BR112017004812B1 - Uso de um anticorpo contra ativina a para preparação de um medicamento para tratamento de fibrodisplasia ossificante progressiva - Google Patents

Abstract

TRATAMENTO DE FIBRODISPLASIA OSSIFICANTE PROGRESSIVA. A presente invenção refere-se a métodos para o tratamento de fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP). Estes métodos envolvem administrar a um indivíduo que tem FOP um regime eficaz de um antagonista do receptor de ativina tipo 2A (ACVR2A) e/ou do receptor de ativina tipo 2B (ACVR2B) ou um antagonista do receptor de ativina tipo 1 (ACVR1). Os antagonistas incluem proteínas de fusão de um ou mais domínios extracelulares (ECDs) de ACVR2A, ACVR2B e/ou ACVR1 e do domínio Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina e anticorpos contra ACVR2A, ACVR2B, ACVR1 ou ativina A.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de acordo com 35 USC 119(e) dos pedidos provisórios US n°s 62/049.869, depositado em 12 de setembro de 2014, e 62/141.775 depositado em 1° de abril de 2015, cujas revelações estão aqui incorporadas, a título de referência, em suas totalidades.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] A fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP) é um distúrbio autossômico dominante caracterizado por um início precoce, ossificação episódica e progressiva do músculo esquelético e do tecido conjuntivo associado. A FOP é causada por mutações no domínio intracelular de ACVR1 (ALK2), com a grande maioria alterando a arginina 206 para histidina (R206H) (Pignolo, R.J. et al. 2011, Orphanet J. Rare Dis.6:80). O ACVR1 é um receptor tipo I para proteínas morfogênicas ósseas (BMPs). Acredita-se que a mutação R206H, dentre outras, aumenta a sensibilidade do receptor à ativação e o torna mais resistente ao silenciamento. Não se conhece nenhuma terapia médica eficaz para a FOP.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO REIVINDICADA

[003] A invenção fornece métodos para tratar fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP) caracterizados pelo fato de compreenderem administrar a um indivíduo que tem FOP um regime eficaz de um antagonista do receptor de ativina tipo 2A (ACVR2A) e/ou do receptor de ativina tipo 2B (ACVR2B). Em alguns métodos, o antagonista compreende um domínio extracelular de ACVR2A ou de ACVR2B. Em alguns métodos, o antagonista compreende uma proteína de fusão de Fc de ACVR2A ou de ACVR2B. Em alguns métodos, o isotipo da proteína de fusão de Fc é a IgG1 humana. Em alguns métodos, o antagonista compreende um domínio extracelular do ACVR2A ligado a um domínio extracelular do ACVR2B. Em alguns métodos, o antagonista compreende adicionalmente um domínio Fc. Em alguns métodos, o antagonista compreende um domínio extra- celular do ACVR2A fundido a um primeiro domínio Fc e um domínio extracelular do ACVR2B fundido a um segundo domínio Fc, sendo que o primeiro e o segundo domínios Fc são complexados um com o outro. Em alguns métodos, o antagonista compreende um ligante entre os domínios extracelulares do ACVR2A e do ACVR2B, cada um fundido a um domínio Fc. Em alguns métodos, o antagonista é uma proteína de fusão que compreende um domínio extracelular do ACVR2A, um domínio extracelular do ACVR2B e um domínio Fc. Em alguns métodos, um regime eficaz de um antagonista do ACVR2A e de um antagonista do ACVR2B é administrado. Em alguns métodos, o antagonista do ACVR2A é uma proteína de fusão Fc do ACVR2A e o antagonista do ACVR2B é uma proteína de fusão Fc do ACVR2B. Em alguns métodos, o antagonista é um anticorpo contra ACVR2A ou ACVR2B. Em alguns métodos, o indivíduo não tem e não está em risco de ter diabetes tipo II, distrofia muscular, esclerose lateral amiotrófica (ELA) ou osteo- porose.

[004] A invenção fornece ainda métodos para o tratamento de FOP, que compreendem administrar a um indivíduo que tem FOP um regime eficaz de um antagonista do receptor de ativina tipo 1 (ACVR1). Em alguns métodos, o antagonista compreende um domínio extracelular de ACVR1. Em alguns métodos, o antagonista compreende uma proteína de fusão de ACVR1. Em alguns métodos, o isotipo da proteína de fusão de Fc é a IgG1 humana. Em alguns métodos, o antagonista é um anticorpo contra ACVR1.

[005] A invenção fornece ainda métodos para tratar fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP) caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo que tem FOP um regime eficaz de um antagonista do receptor de ativina tipo 2A (ACVR2A) e/ou do receptor de ativina tipo 2B (ACVR2B) em combinação com um antagonista do receptor de ativina tipo 1 (ACVR1). Em alguns métodos, o antagonista compreende um domínio extracelular de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B. Em alguns métodos, o antagonista compreende uma proteína de fusão de Fc de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B. Em alguns métodos, o isotipo da proteína de fusão de Fc é a IgG1 humana. Em alguns métodos, o antagonista é um anticorpo contra ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B.

[006] A invenção fornece adicionalmente um método para tratar fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP), que compreende administrar a um indivíduo que tem FOP um regime eficaz de um anticorpo contra ativina A. Opcionalmente, o anticorpo compete pela ligação com um anticorpo que compreende as regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo designado H4H10446P, H4H10430P ou A1. O-pcionalmente, o anticorpo compreende as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo designado H4H10446P, H4H10430P ou A1. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo quimérico, com superfície modificada, humanizado ou humano. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo intacto. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo IgG1 kappa humano.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[007] A FIGURA 1 mostra dados de microCT de camundongos mostrando formação óssea ectópica 6 semanas após o início da administração de tamoxifeno com e sem tratamento com ACVR2A- Fc/ACVR2B-Fc. Nove dentre dez camundongos tratados com mFc de controle (números 1 a 9) mostraram formação óssea ectópica 6 semanas após a administração de tamoxifeno. Os locais mais comuns são a pata traseira, a região do pescoço e o esterno. Dois dentre onze camundongos tratados com ACVR2A-Fc/ACVR2B-Fc (números 12 e 14) mostraram formação óssea ectópica 6 semanas após a administração de tamoxifeno. As lesões ósseas ectópicas nestes dois camundongos tinham pequeno tamanho em comparação com as vistas no grupo tratado com mFc e ambas estavam localizadas no esterno.

[008] A FIGURA 2 mostra dados de microCT de camundongos mostrando formação óssea ectópica 4 semanas após o início da administração de tamoxifeno com ou sem tratamento com LDN212854. Os números 1 a 8 correspondem aos camundongos tratados com tamoxifeno + veículo. Grandes nódulos ósseos ectópicos se formaram nos camundongos de números 1, 2, 3, 4, 5 e 7, e pequenos nódulos ósseos ectópicos se formaram nos camundongos de números 6 e 8. Os números 9 a 16 correspondem aos camundongos tratados com tamoxifeno + LDN212854. Pequenos nódulos ósseos ectópicos se formaram nos camundongos de números 9, 12 e 13. Nenhum nódulo ósseo ectópico poderia ser detectado nos camundongos de números 10, 11, 14, 15 ou 16.

[009] A FIGURA 3 mostra dados de microCT para camundongos propensos à formação óssea ectópica tratados com um anticorpo contra ativina A, um anticorpo de controle irrelevante com isotipo compatível e ACVR2A-Fc. O anticorpo contra ativina A inibiu a formação de nódulos ósseos ectópicos de forma mais eficaz.

[0010] A FIGURA 4 mostra dados de microCT para camundongos propensos à formação óssea ectópica tratados com um anticorpo contra ativina A, um anticorpo de controle irrelevante com isotipo compatível e um anticorpo contra Acvr2a/Acvr2b. O anticorpo contra ativina A e o anticorpo contra Acvr2a/Acvr2b inibidram a formação de nódulos ósseos ectópicos.

[0011] A FIGURA 5 mostra dados de microCT para camundongos propensos à formação óssea ectópica tratados várias doses de um anticorpo contra ativina A em comparação com um anticorpo de controle irrelevante com isotipo compatível. Foi mostrado que dosagens entre 1 mg/kg e 25 mg/kg eram eficazes com 10 mg/kg sendo a dose mais eficaz testada.

DEFINIÇÕES

[0012] Os antagonistas são tipicamente fornecidos na forma isolada. Isto significa que um antagonista é tipicamente ao menos 50%, em peso, isento de proteínas interferentes e outros contaminantes que surgem de sua produção ou purificação, mas não exclui a possibilidade de que o antagonista seja combinado com um excesso de veículo(s) farmacêutico(s) aceitável(is) ou outro veículo concebidos para facilitar seu uso. Algumas vezes, os antagonistas são ao menos 60, 70, 80, 90, 95 ou 99%, em peso, isentos de proteínas interferentes e contaminantes da produção e da purificação.

[0013] Para os propósitos de classificação das substituições de aminoácidos como conservativas ou não conservativas, os aminoácidos são agrupados da seguinte forma: Grupo I (cadeias laterais hidrofóbicas): met, ala, val, leu, ile; Grupo II (cadeias laterais hidrofílicas neutras): cys, ser, thr; Grupo III (cadeias laterais ácidas): asp, glu; Grupo IV (cadeias laterais básicas): asn, gln, his, lys, arg; Grupo V (resíduos que influenciam orientação da cadeia): gly, pro; e Grupo VI (cadeias laterais aromáticas): trp, tyr, phe. As substituições conservativas envolvem substituições entre aminoácidos na mesma classe. As substituições não conservativas constituem a troca de um elemento de uma destas classes por um elemento de outra.

[0014] As porcentagens das identidades de sequência são determinadas com sequências de anticorpo alinhadas de forma máxima pela convenção da numeração de Kabat para uma região variável ou numeração EU para uma região constante. Para outras proteínas, a identidade de sequência pode ser determinada pelo alinhamento das sequências com o uso de algoritmos, como BESTFIT, FASTA, e TFASTA no programa Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), com o uso dos parâmetros de lacuna padrão, ou por inspeção, e o melhor alinhamento. Após o alinhamento, se uma região de anticorpo em questão (por exemplo, toda a região variável madura de uma cadeia pesada ou leve) está sendo comparada com a mesma região de um anticorpo de referência, a porcentagem de identidade de sequência entre as regiões do anticorpo em questão e do anticorpo de referência é o número de posições ocupadas pelo mesmo aminoácido tanto na região do anticorpo em questão quanto na região do anticorpo de referência dividido pelo número total de posições alinhadas das duas regiões, com lacunas não contadas, multiplicado por 100 para converter em porcentagem.

[0015] As composições ou métodos "que compreendem" um ou mais elementos mencionados podem incluir outros elementos não especificamente mencionados. Por exemplo, uma composição que compreende um anticorpo pode conter apenas o anticorpo ou ser combinada com outros ingredientes.

