EA016193B1 - Антитела, направленные против бета-амилоидного пептида, и способы их использования - Google Patents

Abstract

Описаны антитела, направленные против С-концевого участка β-амилоидного пептида и способы использования этих антител для диагностики и лечения болезни Альцгеймера и связанных с пептидом Аβ заболеваний.

Description

По настоящей заявке испрашивается приоритет патентной заявки США серийный № 60/676093, поданной 29 апреля 2005 г., и патентной заявки США серийный № 60/704818, поданной 1 августа 2005 г., полное содержание из которых приведено здесь в качестве ссылки.

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к антителам к бета-амилоидному пептиду. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению таких антител для лечения и/или предупреждения заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.

Предпосылки изобретения

Болезнь Альцгеймера (АО) представляет собой дегенеративное повреждение мозга, клинически характеризующееся прогрессирующими нарушениями памяти, спутанностью сознания, постепенным физическим истощением и, в конечном счете, смертью. Во всем мире приблизительно 15 миллионов человек поражены болезнью Альцгеймера, и ожидают, что их число будет значительно увеличиваться с увеличением продолжительности жизни.

Гистологически заболевание характеризуется очагами неврита, обнаруживаемыми в первую очередь в ассоциативной зоне коры головного мозга, лимбической системе и базальных ганглиях. Основным компонентом этих очагов является бета-амилоидный пептид (Ав), являющийся продуктом расщепления белка-предшественника бета-амилоида (вАРР или АРР). АРР представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I, содержащий большой эктопический Ν-концевой домен, трансмембранный домен и малый цитоплазматический С-концевой хвост. Альтернативный сплайсинг транскрипта одного гена АРР на хромосоме 21 приводит к нескольким изоформам, которые отличаются числом аминокислот.

Ав, по-видимому, играет центральную роль в нейропатологии болезни Альцгеймера. Семейные формы заболевания сцеплены с мутациями в генах АРР и пресенилина (Ταηζί е! а1., 1996, №игоЬю1. Ώίδ. 3:159-168; Нагбу, 1996, Αηη. Меб. 28:255-258). Сцепленные с заболеванием мутации в этих генах приводят к увеличенной продукции формы Ав из 42 аминокислот, преобладающей формы, обнаруженной в амилоидных бляшках. Более того, иммунизация трансгенных мышей со сверхэкспрессией сцепленной с заболеванием мутантной формы АРР с использованием Ав человека уменьшает объем бляшек и связанных патологий (Бейепк е! а1., 1999, №11иге 400:173-177; АО 99/27944), а периферическое введение антител, направленных против Ав, также уменьшает объем бляшек в мозге (Вагб е! а1., 2000, №1Шге Меб1С1пе 6(8):916-919; АО 2004/032868; АО 00/72880).

Опубликовано, что Рс-опосредованный фагоцитоз микроглиальными клетками и/или макрофагами является важным в процессе очищения от бляшек ίη νίνο. Вагб е! а1., Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 100, 20232028 (2003). Однако опубликовано также, что неопосредованные Рс механизмы также вовлечены в клиренс амилоида-в ίη νίνο в результате иммунотерапии. Васвка е! а1., 1. №иго8ск 22:7873-7878 (2002); Эа5 е! а1., 1. Фигова. 23:8532-8538 (2003).

Таким образом, терапия антителами предоставляет многообещающий способ лечения и предупреждения болезни Альцгеймера. Однако клинические испытания на людях вакцины, содержащей Ав1-42, приостановлены из-за менингоэнцефалита в подгруппе пациентов. Οτ^ο^οζο е! а1., №тио1о§у 61:7-8 (2003); Реггег е! а1., Вташ Ра11ю1. 14:11-20 (2004). Опубликовано, что пассивная иммунизация специфическим к Ν-концу анти-Ав антителом приводит к значительному уменьшению большинства диффузного амилоида, однако индуцирует увеличение частоты церебральной микрогеморрагии у трансгенных мышей, обладающих связанными с возрастом развитием амилоидных бляшек и нейродегенерацией, так же как церебральной амилоидной ангиопатией (САА), сходными с наблюдаемыми в мозге человека с АО. РГебсг е! а1., БОенсе 298:1379 (2002). Предполагают, что обострение связанной с церебральной амилоидной ангиопатией (САА) микрогеморрагии у трансгенных по АРР мышей в результате пассивной иммунизации антителом, направленным против бета-амилоида, зависит от узнавания антителом депонированных форм бета-амилоидного пептида. Васке е! а1., 1. №иго8с1. 25:629-636 (2005). Чтобы уменьшить риск воспаления, предлагают пассивную иммунизацию антителами против пептидного компонента отложения амилоида, где антитела лишены Рс-областей. АО 03/086310. Остается необходимость в антителах и других иммунотерапевтических средствах, направленных против Ав, обладающих улучшенными показателями эффективности и безопасности, и подходящих для применения у пациентов-людей.

На всем протяжении данной заявки приведены ссылки на различные публикации (включая патенты и патентные заявки). Полное содержание этих публикаций приведено здесь в качестве ссылки.

Краткая сущность изобретения

Описанное здесь изобретение относится к антителам и полипептидам, связывающимся с С-концом пептида Ав. В одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу или полипептиду, связывающемуся с Ав1-40, Ав1-42 и Ав1-43, где антитело или полипептид связывается с Ав1-40 с более высокой аффинностью, чем аффинность его связывания с Ав1-42 и Ав1-43, и где антитело или полипептид связывается с эпитопом на Ав1_-40, содержащим аминокислоты 25-34 и 40. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с Ав1_-40 с аффинностью, по меньшей мере приблизительно в 40 раз превышающей аффинность его связывания с Ав1_-42 и/или Ав₁.₄₃. В некоторых вариантах осуществления антитело не является антителом 2294.

- 1 016193

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу 60 (взаимозаменяемо обозначенному 60). Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи 60 показаны на фиг. 1. Части определяющей комплементарность области (СЭР.) антитела 60 (включая СЭР. С1ю11на и КаЬа!) также показаны на фиг. 1.

В другом аспекте настоящее изобретение также относится к вариантам антитела 60 с аминокислотными последовательностями, показанными в табл. 3.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, содержащему фрагмент или область антитела 60 или его вариантов, показанных в табл. 3. В одном варианте осуществления фрагмент представляет собой легкую цепь антитела 60. В другом варианте осуществления фрагмент представляет собой тяжелую цепь антитела 60. В другом варианте осуществления фрагмент содержит одну или несколько вариабельных областей из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 60. В другом варианте осуществления фрагмент содержит одну или несколько вариабельных областей из легкой цепи и/или тяжелой цепи, показанных на фиг. 1. В другом варианте осуществления фрагмент содержит одну или несколько СЭР. из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 60.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к полипептидам (которые могут являться или не являться антителом), содержащим любое одно или несколько из следующего: а) одну или несколько СЭР. антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; Ь) СЭР. Н3 из тяжелой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в табл. 3; с) СЭР. Ь3 из легкой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; ά) три СЭР. из легкой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в табл. 3; е) три СЭР. из тяжелой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в табл. 3; Г) три СЭР. из легкой цепи и три СЭР. из тяжелой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в табл. 3. Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептидам (которые могут являться или не являться антителом), содержащим любое одно или несколько из следующего: а) одну или несколько (одну, две, три, четыре, пять или шесть) СЭР, полученных из антитела 60 или его вариантов, показанных в табл. 3; Ь) СЭР, полученную из СЭР. Н3 из тяжелой цепи антитела 60; и/или с) СЭР, полученную из СЭР. Ь3 из легкой цепи антитела 60. В некоторых вариантах осуществления СЭР. представляет собой СЭР, показанную на фиг. 1. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько СЭР, полученные из антитела 60 или его вариантов, показанных в табл. 3, являются по меньшей мере приблизительно на 85%, по меньшей мере приблизительно на 86%, по меньшей мере приблизительно на 87%, по меньшей мере приблизительно на 88%, по меньшей мере приблизительно на 89%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 91%, по меньшей мере приблизительно на 92%, по меньшей мере приблизительно на 93%, по меньшей мере приблизительно на 94%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98%, или по меньшей мере приблизительно на 99% идентичными по меньшей мере одной, по меньшей мере двум, по меньшей мере трем, по меньшей мере четырем, по меньшей мере пяти или по меньшей мере шести СЭР. 60 или его вариантов.

В некоторых вариантах осуществления СЭР. представляет собой СЭР. КаЬа!. В других вариантах осуществления СЭР. представляет собой СЭР. С1ю11на. В других вариантах осуществления СЭР. представляет собой сочетание СЭР. КаЬа! и С1ю11на (обозначаемое также комбинированная СЭР или расширенная СЭР.). Другими словами, для любого данного варианта осуществления, относящегося более чем к одной СЭР, СЭР. могут представлять собой любые из КаЬа!, С1ю11на и/или являться комбинированными.

В некоторых вариантах осуществления антитело по изобретению представляет собой антитело человека. В других вариантах осуществления антитело по изобретению представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело является моноклональным. В некоторых вариантах осуществления антитело (или полипептид) является выделенным. В некоторых вариантах осуществления антитело (или полипептид) является в основном чистым.

Константная область тяжелой цепи антител может происходить из любых типов константной области, таких как 1д0, 1дМ, 1дБ, 1дА и 1дЕ; и любых изотипов, таких как 1д01, 1д02, 1д03, и 1д04.

В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид, описанные здесь, обладают нарушенной эффекторной функцией. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид содержит константную область тяжелой цепи с нарушенной эффекторной функцией, где константная область тяжелой цепи содержит Рс-область. В некоторых вариантах осуществления удалено Νгликозилирование Рс-области. В некоторых вариантах осуществления Рс-область содержит мутацию внутри последовательности узнавания для Ν-гликозилирования, в результате чего Рс-область антитела или полипептида не является Ν-гликозилированной. В некоторых вариантах осуществления Рс-область является пегилированной. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела или полипептида представляет собой константную область тяжелой цепи 1д02а человека, содержащую следующие мутации: А330Р331 до 83308331 (нумерация аминокислот по отношению к последовательности 1д02а дикого типа). В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид содержит константную область 1д04, содержащую следующие мутации: Е233Р234Ь235 до Р233У2 34А235. Эти положения аминокислот основаны на нумерации КаЬа!.

- 2 016193

В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотиду (который может являться выделенным), содержащему полинуклеотид, кодирующий фрагмент или область антитела 60 или его вариантов, показанных в табл. 3. В одном варианте осуществления фрагмент представляет собой легкую цепь антитела 60. В другом варианте осуществления фрагмент представляет собой тяжелую цепь антитела 60. В другом варианте осуществления фрагмент содержит одну или несколько вариабельных областей из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 60. В другом варианте осуществления фрагмент содержит одну или несколько (т.е., одну, две, три, четыре, пять, шесть) определяющих комплементарность областей (СИЯ) из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 60.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к полинуклеотиду (который может являться выделенным), содержащему полинуклеотид, кодирующий антитело 60 или его варианты, показанные в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит один из двух или оба из полинуклеотидов, показанных на 8ЕЦ ΙΌ N0:9 и 8Е0 ΙΌ N0:10.

В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим любое из антител (включая фрагменты антитела) или полипептидов, описанных здесь.

В другом аспекте изобретение относится к векторам (включая экспрессирующие и клонирующие векторы) и клеткам-хозяевам, содержащим любой из полинуклеотидов, описанных здесь.

В другом аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид, кодирующий любое из антител, описанных здесь.

В другом аспекте изобретение относится к комплексу Αβ_1-40, связанного с антителом 60 или его вариантами, показанными в табл. 3.

В другом аспекте изобретение относится к комплексу Αβ_1-40, связанного с любым из антител или полипептидов, описанных здесь.

В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество любого из антител, полипептидов или полинуклеотидов, описанных здесь, и фармацевтически приемлемый наполнитель. В некоторых вариантах осуществления антитела или полипептиды содержат одну или несколько СЭЕ антитела 60.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения антитела 60, включающему в себя культивирование клетки-хозяина или ее потомства в условиях, позволяющих продукцию антитела 60, где клетка-хозяин содержит экспрессирующий вектор, кодирующий антитело 60; и в некоторых вариантах осуществления очистку антитело 60. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующий вектор содержит одну или обе из полинуклеотидных последовательностей, показанных на 8ЕЦ ΙΌ N0:9 и 8ЕС ΙΌ N0:10.

В другом аспекте изобретение относится к способам получения антител или полипептидов, описанных здесь, посредством экспрессии одного или нескольких полинуклеотидов, кодирующих антитело (которое можно экспрессировать отдельно как отдельную легкую или тяжелую цепь, или как легкую и тяжелую цепь, экспрессированные с одного вектора) или полипептид, в подходящей клетке, как правило, с последующим выделением и/или очисткой интересующих антитела или полипептидов.

Изобретение также относится к способу предупреждения, лечения, ингибирования или задержки развития болезни Альцгеймера и других заболеваний, связанных с измененной экспрессией Ар или вАРР, или накоплением пептида Ав, таких как синдром Дауна, болезнь Паркинсона, мультиинфарктная деменция, синдром умеренных когнитивных нарушений, церебральная амилоидная ангиопатия, депрессия, болезнь Крейтцфельда-Якоба, деменция с тельцами Леви и СПИД. Способ включает в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по изобретению.

Изобретение также относится к способу задержки развития симптома, связанного с болезнью Альцгеймера или другими заболеваниями, связанными с накоплением пептида Ав у субъекта, включающему в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по изобретению.

Изобретение относится также к способу подавления формирования амилоидных бляшек и/или накопления амилоида у субъекта, включающему в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по изобретению. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге (ткани мозга) субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга. В других вариантах осуществления накопление амилоида присутствует в системе кровообращения.

Изобретение относится также к способу уменьшения амилоидных бляшек и/или накопления амилоида у субъекта, включающему в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге (ткани мозга) субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга. В других вариантах осуществления накопление амилоида присутствует в системе кровообращения.

Изобретение относится также к способу удаления амилоидных бляшек и/или накопления амилоида

- 3 016193 у субъекта или очистки от них, включающему в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по изобретению. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге (ткани мозга) субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга. В других вариантах осуществления накопление амилоида присутствует в системе кровообращения.

Кроме того, изобретение относится к способу ингибирования накопления пептида Άβ в ткани, включающему в себя контактирование ткани с антителом или полипептидом по настоящему изобретению.

Изобретение относится также к способу уменьшения уровня пептида Άβ (например, в растворимой, олигомерной и депонированной форме) у субъекта, включающему в себя введение субъекту эффективного количества антитела, полипептида или полинуклеотида по изобретению. В некоторых вариантах осуществления накопление пептида Άβ ингибируют и/или уменьшают в мозге. В некоторых вариантах осуществления ингибируют и/или уменьшают токсические эффекты пептида Άβ. Таким образом, способ по настоящему изобретению можно использовать для лечения любого заболевания, при котором присутствует, или при котором предполагают накопление пептида Άβ, такого как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, болезнь Паркинсона, мультиинфарктная деменция, синдром умеренных когнитивных нарушений, церебральная амилоидная ангиопатия, депрессия, болезнь Крейтцфельда-Якоба или деменция с тельцами Леви.

Изобретение относится также к способам улучшения когнитивных функций или обращения когнитивного ухудшения, связанного с заболеваниями, связанными с амилоидным отложением Άβ у субъекта, такими как болезнь Лльцгеймера. включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид по настоящему изобретению.

Любые антитела, полипептиды или полинуклеотиды, описанные здесь, можно применять в способах по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело 60.

Кроме того, антитела и полипептиды по изобретению можно использовать для выявления, диагностики и мониторирования болезни Άльцгеймера и других заболеваний, связанных с измененной экспрессией Άβ или βΆΡΡ, таких как синдром Дауна и СПИД. Способ включает в себя контактирование образца от пациента, подозреваемого в наличии измененной экспрессии Άβ или βΆΡΡ, с антителом по изобретению и определение, отличается ли уровень Άβ или βΆΡΡ от уровня в контрольном или сравнительном образце. В некоторых вариантах осуществления уровень Άβ в сыворотке измеряют до и после введения анти-Άβ антитела; и оценивают любое увеличение уровня Άβ в сыворотке.

Введение любого антитела или полипептида по изобретению можно осуществлять любыми способами, известными в данной области, включая: внутривенно, подкожно, посредством ингаляции, внутриартериально, внутримышечно, интракардиально, интравентрикулярно, парентерально, интратекально и внутрибрюшинно. Введение может являться системным, например внутривенным или местным. Это также относится в общем к полипептидам и полинуклеотидам по настоящему изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к наборам и композициям, содержащим одну или несколько из композиций, описанных здесь. Эти наборы, как правило, в подходящих упаковках и снабженные соответствующими инструкциями являются применимыми в любом из способов, описанных здесь.

