biotechnology)》25,1134-1143(2007))或来自Medarex公司(Medarex,Inc.)的HuMAb小鼠(Lonberg,《实验药理学手册(Handbook Exp.Pharmacol.)》181,69-97(2008)；Lonberg等人,WO93/12227(1993)；US 5,877,397；US 5,874,299；US 5,814,318；US 5,789,650；US 5,770,429；US 5,661,016；US5,633,425；US 5,625,126；US 5,569,825；US 5,545,806；《自然(Nature)》148,1547-1553(1994)；《自然生物学技术》14,826(1996)；Kucherlapati,WO 91/10741(1991)。人抗体还可以通过噬菌体展示方法产生(参见例如Dower等人,WO 91/17271和McCafferty等人,WO 92/01047、US 5,877,218、US 5,871,907、US 5,858,657、US 5,837,242、US 5,733,743和US 5,565,332)。

当据称拮抗剂保留其所衍生自的亲本抗体的性质时，保留可以是完整的或部分的。完整保留活性意味着拮抗剂的活性在实验误差内相同或大于其所衍生的分子的活性。部分保留活性意味着活性显著高于阴性对照的背景水平(即，超出实验误差)并且优选地为其所衍生的分子的对应活性的至少50％。

如果抗原中减少或消除一种抗体的结合的所有氨基酸突减少或消除了另一种抗体的结合，则两种抗体具有同一表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除了另一种抗体的结合，则两种抗体具有重叠表位。

通过其中测试下的抗体抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合的测定确定抗体之间的竞争(参见例如，Junghans等人,《癌症研究(Cancer Res.)》50:1495,1990)。如果过量的测试抗体(例如，至少2×、5×、10×、20×或100×)将参考抗体的结合抑制了至少50％，但优选地抑制了75％、90％或99％，如通过竞争性结合测定的测量的，则测试抗体与参考抗体竞争。通过竞争测定鉴定的抗体(竞争性抗体)包含与和参考抗体相同的表位结合的抗体，以及与相邻表位结合的抗体，所述相邻表位与通过参考抗体结合的表位足够近，以使空间位阻发生。

具体实施方式

I.概述

先前已在进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的小鼠模型中对激活素A抗体进行了测试(参见例如于2015年9月14日提交的EP3191512B1，所述文献的全部内容通过引用明确并入本文)。然而，FOP的小鼠模型，如Acvr1^{[R206H]COIN/+}；Gt(ROSA26)Sor^CreERT2/+小鼠模型，全部是条件性敲除，因为发现组成性突变体不可存活。因此，在FOP小鼠模型中，可以用他莫昔芬(tamoxifen)“接通”疾病，并且这些目前可用的FOP的小鼠模型不是用于研究人类疾病的最优模型，在这些模型中，突变体蛋白质(例如，ALK2^R206H)的表达为组成性的。

本公开部分基于这样的惊人发现，即用激活素A拮抗剂治疗FOP人类受试者显著降低和/或防止新异位骨化(HO)骨生长的发展，并且降低病变生长和矿化的平均速率。然而，用激活素A拮抗剂进行治疗惊奇地不影响已经存在的骨病变。

因此，本文公开了用于治疗人类的进行性骨化性纤维发育不良(FOP)，也被称为明希迈尔病的方法。此类方法涉及向患有FOP的人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂。

II.激活素A

配体的转变生长因子β(TGFβ)超家族包含例如骨形态发生蛋白(BMPs)以及生长分化因子(GDFs)。这些配体的受体为由I型和II型跨膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体构成的异聚受体复合体。I型受体的实例包含激活素受体IA型(ACTRIA、ACVR1或ALK2)、BMP受体IA型和BMP受体IB型。II型受体的实例包含激活素受体IIA型、IIB型(ACTRIIA或ACVR2A和ACTRIIB或ACVR2B)和BMP受体II型。TGFβ超家族的配体对I型和II型受体各自具有不同的亲和力。

人体内的激活素A可以以同二聚或异二聚蛋白的形式存在。同二聚蛋白含有同二聚βA亚基对。异二聚蛋白含有β亚基和βB、βC或βE亚基(即，βAβB、βAβC或βAβE)。所述亚基各自表达为包含信号肽、前肽和成熟多肽的前体多肽。人βA亚基前体的示例性形式为长度426个氨基酸的命名为Swiss Prot P08476的多肽，其中残基1-20为信号肽，残基21-310为前肽，并且残基311-426为成熟多肽。βB亚基前体多肽的示例性形式被命名为Swiss ProtP09529，其中残基1-28为信号肽，残基29-292为前肽，并且残基293-407为成熟多肽。βC亚基的示例性形式被命名为Swiss Prot P55103，其中残基1-18为信号肽，残基19-236为前肽，并且残基237-352为成熟多肽。βE亚基前体的示例性形式被命名为Swiss Prot P58166，其中残基1-19为信号肽，残基20-236为前肽，并且残基237-350为成熟多肽。这些序列的几种变体已知在Swiss Prot数据库中描述。对激活素A的参考包含βA同二聚体形式、βAβB、βAβC和βAβE异二聚体形式以及其亚基以及其中亚基与通过提供的示例性Swiss Prot序列定义的前肽和/或信号肽附接的其前体或这些序列的天然存在的人形式中任何形式。激活素A通过与ACVR2A或ACVR2B结合进行信号传导，但已知不是ACVR1的配体。激活素A反常地通过突变体ACVR进行信号传导以转导成骨信号并触发异位骨形成。

I型和II型受体两者均具有胞外配体结合结构域(ECD)和胞内丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。另外，I型受体在激酶结构域之前具有富甘氨酸/丝氨酸区(GS箱)并且在激酶结构域内具有L45环。两个受体对配体一起起作用以激活下游信号传导通路，如Smad和非Smad信号传导通路。激活涉及配体结合、配体-受体寡聚化和II型受体激酶对I型受体的GS箱的转磷酸化。II型受体激酶是组成性地活跃并且在配体结合和I型受体的激活中起作用。

ACVR1，也被称为激活素a受体I型、ACVR1A、ACVRLK2或ALK2，为配体的TGFβ超家族的I型受体。ACVR1具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，使Smad蛋白磷酸化，并且激活下游信号传导通路。ACVR1存在于许多身体组织中，包含骨骼肌和软骨，并且帮助控制骨和肌肉的生长和发育。如本文其它地方所述，ACVR1基因中的突变导致FOP。ACVR1活性的实例包含能够与配体结合，能够与II型受体形成复合物或者能够激活下游信号传导通路，如Smad通路。

ACVR2，也被称为激活素受体II型，为配体的TGFβ超家族的II型受体。存在至少两种ACVR2受体，例如，激活素受体IIA型(ACVR2A或ACTRIIA)和激活素受体IIB型(ACVR2B或ACTRIIB)。对ACVR2的引用包含ACVR2A和ACVR2B中的任一种或两者。ACVR2A和ACVR2B可以在多种组织中表达，包含骨骼肌、胃、心脏、内膜、睾丸、前列腺、卵巢和神经组织。

在配体结合时，ACVR2受体与I型受体形成复合物，如ACVR1，并且使I型受体的GS箱磷酸化，由此增强I型受体的激酶活性。ACVR2A和ACVR2B活性的实例包含能够与配体结合，能够与I型受体形成复合物或者能够使I型受体磷酸化。

人ACVR2A的示例性形式具有Swiss Prot登录号P27037。残基1-19为信号肽，残基20-135为胞外结构域，残基59-116为激活素I型和II型受体结构域，残基136-161为跨膜结构域，并且残基162-513为细胞质结构域。人ACVR2B的示例性形式指定了Swiss Prot编号Q13705。残基1-18为信号序列，残基19-137为胞外结构域，残基27-117为激活素I型和II型受体结构域，残基138-158为跨膜结构域，并且残基159-512为细胞质结构域。人ACVR1的示例性形式具有Swiss Prot登录号Q04771。残基1-20为信号序列，残基21-123为胞外结构域，残基33-104为激活素I型和II型受体结构域，残基124-146为跨膜结构域，并且残基147-509为细胞质结构域。对ACVR1、ACVR2A和ACVR2B中的任一者的参考包含这些示例性形式、其已知同种型和多态性，如Swiss Prot数据库中列出的那些形式，来自其它物种的同源形式和与例示的形式具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的其它变体。

除了以上定义的例示的序列之外的各种形式的ACVR2A、ACVR2B和ACVR1的残基是通过与对应例示的序列的最大比对编号的，因此对所比对的残基分配了相同编号。来自例示的序列的取代可以是保守或非保守取代。对ACVR1、ACVR2A或ACVR2B的引用还包含无或基本上无跨膜和细胞质部分的完整胞外结构域(例如，分别地ACVR2A、ACVR2B和ACVR1的残基20-135、19-137或21-123)或其部分。胞外结构域的部分保留了足够的完整胞外结构域的残基以结合与完整胞外结构域结合的至少一种配体或反受体并由此拮抗相关受体(例如，分别地，ACVR2A、ACVR2B和ACVR1的残基59-116、27-117或33-104)。

III.激活素A的拮抗剂

A.抗体

术语“抗体”覆盖具有两对重链和轻链的完整抗体，可以结合抗原的抗体片段(例如，Fab、F(ab')₂、Fv、单链抗体、双抗体、抗体嵌合体、杂合抗体、双特异性抗体、人源化抗体等)和包括前述的重组肽。

“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包含：Fab、F(ab')2片段和Fv片段；双抗体；线性抗体(Zapata等人(1995)《蛋白质工程化(Protein Eng.)》10:1057-1062)；单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

抗体可以是单克隆的或多克隆的。“单克隆抗体”是从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即包括所述群体的单独抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每种单克隆抗体通常针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示抗体的特性是从基本上同质的抗体群体中获得的，如通过B细胞的克隆群体产生的那些，并且不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。

要根据本文提供的方法使用的单克隆抗体可以通过以下Kohler等人(1975)《自然》256:495中首次描述的杂交瘤方法或其修改制备。通常，如小鼠等动物通过含有抗原(例如，激活素A、ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B多肽或具体地胞外结构域(受体中)或其一部分)的溶液进行免疫接种。

免疫接种抗原通过将含抗原的溶液在盐水中，优选地在如弗氏完全佐剂(Freund's complete adjuvant)等佐剂中混合或乳化并且肠道外注射乳剂的混合物来进行。在对动物进行免疫接种之后，移除脾脏(以及任选地，几个大淋巴结)并解离为单个细胞。可以通过将细胞悬浮液施涂到涂覆有所关注抗原的板或孔中对脾脏细胞进行筛选。对抗原有特异性的B细胞表达膜结合的免疫球蛋白与板结合并且不冲洗掉。然后诱导所产生的B细胞或所有解离的脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤，并且在选择性培养基中培养。然后将所产生的细胞通过连续稀释铺板并且测定特异性结合所关注抗原(并且不与不相关抗原结合)的抗体的产生。然后将分泌所选单克隆抗体(mAb)的杂交瘤在体外(例如，在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或在体内(作为小鼠体内的腹水)培养。

可替代地，单克隆抗体可以通过重组DNA方法(参见例如美国专利第4,816,567号)制备。还可以使用本文所述的技术将单克隆抗体与噬菌体抗体文库分离，例如，Clackson等人(1991)《自然》352:624-628；Marks等人(1991)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》222:581-597；以及美国专利第5,514,548号。

“抗体”包含针对激活素A、ACVR1、ACVR2A、ACVR2B的嵌合抗体、饰面抗体、人源化抗体和人单克隆抗体并且如上所定义的。

根据其“重链”的恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分配为不同类别。存在五个类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种类别可以被进一步细分为子类别(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚单元结构和三维构型是众所周知的。

目前的单克隆抗体或Fc融合蛋白可以是各种抗体类别中的任何类别。在一个实施例中，单克隆抗体为IgG类抗体。在其它实施例中，单克隆抗体可以具有IgM、IgE、IgD或IgA类。在具体实施例中，所述抗体为IgG的同种型，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，特别是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

轻链和/或重链的氨基末端或羧基末端处的一种或几种氨基酸，如重链的C末端赖氨酸可以按一定比例或全部丢失或衍生分子。取代可以在恒定区中进行以减少或增加效应子功能，如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见例如Winter等人,美国专利第5,624,821号；Tso等人,美国专利第5,834,597号；以及azar等人,《美国国家科学院院刊》103:4005,2006)或延长在人体内的半衰期(参见例如Hinton等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》279:6213,2004)。示例性取代包含位置250处的Gln和/或位置428处的Leu(EU编号)以增加抗体的半衰期。位置234、235、236和/或237中的任何位置处的取代降低了对Fcγ受体，特别是对FcγRI受体的亲和力(参见例如US 6,624,821)。任选地，人IgG2中的位置234、236和/或237被丙氨酸取代并且位置235被谷氨酰胺取代。(参见例如US 5,624,821)。还可以通过用PVA取代位置232-236处的EFLG减少效应子功能(参见WO14/121087)。任选地，位置428处的S可以被P替代，具体地在人IgG4中，以减少内源性免疫球蛋白与外源性免疫球蛋白之间的交换。其它变异可以添加或去除翻译后修饰的位点，如N-X-S/T基序处的N连接的糖基化。变异还可以包含引入旋钮(即，用较大氨基酸替代一种或多种氨基酸s)孔(即，用较小氨基酸取代一种或多种氨基酸)以促进在不同重链之间形成异二聚体以产生双特异性抗体。用于形成旋钮和孔对的示例性取代分别为T336Y和Y407T(Ridgeway等人,《蛋白质工程化》第9卷第7期第617-621页,1996)。变异还可以包含减少EU编号系统中的蛋白质A相互作用(例如，H435R和Y436F)的突变。其中一条重链具有此类变异并且另一条重链不具有此类变异的双特异性抗体可以通过蛋白质-A亲和力色谱法与其亲本抗体分离。

抗体还可以包含与激活素A特异性结合的抗体。此类抗体可以与激活素A的βAβA、βAβB、βAβC和βAβE形式中的任何或所有形式特异性结合。一些抗体与这些形式中的仅一种形式(即，βAβA、βAβB、βAβC或βAβE)特异性结合。对βAβB、βAβC和βAβE形式的特异性可以通过分别地βB、βC或βE亚基内的表位或针对异二聚体的两种组分贡献的表位而被赋予。对βAβ的特异性可以通过由同二聚体内(例如，亚基的接口处)的两种分子而被赋予。一些抗体与激活素A的这些形式中的所有形式特异性结合，在这种情况下表位通常位于βA亚基上。抗体通常在前体蛋白的成熟多肽组分内具有表位。一些抗体在不与人抑制素结合的情况下与任何或所有形式的激活素A特异性结合，所述人抑制素以α(Swiss Prot P05111)βA或αβB异二聚体的形式存在。一些抗体与任何或所有形式的激活素A特异性结合并且与一种或两种形式的人抑制素结合。尽管据信此类抗体抑制激活素A通过其反受体、ACVR2A和/或ACVR2B和/或BMPR2中的一种或多种的信号转导，但是对于在治疗FOP的方法中使用此类抗体不需要理解机制。