[0016] Um anticorpo humanizado é um anticorpo geneticamente modificado no qual as CDRs de um anticorpo "doador"não humano são enxertadas nas sequências do anticorpo "receptor" humano (consulte, por exemplo, Queen, US 5.530.101 e 5.585.089; Winter, US 5.225.539; Carter, US 6.407.213; Adair, US 5.859.205 e 6.881.557; Foote, US 6.881.557). As sequências do anticorpo receptor podem ser, por exemplo, uma sequência de anticorpo humano madura, um compósito destas sequências, uma sequência consenso de sequências de anticorpos humanos ou uma sequência da região da linhagem germinativa. Dessa forma, um anticorpo humanizado é um anticorpo que tem algumas ou todas as CDRs inteiramente ou substancialmente de um anticorpo doador e as sequências estruturais da região variável e regiões constantes, se presentes, inteiramente ou substancialmente de sequências de anticorpos humanos. De modo similar, uma cadeia pesada humanizada tem ao menos uma, duas e geralmente todas as três CDRs inteiramente ou substancialmente de uma cadeia pesada do anticorpo doador, e uma sequência estrutural da região variável de cadeia pesada e a região constante da cadeia pesada, se presentes, substancialmente de sequências estruturais da região variável de cadeia pesada e da região constante humanas. De modo similar, uma cadeia leve humanizada tem ao menos uma, duas e geralmente todas as três CDRs inteiramente ou substancialmente de uma cadeia leve de um anticorpo doador, e uma sequência estrutural da região variável de cadeia leve e uma região constante da cadeia leve, se presentes, substancialmente das sequências humanas estruturais da região variável de cadeia leve e da região constante. Além de nanocorpos e dAbs, um anticorpo humanizado compreende uma cadeia pesada humanizada e uma cadeia leve humanizada. Uma CDR em um anticorpo humanizado é substancialmente de uma CDR correspondente em um anticorpo não humano quando ao menos 85%, 90%, 95% ou 100% dos resíduos correspondentes (conforme definido por Kabat) são idênticos entre as respectivas CDRs. As sequências estruturais da região variável de uma cadeia de anticorpo ou a região constante de uma cadeia de anticorpo são substancialmente de uma sequência estrutural da região variável humana ou de uma região constante humana, respectivamente, quando ao menos 85, 90, 95 ou 100% dos resíduos correspondentes definidos por Kabat são idênticos.

[0017] Embora os anticorpos humanizados frequentemente incorporem todas as seis CDRs (de preferência, conforme definido por Kabat) de um anticorpo de camundongo, eles também podem ser produzidos com menos do que todas as CDRs (por exemplo, ao menos 3, 4, ou 5 CDRs de um anticorpo de camundongo) (por exemplo, Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002; Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002; Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999; Tamura et al., Journal of Immunology, 164:14321441, 2000).

[0018] Um anticorpo quimérico é um anticorpo no qual as regiões variáveis maduras das cadeias pesada e leve de um anticorpo não humano (por exemplo, camundongo) são combinadas com regiões constantes da cadeia leve e pesada humanas. Estes anticorpos retêm substancialmente ou inteiramente a especificidade de ligação do anticorpo de camundongo, e são cerca de dois terços da sequência humana.

[0019] Um anticorpo com superfície modificada (veneered) é um tipo de anticorpo humanizado que retém algumas e geralmente todas as CDRs e alguns dos resíduos estruturais da região variável não humana de um anticorpo não humano, mas troca outros resíduos estruturais da região variável que podem contribuir para os epítopos da célula B ou T, por exemplo, resíduos expostos (Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991) com resíduos de posições correspondentes de uma sequência de anticorpo humano. O resultado é um anticorpo no qual as CDRs são inteiramente ou substancialmente de um anticorpo não humano e as estruturas da região variável do anticorpo não humano são tornadas mais semelhantes às humanas pelas substituições.

[0020] Um anticorpo humano pode ser isolado de um ser humano, ou resultar de outro modo da expressão de genes de imunoglobulina humana (por exemplo, em um camundongo transgênico, in vitro ou por apresentação em fago). Os métodos para produzir anticorpos humanos incluem o método de trioma de Oestberg et al., Cys muoma 2:361-367 (1983); Oestberg, patente US n° 4.634.664; e Engleman et al., patente US 4.634.666. Os anticorpos monoclonais também podem ser produzidos por camundongos transgênicos carregando genes do sistema imunológico humano, como o camundongo VelocImmune® da Regeneron Pharmaceuticals, Inc. (Murphy, PNAS 111 n° 14, 5153-5158 (2014), Xenomouse, Jakobovits, Nature Biotechnology 25, 1134-1143 (2007) ou camundongo HuMAb da Medarex, Inc. (Lonberg, Handbook Exp. Pharmacol. 181, 69-97 (2008); Lonberg et al., WO93/12227 (1993); US 5.877.397, US 5.874.299, US 5.814.318, US 5.789.650, US 5.770.429, US 5.661.016, US 5.633.425, US 5.625.126, US 5.569.825, US 5.545.806, Nature 148, 1547-1553 (1994), Nature Biotechnology 14, 826 (1996), Kucherlapati, WO 91/10741 (1991). Os anticorpos humanos também podem ser produzidos por métodos de apresentação em fago (consulte, por exemplo, Dower et al., WO 91/17271 e McCafferty et al., WO 92/01047, US 5.877.218, US 5.871.907, US 5.858.657, US 5.837.242, US 5.733.743 e US 5.565.332).

[0021] Quando é dito que um antagonista retém uma propriedade de um anticorpo parental a partir do qual ele foi derivado, a retenção pode ser completa ou parcial. A retenção completa de uma atividade significa que a atividade do antagonista é a mesma dentro do erro experimental ou maior que aquela da molécula a partir da qual ele foi derivado. A retenção parcial da atividade significa atividade significativamente acima do nível basal de um controle negativo (isto é, além do erro experimental) e, de preferência, ao menos 50% da atividade correspondente da molécula a partir da qual ele foi derivado.

[0022] Dois anticorpos possuem o mesmo epítopo se todas as mutações de aminoácido no antígeno, que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo, reduzem ou eliminam a ligação do outro. Dois anticorpos possuem epítopos sobrepostos se algumas mutações de aminoácido que reduzem ou eliminam a ligação de um anticorpo, reduzem ou eliminam a ligação do outro.

[0023] A competição entre os anticorpos é determinada por um ensaio no qual um anticorpo em teste inibe a ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum (consulte, por exemplo, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990). Um anticorpo de teste compete com um anticorpo de referência se um excesso de um anticorpo de teste (por exemplo, ao menos 2x, 5x, 10x, 20x ou 100x) inibe a ligação do anticorpo de referência em ao menos 50%, mas de preferência, 75%, 90% ou 99%, conforme medido em um teste de ligação competitiva. Os anticorpos identificados pelo ensaio de competição (anticorpos competidores) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente próximo ao epítopo ligado pelo anticorpo de referência para que ocorra impedimento estérico.

DESCRIÇÃO DETALHADA I.Visão geral

[0024] A presente invenção se refere a métodos para o tratamento de fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP). Estes métodos envolvem administrar a um indivíduo que tem FOP um regime eficaz de um antagonista do receptor de ativina tipo 2A (ACVR2A) e/ou do receptor de ativina tipo 2B (ACVR2B) e/ou um antagonista do receptor de ativina tipo 1 (ACVR1) e/ou um antagonista de ativina A. Estes antagonistas incluem proteínas de fusão que compreendem um ou mais domínios extracelulares (ECDs) de ACVR2A, ACVR2B e/ou ACVR1 e do domínio Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Os anticorpos antagonistas de ACVR2A, ACVR2B, ACVR1 ou ativina A também são apresentados.

II. ACVR1, ACVR2A, ACVR2B e ativina A

[0025] A superfamília do fator de crescimento de transformação ß (TGFß) de ligantes inclui, por exemplo, proteínas morfogênicas ósseas (BMPs) e os fatores de crescimento e diferenciação (GDFs). Os receptores para estes ligantes são complexos receptores heteroméricos compostos por receptores transmembranares de serina/treonina quinase tipo I e tipo II Os exemplos dos receptores tipo I incluem receptor de ativina tipo IA (ACTRIA, ACVR1 ou ALK2), receptor de BMP tipo IA e receptor de BMP tipo IB. Os exemplos dos receptores tipo II incluem receptores de ativina tipo IIA e IIB (ACTRIIA ou ACVR2A e ACTRIIB ou ACVR2B) e o receptor de BMP tipo II. Os ligantes da superfamília de TGFß têm, cada um, diferentes afinidades pelos diferentes receptores de tipo I e tipo II.

[0026] Tanto os receptores do tipo I quanto do tipo II têm um domínio de ligação ao ligante extracelular (ECD) e um domínio serina/treonina quinase intracelular. Além disso, os receptores tipo I têm uma região rica em glicina/serina (GS-box) antes do domínio quinase e um laço L45 dentro do domínio quinase. Ambos os receptores funcionam juntos para os ligantes ativarem as vias de sinalização a jusante, como as vias de sinalização Smad e não Smad. A ativação envolve a ligação ao ligante, oligomerização ligante-receptor e transfosforilação da caixa GS do receptor tipo I pela quinase do receptor tipo II. A quinase do receptor tipo II é constitutivamente ativa e tem um papel na ligação ao ligante e ativação do receptor tipo I.

[0027] O ACVR1, também conhecido como receptor de ativina A tipo I, ACVR1A, ACVRLK2, ou ALK2, é um receptor tipo I para a superfamília de ligantes TGFß. O ACVR1 tem atividade de serina/treonina quinase e fosforila as proteínas Smad e ativa as vias de sinalização a jusante. O ACVR1 é encontrado em muitos tecidos do corpo, incluindo o músculo esquelético e cartilagem e ajuda a controlar o crescimento e o desenvolvimento dos ossos e músculos. Conforme descrito em outro local no presente documento, certas mutações no gene ACVR1 causam FOP. Exemplos da atividade de ACVR1 incluem a capacidade de se ligar aos ligantes, a capacidade de formar um complexo com um receptor tipo II, ou a capacidade de ativar as vias de sinalização a jusante, como a via Smad.

[0028] O ACVR2, também conhecido como receptor de ativina tipo 11, é um receptor tipo II para a superfamília de ligantes TGFß. Há ao menos dois receptores ACVR2, por exemplo, o receptor de ativina tipo IIA (ACVR2A ou ACTRIIA) e o receptor de ativina tipo IIB (ACVR2B ou ACTRIIB). Referência ao ACVR2 inclui ACVR2A e/ou ACVR2B. O ACVR2A e o ACVR2B podem ser expressos em múltiplos tecidos, inclusive no músculo esquelético, estômago, coração, endométrio, testículos, próstata, ovário e tecidos neurais.

[0029] Na ligação ao ligante, um receptor ACVR2 forma um complexo com um receptor tipo I, como ACVR1, e fosforila a caixa GS ("GS box") do receptor tipo I, acentuando, assim, a atividade de quinase do receptor tipo I. Exemplos de atividade de ACVR2A e ACVR2B incluem a capacidade de se ligar aos ligantes, a capacidade de formar um complexo com um receptor tipo I ou a capacidade de fosforilar um receptor tipo I.