Краткое описание некоторых изображений на чертеже (чертежах)

На фиг. 1 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (8Е0 ГО N0:1) и вариабельной области легкой цепи (8Е0 ГО N0:2) антитела 60. СИК КаЬа! показаны жирным текстом, а СИЯ СЬо!Ыа подчеркнуты. Άминокислотные остатки вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи пронумерованы последовательно.

На фиг. 2 показано картирование эпитопов антитела 60 посредством ЕЬ18А. Пептиды Άβ (1-16, 128, 17-40, 17-42, 22-35, 28-40, 28-42, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43 и 33-40) иммобилизовали на планшетах для ЕЫ8А. Моноклональное антитело 60 (20 нМ) инкубировали в течение 1 ч с различными иммобилизованными пептидами. Связывание антитела 60 с иммобилизованными пептидами Άβ измеряли с использованием вторичного антитела козы против каппа человека, конъюгированного с НКР.

На фиг. 3 показано картирование эпитопов антитела 60 посредством ЕЫ8А. Различные пептиды Άβ (обозначенные 8Е0 ГО N0:18-29 сверху вниз последовательности) иммобилизовали на планшетах для ЕЫ8А. Άнтитело 60 инкубировали в течение 1 ч с различными иммобилизованными пептидами. Связывание антитела 60 с иммобилизованными пептидами Άβ измеряли с использованием вторичного антитела козы против каппа человека, конъюгированного с НКР. ΝΒ обозначает отсутствие выявленного связывания.

Фиг. 4 представляет собой схематический чертеж, показывающий эпитоп, с которым антитело 60 связывается на Άβ. Показаны относительные положения Άβ на белке-предшественнике амилоида (ΆΡΡ) и часть ΆΡΡ на мембране клетки. СТ99 обозначает 99 С-концевых аминокислот ΆΡΡ. Показанная аминокислотная последовательность обозначена 8Е0 ГО N0:30.

Фиг. 5 представляет собой фотографию, показывающую иммунное окрашивание экспрессирующих

- 4 016193

АРР клеток с помощью моноклонального антитела, направленного против Αβι_ι₆ (т2324) и антитела 6С. На верхних панелях показаны клетки под флуоресцентным микроскопом после того, как клетки инкубировали с т2324 или 60 (5 мкг/мл каждое) и окрашивали вторичным СуЗ-конъюгированным антителом козы против антител мыши или против антител человека. На нижних панелях показаны клетки, наблюдаемые под микроскопом.

На фиг. 6 показано картирование эпитопов антител 2294 и 60 посредством ЕЬЧ8А. Различные пептиды Ав (обозначенные 8Е0 Ш N0:18-26, 31, и 27-29 сверху вниз последовательности) иммобилизовали на планшетах для ЕЫ8А. Антитела инкубировали в течение 1 ч с различными иммобилизованными пептидами. Связывание антитела 60 с иммобилизованными пептидами Ав измеряли с использованием конъюгированного с НИР вторичного антитела козы против каппа человека. Связывание антитела 2294 с иммобилизованными пептидами Ав измеряли с использованием антитела козы против антител мыши, которое связывает и тяжелую, и легкую цепь, и представляет собой вторичное антитело, конъюгированное с НИР. ΝΒ обозначает отсутствие выявленного связывания. Числами в колонках под 2294 и 60 представлено поглощение при 450 нм.

Подробное описание изобретений

Описанное здесь изобретение относится к антителам и полипептидам, которые связываются с Сконцом Ав. Изобретение относится также к полинуклеотидам, кодирующим эти антитела и/или полипептиды. Изобретение относится также к способам получения и использования этих антител и полипептидов.

Изобретение относится также к способам лечения или предупреждения у субъекта заболеваний, связанных с отложением β-амилоида у индивидуума, таких как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, мультиинфарктная деменция, синдром умеренных когнитивных нарушений, церебральная амилоидная ангиопатия, депрессия, болезнь Крейтцфельда-Якоба и деменция с тельцами Леви, посредством введения субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид, кодирующие антитело или полипептид, описанные здесь.

Общие способы

В практике изобретения, если нет иных указаний, будут применять общепринятые способы молекулярной биологии (включая рекомбинантные способы), микробиологии, клеточной биологии, биохимии и иммунологии, находящиеся в компетенции специалистов в данной области. Такие способы в полной мере описаны в литературе, такой как Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Мапиа1, кесоиФ еФйюи (8ашЬгоок с! а1., 1989) Со1Ф 8ргшд НагЬог

Ргекк; 011доиис1ео11Фе 8уи1йек1к (МЛ. 0ай, еФ. , 1984); Ме!йоФк ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Нитаиа Ргекк; Се11 Вю1оду: А ЬаЬога!огу №1еЬоок (ТЕ. СеШк, еФ., 1998) АсаФетю Ргекк; Ашта1 Се11 Си1!иге (К.1. Егекйиеу, еФ., 1987); ЧиФоФисйои !о Се11 аиФ ТЧккие Си1!иге (1.Р. Ма1йег аиФ Р.Е. КоЬейк, 1998) Р1еиит Ргекк; Се11 аиФ ТЧккие Сийиге: ЬаЬога!огу РгосеФигек (А. Ооу1е. ТВ. 0пГГййк, аиФ Ό.0. №\\ό11, еФк., 1993-1998) Ч. \УПеу аиФ 8оик; Ме!йоФк ш Епхуто1оду (АсаФетю Ргекк, 1ис.); НаиФЬоок оГ Ехрептеи!а1 1ттиио1оду (И.М. \Уей аиФ С.С. В1аскте11, еФк.); 0еие ТгаикГег Уес1огк Гог МаттаНаи Се11к (Ч.М. МФ1ег аиФ М.Р. Са1ок, еФк., 1987); Сиггеи! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (Е.М. АикиЬе1 е! а1., еФк., 1987); РСК: Тйе Ро1утегаке Сйаш Кеасйои, (МиШк е! а1., еФк., 1994); Сиггеи! Рго!осо1к ш 1ттиио1оду (ТЕ. Сойдаи е! а1. , еФк., 1991); 8йог1 Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду (\УФеу аиФ 8оик, 1999); ЧттииоЬю1оду (С.А. Чаие^ау аиФ Р. Тгауегк, 1997); АиФЬоФЧек (Р. Ешсй, 1997); АиФЬоФЧек: а ргасйсаЧ арргоасй (Ό. Са!!у., еФ. , ЧКИ Ргекк, 1988-1989); Моиос1оиа1 аиФЬоФЧек: а ргас!юа1 арргоасй (Р. 8йерйегФ аиФ С. Оеаи, еФк., ОхГогФ Ишуегкйу Ргекк, 2000); Икшд аиФЬоФЧек: а 1аЬога!огу таииа1 (Е. Наг1о\\' аиФ Ό. Ьаие (Со1Ф 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, 1999) ; Тйе АиФЬоФЧек (М. ΖηικΙΙί аиФ 4.Ό. Сарга, еФк., НапгооФ АсаФетю РиЬйкйегк, 1995).

Определения

Антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную специфически связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид, и т.д., посредством по меньшей мере одного участка узнавания антигена, локализованного в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Как применяют здесь, термин охватывает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, но также их фрагменты (такие как ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')₂, Εν), одноцепочечные антитела (8сЕу), их мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, содержащую участок узнавания антигена. Антитело включает в себя антитело любого класса, такое как 1д0, 1дА или 1дМ (или их подкласса), и антитело не должно принадлежать какому-либо конкретному классу. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена тяжелых цепей антитела, иммуноглобулины можно отнести к различным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: 1дА, ЧдО, 1дЕ, 1д0 и 1дМ, и некоторые из них можно далее разделить на подклассы (изотипы), например, 1д01, 1д02, 1д03, 1д04, 1дА1 и 1дА2. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, названы альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Субъединичные структуры и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

Как применяют здесь, моноклональное антитело относится к антителу, полученному из популя

- 5 016193 ции в основном гомогенных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направлены против одного участка антигена. Более того, в отличие от препаратов поликлональных антител, как правило, содержащих различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. Определение моноклональные указывает на характер антитела как полученного, по существу, из гомогенной популяции антител, и его не следует истолковывать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения по настоящему изобретению можно получить способом гибридомы, первоначально описанным КоЫег апб Μίΐδίοίη. 1975, Ыа1иге, 256:495, или можно получить способами рекомбинантной ДНК, такими как описанные в патенте США № 4816567. Моноклональные антитела можно также выделить из фаговых библиотек, полученных с использованием способов, описанных, например, в МсСаГГейу е1 а1., 1990, Ыа1иге, 348:552-554.

Как используют в настоящем описании, гуманизированные антитела относятся к формам не относящихся к человеку (например, мышиных) антител, представляющих собой специфические химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи, или их фрагменты (такие как Ρν, РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂ или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), содержащим минимальную последовательность, полученную из не относящегося к человеку иммуноглобулина. Большей частью гуманизированные антитела представляют собой иммуноглобулины человека (антитело-реципиент), в которых остатки из определяющей комплементарной области (СЭЯ) реципиента заменяют остатками из СЭК. не относящихся к человеку видов (антитело-донор), таких как мышь, крыса или кролик, обладающими желаемой специфичностью, аффинностью и емкостью. В некоторых случаях остатки каркасной области (РЯ) иммуноглобулина человека заменяют соответствующими не присутствующими у человека остатками. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, не обнаруженные ни в антителереципиенте, ни в импортированных последовательностях СЭК. или каркаса, но включенные для дополнительного усовершенствования и оптимизации характеристик антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит в основном все по меньшей мере из одного, и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или в основном все из областей СЭЯ, соответствующих областям не относящегося к человеку иммуноглобулина, и все или в основном области РЯ являются областями с консенсусной последовательностью иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело, не обязательно, содержит по меньшей мере часть константной области или домена (Рс) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Антитела могут обладать Рс-областями, модифицированными, как описано в \УО 99/58572. Другие формы гуманизированных антител обладают одной или несколькими СЭЯ (одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью), измененными по отношению к исходному антителу, которые обозначают также одной или несколькими СЭЯ полученными из одной или нескольких СЭЯ из исходного антитела.

Как применяют здесь, антитело человека обозначает антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности антитела, продуцируемого человеком и/или полученное с применением любого из способов получения антител человека, известных в данной области или описанных здесь. Данное определение антитела человека включает в себя антитела, содержащие по меньшей мере один полипептид тяжелой цепи человека или по меньшей мере один полипептид легкой цепи человека. Одним из таких примеров является антитело, содержащее полипептиды легкой цепи мыши и тяжелой цепи человека. Антитела человека можно получить с использованием различных способов, известных в данной области. В одном варианте осуществления антитело человека отбирают из фаговой библиотеки, где эта фаговая библиотека экспрессирует антитела человека (Уаидйап е1 а1. , 1996, №1иге Вю!есйпо1оду, 14:309-314; Бйеек е! а1., 1998, ΡΝΑ8, (И8А) 95:6157-6162; НоодепЬоот апб ^ш!ег, 1991, 1. Мо1. Вю1., 227:381; Магкк е! а1., 1991, 1. Мо1. Вю1., 222:581). Антитела человека можно также получить введением локуса иммуноглобулина человека трансгенным животным, например, мышам, у которых эндогенные гены иммуноглобулинов являются частично или полностью инактивированными. Этот способ описан в патентах США N0. 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016. Альтернативно, антитело человека можно получить иммортализацией В-лимфоцитов, продуцирующих антитело, направленное против антигена-мишени (такие В-лимфоциты можно выделить из индивидуума, или их можно иммунизировать ш νίΐτο). См., например, Со1е е! а1., Мопос1опа1 . Ап!1Ьоб1е8 апб Сапсег Тйегару, А1ап Я. Ьщ8, р. 77 (1985); Воегпег е! а1., 1991, 1. 1ттипо1., 147 (1):86-95; и патент США Νο. 5750373.

Как применяют здесь, термины 6С и антитело 6С используют как взаимозаменяемые для обозначения антитела, обладающего аминокислотной последовательностью тяжелой цепи, показанной на 8ЕО Ш N0:11, и аминокислотной последовательностью легкой цепи, показанной на 8ЕО Ш N0:12. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи показаны на фиг. 1. Части СОЯ антитела 6С (включая СЭЯ ΓΊιοΙΙιίη и КаЬа!) схематически представлены на фиг. 1. Полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепь, показаны на 8Е0 Ш N0:13 и 8Е0 Ш N0:14. Характеризация 6С описана в примерах.

Термины полипептид, олигопептид, пептид и белок используют здесь как взаимозаменяе

- 6 016193 мые для обозначения полимеров из аминокислот любой длины. Полимер может являться линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и его можно прерывать не аминокислотами. Термины охватывают также аминокислотный полимер, модифицированный естественным образом или посредством вмешательства; например, формированием дисульфидной связи, гликозилированием, введением липида, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, такой как конъюгация с меченным компонентом. В определение входят также, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты, и т.д.), также как другие модификации, известные в данной области. Понятно, что, поскольку полипептиды по настоящему изобретению основаны на антителе, полипептиды могут присутствовать в форме отдельных цепей или связанных цепей.

Полинуклеотид или нуклеиновая кислота используют здесь взаимозаменяемо для обозначения полимеров из нуклеотидов любой длины, включая ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который можно включать в полимер посредством ДНК- или РНКполимеразы. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Модификацию структуры нуклеотида, если она присутствует, можно вводить до или после сборки полимера. Последовательность нуклеотидов можно прерывать не относящимися к нуклеотидам компонентами. Полинуклеотид можно дополнительно модифицировать после полимеризации, например, посредством конъюгации с меченным компонентом. Другие типы модификации включают в себя, например, кэпы, замену одного или нескольких природных нуклеотидов аналогами, межнуклеотидные модификации, например, такие как модификации с незаряженными связями (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), модификации, содержащие боковые группы, например, такие как белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-Ь-лизин, и т.д.), модификации, содержащие интеркалирующие вещества (например, акридин, псорален и т.д.), модификации, содержащие хелаторы (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, окислительные металлы и т.д.), модификации, содержащие алкиляторы, модификации с модифицированными связями (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты, и т.д.), также как немодифицированные формы полинуклеотида(полинуклеотидов). Кроме того, любые из гидроксильных групп, обычно присутствующих на сахарах, можно заменить, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защитить общепринятыми защитными группами или активировать для получения дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или можно конъюгировать с твердыми подложками. 5'- и З'-концевой ОН можно фосфорилировать или замещать аминами или молекулами органических кэппирующих групп от 1 до 20 атомов углерода. Другие гидроксилы также можно дериватизировать общепринятыми защитными группами.

Полинуклеотиды могут также содержать формы аналогов сахаров рибозы или дезоксирибозы, которые широко известны в данной области, включая, например, 2'-О-метил-, 2'-О-аллил, 2'-фтор- или 2'азидорибозу, карбоциклические аналоги сахаров, α-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как сахара арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозу, фуранозу, седогептулозы, ациклические аналоги и абазические аналоги нуклеозидов, такие как метилрибозид. Одну или несколько фосфодиэфирных связей можно заменить альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают в себя в качестве неограничивающих примеров варианты осуществления, где фосфат заменяют Р(О)8 (тиоат), Р(8)8 (дитиоат), (Ο)ΝΚ₂ (амидат), Р(О)В, Р(О)ОВ', СО или СН₂ (формацеталь), в которых каждый из

В или К.' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный алкил (1-20 С); необязательно, содержащий простую эфирную (-О-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Нет необходимости, чтобы все связи в полинуклеотиде являлись идентичными. Предшествующее описание относится ко всем полинуклеотидам, перечисленным здесь, включая РНК и ДНК.

Вариабельная область антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или к вариабельной области тяжелой цепи антитела, либо по отдельности, либо в сочетании. Каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных областей (РВ), соединенных тремя определяющими комплементарность областями (СЭВ), известными также как гипервариабельные области. СЭВ в каждой цепи удерживаются вместе в близком соседстве посредством РВ и, вместе с СЭВ из другой цепи, участвуют в формировании антигенсвязывающего участка антител. Существует по меньшей мере два способа определения СЭВ: (1) способ на основе межвидовой вариабельности последовательности (т.е., КаЬа( е( а1. 8сцисисс5 о£ Рго(еш§ о£ 1тпшпо1ощса1 1п(сгсь1, (5(11 еб. , 1991, Ναΐίοηαΐ 1п8(йи(е8 о£ Неа1(11. Ве(йе§ба ΜΌ)); и (2) способ на основе кристаллографических исследований комплексов антиген-антитело (ΛΙ-ΙαζίΚαηί е( а1 (1997) 1. Мо1ес. Вю1. 273:927-948)). Как применяют здесь, СЭВ может относится к СЭВ, определяемым посредством любого из способов, или посредством сочетания обоих способов.

