MXPA05011100A - Antagonistas de receptor nogo para el tratamiento de condiciones que comprenden placas amiloideas. - Google Patents

Abstract

La invencion proporciona metodos para tratar enfermedades que comprenden deposito anormal de peptido amiloide-( (A(), incluye Enfermedad de Alzheimer, por la administracion de antagonistas de receptor Nogo. La invencion tambien proporciona metodos para reducir niveles del peptido A( en un mamifero por la administracion de polipeptidos solubles de receptor Nogo.

Description

ANTAGONISTAS DE RECEPTOR NOGO PARA EL TRATAMIENTO DE CONDICIONES QUE COMPRENDEN PLACAS AMILOIDEAS Campo de la Invención Esta invención se refiere a neurobiología, neurología y farmacología, de manera más particular, se refiere a métodos para tratar enfermedades que comprenden producción y depósito anormal de péptido amiloideo-ß (?ß) , que incluyen enfermedad de Alzheimer, por la administración de antagonistas del receptor Nogo. Antecedentes de la Invención La enfermedad de Alzheimer (AD) es un trastorno neurodegenerativo que da por resultado pérdida progresiva de memoria, de cognición, de razonamiento, de juicio y de estabilidad emocional, y finalmente muerte. Una marca patológica de la AD es la presencia de placas amiloideas en el cerebro. Sin embargo, las placas amiloideas y los depósitos vasculares amiloideos (angiopatía amiloidea) también están presentes en otras condiciones, por ejemplo, en Trisomía 21 (Síndrome de Down) , Hemorragia Cerebral Hereditaria con Amiloidosis del Tipo Holandés (HCH A-D) , y Angiopatía Amiloidea Cerebral [CAA) . El constituyente principal de las placas amiloideas es el péptido ?ß, que se deriva proteolíticamente de la Proteína Precursora Amiloidea (APP) por ß-secretasa (ß CE) y ?-secretasa (Presenilina-1, 2 y y REF: 167469 proteínas asociadas) . La APP también se convierte a péptidos y fragmentos proteicos inocuos por a-secretasas y ?-secretasa. Los estudios genéticos de la AD familiar humana (FAD) han encontrado que las mutaciones en la APP y/o presenilinas alteran la producción del péptido ?ß o la relación del péptido ?ß42-3 fibrilogénico a otros productos de escisión de APP. Además, los ratones que expresan versiones humanas mutantes de FAD de la APP con o sin presenilinas mutantes exhiben depósito de placas amiloideas y daño cognitivo. En tanto que los péptidos ?ß están implicados en la AD, existe menos certeza con respecto a que formas del péptido ?ß dan por resultado disfunción neuronal y como actúan. La transformación del péptido ?ß monomérico a depósitos grandes de placas amiloideas prosigue a través de varios pasos y formas intermedias pueden ser causantes de la disfunción neuronal de la AD. Por consiguiente, la intervención terapéutica se ha enfocado a reducir los niveles del péptido ?ß y a prevenir la formación de placas amiloideas. Estos planteamientos han encontrado algún éxito e incluyen, por ejemplo, inmunización con péptido ?ß y administración pasiva de anticuerpos anti-péptido ?ß. Ver, por ejemplo Bard et al., Nature ed. 6:916-19 (2000); Holtzman et al., Ad . Drug Delivery Rev. 54: 1603-13 (2002) ; y las solicitudes de patente internacional números WO 99/27944, O 00/72876, y WO 00/72880. Sin embargo, permanece · la necesidad urgente de idear tratamientos terapéuticos adicionales para la AD. Breve Descripción de la Invención La presente invención se basa en los descubrimientos que el tratamiento con polipéptidos solubles del receptor Nogo reduce los niveles del péptido ?ß y que el tratamiento con un antagonista del receptor Nogo, tal como un polipéptido soluble de receptor Nogo, reduce la producción del péptido ?ß y los depósitos de placa. En base a estos descubrimientos, la invención presenta métodos para tratar condiciones asociadas con el depósito de placas amiloideas, que incluyen enfermedad de Alzheimer, por la administración de fragmentos solubles del polipéptido del receptor Nogo y antagonistas del receptor Nogo . En algunas modalidades, la invención proporciona un método para reducir niveles del péptido Ab, en un mamífero que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido soluble del recepto Nogo. En algunas modalidades, los niveles del péptido Ab están elevados en asociación con una enfermedad, trastorno o condición. En algunas modalidades, la enfermedad, trastorno o condición es enfermedad de Alzheimer. En algunas modalidades, el polipéptido soluble de receptor Nogo se administra por inyección de bolo o infusión crónica. En algunas modalidades, el polipéptido soluble de receptor Nogo se administra de forma intravenosa. En algunas modalidades, el polipéptido soluble de receptor Nogo se administra directamente en el sistema nerviosos central . En algunas modalidades, el polipéptido soluble de receptor Nogo se administra directamente en un ventrículo lateral . En algunas modalidades, el polipéptido soluble de receptor Nogo es una forma soluble de un NgRl de mamífero. En algunas modalidades, la forma soluble de un NgRl de mamífero: (a) comprende los aminoácidos 26 a 310 del NgRl humano (SEQ ID NO: 3) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y (b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. En algunas modalidades, la forma soluble de un NgRl de mamífero: (a) comprende los aminoácidos 26 a 344 del NgRl humano (SEQ ID NO: 4) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y (b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. En algunas modalidades, la forma soluble de un NgRl de mamífero-. (a) comprende los aminoácidos 27 a 310 de NgRl de rata (SEQ ID NO: 5) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y (b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. En algunas modalidades, la forma soluble de un NgRl de mamífero: (a) comprende los aminoácidos 26 a 344 de NgRl de rata (SEQ ID NO: 6) con hasta diez sustituciones conservadoras . de aminoácidos; y (b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional.