[0030] Uma forma exemplificadora de ACVR2A humano tem o número de acesso Swiss Prot P27037. Os resíduos 1 a 19 são um peptídeo de sinalização, os resíduos 20 a 135 são um domínio extracelular, os resíduos 59 a 116 são um domínio dos receptores tipos I e II de ativina, os resíduos 136 a 161 são um domínio transmembranar e os resíduos 162 a 513 são um domínio citoplasmático. Uma forma exemplificadora de ACVR2B humano tem o número Swiss Prot Q13705. Os resíduos 1 a 18 são uma sequência de sinalização, os resíduos 19 a 135 são um domínio extracelular, os resíduos 27 a 117 são um domínio dos receptores tipos I e II de ativina, os resíduos 138 a 158 são um domínio transmembranar e os resíduos 159 a 512 são um domínio citoplasmático. Uma forma exemplificadora de ACVR1 humano tem o número de acesso Swiss Prot Q04771. Os resíduos 1 a 20 são uma sequência de sinalização, os resíduos 21 a 123 são um domínio extracelular, os resíduos 33 a 104 são um domínio dos receptores tipos I e II de ativina, os resíduos 124 a 146 são um domínio transmembranar e os resíduos 147 a 509 são um domínio citoplasmático. Referência a qualquer um dentre ACVR1, ACVR2A e ACVR2B inclui estas formas exemplificadoras, isoformas conhecidas e seus polimorfismos, como aqueles mencionados na base de dados Swiss Prot, formas cognatas de outras espécies e outras variantes com ao menos 90, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade de sequência com uma forma exemplificada.

[0031] Os resíduos das formas de ACVR2A, ACVR2B e ACVR1 além das sequências exemplificadas definidas acima são numerados por alinhamento máximo com as sequências exemplificadas correspondentes, então os resíduos alinhados são alocados com o mesmo número. Substituições das sequências exemplificadas podem ser substituições conservativas ou não conservativas. Referência a ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B inclui também domínios extracelulares intactos (por exemplo, os resíduos 20 a 135, 19 a 137 ou 21 a 123 de ACVR2A, ACVR2B e ACVR1, respectivamente) ou uma porção dos mesmos isenta ou substancialmente isenta da porção transmembranar e citoplasmática. As porções de um domínio extracelular retêm resíduos suficientes do domínio extracelular intacto para se ligar a ao menos um ligante ou contrarreceptor que se liga ao domínio extracelular intacto e, assim, antagonizam o receptor relevante (por exemplo, resíduos 59 a 116, 27 a 117 ou 33 a 104 de ACVR2A, ACVR2B e ACVR1, respectivamente).

[0032] A ativina A em seres humanos pode existir como uma proteína homo ou heterodimérica. A proteína homodimérica contém um par de subunidades beta A homodiméricas. A proteína heterodimérica contém uma subunidade beta e uma subunidade beta B, beta C ou beta E (isto é, beta A beta B, beta A beta C ou beta A beta E. As subunidades são, cada uma, expressas como polipeptídeos precursores que incluem um peptídeo de sinalização, um pró-peptídeo e um polipeptídeo maduro. Uma forma exemplificadora de precursor da subunidade beta A humana é um polipeptídeo com 426 aminoácidos de comprimento designado Swiss Prot P08476 no qual os resíduos 1 a 20 são um peptídeo de sinalização, os resíduos 21 a 310 são um pró-peptídeo e os resíduos 311 a 426 são o polipeptídeo maduro. Uma forma exemplificadora de um polipeptídeo precursor da subunidade beta B é designado Swiss Prot P09529 no qual os resíduos 1 a 28 são um peptídeo de sinalização, os resíduos 29 a 292 são um pró-peptídeo e os resíduos 293 a 407 são um polipeptídeo maduro. Uma forma exemplificadora de uma subunidade beta C é designada Swiss Prot P55103, na qual os resíduos 1 a 18 são um peptídeo de sinalização, os resíduos 19 a 236 são um pró-peptídeo e os resíduos 237 a 352 são um polipeptídeo maduro. Uma forma exemplificadora de um precursor da subunidade beta E é designada Swiss Prot P58166 na qual os resíduos 1 a 19 são um peptídeo de sinalização, os resíduos 20 a 236 são um pró-peptídeo e os resíduos 237 a 350 são um polipeptídeo maduro. Várias variantes destas sequências são conhecidas, conforme descrito na base de dados Swiss Prot. Referência à ativina A inclui qualquer um dentre o homodímero beta A, formas heterodiméricas beta A beta B, beta A beta C e beta A beta E, bem como suas subunidades, bem como seus precursores os quais as subunidades são presas ao pró-peptídeo e/ou peptídeo de sinalização definido pelas sequências Swiss Prot exemplificadoras fornecidas ou outras formas humanas de ocorrência natural destas sequências. A ativina A sinaliza através da ligação ao ACVR2A ou ACVR2B, mas não se sabe se ela é um ligante para ACVR1.

III. Antagonistas de ACVR1, ACVR2A, ACVR2B

[0033] Os antagonistas das proteínas do receptor tipo I ACVR1 e do receptor tipo II ACVR2 (por exemplo, ACVR2A e/ou ACVR2B) são fornecidos para o tratamento de FOP. Estes antagonistas podem antagonizar os receptores diretamente pela ligação ao receptor (tal como para um anticorpo contra ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B) ou indiretamente pela ligação a um ligante ou contrarreceptor e inibição da ligação do ligante ou do contrarreceptor a ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B (como para uma proteína de fusão de ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B) entre outros mecanismos. Os antagonistas de ACVR2A e de ACVR2B também podem se ligar à ativina A.

[0034] Um antagonista de ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B aqui fornecido pode inibir ou reduzir a atividade de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B em ao menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais em relação a uma célula de controle ou modelo animal que não recebeu o antagonista.

[0035] Qualquer antagonista de ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B pode ser usado nos métodos para tratar FOP. O antagonista pode compreender, por exemplo, um polipeptídeo ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B, como um domínio extracelular, um anticorpo antagonista, ou um inibidor de molécula pequena.

A. Domínios extracelulares dos polipeptídeos ACVR1, ACVR2A e ACVR2B

[0036] Os antagonistas incluem as proteínas ACVR1, ACVR2A e ACVR2B e seus fragmentos eficazes para inibir ao menos uma atividade do ACVR1, do ACVR2A e do ACVR2B, respectivamente. Estes antagonistas incluem, tipicamente, o domínio extracelular de ACVR1, de ACVR2A ou de ACVR2B ou uma porção dos mesmos. De preferência, estes domínios extracelulares são inteiramente ou substancialmente isentos das regiões transmembranares e citoplasmáticas (isto é, quaisquer resíduos remanescentes destas regiões não têm efeito significativo sobre a função do domínio extracelular). Em outras palavras, o componente de ACVR2A, ACVR2B ou ACVR1 destes antagonistas consiste em ou consiste essencialmente em todo o domínio extracelular de ACVR2A, ACVR2B ou ACVR1 ou de uma porção dos mesmos, conforme definido acima. Estes antagonistas podem ou não incluir outro(s) componente(s) distinto(s) de ACVR2A, ACVR2B ou ACVR1, conforme descrito adicionalmente a seguir. Estes domínios extracelulares isentos ou substancialmente isentos dos domínios transmembranares e citoplasmáticos são solúveis. Estes domínios extracelulares podem funcionar como um antagonista pela ligação a um ligante solúvel ou contrarreceptor, competindo eficazmente com a ligação do ligante ou contrarreceptor ao receptor de superfície celular de ACVR1, de ACVR2A ou de ACVR2B, modulando (reduzindo), assim, a disponibilidade do ligante ou contrarreceptor in vivo.

[0037] Os domínios extracelulares solúveis podem ser inicialmente expressos com uma sequência de sinais, que é clivada durante o curso da expressão. A sequência de sinais pode ser uma sequência de sinalização nativa de um ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B, como aquelas descritas na patente US n° 7.709.605, aqui incorporada em sua totalidade, a título de referência, ou pode ser uma sequência de sinalização de uma proteína diferente, como a melitina da abelha produtora de mel (HBM) ou o ativador do plasminogênio tecidual (TPA). Alternativamente, os polipeptídeos ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B extracelulares solúveis podem ser sintetizados ou expressos sem uma sequência de sinalização.

[0038] Os ECDs ou domínios de ligação ao ligante de ACVR1, ACVR2A e ACVR2B são altamente conservados entre as espécie, inclusive camundongos e seres humanos. Os ECDs contêm uma região rica em cisteina e uma região de cauda C-terminal. Os ECDs de ACVR1, ACVR2A e ACVR2B se ligam a um grupo diverso de ligantes da família TGFß, incluindo, por exemplo, ativina A, miostatina (GDF-8), GDF-11 e BMPs. Consulte, por exemplo, Souza et al. (2008) Molecular Endocrinology 22(12):2689-2702.

[0039] Exemplos de polipeptídeos ACVR2A e de ACVR2B e de polipeptídeos ACVR2A e ACVR2B solúveis incluem aqueles revelados na patente US n° 7.842.633; patente US n° 7.960.343; e patente US n° 7.709.605, cada uma das quais está aqui incorporada a título de referência na íntegra.

[0040] O ECD de um polipeptídeo ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B pode ser mutado de modo que o polipeptídeo variante tenha propriedades de ligação a ligantes alteradas (por exemplo, especificidade de ligação ou afinidade). Alguns polipeptídeos ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B variantes têm afinidade de ligação alterada (por exemplo, elevada ou reduzida) para um ligante específico. As variantes têm ao menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade de sequência às sequências de ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B de ocorrência natural, e retêm a atividade biológica e, portanto, têm uma atividade de ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B, conforme descrito em outro local no presente documento. As variantes e os fragmentos ativos de ACVR2A e de ACVR2B são descritos, por exemplo, na patente US n° 7.842.633; patente US n° 7.960.343; e patente US n° 7.709.605, cada uma das quais está aqui incorporada a título de referência em sua totalidade.

[0041] Ensaios para medir a atividade de ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B são revelados por exemplo, na patente US n° 7.842.633; patente US n° 7.960.343; e na patente US n° 7.709.605. Por exemplo, uma variante de um polipeptídeo ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B pode ser submetida a triagem para sua capacidade de se ligar a um ligante ou para a capacidade de impedir a ligação de um ligante a uma proteína do receptor ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B.

B. Proteínas de fusão

[0042] Os polipeptídeos ACVR1, ACVR2A e ACVR2B descritos acima podem ser expressos como proteínas de fusão com ao menos uma porção de um polipeptídeo ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B e um ou mais domínios de fusão.

[0043] Os domínios de fusão incluem uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (Fc), albumina sérica humana (HSA), glutationa S transferase (GST), proteína A, proteína G, ou qualquer domínio de fusão que possa ser útil na estabilização, solubilização, isolamento ou multimerização de uma proteína de fusão.