Константная область антитела обозначает константную область легкой цепи антитела или константную область тяжелой цепи антитела, либо по отдельности, либо в сочетании.

- 7 016193

Эпитоп, который избирательно связывается или специфически связывается (применяют здесь взаимозаменяемо) с антителом или полипептидом, представляет собой термин, хорошо известный в данной области, и способы для определения такого специфического или избирательного связывания также хорошо известны в данной области. Говорят, что для молекулы показали специфическое связывание или избирательное связывание, если она реагирует или связывается более часто, более быстро, с большей продолжительностью и/или с большей аффинностью с конкретной клеткой или веществом, чем с альтернативными клетками или веществами. Антитело специфически связывается или избирательно связывается с мишенью, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, более быстро, и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими веществами. Например, антитело, которое специфически или избирательно связывается с эпитопом Αβι_-40, представляет собой антитело, которое связывает этот эпитоп с большей аффинностью, авидностью, более быстро, и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими эпитопами Αβι_-40 или не относящимися к Αβι_-40 эпитопами. Из чтения данного определения понятно также, что, например, антитело (или группа, или эпитоп), которое специфически или избирательно связывается с первой мишенью, может специфически или избирательно связываться, или не связываться, со второй мишенью. Как таковое, специфическое связывание или избирательное связывание не обязательно требует (хотя может включать в себя) исключительное связывание. Как правило, однако не обязательно, ссылка на связывание означает избирательное связывание.

Как применяют здесь, по существу, чистый относится к веществу, являющемуся по меньшей мере на 50% чистым (т.е., свободным от загрязнений), более предпочтительно по меньшей мере на 90% чистым, более предпочтительно, по меньшей мере на 95% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 98% чистым, более предпочтительно по меньшей мере на 99% чистым.

Клетка-хозяин включает в себя отдельную клетку или культуру клеток, которая может являться или является реципиентом для вектора(векторов) для введения полинуклеотидных вставок. Клеткихозяева включают в себя потомство отдельной клетки-хозяина, и потомство не обязательно является полностью идентичным исходному родителю (по морфологии или по комплементарности геномной ДНК) из-за природной, случайной или намеренной мутации. Клетка-хозяин включает в себя клетки, трансфицированные ίη νίνο полинуклеотидом(полинуклеотидами) по настоящему изобретению.

Термин Те-область применяют для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. Те-область может представлять собой природную последовательность Те-области или вариант Те-области. Хотя границы Тс-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут меняться, Тс-область тяжелой цепи 1дС человека обычно обозначают как простирающуюся от аминокислотного остатка в положении Сук226, или от Рго230, до ее С-конца. Нумерация остатков в Тс-области представляет собой нумерацию по индексу ЕЙ, как в КаЬа(. КаЬа! е( а1., 8сс.|испсс5 о£ Рго1еш8 о£ 1типо1од1са1 1п1сгс51. 5(11 Еб. РиЫю Неа1(11 8еМсе, Иа1юпа1 1п8(Ш.1(е8 о£ НеаНй, ВеШекба, Мб., 1991. Тс-область иммуноглобулина, как правило, содержит два константных домена, СН2 и СН3.

Как применяют здесь, Тс-рецептор и ТсК обозначает рецептор, связывающийся с Тс-областью антитела.

Предпочтительный ТсК. представляет собой природную последовательность ТсК человека. Более того предпочтительным ТсК является тот, который связывается с антителом 1дС (гамма-рецептор) и включает в себя рецепторы подклассов ТсуК1, ТсуКП и ТсуКШ, включая аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. Рецепторы ТсуКП включают в себя ТсуК11А (активирующий рецептор) и ТсуКПВ (ингибирующий рецептор), обладающие сходными аминокислотными последовательностями, различающимися в первую очередь их цитоплазматическими доменами. Обзор ТсК приведен в Кате(с11 апб Кше1, 1991, Апп. Кет. 1ттипо1., 9:457-92; Саре1 е( а1., 1994, 1ттипоте1йоб8, 4:2534; и бе Наак е( а1., 1995, 1. ЬаЬ. С1ш. Меб., 126:330-41. ТсК включает в себя также неонатальный рецептор, ТсКп, ответственный за перенос материнских 1дС плоду (Оиуег е( а1., 1976, 1. 1ттипо1., 117:587; и К1т е( а1., 1994, 1. 1ттипо1., 24:249).

Комплементзависимая цитотоксичность и СЭС обозначают лизис мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента запускается связыванием первого компонента системы комплемента (С.'1с.|) с молекулой (например, антителом), образовавшей комплекс с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ СЭС, например, как описано в Саххапо-8ап(ого е( а1., 1. 1ттипо1. МеШобк, 202:163 (1996).

Функциональная Тс-область обладает по меньшей мере одной эффекторной функцией природной последовательности Тс-области. Примеры эффекторных функций включают в себя связывание С 1с.|; комплементзависимую цитотоксичность (СЭС); связывание Тс-рецептора; антителозависимую опосредуемую клетками цитотоксичность (АЭСС); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов поверхности клеток (например В-клеточного рецептора; ВСК) и т.д. Такие эффекторные функции, как правило, требуют объединения Тс-области со связывающим доменом (например, с вариабельным доменом антитела), и их можно оценить с использованием различных анализов, известных в данной области для оценки таких эффекторных функций антитела.

- 8 016193

Природная последовательность Ре-области включает в себя аминокислотную последовательность, идентичную с аминокислотной последовательностью Рс-области, обнаруженной в природе. Вариант Рсобласти включает в себя аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности природной последовательности Рс-области в силу по меньшей мере одной модификации аминокислоты, еще сохраняющую по меньшей мере одну эффекторную функцию природной последовательности Рс-области. Предпочтительно, вариант Рс-области обладает по меньшей мере одной аминокислотной заменой по сравнению с природной последовательностью Рс-области или с Рс-областью родительского полипептида, например, от приблизительно одной до приблизительно десяти аминокислотных замен и предпочтительно от приблизительно одной до приблизительно пяти аминокислотных замен в природной последовательности Рс-области или в Рс-области родительского полипептида. Вариант Рс-области здесь предпочтительно будет обладать по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью последовательности с природной последовательностью Рс-области и/или с Рс-областью родительского полипептида и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью последовательности с ними, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательности с ними.

Как применяют здесь антителозависимая опосредуемая клетками цитотоксичность и ЛИСС обозначает опосредуемую клетками реакцию, при которой неспецифические цитотоксические клетки, экспрессирующие Рс-рецепторы (РсЯ) (например, натуральные клетки-киллеры (ΝΚ), нейтрофилы и макрофаги) узнают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. Активность интересующей молекулы в ЛЭСС можно оценить с использованием анализа АЭСС ίη νίίτο, такого как описан в патентах США Νο. 5500362 или 5821337. Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и ΝΚ-клетки. Альтернативно или дополнительно, активность интересующей молекулы в АЭСС можно оценить ίη νίνο, например, в модели на животных, такой как описанная в Оупсх с1 а1., 1998, ΡΝΑ8 (И8А), 95:652-656.

Как применяют здесь, эффективная доза или эффективное количество лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для получения благоприятных или желаемых результатов. В случае профилактического использования благоприятные или желаемые результаты включают в себя такие результаты, как исключение или уменьшение риска, снижение тяжести, или отсрочка дебюта заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие во время развития заболевания. В случае терапевтического использования благоприятные или желаемые результаты включают в себя такие клинические результаты, как ингибирование, подавление или уменьшение формирования амилоидных бляшек, уменьшение, удаление амилоидных бляшек, очистка от них, улучшение когнитивных функций, обращение или замедление когнитивных нарушений, секвестрирование или увеличение количества растворимого пептида Ав, циркулирующего в биологических жидкостях, уменьшение одного или нескольких симптомов, возникающих в результате заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие во время развития заболевания, увеличение качества жизни страдающих заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, усиление эффекта другого лекарственного средства, задержка прогрессирования заболевания, и/или продление выживаемости пациентов. Эффективную дозу можно вводить одним или несколькими введениями. Для целей по настоящему изобретению эффективная доза лекарственного средства, соединения, или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для осуществления профилактического или терапевтического лечения, либо напрямую, либо опосредованно. Как понятно в клиническом контексте, эффективной дозы лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции можно достигать в объединении или не в объединении с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, эффективную дозу можно рассматривать в контексте введения одного или нескольких лекарственных средств, и можно рассматривать отдельное средство как введенное в эффективном количестве, если, в объединении с одним или несколькими другими средствами, можно быть достигнут или достигнут желаемый результат.

Как применяют здесь, лечение или обработка представляет собой способ получения благоприятных или желаемых результатов, включая клинические результаты. Для целей по настоящему изобретению благоприятные или желаемые клинические результаты включают в себя в качестве неограничивающих примеров одно или несколько из следующего: ингибирование, подавление или уменьшение формирования амилоидных бляшек, уменьшение, удаление амилоидных бляшек или очистка от них, улучшение когнитивных функций, обращение или замедление когнитивных нарушений, секвестрирование растворимого пептида Ав, циркулирующего в биологических жидкостях, уменьшение количества пептида Ав (включая растворимый, олигомерный и депонированный) в ткани (такой как мозг), ингибирование, замедление и/или уменьшение накопления пептида Ав в мозге, ингибирование, замедление и/или

- 9 016193 уменьшение токсических эффектов пептида Αβ в ткани (такой как мозг), уменьшение симптомов, возникающих в результате заболевания, увеличение качества жизни страдающих заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, задержка прогрессирования заболевания, и/или продление выживаемости пациентов.

Как применяют здесь, задержка развития болезни Альцгеймера означает откладывание, затруднение, замедление, торможение, стабилизацию и/или отсрочку развития заболевания. Эта задержка может продолжаться различные периоды времени, в зависимости от истории заболевания и/или подлежащего лечению индивидуума. Как очевидно специалисту в данной области, достаточная или значительная задержка может, в сущности, включать в себя предупреждение, при котором у индивидуума не развивается заболевание. Способ задержки развития болезни Альцгеймера представляет собой способ уменьшения вероятности развития заболевания в заданный интервал времени и/или снижения тяжести заболевания в заданный интервал времени по сравнению с не использованием способа. Такие сравнения, как правило, основаны на клинических исследованиях с использованием статистически значимого числа субъектов.

Развитие болезни Альцгеймера означает дебют и/или прогрессирование болезни Альцгеймера у индивидуума. Развитие болезни Альцгеймера можно детектировать с использованием общепринятых клинических способов, как описано здесь. Однако развитие относится также к прогрессированию заболевания, которое первоначально может не поддаваться детекции. Для целей по настоящему изобретению прогрессирование относится к биологическому курсу состояния заболевания, в данном случае, как определяют посредством общепринятого неврологического осмотра или опроса пациента, или как можно определить посредством более специализированного тестирования. Множество этих диагностических тестов включают в себя в качестве неограничивающих примеров, нейровизуализацию, выявление изменений уровней конкретных белков в сыворотке или спинномозговой жидкости (например, амилоидных пептидов и Таи), компьютерную томографию (СТ) и магнитно-резонансную томографию (МК1). Развитие включает в себя возникновение, рецидив и дебют. Как применяют здесь, дебют или возникновение болезни Альцгеймера включает в себя первичный дебют и/или рецидив.

Как применяют здесь, введение в сочетании включает в себя одновременное введение и/или введение в разное время. Введение в сочетании также охватывает введение в виде совместного состава или введение в качестве отдельных композиций. Как применяют здесь, введение в сочетании предназначено, чтобы охватывать любые условия, при которых индивидууму вводят анти-Ав антитело и другое средство, что может происходить одновременно и/или по отдельности. Как обсуждают здесь далее, понятно, что анти-Ав антитело и другое средство можно вводить с различными частотами или интервалами дозирования. Например, анти-Ав антитело можно вводить раз в неделю, в то время как другое средство можно вводить менее часто. Понятно, что анти-Ав антитело и другое средство можно вводить с использованием одного и того же способа введения или разных способов введения.

Биологический образец включает в себя множество типов образцов, полученных от индивидуума, и его можно использовать в диагностическом или контролирующем анализе. Определение охватывает кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, образцы твердой ткани, такие как образец после биопсии, или культуры тканей или клеток, полученные из них, и их потомство. Определение включает в себя также образцы, подвергаемые после их получения любым манипуляциям, таким как обработка реагентами, солюбилизация, или обогащение конкретными компонентами, такими как белки или полинуклеотиды, или погружение в полутвердое или твердое связующее с целью получения срезов. Термин биологический образец охватывает клинический образец и включает в себя также клетки в культуре, супернатанты клеток, лизаты клеток, сыворотку, плазму, биологическую жидкость и образцы ткани.

Субъект (альтернативно обозначаемый индивидуум) представляет собой млекопитающее, более предпочтительно человека. Млекопитающие также включают в себя в качестве неограничивающих примеров, сельскохозяйственных животных (таких как коровы), спортивных животных, домашних животных (таких как кошки, собаки, лошади), приматов, мышей и крыс.

Как применяют здесь, вектор обозначает конструкцию, способную доставлять и предпочтительно экспрессировать один или несколько интересующих ген(ов) или последовательность (последовательностей) в клетке-хозяине.

Векторы включают в себя в качестве неограничивающих примеров вирусные векторы, экспрессирующие векторы из голой ДНК или РНК, плазмидные, космидные или фаговые векторы, экспрессирующие ДНК-или РНК-векторы, связанные с катионными конденсирующими средствами, экспрессирующие ДНК- или РНК-векторы, инкапсулированные в липосомы, и конкретные эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

Как применяют здесь, контролирующая экспрессию последовательность обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, управляющую транскрипцией нуклеиновой кислоты. Контролирующая экспрессию последовательность может представлять собой промотор, такой как конститутивный или индуцируемый промотор или энхансер. Контролирующая экспрессию последовательность является функционально связанной с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей транскрипции.

- 10 016193

Как применяют здесь, фармацевтически приемлемый носитель включает в себя любое вещество, которое, при объединении с активным ингредиентом, позволяет ингредиенту сохранять биологическую активность и не реагирует с иммунной системой субъекта. Неограничивающие примеры включают в себя любой из общепринятых фармацевтических носителей, такой как фосфатно-солевой буфер, вода, эмульсии, такие как эмульсия масло/вода, и различные типы увлажняющих веществ. Предпочтительными разбавителями для аэрозоля или парентерального введения являются фосфатно-солевой буфер или нормальный (0,9%) физиологический раствор. Композиции, содержащие такие носители, составляют хорошо известными общепринятыми способами (см., например, К.ешшд1ои'8 Рйагтасеибса1 8аспсс5. 18111 еб1ΐίοη, А. Сеппаго, еб., Маск РиЫщЫпд Со., Еайоп, РА, 1990; и К.етшд1оп, Т1е 8с1епсе апб Ргасйсе οί Рйагтасу 2011 Еб. Маск РиЫййшд, 2000).

Термин к_оп, как применяют здесь, предназначен для обозначения константы скорости для связывания антитела с антигеном.

Термин к_о££, как применяют здесь, предназначен для обозначения константы диссоциации для диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген.

Термин К_с, как применяют здесь, предназначен для обозначения константы равновесия диссоциации для взаимодействия антитело-антиген.

Композиции и способы получения композиций

Анти-в-амилоидные антитела и полипептиды.

Настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с С-концом пептида Ав. Настоящее изобретение относится к антителу или полипептиду, связывающемуся с Αβ_1-40, Αβ_1-42, и Αβ_1-43. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид связывается с Αβ_1-40 с более высокой аффинностью, чем для его связывания с Αβ_1-42 и Αβ_1-43. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с Αβ_1-36, Αβ_1-37, Αβ_1-38 и Αβ_1-39. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается ^с Α-^β22-35. В некоторых вариантах осуществления, антитело связывается с Аβ_28-40. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид связывается с эпитопом на Αβ_1-40, содержащим аминокислоты 25-34 и 40.

Настоящее изобретение также относится к композициям, включая фармацевтические композиции, содержащим любое из антител или полипептидов, описанных здесь (такие как антитело 6С и его варианты, показанные в табл. 3 или полипептид, полученный из антитела 6С и его вариантов, показанных в табл. 3); или полинуклеотиды, описанные здесь. Как применяют здесь, композиции содержат одно или несколько антител или полипептидов (которые могут являться или не являться антителом), которые связываются с С-концом Αβ_1-40, и/или один или несколько полинуклеотидов, содержащих последовательности, кодирующие одно или несколько антител или полипептидов, которые связываются с С-концом Αβ₁₄₀. Эти композиции могут дополнительно содержать подходящие наполнители, такие как фармацевтически приемлемые наполнители, включая буферы, которые хорошо известны в данной области.