En algunas modalidades, la forma soluble de un Ng l de mamífero comprende adicionalmente una porción de fusión. En algunas modalidades, la porción de fusión es una porción de inmunoglobulina. En algunas modalidades, la porción de inmunoglobulina es una porción de Fe. En algunas modalidades, la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.001 mg/kg a 10 mg/kg. En algunas modalidades, la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.01 mg/kg a 1.0 mg/kg. En algunas modalidades, la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.05 mg/kg a 0.5 mg/kg. En algunas modalidades, la invención proporciona un método para prevenir o tratar una enfermedad, trastorno o condición asociada con placas del péptido Ab en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de NgRl. En algunas modalidades, las placas están en el sistema nervioso central. En algunas modalidades, la enfermedad, trastorno o condición es enfermedad de Alz eimer. En algunas modalidades, el antagonista de NgRl se administra directamente en el sistema nervioso central. En algunas modalidades, el antagonista de NgRl se administra directamente en un ventrículo lateral. En algunas modalidades, el antagonista de NgRl se administra por inyección de bolo o infusión crónica. En algunas modalidades, el polipéptido soluble de receptor Nogo es una forma soluble de un NgRl de mamífero. En algunas modalidades, la forma soluble de un NgRl de mamífero-, (a) comprende los aminoácidos 26 a 310 del NgRl humano (SEQ ID NO: 3) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y (b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. En algunas modalidades, la forma soluble de un NgRl de mamífero: (a) comprende los aminoácidos 26 a 344 de NgRl humano (SEQ ID NO: 4) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y (b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. En algunas modalidades, la forma soluble de un NgRl de mamífero: (a) comprende los aminoácidos 27 a 310 de NgRl de rata (SEQ ID NO: 5) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y (b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. En algunas modalidades, la forma soluble de un NgRl de mamífero: (a) comprende los aminoácidos 27 a 344 de NgRl de rata (SEQ ID NO: 6) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y (b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. En algunas modalidades, la forma soluble de un NgRl de mamífero comprende adicionalmente una porción de fusión. En algunas modalidades, la porción de fusión es una porción de inmunoglobulina. En algunas modalidades, la porción de inmunoglobulina es una porción de Fe.

En algunas modalidades, el antagonista de NgRl comprende un anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno del mismo que se une a un NgRl de mamífero. En algunas modalidades, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de Fab, un fragmento de Fab' , un fragmento de F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento Fd, un diacuerpo, y un anticuerpo de cadena individual. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un polipéptido unido por un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de: HB 7E11 (ATCC™ Número de acceso PTA-4587), HB 1H2 (ATCCf Número de acceso PTA-4584) , HB 3G5 (ATCC*151 Número de acceso PTA-4586) , HB 5B10 (ATCC^ Número de acceso PTA-4588), y HB 2F7 (ATCC™ Número de acceso PTA-4585) . En algunas modalidades, el · anticuerpo monoclonal se produce por el hibridoma HB 7E11. En algunas modalidades, el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 7); LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 8); LDLSDDAELR (SEQ ID N0:9); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 10); LDLASDDAELR (SEQ ID NO: 11); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 12); LDALSDDAELR (SEQ ID NO: 13); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 14); LDLSSDEAELR (SEQ ID NO: 15); DNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 16); DNAQLR (SEQ ID NO: 17); ADLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 18); LALSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 19); LDLSDNAALRWDPTT (SEQ ID NO: 20); LDLSDNAQLHWDPTT (SEQ ID NO: 21) ; y LDLSDNAQLAWDPTT (SEQ ID NO: 22) . En algunas modalidades, la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.001 mg/kg a 10 mg/kg. En algunas modalidades, la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.01 mg/kg a 1.0 mg/kg. En algunas modalidades, la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.05 mg/kg a 0.5 mg/kg. Descripción Detallada de la Invención A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica al cual corresponde esta invención. En caso de conflicto, controlará la presente solicitud que incluye las definiciones . A menos que se requiera de otro modo por contexto, los términos singulares deben incluir pluralidades y términos plurales deben incluir lo singular. Todas las publicaciones, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan por referencia en sus totalidades para todos los propósitos cono si cada publicación o solicitud de patente individual se indicara de forma específica e individual para ser incorporada como referencia. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden usar en la práctica o prueba de la presente invención, Se describen más adelante los materiales y métodos adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se propone que sean limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones . De principio a fin en esta especificación y en las reivindicaciones, la palabra "comprende", o variaciones tal como "comprenden" o "que comprenden", indican la inclusión de cualquier número entero citado o grupo de números enteros pero no la exclusión de ningún otro número entero o grupo de números enteros . A fin de definir adicionalmente esta invención, se proporcionan los siguientes términos y definiciones . Como se usa en la presente, "anticuerpo" significa una inmunoglobulina intacta, o un fragmento de unión a antigeno de la misma. Los anticuerpos de esta invención pueden ser de cualquier isotipo o clase (por ejemplo, M, D, G, E y A) o cualquier otra subclase (por ejemplo Gl-4, Al-2) y puede tener ya sea una cadena ligera a kappa (?) o lambda (?) . Como se usa en la presente, "anticuerpo humanizado" significa un anticuerpo en el cual se reemplacen al menos una porción de las secuencias no humanas con secuencias humanas .

Los ejemplos de cómo elaborar los anticuerpos humanizados se pueden encontrar en las patentes de los Estados Unidos números 6,054,297, 5, 886, 152 y 5, 877, 293. Como se usa en la presente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Como se usa en la presente, una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en una etapa anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. Como se usa en la presente, un "paciente" significa un mamífero, por ejemplo, un humano. Como se usa en la presente, "proteína de fusión" significa una proteína que comprende un primer polipéptido fusionado a un segundo polipéptido heterólogo. Como se usa en la presente, un "antagonista de receptor Nogo" significa una molécula que inhibe la unión del receptor-1 Nogo a un ligando (por ejemplo NogoA, NogoB, NogoC, MAG OM-gp) . Como se usa en la presente, "polipéptido de receptor Nogo" incluye la proteína de longitud completa del receptor-1 Nogo y fragmentos de la misma que se unen al péptido ?ß o antagonizan la función del receptor Nogo. Un primer aspecto de la invención se basa en el descubrimiento que los polipéptidos solubles del receptor Nogo I se unen directamente al péptido ?ß . Por lo tanto, sin ! proponerse que se una por teoría, parece que los polipéptidos ¡ solubles del receptor Nogo pueden funcionar como un depósito del péptido ?ß in vivo. Este mecanismo se puede aprovechar para agotar los niveles del péptido ?ß en la sangre en circulación, en el sitio de depósito, o en ambos, inhibiendo de este modo la formación de placas amiloideas o reduciendo el tamaño de las placas existentes . Debido a que un sitio de acción está en la corriente sanguínea, la invención evita de manera ventajosa el requisito de administrar los polipéptidos ¦ solubles del receptor Nogo al sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés) . Sin embargo se apreciará que los polipéptidos solubles del receptor Nogo se pueden administrar directamente en el CNS en lugar de, o además de, la administración sistémica. Un segundo aspecto de la invención se basa en el descubrimiento que los polipéptido solubles del receptor Nogo u otros antagonistas del receptor Nogo, por ejemplo, un anticuerpo anti-receptor Nogo, interfieren con la función del receptor Nogo en el CNS . Esto da por resultado tanto niveles reducidos del péptido ?ß como una reducción de los depósitos de placa. En este mecanismo, el sitio de acción de los polipéptidos solubles del receptor Nogo u otros antagonistas del receptor Nogo está en le CNS. Sin intentar que se una por teoría, parece que al menos un efecto de inhibir la función de NgR es reducir el procesamiento de la APP que produce el péptido ?ß . Antagonistas del Recepto Nogo Se puede usar cualquier antagonista del receptor Nogo en los métodos de la invención. Por ejemplo, los antagonistas del receptor Nogo que se pueden usar en los métodos de la invención, incluyen, de manera enunciativa y sin limitación: polipéptidos solubles del receptor-1 Nogo; anticuerpos q ue se unen a la proteína del receptor Nogo y fragmentos de unión a antígeno de estos anticuerpos; y antagonistas de molécula pequeña. Polipéptidos Solubles del Receptor-1 Nogo Algunas modalidades de la invención usan un polipéptido soluble del receptor-1 Nogo (receptor-1 Nogo también se refiere de forma diversa como "receptor Nogo" , "NogoR", "NogoR-1", wNgR" , y "NgR-1") . El receptor-1 Nogo de longitud completa consiste de una secuencia de señal, una región de N-terminal (NT) , ochos repeticiones de alto contenido de leucina (LRR) , una región de LRRCT (una C-terminal del dominio de repeticiones de alto contenido de leucina de las ocho repeticiones de alto contenido de leucina), una región de C-terminal (CT) y un anclaje GPI. Las secuencias de los polipéptidos del receptor Nogo de humano y rata se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 Secuencias de Polipéptidos del receptor-1 Nogo de Humano y Rata Los polipéptidos solubles del receptor Nogo usados en los métodos de la invención comprenden un dominio NT; 8 LRR y un dominio LRRCT y carecen de una secuencia de señal y un anclaje GPI funcional (es decir, no anclaje GPI o un anclaje GPI que falla en asociarse eficientemente a una membrana celular) . Los polipéptido adecuados incluyen, por ejemplo, los aminoácidos 26-310 (SEQ ID NO: 3) y 26-344 (SEQ ID NO: 4) del receptor Nogo humano y los aminoácidos 27-310 (SEQ ID NO: 5) y 27-34 (SEQ ID NO: 6) del receptor Nogo de rata (Tabla 2). Los polipéptidos adicionales que se pueden usar en los métodos de la invención se describen, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente Internacional PCT/US02/32007 y PCT/US03/25004.