[0044] Um domínio Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina é um domínio preferido para as proteínas de fusão. Fusões com a porção Fc de uma imunoglobulina conferem propriedades farmacocinéticas desejáveis a uma ampla gama de proteínas (por exemplo, aumenta a estabilidade e/ou a meia-vida sérica da proteína). Dessa forma, a invenção fornece proteínas de fusão compreendendo ao menos um ECD de um ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B fundido a um domínio Fc de uma imunoglobulina.

[0045] O domínio Fc para uso nos presentes métodos pode ser de qualquer imunoglobulina. Qualquer uma das várias classes de imunoglobulinas pode ser usada, inclusive IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Dentro da classe IgG há diferentes subclasses ou isotipos, incluindo, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em uma modalidade, a proteína de fusão de Fc compreende o domínio Fc de uma molécula de IgG. Em uma modalidade adicional, o domínio Fc é de uma molécula de IgG1. A molécula de imunoglobulina pode ser de qualquer tipo de animal, incluindo, por exemplo, um mamífero, um roedor, um ser humano, um camundongo, um rato, um hamster ou um coelho. Em uma modalidade, o domínio Fc da imunoglobulina é de um mamífero. Em uma outra modalidade, o domínio Fc é de um ser humano. Em ainda outra modalidade, o domínio Fc é de um roedor, como um camundongo ou rato. Em uma modalidade específica, o domínio Fc da proteína de fusão é de IgG1 humana.

[0046] As proteínas de fusão de Fc aqui fornecidas podem ser produzidas por qualquer método conhecido na técnica. As proteínas de fusão de Fc podem incluir ao menos as regiões CH2 e CH3, e tipicamente, ao menos uma porção de uma região de dobradiça. Embora a região CH1 possa estar presente, ela é tipicamente omitida nas proteínas de fusão.

[0047] A fusão pode ser feita em qualquer sítio dentro da porção Fc de um domínio constante da imunoglobulina. As fusões podem ser feitas à porção C-terminal da porção Fc de um domínio constante, ou imediatamente em posição N-terminal à região CH1 da cadeia pesada. Os sítios específicos podem ser selecionados para otimizar a atividade biológica, as características de secreção ou de ligação da proteína de fusão de Fc.

[0048] Em alguns casos, um ácido nucleico que codifica o ECD de ACVR1, de ACVR2A e/ou de ACVR2B é fundido na porção C-terminal a um ácido nucleico que codifica a terminação N de uma sequência do domínio constante da imunoglobulina. Em outros casos, fusões N- terminais também são possíveis. Também é possível fundir um ECD de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B à terminação N e à terminação C de uma sequência do domínio constante da imunoglobulina.

[0049] Para a produção de fusões de imunoglobulina, consulte também a patente US n° 5.428.130, patente US N° 5.843.725, patente US n° 6.018.026 e WO2005/070966, cada uma das quais está aqui incorporada a título de referência na íntegra.

[0050] Uma proteína de fusão pode ser produzida, por exemplo, pela expressão recombinante de um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão. Por exemplo, a proteína de fusão pode ser produzida pela fusão de um ácido nucleico que codifica um ECD de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B a um ácido nucleico que codifica um domínio Fc. O ácido nucleico de ECD de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B pode ser fundido à terminação N de um ácido nucleico que codifica um domínio Fc ou pode ser fundido à terminação C de um gene que codifica um domínio Fc. Alternativamente, o ECD pode ser fundido em qualquer posição no domínio Fc.

[0051] As proteínas de fusão de ECD também podem incluir um ligante. No caso de uma proteína de fusão de Fc, o ligante pode estar posicionado entre o ECD de ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B e o domínio Fc, opcionalmente, substituindo parte ou toda a região de dobradiça. O ligante pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos que são relativamente isentos de estrutura secundária. Um ligante pode ser rico em resíduos de glicina e prolina e pode, por exemplo, conter sequências repetidas de treonina/serina e glicinas (por exemplo, repetições TG4 ou SG4).

[0052] Duas ou mais proteínas de fusão de ECD-Fc podem ser unidas por um ligante. Em tais casos, o ligante pode ser posicionado entre os ECDs ou o ligante pode ser posicionado entre os domínios Fc para unir as proteínas de fusão. Por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais proteínas de fusão de Fc de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B podem ser unidas por ligação.

[0053] Exemplos das proteínas de fusão de ECD de ACVR2A e/ou ACVR2B foram descritos, como aquelas reveladas na patente US n° 7.842.633; patente US n° 7.960.343; e patente US n° 7.709.605, cada uma das quais está aqui incorporada a título de referência na íntegra.

[0054] Um exemplo de um antagonista de ACVR2A é conhecido como Sotatercept (também chamado de ACE-011). O Sotatercept contém o ECD de ACVR2A fundido a um domínio Fc da IgG1 humana e é descrito em detalhes em Carrancio et al., (2014) British J Haematology. 165(6):870-872, aqui incorporado em sua totalidade, a título de referência.

[0055] Um exemplo de um antagonista de ACVR2B é conhecido como ACE-031. O ACE-031 contém o ECD de ACVR2B fundido a um domínio Fc de IgG1 humana e é descrito em detalhes em Sako et al., (2010) J. Biol. Chem. 285(27):21037-21048, aqui incorporado em sua totalidade, a título de referência.

[0056] Exemplos de proteínas de fusão de ECD de ACVR1 são conhecidas, como aquelas reveladas em Berasi, et al., (2011) Growth Factors, 29(4):128-139; aqui incorporado em sua totalidade, a título de referência.

C. Proteínas de fusão de ECD híbridas

[0057] Antagonistas da proteína de fusão de ECD híbrida ou multiespecífica também são apresentados. As proteínas de fusão de ECD híbridas podem compreender uma combinação de dois ou mais ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B ECDs. Por exemplo, as proteínas de fusão podem compreender 1, 2, 3, 4 ou mais moléculas de ECD de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B. Em uma modalidade, o antagonista compreende um ECD de ACVR2A ligado a um ECD de ACVR2B. Em uma modalidade adicional, o antagonista compreende adicionalmente um domínio Fc.

[0058] Em uma modalidade, uma proteína de fusão pode com preender uma ou mais moléculas de um ECD de ACVR2A e uma ou mais moléculas de um ECDd de ACVR2B. Em uma outra modalidade, uma proteína de fusão pode compreender uma ou mais moléculas de um ECD de ACVR1 e uma ou mais moléculas de um ECD de ACVR2A. Em uma outra modalidade, uma proteína de fusão pode compreender uma ou mais moléculas de um ECD de ACVR1 e uma ou mais moléculas de um ECD de ACVR2B.

[0059] Em uma modalidade, uma proteína de fusão compreende uma ou mais proteínas de fusão de ECD-Fc de ACVR2A e uma ou mais proteínas de fusão de ECD-Fc de ACVR2B que são complexadas juntas. Em outra modalidade, uma proteína de fusão compreende uma ou mais proteínas de fusão de ECD-Fc de ACVR1 e uma ou mais proteínas de fusão de ECD-Fc de ACVR2A que são complexadas juntas. Em outra modalidade, uma proteína de fusão compreende uma ou mais proteínas de fusão de ECD-Fc de ACVR1 e uma ou mais proteínas de fusão de ECD-Fc de ACVR2B que são complexadas juntas. Em tais casos, as proteínas de fusão podem ser unidas juntas através de seus domínios Fc, por exemplo, por ao menos uma ligação dissulfeto ou por uma sequência ligante. Alternativamente, as porções de ECD da proteína de fusão podem ser unidas juntas por uma sequência ligante.

[0060] Em uma modalidade, o antagonista compreende um ECD de ACVR2A fundido a um primeiro domínio Fc e um ECD de ACVR2B fundido a um segundo domínio Fc. Em tais casos, os domínios Fc pode ser complexados um com o outro. Em uma outra modalidade, o antagonista compreende um ligante entre os ECDs de ACVR2A e de ACVR2B, cada um sendo fundido a um domínio Fc.

[0061] As proteínas de fusão podem ser construídas para gerar antagonistas de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B em um formato em tandem. Em uma modalidade, uma proteína compreende dois ou mais ECDs de ACVR1, de ACVR2A e/ou de ACVR2B em tandem seguido de um domínio Fc. Em alguns casos, os ECDs dispostos em tandem são separados por uma sequência ligante. Tal proteína de fusão de tandem pode compreender 1, 2, 3, 4 ou mais ECDs de ACVR1, de ACVR2A e/ou de ACVR2B.

D. Antagonistas do anticorpo

[0062] Um antagonista de ACVR1, de ACVR2A ou de ACVR2B inclui anticorpos contra (em outras palavras, que se ligam especificamente a) qualquer um destes receptores, de preferência, anticorpos com um epítopo dentro do domínio extracelular. A ligação específica de um anticorpo ou proteína de fusão ao seu antígeno alvo significa uma afinidade de ao menos 106, 107, 108, 109 ou 1010 M-1. A ligação específica é detectavelmente maior em magnitude e é distinguível da ligação não específica que ocorre a ao menos um alvo não relacionado. Os métodos para preparar os anticorpos são conhecidos na técnica. Consulte, por exemplo, Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497; e Harlow & Lane (1988) Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY.

[0063] Qualquer anticorpo que iniba ou reduza a atividade de ACVR1, de ACVR2A e/ou de ACVR2B (por exemplo, um anticorpo antagonista) pode ser usado. Tais anticorpos contra ACVR2A e ACVR2B incluem, por exemplo, os anticorpos revelados na patente US n° 8.486.403, patente US n° 8.128.933, WO2009/137075 e em Lach- Trifilieff, et al. (2014) Mol. Cell Biol. 34(4):606-618, cada um dos quais está aqui incorporado em sua totalidade, a título de referência. As formas humanizadas, quiméricas e com modificação de superfície de qualquer um destes anticorpos estão incluídas assim como os anticorpos que competem pela ligação a elas.

[0064] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo anti- ACVR2A. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo anti- ACVR2B. Em outras modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico contra ACVR2A e contra ACVR2B. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo anti-ACVR1. Em outras modalidades, o anticorpo pode ser um anticorpo biespecífico contra ACVR1 e ACVR2A ou contra ACVR1 e ACVR2B.

[0065] O termo "anticorpo" abrange anticorpos intactos com dois pares de cadeias pesadas e leves, fragmentos de anticorpo que podem se ligar ao antígeno (por exemplo, F(ab’)2, Fv, anticorpos de cadeia única, diacorpos, quimeras de anticorpos, anticorpos híbridos, anticorpos biespecíficos, anticorpos humanizados, e similares), e peptídeos recombinantes compreendendo os anteriores.