Антитела и полипептиды по настоящему изобретению характеризуются любой (одной или несколькими) из следующих характеристик: (а) связывание с Αβ_1-40, Αβ_1-42, и Αβ_1-43; (Ь) связывание с Αβ_1-40, Αβ₁₄₂, и Αβ_1-43 с более высокой аффинностью связывания с Αβ_1-40, чем с Αβ_1-42 и Αβ_1-42; (с) связывание с эпитопом на Αβ_1-40, содержащим аминокислоты 25-34 и 40; (б) связывание с Αβ_1-36, Αβ_1-37, Αβ_1-38 и Αβ_1-39, однако, с более низкой аффинностью по сравнению со связыванием с Αβ_1-40; (е) связывание с Αβ_22-37 с К_с менее, чем приблизительно 1 мкМ; (ί) связывание с Αβ_22-35; (д) связывание с Αβ_28-40; (11) отсутствие связывания с АРР, экспрессированным в клетке; (ί) подавление формирования амилоидных бляшек у субъекта; (]) уменьшение амилоидных бляшек у субъекта; (к) лечение, предупреждение, облегчение одного или нескольких симптомов болезни Альцгеймера или другого связанного с накоплением Аβ заболевания (например, синдрома Дауна, болезни Паркинсона, мультиинфарктной деменции, синдрома умеренных когнитивных нарушений, церебральной амилоидной ангиопатии, депрессии, болезни КрейтцфельдаЯкоба, деменции с тельцами Леви); (1) улучшение когнитивной функции. Антитела и полипептиды по изобретению могут также обладать нарушенной эффекторной функцией, описанной здесь. Антитела и полипептиды с нарушенной эффекторной функцией могут обладать желаемыми показателями безопасности в отличие от других опубликованных анти-Аβ антител. Например, композиции по настоящему изобретению могут не вызывать существенных или неприемлемых уровней одного или нескольких из: кровотечения из сосудов мозга (церебральная геморрагия); менингоэнцефалит (включая изменения изображения магнитно-резонансного сканирования); повышенное число белых клеток крови в спинномозговой жидкости; воспаление в центральной нервной системе.

Соответственно, настоящее изобретение относится к любому из следующего, или к композициям (включая фармацевтические композиции), содержащим любое из следующего: (а) антитело 6С или его варианты, показанные в таблице 3; (Ь) фрагмент или область антитела 6С или его вариантов, показанных в табл. 3; (с) легкая цепь антитела 6С или его вариантов, показанных в таблице 3; (б) тяжелая цепь антитела 6С или его вариантов, показанных в табл. 3; (е) одна или несколько вариабельная область(области) из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 6С или его вариантов, показанных в таблице 3; (ί) одна или несколько СОВ (одна, две, три, четыре, пять или шесть СЭК.) антитела 6С или его вариантов, показанных

- 11 016193 в таблице 3; (д) СЭЯ Н3 из тяжелой цепи антитела 60; (й) СЭЯ Ь3 из легкой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в табл. 3; (1) три СОЯ из легкой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; (]) три СОЯ из тяжелой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в табл. 3; (к) три СОЯ из легкой цепи и три СОЯ из тяжелой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; и (1) антитело, содержащее любое из (Ь)-(к). Настоящее изобретение также относится к полипептидам, содержащим любое одно или несколько из вышеуказанного.

Части СОЯ антитела 60 (включая СОЯ Сйойиа и КаЬа!) схематически изображены на фиг. 1. Определение областей СОЯ полностью находится в компетенции специалистов в данной области. Понятно, что в некоторых вариантах осуществления СОЯ могут представлять собой сочетание СОЯ КаЬа! и Сйойиа (называемые также комбинированными СОЯ или расширенными СОЯ). В некоторых вариантах осуществления СОЯ представляют собой СОЯ КаЬай В других вариантах осуществления СОЯ представляют собой СОЯ СйоЯиа. Другими словами, в вариантах осуществления с более, чем одной СОЯ, СОЯ могут представлять собой любое из ЯаЬа1, Сйо1й1а, комбинированных СОЯ, или их сочетаний.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к полипептиду (который может являться или не являться антителом), содержащему по меньшей мере одну СОЯ, по меньшей мере две, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять или все шесть СОЯ, которые являются в основном идентичными по меньшей мере одной СОЯ, по меньшей мере двум, по меньшей мере трем, по меньшей мере четырем, по меньшей мере пяти или всем шести СОЯ из 60 или его вариантов, показанных в таблице 3. Другие варианты осуществления относятся к антителам, обладающим по меньшей мере двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью СОЯ, которые являются в основном идентичными по меньшей мере двум, трем, четырем, пяти или шести СОЯ 60 или полученным из 60. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна, две, три, четыре, пять или шесть СОЯ являются по меньшей мере приблизительно на 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 96, 97, 98, или на 99% идентичными по меньшей мере одной, двум, трем, четырем, пяти или шести СОЯ 60 или его вариантов, показанных в таблице 3. Понятно, что для целей настоящего изобретения специфичность связывания и/или общая активность, по существу, сохраняется, хотя степень активности может отличаться по сравнению с 60 или его вариантами, показанными в табл. 3 (может являться большей или меньшей).

Настоящее изобретение также относится к полипептиду (который может являться или не являться антителом), содержащему аминокислотную последовательность 60 или его вариантов, показанных в табл. 3, обладающую одним из следующего по меньшей мере 5 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере 8 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере приблизительно 10 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере приблизительно 15 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере приблизительно 20 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере приблизительно 25 непрерывными аминокислотами, по меньшей мере приблизительно 30 непрерывными аминокислотами из последовательности 60 или его вариантов, показанных в табл. 3, где по меньшей мере 3 из аминокислот происходят из вариабельной области 60 (фиг. 1) или его вариантов, показанных в табл. 3. В одном варианте осуществления вариабельная область происходит из легкой цепи 60. В другом варианте осуществления вариабельная область происходит из тяжелой цепи 60. Примерный полипептид обладает непрерывными аминокислотами (описанных выше длин) из вариабельных областей как тяжелой, так и легкой цепи 60. В другом варианте осуществления 5 (или более) непрерывных аминокислот происходят из определяющей комплементарность области (СОЯ) из 60, показанной на фиг. 1. В некоторых вариантах осуществления непрерывные аминокислоты происходят из вариабельной области 60.

Аффинности связывания антител и полипептидов по настоящему изобретению могут меняться и не обязательно должны составлять (но могут составлять) конкретное значение или диапазон, как в примерных вариантах осуществления, описанных ниже. Аффинность связывания (К_с) антител и полипептидов по настоящему изобретению к Αβ_£-40 может составлять от приблизительно 0,10 до приблизительно 0,80 нМ, от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,75 нМ и от приблизительно 0,18 до приблизительно 0,72 нМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания составляет приблизительно до 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ, приблизительно 40 пМ, или более чем приблизительно 40 пМ. В одном варианте осуществления аффинность связывания составляет приблизительно между 2 и 22 пМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет менее чем приблизительно 10 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 4 нМ, приблизительно 3 нМ, приблизительно 2 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 900 пМ, приблизительно 800 пМ, приблизительно 700 пМ, приблизительно 600 пМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 400 пМ, приблизительно 300 пМ, приблизительно 200 пМ, приблизительно 150 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 90 пМ, приблизительно 80 пМ, приблизительно 70 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 30 пМ, приблизительно 10 пМ. В одном варианте осуществления аффинность связывания составляет приблизительно 10 нМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет менее чем приблизительно 10 нМ, менее чем приблизительно 50 нМ, менее чем приблизительно 100 нМ, менее чем приблизительно 150 нМ, менее чем приблизительно 200 нМ, менее чем приблизительно 250 нМ, менее чем приблизительно 500 нМ, или менее чем приблизительно 1000 нМ. В других вариантах осуществления, аффинность связывания

- 12 016193 составляет менее чем приблизительно 5 нМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет менее чем приблизительно 1 нМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет приблизительно 0,1 нМ или приблизительно 0,07 нМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет менее чем приблизительно 0,1 нМ или менее чем приблизительно 0,07 нМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет от любого из приблизительно 10 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 900 пМ, приблизительно 800 пМ, приблизительно 700 пМ, приблизительно 600 пМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 400 пМ, приблизительно 300 пМ, приблизительно 200 пМ, приблизительно 150 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 90 пМ, приблизительно 80 пМ, приблизительно 70 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 30 пМ, приблизительно 10 пМ до любого из приблизительно 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ или приблизительно 40 пМ. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания является любой из приблизительно 10 нМ, приблизительно 5 нМ, приблизительно 1 нМ, приблизительно 900 пМ, приблизительно 800 пМ, приблизительно 700 пМ, приблизительно 600 пМ, приблизительно 500 пМ, приблизительно 400 пМ, приблизительно 300 пМ, приблизительно 200 пМ, приблизительно 150 пМ, приблизительно 100 пМ, приблизительно 90 пМ, приблизительно 80 пМ, приблизительно 70 пМ, приблизительно 60 пМ, приблизительно 50 пМ, приблизительно 40 пМ, приблизительно 30 пМ, приблизительно 10 пМ. В других вариантах осуществления аффинность связывания составляет приблизительно 2 пМ, приблизительно 5 пМ, приблизительно 10 пМ, приблизительно 15 пМ, приблизительно 20 пМ, приблизительно 40 пМ или более чем приблизительно 40 пМ.

Антитела и полипептиды по настоящему изобретению также могут связываться с одним или несколькими из Αβι_-36, Αβι_-37 Αβι_-38, Αβι_-39, Αβι_-42 и Αβι_-43, однако аффинность связывания с одним или несколькими из этих пептидов меньше, чем аффинности их связывания с Αβ_1-40. В некоторых вариантах осуществления К_с антител или полипептидов для одного или нескольких из Αβι_-36, Αβ_1-37, Αβ_1-38, Αβ_1-39, Αβ1 .42 и Αβι_-43 по меньшей мере приблизительно в 5 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 20 раз, по меньшей мере приблизительно в 30 раз, по меньшей мере приблизительно в 40 раз, по меньшей мере приблизительно в 50 раз, по меньшей мере приблизительно в 80 раз, по меньшей мере приблизительно в 100 раз, по меньшей мере приблизительно в 150 раз, по меньшей мере приблизительно в 200 раз или по меньшей мере приблизительно в 250 раз больше К для ^Αβ1-40.

Настоящее изобретение также относится к способам получения любого из этих антител или полипептидов. Антитела по настоящему изобретению можно получить способами, известными в данной области. Например, антитело можно получить посредством иммунизации млекопитающего пептидом Аβ (таким как Αβ_25-40 в качестве иммуногена). Полипептиды можно получать посредством протеолитической или другой деградации антител, посредством рекомбинантных способов (т.е., отдельные или слитые полипептиды), как описано выше, или посредством химического синтеза. Полипептиды антител, особенно более короткие полипептиды вплоть до приблизительно 50 аминокислот, удобно получать посредством химического синтеза. Способы химического синтеза известны в данной области и являются коммерчески доступными. Например, антитело можно получить посредством автоматического синтезатора полипептидов с применением твердофазного способа. См. также патенты США № 5807715; 4816567; и 6331415.

По другой альтернативе антитела можно получать с использованием рекомбинантных способов, хорошо известных в данной области. В одном варианте осуществления полинуклеотид содержит последовательность, кодирующую вариабельные области тяжелой цепи и/или легкой цепи антитела 6С, показанную на 8ЕО ΙΌ N0:9 и 8ЕО ΙΌ N0:10. В другом варианте осуществления полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, показанную на 8Е0 ΙΌ N0:9 и 8Е0 ΙΌ N0:10, клонируют в один или несколько векторов для экспрессии или размножения.

Последовательность, кодирующую интересующее антитело, можно поддерживать в векторе в клетке-хозяине, и затем клетку-хозяина можно размножать и замораживать для будущего использования. Векторы (включая экспрессирующие векторы) и клетки-хозяева дополнительно описаны здесь.

Настоящее изобретение относится также к одноцепочечным фрагментам вариабельной области (ксЕу) антител по настоящему изобретению, таких как 60. Одноцепочечные фрагменты вариабельной области получены посредством соединения вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи с использованием короткого связывающего пептида. Βίτά с1 а1. (1988) §аеисе 242:423-426. Примером связывающего пептида является (СССС8)₃. образующий мостик приблизительно 3,5 нм между С-концом одной вариабельной области и ^концом другой вариабельной области. Сконструировали и применили линкеры других последовательностей. Βίτά е1 а1. (1988). Линкеры, в свою очередь, можно модифицировать для дополнительных функций, таких как присоединение лекарственных средств или присоединение к твердым подложкам. Одноцепочечные варианты можно получать либо рекомбинантным, либо синтетическим способом. Для синтетического получения 5сЕу можно использовать автоматический синтезатор. Для рекомбинантного получения ксЕу, подходящую плазмиду, содержащую полинуклеотид, кодирую

- 13 016193 щий 5сРу, можно вводить в подходящую клетку-хозяин, либо эукариотическую, такую как клетки дрожжей, растений, насекомых или млекопитающих, либо прокариотическую, такую как Е. со11. Полинуклеотиды, кодирующие интересующую 5сРу, можно получить посредством общепринятых манипуляций, таких как лигирование полинуклеотидов. Полученные 5сРу можно выделить с использованием общепринятых способов очистки белка, известных в данной области.

Включены также другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой бивалентные, биспецифические антитела, в которых домены УН и УЕ экспрессированы на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который является слишком коротким, чтобы позволять спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи, таким образом заставляя домены спариваться с комплементарными доменами на другой цепи и создавая два антигенсвязывающих участка (см. например, НоШдет, Р., е! а1. (1993) Ргос. №11. Асаб 8с1. И8А 90:6444-6448; РоЦак, В. 1., е! а1. (1994) 8!гис!иге 2:1121-1123).

Например, биспецифические антитела, моноклональные антитела, обладающие специфичностью связывания по меньшей мере для двух различных антигенов, можно получить с использованием антител, описанных здесь. Способы получения биспецифических антител известны в данной области (см., например, 8иге511 е! а1., 1986, Ме!йоб§ ίη Епхуто1оду 121:210). Традиционно, рекомбинантное получение биспецифических антител являлось основанным на коэкспрессии двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина с двумя тяжелыми цепями, обладающими различными специфичностями (МШйеш и Сие11о, 1983, №1иге 305, 537-539).

Согласно одному способу получения биспецифических антител вариабельные домены антител с желаемыми специфичностями связывания (участками объединения антитело-антиген) сливают с последовательностями константного домена иммуноглобулина. Предпочтительно их сливают с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащим по меньшей мере часть шарнирной, СН2 и СН3 областей. Предпочтительно, чтобы первая константная область тяжелой цепи (СН1), содержащая участок, необходимый для связывания легкой цепи, присутствовала по меньшей мере в одном из слитых белков. ДНК, кодирующие слитые белки с тяжелой цепью иммуноглобулина и, если желательно, с легкой цепью иммуноглобулина, вставляют в отдельные экспрессирующие векторы и котрансфицируют в подходящий организм-хозяин. Это предоставляет большую гибкость в регулировании взаимного соотношения трех полипептидных фрагментов в вариантах осуществления, когда с неравными соотношениями трех полипептидных цепей, применяемых в конструкции, достигают оптимального выхода. Однако можно вставлять кодирующие последовательности для двух или всех трех полипептидных цепей в один экспрессирующий вектор, когда экспрессия по меньшей мере двух полипептидных цепей в равных соотношениях приводит к высоким выходам, или когда соотношения не являются особенно важными.

По одному способу биспецифические антитела состоят из гибридной тяжелой цепи иммуноглобулина с первой специфичностью связывания на одном плече и гибридной пары тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина (обеспечивающего вторую специфичность связывания) на другом плече. Эта асимметричная структура с легкой цепью иммуноглобулина только на одной половине биспецифической молекулы, облегчает отделение желаемого биспецифического соединения от нежелательных сочетаний цепей иммуноглобулина. Этот способ описан в публикации РСТ № \¥О 94/04690, опубликованной 3 марта 1994 г.

Гетероконъюгированные антитела, содержащие два ковалентно соединенных антитела, также входят в объем настоящего изобретения. Такие антитела использовали для нацеливания клеток иммунной системы на нежелательные клетки (патент США № 4676980) и для лечения инфекции Н1У (публикация патентной заявки РСТ № XV О 91/00360 и XVО 92/200373; ЕР 03089). Гетероконъюгированные антитела можно получить с использованием любых подходящих способов перекрестного сшивания. Подходящие средства и способы для перекрестного сшивания хорошо известны в данной области и описаны в патенте США № 4676980.

Химерные или гибридные антитела можно также получить ίη νίίτο с использованием известных способов химии белкового синтеза, включая способы, включающие в себя сшивающие средства.