Tabla 2 Polipéptido Solubles de receptor Nogo de Humano y Rata Una proteína de fusión que incluye un polipéptido soluble de receptor de Nogo se puede usar en los métodos de la invención. En algunas modalidades, la porción heteróloga de la proteína de fusión es un dominio constante de inmunoglobulina . En algunas modalidades, el domino constante de inmunoglobulina es un dominio constante de cadena pesada. En algunas modalidades, el polipéptido heterólogo es un fragmento Fe. En algunas modalidades, el Fe se une al extremo C-terminal de un polipéptido soluble de receptor Nogo. En algunas modalidades, la proteina de fusión del receptor Nogo es un dímero, por ejemplo, un dímero de fusión Fe. Anticuerpos Algunos métodos de la invención usan un antagonista del Receptor Nogo que es un anticuerpo o un fragmento de unión a antlgeno del mismo que se une de forma específica a un polipéptido inmunogénico de receptor-1 Nogo que inhibe la unión del receptor-1 Nogo a un ligando (por ejemplo, NogoA, NogoB, NogoC, MAG, OM-gp) . El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno usado en estos métodos de la invención se puede producir in vivo o in vitro. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o fragmentos de unión a antígeno del mismo es murino o humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-receptor-1 Nogo o fragmentos de unión antígeno del mismo es recombinante, manejado, humanizado y/o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo se selecciona de los anticuerpos descritos en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US03/25004. Los anticuerpos útiles en la presente invención se pueden emplear con o sin modificación. Los fragmentos de unión a antígeno de ejemplo de los anticuerpos que se pueden usar en los métodos de la invención son Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb, y fragmentos que contienen los fragmentos de la región de determinación de complementariedad (CDR) , anticuerpos de cadena individual (scFv) , anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipétidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión específica a antígeno al polipéptido (por ejemplo, inmunoadhesinas) . Como se usa en la presente, Fd significa un fragmento que consiste de los dominios VH y CHi; Fv significa un fragmento que contiene los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; y dAb significa un fragmento que consiste de un dominio VH ( ard et al., Nature 341:544-46 (1989)). Como se usa en la presente, anticuerpo de cadena individual (scFv) significa un anticuerpo en el cual están apareadas la región VL y una región VH para formar moléculas monovalentes via un ligador sintético que les permite hacerse como una cadena individual de proteína (Bird et al . , Science 242:423-26 (1988) y Huston et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-83 (1988)). Como se usa en la presente, el diacuerpo significa un anticuerpo biespecífico en el cual se expresan los dominios VH y VL en una cadena individual de polipéptido, pero usado un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de este modo a los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (ver, por ejemplo, Holliger et al., Proc. Nati. Acad.

Sci . USA 90:6444-48 (1993) y Poljak et al., Structure 2:1121- 23 (1994)). Inmunización Los anticuerpos para el uso en los métodos de la invención se pueden generar por inmunización de un hospedero adecuado (por ejemplo, vertebrados, incluyendo humanos, ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, vacas, caballos, reptiles, peces, anfibios, y en huevos de aves, reptiles y peces) . Estos anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales para una revisión de los métodos para elaborar anticuerpos ver, por ejemplo Harlow y La e (1988) , Antibodies, A Laboratory Manual; Yelton et al., Ann. Rey, de Biochem. , 50:657-80 (1981); y Ausubel et al. (1989), Current Protocole in Molecular Biology (New York: John Wiley & Sons) . La inmunorreactividad de un anticuerpo con un polipéptido inmunogénico de - .receptor Nogo se puede determinar por cualquier método adecuado, incluyendo por ejemplo, ensayo de inmunotransferencia y ELISA. Los anticuerpos monoclonales para el uso en los métodos de la invención se pueden elaborar por procedimientos convencionales como se describe, por ejemplo, en Harlow y Lañe (1988) , supra. Se puede inmunizar un hospedero con un polipéptido inmunogénico del receptor-1 Nogo ya sea con o sin un adyuvante. Los polipéptidos adecuados se describen por ejemplo en las solicitudes de patente internacional PCT/US01/31488 , PCT/US02/32007 y PCT/US03/2500 . El hospedero también se puede inmunizar con el receptor-1 Nogo asociado con la membrana celular de una célula intacta o destruida y anticuerpos identificados por la unión a un polipéptido de receptor-1 Nogo. Otras técnicas adecuadas para producir un anticuerpo comprenden exposición in vitro de linfocitos al receptor-1 Nogo o a un polipéptido inmunogénico de la invención, o de manera alternativa, la selección de bibliotecas de anticuerpos en fago o vectores similares. Ver Huse et al., Science 246:1275-81 (1989). Los anticuerpos anti- eceptor-1 Nogo usados en los métodos de esta invención también se pueden aislar al detectar una biblioteca de anticuerpos recombinantes de combinación. Se conocen en la técnica las metodologías para preparar y detectar estas bibliotecas. Existen métodos y materiales comercialmente disponibles para generar bibliotecas de exhibición en fagos (por ejemplo el Sistema de Anticuerpos de Fago ecombinante de Pharmacia, número de catálogo 27-9400-01; el equipo de exhibición en fago Stratagene SurfZAPm, número de catálogo 240612; y otros de MorphoSys) . Después de la detección y aislamiento de un anticuerpo anti-receptor-1 Nogo de una biblioteca dde exhibición de inmunoglobulina recombinante, se puede recuperar el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo seleccionado a partir del paquete de exhibición (por ejemplo, del genoma de fago) y se sub-clona en otros vectores de expresión por técnicas normales de ADN recombinante . Para expresar un anticuerpo aislado al detectar una biblioteca de combinación, el ADN que codifica para la cadena pesa y la cadena ligera del anticuerpo o las regiones variables del mismo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en una célula ospederoa. Usos para Antagonistas de Receptor Nogo Esta invención se refiere a métodos para tratar enfermedades que comprenden depósito normal de péptido ?ß al administrar antagonistas de receptor Nogo. Los antagonistas de receptor Nogo usados en los métodos de la invención incluyen, de manera enunciativa y sin limitación, polipéptidos solubles de receptor Nogo, anticuerpos a la proteína de receptor Nogo y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, y antagonistas de molécula pequeña. En algunas modalidades, el depósito normal de péptido ?ß se asocia con una enfermedad, trastorno o condición, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer. Usos para Polipéptidos Solubles de Receptor Nogo Esta invención también se refiere a métodos para reducir los niveles de péptido ?ß por la administración de polipéptidos solubles de receptor Nogo. En algunas de estas modalidades, los niveles del péptido ?ß están elevados en asociación con una enfermedad, trastorno o condición, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer.