[0066] Os "fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência, a região de ligação ao antígeno ou variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem Fab, F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 10:1057-1062); moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

[0067] O anticorpo pode ser monoclonal ou policlonal. Um "anticorpo monoclonal"é um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compõem a população são idênticos com exceção de possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em menores quantidades. Os anticorpos monoclonais são frequentemente altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem tipicamente anticorpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticorpo monoclonal é tipicamente dirigido contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, como aqueles produzidos por uma população clonal de células B, e não exige a produção do anticorpo por nenhum método específico.

[0068] Os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com os métodos aqui fornecidos podem ser produzidos pelo método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ou uma modificação dos mesmos. Tipicamente, um animal, como um camundongo, é imunizado com uma solução contendo um antígeno (por exemplo, um polipeptídeo ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B, ou ativina A, particularmente, o domínio extracelular (nos m receptores) ou uma porção do mesmo).

[0069] A imunização pode ser feita pela mistura ou emulsificação da solução contendo antígeno em solução salina, de preferência, em um adjuvante como adjuvante completo de Freund, e injeção da mistura ou emulsão parenteralmente. Após a imunização do animal, o baço (e opcionalmente, vários nódulos linfáticos grandes) são removidos e dissociados em células isoladas. As células esplênicas podem ser submetidas à triagem mediante a aplicação de uma suspensão de células a uma placa ou poço revestido com o antígeno de interesse. As células B que expressam imunoglobulina ligada à membrana específica para o antígeno se ligam à placa e não são removidas por enxágue. As células B resultantes, ou todas as células esplênicas dissociadas, são, então, induzidas a se fundirem com células de mieloma para formar hibridomas, e são cultivadas em um meio seletivo. As células resultantes são plaqueadas por diluição seriada e são testadas para a produção de anticorpos que se ligam especificamente ao antígeno de interesse (e que não se ligam a antígenos não relacionados). Os hibridomas que secretam anticorpo monoclonal (mAb) selecionados são, então, cultivados in vitro (por exemplo, em frascos para cultura de tecido ou reatores de fibra oca), ou in vivo (como ascite em camundongos).

[0070] Alternativamente, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (consulte, por exemplo, patente US n° 4.816.567). Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos de fagos com o uso das técnicas descritas, por exemplo, em Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; e na patente US n° 5.514.548.

[0071] Os "anticorpos" incluem anticorpos quiméricos, com superfície modificada, humanizados e monoclonais humanos contra qualquer um dentre ACVR1, ACVR2A, ACVR2B e ativina A, conforme definido acima.

[0072] Dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Há cinco classes importantes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados alfa, delta, epsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

[0073] Os presentes anticorpos monoclonais ou proteínas de fusão de Fc podem ser qualquer uma das várias classes de anticorpo. Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal é um anticorpo da classe IgG. Em outras modalidades, o anticorpo monoclonal pode ser da classe IgM, IgE, IgD ou IgA. Em modalidades específicas, o anticorpo é um isotipo de IgG, como IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4, particularmente, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana.

[0074] Um ou vários aminoácidos na terminação amino ou carboxila da cadeia leve e/ou pesada, como uma lisina C-terminal da cadeia pesada, podem estar ausentes ou podem ser derivatizados em uma proporção ou em todas as moléculas. Substituições podem ser feitas nas regiões constantes para reduzir ou aumentar a função efetora, como a citotoxicidade mediada pelo complemento ou ADCC (consulte, por exemplo, Winter et al., patente US n° 5.624.821; Tso et al., patente US n° 5.834.597; e Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006), ou para prolongar a meia-vida em seres humanos (consulte, por exemplo, Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004). As substituições exemplificadoras incluem uma Gln na posição 250 e/ou uma Leu na posição 428 (numeração EU) para aumentar a meia-vida de um anticorpo. Uma substituição em qualquer uma das posições 234, 235, 236 e/ou 237 reduz a afinidade pelos receptores FCY, particularmente, pelo receptor FCYRI (consulte, por exemplo, US 6.624.821). Opcionalmente, as posições 234, 236 e/ou 237 na IgG2 humana são substituídas por alanina e a posição 235 por glutamina. (Consulte, por exemplo, US 5.624.821). As funções efetoras também podem ser reduzidas pela substituição de EFLG nas posições 232 a 236 por PVA (consulte WO14/121087). Opcionalmente, S na posição 428 pode ser substituído por P, particularmente, na IgG4 humana para reduzir a troca entre imunoglobulinas endógenas e exógenas. Outras variações podem adicionar ou remover sítios de modificação pós-traducional, como glicosilação N-ligada nos motivos N-X-S/T. As variações também podem incluir a introdução de "knobs" (isto é, troca de um ou mais aminoácidos por aminoácidos maiores) ou orifícios (isto é, troca de um ou mais aminoácidos por aminoácidos menores) para promover a formação de heterodímeros entre diferentes cadeias pesadas para a produção de anticorpos biespecíficos. As substituições exemplificadoras para formar um par de "knob" e orifício são T336Y e Y407T, respectivamente (Ridgeway et al., Protein manipulação vol.9 no.7 pp.617-621, 1996). As variações também podem incluir mutações que reduzem a interação com proteína A (por exemplo, H435R e Y436F) no sistema de numeração EU. Anticorpos biespecíficos nos quais uma cadeia pesada tem esta variação, e o outro não, podem ser separados de seus anticorpos parentais por cromatografia de afinidade à proteína A.

[0075] Os anticorpos também podem incluir anticorpos que se ligam especificamente à ativina A. Estes anticorpos podem se ligar especificamente a qualquer um ou a todas as formas beta A beta A, beta A beta B, beta A beta C e beta A beta E da ativina A. Alguns anticorpos se ligam especificamente a apenas uma destas formas (isto é, beta A beta A, beta A beta B, beta A beta C ou beta A beta E). A especificidade para as formas beta A beta B, beta A beta C e beta A beta E pode ser conferida por um epítopo dentro da subunidade beta B, beta C ou beta E, respectivamente, ou para um epítopo ao qual ambos os componentes do heterodímero contribuem. A especificidade para beta A beta pode ser conferida por um epítopo contribuído por ambas as moléculas dentro do homodímero (por exemplo, na interface das subunidades). Alguns anticorpos se ligam especificamente a todas estas formas da ativina A, e neste caso, o epítopo está tipicamente na subunidade beta A. Os anticorpos têm, tipicamente, epítopos dentro do componente do polipeptídeo maduro das proteínas precursoras. Alguns anticorpos se ligam especificamente a qualquer uma ou a todas as formas da ativina A sem se ligarem à inibina humana, que existe sob a forma de heterodímeros alfa (Swiss Prot P05111) beta A ou alfa beta B. Alguns anticorpos se ligam especificamente a qualquer uma ou a todas as formas da ativina A e se ligam a uma ou ambas as formas da inibina humana. Embora se acredite que estes anticorpos inibem a transdução de sinal da ativina A através de um ou mais de seus contrarreceptores, ACVR2A e/ou ACVR2B e/ou BMPR2, um entendimento do mecanismo não é necessário para o uso destes anticorpos nos métodos para tratar FOP.

[0076] Uma quantidade substancial de anticorpos contra a ativina A foi relatada. Por exemplo, US2015/00373339 revela os anticorpos humanos designados H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P2, H4H10447P2, H4H10447P2, H4H10448P2 e H4H10452P2. O documento US 8.309.082 revela os anticorpos humanos A1-A14. Anticorpos de camundongo contra a ativina A estão disponíveis junto a vários fornecedores comerciais, como MAB3381 junto à R&D Systems ou 9H16 junto à Novus Biologicals ou MM0074-7L18 (ab89307) AbCam.

[0077] Os anticorpos preferidos têm uma afinidade pela ativina A (medida a 25°C tal como no exemplo 3 de US2015/00373339) de ao menos 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1, ou 1013 M-1. Alguns anticorpos têm uma afinidade dentro de uma faixa de 109-1012 M-1. Os anticorpos preferidos inibem a transdução de sinal da ativina A com uma IC50 menor que 4 nM, e de preferência, menor que 400 pM ou 40 pM. Alguns anticorpos inibem a transdução de sinal com uma IC50 na faixa de 4 nM a 10 pM ou 3,5 nM a 35 pM.

[0078] A inibição da transdução de sinal pode ser medida tal como no exemplo 6 de US20150037339, que é resumida a seguir. A linhagem celular humana de rabdomiossarcoma A204 é transfectada com um plasmídeo repórter Smad 2/3-luciferase para produzir a linhagem celular A204/CAGAx12-Luc. As células A204/CAGAx12-Luc foram mantidas em meio McCoy 5A suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina/estreptomicina/glutamina e 250 µg/mL de G418. Para o bioensaio, as células A204/CAGAx12-Luc foram semeadas em placas de ensaio de 96 poços a 10.000 células/poço em meio com baixo teor de soro, 0,5% de SFB e OPTIMEM, e incubadas a 37°C e 5% de CO2 de um dia para o outro. A ativina A é diluída seriadamente a 1:3 desde 100 a 0,002 nM e adicionada às células começando junto com um controle sem ativina. Os anticorpos são diluídos seriadamente a 1:3 começando desde 100 a 0,002 nM, 1000 a 0,02 nM, ou 300 a 0,005 nM incluindo as amostras de controle contendo um anticorpo de controle isotípico adequado ou nenhum anticorpo e adicionados às células com uma concentração constante de 100 pM de ativina A.

[0079] Alguns anticorpos inibem a ligação da ativina A ao ACVR2A e/ou ao ACVR2B e/ou ao BMPR2 em ao menos 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, conforme medido quando o receptor é expresso a partir de uma célula ou o domínio extracelular é fundido com um domínio Fc como uma proteína de fusão, e a proteína de fusão é imobilizada a um suporte (por exemplo, um chip sensor Biacore). Nestas medições, o anticorpo e a ativina A devem estar presentes em quantidades equimolares e o receptor ou o domínio extracelular em excesso.

[0080] Alguns anticorpos se ligam a um epítopo dentro dos resíduos 321 a 343 ou 391 a 421 da ativina A de comprimento completo, que correspondem a C11-S33 e C81-E111 da proteína madura.

[0081] Um anticorpo exemplificador usado nos presentes exemplos é designado H4H10446P no documento US2015037339. Sua região variável de cadeia pesada e CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada têm as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs:162, 164, 166 e 168, respectivamente, do documento US2015/00373339 (presentes SEQ ID NOs:1 a 4, respectivamente). Sua região variável de cadeia leve e CDRs, CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve têm as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs:146, 148, 150 e 152, respectivamente, do documento US2015/0037339 (presentes SEQ ID NOs:5 a 8, respectivamente). O H4H10446P inibe a sinalização mediada pela ativina A através de ACVR2A e/ou de ACVR2B, mas não inibe fortemente, caso iniba, a ligação da ativina A ao ACVR2A ou ao ACVR2B. Outros anticorpos que competem com H4H10446P pela ligação à ativina A humana ou que se ligam ao mesmo epítopo na ativina A humana que H4H10446P estão incluídos e aqueles que compartilham sua inibição da sinalização estão também incluídos.