Например, иммунотоксины можно конструировать с использованием реакции дисульфидного обмена или формированием тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают в себя иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат.

Гуманизированное антитело, содержащее одну или несколько СЭВ антитела 6С или одну или несколько СЭВ, полученных из антитела 6С, можно получить с использованием любых способов, известных в данной области. Например, для гуманизации моноклонального антитела можно использовать четыре основные стадии. Это: (1) определение нуклеотидной и предсказанной аминокислотной последовательности легких и тяжелых вариабельных доменов исходного антитела, (2) конструирование гуманизированного антитела, т. е. решение, каркасную область какого антитела использовать в ходе процесса гуманизации, (3) методы/способы фактической гуманизации и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела. См., например, патенты США № 4816567; 5807715; 5866692; 6331415; 5530101; 5693761;5693762;5585089;6180370;5225539;6548640.

В рекомбинантных гуманизированных антителах часть Рсу можно модифицировать, чтобы избе

- 14 016193 жать взаимодействия с Ееу-рецептором и комплементом иммунной системы. Данный тип модификации сконструирован Эг. М1ке С1агк из 1)ераПтеп1 о£ Ра11ю1оцу а! СатЬгНде Итуегзйу, и способы получения таких антител описаны в Ш0 99/58572, опубликованной 18 ноября 1999 г.

Например, можно сконструировать константную область, более сходную с константными областями человека, чтобы избежать иммунного ответа, если антитело используют в клинических испытаниях и способах лечения у человека. См., например, патенты США № 5997867 и 5866692.

Настоящее изобретение относится к модификациям антитела 60, включая функционально эквивалентные антитела, значительно не влияющим на их свойства, и вариантам, обладающим увеличенной или уменьшенной активностью и/или аффинностью. Например, в аминокислотную последовательность антитела 60 можно вносить мутации для получения антитела с желаемой аффинностью связывания с пептидом Α_1-40. Модификация полипептидов является общепринятой практикой в данной области, и нет необходимости подробно описывать ее здесь. Модификация полипептидов проиллюстрирована в примерах. Примеры модифицированных полипептидов включают в себя полипептиды с консервативными заменами аминокислотных остатков, с одной или несколькими делециями или добавлениями аминокислот, которые не вносят значительных вредных изменений в функциональную активность, или с использованием химических аналогов.

Вставки аминокислотной последовательности включают в себя вставки, слитые с N и/или Сконцом, по длине лежащие в диапазоне от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, так же как вставки одного или множества аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают в себя антитело с ^концевым остатком метионила или антитело, слитое с эпитопом-меткой. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают в себя антитело, слитое на N или С-конце с ферментом или полипептидом, увеличивающим время полужизни антитела в сыворотке.

Варианты с заменами обладают по меньшей мере одним аминокислотным остатком, удаленным из молекулы антитела, и другим остатком, вставленным на его место. Участки, представляющие наибольший интерес для замещающего мутагенеза, включают в себя гипервариабельные области, однако предусматривают также изменения в РЕ. Консервативные замены показаны в табл. 1 под заголовком консервативные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, тогда можно вводить более существенные замены, обозначенные примерные замены в табл 1, или как описано ниже по отношению к классам аминокислот, и проводить скрининг продуктов. Таблица 1. Аминокислотные замены

- 15 016193

Значительных модификаций биологических свойств антитела достигают посредством выбора замен, которые значительно отличаются по их эффекту на поддержание (а) структуры полипептидного остова в области замены, например, в виде листа или спиральной конформации, (Ь) заряда или гидрофобности молекулы в намеченном участке, или (с) объема боковой цепи. Существующие в природе остатки подразделяют на группы на основании общих свойств боковых цепей:

(1) неполярные: норлейцин, Ме!, А1а, Уа1, Ьеи, 11е;

(2) полярные незаряженные: Сук, 8ег, ТЬг, Аки, 01п;

(3) кислые (отрицательно заряженные): Акр, 01и;

(4) основные (положительно заряженные): Ьук, Агд;

(5) остатки, влияющие на ориентацию цепи: 01у, Рго; и (6) ароматические: Тгр, Туг, РНе, Н1к. Неконсервативные замены выполняют посредством замены члена одного из этих классов на члена другого класса.

Любые остатки цистеина, не вовлеченные в поддержание соответствующей конформации антитела, также можно заменять, как правило, на серии, для улучшения устойчивости молекулы к окислению и предотвращения аберрантного перекрестного сшивания. И наоборот, цистеиновую связь(связи) можно добавить в антитело для улучшения его стабильности, в частности, когда антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Εν-фрагмент.

Модификации аминокислот могут лежать в диапазоне от замены или модификации одной или нескольких аминокислот до полной реконструкции области, такой как вариабельная область. Изменения в вариабельной области могут изменять аффинность связывания и/или специфичность. В некоторых вариантах осуществления внутри домена СОЯ выполняют не более чем от одной до пяти консервативных аминокислотных замен. В других вариантах осуществления внутри домена СИЯ выполняют не более чем от одной до трех консервативных аминокислотных замен. В другом варианте осуществления домен СИЯ представляет собой СИЯН3 и/или СИЯ Ь3.

Модификации включают в себя также гликозилированные и негликозилированные полипептиды, так же как полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, например, такими как гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Άнтитела являются гликозилированными в консервативных положениях в константных областях (ЗеПспк апб Ьипб, 1997, СНет. 1ттипо1. 65:111-128; \νπ§Ηΐ апб Моткоп, 1997, Т1ЬТЕСН 15:26-32). Олигосахаридные боковые цепи иммуноглобулинов влияют на функцию белка (Воуб е! а1., 1996, Мо1. 1ттипо1. 32:1311-1318; \νίΙΙ\\Ό апб Но\\агб, 1990, ВюсНет. 29:4175-4180) и внутримолекулярное взаимодействие между частями гликопротеина, что может влиять на конформацию и презентируемую трехмерную поверхность гликопротеина (НеППепк апб Ьипб, выше; Vукк апб Vадпе^, 1996, Сиггеп! 0рт. Вю!есН. 7:409-416). Олигосахариды могут служить также для нацеливания данного гликопротеина на конкретные молекулы на основании специфических узнаваемых структур. Опубликовано также, что гликозилирование антител влияет на антителозависимую опосредуемую клетками цитотоксичность (АИСС). В частности, опубликовано, что клетки СНО с регулируемой тетрациклином экспрессией β(1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы III (0пТ111), гликозилтрансферазы, катализирующей формирование бисекторного 01сNАс, обладают улучшенной активностью АИСС (Итапа е! а1., 1999, Ма!иге Вю!есН. 17:176-180).

Гликозилирование антител, как правило, является либо ^связанным, или О-связанным. N связанное относится к присоединению углеводной группы к боковой цепи аспарагинового остатка. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин, аспарагин-Х-треонин и аспарагин-Х-цистеин, где X представляет собой любую аминокислоту кроме пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной группы к боковой цепи аспарагина. Таким образом, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный участок гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров №ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, наиболее обычно, к серину или треонину, хотя можно использовать также 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.

Добавление участков гликозилирования к антителу, удобно осуществлять посредством изменения аминокислотной последовательности, так чтобы она содержала одну или несколько из описанных выше трипептидных последовательностей (для участков ^связанного гликозилирования). Изменение можно также осуществлять посредством добавления к последовательности исходного антитела одного или нескольких остатков серина или треонина, или заменой на эти остатки (для участков 0-связанного гликозилирования).

Характер гликозилирования антител можно также изменять без изменения лежащей в основе нуклеотидной последовательности. Гликозилирование в значительной степени зависит от клетки-хозяина, используемой для экспрессии антитела. Поскольку тип клеток, применяемый для экспрессии рекомбинантных гликопротеинов, например, антител, в качестве потенциальных терапевтических средств, редко представляет собой природную клетку, можно ожидать изменений в характере гликозилирования антител (см., например Нке е! а1., 1997, I. Вю1. СЬет. 272:9062-9070).

В добавление к выбору клеток-хозяев факторы, влияющие на гликозилирование во время рекомбинантного получения антител включают в себя способ выращивания, состав среды, плотность культуры,

- 16 016193 насыщение кислородом, рН, схемы очистки и т. п. Предложены различные способы для изменения характера гликозилирования, достигаемого в конкретном организме-хозяине, включая введение или сверхэкспрессию конкретных ферментов, вовлеченных в образование олигосахаридов (патенты США № 5047335; 5510261 и 5278299). Гликозилирование или конкретные типы гликозилирования можно ферментативно убирать из гликопротеина, например, с использованием эндогликозидазы Н (Εηάο Н) , Ν-гликозидазы Г, как описано в примере 1, эндогликозидазы Г1, эндогликозидазы Г2, эндогликозидазы Г3. Кроме того, рекомбинантную клетку-хозяина можно генетически модифицировать, чтобы она являлась дефектной по процессингу конкретных типов полисахаридов. Эти и подобные способы хорошо известны в данной области.

Другие способы модификации включают в себя использование способов связывания, известных в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров ферментативные способы, окислительное замещение и хелатообразование. Модификации можно применять, например, для присоединения меток для иммунологического анализа. Модифицированные полипептиды 60 получают с использованием общепринятых в данной области способов, и их можно скринировать с использованием общепринятых анализов, известных в данной области, некоторые из которых описаны ниже и в примерах.

Другие модификации антитела включают в себя антитела, модифицированные, как описано в публикации РСТ № АО 99/58572, опубликованной 18 ноября 1999 г. Эти антитела содержат, помимо связывающего домена, нацеленного на молекулу-мишень, эффекторный домен, обладающий аминокислотной последовательностью, по существу, гомологичной всему или части константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Эти антитела способны связывать молекулу-мишень без запуска значительного комплемент-зависимого лизиса, или опосредованного клетками разрушения мишени. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен способен специфически связывать ГсРп и/или ГсуКНЬ. Эти варианты, как правило, основаны на химерных доменах, полученных из двух или более доменов С_н2 тяжелых цепей иммуноглобулина человека. Антитела, модифицированные таким способом, особенно подходят для использования в постоянной терапии антителами, чтобы избежать воспалительных и других неблагоприятных реакций на общепринятую терапию антителами.

Настоящее изобретение относится к вариантам осуществления аффинного созревания. Например, аффинно зрелые антитела можно получить способами, известными в данной области (Магкк е! а1., 1992, Вю/ТесЬпо1оду, 10:779-783; ВагЬак е! а1., 1994, Ргос Ναι. Лсаб. 8с1, И8Л 91:3809-3813; 8сЫег е! а1., 1995, Оепе, 169:147-155; УеИоп е! а1., 1995, Σ. 1ттипо1., 155:1994-2004; .Тасккоп е! а1., 1995, Σ. 1ттипо1., 154(7):3310-9; НаМбпз е! а1, 1992, Г Мо1. Вю1., 226:889-896; и АО 2004/058184).

Следующие способы можно использовать для регуляции аффинности антитела и для характеризации СЭР. Один из способов характеризации СЭР антитела и/или изменения (такого как улучшение) аффинности связывания полипептида, такого как антитело, назван библиотека сканирующего мутагенеза. Как правило, библиотека сканирующего мутагенеза работает следующим образом. Аминокислоты в одном или нескольких положениях в СЭР заменяют двумя или более (например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20) аминокислотами с использованием известных в данной области способов. В результате этого получают небольшие библиотеки клонов (в некоторых вариантах осуществления, одну для каждого анализируемого положения аминокислоты), каждая с комплексностью два или более членов (если аминокислоту в каждом положении заменяют на две или более аминокислоты). Как правило, библиотека содержит также клон, содержащий природную (не замененную) аминокислоту. Небольшое число клонов, например приблизительно 20-80 клонов (в зависимости от комплексности библиотеки), из каждой библиотеки скринируют по аффинности связывания с полипептидом-мишенью (или другой мишенью связывания), и идентифицируют кандидаты с увеличенным, тем же самым, уменьшенным или отсутствующим связыванием. Способы определения аффинности связывания хорошо известны в данной области. Аффинность связывания можно определить с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса В1Асоге, выявляющего приблизительно 2-кратную или большую разницу в аффинности связывания. В1Асоге является особенно применимым, когда исходное антитело уже связывается с относительно высокой аффинностью, например, К_с приблизительно 10 нМ или ниже. Скрининг с использованием поверхностного плазмонного резонанса В1Асоге описан в примерах здесь.

Аффинность связывания можно определить с использованием Кшеха Вюсепког, анализов близости сцинтилляции, ЕЫ8А, иммунологического анализа ΟΚΙΟΕΝ (ΙΟΕΝ), тушения флуоресценции, переноса флуоресценции, и/или дрожжевого дисплея. Можно также проводить скрининг по аффинности связывания с использованием подходящего биологического анализа.

В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в каждом положении в СЭР заменяют (в некоторых вариантах осуществления, по одной за один раз) всеми 20 природными аминокислотами с использованием известных в данной области способов мутагенеза (некоторые из которых описаны здесь). В результате этого получают небольшие библиотеки клонов (в некоторых вариантах осуществления, одну для каждого анализируемого положения аминокислоты), каждая с комплексностью 20 членов (если каждое положение заменяют на все 20 аминокислот).

В некоторых вариантах осуществления подлежащая скринингу библиотека содержит замены в двух или более положениях, которые могут присутствовать в одной и той же СЭР или в двух или более СЭР.

- 17 016193

Таким образом, библиотека может содержать замены в двух или более положениях в одной СОЯ. Библиотека может содержать замену в двух или более положениях в двух или более СОЯ. Библиотека может содержать замену в 3, 4, 5 или более положениях, где указанные положения обнаружены в двух, трех, четырех, пяти или шести СОЯ. Замену можно получить с использованием кодонов с низкой вырожденностью. См., например, табл. 2 из Ва1ш1 е1 а1., (1993) Сепе 137 (1): 109-18).

СОЯ может представлять собой СЭКН3 и/или СОЯЬ3. СОЯ может представлять собой одну или несколько из СОЯЫ, СПЯЬ2, СОВБ3. СЭВН1. СЭЕН2 и/или СЭВН3. СОЯ может представлять собой СОЯ КаЬа!, СОЯ С1ю11иа или расширенную СОЯ.

Кандидаты с улучшенным связыванием можно секвенировать, таким образом идентифицируя мутантную СОЯ с заменой, приводящей к улучшенной аффинности (обозначаемую также улучшенной заменой). Связывающиеся кандидаты можно также секвенировать, таким образом идентифицируя замены в СОЯ с сохранением связывания.

Можно проводить множество циклов скрининга. Например, кандидаты (содержащие каждый замену аминокислоты в одном или нескольких положениях в одной или нескольких СОЯ) с улучшенным связыванием являются применимыми также для конструирования второй библиотеки, содержащей по меньшей мере исходную и замененную аминокислоту в каждом положении улучшенной СОЯ (т.е., положении аминокислоты в СОЯ, в котором для мутанта с заменой показали улучшенное связывание). Получение и скрининг или отбор этой библиотеки дополнительно обсуждают ниже.

Библиотека сканирующего мутагенеза также предоставляет средство для характеризации СОЯ, поскольку частота клонов с улучшенным связыванием, таким же связыванием, уменьшенным связыванием или с отсутствием связывания также предоставляет информацию относительно важности каждого положения аминокислоты для стабильности комплекса антитело-антиген. Например, если для положения СЭВ сохраняется связывание при замене на все 20 аминокислот, данное положение идентифицируют как положение, которое маловероятно является необходимым для связывания антигена. Наоборот, если для положения СОЯ сохраняется связывание только для небольшого процента замен, данное положение идентифицируют как положение, которое является важным для функционирования СОЯ. Таким образом, способами библиотеки сканирующего мутагенеза получают информацию относительно положений в СОЯ, которые можно заменить на множество различных аминокислот (включая все 20 аминокислот), и положений в СОЯ, которые нельзя заменять, или которые можно заменять только немногими аминокислотами.

Кандидаты с улучшенной аффинностью можно объединять во вторую библиотеку, которая содержит в данном положении улучшенную аминокислоту, исходную аминокислоту и может дополнительно содержать дополнительные замены в данном положении, в зависимости от комплексности библиотеки, которая является желательной или возможной с использованием желательного способа скрининга или отбора. Кроме того, если желательно, в соседних положениях аминокислот можно случайно выбирать по меньшей мере две или более аминокислот. Случайный выбор соседних аминокислот может позволять дополнительную конформационную гибкость в мутантной СОЯ, что, в свою очередь, может позволять или облегчать введение большого числа улучшающих мутаций. Библиотека может также содержать замены в положениях, для которых не показали улучшенную аффинность в первом цикле скрининга.

Во второй библиотеке проводят скрининг или отбор членов библиотеки с улучшенной и/или измененной аффинностью связывания с использованием любого способа, известного в данной области, включая скрининг с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса ΒΙΑοοκ и отбор с использованием любого способа, известного в данной области для отбора, включая фаговый дисплей, дрожжевой дисплей и рибосомный дисплей.