Composiciones Farmacéuticas Los polipéptidos solubles de receptor Nogo y los antagonistas de receptor Nogo usados en los métodos de la invención se pueden formular en composiciones farmacéuticas para la administración a mamíferos, incluyendo humanos. Las composiciones farmacéuticas usadas en los métodos de esta invención comprenden portadores farmacéuticamente aceptables . Los portadores farmacéuticamente aceptables útiles en estas composiciones farmacéuticas incluyen, por ejemplo, intercambiadores iónicos, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tal como albúmina sérica humana, sustancias amortiguadoras tal como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tal como sulfato de protamina, fosfato ácido disódico, fosfato ácido potásico, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinil-pirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos , ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana. Las composiciones usadas en los métodos de la presente invención se pueden administrar por cualquier método adecuado, por ejemplo, de forma parenteral, intravenosa, oral, por aspersión de inhalación, de forma tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal o via un depósito implantado. El término "parenteral" como se usa en la presente incluye técnicas de infusión o inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial, intra-esternal, intratecal, intra-hepática, intra-lesional y intracraneal. Como se describe anteriormente, los antagonistas de receptor Nogo usados en los métodos de la invención actúan en el CNS, que da por resultado tanto niveles reducidos de péptido ?ß como una reducción en los depósitos de placa. Por consiguiente, en los métodos de la invención que usan un antagonista de receptor Nogo, el antagonista de receptor Nogo debe cruzar la barrera sanguínea del cerebro . Este cruce puede resultar de las propiedades fisicoquímicas inherentes en la molécula misma del antagonista de receptor Nogo, de otros componentes en una formulación farmacéutica, o del uso de un dispositivo mecánico tal como una aguja, cánula o instrumentos quirúrgicos para escindir la barrera sanguínea del cerebro. Donde el antagonista de receptor Nogo es una molécula que no cruza inherentemente la barrera sanguínea del cerebro, las rutas adecuadas de administración son, por ejemplo, intratecal o intracraneal, por ejemplo, directamente en un ventrículo lateral. Donde el antagonista de receptor Nogo es una molécula que cruza inherentemente la barrera sanguínea del cerebro, o donde un polipéptido soluble de receptor Nogo se usa en un método de la invención donde la unión directa al péptido ?ß da por resultado niveles reducidos de péptido ?ß, la ruta de administración puede ser por una o más de las varias rutas descritas más adelante. Las formas inyectables, estériles de las composiciones usadas en los métodos de esta invención pueden ser suspensión acuosa u oleaginosa. Estas suspensiones se pueden formular de acuerdo a técnicas conocidas usando agentes de dispersión o humectación adecuados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solución en 1, 3-butanodiol . Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden emplear están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, se emplean de manera convencional aceites fijos, estériles como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito, se puede emplear cualquier aceite firme, insípido incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Los ácidos grados, tal como ácido oleico y sus derivados de glicéridos son útiles en la preparación de productos inyectables, como son los aceites naturales farmacéuticamente aceptables, tal como aceite de oliva o aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas . Estas soluciones o suspensiones aceitosas también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, tal como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares que se usan comúnmente en la formulación de formas de dosis farmacéuticamente aceptables que incluyen emulsiones y suspensiones. Otros agentes tensioactivos comúnmente usados, tal como Tweens, Spans y otros agentes emulsionadores o mejoradores de biodisponibilidad que se usan comúnmente en la elaboración de formas de dosis sólidas, líquidas u otras farmacéuticamente aceptables se pueden usar también para los propósitos de la formulación. Las formulaciones parenterales pueden ser una dosis de bolo individual, una infusión o una dosis de bolo de carga seguida con una dosis de mantenimiento. Estas composiciones se pueden administrar una vez por día o en una base de "como se necesite" . Ciertas composiciones farmacéuticas usadas en los métodos de esta invención se pueden administrar de forma oral u en cualquier forma de dosis oralmente aceptable qué incluyen, por ejemplo, cápsulas, tabletas, suspensiones o soluciones acuosas . Ciertas composiciones farmacéuticas también se pueden administrar por aerosol nasal o inhalación. Estas composiciones se pueden preparar como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservadores adecuados, promotores de absorción para mejorar la biodisponibilidad, fluorocarburos y/u otros agentes convencionales de solubilización o dispersión.