[0082] Um outro anticorpo exemplificador para uso nos presentes métodos é designado H4H10430P em US2015037339. Sua região variável de cadeia pesada e CDRs CDRH1, CDRH2 e CDRH3 de cadeia pesada têm as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs:66, 68, 70 e 72, respectivamente, no documento US2015/00373339 (presentes SEQ ID NOs:7 a 12, respectivamente). Sua região variável de cadeia leve e CDRs, CDRL1, CDRL2 e CDRL3 da cadeia leve têm as sequências de aminoácidos das SEQ ID NOs:74, 76, 78 e 80, respectivamente, o documento US2015/0037339 (presentes SEQ ID NOs:13 a 16, respectivamente). Este anticorpo inibe a ligação da ativina A ao ACVR2A e/ou ao ACVR2B e inibe a transdução de sinal através de um destes receptores ou ou ambos. Outros anticorpos que competem com H4H10430P pela ligação à ativina A ou que se ligam ao mesmo epítopo na ativina A que o H4H10430P e compartilham sua propriedade de inibição da ligação da ativina A e a transdução de sinal através de ACVR2A e ACVR2B estão também incluídos.

[0083] Outro anticorpo exemplificador para uso nos presentes métodos é o anticorpo designado A1 em US 8.309.082, que é caracterizado por regiões variáveis da cadeia leve e pesada com as sequências SEQ ID NOs:9 e 10 em US8.309.082 (presentes SEQ ID NOs:17 e 18, respectivamente). Suas CDRs de cadeia leve, CDRL1, CDRL2 e CDRL3, com as sequências SEQ ID NO:11, 12, e 13, respectivamente, no US8.309.082 (presentes SEQ ID NOs:19 a 21, respectivamente), e suas CDRs de cadeia pesada, CDRH1, CDRH2 e CDRH3 que têm as sequências SEQ ID NOs: 62, 63 e 64, respectivamente, no documento US 8.309.082 (as presentes SEQ ID NOs:22 a 24, respectivamente). Outros anticorpos que competem com H4H10430P pela ligação à ativina A ou que se ligam ao mesmo epítopo na ativina A que o H4H10430P e compartilham sua propriedade de inibição da ligação da ativina A e a transdução de sinal através de ACVR2A e ACVR2B também estão incluídos.

[0084] Outros anticorpos podem ser obtidos por mutagênese do cDNA que codifica as cadeias pesadas e leves de qualquer um dos anticorpos acima mencionados. Os anticorpos monoclonais que são ao menos 90%, 95% ou 99% idênticos a qualquer um dos anticorpos acima mencionados na sequência de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia pesada e/ou leve maduras e mantêm suas propriedades funcionais, e/ou que diferem do respectivo anticorpo por um pequeno número de substituições de aminoácido funcionalmente inconsequentes (por exemplo, substituições conservativas), deleções, ou inserções estão também incluídos na invenção. Os anticorpos monoclonais com ao menos 1, 2, 3, 4, 5 e, de preferência, todas as seis CDR(s) sendo 90%, 95%, 99% ou 100% idênticas às CDRs correspondentes de qualquer um dos anticorpos exemplificados estão também incluídos. As CDRs são, de preferência, conforme definidas por Kabat, mas podem ser definidas por qualquer definição alternativa convencional, como Chothia, Kabat-Chothia composto, a definição de contato ou definição AbM (consulte a internet no website bioinf.org.uk/abs).

E. Antagonistas de molécula pequena

[0085] Os antagonistas de ACVR1, de ACVR2A e de ACVR2B também podem ser antagonistas de molécula pequena. Estes antagonistas de molécula pequena podem inibir uma atividade de ACVR1, de ACVR2A, de ACVR2B ou da ativina A. Os antagonistas de molécula pequena de ACVR1 incluem, por exemplo, LDN-212854 descrito em Mohedas et al., (2013) ACS Chem. Biol. 8:1291-1302, aqui incorporado em sua totalidade, a título de referência.

IV. Ensaios de triagem

[0086] A atividade dos vários antagonistas de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B e variantes ou fragmentos dos mesmos aqui fornecidos pode ser submetida à triagem em uma variedade ensaios. Por exemplo, os antagonistas de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B e as suas variantes podem ser submetidos à triagem para sua capacidade de ligação aos ligantes ou ligação aos receptores ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B, para sua capacidade de inibir a ligação de um ligante a um polipeptídeo ACVR1 e/ou ACVR2 e/ou para sua capacidade de inibir a atividade dos receptores ACVR1 ou ACVR2.

[0087] A atividade de um antagonista de ACVR1 ou de ACVR2 ou variantes ou fragmentos dos mesmos, pode ser testada in vitro ou em ensaios à base de células. Os ensaios de ligação in vitro e os ensaios para medir a inibição da atividade do receptor são bem conhecidos. Vários ensaios para medir a atividade de um antagonista de ACVR1, ACVR2A ou ACVR2B são descritos em detalhes, por exemplo, na patente US n° 7.842.663 aqui incorporada em sua totalidade, a título de referência.

[0088] A capacidade de o antagonista modular a formação de complexo entre o polipeptídeo ACVR1 ou ACVR2 e sua proteína de ligação pode ser detectada por uma variedade de técnicas. Por exemplo, a modulação da formação de complexos pode ser quantificada com o uso, por exemplo, de proteínas marcadas de forma detectável como o polipeptídeo ACVR1 ou ACVR2, ou sua proteína de ligação, radiomarcado (por exemplo, 32P, 35S, 14C ou 3H), marcado fluorescentemente (por exemplo, FITC), ou marcado enzimaticamente, por imunoensaio, ou por detecção cromatográfica.

[0089] A capacidade de o antagonista de ACVR1 ou ACVR2 inibir a sinalização mediada pelo receptor ACVR1 or ACVR2 pode ser monitorada. Os antagonistas de ACVR1 e/ou ACVR2 e variantes ou fragmentos dos mesmos também podem ser submetidos à triagem para atividade em um ensaio in vivo.

[0090] Os antagonistas de ACVR1 e/ou ACVR2 e variantes ou fragmentos dos mesmos também podem ser submetidos à triagem para atividade em um ensaio in vivo. Por exemplo, os antagonistas de ACVR1 ou ACVR2 ou suas variantes podem ser submetidos à triagem para sua capacidade de tratar FOP em um modelo de camundongo de FOP (por exemplo, capacidade de diminuir a formação óssea ectópica). Camundongos transgênicos com supressão gênica (knock-in) foram desenvolvidos carregando um alelo condicional que codifica Acvr1 [R206H]. Estes camundongos Acvr1 [R206H]COIN/+são descritos em US 14/207.320 e no PCT/US2014/026582, que estão aqui incorporados a título de referência em suas totalidades. Este alelo expressa a variante R206H apenas após ativação pela recombinase Cre. Isto permite a ativação dependente de Cre da expressão de Acvr1 [R206H] em tecidos específicos e em um momento específico usando diferentes tipos de linhagens acionadoras de Cre. Desta maneira, os camundongos resultantes também se desviam da letalidade perinatal que foi observada com um alelo knock-in não regulado de Acvr1 [R206H]. A ativação da expressão de Acvr1 [R206H] em camundongos jovens ou em camundongos adultos resulta na formação óssea ectópica. Por exemplo, camundongos Acvr1 [R206H]COIN/+; Gt(ROSA26)SorCreERt2/+ (nos quais CreERt2 é uma recombinase regulável por tamoxifeno (consulte, Feil et al. (1997) Biochem Biophys Res

[0091] Commun. 237(3):752-7) que foi introduzida no lócus Gt(ROSA26)Sor, e, portanto, é expressa constitutivamente e globalmente) desenvolvem FOP após exposição ao tamoxifeno. Resumidamente, na ausência do tamoxifeno, o CreERt2 é inativo. O tamoxifeno ativa a expressão de Cre que então age sobre Acvr1 [R206H]COIN/+ para convertê-lo em Acvr1 [R206H]/+, convertendo, assim, o genótipo dos camundongos para espelhar o genótipo dos pacientes com FOP que são ACVR1 [R206H]. O alelo Acvr1 [R206H] expressa Acvr1 [R206H], e isto é adequado para direcionar o desenvolvimento de FOP nos camundongos Acvr1 [R206H]/+; Gt(ROSA26)SorCreERt2/+ Isto causa desvio da letalidade embrionária experimentada com camundongos knock-in Acvr1 [R206H] convencionais, Acvr1 [R206H] knock-in mice, Acvr1tm1Emsh (http://www.informatics.jax.org/allele/key/828153) Após o tratamento com tamoxifeno, os antagonistas de ACVR1, de ACVR2A e/ou de ACVR2B, ou um controle, podem ser administrados aos camundongos Acvr1 [R206H]COIN/+; Gt(ROSA26)SorCreERt2/+ e os animais são monitorados para formação óssea ectópica. Consulte Chakkalakal SA, et al. (20120 An Acvr1 R206H knock-in mouse has fibrodysplasia ossificans progressiva. J Bone Miner Res. 27(8):1746-56. Este ensaio é descrito em detalhes nos exemplos abaixo.

V. Fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP)

[0092] A FOP é um distúrbio hereditário raro no qual a ossificação heterotópica forma osso histologicamente e biomecanicamente "normal" nos sítios extraesqueléticos, como o tecido conjuntivo. Este distúrbio, embora episódico, é cumulativo, e resulta em incapacidade permanente com severidade crescente.

[0093] A prevalência da FOP em todo o mundo é de aproximadamente 1/2.000.000. Não há predileção étnica, racial, de gênero, ou geográfica para a FOP. Ela não é apenas uma doença extremamente incapacitante, como também é uma condição que leva a um tempo de vida consideravelmente encurtado.

[0094] As características da FOP incluem, por exemplo, malformações congênitas do dedão do pé, erupções caracterizadas por inchados dolorosos de tecido mole na cabeça, pescoço, e/ou costas com inflamação e formação progressiva de osso heterotópico através de ossificação endocondral.

[0095] A FOP pode ser suspeita clinicamente com base na presença de malformações do dedão do pé. Os testes de diagnóstico, como raios X ou varredura óssea podem embasar as anormalidades do dedão do pé e confirmar a presença de ossificação heterotópica. O diagnóstico da FOP também pode ser confirmado por testes genéticos, por exemplo, pela detecção da mutação 617 G-to-A (R206H) no gene Acvr1.

[0096] É comum que a FOP seja diagnosticada erroneamente como vários outros distúrbios, incluindo outras condições de ossificação heterotópica. A FOP deve ser diferenciada por um diagnóstico diferencial de distúrbios incluindo, por exemplo, malformações congênitas isoladas, linfoedema, sarcoma de tecido mole, tumores desmoides, fibromatose juvenil agressiva, joanetes juvenis, braquidactilia isolada, heteroplasia óssea progressiva e ossificação heterotópica. A presença de malformações congênitas do dedão do pé e as erupções dolorosas do tecido mole podem ser usadas para diferenciar a FOP de outros distúrbios.