Настоящее изобретение относится также к слитым белкам, содержащим один или несколько фрагментов или областей из антител (таких как 6С) или полипептидов по изобретению. Один из вариантов осуществления относится к слитому полипептиду, содержащему по меньшей мере 10 непрерывных аминокислот из вариабельного участка легкой цепи, показанного на 8ЕО Ш N0:2 (фиг. 1) и/или по меньшей мере 10 аминокислот из вариабельного участка тяжелой цепи, показанного на 8Е0 ΙΌ N0:1 (фиг. 1). Другие варианты осуществления относятся к слитому полипептиду, содержащему по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25, или по меньшей мере приблизительно 30 непрерывных аминокислот из вариабельного участка легкой цепи, показанного на 8Е0 ΙΌ N0:2 (фиг. 1) и/или по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25, или по меньшей мере приблизительно 30 непрерывных аминокислот из вариабельного участка тяжелой цепи, показанного на 8Е0 ΙΌ N0:1 (фиг. 1). В другом варианте осуществления слитый полипептид содержит вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи 6С, как показано на 8Е0 ΙΌ N0:2 и 8Е0 ΙΌ N0:1 из фиг. 1. В другом варианте осуществления слитый полипептид содержит одну или несколько СОЯ из 6С. В других вариантах осуществления слитый полипептид содержит СОЯ Н3 и/или СОЯ Ь3 антитела 6С. Для целей по настоящему изобретению слитый белок 6С содержит одно или несколько антител 6С и другую аминокислотную последовательность, к которой они не присоединены в природной молекуле, например, гетерологичную последовательность

- 18 016193 или гомологичную последовательность из другой области. Гетерологичные последовательности включают в себя в качестве неограниченных примеров метку, такую как метку РЬА0 или метку 6Нй. Метки хорошо известны в данной области.

Слитый полипептид 60 можно получить способами, известными в данной области, например, синтетическими или рекомбинантными.

Как правило, слитые белки 60 по настоящему изобретению получены посредством получения экспрессии кодирующего их полинуклеотида с использованием рекомбинантных способов, описанных здесь, хотя их можно также получить другими способами, известными в данной области, включая, например, химический синтез.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим антитела 60 или полипептиды, конъюгированные (например, связанные) со средством, облегчающим присоединение к твердой подложке (таким как биотин или авидин). Для простоты ссылка будет сделана в основном на 60 или антитела, подразумевая, что данные способы применяют к любому из вариантов осуществления связывания Ав1 -40, описанных здесь. Конъюгация, как правило, обозначает связывание этих компонентов, как описано здесь. Связывания (которое, как правило, представляет собой фиксацию этих компонентов в непосредственном объединении по меньшей мере для введения) можно достигать любым числом способов. Например, возможна непосредственная реакция между средством и антителом, когда каждый обладает заместителем, способным реагировать с заместителем другого. Например, нуклеофильная группа, такая как амино или сульфгидрильная группа, на одном может являться способной реагировать с карбонилсодержащей группой, такой как ангидрид или кислый галогенид, или с алкильной группой, содержащей хорошо уходящую группу (например, галогенид), на другом.

Антитело или полипептид по настоящему изобретению можно связывать со средством для мечения (альтернативно обозначаемым метка), таким как флуоресцентная молекула, радиоактивная молекула или любые другие метки, известные в данной области. В данной области известны метки, которые, как правило, производят сигнал (либо напрямую, либо опосредованно).

Изобретение относится также к композициям (включая фармацевтические композиции) и наборам, содержащим антитело 60, и, как ясно из настоящего описания, к любому или всем из антител и/или полипептидов, описанных здесь.

Анти-Ар антитела и полипептиды с нарушенной эффекторной функцией

Антитела или полипептиды (включая фармацевтические композиции, содержащие антитела или полипептиды), описанные здесь, могут обладать нарушенной эффекторной функцией. Как применяют здесь, антитело или полипептид с нарушенной эффекторной функцией (применяют взаимозаменяемо с иммунологически инертный или частично иммунологически инертный) обозначает антитела или полипептиды, не обладающие никакой эффекторной функцией или обладающие уменьшенной активностью или активностями эффекторной функции (по сравнению с антителом или полипептидом, обладающим немодифицированной или природной константной областью), например, не обладающие активностью или обладающие уменьшенной активностью в одном или нескольких из следующего: а) запуске опосредованного комплементом лизиса; Ь) стимуляции антителозависимой опосредуемой клетками цитотоксичности (АЭСС); и с) активации микроглии. Активность эффекторной функции можно уменьшить приблизительно на любое количество из 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 и 100%. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с бета-амилоидным пептидом без запуска существенного комплемент-зависимого лизиса, или опосредованного клетками разрушения мишени. Например, участок связывания Рс-рецептора на константной области можно модифицировать или подвергать мутагенезу для удаления или уменьшения аффинности связывания с конкретными Рс-рецепторами, такими как РсуВ1, РсуКП и/или РсуКШ. Для простоты ссылка будет сделана на антитела, подразумевая, что данные варианты осуществления также применяют к полипептидам. Систему нумерации ЕЙ (КаЬа! е! а1., Бедиегоев οΓ РгсЛеиъ οΓ Iттиηο1οд^са1 Ийегей; 511 еб. РиЬйс Неа1!1 БеМсе, Νη!ίοηη1 ИззШШез οΓ Неаййу, ВеЕйевба, Мб., 1991) применяют для обозначения, какой аминокислотный остаток(остатки) константной области (например, из антитела 1д0) изменены или мутированы. Нумерацию можно использовать для конкретного типа антитела (например, 1д01) или вида (например, человека) подразумевая, что подобные изменения можно выполнять среди всех типов антител и видов.

В некоторых вариантах осуществления антитело, специфически связывающее Ав пептид, содержит константную область тяжелой цепи с нарушенной эффекторной функцией. Константная область тяжелой цепи может обладать природной последовательностью или представлять собой вариант. В некоторых вариантах осуществления в аминокислотную последовательность природной тяжелой цепи вносят мутации, например, посредством замены, вставки и/или делеции аминокислоты, посредством чего нарушают эффекторную функцию константной области. В некоторых вариантах осуществления Νгликозилирование Рс-области константной области тяжелой цепи также можно изменить, например, можно удалить полностью или частично, посредством чего нарушают эффекторную функцию константной области.

В некоторых вариантах осуществления эффекторную функцию нарушают посредством удаления Ν- 19 016193 гликозилирования Ес-области (например, в домене СН 2 1дС) анти-Αβ пептида. В некоторых вариантах осуществления Ν-гликозилирование Ес-области удаляют посредством мутации гликозилированного аминокислотного остатка или фланкирующих остатков, являющихся частью последовательности узнавания для гликозилирования в константной области. Трипептидные последовательности аспарагин-Хсерин (Ν-Χ-8), аспарагин-Х-треонин (Ν-Χ-Τ) и аспарагин-Х-цистеин (Ν-Χ-С), где X представляет собой любую аминокислоту кроме пролина, являются последовательностями узнавания для ферментативного присоединения углеводной группы к боковой цепи аспарагина для Ν-гликозилирования. Мутация любой аминокислоты в трипептидной последовательности в константной области приводит к негликозилированному 1дС. Например, в участок Ν-гликозилирования Ν2 97 1дС1 и 1дС3 человека можно вводить мутацию до Α, Ό, О, К или Н. См. Тао е1 а1., 1. 1ттипо1о§у 143: 2595-2601 (1989); и кйепз е1 а1., 1ттипо1ощса1 Ве\зе\\ъ 163:59-76 (1998). Опубликовано, что 1§С1 и 1§С3 человека с заменой Акп-297 на С1п, ΗΪ8 или Ьуз не связывает ЕсуВ1 человека и не активирует комплемент с полной потерей способности связывать С1с.| для 1дС 1 и существенным уменьшением для 1дС3. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту Ν в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации на любую из аминокислот А, С, Ό, Е, Е, С, Н, I, К, Ь, М, Р, О, В, 8, Т, V, Υ. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту Ν в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации на консервативную замену. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту Χ в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации на пролин. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту 8 в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации на Α, Ό, Е, Е, С, Н, I, К, Ь, М, Ν, Р, О, В, V, Υ. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту Т в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации на Α, Ό, Е, Е, С, Н, I, К, Ь, М, Ν, Р, О, В, V, ^, Υ. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту С в трипептидной последовательности заменяют посредством мутации на Α, Ό, Е, Е, С, Н, I, К, Ь, Μ, Ν, Р, О, В, V, ^, Υ. В некоторых вариантах осуществления аминокислоту, следующую за трипептидом, заменяют посредством мутации на Р. В некоторых вариантах осуществления Ν-гликозилирование в константной области удаляют ферментативно (например, Ν-гликозидазой Е, как описано в примере 1, эндогликозидазой Е1, эндогликозидазой Е2, эндогликозидазой Е3, и эндогликозидазой Н). Удаления Ν-гликозилирования можно достигать также продукцией антитела в линии клеток, дефектных по Ν-гликозилированию. е1 а1., 1 Iттиηо1. 160 (7) :3393-402 (1998).

В некоторых вариантах осуществления в аминокислотный остаток, взаимодействующий с олигосахаридом, присоединенным к участку Ν-гликозилирования константной области, вводят мутацию для уменьшения аффинности связывания со ЕсуВР Например, можно внести мутацию в Е241, У264, Ό265 ^С3 человека. См. Ьипб е1 а1., 1. Iттипο1ο§у 157:4 963-4969 (1996).

В некоторых вариантах осуществления эффекторную функцию нарушают посредством модификации таких областей человека, как 233-236, 297, и/или 327-331, как описано в РСТ \УО 99/58572 и

Απηοιπ е1 а1., Мо1еси1аг Iттипо1о§у 40: 585-593 (2003); Веббу е1 а1., 1. Iттипо1о§у 164:1925-1933 (2000). Антитела, описанные в РСТ \УО 99/58572 и Α^тοи^ е1 а., содержат, помимо связывающего домена, нацеленного на молекулу-мишень, эффекторный домен, обладающий аминокислотной последовательностью, по существу, гомологичной всему или части константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека. Эти антитела способны связывать молекулу-мишень без запуска значительного комплементзависимого лизиса или опосредованного клетками разрушения мишени. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен обладает уменьшенной аффинностью для ЕсуВЕ, ЕсуВПа и ЕсуВШ. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен способен специфически связывать ЕсВп и/или ЕсуВПЬ. Эти варианты, как правило, основаны на химерных доменах, полученных из двух или более тяжелых цепей доменов С_н2 иммуноглобулина человека. Антитела, модифицированные таким способом, особенно подходят для использования в постоянной терапии антителами, чтобы избежать воспалительных и других неблагоприятных реакций на общепринятую терапию антителами. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела представляет собой тяжелую цепь человека с одной из следующих мутаций: 1) А327А330Р331 до С32783308331; 2) Е233Ь234Ь235С236 до Ρ233Μ234Α235 с делецией С236; 3) Е233Ь234Ь235 до Р233V234Α235; 4) Е233Ь234Ь235С236 Α327Α330Ρ331 до Ρ233V234Α235С32783308331 с делецией С236; 5) Е233^234^235Α327Α330Ρ331 до Ρ233V234Α235С32783308331; и 6) Ν297 до А297 или любой другой аминокислоты кроме Ν. Эти мутации можно сочетать, например, любую из 1) - 5) можно сочетать с б). В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела представляет собой тяжелую цепь IдС2 человека со следующими мутациями: А330Р331 до 83308331; Ν297 до 0297; и N297С327Α330Ρ331 до 0297032783308331. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи антитела представляет собой тяжелую цепь IдС4 человека с любыми из следующих мутаций: Е233Е234Ь235С236 до Ρ233V234Α235 с делецией С236; Е233Е234Ь235 до Ρ233V234Α235; Р228Ь235 до 8228Е235; Ν297 до 0297; и Е233Е234Ь235С236№97 до Ρ233V234Α235С236^297.

Константную область антител можно также модифицировать, чтобы нарушить активацию комплемента. Например, активацию комплемента антителами ^С, следующую за связыванием компонента комплемента С1, можно уменьшить посредством мутации аминокислотных остатков в константной об

- 20 016193 ласти в связывающем С1 мотиве (например, в связывающем С1с.| мотиве). Опубликовано, что мутация до А1а для каждого из Б270, К322, Р329, Р331 1д01 человека значительно снижает способность антитела связывать С1с.| и активировать комплемент. В случае мышиного 1д02Ь связывающий С1с.| мотив состоит из остатков Е318, К320 и К322. 1йизоде е! а1., I. 1штипо1оду 164:4178-4184 (2000); Бипсап е! а1., №11игс 322: 738-740 (1988).

Считают, что связывающий С1с.| мотив Е318, К320 и К322, идентифицированный для мышиного 1д02Ь, является общим для других изотипов антител. Бипсап с! а1., №11иге 322: 738-740 (1988). Связывающую С1с.| активность 1д02Ь можно прекратить посредством замены любого из трех указанных остатков на остаток, обладающий неподходящей группой на боковой цепи. Нет необходимости заменять ионные остатки только на А1а для прекращения связывания С1с.|. Можно также использовать другие алкилзамещенные неионные остатки, такие как 01у, 11е, Ьеи или Уа1, или такие ароматические неполярные остатки, как Р1е, Туг, Тгр и Рго вместо любого из трех остатков, чтобы прекратить связывание С1с.|. Кроме того, можно использовать такие полярные неионные остатки, как 8ег, ТЬг, Суз и Ме! вместо остатков 320 и 322, но не 318, чтобы прекратить активность связывания С1с.|.

Настоящее изобретение также относится к антителам с нарушенной эффекторной функцией, где антитело обладает модифицированной шарнирной областью. Аффинность связывания 1д0 человека с его Рс-рецепторами можно модулировать посредством модификации шарнирной области. СапйеИ е! а1., Т Ехр. Мей. 173:1483-1491 (1991); Не/агеН е! а1., I У1го1. 75:12161-12168 (2001); Кейра!Б е! а1., Нитап 1ттипо1оду 59:720-727 (1998). Конкретные аминокислотные остатки можно подвергать мутагенезу или делетировать. Модифицированная шарнирная область может содержать полную шарнирную область, полученную из антитела класса или подкласса антител, отличного от того, из которого происходит домен СН1. Например, константный домен (СН1) антител класса 1д0 можно присоединять к шарнирной области антитела класса 1д04. Альтернативно, новая шарнирная область может содержать часть природного шарнира или повторяющуюся единицу, в которой каждая единица в повторе выведена из природной шарнирной области. В некоторых вариантах осуществления природную шарнирную область изменяют посредством превращения одного или нескольких цистеиновых остатков в нейтральный остаток, такой как аланин, или посредством превращения подходящим образом расположенных остатков в цистеиновые остатки. Патент США № 5677425. Такие изменения проводят с использованием известных в данной области способов химии белка и, предпочтительно, генетической инженерии, и как описано здесь.

Полипептиды, специфически связывающиеся с пептидом Ав и слитые с константной областью тяжелой цепи, обладающей нарушенной эффекторной функцией, можно также применять для описанных здесь способов. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит последовательность, полученную из антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления полипептид получен из антитела с одним доменом, связывающегося с пептидом Ав. Антитело с одним доменом можно получить с использованием способов, известных в данной области. ОпнБГаг е! а1., Титоиг Бю1. 25:296-305 (2004); Нетпд е! а1., Тгепйз ш 21:484-489 (2003).

В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой Р(аЬ')₂фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой РаЬ фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой одноцепочечное антитело зсРу. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой пегилированный Р(аЬ')₂-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой пегилированный РаЬ-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело или полипептид представляет собой пегилированное одноцепочечное антитело зсРу.

Можно также использовать другие способы получения антител с нарушенной эффекторной функцией, известные в данной области.

Антитела и полипептиды с модифицированной константной областью можно тестировать в одном или нескольких анализах для оценки уровня снижения эффекторной функции в биологической активности по сравнению с исходным антителом. Например, способность антитела или полипептида с измененной Рс-областью связывать комплемент или Рс-рецепторы (например, Рс-рецепторы на микроглии), или измененную шарнирную область можно оценить с использованием анализов, описанных здесь, так же как любого известного в данной области анализа. РСТ АО 99/58572; Агтоиг е! а1., Мо1еси1аг 1ттипо1оду 40: 585-593 (2003); Кеййу е! а1., I. 1ттипо1оду 164:1925-1933 (2000); 8опд е! а1., 1пГес!юп апй 1ттиш!у 70:5177-5184 (2002).