La cantidad de un polipéptido soluble de receptor Nogo o un antagonista de receptor Nogo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una forma de dosis individual variará dependiendo del hospedero tratado y del modo particular de administración. La composición se puede administrar como una dosis individual, múltiples dosis o durante un periodo de tiempo establecido en una infusión. También se pueden ajustar los regímenes de dosis para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una repuesta terapéutica o profiláctica) . Los métodos de la invención usan una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un polipéptido soluble de receptor Nogo o un antagonista de receptor Nogo. Esta cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva puede variar de acuerdo a factores tal como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo. Una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva es también una en la cual tienen más peso los efectos terapéuticamente benéficos que cualquier efecto tóxico o perjudicial. Un régimen de tratamiento y dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo el polipéptido soluble de receptor Nogo o antagonista de receptor Nogo, particular, usado, la edad del paciente, peso corporal, salud general, sexo y dieta, y el tiempo de administración, la velocidad de excreción, combinación de fármaco, y la severidad de la enfermedad particular que se trate. El juicio de estos factores por los enfermeros médicos está dentro de la habilidad de la técnica. La cantidad también dependerá del paciente individual que se trate, la ruta de administración, el tipo de formulación, las características del compuesto usado, la severidad de la enfermedad, y el efecto deseado. La cantidad usada se puede determinar por los principios farmacológicos y farmacocinéticos bien conocidos en la técnica. En los métodos de la invención, los antagonistas de receptor Nogo se administran en general directamente al CNS, de forma intracerebroventricular, o intratecalmente, por ejemplo, en un ventrículo lateral. Los métodos de la invención, donde se usa un polipéptido soluble de receptor Nogo para reducir los niveles de péptido ?ß, los polipéptidos solubles de receptor Nogo se administran en general de forma intravenosa. Las composiciones para la administración de acuerdo a los métodos de la invención se pueden formular de modo que se administra una dosis de 0.001-10 mg/kg de peso corporal por día del antagonista de receptor Nogo. En algunas modalidades de la invención, la dosis es 0.01-1.0 mg/kg de peso corporal por día. En algunas modalidades, la dosis es 0.05-0.5 mg/kg de peso corporal por día. Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones usadas en los métodos de la invención. Por ejemplo, un anticuerpo de receptor Nogo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un polipéptido soluble de receptor Nogo o una proteina de fusión se puede co-formular con y/o co-administrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales. La invención abarca cualquier método adecuado de distribución para un polipéptido soluble de receptor Nogo o un antagonista de receptor Nogo a un tejido objetivo seleccionado, incluyendo inyección de bolo de una solución acuosa o implantación de un sistema de liberación controlada. El uso de un implante de liberación controlada reduce la necesidad de inyecciones repetidas . El polipéptido soluble de receptor Nogo o los antagonistas de receptor Nogo usados en los métodos de la invención se pueden dar directamente por infusión en el cerebro. Los varios implantes para infusión cerebral directa de los compuestos se conocen y son efectivos en la distribución de compuestos terapéuticos a pacientes humanos que sufren de trastornos neurológicos . Estos incluyen infusión crónica en el cerebro usando una bomba, estereotácticamente implantada, catéteres intersticiales temporales, implantes permanentes de catéter intracraneal, e implantes biodegradables quirúrgicamente implantados. Ver, por ejemplo Gilí et al-, supra; Scharfen et al., High Activity Iodine-125 Intersticial Implant For Gliomas," Int. J. adiation Oncology Biol . Phys . 24(4):583-91 (1992); Gaspar et al., "Permanent 125I Implants for Recurrent Malignant Gliomas", Int. J. Radiation Oncolog Biol . Phys . 43(5): 977-82 (1999);. Capítulo 66, páginas 577-580, Bellezza et al., "Stereotactic Interstitial Brachytherapy, " in Gildenberg et al., Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery, McGraw-Hill (1998) ; y Brem et al., "The Safety of Interstitial Chemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy in the Treatment of Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase I Trial," J. Neuro-Oncology 26:111-23 (1995). Las composiciones también pueden comprender un polipéptido soluble de receptor Nogo o un antagonista de receptor Nogo dispersado en un material portador biocompatible que funciona como un sistema de distribución o soporte adecuado para los compuestos . Los ejemplos adecuados. de portadores de liberación sostenida incluyen matrices polimétricas semipermeables en la forma de artículos formados tal como supositorios o cápsulas . Las matrices de liberación sostenida, implantables o microcapsulares incluyen poliláctidos (Patente de los Estados Unidos Número 3,773,319; EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (etileno-acetato de vinilo (Sidman et al., Biopolymers 22:547-56 (1985)) poli (2-hidroxietil-metacrilato, etileno-acetato de vinilo (Langer et al . , J. Biomed. Mater.

Res . 15:167-277 (1981); Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)) o ácido poli-D- (-) -3- idroxibutírico (EP 133,988). En algunas modalidades de la invención, un polipéptido soluble de receptor Nogo o antagonista de receptor Nogo se administra a un paciente por infusión directa en una región apropiada del cerebro. Ver, por ejemplo Gilí et al., "Direct brain infusión of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease," Nature ed. 9: 589-95 (2003). Las técnicas alternativas están disponibles y se pueden aplicar para administrar un polipéptido soluble de receptor Nogo o un antagonista de receptor Nogo de acuerdo con la invención. Por ejemplo, la colocación esterotáctica de un catéter o implante se puede lograr usando la unidad de Riechert-Mundinger y la unidad de localización multipropósito ZD (Zamorano-Du ovny) . Un explorador de tomografía computarizado mejorado en contraste (CT) , que inyecta 120 mi de omnipaque, 350 mg de yodo/ml, con espesor de rodaja de 2 mtti puede permitir la planeación del tratamiento multiplanar tridimensional (STP, Fisher, Freiburg, Alemania) . Este equipo permite la planeación en base a los estudios de formación de imágenes de resonancia magnética, fusionando la información objetivo de CT y MRI para confirmación objetivo clara. El sistema estereotáctico Leksell (Downs Surgical, Inc., Decatur, GA) modificado para el uso con un explorador GE CT (General Electric Company, ilwaukee, WI) así como el sistema estereotáctico de Brown-Roberts-Wells (BRW) (Radionics, Burlington, MA) se puede usar para este propósito. De esta manera, en la mañana del implante, el anillo base anular del armazón esterotáctico de BRW se puede unir al cráneo del paciente. Se pueden obtener secciones de CT en serie a intervalos de 3 mm a través de la región (tejido objetivo) con un armazón de localizador de varilla de grafito sujetado a la placa base. Se puede correr un programa de planeación de tratamiento computarizado en una computadora VAX 11/780 (Digital Equipment Corporation, Maynard, Mass) usando coordenadas de CT de las imágenes de la varilla de gafito para correlacionar entre el espacio de CT y el espacio de BRW. Ejemplos Ejemplo 1: Localización Subcelular de NgR y Nogo se Altera en la Enfermedad de Alzheimer Se obtuvieron muestras anónimas de tejido cerebral de control y con enfermedad de Alzheimer (AD) de humano del NIH-supported Harvard Brain Tissue Resource Center y se examinaron histológicamente para la localización de NogoA y NgR usando los anticuerpos anti-NogoA y anti-NgR (ver Wang et al., J. Neurosci. 22:5505-12 (2002)). El tejido del área 44 de Broadman y del hipocampo se examinaron en seis casos de control y seis casos con AD. Se confirmó la especificidad de la tinción por bloqueo de antígeno y por la presencia de una banda individual inmunorreactiva en las inmunotransferencias .