已经报道了显著数量的针对激活素A的抗体。例如，美国专利第9,718,881号公开了命名为H4H10423P、H4H10424P、H4H10426P、H4H10429P、H4H10430P、H4H10432P2、H4H10433P2、H4H10436P2、H4H10437P2、H4H10438P2、H4H10440P2、H4H10442P2、H4H10445P2、H4H10446P2、H4H10447P2、H4H10447P2、H4H10448P2、H4H10452P2的人抗体。US 8,309,082公开了人抗体A1-A14。针对激活素A的小鼠抗体可从几个商业供应商获得，如来自R&D系统公司(R&D Systems)的MAB3381、来自罗福斯生物制剂公司(Novus Biologicals)的9H16或MM0074-7L18(ab89307)AbCam。

优选抗体对激活素A具有的亲和力(如US2015/00373339的实例3中在25℃下测量的)为至少10⁸M^-1、10⁹M^-1、10¹⁰M^-1、10¹¹M^-1、10¹²M^-1或10¹³M^-1。一些抗体具有的亲和力在10⁹-10¹²M^-1的范围内。优选抗体抑制在IC50小于4nM并且优选地小于400pM或40pM的情况下对激活素A的信号转导。一些抗体抑制在和IC50在4nM到10pM或3.5nM到35pM的情况下的信号转导。

信号转导抑制可以如美国专利第9,718,881号的实例6中测量，所述美国专利如下汇总。用Smad 2/3-荧光素酶报告质粒转染人A204横纹肌肉瘤细胞系以产生A204/CAGAx12-Luc细胞系。将A204/CAGAx12-Luc细胞维持在补充有10％胎牛血清、盘尼西林(penicillin)/链霉素(streptomycin)/谷氨酰胺和250μg/mL的G418的McCoy's5A中。对于生物测量，将A204/CAGAx12-Luc细胞以10,000个细胞/孔在低血清培养基、0.5％FBS和OPTIMEM中接种到96孔测定板上，并且在37℃和5％CO₂下过夜温育。以1:3将激活素A从100nM连续稀释到0.002nM并且与不含有激活素的对照一起开始添加到细胞中。以1:3将激活素A连续稀释，从100nM开始连续稀释到0.002nM，从1000nM连续稀释到0.02nM或从300nM连续稀释到0.005nM，包含含有适当的同种型对照抗体或不含有抗体的对照样品，并且以100pM激活素A的恒定浓度添加到细胞中。

一些抗体将激活素A与ACVR2A和/或ACVR2B和/或BMPR2的结合抑制至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％，如在受体从细胞中表达或胞外结构域与Fc结构域融合作为融合蛋白，并且融合蛋白被固定化到载体(例如，Biacore传感器芯片)时测量的。在此类测量中，所述抗体和激活素A应以等摩尔量呈现并且受体或胞外结构域应以过量呈现。

一些抗体与全长激活素A的残基321-343或391-421内的成熟蛋白质的C11-S33和C81-E111相对应的表位结合。

本实例中使用的示例性抗体在美国专利第9,718,881号中被命名为H4H10446P。其重链可变区以及重链CDR1、CDR2和CDR3，分别具有美国专利第9,718,881号中的SEQ ID NO:162、164、166和168的氨基酸序列(目前分别为SEQ ID NO:1、2、3和4)。其轻链可变区以及轻链CDR，即CDRL1、CDRL2和CDRL3，分别具有美国专利第9,718,881号的SEQ ID NO:146、148、150和152的氨基酸序列(目前分别为SEQ ID NO:5、6、7和8)。H4H10446P抑制通过ACVR2A和/或ACVRIIB进行的激活素A介导的信号传导，但不强烈抑制(如果有的话)激活素A与ACRIIA或ACVR2B结合。与H4H10446P竞争与人激活素A结合或与人激活素A上与H4H10446P相同的表位结合的其它抗体被包含在内，并且还诱导了共享其对信号传导的抑制。

供本方法中使用的另一示例性抗体在美国专利第9,718,881号中被命名为H4H10430P。其重链可变区以及重链CDR，即CDRH1、CDRH2和CDRH3，分别具有美国专利第9,718,881号中的SEQ ID NO:66、68、70和72的氨基酸序列(目前分别为SEQ ID NO:9、10、11和12)。其轻链可变区以及轻链CDR，即CDRL1、CDRL2和CDRL3，分别具有美国专利第9,718,881号中的SEQ ID NO:74、76、78和80的氨基酸序列(目前分别为SEQ ID NO:13、14、15和16)。此抗体抑制激活素A与ACRV2A和/或ACVR2B结合并且抑制通过这些受体中的一种或两种受体进行的信号转导。还包含了与H4H10430P竞争以作为H4H10430P与激活素A结合或与激活素A上的同一表位结合并且共享其抑制激活素A结合以及通过ACVR2A和ACVR2B进行的信号转导的性质的其它抗体。

供本方法中使用的示例性抗体为加托索单抗(garetosmab)。重组单克隆抗体加托索单抗为共价异四聚体，其由两条二硫化物连接的人重链(IgG4同种型)组成，每条重链通过二硫键与人κ轻链共价连接。基于原代序列，假定形成了16个典型二硫键并且从每个重链C末端中去除了Lys453，没有聚糖的抗体具有的预测的分子量为145,235.3Da。每条重链在Fc结构域的铰链区内在氨基酸Pro234处含有丝氨酸到脯氨酸突变，以降低IgG4同种型抗体形成含半抗体的溶液的倾向性。在每条重链上存在单个N连接的糖基化位点(Asn303)，其在分子的Fc结构域中位于恒定区内。加托索单抗重链和轻链可变结构域内的互补决定区(CDR)一起形成针对其靶点的结合位点：激活素A、激活素AB和激活素AC。图10中呈现了重链和轻链氨基酸序列、每条多肽链内CDR的位置、重链N连接的糖基化位点的位置和加托索单抗单克隆抗体的预测的二硫键结构。

供本方法中使用的另一种示例性抗体为在美国专利第8,309,082号中被命名为A1的抗体，其特征在于在美国专利第8,309,082号中具有序列SEQ ID NO:9和10(目前分别为SEQ ID NO:17和18)的轻链和重链可变区。在美国专利第8,309,082号中分别具有序列SEQID NO:11、12和13(目前分别为SEQ ID NO:19、20和21)的其轻链CDR，即CDRL1、CDRL2和CDRL3以及在美国专利第8,309,082号中分别具有序列SEQ ID NO:62、63和64(目前分别为SEQ ID NO:22、23和24)的其重链CDR，即CDRH1、CDRH2和CDRH3。还包含了与H4H10430P竞争以作为H4H10430P与激活素A结合或与激活素A上的同一表位结合并且共享其抑制激活素A结合以及通过ACVR2A和/或ACVR2B转导信号的性质的其它抗体。

其它抗体可以通过编码以上提到的抗体中的任何抗体的重链和轻链的cDNA的突变发生获得。在本公开中还包含成熟重链和/或轻链可变区的氨基酸序列中的与以上提到的抗体中的任何抗体至少90％、95％或99％相同并且维持其功能性质和/或与相应抗体的不同之处在于少量的功能上无关紧要的氨基酸取代(例如，保守取代)、缺失或插入的单克隆抗体。还包含具有与所述例示的抗体中的任何抗体的对应CDR 90％、95％、99％或100％相同的至少1个、2个、3个、4个、5个并且优选地全部六个CDR的单克隆抗体。CDR优选地如通过Kabat所定义的，但可以通过常规替代性定义，如Chothia、复合Kabat-Chothia、接触定义或AbM定义而定义(参见万维网bioinf.org.uk/abs)。

B.蛋白质/肽抑制剂

可用于本公开的方法的激活素A的拮抗剂包含各种分子，例如，激活素A的肽抑制剂以及其各种抑制性片段、衍生物和类似物。本公开内还包含了激活素A的可以充当激活素A信号传导的竞争性抑制剂的肽抑制剂以及各种抑制性片段、其衍生物和类似物。在一些实施例中，肽抑制剂为卵泡抑素(参见例如，PCT公开第WO 2014/064292号)或其衍生物或类似物，所述卵泡抑素抑制激活素A与本文公开的其受体中的任何受体之间的信号传导通路。信号转导抑制可以如本文先前公开的进行测量。

激活素A的肽抑制剂可以使用本领域众所周知的各个表达系统由核酸的对应片段重组产生，并且各种宿主系统适于产生，包含细菌(例如，大肠杆菌(E.coli))、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、昆虫(例如，Sf9)和哺乳动物细胞(例如，CHO、COS-7)。许多表达载体已被开发并且可用于这些宿主中的每种宿主。用于克隆和表达的载体和程序例如在以下中讨论：Sambrook等人(Sambrook等人《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,纽约冷泉港冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)(1987))以及Ausubel等人,1995。可用于本公开的标准表达是本领域众所周知的并且包含(但不限于)质粒、钻粒、噬菌体载体、病毒载体和酵母人工染色体。载体序列可以含有用于在大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)中传播的复制起点；复制的SV40起点；用于在宿主细胞中进行选择的氨苄西林(Ampicillin)、新霉素(neomycin)或嘌呤霉素(puromycin)抗性基因；和/或扩增显性可选标记的基因(例如，二氢叶酸盐还原酶基因)加上所关注基因。

可替代地，激活素A的肽抑制剂可以使用本领域已知的技术，例如，常规Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学来化学合成。肽合成的方法还参见Bodansky,“肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis)”(柏林斯普林格出版公司(Springer Verlag,Berlin)(1993))和Grant(编辑),“合成肽：用户指南(Synthetic Peptides:A User'sGuide)”(W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman和Company),纽约(1992))。另外，自动化肽合成器可商购获得(例如，Advanced ChemTech型号396；Milligen/Biosearch 9600)。

在某些实施例中，激活素A的可用拮抗剂为小分子，如肽和拟肽。如本文所用，术语“拟肽”包含经化学修饰的肽和含有非天然存在的氨基酸、类胨等的肽样分子。拟肽提供了优于肽的各个优点，包含增强施用于受试者时的稳定性。用于鉴定拟肽的方法是本领域众所周知的并且包含筛选含有潜在拟肽的文库的数据库。例如，剑桥结构数据库(theCambridge Structural Database)含有一系列多于300,000种具有已知晶体结构的化合物(Allen等人,《晶体学报：部分B(Acta Crystallogr.Section B)》35:2331(1979))。在无靶分子的晶体结构可用的情况下，可以使用例如CONCORD计划产生结构(Rusinko等人,《化学信息与计算机科学杂志(J.Chem.Inf.Comput.Sci.)》29:251(1989))。另一数据库可用化学品目录(Available Chemicals Directory)(分子设计有限公司信息系统(MolecularDesign Limited,Informations Systems)；加利福尼亚圣莱安德罗(San LeandroCalif.))含有约100,000种化合物，所述化合物可商购获得并且还可以搜索以鉴定潜在拟肽。

在某些实施例中，激活素A的肽抑制剂可以进一步包括翻译后修饰。此类修饰包含但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。因此，经修饰的可溶性多肽可以含有非氨基酸要素，如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖以及磷酸盐。此类非氨基酸要素对多肽的功能的影响可以使用本文所述的功能测定来测试。

C.小分子抑制剂

本公开还涵盖激活素A的小分子抑制剂。小分子为不同组的合成物质和天然物质，其通常具有低分子量(优选地小于约2000道尔顿、小于约1000道尔顿或小于约500道尔顿)。小分子，在不受限的情况下，可以为，例如，核酸、肽、多肽、肽核酸、拟肽、碳水化合物、脂质或其它有机(含碳)或无机分子并且可以是合成的或天然存在的或任选地可以是衍生化的。此类小分子可以是药学上可递送的物质或者可以进一步衍生化以促进递送或靶向。其可以从天然来源(例如，植物、真菌、微生物等)中分离或者可以从合成化合物或天然化合物的随机或组合化学文库中分离或可以合成。参见Werner等人,(2006)《功能基因组学简报(BriefFunct.Genomic Proteomic)》5(1):32-6。本领域已知许多可以使用的随机或组合文库。目前有许多方法用于基于糖、肽和核酸的化合物的随机和定向合成。合成化合物文库可从美布里奇化学公司(Maybridge Chemical Co.)(英国康沃尔郡特雷维尔特(Trevillet,Cornwall,UK))、卡姆格耐克斯公司(Comgenex)(新泽西州普林斯顿(Princeton,N.J.))、布兰顿联合公司(Brandon Associates)(新罕布什尔州梅里马克(Merrimack,N.H.))和微源公司(Microsource)(康涅狄格州新米尔福德(New Milford,Conn.))商购获得。可从奥德里奇公司(Aldrich)(威斯康辛州密尔沃基(Milwaukee,Wis.))获得稀有化学品文库。可替代地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库可从例如潘实验室(PanLaboratories)(华盛顿州博瑟尔(Bothell,Wash.))或麦考萨奇公司(MycoSearch)(北卡罗来纳州(N.C.))获得或可易于产生。另外，天然和合成产生的文库和化合物易于通过常规化学、物理和生物化学手段进行修饰(Blondelle等人,(1996)《生物技术趋势(Tib Tech)》14:60)。

鉴定和筛选激活素A的拮抗剂，例如，小分子抑制剂可以通过确定所涉及的蛋白质的结构特征，例如使用X射线晶体学、中子衍射、核磁共振光谱学和用于结构确定的其它技术而得到进一步促进。这些技术提供了激活素A的拮抗剂的合理设计或鉴定。

D.影响激活素A表达或激活素A信号传导中的下游分子事件的化合物

本公开还涵盖激活素A的抑制激活素A表达或防止激活素A与其下游信号传导通路接合的抑制剂。可用表达抑制剂的非限制性实例包含，例如，干扰RNA(例如，siRNA)、dsRNA、经RNA聚合酶III转录的DNA、核酶和反义核酸。