Конкурентные анализы можно использовать для определения, связывают ли два антитела один и тот же эпитоп посредством распознавания идентичных или стерически перекрывающихся эпитопов, или одно антитело конкурентно ингибирует связывание второго антитела с антигеном. Эти анализы известны в данной области. Как правило, антиген иммобилизуют на многолуночном планшете и измеряют способность немеченых антител блокировать связывание меченых антител. Общепринятыми метками для таких конкурентных анализов являются радиоактивные метки или ферментативные метки.

Антитела и полипептиды, специфически связывающиеся с Ав, можно скринировать по эффективности удаления отложения амилоида и другим благоприятным эффектам, таким как улучшение когни

- 21 016193 тивных функций. Например, антитела или полипептиды можно вводить животному с патологией Альцгеймера. Различные модели на животных для болезни Альцгеймера известны в данной области. После введения уровень плотных и диффузных амилоидных бляшек, анализ поведения с точки зрения когнитивных функций, активацию микроглии и микрогеморрагию можно тестировать с использованием способов, известных в данной области и подробно описанных в примере 2. РСТ ХУО 2004/032868; ХУПсоск е( а1., 1. №иго8с1. 23:3745-3751 (2003); ХУПсоск е( а1., 1. №игош£ 1атта(юп 1:24 (2004).

Полинуклеотиды, векторы и клетки-хозяева

Изобретение относится также к выделенным полинуклеотидам, кодирующим антитела и полипептиды по настоящему изобретению (включая антитело, содержащее полипептидные последовательности вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи, показанных на фиг. 1), а также к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид.

Соответственно, изобретение относится к полинуклеотидам (или композициям, включая фармацевтические композиции), содержащим полинуклеотиды, кодирующие любое из следующего: (а) антитело 60 или его варианты, показанные в таблице 3; (Ь) фрагмент или область антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; (с) легкую цепь антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; (б) тяжелую цепь антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; (е) одну или несколько вариабельную область (области) из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; (ί) одну или несколько СИВ (одну, две, три, четыре, пять или шесть СИВ) антитела 6С или его вариантов, показанных в таблице 3; (д) СИВ НЗ из тяжелой цепи антитела 60; (к) СИВ Ь3 из легкой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; (ί) три СИВ из легкой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; (|) три СИВ из тяжелой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; (к) три СИВ из легкой цепи и три СИВ из тяжелой цепи антитела 60 или его вариантов, показанных в таблице 3; и (1) антитело, содержащее любое из (Ь)-(к). В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит любой полинуклеотид(ы), показанный на 8 ЕС 1И NΟ:9 и 8 ЕС 1И NΟ:10, или оба.

В другом аспекте изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим любое из антител (включая фрагменты антител) и полипептидов, описанных здесь, таких как антитела и полипептиды, с нарушенной эффекторной функцией. Полинуклеотиды можно получить способами, известными в данной области.

В другом аспекте изобретение относится к композициям (таким как фармацевтические композиции), содержащим любой из полинуклеотидов по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий антитело 60, как описано здесь. В другом варианте осуществления композиция содержит экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий любое из антител или полипептидов, описанных здесь. В других вариантах осуществления композиция содержит любой или оба из полинуклеотидов, показанных на 8Е0 1И NΟ:9 и 8Е0 1И NΟ:10. Экспрессирующие векторы и введение композиций полинуклеотидов описаны здесь далее.

В другом аспекте изобретение относится к способу получения любого из полинуклеотидов, описанных здесь.

Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, комплементарным любой такой последовательности. Полинуклеотиды могут являться одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными, и могут представлять собой молекулы ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК включают в себя молекулы ΗηΒΝΑ, которые содержат интроны и соответствуют молекуле ДНК один к одному, и молекулы мРНК, которые не содержат интронов. Внутри полинуклеотида по настоящему изобретению могут присутствовать, но не обязательно, дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности, и полинуклеотид может, но не обязательно, являться связанным с другими молекулами и/или материалами подложки.

Полинуклеотиды могут содержать природную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, кодирующую антитело или его часть) или могут содержать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотидов содержат одну или несколько замен, добавлений, делеций и/или вставок, таких что иммунореактивность кодируемого полипептида не является уменьшенной относительно природной иммунореактивной молекулы. Эффект на иммунореактивность кодируемого полипептида, как правило, можно оценить, как описано здесь. Варианты предпочтительно обладают по меньшей мере приблизительно 70% идентичностью, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% идентичностью с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей природное антитело или его часть.

Говорят, что две полинуклеотидные или полипептидные последовательности являются идентичными, если последовательность нуклеотидов или аминокислот в двух последовательностях является одинаковой при выравнивании для максимального соответствия, как описано ниже. Сравнения между двумя последовательностями, как правило, проводят посредством сравнения последовательностей по идентичности на протяжении окна сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства последовательности. Окно сравнения, как применяют здесь, обозначает фрагмент по меньшей ме

- 22 016193 ре приблизительно из 20 непрерывных положений, обычно от 30 до приблизительно 75, от 40 до приблизительно 50, в котором последовательность можно сравнивать с контрольной последовательностью из того же числа непрерывных положений после оптимального выравнивания двух последовательностей.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить с использованием программы Медайдп в пакете биоинформатического программного обеспечения Ьакегдепе (ΌΝΑ8ТАЯ, 1пс., Маб1коп, VI), с использованием параметров по умолчанию. В этой программе реализовано несколько схем выравнивания, описанных в следующих ссылках: ОауНоГГ, М.О. (1978) А тобе1 оГ еуо1иРопагу сНапде ш ргсЛеюк - Ма1псек Гог бе1есбпд бМаЩ геШюпкЫрк. 1п ОауНоГГ, М.О. (еб.) Абак оГ РгоШп 8едиепсе апб 81гис1иге, №1бопа1 Вютебюа1 Яекеагсй Роипбабоп, \Уа51ипд1оп ОС Уо1. 5, 8ирр1. 3, рр. 345358; Нет 1., 1990, Ишйеб АрргоасН 1о АИдптеп! апб РНу1одепек рр. 626-645 МеЛобк т Епхуто1оду уо1. 183, Асабетк Ргекк, 1пс., 8ап П1едо, СА; Шддтк, Ό.0. апб 8багр, Р.М., 1989, САВ1О8 5:151-153; Муегк, Ε.ν. апб Ми11ег V., 1988, САВ1О8 4:11-17; ЯоЬткоп, Ε.Ό., 1971, СотЬ. Тйеог. 11:105; 8ап1ои, Ν., №к, М., 1987, Мо1. Вю1. Еуо1. 4:406-425; 8пеа!б, Р.Н.А. апб 8ока1, Я.Я., 1973, №ипепса1 Тахопоту Не Рбпс1р1ек апб Ргасбсе оГ №.ппепса1 Тахопоту, Ргеетап Ргекк, 8ап Ргапаксо, СА; ^бЬиг, V.! апб Ыртап, Ό.Ι., 1983, Ргос. №б. Асаб. 8οΐ. И8А 80:726-730.

Предпочтительно, процент идентичности последовательности определяют посредством сравнения двух оптимально выровненных последовательностей на протяжении окна сравнения из по меньшей мере 20 положений, где часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пропуски) в 20% или менее, обычно от 5 до 15%, или от 10 до 12%, по сравнению с контрольными последовательностями (которые не содержат добавлений или делеций) для оптимального выравнивания двух последовательностей. Процент вычисляют посредством определения числа положений, в которых идентичные основания нуклеиновой кислоты или аминокислотные остатки присутствуют в обеих последовательностях, для определения числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в контрольной последовательности (т.е. размер окна) и умножения результатов на 100 для получения процента идентичности последовательности.

Варианты могут также, или альтернативно, являться, по существу, гомологичными природному гену или его части или комплементарной ему последовательности. Такие варианты полинуклеотидов являются способными гибридизоваться в умеренно строгих условиях с природной последовательностью ДНК, кодирующей природное антитело (или с комплементарной последовательностью).

Подходящие умеренно строгие условия включают в себя предварительную отмывку в растворе 5 X 88С, 0,5% 8Ό8, 1,0 мМ ЭДТА (рН 8,0); гибридизацию при 50-65°С, 5х88С в течение ночи; с последующей промывкой дважды при 65°С в течение 20 мин, каждая в 2х, 0,5х и 0,2х88С, содержащем 0,1% 8Ό8.

Как применяют здесь, высоко строгими условиями или условиями высокой строгости являются условия, при которых: (1) применяют низкую ионную силу и высокую температуру для отмывки, например 0,015 М хлорид натрия/0,0015 М цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°С; (2) во время гибридизации применяют денатурирующее средство, такое как формамид, например, 50% (об./об.) формамид с 0,1% бычьим сывороточным альбумином/0,1% фиколлом/0,1% поливинилпирролидоном/50 мМ натрий-фосфатным буфером при рН 6,5 с 750 мМ хлоридом натрия, 75 мМ цитратом натрия при 42°С; или (3) применяют 50% формамид, 5х88С (0,75 М №С1, 0,075 М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (рН 6,8), 0,1 % пирофосфат натрия, 5храствор Денхардта, обработанную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% 8Ό8 и 10% декстрансульфат при 42°С, с отмывками при 42°С в 0,2 х 88С (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°С с последующей отмывкой высокой строгости, состоящей из 0,1х88С, содержащего ЭДТА, при 55°С. Специалисту в данной области будет известно, как регулировать температуру, ионную силу и т.д., как необходимо для соответствия таким факторам, как длина зонда и т.п.

Обычному специалисту в данной области понятно, что в результате вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипептид, как описано здесь. Некоторые из этих полинуклеотидов обладают минимальной гомологией с нуклеотидной последовательностью любого природного гена. Тем не менее полинуклеотиды, которые различаются из-за различий в использовании кодонов, конкретно охвачены настоящим изобретением. Кроме того, аллели генов, содержащих полинуклеотидные последовательности, приведенные здесь, входят в объем настоящего изобретения. Аллели представляют собой эндогенные гены, которые различаются в результате одной или нескольких мутаций, таких как делеции, добавления и/или замены нуклеотидов. Полученные мРНК и белок могут, но не обязательно, обладать измененными структурой или функцией. Аллели можно идентифицировать с использованием общепринятых способов (таких как гибридизация, амплификация и/или сравнение с базой данных последовательностей).

Полинуклеотиды по настоящему изобретению можно получить с использованием химического синтеза, рекомбинантных способов или ПЦР. Способы химического синтеза полинухлеотидов хорошо известны в данной области и не нуждаются в подробном описании здесь. Специалист в данной области

- 23 016193 может использовать последовательности, предоставленные здесь, и коммерческий ДНК-синтезатор для получения желаемой последовательности ДНК.

Для получения полинуклеотидов с использованием рекомбинантных способов полинуклеотид, содержащий желаемую последовательность, можно вставить в подходящий вектор, и вектор, в свою очередь, можно ввести в подходящую клетку-хозяина для репликации и размножения, как обсуждают здесь далее. Полинуклеотиды можно вводить в клетки-хозяева посредством любых способов, известных в данной области. Клетки трансформируют введением экзогенного полинуклеотида посредством прямого поглощения, эндоцитоза, трансфекции, Р-конъюгации или электропорации. После введения экзогенный полинуклеотид может поддерживаться в клетке в форме неинтегрированного вектора (такого как плазмида) или интегрировать в геном клетки-хозяина. Размноженный таким образом полинуклеотид можно выделить из клетки-хозяина способами, хорошо известными в данной области. См., например, 8атЬгоок е! а1. (1989).

Альтернативно, ПЦР позволяет воспроизведение последовательностей ДНК. Способ ПЦР хорошо известен в данной области и описан в патентах США Νο. 4683195, 4800159, 4754065 и 4683202, также как в РСВ: ТНе Ро1утегаке СНат Веасбоп, Ми11к е! а1. ебк., Вйкаиклтег Ргекк, Βοκίοη (1994).

РНК можно получить, используя выделенную ДНК в подходящем векторе и вводя ее в подходящую клетку-хозяина. Когда клетка делится, и ДНК транскрибируется в РНК, РНК затем можно выделить с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области, как указано, например, в 8атЬгоок е! а1., (1989).

Подходящие клонирующие векторы можно конструировать согласно общепринятым способам, или можно выбирать из большого числа клонирующих векторов, доступных в данной области. В то время как выбранный клонирующий вектор можно менять в зависимости от предназначенной для использования клетки-хозяина, применимые клонирующие векторы, как правило, будут обладать способностью к самовоспроизведению, могут обладать одним участком узнавания для конкретной рестрикционной эндонуклеазы, и/или могут нести гены маркера, который можно использовать для отбора клонов, содержащих вектор. Подходящие примеры включают в себя плазмиды и бактериальные вирусы, например, рИС18, рИС19, В1ие8СТ1р! (например, рВ8 8К+) и их производные, тр18, тр19, рВВ322, рМВ9, Со1Е1, рСВ1, ВР4, фаговые ДНК и челночные векторы, такие как р8Л3 и рАТ28. Эти и многие другие векторы для клонирования доступны от коммерческих поставщиков, таких как ВюВаб, 8!та!едепе и Ιηνί!το^η.

Экспрессирующие векторы, как правило, представляют собой способные к репликации полинуклеотидные конструкции, содержащие полинуклеотид по настоящему изобретению. Подразумевают, что экспрессирующий вектор должен быть способен к репликации в клетках-хозяевах, либо в форме эписом, либо как интегрированная часть хромосомной ДНК. Подходящие экспрессирующие векторы включают в себя в качестве неограничивающих примеров плазмиды, вирусные векторы, включая аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, ретровирусы, космиды и экспрессирующий вектор(векторы), описанные в публикации РСТ Νο. \νθ 87/04462. Компоненты вектора обычно могут включать в себя, в качестве неограничивающих примеров, одно или несколько из следующего: сигнальная последовательность; точка начала репликации; один или несколько маркерных генов; подходящие контролирующие транскрипцию элементы (такие как промоторы, энхансеры и терминатор). Для экспрессии (т.е., трансляции), обычно необходимы один или несколько контролирующих трансляцию элементов, таких как участки связывания рибосомы, участки инициации трансляции и стоп-кодоны.

Векторы, содержащие интересующие полинуклеотиды, можно вводить в клетку-хозяина посредством любого числа подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с применением хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, ΌΕΑΕ-декстрана, или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфекцию (например, где вектор представляет собой инфекционный агент, такой как вирус осповакцины) . Выбор вводимых векторов или полинуклеотидов часто зависит от свойств клетки-хозяина.

Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозявам, содержащим любой из полинуклеотидов, описанных здесь. Любые клетки-хозяева, способные к сверхэкспрессии гетерологичных ДНК, можно использовать для целей выделения генов, кодирующих интересующие антитело, полипептид или белок. Клетки-хозява млекопитающих включают в себя в качестве неограничивающих примеров клетки СО8, НеЬа и СНО. См. также публикацию РСТ № νθ 87/04462. Подходящие не относящиеся к млекопитающим клетки-хозяева включают в себя прокариоты (такие как Е. со11 или В. киЫШк) и дрожжи (такие как 8. сеге\'кае. 8. ротЬе; или К. 1ас!к). Предпочтительно, клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне приблизительно в 5 раз выше, более предпочтительно, в 10 раз выше, еще более предпочтительно, в 20 раз выше, чем уровень соответствующего эндогенного интересующего антитела или белка, если они присутствуют, в клетках-хозяевах. Скрининг клеток-хозяев по специфическому связыванию с Αβι_-40 осуществляют посредством иммунологического анализа или РАС8. Можно идентифицировать клетку, сверхэкспрессирующую интересующее антитело или белок.

- 24 016193

Диагностические применения полученных из 6С антител и анти-Αβ антител с нарушенной эффекторной функцией

Антитело 60, которое связывается с С-концом Аβ, можно использовать для идентификации или детекции присутствия или отсутствия Аβ. Для простоты, ссылка будет сделана в основном на 60 или антитела, подразумевая, что данные способы применяют к любому из вариантов осуществления связывания Аβ (таким как полипептиды), описанных здесь. Детекция, как правило, включает в себя контактирование биологического образца с антителом, описанным здесь, которое связывается с Аβ, и формирование комплекса между Аβ и антителом (например, 60), которое специфически связывается с Аβ. Формирование такого комплекса может происходить ίη νίΐτο или ίη νίνο. Термин детекция, как применяют здесь, включает в себя качественную и/или количественную детекцию (измерение уровней) с отсчетом от контроля или без него.

Любой из множества известных способов можно применять для детекции, включая, в качестве неограничивающих примеров, иммунологический анализ с использованием антитела, связывающего полипептид, например, посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ΕΟδΑ), радиоиммунного анализа (ΚΙΑ) и т.п.; и функциональный анализ кодируемого полипептида, например, анализ по активности связывания или ферментативный анализ. В некоторых вариантах осуществления антитело является меченным поддающейся детекции меткой. Другие варианты осуществления известны в данной области и описаны здесь.