En el cerebro de humano de adulto de control, fue detectable la inmunorreactividad de NogoA en un patrón granular difuso en el neurópilo de estas regiones cerebrales con poca tinción celular. En contraste, en todos los casos con AD, hubo un cambio dramático de NogoA a cuerpos de células neuronales . Se cambio la localización de NgR de una manera opuesta. En los casos de control, la mayor concentración de la proteína de NgR se encontró en el soma celular, mientras que en los casos con AD, el cerebro exhibió una inmunorreactividad difusa de neurópilos, y poca tinción celular. El análisis por inmunotransferencia con anticuerpos anti-NgR confirmó que esto no fue debido a niveles alterados de NgR y la tinción adyacente con anticuerpos anti-NogoA indicó que esto no fue debido a la ausencia de neuronas . Además del cambio de NgR fuera del soma celular, se observó que NgR se concentró en placas amiloideas y la doble inmunohistoquimica para ?ß y NgR demostró que las dos proteínas se co-localizan en estos depósitos . Estos hallazgos sugieren que la ruta de NogoA/NgR tiene un papel en la patología de AD. Ejemplo 2: APP y Formas Múltiples de Péptido ?ß Interactúan con NgR En base a estas observaciones, se probó si NogoA o NgR interactúa directamente con APP. Construcciones etiquetadas con epítopo de NgR (NgR-myc construidas como se describe en Liu et al., Science 297:1190-93 (2002) y APP (APP-V5; I.M.A.G.E. clon #5259793 se subclonó en pcDNA3.1-V5H para crear la fusión C-terminal a APP-695) se expresaron en células COS-7 y se realizó la inmunoprecipitación con anticuerpos anti-V5 y anti-mye. Las inmunotransferencias del material precipitado entonces se sondearon con anticuerpos anti-V5, anti-myc y anti-NgR. Los estudios de inmunoprecipitación demostraron una asociación específica de APP con NgR. No fue detectable NogoA en el material inmunoprecipitado usando anti-NogoA. También se monitorizó la ubicación de la APP etiquetada con epítopo en las células COS-7 transfectadas y se encontró que una mayoría de la proteína en los controles se localizó intracelularmente en regiones perinucleares , pero que la coexpresión de NgR con APP cambia una mayoría de APP a la superficie celular. Además, las ubicaciones de APP y NgR fueron idénticas en experimentos de doble marca en las células transfectadas . El nivel total de expresión de APP celular no se alteró por la co-expresión de NgR. Adicionalmente, las proteínas nativas de APP y NgR también se co-localizaron en neuronas primarias como se determina al sondear con anticuerpos anti-APP (Santa Cruz Biotechnology) y anti-NgR. Estos resultados confirman una asociación física de NgR con APP. Entonces se investigó si la región ?ß de APP está comprendida en su interacción con NgR, incluyendo si el péptido fibrilogénico ?ß42-3 se une a NgR. Se crearon dos construcciones de proteína de fusión que contiene fosfatasa alcalina (AP) y la región hidrófila de ?ß (aminoácidos 1-28) al fusionar la secuencia de codificación en cuadro con la secuencia de señal-6xHis-secuencia placental de fosfatasa alcalina (AP) del vector pAP-6 (Nakamura et al., Neuron 2:1093-1100, 1988). Las proteínas ??-?ß y ?ß-?? se unen ambas a células COS que expresan NgR pero no a células COS transfectadas con vector. Esta unión fue saturable con una ¾ aparente de 60 nM. La interacción también se detectó usando biotina-?ß (1—40) purificada en un ensayo tipo ELISA con NgR inmovilizada. En contraste, el péptido invertido 40-1 no interactúa con NgR inmovilizada en ninguno de estos experimentos. También se incubó ??a?-?ß 2 durante 2 horas a 4°C con células SKNMC humanas que expresan NgR-1 humano y se encuentra que el péptido . ?ß42 fibrilogénico se une a estas células . También se probó la unión del péptido ?ß a uñ polipéptido soluble de NgR, el sNgR310 (ver, por ejemplo, PCT/US03/25004) , como sigue. Se inmovilizó el sNgR310 en una placa de microtítulo y se aplicó biot±na-Api-40 o biotina-?ß40-1 durante 16 horas a 4°C. Después de la remoción de los péptidos no unidos, se detectó la biotina-?ß unida por HRP conjugada a estreptavidina. Como con el NgR de longitud completa se observó que biotina-Api-40, pero no se une a sNgR310. También se realizaron estos experimentos en la presencia de anticuerpos anti-NgR tal como el anticuerpo monoclonal HB 7E1 (descrito en PCT/US03/25004) , y se encontró que se puede inhibir la unión de Biotina-A i-40 por los anticuerpos anti-NgR. En experimentos separados, se confirmó que los anticuerpos anti-NgR también inhiben la unión de Biotina-Api-40 a ya sea las células C0S7 que expresan NgRl de rata o a las células SKNMC que expresan NgRl de humano. De manera colectiva, estos datos confirmaron que APP y las formas que se presentan de forma natural del péptido ?ß interactúan directamente con NgR. La especificidad y selectividad de la interacción ?ß(1-28) con NgR se sondeó de varias maneras. La interacción fue especifica para NgRl debido a que ni NgR2 ni NgR3, que comparten similitud de secuencia con NgR, se unen a ?ß-??. Adicionalmente, se observó especificidad de especies: NgR humano se une a ?ß humano a un mayor grado que NgR de ratón se une a ?ß humano o NgR humano se une a ?ß de ratón o NgR de ratón se une a ?ß de ratón. Finalmente, se examinaron neuronas cultivadas de ratones NgR -/- generados en nuestro laboratorio (estos ratones se suprimieron para el Exon II de NgR y no se produce proteina de NgR) y se encontró que no se unen ni al fragmento de Nogo-66 de NogoA (ver por ejemplo, solicitudes de patente internacional PCT/US01/01041 y PCT/US02/32007) o el péptido ?ß. Estos datos demuestran que NgR es el sitio de unión de superficie celular neuronal primario para ?ß (1-28) .