[0097] Pacientes com FOP têm malformações congênitas do dedão do pé, mas de outro modo parecem normais ao nascimento. As erupções associadas com a FOP começam durante a primeira década de vida. As erupções podem ser desencadeadas, por exemplo, por lesão do tecido mole, quedas, fadiga, infecções virais ou injeções intramusculares. O resultado destas erupções é uma transformação de tecido mole, como ligamentos, músculo esquelético ou tendões em osso heterotópico.

[0098] Não havia tratamento terapêutico anterior para FOP. A FOP foi manejada por medidas preventivas, como maior segurança e estratégias para minimizar lesões, evitando injeções intramusculares e tomando cuidado ao receber tratamento dental. Tratamentos com doses elevadas de corticoesteroides iniciadas dentro das primeiras 24 horas de uma erupção podem ajudar a reduzir a inflamação e o edema associados às erupções. As estratégias cirúrgicas para remover o osso heterotópico não são recomendadas já que são contraprodutivas e causam nova ossificação heterotópica induzida por trauma.

[0099] A FOP é causada por mutações em Acvr1 (também conhecido como ALK2) que parecem destabilizar a interação do domínio GS com uma molécula inibitória, FKBP12 (Groppe, J., et al. 2011, Cells Tissues Organs, 194:291-295). O FKBP12 é um modulador negativo do ACVR1 e funciona estabilizando o receptor em uma conformação inativa (Huse, M., et al. 1999, Cell, 96:425-436). Consulte Kaplan, F.S., et al. 2012, Disease Models & Mechanisms, 5:756-762).

[00100] Um exemplo de uma mutação em ACVR1 que está associada à FOP é uma mutação de arginina 206 para histidina (R206H) no domínio intracelular.

[00101] Um indivíduo em risco de desenvolver FOP inclui qualquer indivíduo com a mutação R206H de ACVR1 ou outra mutação associadaà FOP, um indivíduo nascido com malformações do dedão do pé, ou um indivíduo que tem um histórico familiar de FOP, que ainda não desenvolveu sintomas de FOP suficientes para um diagnóstico de FOP ser feito por critérios reconhecidos na técnica.

VI. Métodos de tratamento

[00102] Os métodos de tratamento de FOP, que compreendem administrar a um indivíduo que tem FOP um regime eficaz de um antagonista de ACVR1, de ACVR2A e/ou de ACVR2B, são aqui fornecidos. Em uma modalidade, é administrado um regime eficaz de um antagonista de ACVR2A e um antagonista de ACVR2B. Em uma modalidade adicional, o antagonista de ACVR2A é uma proteína de fusão de Fc e o antagonista de ACVR2B é uma proteína de fusão de Fc. Em uma outra modalidade, a FOP é tratada pela administração de um regime eficaz de um anticorpo contra ativina A.

[00103] O "tratamento" de um indivíduo com FOP significa a administração de um regime eficaz de um antagonista de ACVR1, de ACVR2A e/ou de ACVR2B, ou um anticorpo contra ativina A, a um indivíduo que tem FOP, onde o propósito é curar, sarar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, atenuar, aprimorar, ou afetar a condição de um ou mais sintomas de FOP.

[00104] Um "indivíduo" é qualquer animal (isto é, mamíferos) como seres humanos, primatas, roedores, como camundongos e ratos, animais agrícolas e domesticados como, cães, gatos, bovinos, cavalos, porcos, ovelha, e similares, nos quais se deseja tratar FOP. Em qualquer um dos presentes métodos, o indivíduo pode ser um mamífero e, de preferência, é um ser humano.

[00105] Um regime eficaz de um antagonista de ativina A, ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B, ou de um anticorpo contra ativina A, significa uma combinação de dose, frequência e via de administração de um antagonista que leva a uma resposta positiva em ao menos um sinal ou sintoma de FOP. Uma resposta positiva pode incluir reduzir, eliminar, melhorar, inibir a piora ou retardar ao menos um sinal ou sintoma de FOP. Os sinais ou sintomas de FOP que podem ser o objeto de uma resposta positiva incluem, por exemplo, formação de osso ectópico ou heterotópico, erupções relacionadas à FOP, ou dor e inchaço associados com as erupções. O regime pode ser avaliado em um único paciente pela comparação dos sinais e sintomas antes e depois do tratamento. Um regime é considerado eficaz se ao menos um sinal ou sintoma der uma resposta positiva após o tratamento. Um regime pode ser, alternativa ou adicionalmente, avaliado pela comparação dos sinais e sintomas da população de indivíduos tratados com um antagonista ou com os antagonistas da presente invenção com uma população de controle de indivíduos que não recebem o tratamento. Os indivíduos para esta comparação podem ser um modelo animal, ou pacientes humanos em um teste clínico (por exemplo, fase I, fase II, IIa, IIb ou III). Um regime é considerado eficaz se houver uma resposta positiva estatisticamente significativa entre as populações em ao menos um sinal ou sintoma.

[00106] Em alguns métodos para tratar FOP, o indivíduo não tem e não está em risco de outras condições tratáveis com os antagonistas contra ACVR1, ACVR2A, e/ou ACVR2B, ou um anticorpo contra ativina A. Por exemplo, o indivíduo não ter qualquer um ou de todos dentre diabetes tipo II, distrofia muscular, esclerose lateral amiotrófica (ELA) e osteoporose.

A. Métodos de administração

[00107] Os antagonistas de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B ou um anticorpo contra a ativina A, são geralmente administrados diretamente como proteínas ou pequenas moléculas, mas no caso de proteínas também podem ser administradas como um ácido nucleico que codifica estas proteínas. Estes antagonistas podem ser administrados por vários métodos, como transfecção celular, terapia gênica, administração direta com um veículo de aplicação ou veículo farmaceuticamente aceitável, aplicação indireta pelo fornecimento de células recombinantes que compreendem um ácido nucleico que codifica um antagonista de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B, ou um anticorpo contra ativina A, aqui fornecido.

[00108] Vários sistemas de liberação podem ser usados para administrar os antagonistas de ACVR1, ACVR2A e/ou ACVR2B ou um anticorpo contra ativina A, aqui fornecido, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, endocitose mediada por receptor (consulte, por exemplo, Wu e Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), construção de um ácido nucleico como parte de um vetor retroviral ou outro vetor, etc.

[00109] Os métodos de administração podem ser enterais ou parenterais e incluem as vias intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, pulmonar, intranasal, intraocular, epidural, e oral. Os compostos podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo, por infusão ou injeção de bolus, por absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (por exemplo, mucosa bucal, mucosa retal e intestinal, etc.) e podem ser administradas juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistêmica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir as composições farmacêuticas da invenção no sistema nervoso central por qualquer via adequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, fixado a um reservatório, como um reservatório de Omcana. Administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente de aerossolização. Administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, pelo uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente de aerossolização.

[00110] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas localmente à área que precisa de tratamento; isto pode ser obtido, por exemplo, por infusão local durante a cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, por injeção, através de um cateter, ou através de um implante, o dito implante sendo de um material poroso, não poroso, ou gelatinoso, incluindo membranas, como membranas sialasticas, fibras, ou substitutos de pele comerciais.

[00111] Em uma outra modalidade, o agente ativo pode ser liberado em uma vesícula, em particular, um lipossoma (consulte Langer (1990) Science 249:1527-1533). Em uma outra modalidade, o agente ativo pode ser liberado em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (consulte Langer (1990) supra). Em uma outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados (consulte, Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105). Em uma outra modalidade na qual o agente ativo da invenção é um ácido nucleico que codifica uma proteína, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão de sua proteína codificada, pela construção dele como parte de um vetor de expressão de ácido nucleico adequado e administração do mesmo para que ele se torne intracelular, por exemplo, usando um vetor retroviral (consulte, por exemplo, a patente US n° 4.980.286), ou por injeção direta, ou usando bombardeio de micropartículas, ou revestimento com lipídios ou receptores de superfície celular ou agentes de transfecção, ou pela administração deste em ligação a um peptídeo semelhante a homeobox que é conhecido por entrar no núcleo (vide, por exemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868), etc. Alternativamente, um ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado dentro do DNA da célula hospedeira para expressão, por recombinação homóloga.

B. Terapias de combinação

[00112] Os antagonistas de ACVR1, ACVR2A e ACVR2B ou um anticorpo contra a ativina A, aqui fornecidos podem ser administrados em combinação com outro ou outros tratamentos. Em uma modalidade, o método de tratar FOP envolve a co-administração de um antagonista de ACVR2A e um antagonista de ACVR2B. Em uma outra modalidade, o método para tratar FOP envolve a co-administração de um antagonista de ACVR1, de ACVR2A e de ACVR2B. Em outras modalidades, um antagonista de ACVR1 pode ser co-administrado com um antagonista de ACVR2A e/ou de ACVR2B. Os antagonistas de ACVR1, de ACVR2A e de ACVR2B podem ser administrados como composições farmacêuticas separadas ou podem ser administrados como uma composição farmacêutica isolada que compreende uma combinação destes agentes. Os antagonistas de ACVR1, de ACVR2A e/ou de ACVR2B ou um anticorpo contra a ativina A, sozinhos ou em combinação, podem ser administrados em conjunto com um ou mais compostos terapêuticos adicionais. A terapia de combinação pode abranger a administração simultânea ou alternada. Além disso, a combinação pode abranger administração aguda ou crônica.

C. Composições farmacêuticas

[00113] A presente invenção fornece, adicionalmente, composições farmacêuticas que compreendem um antagonista de ativina A, de ACVR1, de ACVR2A e/ou de ACVR2B, ou um anticorpo contra ativina A, aqui fornecido, e um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência reguladora governamental ou que é mencionado na farmacopeia americana ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente, em seres humanos. O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente ou transportador com o qual o agente terapêutico é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, inclusive aqueles de petróleo, de origem animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e similares. Exci-pientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno glicol, água, etanol e similares. A composição pode também, se desejado, conter quantidades menores de agentes umectantes ou de emulsificação, ou agentes de tamponamento de pH.

[00114] Estas composições podem assumir a forma de soluções, suspensões, emulsões, tabletes, pílulas, cápsulas, pós, formulações com liberação sustentada e similares. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais, como triglicerídeos. Formulação oral pode incluir veículos padrão, como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.

[00115] Em uma modalidade, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Quando necessário, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local como lidocaina para melhorar a dor no local da injeção. Quando a composição deve ser administrada por infusão, ela pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água ou solução salina estéril de grau farmacêutico. Quando a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida para que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[00116] Os antagonistas de ativina A, de ACVR1, de ACVR2A e/ou de ACVR2B, ou um anticorpo contra ativina A, aqui fornecidos podem ser formulados como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aqueles formados com os grupos amino livres como aqueles derivados de ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico e similares, e aqueles formados com os grupos carboxila livres como aqueles derivados de hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, isopropilamina, trietilamina, 2- etilamino etanol, histidina, procaína e similares.