反义寡核苷酸，包含反义DNA、RNA和DNA/RNA分子，起到通过与靶向mRNA结合并且防止蛋白质翻译而直接阻断mRNA的翻译的作用。例如，至少约15个碱基并且与靶DNA序列的独特区互补的反义寡核苷酸可以，例如，通过常规磷酸二酯技术合成(Dallas等人,(2006)《医学科学评议杂志(Med.Sci.Monit.)》12(4):RA67-74；Kalota等人,(2006)《实验药理学手册》173:173-96；Lutzelburger等人,(2006)《实验药理学手册》173:243-59)。

siRNA包括双链结构，所述双链结构通常含有15个到50个碱基对并且优选地含有21个到25个碱基对并且具有与细胞内所表达的靶基因或RNA相同或几乎相同的核苷酸序列。反义多核苷酸包含但不限于：吗啉代、2'-O-甲基多核苷酸、DNA、RNA等。抑制激活素A表达的siRNA的实例包含但不限于以下中公开的抗激活素A siRNA：Hoda等人,《英国癌症杂志(Br J Cancer.)》2012年12月4日；107(12):1978-86。

经RNA聚合酶III转录的DNA含有启动子，如U6启动子。这些DNA可以被转录以在细胞中产生可以充当siRNA的小发夹RNA或可以充当反义RNA的线性RNA。抑制剂可以在体外聚合，重组RNA含有嵌合序列或这些组的衍生物。抑制剂可以含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成核苷酸或使得靶RNA和/或基因被抑制的任何合适的组合。另外，这些形式的核酸可以是单链的、双链的、三链的或四链的。(参见，例如，Bass(2001)《自然》,411,428 429；Elbashir等人,(2001)《自然》,411,494 498；以及PCT公开第WO 00/44895号、第WO 01/36646号、第WO 99/32619号、第WO 00/01846号、第WO 01/29058号、第WO 99/07409号、第WO00/44914号)。

核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶促RNA分子。核酶作用的机制涉及核酶分子与互补性靶RNA的序列特异性杂交以及之后的内切核苷酸切割。特异性且高效催化mRNA序列的内切核苷酸切割的经工程化的锤头基序核酶分子也在本公开的范围内。扫描核酶切割位点的包含以下序列GUA、GUU和GUC的靶分子初始地鉴定任何潜在RNA靶标内的核酶切割位点。在鉴定后，可以评估介于约15个核糖核苷酸与20个核糖核苷酸之间的与靶基因的含有切割位点的区相对应的短RNA序列的预测结构特征，如可能使寡核苷酸序列不适合的次级结构。候选靶标的适合性还可以通过使用例如核糖核酸酶保护测定测试其对于与互补寡核苷酸的杂交的可及性来评估。

可以通过已知方法制备本公开的表达抑制剂。这些技术包含用于化学合成，例如，通过固相磷酰胺化学合成的技术。可替代地，反义RNA分子可以通过体外或体内转录编码RNA分子的DNA序列产生。此类DNA序列可以并入到并入合适的RNA聚合酶启动子，如T7或SP6聚合酶启动子等的各种载体中。参见例如Weintraub,H.等人,“作为用于遗传分析的分子工具的反义RNA(Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis)”,《评论--遗传学趋势(Reviews--Trends in Genetics》,第1卷(1)1986。

可以引入对本公开的寡核苷酸的各种修饰作为增加胞内稳定性和半衰期的手段。可能的修饰包含但不限于向分子的5'和/或3'端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列或在寡核苷酸骨架内使用硫代磷酸盐或2'-O-甲基而非磷酸二酯酶键。

易于制备与各种靶分子结合的衔接子核酸序列。本公开的衔接子核酸序列可以包含整个RNA或部分RNA或者整个或部分DNA和/或其它核苷酸类似物。衔接子通常被开发为通过采用被称为SELEX(指数富集的配体系统进化)的已知的体内或体外(最通常的体外)选择技术与特定配体结合。制备衔接子的方法描述于，例如，Ellington和Szostak(1990)《自然》346:818、Tuerk和Gold(1990)《科学》249:505、美国专利第5,582,981号；PCT公开第WO 00/20040号；美国专利第5,270,163号；Lorsch和Szostak(1994)《生物化学(Biochem.)》33:973；Mannironi等人,(1997)《生物化学》36:9726；Blind(1999)《美国国家科学院院刊》96:3606-3610；Huizenga和Szostak(1995)《生物化学》34:656-665；PCT公开第WO 99/54506号、第WO 99/27133号和第WO 97/42317号；以及美国专利第5,756,291号。

IV.ACVR1、ACVR2A、ACVR2B的拮抗剂

提供了I型受体ACVR1和II型受体ACVR2蛋白质(例如，ACVR2A和/或ACVR2B)的拮抗剂以用于治疗FOP。此类拮抗剂可以通过与受体结合(如对于针对ACVR1、ACVR2A或ACVR2B的抗体)直接或通过与配体或反受体结合并抑制配体或反受体与ACVR1、ACVR2A或ACVR2B结合(如对于ACVR1、ACVR2A或ACVR2B的融合蛋白)等其它机制间接拮抗受体。ACVR2A和ACVR2B的拮抗剂还可以与激活素A结合。

相对于对照细胞或未接受拮抗剂的动物模型，本文提供的ACVR1、ACVR2A或ACVR2B拮抗剂可以将ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B的活性抑制或降低至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多。

激活素A的任何拮抗剂可以单独或与ACVR1、ACVR2A或ACVR2B中的一种或多种的拮抗剂组合在用于治疗FOP的方法中使用。拮抗剂可以包括，例如，激活素A、ACVR1、ACVR2A或ACVR2B多肽，如胞外结构域、拮抗剂抗体或小分子抑制剂。

A.ACVR1、ACVR2A和ACVR2B多肽的胞外结构域

拮抗剂包含分别有效抑制ACVR1、ACVR2A和ACVR2B的至少一种活性的ACVR1、ACVR2A和ACVR2B蛋白质和其片段。此类拮抗剂通常包含ACVR1、ACVR2A或ACVR2B或其部分的胞外结构域。优选地，此类胞外结构域完全或基本上无跨膜和细胞质区(即，来自这些区的任何其余残基对胞外结构域的功能无显著影响)。换言之，此类拮抗剂的ACVR2A、ACVR2B或ACVR1组分由以上定义的ACVR2A、ACVR2B或ACVR1的整个胞外结构域或其一部分组成或基本上由所述整个胞外结构域或其一部组成。此类拮抗剂可以包含或可以不包含与ACVR2A、ACVR2B或ACVR1不同的其它组分，如下面进一步描述的。无或基本上无跨膜和细胞质结构的此类胞外结构域是可溶性的。此类胞外结构域可以通过与可溶性配体或反受体结合，有效地与配体或反受体竞争与ACVR1、ACVR2A或ACVR2B细胞表面受体结合，由此调节(降低)配体或反受体在体内的可用性而起到拮抗剂的作用。

可溶性胞外结构域可以初始地通过信号序列表达，所述信号序列在表达的过程中被切割。信号序列可以是ACVR1、ACVR2A或ACVR2B的天然信号序列，如美国专利第7,709,605号(所述美国专利通过引用以其整体并入本文)中描述的那些天然信号序列或者可以是来自不同蛋白质，如蜂蜜蜂毒肽(HBM)或织纤溶酶原激活剂(TPA)的信号序列。可替代地，可溶性胞外ACVR1、ACVR2A或ACVR2B多肽可以在没有信号序列的情况下合成或表达。

ACVR1、ACVR2A和ACVR2B的ECD或配体结合结构域高度保存在包含小鼠和人的物种之中。ECD含有富半胱氨酸区和C末端尾区。ACVR1、ACVR2A和ACVR2B的ECD与不同组的TGFβ家族配体结合，包含，例如，激活素A、肌骨素(GDF-8)、GDF-11和BMP。参见例如Souza等人(2008)《分子内分泌学(Molecular Endocrinology)》22(12):2689–2702。

ACVR2A和ACVR2B多肽以及可溶性ACVR2A和ACVR2B多肽的实例包含以下中公开的那些：美国专利第7,842,633号；美国专利第7,960,343号；以及美国专利第7,709,605号，所述美国专利中的每一个通过引用以其整体并入本文。

ACVR1、ACVR2A或ACVR2B多肽的ECD可以突变使得变体多肽改变配体结合性质(例如，结合特异性或亲和力)。一些变体ACVR1、ACVR2A或ACVR2B多肽已经改变了对特异性配体的结合亲和力(例如，升高或降低)。变体与天然存在的ACVR1、ACVR2A或ACVR2B序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性，并且保留生物活性并且因此具有如本文其它地方所述的ACVR1、ACVR2A或ACVR2B活性。ACVR2A和ACVR2B的活跃变体和片段在例如以下中描述：美国专利第7,842,633号；美国专利第7,960,343号；以及美国专利第7,709,605号，所述美国专利中的每一个通过引用以其整体并入本文。

用于测量ACVR1、ACVR2A或ACVR2B活性的测定在例如以下中公开：美国专利第7,842,633号；美国专利第7,960,343号；以及美国专利第7,709,605号。例如，可以对ACVR1、ACVR2A或ACVR2B多肽变体与配体结合的能力或防止配体与ACVR1、ACVR2A或ACVR2B受体蛋白质结合的能力进行筛选。

B.融合蛋白

以上所述的ACVR1、ACVR2A和ACVR2B多肽可以表达为具有ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B多肽以及一个或多个融合结构域的至少一部分的融合蛋白。

融合结构域包含免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、人血清白蛋白(HSA)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、蛋白质A、蛋白质G或可以用于稳定、增溶、分离或多聚融合蛋白的任何融合结构域。

免疫球蛋白重链的Fc结构域为融合蛋白的优选结构域。与免疫球蛋白的Fc部分融合赋予各个范围的蛋白质期望的药代动力学性质(例如，增加蛋白质的稳定性和/或血清半衰期)。因此，本公开提供了包括ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B的与免疫球蛋白的Fc结构域融合的至少一个ECD的融合蛋白。

供本方法中使用的Fc结构域可以来自任何免疫球蛋白。可以使用各个类别的免疫球蛋白中的任何免疫球蛋白，包含IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。在IgG类别内，存在不同子类别或同种型，包含，例如，IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。在一个实施例中，Fc融合蛋白包括IgG分子的Fc结构域。在另外的实施例中，Fc结构域来自IgG₁分子。免疫球蛋白分子可以为任何动物类型，包含，例如，哺乳动物、龋齿动物、人、小鼠、大鼠、仓鼠和兔。在一个实施例中，免疫球蛋白Fc结构域来自动物。在另一实施例中，Fc结构域来自人。在又另一实施例中，Fc结构域来自龋齿动物，如小鼠或大鼠。在一具体实施例中，融合蛋白的Fc结构域来自人IgG1。

本文提供的Fc融合蛋白可以通过本领域已知的任何方法制备。Fc融合蛋白可以包含至少CH2和CH3区，并且典型地包含铰链区的至少一部分。尽管可以存在CH1区，但通常在融合蛋白中忽略所述区。

融合可以在免疫球蛋白恒定结构域的Fc部分内的任何位点处进行。融合可以到恒定结构域的Fc部分的C末端进行或紧接着到重链的CH1区的N末端进行。可以选择特定位点以优化Fc融合蛋白的生物活性、分泌或结合特性。

在一些情况下，编码ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B的ECD的核酸C末端地与编码免疫球蛋白恒定结构域序列的N末端的核酸融合。在其它情况下，N末端融合也是可能的。还可能的是将ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B的ECD与免疫球蛋白恒定结构域序列的N末端和C末端两者融合。

对于免疫球蛋白融合的产生，还参见美国专利第5,428,130号、美国专利第5,843,725号、美国专利第6,018,026号和WO2005/070966，所述文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。

融合蛋白可以，例如，通过重组表达编码融合蛋白的核酸产生。例如，融合蛋白可以通过将编码ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B的ECD的核酸与编码Fc结构域的核酸融合制备。ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B ECD核酸可以与编码Fc结构域的核酸的N末端融合或者可以与编码Fc结构域的基因的C末端融合。可替代地，ECD可以在Fc结构域中的任何位置处融合。

ECD融合蛋白还可以包含接头。在Fc融合蛋白的情况下，接头可以定位在ACVR1、ACVR2A或ACVR2B ECD与Fc结构域之间，任选地，替代铰链区的一部分或全部。接头可以为相对无次级结构的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、50个或更多个氨基酸。接头可以富含甘氨酸和脯氨酸残基并且可以，例如，含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的重复序列(例如，TG_4或SG₄重复序列)。

通过接头两种或更多种ECD-Fc融合蛋白可以连接在一起。在这种情况下，接头可以定位在ECD之间或者接头可以定位在Fc结构域之间以将融合蛋白连接在一起。例如，1个、2个、3个、4个或更多个ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B Fc融合蛋白可以连接在一起。

ACVR2A和/或ACVR2B ECD融合蛋白的实例已进行描述，如以下中公开的那些：美国专利第7,842,633号；美国专利第7,960,343号；以及美国专利第7,709,605号，所述美国专利中的每一个通过引用以其整体并入本文。

ACVR2A拮抗剂的一个实例已知为Sotatercept(也被称为ACE-011)。Sotatercept含有ACVR2A的与人IgG1 Fc结构域融合的ECD并且在Carrancio等人,(2014)《英国血液学杂志(British J Haematology.)》165(6):870-872中详细描述，所述文献通过引用以其整体并入本文。

ACVR2B拮抗剂的一个实例被称为ACE-031。ACE-031含有ACVR2B的与人IgG1 Fc结构域融合的ECD并且在Sako等人,(2010)《生物化学杂志》285(27):21037-21048中详细描述，所述文献通过引用以其整体并入本文。

ACVR1 ECD融合蛋白的实例是已知的，如Berasi,等人,(2011)《生长因子(GrowthFactors)》,29(4):128-139中公开的那些；所述文献通过引用以其整体并入本文。

C.混合ECD融合蛋白

还提供了混合或多特异性ECD融合蛋白拮抗剂。混合ECD融合蛋白可以包括两个或更多个ACVR1 ECD、ACVR2A ECD和/或ACVR2B ECD的组合。例如，融合蛋白可以包括1个、2个、3个、4个或更多个ACVR1 ECD、ACVR2A ECD和/或ACVR2B ECD分子。在一个实施例中，拮抗剂包括与ACVR2B ECD连接的ACVR2A ECD。在另外的实施例中，拮抗剂进一步包括Fc结构域。