Para definir adicionalmente que residuos se requieren para la interacción de NgR, se crearon fusiones de AP de varias supresiones en el péptido ?ß(1-28) y se monitorizó la unión a NgR expresado en células COS-7 al ensayar la actividad de AP. La supresión de los residuos amino-terminales 7 no altera la unión a NgR y la supresión de los residuos amino-terminales 14 redujo moderadamente la unión de NgR. Sin embargo, la supresión de los aminoácidos 1-16 abrogó la unión de NgR. En el término carboxi de ?ß (1-28) , un mutante de truncamiento de 7 aminoácidos no exhibió afinidad para NgR. De esta manera, los aminoácidos 7-28 están comprendidos en la afinidad de NgR y los aminoácidos 15-28 son especialmente importantes . Consistente con estas observaciones, se encontró que los productos de péptido de ß-secretasa nativos (que contienen los aminoácidos 8-21) pero no los productos de escisión de a-secretasa (proteolizados en el aminoácido 17) se unen a NgR. Ejemplo 3: ?ß se une al Sitio de NgR Distinto que el Unido por Ligandos de Mi'elina Se analizó si la unión de ?ß(1-28) compitió por la unión de NgR con otros ligandos conocidos para NgR al permitir que ??-?ß(1-28) soluble 250 nM o AP-Nogo (1-33) se una a cavidades revestidas con sNgR310-Fc purificado en la presencia de varias concentraciones de ?ß libre de competencia. En un experimento similar, también se probó si biotina-?ß (1-40) se une a sNgR344-Fc de rata. Se observó que los péptidos ?ß se unen tanto a sNgR310-Fc y sNgR344-Fc. De esta manera, los péptidos ?ß, igual que otros ligandos de NgR, requieren la región completa de LRR de la proteina de NgR para la unión, pero no requieren la extremidad carboxilo de los residuos 310-450. Sin embargo, ?ß(1-28) desplazó la unión de ?ß-?? pero no la unión AP-Nogo-66 (1-33 ) o AP-O gp en los ensayos de competición. El péptido ?ß puede empezar a desplazar AP-MAG muy ligeramente a altas, concentraciones en nuestros experimentos. De esta manera, el sitio de unión de ?ße NgR parece bastante distinto de aquel para los ligandos de mielina NogoA, OMgp y MAG. Consistente con esto, la presencia de ?ß tiene poco efecto en mielina o la inhibición de Nogo-66 de la excreción de neurita. Ejemplo 4: NgR Mejora la Producción de ?ß Debido a que uno de los pasos críticos en el desarrollo de AD es la producción proteolítica de ?ß a partir de APP, se valoró el efecto de NgR en este procesamiento. Se transíectaron células HEK293T con NgR y se observó que el medio condicionado de estas células contiene un nivel bajo pero detectable de ?ß, que es comparable a aquel observado en una célula que expresa el imitante de FAD, APPs , indicando procesamiento incrementado de ß-secretasa. La presencia de NgR también incrementó el procesamiento de -secretasa como se indica por el hecho que también se incrementaron los niveles de sAPPa por la expresión de NgR. Para examinar el significado de la -interacción de NgR/?ß en el procesamiento de APP xn vivo, el transgen de APPs de ratones APPsw/PSEN-1 (DeltaE9) se cultivó en un fondo nulo de NgR. Se examinaron los extractos cerebrales para los niveles de ?ß y sAPPoc a los 3 meses de edad como sigue. Se extrajo el cerebro anterior con ácido fórmico 0.1M, se neutralizó con Tris y se clarificó por centrifugación a 10,000 x g. Los niveles de sAPPa se midieron en los extractos cerebrales por inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-APP 22C11 amino-terminal (Chemicon) y por inmunotransferencia con el anticuerpo anti-?ß (1-17) 6E10 (Chemicon). En comparación a ratones de control correspondidos en carnada, la ausencia de NgR reduce significativamente la producción tanto de ?ß como de sAPPa bajo condiciones fisiológicas. Estos resultados confirmaron que NgR tiene un papel en la formación incrementada de ?ß in vivo. Ejemplo 5: Péptido ?ß42 Fibrilogénico Facilita la Unión del Péptido ?ß a NgR Se examinó si la interacción entre NgR y el péptido ?ß tienen un papel en la formación de agregados. Se inmovilizó sNgR310 en placas de microtítulo y se aplicó ???^?3-?ß40 junto con el péptido ?ß42. Se cuantificó la Biotina-péptido ?ß40 unidos usando HRP de estreptavidina y se encontró que el incremento de la concentración del péptido ?ß42 mejoró la unión de Biotina-péptido ?ß40 de una manera dependiente de la dosis. Se confirmaron estos datos usando células S MC que expresan NgRl humano y de encontró que el péptido ?ß 2 mejoró nuevamente la unión de Biotina-péptido ?ß40 a las células de una manera dependiente de la dosis. También se encontró que los anticuerpos anti-NgR inhiben la mejora mediada por el péptido ?ß42 de la unión de Biotina-AP40 a las células SKNMC que expresan NgRl humano. Estos resultados indican que la interferencia con la interacción de NgR/péptido ?ß inhibe la formación de los agregados de péptido ?ß. Ejemplo 6: Tratamiento con un Antagonista de NgR Reduce el Depósito de Placas ?ß Para examinar el papel de las interacciones NgR/???/?ß in vivo, se dio por infusión sNgR310-Fc (un antagonista de NgR; ver solicitud de patente internacional PCT/US03/25004) en ratones transgénicos dobles APPsw/PSEN-l(DeltaE9) (de Jackson Laboratories). La proteina sNgR310-Fc contiene la unión de ligando de LRR completa del NgR fusionado a la porción Fe de IgG. Para administrar la proteína sNgR310-Fe, se anestesiaron ratones de 5 meces de edad con isoflurano/oxígeno y se perforó en el cráneo un agujero de taladro. Se introdujo una cánula (ALZET brain infusión kit II, Alza Scientific Products, Palo Alto, CA) en el ventrículo lateral derecho a las coordenadas estereotáxicas 0.6 mm posterior y 1.2 mm lateral a bregma y 4.0 mm de profundidad 'a la superficie pial. La cánula se mantuvo en su lugar con cianoacrilato y el catéter se unió a una minibom a osmótica subcutánea (Alzet 2ML4) . La bomba distribuyó 2.5 µ?/hr durante 28 días de una solución de 1.2 mg/ml de sNgR310-Fc o IgG de rata en PBS (ratones de control recibieron IgG de rata puesto que tanto el NgR como la porción Fe fueron de origen de rata) . Las bombas se reemplazaron después de 28 días y se conectaron a la misma cánula. La dosis total de proteína dada por infusión fue de 2.5 mg por ratón durante 56 días. Al final de este' periodo, se sacrificaron ratones y se midieron los niveles cerebrales de ?ß usando un equipo ELISA de Biosource International de acuerdo a las instrucciones del fabricante . Se valoró el depósito de ?ß en las placas amiloideas por inmunohistoquímica anti-?ß como sigue. Placas ?ß en secciones sagitales de cerebro fijado con paraformaldehído al 4% se detectaron inmunohistológicamente con el anticuerpo anti-?ß??-17)6E10 después del tratamiento con ácido fórmico 0.1 M para la recuperación de antígeno. Se cuantificó el área de placa usando imagen de NIH como un porcentaje del área cortical cerebral para 3 secciones de cada animal. En los ratones tratados con sNgR310-Fc, se redujo de manera significativa el depósito de ?ß inmunorreacti o en la placa. Además, el nivel total tanto de ?ß (1-40) como de ?ß{1-42) disminuyó por 50% en el cerebro de estos ratones. Hubo una correlación estrecha entre los niveles de ?ß y el depósito de placas amiloideas en estos ratones, sugiriendo que sNgR310-Fc altera el metabolismo de de ???/?ß a un mayor grado que la agregación de ?ß. Sin embargo, los presentes datos indican que la presencia de sNgR310-Fc disminuye tanto la producción de ?ß así como su depósito en las placas. El producto de -secretasa, sAPPa, también se midió por inmunoprecipitación y análisis de inmunotransferencia . Los niveles de sAPPa disminuyeron en los cerebros de los animales tratados con sNgR3lO-Fc a un grado similar como lo hicieron los niveles de ?ß demostrando que se inhiben tanto el procesamiento de oc-secretasa como de ß-secretasa por sNgR310-Fc in vivo. Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será evidente para aquellos expertos en la técnica en vista de las enseñanzas de esta invención que se pueden hacer ciertos cambios y modificaciones a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para reducir los niveles de péptido ?