[00117] A quantidade e frequência do antagonista de ativina A, de ACVR1, de ACVR2A e/ou de ACVR2B ou de um anticorpo contra ativina A, administrados por uma via especificada eficaz no tratamento de FOP (por exemplo, regime eficaz) podem ser determinadas por técnicas clínicas padrão com base na presente descrição. Além disso, testes in vitro podem ser empregados para auxiliar na identificação de faixas ideais de dosagem. A dosagem precisa a ser empregada na formulação também depende da via de administração e da severidade da condição, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do profissional e com as circunstâncias de cada paciente. Entretanto, faixas de dosagem adequadas para administração parenteral, de preferência, intravenosa ou subcutânea são, em geral, de cerca de 20 a 50.000 microgramas de composto ativo por quilograma de peso corporal. Para anticorpos contra ativina A, faixas de dosagem adequadas incluem 1 a 25 mg/kg, 2 a 20 mg/kg 5 a 15 mg/kg, 8-12 mg/kg e 10 mg/kg.

[00118] Faixas de dosagem adequadas para administração intranasal são, em geral, de cerca de 0,01 pg/kg de peso corporal a 1 mg/kg de peso corporal. As dosagens eficazes podem ser extrapoladas destas curvas de resposta à dosagem derivadas dos sistemas de teste de modelo de animal ou in vitro.

[00119] As frequências de administração também variam dependendo da severidade da condição e da meia-vida do agente, dentre outros fatores, mas estão tipicamente entre diária e trimestral, incluindo, por exemplo, duas vezes por semana, semanalmente, quinzenal, mensal, bimestral. Os agentes também podem ser administrados em intervalos irregulares responsivos à condição do paciente ou redução no nível sérico do agente abaixo de um limite, dentre outros fatores.

[00120] Todos os depósitos de patente, websites, outras publicações, números de acesso e similares citados acima ou abaixo estão aqui incorporados a título de referência na íntegra para todos os propósitos com a mesma abrangência como se cada item individual fosse especificamente e individualmente indicado como estando incorporado por referência. Se diferentes versões de uma sequência forem associadas a um número de acesso em diferentes momentos, entende-se a versão associada ao número de acesso na data de depósito efetiva deste pedido. A data de depósito efetiva significa a data de depósito anterior ao presente ou a data de depósito de um pedido de prioridade que se refere ao número de acesso, se aplicável. De modo semelhante, se diferentes versões de uma publicação, website ou similares forem publicadas em diferentes momentos, entende-se a versão mais recentemente publicada na data de depósito efetiva do pedido, exceto onde indicado em contrário. Qualquer elemento, etapa, elemento, modalidade ou aspecto da invenção pode ser usado em combinação com qualquer outro, exceto quando especificamente indicado de outro modo.

Exemplos Exemplo 1: Uso de ACVR2A-Fc/ACVR2B-Fc para suprimir a formação óssea ectópica em um modelo de camundongo de FOP.

[00121] Acvr1 [R206H]COIN/+; Gt(ROSA26)SorCreERt2/+ foram protegidos da formação óssea ectópica após tratamento com tamoxifeno pelo tratamento com ACVR2A-Fc/ACVR2B-Fc.

[00122] Um modelo de camundongo de FOP, chamado de Acvr1 [R206H]COIN/+; Gt(ROSA26)SorCreERt2/+ foi administrado com tamoxifeno em uma dose de 1 mg/camundongo i.p. durante oito dias. Onze camundongos foram tratados com 10 mg/kg de ACVR2A-Fc e 10 mg/kg de ACVR2B-Fc duas vezes por semana e dez camundongos foram tratados com 10 mg/kg de mFc de controle duas vezes por semana durante 6 semanas. Os camundongos foram monitorados com o uso de µCT in vivo na linha de base, 2, 4 e 6 semanas após o início da administração de tamoxifeno. Após 6 semanas, 9 dentre 10 camundongos no grupo mFc tinham desenvolvido osso ectópico em ao menos um local, em contrapartida, apenas 2 dentre 11 camundongos no grupo ACVR2A-Fc e ACVR2B-Fc mostraram desenvolvimento de osso ectópico e este osso tinha tamanho pequeno. Estes resultados são mostrados na figura 1.

Exemplo 2: Uso de um inibidor de molécula pequena de ACVR1 quinase para suprimir a formação óssea ectópica em um modelo de camundongo de FOP.

[00123] Acvr1 [R206H]COIN/+; Gt(ROSA26)SorCreERt2/+ foram protegidos da formação óssea ectópica após tratamento com tamoxifeno pelo tratamento com o inibidor de ACVR1 quinase LDN-212854.

[00124] 16 camundongos Acvr1 [R206H]COIN/+; Gt(ROSA26)SorCreERt2/+ foram administrados com tamoxifeno a uma dose de 1mg/camundongo i.p. durante oito dias. Oito camundongos foram tratados com 3 mg/kg do inibidor de ACVR1 quinase LDN-212854 (Mohedas et al. (2013) ACS Chem. Biol. 8:1291-1302) duas vezes ao dia durante 4 semanas. Oito camundongos foram tratados com controle de veículo duas vezes ao dia durante 4 semanas. Os camundongos foram monitorados com o uso de µCT in vivo na linha de base, 2 e 4 semanas após o início da administração de tamoxifeno. Após 4 semanas 8 dos 8 camundongos no grupo de controle de veículo mostraram formação óssea ectópica, em 6 destes camundongos, as lesões ósseas ectópicas eram grandes. Em contrapartida, no grupo tratado com LDN-212854, 3 dentre 8 camundongos mostraram formação óssea ectópica, o tamanho das lesões ósseas ectópicas formadas nos 3 camundongos era pequeno em comparação com o grupo de controle de veículo. Estes resultados são mostrados na figura 2.

Exemplo 3: Uso de um anticorpo contra ativina A para suprimir a formação óssea ectópica em um modelo de camundongo de FOP.

[00125] 23 camundongos Acvr1 [R206H]COIN/+; Gt(ROSA26)SorCreERt2/+ foram tratados com tamoxifeno a uma dose de 1 mg/camundongo i.p. durante oito dias. Sete camundongos foram tratados com 25 mg/kg de anticorpo de controle isotípico duas vezes por semana, oito camundongos foram tratados com 25 mg/kg de anticorpo contra ativina A (H4H10446P) duas vezes por semana e oito camundongos foram tratados com 10 mg/kg de ACVR2a-Fc duas vezes por semana durante 3 semanas. Os tratamentos com estes agentes foram começados concomitantemente ao início do tratamento com tamoxifeno. Os camundongos foram monitorados com o uso de microtomografia computadorizada (µCT) in vivo na linha de base, 2 e 3 semanas após o início da administração de tamoxifeno. A Figura 3 mostra que após 3 semanas, todos os camundongos no grupo de controle com anticorpo isotípico haviam desenvolvido osso ectópico em ao menos um local, em contrapartida, nenhum dos camundongos no grupo com anticorpo contra ativina A mostrou desenvolvimento de osso ectópico neste momento. Dois camundongos no grupo ACVR2a-Fc desenvolveram osso ectópico em 3 semanas.

Exemplo 4:

[00126] Acvr1 [R206H]COIN/+; Gt(ROSA26)SorCreERt2/+ foram protegidos da formação óssea ectópica após tratamento com tamoxifeno por ativina A e um anticorpo bloqueador de Acvr2a e b.

[00127] 26 camundongos Acvr1 [R206H]COIN/+; Gt(ROSA26)Sor- CreERt2/+ foram administrados com tamoxifeno a uma dose de 40 mg/kg i.p. durante oito dias Oito camundongos foram tratados com 10 mg/kg de anticorpo de controle isotípico (REGN1945), nove camundongos foram tratados com 10 mg/kg de anticorpo contra ativina A (H4H10446P) REGN2477) e nove camundongos foram tratados com 10 mg/kg de um anticorpo contra Acvr2a/Acvr2b duas vezes por semana durante 6 semanas. Os camundongos foram monitorados com o uso de µCT in vivo na linha de base, 2, 3 e 4 semanas após o início da administração de tamoxifeno. A Figura 4 mostra que após 4 semanas, 7 dentre 8 camundongos no grupo de controle com anticorpo isotípico haviam desenvolvido osso ectópico em ao menos um local, em contrapartida, apenas um dos camundongos no grupo tratado com anticorpo contra ativina A e três dos camundongos no grupo tratado com anticorpo Acvr2a/Acvr2b desenvolveram osso ectópico em 4 semanas. O tamanho do osso ectópico que se formou no grupo tratado com anticorpo foi menor do que no grupo tratado com controle isotípico.

Exemplo 5:

[00128] Acvr1 [R206H]COIN/+; Gt(ROSA26)SorCreERt2/+ foram protegidos da formação óssea ectópica após tratamento com tamoxifeno por um anticorpo bloqueador de ativina A.

[00129] 35 camundongos Acvr1 [R206H]COIN/+; Gt(ROSA26)- SorCreERt2/+ foram administrados com tamoxifeno a uma dose de 40 mg/kg i.p. durante oito dias Oito camundongos foram tratados com 25 mg/kg de anticorpo de controle isotípico (REGN1945), nove camundongos foram tratados com 25 mg/kg de anticorpo contra ativina A (H4H10446P) (REGN2477), nove camundongos foram tratados com 10 mg/kg de anticorpo contra ativina A (REGN2477) e nove camundongos foram tratados com 1 mg/kg de anticorpo contra ativina A (REGN2477) semanalmente durante 6 semanas. Os camundongos foram monitorados com o uso de µCT in vivo na linha de base, 2, 3, 4 e 6,5 semanas após o início da administração de tamoxifeno. O volume do osso ectópico em cada camundongo foi calculado a partir das imagens de µCT. A Figura 5 mostra que após 4 semanas, todos os camundongos no grupo de controle com anticorpo isotípico haviam desenvolvido osso ectópico em ao menos um local, ao contrário de apenas 2 camundongos em cada dos grupos tratados com anticorpo contra ativina A. Em 6,5 semanas, o volume total médio de osso ectópico no grupo tratado com controle isotípico foi de 65,4 mm3 em comparação com 1,87 mm3 nos grupos tratados com 25 mg/kg, 0,3 mm3 com 10 mg/kg e 7,3 mm3 com 1 mg/kg de anticorpo contra ativina.

Claims (7)

1. Uso de um anticorpo contra a ativina A, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para tratar fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP).

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compete pela ligação com um anticorpo que compreende as regiões variáveis das cadeias pesada e leve designadas SEQ ID NOS: 1 e 5, SEQ ID NOS: 9 e13 ou SEQ ID NOS: 18 e 17.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende as regiões variáveis das cadeias pesada e leve da SEQ ID NOS: 1 e 5, SEQ ID NOS: 9 e 13 ou SEQ ID NOS: 18 e 17.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de SEQ ID NOS: 1 e

5. 5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é quimérico, com superfície modificada ("veneered"), humanizado ou humano.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo intacto.

7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG1 kappa humano.