在一个实施例中，融合蛋白可以包括一个或多个ACVR2A ECD分子以及一个或多个ACVR2B ECD分子。在另一实施例中，融合蛋白可以包括一个或多个ACVR1 ECD分子以及一个或多个ACVR2A ECD分子。在另一实施例中，融合蛋白可以包括一个或多个ACVR1 ECD分子以及一个或多个ACVR2B ECD分子。

在一个实施例中，融合蛋白包括一种或多种ACVR2A ECD-Fc融合蛋白以及复合在一起的一种或多种ACVR2B ECD-Fc融合蛋白。在另一实施例中，融合蛋白包括一种或多种ACVR1 ECD-Fc融合蛋白以及复合在一起的一种或多种ACVR2A ECD-Fc融合蛋白。在另一实施例中，融合蛋白包括一种或多种ACVR1 ECD-Fc融合蛋白以及复合在一起的一种或多种ACVR2B ECD-Fc融合蛋白。在这种情况下，融合蛋白可以通过其Fc结构域，例如，通过至少一个二硫键或通过接头序列连接在一起。可替代地，融合蛋白的ECD部分可以通过接头序列连接在一起。

在一个实施例中，拮抗剂包括与第一Fc结构域融合的ACVR2A ECD和与第二Fc结构域融合的ACVR2B ECD。在这种情况下，Fc结构域可以彼此复合。在另一实施例中，拮抗剂包括各自与Fc结构域融合的ACVR2A ECD与ACVR2B ECD之间的接头。

融合蛋白可以被构造为产生串联格式的ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂。在一个实施例中，融合蛋白包括Fc结构域之后串联的来自ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B的两个或更多个ECD。在一些情况下，串联布置的ECD被接头序列分开。此串联融合蛋白可以包括1个、2个、3个、4个或更多个ACVR1 ECD、ACVR2A ECD和/或ACVR2B ECD。

D.抗体拮抗剂

ACVR1、ACVR2A或ACVR2B拮抗剂包含针对这些受体中的任何受体的抗体(换言之，具体地与其结合)，优选地在胞外结构域内具有表位的抗体。抗体或融合蛋白与其靶抗原的特异性结合意指亲和力为至少10⁶M^-1、10⁷M^-1、10⁸M^-1、10⁹M^-1或10¹⁰M^-1。特异性结合的量值可检测地更高，并且可与发生于至少一个非相关靶标的非特异性结合区分。用于制备抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Kohler&Milstein(1975)《自然》256:495-497；以及Harlow和Lane(1988)《抗体：实验室手册(Antibodies:a Laboratory Manual)》,纽约冷泉港冷泉港实验室。

可以使用抑制或降低ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B的活性的抗体(例如，拮抗剂抗体)。此类ACVR2A和ACVR2B抗体包含，例如，以下中公开的那些抗体：美国专利第8,486,403号、美国专利第8,128,933号、WO2009/137075以及Lach-Trifilieff等人(2014)《分子与细胞生物学(Mol.Cell Biol.)》34(4):606-618，所述文献中的每一个通过引用以其整体并入本文。这些抗体中的任何抗体的人源化形式、嵌合形式和饰面形式被包含在内，如同与其竞争结合的抗体。

在一个实施例中，抗体为抗ACVR2A抗体。在另一实施例中，抗体为抗ACVR2B抗体。在其它实施例中，抗体可以为针对ACVR2A和ACVR2B两者的双特异性抗体。在另一实施例中，抗体为抗ACVR1抗体。在其它实施例中，抗体可以为针对ACVR1和ACVR2A两者或者针对ACVR1和ACVR2B两者的双特异性抗体。

E.小分子拮抗剂

激活素A、ACVR1、ACVR2A和ACVR2B的拮抗剂还可以为小分子拮抗剂。此类小分子拮抗剂可以抑制激活素A、ACVR1、ACVR2A或ACVR2B的活性。ACVR1的小分子拮抗剂包含，例如，Mohedas等人,(2013)《ACS化学生物学(ACS Chem.Biol.)》8:1291-1302中描述的LDN-212854，所述文献通过引用以其整体并入本文。

V.筛选测定

可以在各种测定中对本文提供的各种激活素A、ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂和其变体或片段的活性进行筛选。例如，可以对ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂和其变体与配体结合或与ACVR1、ACVR2A或ACVR2B受体结合的能力、其抑制配体与ACVR1和/或ACVR2多肽结合的能力和/或其抑制ACVR1或ACVR2受体的活性能力进行筛选。

可以在体外或在基于细胞的测定中测试ACVR1或ACVR2拮抗剂或者其变体或片段的活性。体外结合测定和用于测量对受体活性的抑制的测定是众所周知的。用于测量ACVR1、ACVR2A或ACVR2B拮抗剂的活性的各种测定在，例如，美国专利第7,842,663号中详细描述，所述美国专利通过引用以其整体并入本文。

可以通过各种技术检测拮抗剂调节ACVR1或ACVR2多肽与其结合蛋白之间的复合物形成的能力。例如，调节复合物的形成可以使用，例如，可检测地标记的蛋白质，如放射性标记的(例如，³²P、³⁵S、¹⁴C或³H)、荧光标记的(例如，FITC)或酶促标记的ACVR1或ACVR2多肽或其结合蛋白质，通过免疫测定或通过色谱检测定量。

可以监测ACVR1或ACVR2拮抗剂抑制ACVR1或ACVR2受体介导的信号传导的能力。例如，可以使用Smad响应性报告基因监测下游信号传导，如Smad激活的影响。

可以在体内测定中对ACVR1和/或ACVR2拮抗剂和其变体或片段的活性进行筛选。例如，可以对ACVR1或ACVR2拮抗剂或其变体治疗FOP的小鼠模型的FOP的能力(例如，减少异位骨形成的能力)进行筛选。已开发了承载编码Acvr1[R206H]的条件等位基因的转基因敲入小鼠。这些Acvr1^{[R206H]COIN/+}小鼠在US 14/207,320和PCT/US2014/026582中描述，所述文献通过引用以其整体并入本文。此等位基因仅在由Cre重组酶激活之后表达R206H变体。这允许在具体组织处并且在具体时间通过使用不同类型的Cre驱动系Cre依赖性激活Acvr1[R206H]表达。以此方式，所得小鼠还避开了围产期死亡，已通过Acvr1[R206H]的未调节的敲入等位基因观察到所述围产期死亡。幼年或成年小鼠中的Acvr1[R206H]表达的激活导致异位骨形成。例如，Acvr1^{[R206H]COIN/+}；Gt(ROSA26)Sor^CreERt2/+小鼠(其中CreERt2为已被引入到Gt(ROSA26)Sor基因座中的可他莫昔芬调节的重组酶(参见Feil等人(1997)《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Commun.)》237(3):752-7)，并且因此其组成性地且全局性地表达)在暴露于他莫昔芬之后患上FOP。简要地，在不存在他莫昔芬的情况下，CreERt2为不活跃的。他莫昔芬激活Cre的表达，所述Cre然后对Acvr1^{[R206H]COIN/+}起作用以将其转化为Acvr1^[R206H]/+，由此转化小鼠的基因型以反映FOP患者的作为ACVR1[R206H]的基因型。Acvr1^[R206H]等位基因表达Acvr1[R206H]，并且这足以驱动Acvr1^[R206H]/+；Gt(ROSA26)Sor^CreERt2/+小鼠患上FOP。这避开了常规Acvr1^[R206H]敲入小鼠Acvr1^tm1Emsh所经历的死亡(http://www.informatics.jax.org/allele/key/828153)。他莫昔芬治疗之后，可以将ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂或对照施用于Acvr1^{[R206H]COIN/+}；Gt(ROSA26)Sor^CreERt2/+小鼠，并且监测动物的异位骨形成。参见Chakkalakal SA等人(20120“Acvr1 R206H敲入小鼠患有进行性骨化性纤维发育不良(An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasiaossificans progressiva.)”《骨与矿物研究杂志(J Bone Miner Res.)》27(8):1746-56。此测定在以下实例中详细描述。

VI.进行性骨化性纤维发育不良(FOP)

FOP为罕见的可遗传病症，其中异位骨化在组织学上和生物化学上在骨外部位，如结缔组织，处形成“正常”骨。此病症，虽然是发作性，但是积累性的，并且导致严重程度不断增加的永久性残疾。FOP是不间断、逐步发展的超罕见遗传病症，其中肌肉、肌腱和韧带逐渐被骨替代，这是被称为异位骨化(HO)的过程。下巴、脊椎和胸腔的HO可能使得难以说话、吃饭或呼吸，从而导致体重减轻并且加速移动性的丧失和骨骼畸形。患有FOP的人还会经历被称为“急性发作”的发作性局部化炎症，但是HO可能默默发生以及与症状关联发生。大多数患有FOP的人到30岁都坐轮椅，并且平均存活年龄为大约40岁。死亡通常是由源于HO以及胸部、脖子和下巴丧失移动性的并发症引起的，如肺炎、心脏衰竭和误吸。

FOP的全球患病率为大约1/2,000,000。全球大约800-1000名患者被诊断为患有FOP，其中许多其它人被认为仍未被诊断或被误诊。FOP不存在种族、人种、性别或地理偏好。其不仅仅是极其致残的疾病，还是寿命显著缩短的病状。

FOP的特性包含，例如，大脚趾先天畸形、特征在于疼痛的头部软组织肿胀的急性发作和/或背部有炎症以及通过软骨内骨化逐渐形成异位骨。

可以基于存在大脚趾畸形而在临床上怀疑是FOP。诊断测试，如x射线或骨扫描可以证实大脚趾异常并且确存在异位骨化。FOP诊断还可以通过基因测试，例如，通过检测ACVR1基因中的617G到A(R206H)突变确认。

因为几种其它病症，包含异位骨化的其它病症，因此FOP被误诊很常见。FOP应通过病症的差异诊断来区分，包含，例如，孤立性先天畸形、淋巴性水肿、软组织肉瘤、硬纤维瘤、侵袭性幼年纤维瘤、幼年拇指外翻、孤立性短指症、进行性骨发育异常和异位骨化。可以使用存在大脚趾先天畸形和疼痛的软组织急性发作将FOP与其它病症区分。

患有FOP的患者具有大脚趾先天畸形但除此之外在出生时看起来正常。与FOP相关的急性发作在生命的前十年期间开始。急性发作可能通过，例如，软组织损伤、跌倒、疲劳、病毒感染或肌内注射而被触发。急性发作的结果是如韧带、骨骼肌或肌腱等软组织变形为异位骨。

无针对FOP或用于预防或逆转与FOP相关的HO的先前治疗性治疗。FOP是通过预防性措施管理的，如提高的安全性和使损伤最小化的策略、避免肌内注射以及在接受牙齿保健时注意。在急性发作的前24小时内开始高剂量皮质类固醇治疗可以帮助减轻炎症和与急性发作相关的水肿。用于去除异位骨的外科手术策略是不建议的，因为这会适得其反并且会导致新的创伤诱导的异位骨化。

如本文可互换使用的，“新异位骨化”、“新异位骨化病变”、“新骨病变”或“新病变”是指受试者体内预先不存在，例如，在施用激活素A拮抗剂之前或在施用激活素A拮抗剂时，的异位骨化。在一个实施例中，在施用激活素A拮抗剂之后，新异位骨化可以预防或使其体积减小。在一个实施例中，在经历外科手术以去除预先存在的异位骨化之后受试者可能会出现新异位骨化(并且施用激活素A拮抗剂可以会防止此发生)。新异位骨化病变的出现可以使用在本领域中标准的技术测量/确定。例如，病变可以通过，例如，使用正电子发射断层(PET)扫描确定，如本文更详细讨论的。

新异位骨化病变的“强度”或“严重程度”是指用于，例如，在其活性、强度、体积、每日平均疼痛、生长和矿化的速率、疼痛的急性发作的发生和/或新异位骨化病变的数量方面分析新异位骨化病变的形成的不良表型中的一种或多种表型。新异位骨化病变的强度、严重程度或活性可以通过，例如，使用正电子发射断层(PET)扫描用18F-NaF PET确定。例如，Botman等人,2019(《骨(Bone.)》2019年7月；124:1-6；通过引用以其整体并入)描述了使用18F-NaF PET作为FOP中HO生长的预测剂，并且充当用于评估具体与高强度18F-NaF PET信号相关的活跃HO病变的基础。在一个实施例中，病变活性(LA)＝病变中18F-NaF的总信号。

单个持续靶标或新异位骨化病变的体积可以通过本领域中的一种或多种已知方法测量。在一个实施例中，可以使用体积计算机断层(CT)以测量异位骨形成中的变化并且确定新异位骨化病变的体积。

如本文所述的总体病变活性(TLA)定义如下：TLA＝给定时间点时患者的所有靶标和新病变的病变活性的患者层次总和-生长和矿化中的HO负荷的测量结果。

“骨生长和矿化活性的速率”是指异位骨形成的变化。在一个实施例中，可以使用18F-NaF PET以提供骨生长和矿化活性的敏感性、特异性和全身定量测量。在另一实施例中，可以使用通过18F-NaF PET进行的正电子发射断层(PET)和体积计算机断层(CT)以测量骨生长和矿化活性的变化。

“每日平均疼痛NRS”是指通过使用0-10数字评定量表(NRS)对每周内的每日疼痛求平均以进行疼痛管理。评估疼痛强度被视为临床疼痛研究中的核心结果领域之一(Dworkin等人,2005；通过引用以其整体并入本文)。数字评定量表(NRS)被视为可用于评估疼痛的强度的最佳单项方法之一(Jensen等人,1999；Breivik等人,2000；通过引用以其整体并入本文)。NRS使用0-10排序量表评估疼痛强度，其中0表示“无疼痛”并且10为“不可承受的疼痛”或与本文公开的所有病变活性相关的类似声明。

“急性发作”是指可以进行或伴随异位骨化或新异位骨化的疼痛性和/或水肿性肿胀。显著地，已报道了异位骨化和慢性疾病进展不存在急性发作。急性发作是患有FOP的患者的显著负荷，无论是否与HO相关。施用激活素A拮抗剂之后急性发作的频率和强度降低表明FOP中的急性发作与激活素A相关。

“预先存在的病变”是指受试者先前存在，例如，在施用之前和/或施用时并且不是新异位骨化病变的病变。在一个实施例中，向人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂不影响受试者的预先存在的病变。在一个实施例中，相比于施用之前受试者的预先存在的病变的数量，向人类受试者施用有效量的激活素A拮抗剂不影响受试者的预先存在的病变的数量。在一个实施例中，相比于施用之前受试者的预先存在的病变的体积，向人类受试者施用有效量的激活素A拮抗剂不影响受试者的预先存在的病变的体积。在另一实施例中，相比于施用之前受试者的预先存在的病变的强度或严重程度，施用治疗有效量的激活素A拮抗剂不降低预先存在的病变的强度或严重程度。在一个实施例中，相对于对照受试者，向人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂不会降低预先存在的病变的异位骨化病变生长和/或预先存在的病变的矿化的速率。在一个实施例中，相对于对照受试者，向人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂不降低预先存在的病变的数量。在一个实施例中，相对于对照受试者，向人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂不降低预先存在的病变的强度或活性。