ß en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido soluble de receptor Nogo. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque los niveles del péptido ?ß están elevados en asociación con una enfermedad, trastorno, o condición. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque la enfermedad, trastorno o condición es enfermedad de Alzheimer. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el polipéptido soluble de receptor Nogo se administra por inyección de bolo o infusión crónica. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4 , caracterizado porque el polipéptido soluble de receptor Nogo se administra de forma intravenosa. 6. El método de conformidad con la reivindicación 4 , caracterizado porque el polipéptido soluble de receptor Nogo se administra directamente en el sistema nervioso central. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polipéptido soluble de receptor Nogo se administra directamente en un ventrículo lateral . 8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque el polipéptido soluble de receptor Nogo es una forma soluble de un NgRl de mamífero . 9. El método de conformidad con la reivindicación 8 , caracterizado porque la forma soluble de un NgRl de mamífero: a) comprende los aminoácidos 26 a 310 de NgRl de humano (SEQ ID NO: 3) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y b) carece de (i) un dominio de transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. 10. El método de conformidad con la reivindicación 8 , caracterizado porque la forma soluble de un NgRl de mamífero: a) comprende los aminoácidos 26 a 344 de NgRl de humano (SEQ ID NO: 4) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y b) carece de (i) un dominio dé transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. 11. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la forma soluble de un NgRl de mamífero: a) comprende los aminoácidos 27 a 310 de NgRl de rata (SEQ ID NO: 5) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y b) carece (i) un dominio transmembrana, funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. 12. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la forma soluble de un NgRl de mamífero: a) comprende los aminoácidos 27 a 344 de NgRl de rata (SEQ ID NO: 6) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. 13. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la forma soluble de un NgRl de mamífero comprende adicionalmente una porción de fusión. 1 . El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la porción de fusión es una porción de inmunoglobulina. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la porción de inmunoglobulina es una porción de Fe. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.001 mg/kg a 10 mg/kg. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.01 mg/kg a 1.0 mg/kg. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.05 mg/kg a 0.5 mg/kg. 19. Un método para prevenir o tratar una enfermedad, trastorno o condición asociada con las placas de péptido ?ß en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un antagonista de NgRl. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque las placas están en el sistema nervioso central . 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la enfermedad, trastorno o condición es enfermedad de Alzheimer. 22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizado porque el antagonista de NgRl se administra directamente en el sistema nervioso central . 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el antagonista de NgRl se administra directamente en un ventrículo lateral. 2 . El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el antagonista de NgRl se administra por inyección de bolo o infusión crónica. 25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizado porque el antagonista de NgRl comprende una forma soluble de un NgRl de mamífero. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la forma soluble de un NgRl de mamífero: a) comprende los aminoácidos 26 a 310 de NgRl de humano (SEQ ID NO: 3) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional y (ii) un péptido de señal funcional. 27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la forma soluble de un NgRl de mamífero: a) comprende los aminoácidos 26 a 344 de NgRl de humano (SEQ ID NO: 4) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional y (ii) un péptido de señal funcional. 28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la forma soluble de un NgRl de mamífero: a) comprende los aminoácidos 27 a 310 de NgRl de rata (SEQ ID NO: 5) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. 29. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la forma soluble de un NgRl de mamífero: a) comprende los aminoácidos 27 a 344 de NgRl de rata (SEQ ID NO: 6) con hasta diez sustituciones conservadoras de aminoácidos; y b) carece de (i) un dominio transmembrana funcional, y (ii) un péptido de señal funcional. 30. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la forma soluble de un NgRl de mamífero comprende adicionalmente una porción de fusión. 31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la porción de fusión es una porción de inmunoglobulina . 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la porción de inmunoglobulina es una porción de Fe. 33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizado porque el antagonista de NgRl comprende un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un NgRl de mamífero. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un fragmento Fab, un fragmento Fab' , un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento Fd, un diacuerpo, y un anticuerpo de cadena individual . 35. El método de conformidad con la reivindicación 33 , caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un polipéptido unido por un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de: HB7E11 (ATCC*® Número de acceso PTA-4587), HB1H2 (ATCC^ Número de acceso PTA-4584) , HB 3G5 (ATCC Número de acceso PTA-4586) , HB5B10 (ATCCm Número de acceso PTA-4588) y HB 2F7 (ATCC™ Número de acceso PTA-4585) . 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal se produce por el hibridoma HB7E11. 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 7); LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 8); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 9); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 10); LDLASDDAELR (SEQ ID NO: 11); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO.12); LDALSDDAELR (SEQ ID NO: 13); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 14); LDLSSDEAELR (SEQ ID NO: 15); DNAQLRWDPTT (SEQ ID NO-.16); DNAQLR (SEQ ID NO: 17); ADLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 18); LALSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 19); LDLSDNAALRWDPTT (SEQ ID NO: 20); LDLSDNAQLHWDPTT (SEQ ID NO: 21); y LDLSDNAQLAWDPTT (SEQ ID NO: 22) . 38. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque el polipéptido consiste de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 7); LDLSDNAQLR (SEQ ID NO: 8); LDLSDDAELR (SEQ ID NO: 9); LDLASDNAQLR (SEQ ID NO: 10);-LDLASDDAELR (SEQ ID NO: 11); LDALSDNAQLR (SEQ ID NO: 12); LDALSDDAELR (SEQ ID NO: 13); LDLSSDNAQLR (SEQ ID NO: 14); LDLSSDEAELR (SEQ ID NO: 15); DNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 16); DNAQLR (SEQ ID NO: 17); ADLSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 18); LALSDNAQLRWDPTT (SEQ ID NO: 19); LDLSDNAALRWDPTT (SEQ ID NO: 20); LDLSDNAQLHWDPTT (SEQ ID NO: 21); y LDLSDNAQLAWDPTT (SEQ ID NO: 22) . 39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizado porgue la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.001 mg/kg a 10 mg/kg. 40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.01 mg/kg a 1.0 mg/kg. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva es de 0.05 mg/kg a 0.5 mg/kg.