VII.治疗方法

本文提供了治疗FOP的方法，所述方法包括向患有FOP的受试者施用治疗有效量的激活素A、ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂。在一个实施例中，通过施用治疗有效量的激活素A拮抗剂治疗FOP。在一个实施例中，通过施用治疗有效量的针对激活素A的抗体治疗FOP。在一个实施例中，施用治疗有效量的ACVR2A拮抗剂和ACVR2B拮抗剂。在另外的实施例中，ACVR2A拮抗剂为Fc融合蛋白，并且ACVR2B拮抗剂为Fc融合蛋白。

一方面，本公开提供了一种降低患有进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的人类受试者的新异位骨化病变的强度或严重程度的方法，所述方法包括向患有FOP的受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂。在一个实施例中，相对于未施用激活素A拮抗剂的人类受试者，人类受试者的新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少10％或至少5％。

“治疗”患有FOP的受试者意指向患有FOP的受试者施用治疗有效量的针对激活素A的抗体，其中目标是治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、缓和、改进或影响FOP的一种或多种症状的状况。

“受试者”为如人、灵长类动物等任何动物(即，哺乳动物)、如小鼠和大鼠等龋齿动物、如狗、猫、牛、马、猪、羊等农用或家养动物，其中其期望治疗FOP。在本方法中的任何方法中，受试者可以为哺乳动物，并且优选地为人。

“对照”是指用作用于与受试者的样品、测量结果或值进行比较的参考样品、测量结果或值。例如，对照可以在施用激活素A拮抗剂之前从受试者体内提取或测量。在另一实施例中，对照可以在施用激活素A拮抗剂从受试者体内提取或测量。对照也可以表示相似个体的群体收集的平均测量结果。在另一实施例中，对照可以为从患有疾病或病状，例如FOP，的个体的群体收集的平均或中值的值或测量结果。在另一实施例中，对照可以为从健康群体，例如，未患有FOP的群体收集的平均或中值的值或测量结果。本领域的普通技术人员将认识到对照可以被设计为用于评估本文公开的任何数量的参数，例如，HO病变体积、新HO病变数量等。

激活素A、ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂的治疗有效量意指施用在FOP的至少一种迹象或症状方面带来积极应答的拮抗剂的剂量、频率或途径的组合。积极应答可以包含降低、消除、抑制FOP的至少一种迹象或症状恶化或延迟所述至少一种迹象或症状。可以为积极应答的对象的FOP的迹象或症状包含，例如，异位(ectopic)或异位(heterotopic)骨形成、FOP急性发作或与急性发作相关的疼痛和肿胀。可以通过将治疗之前和之后的迹象和症状进行比较评估在单个患者体内的治疗有效量。如果在治疗之后至少一种迹象或症状提供了积极应答，则量被视为有效。可替代地或另外可以通过将用本公开的一种或多种拮抗剂治疗的受试者的群体的迹象和症状与未接受治疗的受试者的对照群体进行比较评估治疗有效量。用于此类比较的受试者可以为动物模型或临床试验中的人类受试者(例如，I期、II期、IIa期、IIb期或III期)。如果群体之间至少一种迹象或症状方面存在统计上显著的积极应答，则量被视为有效。

一方面，本公开提供了一种预防患有FOP的人类受试者形成新异位骨化病变的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂，由此预防在所述人类受试者体内形成新异位骨化病变。

另一方面，本公开提供了一种降低患有FOP的人类受试者的新异位骨化病变的强度或严重程度的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂，由此降低所述人类受试者的新异位骨化病变的强度或严重程度。

在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少5-80％、至少10-80％、至少20-80％、至少30-80％、至少40-80％、至少50-80％、至少60-80％、至少70-80％、至少5-70％、至少5-60％、至少5-50％、至少5-40％、至少5-30％、至少5-20％或至少5-10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少5％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少60％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少70％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少5-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少10-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少20-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少30-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少40-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少50-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少60-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少70-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少5-70％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少5-60％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少5-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少5-40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少5-30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少5-20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的强度或严重程度降低了至少5-10％。

在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少5-80％、至少10-80％、至少20-80％、至少30-80％、至少40-80％、至少50-80％、至少60-80％、至少70-80％、至少5-70％、至少5-60％、至少5-50％、至少5-40％、至少5-30％、至少5-20％或至少5-10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少5％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少15％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少25％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少60％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少70％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少5-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少10-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少20-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少30-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少40-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少50-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少60-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少70-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少5-70％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少5-60％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少5-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少5-40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少5-30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少5-20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出异位骨化病变的总体病变活性降低了至少5-10％。

在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.2倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、0.2倍到3倍、0.5倍到3倍、1倍到3倍、1.5倍到3倍、2倍到3倍、2.5倍到3倍、0.2倍到2.5倍、0.2倍到2倍、0.2倍到1.5倍、0.2倍到1倍或0.2倍到0.5倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.2倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.5倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约1倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约1.5倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约2倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约2.5倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约3倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.2倍到3倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.5倍到3倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约1倍到3倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约1.5倍到3倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约2倍到3倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约2.5倍到3倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.2倍到2.5倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.2倍到2倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.2倍到1.5倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.2倍到1倍。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.2倍到0.5倍。

在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5-50％、至少10-50％、至少20-50％、至少30-50％、至少40-50％、至少5-40％、至少5-30％、至少5-20％或至少5-10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少5％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少15％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少25％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少5-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少10-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少20-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少30-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少40-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少5-40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少5-30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少5-20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少5-10％。

在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5-50％、至少10-50％、至少20-50％、至少30-50％、至少40-50％、至少5-40％、至少5-30％、至少5-20％或至少5-10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少5％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少5-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少10-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少20-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少30-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少40-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少5-40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少5-30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少5-20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少5-10％。

在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5-50％、至少10-50％、至少20-50％、至少30-50％、至少40-50％、至少5-40％、至少5-30％、至少5-20％或至少5-10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少5％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少5-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少10-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少20-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少30-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少40-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少5-40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少5-30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少5-20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少5-10％。

在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少5-90％、至少10-90％、至少20-90％、至少30-90％、至少40-90％、至少50-90％、至少60-90％、至少70-90％、至少80-90％、至少5-80％、至少5-70％、至少5-60％、至少5-50％、至少5-40％、至少5-30％、至少5-20％或至少5-10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少10％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少60％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少70％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少90％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5-90％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少10-90％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少20-90％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少30-90％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少40-90％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少50-90％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少60-90％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少70-90％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少80-90％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5-80％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5-70％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5-60％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5-50％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5-40％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5-30％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5-20％。在一个实施例中，相对于对照受试者，人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5-10％。

在用于治疗FOP的一些方法中，受试者不具有可用针对激活素A、ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B的拮抗剂治疗的其它病状或没有其它病症的风险。例如，受试者可以无任何或所有II型糖尿病、肌肉萎缩症、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和骨质疏松症。

A.施用方法

激活素A、ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂通常直接以蛋白质或小分子形式施用，但在蛋白质的情况下，还可以以编码此类蛋白质的核酸形式施用。此类拮抗剂可以通过各种方法，如细胞转染、基因疗法、直接施用递送媒剂或药学上可接受的载体、通过提供包括编码本文提供的激活素A、ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂的核酸或针对激活素A的抗体的重组细胞间接递送。

可以使用各种递送系统以施用本文提供的激活素A、ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂或针对激活素A的抗体，例如，脂质体形式的包封剂、微粒、微胶囊、能够表达化合物的重组细胞、受体介导的内吞(参见例如Wu和Wu,1987,《生物化学杂志》262:4429-4432)、构建作为线粒体或其它载体的一部分的核酸等。

施用的方法可以为肠内或肠胃外并且包含皮内、肌内、覆膜内、静脉内、皮下，肺部、鼻内、眼内、硬膜外和口腔途径。化合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或团注注射、通过上皮或皮肤粘膜内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收施用并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性的或局部的。另外，可能期望通过任何合适的途径，包含脑室内和鞘内注射，将本公开的药物组合物引入到中枢神经系统中；心室内注射可以通过例如附接到如Omcana容器等容器的心室内导管来促进。还可以采用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器和具有雾化剂的调配物。

本公开的药物组合物可以局部施用于需要治疗的区域；这可以例如通过在外科手术期间局部输注、局部施用，例如，通过注射、借助于导管或借助于植入物实现，所述植入物为多孔、无孔或凝胶材料，包含膜，如硅橡胶膜、纤维或商用皮肤替代物。

在另一实施例中，可以在囊泡中递送，具体地，在脂质体中(参见Langer(1990)《科学》249:1527-1533)活性剂。在另一实施例中，可以在控释系统中递送活性剂。在一个实施例中，可以使用泵(参见Langer(1990)同上)。在另一实施例中，可以使用聚合材料(参见Howard等人(1989)《神经外科学杂志(J.Neurosurg.)》71:105)。在另一实施例中，在本公开的活性剂为编码蛋白质的核酸的情况下，可以体内施用核酸以如下促进所述核酸的所编码蛋白质的表达：通过构建所述核酸作为适当核酸表达载体的一部分并且施用所述核酸使得其变为胞内，例如，通过使用逆转录病毒载体(参见，例如，美国专利第4,980,286号)或通过间接注射或通过使用微粒轰击或涂覆脂质或细胞表面受体或转染剂或通过施用所述核酸与已知进入核的同源异型盒样肽的组合(参见，例如，Joliot等人,1991,《美国国家科学院院刊》88:1864-1868)等。可替代地，核酸可以被细胞内引入并掺入在宿主细胞DNA内以通过同源重组进行表达。

B.组合疗法

本文提供的激活素A、ACVR1、ACVR2A和ACVR2B拮抗剂或针对激活素A的抗体可以与一种另一种或其它治疗组合使用。在一个实施例中，治疗FOP的方法涉及共施用ACVR2A拮抗剂和ACVR2B拮抗剂。在另一实施例中，治疗FOP的方法涉及共施用ACVR1、ACVR2A和ACVR2B拮抗剂。在其它实施例中，ACVR1拮抗剂可以与ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂共施用。ACVR1、ACVR2A和ACVR2B拮抗剂可以作为单独药物组合物施用或者可以作为包括这些药剂的组合的单个药物组合物施用。ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂或针对激活素A的抗体单独或组合可以与一种或多种额外治疗化合物结合。组合疗法可以涵盖同时施用或交替施用。另外，组合可以涵盖急性施用或慢性施用。

C.药物组合物

本公开还提供了药物组合物，其包括本文提供的激活素A、ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂或针对激活素A的抗体和药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其它公认的药典中列出的用于动物并且更具体地用于人类。术语“载体”是指治疗剂与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。此类药物载体可以是无茵液体，如水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。合适的药物赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。

这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释调配物等形式。可以用如甘油三酯等传统的粘合剂和载体将组合物调配为栓剂。口服调配物可以包含标准载体，如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin.的“雷明顿氏药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)”。

在一个实施例中，根据例程程序将组合物调配为适于静脉内施用于人类受试者的药物组合物。必要时，所述组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因(lidocaine)以便缓解注射部位的疼痛。在通过输注施用组合物时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶分配组合物。当组合物通过注射施用时，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，使得可以在施用之前混合成分。

本文提供的激活素A、ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂或针对激活素A的抗体可以被调配为中性或盐形式。药学上可接受的盐包含用自由氨基，如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些自由氨基，形成的那些盐以及用自由羧基，如源自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些自由羧基形成的那些盐。

通过有效治疗FOP(例如，治疗有效量)的特定途径施用的激活素A、ACVR1、ACVR2A和/或ACVR2B拮抗剂或针对激活素A的抗体的量和频率可以基于本描述通过标准临床技术确定。此外，可以采用体外测定来帮助鉴定最优剂量范围。调配物中要采用的精确剂量还将取决于施用途径和病状的严重度，并且应根据实践者的判断和每个受试者的情况来决定。然而，用于肠胃外施用，优选地，静脉内或皮下的合适剂量范围通常为每千克体重约20-50000微克活性化合物。对于针对激活素A的抗体，合适剂量范围包含1-25mg/kg、2-20mg/kg5-15mg/kg、8-12mg/kg和10mg/kg。用于鼻内施用的合适剂量范围通常为约0.01pg/kg体重到1mg/kg体重。可从来源于体外或动物模型测试系统的剂量-应答曲线外推出有效剂量。

施用的频率还根据病状的严重程度和药剂的半衰期等其它因素而变化，但通常介于每日与每季之间，包含，例如，一周两次、一周一次、两周一次、一月一次、两月一次。还可以响应于患者的病状或药剂的血清水平降低到阈值以下等其它因素以不规则间隔施用药剂。

上文或下文引用的所有专利申请、网站、其它出版物、登录号等都出于所有目的，过引用以其整体并入，其程度如同每个单独的项被单独并且具体地指出为通过引用并入。如果序列的不同版本与不同时间的登录号相关联，则意指在本申请的有效提交日期与登录号相关联的版本。有效提交日期是指实际提交日期或提及登录号的优先权申请的提交日期(在适用情况下)中较早的日期。同样地，如果出版物、网站等的不同版本在不同时间发布，除非另有说明，否则指在申请的有效提交日期最近发布的版本。除非另外具体说明，否则本公开的任何特征、步骤、元件、实施例或方面都可以与任何其它特征、步骤、元件、实施例或方面组合使用。

实例

实例1：减少患有进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的患者的新骨病变活性的形成

在患有FOP的受试者体内，骨在正常骨架之外的软组织中形成，这是被称为异位(在错误的地方)骨化(HO)的过程。进行了关键双盲安慰剂对照的试验以评估患有FOP的患者体内的激活素A拮抗剂，例如，加托索单抗。在主要端点时，加托索单抗将新HO骨生长相对于基线降低了25％，如通过CT扫描测量的，并且将在28周内病变生长和矿化的平均速率降低了25％，如通过更敏感的PET骨扫描测量的。加托索单抗在单独的28周时间点(事后分析)时的PET骨扫描结果方面显示出统计上显著的50％降低，这很大是由新病变的发病率和强度的显著降低驱动的。加托索单抗将新骨病变的发病率降低了大约90％，如通过PET和CT扫描两者测量的，并且将患者报告的急性发作的发病率降低了一半。

此安慰剂对照的试验的结果表明可以几乎消灭新HO骨形成和急性发作的有效治疗，其中新骨的发病率几乎降低了90％，这对于患有FOP的人来说是开创性的结果。这些数据还通过PET扫描进行展示显著提高了对疾病的了解，即，患有FOP的未经治疗的患者会经历比先前所想的频繁更高且分布更广的病变。

研究从美国和欧洲通过对FOP的临床诊断以及ACVR1基因突变的记录招募了44明成人患者(18-60岁)。试验采用18F-NaF PET成像和CT扫描来研究加托索单抗对患有FOP的患者的HO的变化的影响。18F-NaF是广泛认可并且广泛使用的趋骨性PET示踪剂，其具有高敏感度以检测几种骨相关疾病，如派杰氏病(Paget's disease)和具有骨累及的癌症中的异常骨生长、转换和矿化。研究具有三时间段试验设计，其由随机化、双盲安慰剂对照的治疗时间段(6个月)、经安慰剂治疗的患者跨越到加托索单抗治疗的开放标签治疗时间段(6个月)和开放标签随访治疗组成。在第28周时记录了主要分析。

来自研究的关键临床结果在以下表1中汇总。所有端点为28周并且通过盲、独立性中央审查评估。

表1

*主要端点

**指定端点

^探索端点

事后分析

在28周治疗时间段期间，观察到加托索单抗总体上耐受性良好。任何严重的不良事件(SAE)被视为与基础疾病的严重程度相关。治疗期出现的不良事件(TEAE)100％发生在安慰剂组和经治疗的组两者中；绝大多数的严重程度为轻度到中度。TEAE的显著不平衡包含流鼻血(50.0％对16.7％)和皮肤事件(睫毛脱落[眉毛丧失，25.0％对0％]、痤疮[30.0％对8.3％]和皮肤感染的复合症状，包含脓肿、痈、毛囊炎、疖)。试验的开放标签部分的两名经治疗的患者患上严重的脓肿，需要住院治疗以引流，但在继续加托索单抗治疗时报道地消退。试验的开放标签部分的一名患者由于与治疗不相关的创伤死亡。

加托索单抗对安慰剂降低了相对于第8周和第28周时间点(-24.6，p 0.07)，即主要端点的基线平均值的总体病变活性变化百分比；在第8周端点时未降低，但在第28周端点(DB时间段结束时)降低为49％(标称p＝0.043)。这很大是由新病变的发病率、强度和病变活性的显著标记的降低驱动的。新病变的总体病变活性(如在第28周通过PET测量的)降低了97％(p＝0.009)，同时新病变的总体体积(如在第28周通过CT测量的)降低了90％(p＝0.017)。在患者报告的急性发作(51％)和研究者报告的AE急性发作(76％)中看到显著降低。用加托索单抗进行治疗还证明了可接受的安全性概况。

激活素A拮抗剂，例如，加托索单抗进行的激活素A阻断可以显著减少新异常骨形成和疼痛的急性发作的发生。这些数据强烈支持激活素A为患有FOP的患者的急性发作和新骨病变两者的重要触发剂的假设。

实例2：激活素A拮抗剂预防新异位骨化(HO)

进行了28周随机化双盲安慰剂对照的研究(时间段1)以测试激活素A拮抗剂，如加托索单抗是否将断开对患有FOP的人类受试者的异位骨形成的激活素A依赖性信号传导。

使用了用18F-NaF PET进行的正电子发射断层(PET)扫描和体积计算机断层(CT)以测量异位骨形成的变化。已在几种其它疾病环境中示出18F-NaF PET提供了骨矿化活性的敏感性、特异性和全身定量测量。由Botman,2019(通过引用以其整体并入本文)共布的数据支持使用18F NaF PET作为FOP中HO生长的预测剂并且充当用于评估具体与高强度18F-NaF PET信号相关的活跃HO病变的基础。此外，在6个月内通过CT对HO病变进行的体积评估还允许评估HO病变的生长和可PET检测的病变到可CT检测的成熟HO病变的转变。观察到加托索单抗快速降低¹⁸F-NaF摄取(通过PET)，并且防止新异位骨形成(通过CT)。

研究被设计为有80％能力检测28周平均总体病变活性的降低为57％(PET)，在第8周¹⁸F-NaF SUV最大值降低40％，并且通过CT得到的总体体积的差为60％。招募的44名患者100％在基线时具有活跃HO，如通过PET检测到的。结果表明加托索单抗抑制新病变的出现但不终止确立的病变的进展(表2)。还观察到加托索单抗耐受良好。经加托索单抗治疗的患者中更频繁的SAE没有趋势并且也不可能反映疾病的严重程度。AE的显著不平衡包含流鼻血(50.0％对16.7％)和皮肤事件-睫毛脱落(25.0％对0％)、痤疮(30.0％对8.3％)和皮肤感染的复合症状(例如，脓肿、痈、毛囊炎、疖)。

如研究设计(图1)的示意图中描绘的，此研究由一个筛选/基线时间段(第-28天到第-1天)、两个6个月治疗时间段和一个随访治疗时间段(时间段3)组成。3个治疗时间段为：时间段1：6个月随机化双盲安慰剂对照的治疗时间段；时间段2：6个月开放标签加托索单抗治疗时间段；时间段3：用加托索单抗继续治疗直到患者完成第76周访视，并且已收集并验证了到随机化到研究中的最后一名患者完成28周访视(时间段1)的时间的所有数据并且安全性和功效的主要分析的结果可供赞助商使用的随访治疗时间段。

新出现的数据(Eekhoff等人,JBMR 2017和《骨》2017,Upadhyay等人,JBMR 2017；所述文献中的每个通过引用以其整体并入本文)表明PET扫描可以鉴定“活跃”骨病变。作为用于预防新病变的替代，研究了加托索单抗对这些“活跃”骨病变的影响。因此，主要端点评估了如通过PET在现有骨病变与潜在地新骨病变两者中测量的“总体病变活性”(TLA)，如通过大小和强度评估的(评估的示踪剂的摄取)。多个其它端点捕获如通过PET和CT两者评估的总体病变和新病变，并且还捕获由患者和研究者报告的急性发作。主要分析(通过PET的TLA)以及对骨病变的多种其它的分析(包含通过CT)表明用加托索单抗进行的治疗与相比于安慰剂约25％的总体降低相关。这些降低几乎是完全由如在28周时通过PET或CT评估的新病变的大约90％降低驱动的。这归因于FOP患者的令人惊讶地高频率的新病变(11/24安慰剂患者在28周内具有平均2.7个新病变，相比之下3/20的加托索单抗患者各自具有一个病变)。患者报告的急性发作(50％)和研究者报告的AE急性发作(76％)显著减少。这些数据表明对于FOP患者的新骨病变的形成需要激活素A；然而，其在现有PET阳性和CT骨病变中似乎未发挥主要作用。

表2

成像

将放射性标记的18F氟化钠注射到患者体内，并且提取每位患者的经组合的PET/CT图像。PET/CT成像分析的细节指示如下：

PET：标准化摄取值(SUV)为来自扫描的放射性的测量结果。SUV平均值＝所关注区(ROI)，如异位骨化(HO)中18F-NaF的平均浓度-平均ROI多“热”。SUV最大值＝ROI内的最大(“最热”)像素。病变活性(LA)＝病变中18F-NaF的总信号。跨PET上的病变的整个代谢体积(MV)的平均SUV。总体病变活性(TLA)＝给定时间点时患者的所有靶标和新病变的LA的患者层次总和-生长和矿化中的HO负荷的测量结果。TLA变化％的时间加权平均值(TWA)＝用于跨时间点评估生长和矿化中的HO的负荷变化的TLA变化％在28周内的平均值。PET成像清晰地表明疾病进展(图2A)以及加托索单抗对HO病变的影响(图2B)。

CT：HO体积＝单个持续靶标或新HO病变的体积。总体HO体积＝给定时间点时患者层次的靶标和HO病变的体积的总和–所形成HO负荷的测量结果。

来自成像分析的结果表明，当将现有(“靶标”)病变与新病变分开进行检查时，加托索单抗的影响更显著(图3A-3B)。

功效

当在第8周时间点和第28周时间点时求平均时观察到相对于基线，加托索单抗降低了总体病变活性(新和现有两者)(-25％，p＝0.074)。在第8周端点时未降低(p＝0.592)，但在第28周端点(DB时间段结束时)降低为49％(标称p＝0.043)。这很大是由新病变的发病率、活性(PET)和体积(CT)的显著降低驱动的。新病变的总体病变活性(如在第28周通过PET测量的)降低了97％(p＝0.009)，同时新病变的总体体积(如在第28周通过CT测量的)降低了90％(p＝0.017)。所有端点均为预先规定的(通过CT得到的具有新HO病变的患者的数量除外)通过盲、独立性中央审查评估。通过PET/CT骨扫描评估病变。通过PET扫描的测量与对CT扫描的同时评估确定新病变的100％相关性。患者报告的急性发作(51％)和研究者报告的AE急性发作(76％)显著减少。这些数据强烈支持激活素A为患有FOP的患者形成新病变所需的配体。激活素A似乎在现有PET/CT病变的进展中未发挥主要作用。因此，阻断激活素A为改变这些长期受折磨的患者的疾病的过程提供了机会。

安全性

在28周治疗时间段期间，治疗期出现的不良事件(TEAE)100％发生在安慰剂组和经治疗的组两者中；大多数的严重程度为轻度到中度。TEAE的显著不平衡包含流鼻血(50.0％对16.7％)和皮肤事件(睫毛脱落[眉毛丧失，25.0％对0％]、痤疮[30.0％对8.3％]和皮肤感染的复合症状，包含脓肿、痈、毛囊炎、疖)。

实例3：研究设计和解释

研究设计与其它研究如何不同

进行了2期、随机化、双盲、安慰剂对照的研究以评估安全性、耐受性以及患有FOP的成人的静脉内加托索单抗(每4周以10mg/kg施用)对异位骨形成的影响。这消除了潜在不平衡以及与外部历史对照和非盲评估相关联的偏置。

关于疾病异位骨化(HO)体积告诉我们什么

进行性HO是FOP的定义特性。HO体积可能影响疾病活性以及关节变得不活动的潜能。HO的定位对患者重要并且可以是有临床意义的。尽管骨的体积是定向性地相关的，但病变的数量和定位为疾病活性的重要量度。在研究中，主要端点集中于总体病变活性对安慰剂。例如，来自如肘部等关节中的新病变的少量的骨可能会使其一生无法移动，而可以在较少移动的关键区域中添加大量骨或在具有现有HO的区域中所述大量骨的影响可能低得多。另外，在小体积或大体积增加的情况下分析具有1个或2个离群值的数据集时，“平均体积”变化的解释可能是有挑战性的。

成像原理

成像分析

通过与异常骨的密度和形态学一致的密度和形态学以及与如在CT扫描中鉴定的肌腱或韧带等骨骼肌一致的位置将病变鉴定为HO。所述病变是通过对样品为盲的2个独立读取者鉴定的并且是通过也是盲的独立审核员确认的。所述读取者和审核员全部都是委员会认证的放射科医师。

用于病变选择的标准和用于研究设计和成像分析的原理

用于病变选择的原理在《成像章程(imaging charter)》中明确定义并且受到FDA批准。进行了额外事后图像分析以更好理解FOP的自然病史和加托索单抗对HO形成的影响。规定了“至多7个病变”，因为许多病变是不期望的并且高于病变的所述数量对于读取者来说将是不实际。基于PET上在正位重建骨之上3倍的强度选择病变。

排除由于炎性骨软骨瘤或骨关节炎的假阳性

《成像章程》指导作为委员会认证的放射科医师的2名独立读取者和独立审核员以通过其位置(如关节)或通过其来自CT扫描的特征小心避开与非HO病理学相关的PET的任何区，这在这些特征都与退行性疾病、骨软骨瘤等一致时进行。所有读取者还接受了《成像章程》的训练。

与用于检测成骨细胞活性的¹⁸FNaF PET/CT比较的骨显像

广泛使用了锝-99m亚甲基二膦酸盐(^99mTcMDP)骨显像以检测成骨细胞活性。PET/CT为将横截面功能成像与解剖成像组合以进行诊断的分子成像技术。氟-18氟化物(¹⁸F-氟化物)为用于检测骨骼异常的高度敏感的趋骨性PET示踪剂。¹⁸F-氟化物的摄取机制类似于^99mTcMDP的摄取机制。然而，¹⁸F-氟化物显示出更好的药代动力学特性，包含骨中较快的血液清除和两倍高的摄取。¹⁸F-氟化物的摄取反映了血流和骨重建。混合PET/CT系统的使用显著改进了¹⁸F-氟化物成像的特异性，因为研究的CT组分允许形态学表征功能性病变以及在良性病变与转移之间进行更准确区分。

与^99mTcMDP骨显像相比，氟-18氟化钠正电子发射断层-计算机断层(¹⁸FNaF PET/CT)成像具有更高的敏感度和更高的空间分辨率。另外，¹⁸FNaF PET/CT图像的质量更好，并且其可以更准确地定量。这是由于骨的较低质粒蛋白结合和较高摄取。

¹⁸FNaF PET为研究中通常使用的高度敏感性技术。使用了¹⁸FNaF PET作为研究中的基准以评估CT成像是否将产生可比较的结果。数据显示可以使用CT以监测在对¹⁸FNaFPET具有可比较的敏感度的情况下的疾病进展，由此确认其用于临床实践的能力。

临床数据

研究是基于阻断激活素A并预防新病变形成的假设，并且初始28周结果的总体性令人鼓舞。

进行了长期56周研究，其中安慰剂患者将跨越到加托索单抗组以进一步了解这些结果并将这些结果放入具体环境中。加托索单抗的主要影响在于预防新病变。主要端点上的数据优雅地展示了TLA在治疗的第8周之后显著减少，而安慰剂组中出现更多新病变，这与加托索单抗形成对比。与加托索单抗组相比，安慰剂组在28周研究时间段内平均得到多出大约10cm³的新HO(相对于基线的变化平均值为16.7cm³对6.5cm³)。

高比例的患有FOP的患者因为胸廓发育不良死亡，因此评估用加托索单抗治疗对肺部功能的影响至关重要。数据表明，相比于安慰剂，加托索单抗通过在第28周预防新HO的方式保留了肺部功能。

加托索单抗对FOP的影响

加托索单抗的抑制水平在长间隔内应一致以预防确立的HO病变的进展或预防新HO病变。FOP为伴随持续HO的慢性疾病，其中一些为无声的并且与急性发作不相关。因此，为了控制所述疾病，给药必须为慢性的。患者的血清中的药物的水平应始终高于激活素A饱和水平以预防新HO的进展或发展。

儿科研究

进行了56周2期研究以在儿科患者和成人患者两者中进行评估。

与帕罗伐汀(palvarotene)不同，加托索单抗的临床前数据显示出对生长板无影响。数据表明成人FOP患者的正常骨中的¹⁸FNaF的摄取无变化。

已研究了在患有FOP的成人患者中通过IV施用每四周给药一次(Q4W)的10mg/kg的剂量水平。此研究中报告的不良影响(例如，头疼、流鼻血以及皮肤和软组织感染)似乎与患者之中的药物暴露(C最大值、C最小值或AUC无关)。在儿科研究中纳入剂量确认队列(队列A)的原因与安全担忧无关，而是选择针对每个体重组(即，患者<30kg或>30kg)的在儿科患者中实现与研究中的成人患者的功效相关的暴露类似的暴露的剂量方案。

提出了以下给药方案以用于在患有FOP的患者中进行儿科研究：对于重量低于30kg的患者，15mg/kg IV Q4W；以及对于重量为或高于30kg的患者，10mg/kg IV Q4W。在初始研究中，在患有FOP的成人患者中研究了10mg/kg IV Q4W剂量，所述剂量在功效和可接受的安全性概况方面显示出有益应答。在此研究中，在10mg/kg IV Q4W剂量之后，患有FOP的成人患者的稳态槽浓度的中值(范围)为120.7(68.1-199.0)mg/L。基于在初始研究和两个人体首次(FIH)研究中产生的加托索单抗和总体激活素A的浓度数据，加托索单抗的浓度维持高于约50mg/L与靶点介导的消除通路的饱和相关，如通过0.05-0.06mg/L左右的总体激活素A的恒定水平证明的。在大多数患者中最大靶点接合的情况下，通过维持靶点介导的消除通路饱和，在成人患者中利用10mg/kg IV Q4W剂量观察到的暴露被视为提供了显著的功效益处。

在患有FOP的儿科患者中，根据使用群体PK模型基于来自成人健康受试者和患有FOP的成人患者的数据进行的模拟，针对队列A(对于低于30kg的患者15mg/kg IV Q4W，或对于为或高于30kg的患者10mg/kg IV Q4W)提出的剂量期望与在初始研究中研究的成人患者在10mg/kg IV Q4W下的暴露相匹配。基于来自队列A中接受活性药物的8名患者的分析的结果，在体重组中的一个或多个组中剂量可以调整以确保与初始研究中的成人相当的暴露。队列B患者将仅在已基于队列A中招募的患者的从第1天到第85天的数据确认了剂量之后开始接受研究药物。因为目标是靶点饱和以确保功效，因此研究了FOP患者的不同剂量。对儿科进行建模引导到至多15mg/ml的剂量以满足较小儿童的靶点饱和。来自毒理学研究的数据未表明儿童的安全性风险增加。

PET扫描和CT扫描成像的程序审查

PET/CT扫描的审查被视为预先规定的、中央的、独立的且盲的。第28周研究之后，安慰剂组中的患者转变到加托索单抗，并且自此所有研究参与者都接受活性药物。为了进行研究的主要分析，双盲安慰剂对照的时间段(时间段1)期间的研究治疗分配是非盲的。然而，重要的是应注意，时间段1期间的单独治疗分配没有对研究者/站点人员公开，也没有向独立成像读取者或成像审核员公开。研究赞助商对成像结果也是盲的并且在第56周数据库锁定之前将不会获取扫描。这允许成像读取者在第56周进行PET/CT扫描的盲态分析。同样，在第28周与第56周期间以及甚至在之后(大多数患者超过第76周)，研究者在不确定其在安慰剂对照的时间段期间接受了什么的情况下继续进行其对研究患者的临床评估。

实例4：激活素A拮抗剂预防新异位骨化(HO)

研究设计

2期、随机化、双盲、安慰剂对照的研究被设计为评估每4周给药10mg/kg加托索单抗(Q4W)在患有进行性骨化性纤维发育不良(FOP)的成人患者体内的安全性、耐受性、药代动力学和功效。通过对异位(HO)骨形成进行¹⁸F-NaF正电子发射断层(PET)和低剂量X射线计算机断层(CT)成像分析评估了功效。期望的是相比于安慰剂，研究将显示以下：a)加托索单抗耐受良好；b)通过证明PET信号的减少以及通过体积CT对HO的生长的抑制，加托索单抗降低了HO；以及c)加托索单抗抑制如通过PET和CT评估的新HO病变的发展。

此研究由4周筛选/基线时间段、6个月随机化双盲安慰剂对照的治疗时间段(时间段1)、6个月开放标签加托索单抗治疗时间段(时间段2)和利用开放标签加托索单抗的随访治疗时间段(时间段3)组成。在所有患者完成双盲治疗(时间段1)时进行了主要分析。关于包含具有与ACVR1突变相关的任何FOP的患者的活性HO分析组(AHO，n＝44)和活性HO ACVR1[R206H]突变组(AHOC，n＝42)分析了所有主要和次要第28周功效端点。研究的《成像章程》将活跃患者定义为具有至少一种异位骨化病变的展示出如通过中央审查评估的对¹⁸F-NaFPET的摄取为正常参考骨的摄取的至少三倍的那些患者。类似地，用于通过PET和CT鉴定新HO病变的标准在《成像章程》中预先规定。对安全性分析组进行了安全性分析，并且安全性分析包含了截止数据截止日期的所有可用数据。患者处置

将总共44名患者随机化(加托索单抗组中20名患者并且安慰剂组中24名患者)。四十三名(98％)患者完成了双盲治疗时间段；来自加托索单抗组的1名患者在双盲时间段期间由于热病的不良事件退出了研究(细节参见以下)。完成双盲时间段的全部43名患者进入开放标签时间段2。截止数据截止日期，12名患者进入随访治疗时间段3。一名患者在时间段3中由于跌倒之后严重的头部创伤死亡(与治疗无关)。平衡了两个治疗组之间的AHO、AHOC和SAF群体的人口统计特性和基线疾病特性。

功效结果

使用统计层级测试的所有主要和关键次要端点的结果在表3中呈现(按统计层级的次序)。在AHO中相比于安慰剂(p＝0.0741)，加托索单抗在28周内相对于基线将平均总体病变活性(通过¹⁸F-NaF PET)相对于基线降低了大约25％(LS平均值差)。事后分析表明总体病变活性降低可能不会以恒定速率发生。到第8周总体病变活性相对于基线的变化百分比在两个治疗组中相似，到第28周总体病变活性相对于基线的变化百分比在加托索单抗组中比安慰剂(事后；p＝0.043；图4)低。关于其它端点，在AHO中在第28周(p＝0.3726)观察到HO病变的总体体积(通过CT)相比于安慰剂相对于基线降低了大约25％(LS平均值差)。在AHOC群体中观察到相似结果。在AHO中相比于安慰剂降低加托索单抗组的每日平均疼痛的趋势良好(图5)。在AHOC中观察到相似结果。加托索单抗组中相比于安慰剂通过PET得到的总体病变活性和通过CT得到的HO病变的总体体积的降低主要是由加托索单抗在降低新病变生长方面的功效驱动的。

表3：统计层级中的主要和关键次要功效端点结果

AHO＝患有至少1种活性HO病变的患者；AHOC＝患有至少1种活性HO病变和经典ACVR1R206H突变的患者；ANCOVA＝协方差分析；MMRM＝重复测量混合模型。使用了在第28周通过审核的所选读取者提供的评估以进行主要分析(在第28周未进行审核的情况下选择读取者1)。

对通过加托索单抗抑制新病变的分析

以下(表4)在AHO群体中进行的关键预先规定的次要探索性和事后分析的分析表明加托索单抗组中相比于安慰剂通过PET得到的总体病变活性和通过CT得到的HO病变的总体体积降低主要是由与新HO病变生长，如新HO病变的发病率、速率、病变活性(PET)和体积(CT)相关的多个端点的几乎90％降低驱动的。在加托索单抗组中相比于安慰剂，在28周内新PET病变的数量显著减少(新病变的速率降低87.4％)。在加托索单抗组中相比于安慰剂，新PET病变的数量显著较低(3对29)。在加托索单抗组中相比于安慰剂，与新病变相关的每位患者的平均总体病变活性较低(5.22/pt对205.99/pt)。相比于安慰剂组，与加托索单抗组中患有新PET病变的患者的新病变相关的总体病变活性也显著较低(图6)。在加托索单抗组中相比于安慰剂，在28周内患上新PET病变的患者的百分比较低(15％对46％，图7)。在加托索单抗组中相比于安慰剂，在28周内新CT病变的数量较低(新病变的速率降低86.7％)。相比于安慰剂组的27个新CT病变，加托索单抗组中存在3个新CT病变。在加托索单抗组中相比于安慰剂，与新病变相关的平均每患者总体CT体积较低(1.06cm³/pt对10.21cm³/pt)。在加托索单抗组中相比于安慰剂组，与患上新CT病变的患者的新病变相关的总体CT体积也较低(图8)。在加托索单抗组中相比于安慰剂，在28周内患上新CT病变的患者的百分比较低(15％对46％，图9)。另外，在加托索单抗组中相比于安慰剂，患有如通过患者日志评估的急性发作以及研究者报告的急性发作的不良事件的患者的比例较低。在AHOC群体中观察到相似结果。

表4：其它支持功效结果(AHO)

安全性结果

在28周双盲治疗时间段期间，治疗期出现的不良事件(TEAE)100％发生在加托索单抗组和安慰剂组两者的患者中；大多数的严重程度为轻度到中度。相应地加托索单抗组和安慰剂组的TEAE的显著不平衡包含流鼻血(50.0％对16.7％)和皮肤事件(睫毛脱落[眉毛丧失，25.0％对0％]、痤疮[30.0％对8.3％]和皮肤感染的复合症状，包含脓肿、痈、毛囊炎和疖)。当安慰剂组的患者在持续进行的开放标签时间段(时间段2)中转变为加托索单抗时，流鼻血和以上皮肤实践的报告频率增加。对安慰剂组与加托索单抗组之间的28周双盲时间段期间的输注反应的频率进行了平衡(安慰剂：6/24(25％；加托索单抗：5/20(25％))。时间段2期间，4名患者(9.3％)在接受加托索单抗时呈现出输注反应。在时间段1期间分别报告了经加托索单抗和安慰剂治疗的组的20％和8.3％的严重不良事件(SAE)。分配到加托索单抗组的患者在时间段1期间出现的一件SAE(流鼻血)导致了针对鼻腔填塞的住院治疗。此事件的特征在于可疑非预期严重不良反应(SUSAR)。患者完全恢复并且继续研究。在开放标签时间段期间并且直到数据截止日期，报告了3件SAE。两名患者在时间段2期间发生了脓肿的SAE，这需要针对切开和引流(分别地由研究者报告为与研究药物相关和不相关的皮下脓肿和囊肿脓肿)的住院治疗。脓肿消退并且患者在暂时治疗中断之后继续接受加托索单抗。第三患者发生了由于跌倒引起的严重头部创伤的SAE，之后死亡。头部创伤在时间段3期间在患者接受了16次加托索单抗输注之后发生，并且被研究者评估为与研究药物不相关。20名加托索单抗组患者中的十九名患者和24名安慰剂组患者中的24名患者完成时间段1。在28周治疗时间段中终止加托索单抗的患者发生了由研究者评估为严重程度为轻度并且与研究药物不相关的不良事件。患者呈现了2件肺炎的SAE(住院治疗)(其中一件兼有败血症)之后热病复发导致研究者终止患者进行研究。在其它临床特征之中，此患者的药物史包含重度限制性肺病、支气管扩张和骨骼畸形。一名患者在开放标签随访治疗时间段(时间段3)由于与治疗不相关的头部创伤死亡。

结论

加托索单抗在28周内相对于基线降低了总体病变活性(新病变和现有病变两者)(时间加权平均值为差值约25％,p＝0.0741)。这很大是由新病变的发病率、速率、活性(PET)和体积(CT)的大约90％降低驱动的。在如FOP等其中进行大到足以确保足够能力的研究不可行的超罕见病状中，常见的是接受10％的I类误差率以避免制造2类误差。就此而言，总体功效结果是令人信服的并且强烈支持加托索单抗减少了患有FOP的患者形成新HO。结果还支持这样的解释，即激活素A在基线时通过PET/CT选择的现有HO病变的进展中似乎未发挥关键作用。用加托索单抗进行治疗表明可接受的安全性概况以及输注反应和SAE的低发病率。大多数TEAE的严重程度为轻度到中度。TEAE中的显著不平衡包含流鼻血、痤疮、睫毛脱落和皮肤感染的复合症状，包含脓肿、痈毛囊炎和疖。在此持续进行的研究中，并且所有患者已转变到开放标签时间段(时间段2和3)。安慰剂患者到加托索单抗的跨越允许在第56周时确认加托索单抗治疗引起相比于对照(其中“对照”为在先前的安慰剂治疗时间段期间这些相同患者的测量结果)新骨病变形成显著降低。第56周数据还将提供关于治疗作用在继续其加托索单抗治疗的患者体内的持续性的信息。总的来说，来自研究的安全性和功效数据显示出加托索单抗对治疗患有FOP的成人患者的积极效益风险。用加托索单抗阻断激活素A提供了改变长期受折磨的FOP患者的疾病的过程的机会。

研究目标

主要目标

研究的主要安全性目标是评估加托索单抗在患有FOP的患者体内的安全性和耐受性。研究的主要功效目标是评估加托索单抗对安慰剂对患有FOP的患者的HO相对于基线的变化的影响，如在通过PET得到的HO病变和通过CT得到的HO病变的总体体积方面通过¹⁸F-NaF摄取确定的。次要目标

研究的次要目标是：

·将加托索单抗对安慰剂对由于FOP引起的疼痛的影响，如基于每日疼痛NRS评分通过疼痛的曲线下面积(AUC)测量的。

·评估加托索单抗对安慰剂在HO中相对于基线的变化的影响，如借助于通过¹⁸F-NaF PET或通过CT鉴定的新HO病变的数量确定的。

·评估加托索单抗对安慰剂对通过PET得到的单个活性HO位点的¹⁸F-NaF标准化摄取值最大值(SUV最大值)相对于基线的变化的影响。

·评估在第28周从安慰剂切换到加托索单抗的患者对在基线与第28周之间的相同患者中加托索单抗在第28周与第56周之间对通过¹⁸F-NaF PET或通过CT鉴定的HO病变的数量、活性和体积的影响。

·评估加托索单抗对安慰剂在骨形成的生物标志物方面相对于基线的变化的影响。

·表征基线时和研究药物的首次给药之后随着时间推移的总体激活素A的浓度。

·表征加托索单抗在患有FOP的患者体内的浓度-时间概况(药代动力学[PK])谱。

·评估加托索单抗的免疫原性。

研究设计

这是2期、随机化、双盲、安慰剂对照的研究，其被设计为评估在患有FOP的成人患者体内重复给药10mg/kg IV加托索单抗Q4W的异位骨形成方面的安全性、耐受性、PK和影响。如研究设计示意图(图1)中描绘的，此研究由一个筛选/基线时间段(第-28天到第-1天)、两个6个月治疗时间段和一个随访治疗时间段(时间段3)组成。

在筛选/基线时间段期间，所有患者经历知情同意书过程和筛选/基线程序。在双盲治疗时间段(时间段1)中，患者被随机化为接受10mg/kg剂量的加托索单抗或相匹配的安慰剂，IC施用Q4W到第24周，总计7次给药。随机化是通过性别、经典ACVR1[R206H]突变/差异ACVR1突变以及如通过¹⁸F-NaF-PET/CT确定的基线活性HO病变的存在/不存在分层的。在开放标签治疗时间段(时间段2)中，完成双盲治疗时间段的所有患者接受了以10mg/kg Q4W的剂量IV施用的加托索单抗到第52周，总计7次给药。完成时间段2的患者在时间段3中继续接受加托索单抗到第76周或超过第76周。基线、第8周、第28周、第56周和第76周时进行成像程序。

统计分析

分析群体

根据《国际人用药品注册技术要求协调会(International Conference ofHarmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticalsfor Human Use(ICH))》指南ICH E9临床试验统计原理(1998)，使用以下分析群体以进行所有统计分析：

基线-活性HO分析组(AHO)：基线-活性HO分析组(AHO)包含在基线时具有至少一种活性HO病变的所有随机化患者；其基于分配的治疗(如随机化的)。

基线-活性HO经典ACVR1[R206H]突变分析组(AHOC)：基线-活性HO经典ACVR1[R206H]突变分析组(AHOC)包含具有经典ACVR1[R206H]突变并且在基线时具有通过18F-NaF PET阳性率定义的至少一种活性HO病变的所有随机化患者；其基于分配的治疗(如随机化的)。

安全性分析组(SAF)：安全性分析组(SAF)包含接受任何研究药物的所有随机化患者。在安全性分析中使用接受的实际治疗。

功效变量分析

研究的功效变量由来自成像程序的评估、临床端点和骨形成的生物标志物组成。

多重性考虑：研究具有四个主要功效目标和两个次要功效目标。为了控制I类误差率，以2侧5％显著性水平应用层级测试程序，仅在确立了所有主要端点的统计显著性的情况下测试关键次要功效端点。主要功效端点和关键次要功效端点的测试顺序的次序如下：

主要功效端点：

AHO中在28周内通过¹⁸F-NaF PET得到的总体病变活性相对于基线的变化百分比的 时间加权平均值(标准化AUC)

计算了每位患者在28周内通过18F-Naf PET得到的总体病变活性相对于基线的变化百分比的AUC。在AUC的计算中使用了标称时间(即，第8周和第28周)而不是实际时间。如果第8周的成像扫描丢失，则使用基线与第28周之间的变化％的线性插值来计算AUC。如果第28周的成像扫描丢失，则第8周的变化％结转到第28周以计算AUC。得到了时间加权平均值(标准化AUC)作为在28周内通过¹⁸F-Naf PET得到的总体病变活性相对于基线的变化百分比除以28的AUC。使用协方差分析(ANCOVA)模型以分析在28周内变化百分比的时间加权平均值。模型包含作为协变量的治疗、性别和基线总体病变活性。从模型中排除了ACVR1突变类型，因为除了两名患者之外所有患者都具有ACVR1经典突变。由ANCOVA模型提供了相对于基线的LS变化平均值的差值、对应95％CI和p值以将加托索单抗组针对安慰剂组进行比较。

AHO中在第28周通过CT评估的HO病变的总体体积相对于基线的变化百分比

在AHO分析组中使用MMRM模型分析了在第8周和28周内通过CT评估的HO病变的总体体积相对于基线的变化百分比。模型含有治疗、性别、ACVR1突变类型(经典、非经典)、访视(第8周和第28周)、基线总体体积和访视互动治疗。使用了非结构化协方差以解释时间之间的患者内相关性。由MMRM模型提供了相对于基线的LS变化平均值的差值、对应95％CI和p值以将加托索单抗组针对安慰剂组进行比较。

AHOC中在28周内通过¹⁸F-NaF PET得到的总体病变活性相对于基线的变化百分比 的时间加权平均值(标准化AUC)

使用与针对AHO中的第一主要端点相同的方法分析了AHOC中在28周内通过¹⁸F-NaFPET得到的总体病变活性相对于基线的变化百分比的时间加权平均值(标准化AUC)。模型含有治疗、性别、访视(第8周和第28周)、访视互动治疗和基线总体病变活性的独立变量。

AHOC中在第28周通过CT评估的HO病变的总体体积相对于基线的变化百分比

使用与针对AHO中的第二主要端点相同的方法分析了AHO中在第28周通过CT评估的HO病变的总体体积相对于基线的变化百分比。此模型含有治疗、性别、访视(第8周和第28周)、基线总体体积和访视互动治疗。

关键次要功效端点：

如在AHO中在28周内使用每日NRS测量的由于FOP引起的每日疼痛相对于基线的时 间加权平均值(标准化AUC)变化

计算了每位患者的每日疼痛评分相对于基线变化的时间加权平均值(当前疼痛、最严重的疼痛和最轻的疼痛的平均值)。如果丢失了中间日子的疼痛评分，则使用两个相邻测量结果之间的变化的线性插值来计算时间加权平均值。如果丢失是单调的，则使用基线后末次观测值结转(LOCF)方法来计算丢失的值。在AHO中使用ANCOVA模型分析第28周内每日疼痛的时间加权平均值变化。此模型含有治疗、性别、ACVR1突变类型(经典、非经典)和基线每日疼痛评分。

如在AHOC中在28周内使用每日NRS测量的由于FOP引起的每日疼痛相对于基线的 时间加权平均值(标准化AUC)变化

以与先前关键次要端点相同的方法(AHO中)分析了如在AHOC中在28周内使用每日NRS测量的由于FOP引起的每日疼痛相对于基线的时间加权平均值(标准化AUC)变化。此模型含有治疗、性别和基线每日疼痛评分。

安全性数据分析

在SAF中进行了针对所有患者的安全性和耐受性的总结。安全性分析是基于报告的AE、临床实验室评估和生命体征进行的。在SAP中定义了实验室变量的治疗期出现的潜在地临床显著的值(PCSV)的阈值和生命体征。在确定治疗期出现的PCSV时基线是指当前研究的基线值。

28周研究的扩展

接受加托索单抗的研究参与者继续进行到第56周以扩展研究。此外，允许接受安慰剂的研究参与者在扩展时间段期间接受加托索单抗。在扩展时间段期间接受加托索单抗的安慰剂患者在新病变的数量、病变体积和疼痛评分方面具有相似降低，如在盲态时间段期间(即，到第28周)看到的。

非正式序列列表

SEQ ID NO:1

QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSFS SHFWSWIRQP PGKGLEWIGY ILYTGGTSFNPSLKSRVSMS VGTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARARS GITFTGIIVP GSFDIWGQGT MVTVSS

SEQ ID NO.:2

GGSFSSHF

SEQ ID NO.:3

ILYTGGT

SEQ ID NO.:4

ARARSGITFTGIIVPGSFDI

SEQ ID NO:5

EIVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY GASSRATGIPDRFSGSGSGT DFTLTISRLE PEDFAVYYCQ QYGSSPWTFG QGTKVEIK

SEQ ID NO.:6

QSVSSSY

SEQ ID NO.:7

GAS

SEQ ID NO.:8

QQYGSSPWT

SEQ ID NO:9

EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCKASGFAFDDFAMHWVRQAPGKGLEWVSGIVWNSGDIGY

ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLRTEDTALYFCVKDMVRGLMGFNYYGMDVWGQGTT

VTVSS

SEQ ID NO.:10

GFAFDDFA

SEQ ID NO.:11

IVWNSGDI

SEQ ID NO.:12

VKDMVRGLMGFNYYGMDV

SEQ ID NO:13

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTISTYLVWYRQRPGQAPSLLIYDASNRATDIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPITFGQGTRLEIK

SEQ ID NO.:14

QTISTY

SEQ ID NO.:15

DAS

SEQ ID NO.:16

QQRSNWPIT

SEQ ID NO.:17

SYEVTQAPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGIPER

FSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVL

SEQ ID NO.:18

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGLSWVRQAPGQGLEWMGWIIPYNGNTNS

AQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYFCARDRDYGVNYDAFDIWGQGTMVTV

SS

SEQ ID NO.:19

SGDKLGDKYAC

SEQ ID NO.:20

QDSKRPS

SEQ ID NO.:21

QAWDSSTAV

SEQ ID NO.:22

GYTFTSYGLS

SEQ ID NO.:23

WIIPYNGNTNSAQKLQG

SEQ ID NO.:24

DRDYGVNYDAFDI

Claims (31)

1.一种减少在患有FOP的人类受试者体内形成新异位骨化病变的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂，由此减少在所述人类受试者体内形成新异位骨化病变。

2.根据权利要求1所述的方法，其中预防在所述人类受试者体内形成新异位骨化病变。

3.一种预防在患有FOP的人类受试者体内形成新异位骨化病变的方法，所述方法包括向所述人类受试者施用治疗有效量的激活素A拮抗剂，由此预防在所述人类受试者体内形成新异位骨化病变。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变的数量减少了至少5％、至少10％、至少20％、至少约25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少5％-90％、至少10％-90％、至少20％-90％、至少30％-90％、至少40％-90％、至少50％-90％、至少60％-90％、至少70％-90％、至少80％-90％、至少5％-80％、至少5％-70％、至少5％-60％、至少5％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变体积减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5％-50％、至少10％-50％、至少20％-50％、至少30％-50％、至少40％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变生长和矿化的速率降低了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5％-50％、至少10％-50％、至少20％-50％、至少30％-50％、至少40％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于对照，所述人类受试者表现出新异位骨化病变强度降低了至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少5％-50％、至少10％-50％、至少20％-50％、至少30％-50％、至少40％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于对照，所述人类受试者表现出所述异位骨化病变的总体病变活性(TLA)降低了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少5％-80％、至少10％-80％、至少20％-80％、至少30％-80％、至少40％-80％、至少50％-80％、至少60％-80％、至少70％-80％、至少5％-70％、至少5％-60％、至少5％-50％、至少5％-40％、至少5％-30％、至少5％-20％或至少5％-10％。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于对照，所述人类受试者表现出每日平均疼痛NRS降低了约0.2倍、0.5倍、1倍、1.5倍、2倍、3倍、0.2倍到3倍、0.5倍到3倍、1倍到3倍、1.5倍到3倍、2倍到3倍、2.5倍到3倍、0.2倍到2.5倍、0.2倍到2倍、0.2倍到1.5倍、0.2倍到1倍或0.2倍到0.5倍。

10.根据权利要求4到9中任一项所述的方法，其中所述对照为从尚未施用所述激活素A拮抗剂的患有FOP的人类受试者的群体采集的平均测量结果或值。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于对照，所述治疗有效量的激活素A拮抗剂减少了所述人类受试者的疼痛急性发作的发生。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过正电子发射断层(PET)扫描、计算机断层(CT)扫描或其组合分析所述新异位骨化病变。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述PET扫描分析通过向所述人类受试者施用放射性标记的¹⁸F氟化钠(¹⁸F-NaF)进行。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中向所述人类受试者施用所述治疗有效量的激活素A拮抗剂，持续至少8周。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括选择将受益于新异位骨化病变的形成不断减少的患有FOP的受试者。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述将受益于新异位骨化病变的形成不断减少的受试者将要经历外科手术。

17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述人类受试者将要经历针对FOP的治疗性治疗。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述激活素A拮抗剂未减少所述人类受试者体内任何预先存在的病变的数量、体积或大小。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述激活素A拮抗剂为蛋白质或小分子。

20.根据权利要求1到18中任一项所述的方法，其中所述激活素A拮抗剂为抗激活素A抗体或其抗原结合片段。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段为嵌合抗体、饰面抗体、人源化抗体或人抗体或其抗原结合片段。

22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段为人κIgG1抗体。

23.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括以下六种CDR序列：

(a)与序列GGSFSSHF具有至少约80％同一性的HCDR1；

(b)与序列ILYTGGT具有至少约80％同一性的HCDR2；

(c)与序列ARARSGITFTGIIVPGSFDI具有至少约80％同一性的HCDR3；

(d)与序列QSVSSSY具有至少约80％同一性的LCDR1；

(e)与序列GAS具有至少约80％同一性的LCDR2；以及

(f)与序列QQYGSSPWT具有至少约80％同一性的LCDR3。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括以下六种CDR序列：

(a)具有序列GGSFSSHF的HCDR1；

(b)具有序列ILYTGGT的HCDR2；

(c)具有序列ARARSGITFTGIIVPGSFDI的HCDR3；

(d)具有序列QSVSSSY的LCDR1；

(e)具有序列GAS的LCDR2；以及

(f)具有序列QQYGSSPWT的LCDR3。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的轻链可变区。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:5具有至少95％同一性的轻链可变区。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:1的重链可变区和包含SEQ ID NO:5的轻链可变区。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:25的重链和包含SEQ ID NO:26的轻链。

29.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的重链可变区和与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的轻链可变区。

30.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述抗激活素A抗体或其抗原结合片段与包括以下六种CDR序列的抗体竞争结合：

(a)具有序列GGSFSSHF的HCDR1；

(b)具有序列ILYTGGT的HCDR2；

(c)具有序列ARARSGITFTGIIVPGSFDI的HCDR3；

(d)具有序列QSVSSSY的LCDR1；

(e)具有序列GAS的LCDR2；以及

(f)具有序列QQYGSSPWT的LCDR3。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述激活素A拮抗剂与第二疗法组合施用。

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