Антитела и полипептиды по изобретению можно использовать для выявления, диагностики и мониторирования заболевания, состояния или нарушения, связанного с измененной или аберрантной экспрессией Αβ или βАРР, такого как болезнь Альцгеймера и синдром Дауна. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам, включающим в себя контактирование пробы (образца) от индивидуума, у которого предполагают измененную или аберрантную экспрессию Аβ, с антителом или полипептидом по изобретению и определение, отличается ли уровень Аβ от уровня в контрольном или сравнительном образце. В других вариантах осуществления изобретение относится к способам, включающим в себя контактирование пробы (образца) от индивидуума и определение уровня экспрессии Аβ.

Для диагностических применений антитело можно метить поддающейся детекции группой, включая, в качестве неограничивающих примеров, радиоактивные изотопы, флуоресцентные метки и различные фермент-субстратные метки. Способы конъюгации меток с антителом известны в данной области. В другом варианте осуществления изобретения антитела по настоящему изобретению не нужно метить, и их присутствие можно выявлять с использованием меченого антитела, которое связывается с антителами по изобретению.

Антитела по изобретению можно применять в любом известном способе анализа, таком как анализы конкурентного связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации. Ζοΐα, Мопос1опа1 апбЬоФек: Α Мапиа1 οί Тес11тс|иек, рр.147-158 (СКС Ргекк, Ичс. 1987).

Антитела можно использовать также в диагностических анализах ίη νίνο, таких как визуализация ίη νίνο. Как правило, антитело метят радиоактивным изотопом (таким как ^Π1Ιη, ⁹⁹Тс, ¹⁴С, ¹³¹Ι, ¹²⁵Ι, или ³Н), так что интересующие клетки или ткань можно локализовать с использованием иммуносцинтиграфии.

Антитело можно также использовать в качестве окрашивающего реагента при патологии, следуя способам, хорошо известным в данной области.

Анти-Аβ антитела с нарушенной эффекторной функцией можно использовать для измерения накопления амилоида в мозге для диагностики субъекта, подверженного риску ΑΌ или с диагнозом ΑΌ, и оценки прогрессирования какого-либо лечения и стадии заболевания. Опубликовано, что периферическое введение моноклонального анти-Аβ антитела приводит к быстрому увеличению уровня Аβ в плазме и амплитуда этого увеличения хорошо коррелирует с накоплением амилоида в гиппокампе и коре головного мозга. ОеМа1Ю8 е1 а1., Баенсе 295:22 64-2267 (2002). В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят анти-Аβ антитело с нарушенной эффекторной функцией, и измеряют уровень Аβ в плазме, в соответствии с чем увеличение уровня Аβ в плазме указывает на присутствие и/или уровень накопления амилоида в мозге у субъекта. Эти способы можно использовать для мониторирования эффективности лечения и стадии заболевания и для определения будущих доз и частоты. Антитела с нарушенной эффекторной функцией могут обладать лучшими показателями безопасности и предоставлять преимущества для этих диагностических применений.

Способы использования анти-Аβ антитела для терапевтических целей.

Антитела (включая полипептиды), полинуклеотиды и фармацевтические композиции, описанные здесь, можно использовать в способах лечения, предупреждения и ингибирования развития болезни Альцгеймера и других заболеваний, связанных с измененной экспрессией Аβ или βАРР, или накоплением или отложением пептида Аβ (в совокупности обозначенных связанные с Аβ заболевания), таких как синдром Дауна, болезнь Паркинсона, мультиинфарктная деменция, синдром умеренных когнитивных нарушений, церебральная амилоидная ангиопатия, повреждение сосудов, вызванное отложением пепти

- 25 016193 да Ав в кровеносных сосудах (такое как инсульт и НСНХУА-Э). депрессия, болезнь Крейтцфельда-Якоба, и деменция с тельцами Леви. Такие способы включают в себя введение субъекту антител, полипептидов или полинуклеотидов, или фармацевтической композиции. При профилактических применениях фармацевтические композиции или лекарственные средства вводят пациенту, восприимчивому к болезни Альцгеймера, или иначе подверженному риску болезни Альцгеймера (или другого связанного с Ав заболевания), в количестве, достаточном для исключения или уменьшения риска, уменьшения тяжести или отсрочки дебюта заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие во время развития заболевания. Для терапевтических применений композиции или лекарственные средства вводят пациенту, у которого предполагают заболевание, или уже страдающему таким заболеванием, в количестве, достаточном для лечения, или, по меньшей мере, частичной остановки симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая его осложнения и промежуточные патологические фенотипы при развитии заболевания.

Изобретение относится также к способу отсрочки у субъекта развития симптома, связанного с болезнью Альцгеймера (или другим связанным с Ав заболеванием), включающему в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь антитело, полипептид или полинуклеотид. Симптомы, связанные с болезнью Альцгеймера, включают в себя в качестве неограничивающих примеров снижение памяти, нарушение решения проблем, речи, счета, зрительнопространственного восприятия, суждений и поведения.

Настоящее изобретение также относится к способам ингибирования или подавления формирования амилоидных бляшек и/или накопления Ав у субъекта, включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь антитело, полипептид или полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга субъекта. В других вариантах осуществления накопление Ав происходит в системе кровообращения субъекта.

Настоящее изобретение также относится к способам уменьшения амилоидных бляшек и/или уменьшения или замедления накопления Ав у субъекта, включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь антитело, полипептид или полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга субъекта. В других вариантах осуществления накопление Ав происходит в системе кровообращения субъекта.

Настоящее изобретение также относится к способам удаления амилоидных бляшек и/или накопления Ав у субъекта или очистки от них, включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь антитело, полипептид или полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в мозге субъекта. В некоторых вариантах осуществления амилоидные бляшки присутствуют в сосудах мозга субъекта. В других вариантах осуществления накопление Ав происходит в системе кровообращения субъекта.

Настоящее изобретение также относится к способам снижения уровня пептида Ав в ткани (такой как мозг), ингибирования и/или снижения накопления пептида Ав в ткани (такой как мозг) и ингибирования и/или снижения токсических эффектов пептида Ав в ткани (такой как мозг) у субъекта, включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, полипептид или полинуклеотид, описанные здесь. Полипептид Ав может присутствовать в растворимой, олигомерной или депонированной форме. Олигомерная форма Ав может являться составленной из 2-50 полипептидов Ав, которые могут представлять собой смесь полноразмерных пептидов 1-40 и 1-42 и/или любого усеченного варианта этих пептидов.

Изобретение относится также к способам улучшения когнитивных функций или обращения когнитивных нарушений, связанных с заболеваниями, связанными с отложением Ав у субъекта, такими как болезнь Альцгеймера, включающим в себя введение субъекту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей описанные здесь антитело, полипептид или полинуклеотид.

Описанные здесь способы (включая профилактику или терапию) можно осуществлять посредством однократной прямой инъекции в одной временной точке или во многих временных точках, в один или множество участков. Введение во множество участков может также являться почти одновременным. Частоту введения можно определить и регулировать во время курса терапии, и она основана на достижении желаемых результатов. В некоторых случаях могут являться подходящими составы с замедленным непрерывным высвобождением антител (включая полипептиды), полинуклеотидов и фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Различные составы и устройства для достижения замедленного высвобождения известны в данной области.

Пациенты, субъекты или индивидуумы включают в себя млекопитающих, таких как человек, крупный рогатый скот, лошади, собаки, кошки, свиньи и овцы. Субъект предпочтительно представляет собой человека и может являться или не являться пораженным заболеванием или в настоящее время обладающим симптомами. В случае болезни Альцгеймера практически любой подвержен риску страдать болез

- 26 016193 нью Альцгеймера, если он или она проживет достаточно долго. Таким образом, настоящие способы можно выполнять профилактически для общей популяции без необходимости какой-либо оценки риска для рассматриваемого пациента. Настоящие способы являются применимыми для индивидуумов, обладающих известным генетическим риском для болезни Альцгеймера. Такие индивидуумы включают в себя тех, кто обладает родственниками, перенесшими это заболевание, и тех, чей риск установлен посредством анализа генетических или биохимических маркеров. Генетические маркеры риска будущей болезни Альцгеймера включают в себя мутации в гене АРР, в частности, мутации в положении 717 и положениях 670 и 671, обозначенных, соответственно, как мутация Харди и шведская мутация (см. Нагбу (1997) Тгепбк №игокс1. 20:154-9). Другими маркерами риска являются мутации в генах пресенелина, Ρ81 и Ρ82, и АроЕ4, семейная история ΑΌ, гиперхолестеринемия или атеросклероз. Индивидуумов, в настоящее время страдающих болезнью Альцгеймера, можно распознать по характерной деменции, так же как по присутствию описанных выше факторов риска. Кроме того, доступен ряд диагностических тестов для идентификации индивидуумов с ΑΌ. Тесты включают в себя измерение уровней в С8Е !аи и Λβ42. Повышенные уровни 1аи и пониженные уровни Ав42 означают наличие ΑΌ. Индивидуумам, страдающим болезнью Альцгеймера, можно также ставить диагноз по критериям ΑΌΡΌΑ (Ассоциации болезни Альцгеймера и относящихся к ней расстройств). Для пациентов без симптомов лечение можно начинать в любом возрасте (например, 10, 20, 30). Обычно, однако, нет необходимости начинать лечение, пока пациент не достигнет 40, 50, 60 или 70. Лечение, как правило, включает в себя многократное дозирование в течение периода времени. Лечение можно мониторировать в течение времени различными способами, известными в данной области. В случае пациентов с потенциальным синдромом Дауна лечение можно начинать внутриутробно посредством введения лекарственного средства матери или вскоре после рождения.

Фармацевтическая композиция, которую можно использовать в вышеуказанных способах, содержит любое из антител, полипептидов и/или полинуклеотидов, описанных здесь. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело 6С или его варианты, показанные в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой антитело, специфически связывающееся с пептидом Ав и содержащее константную область с нарушенной эффекторной функцией.

Введение и дозирование

Антитело предпочтительно вводят млекопитающему в носителе; предпочтительно, в фармацевтически приемлемом носителе. Пригодные носители и их составы описаны в Яеттд!оп'к Рйагтасеи!юа1 Заепсек, 18(Н ебйюп, Α. Сеппаго, еб., Маск РиЫкЫпд Со., Еак!оп, ΡΑ, 1990; и Яеттд!оп, ТНе Зстепсе апб РгасЕсе οί Ρйа^тасу 201И Еб. Маск ΡυΗίκΗί^, 2000. Как правило, соответствующее количество фармацевтически приемлемой соли используют в составе для приведения состава в изотоническое состояние. Примеры носителя включают в себя физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. рН раствора составляет предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 8 и более предпочтительно от приблизительно 7 до приблизительно 7,5. Дополнительные носители включают в себя препараты для замедленного высвобождения, такие как полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, где матрицы присутствуют в форме сформированных предметов, например, пленок, липосом или микрочастиц. Специалистам в данной области очевидно, что конкретные носители могут являться более предпочтительными в зависимости, например, от способа введения и концентрации вводимого антитела.

Антитело можно вводить млекопитающему посредством инъекции (например, системной, внутривенной, внутрибрюшинной, подкожной, внутримышечной, интрапортальной, интрацеребральной, интрацеребровентрикулярной и интраназальной), или посредством других способов, таких как вливание, чтобы обеспечить его доставку в кровоток в эффективной форме. Антитело можно также вводить способами изолированной перфузии, такими как перфузия изолированной ткани, для достижения местных терапевтических эффектов. Внутривенная инъекция является предпочтительной.

Эффективные дозы и расписания для введения антитела можно определить эмпирически, и производство таких определений лежит в компетенции специалистов в данной области. Специалистам в данной области понятно, что доза антитела, которую нужно вводить, будет меняться в зависимости, например, от млекопитающего, которому будут вводить антитело, способа введения, конкретного типа используемого антитела и других лекарственных средств, вводимых млекопитающему. Руководство по выбору подходящих доз антитела можно найти в литературе по терапевтическому использованию антител, например, НапбЬоок οί Мопос1опа1 Αη!^Ьοб^ек, Ееггопе е! а1., ебк., №дек ΡηΜ^Εο^, ΡπγΗ Я1бде, N.1, 1985, с11. 22 апб рр. 303-357; Зтйй е! а1., Αη!^Ьοб^ек ш Нитап И1адпок1к апб Тйегару, НаЬег е! а1., ебк., Яауеп Ριόκκ, №\ν Уогк, 1977, рр. 365-389. Обычная ежесуточная доза антитела, используемого в отдельности, может лежать в диапазоне от приблизительно 1 мкг/кг вплоть до 100 мг/кг массы тела или более в сутки в зависимости от упомянутых выше факторов. Как правило, можно использовать любую из следующих доз: вводят дозу по меньшей мере приблизительно 50 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 3 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 1 мг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 750 мкг/кг массы тела; по меньшей мере

- 27 016193 приблизительно 500 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 250 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 100 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 50 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 10 мкг/кг массы тела; по меньшей мере приблизительно 1 мкг/кг массы тела, или более. Антитела можно вводить в меньших дозах или менее часто в начале лечения, чтобы избежать потенциальных побочных эффектов, таких как временная церебральная амилоидная ангиопатия (САА).

В некоторых вариантах осуществления может присутствовать более одного антитела. Такие композиции могут содержать по меньшей мере одно, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять различных антител (включая полипептиды) по изобретению.

Антитело можно также вводить млекопитающему в сочетании с эффективными количествами одного или нескольких других лекарственных средств. Антитело можно вводить последовательно или одновременно с одним или несколькими другими лекарственными средствами. Количество антитела и лекарственного средства зависит, например, от того, какой тип лекарственных средств используют, подлежащего лечению патологического состояния и способов введения, однако, как правило, оно будет меньше, чем при использовании каждого в отдельности.

После введения антитела млекопитающему физиологическое состояние млекопитающего можно мониторировать различными способами, хорошо известными специалисту в данной области.

Вышеуказанные принципы введения и дозирования можно адаптировать для полипептидов, описанных здесь.

Полинуклеотид, кодирующий описанные здесь антитело или полипептид, также можно использовать для доставки и экспрессии антитела или полипептида в желаемой клетке. Очевидно, что экспрессирующий вектор можно использовать для непосредственной экспрессии антитела. Экспрессирующий вектор можно вводить системно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно, подкожно, интратекально, интравентрикулярно, перорально, энтерально, парентерально, интраназально, на кожу или посредством ингаляции. Например, введение экспрессирующих векторов включает в себя местное или системное введение, включая инъекцию, пероральное введение, бомбардировку частицами или введение через катетер и местное введение. Специалисты в данной области знакомы с введением экспрессирующих векторов для получения экспрессии экзогенного белка ш т1то. См., например, патенты США № 6436908; 6413942; и 6376471.

Можно использовать также направленную доставку терапевтической композиции, содержащей полинуклеотид, кодирующий антитело по изобретению. Способы опосредованной рецептором доставки ДНК описаны, например, в Тшбе1к е( а1., Тгепбк Вю!есНпо1. (1993) 11:202; СЫои е( а1., Сепе ТНегареийск: Ме!Нобк Апб АррНсайопк Οί Эйес! Сепе ТгапкГег (ТА. ^оШ, еб.) (1994); \Уи е( а1., ί. Вю1. СНет. (1988) 263:621; \\'и е! а1., ί. Вю1. СНет. (1994) 269:542; 2епке е! а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8οΐ. (И8А) (1990) 87:3655; νυ е! а1., ί. Вю1. СНет. (1991) 266:338. Терапевтические композиции, содержащие полинуклеотид, вводят в диапазоне от приблизительно 100 нг до приблизительно 200 мг ДНК для местного введения по протоколу генотерапии. Концентрации, лежащие в диапазоне от приблизительно 500 нг до приблизительно 50 мг, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2 мг, от приблизительно 5 мкг до приблизительно 500 мкг и от приблизительно 20 мкг до приблизительно 100 мкг ДНК, также можно использовать в ходе протокола генотерапии. Терапевтические полинуклеотиды и полипептиды по настоящему изобретению можно доставлять с использованием носителей для доставки генов. Носитель для доставки генов может быть вирусного или не вирусного происхождения (см., в основном, 1о11у, Сапсег Сепе ТНегару (1994) 1:51; К1тига, Нитап Сепе ТНегару (1994) 5:845; Соппе11у, Нитап Сепе ТНегару (1995) 1:185; и Кар11!!, №1й1ге Сепейск (1994) 6:148). Экспрессию таких кодирующих последовательностей можно индуцировать с использованием эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности может являться либо конститутивной, либо регулируемой.

Векторы на основе вирусов для доставки желаемого полинуклеотида и экспрессии в желаемой клетке хорошо известны в данной области. Носители на основе вирусов включают в себя в качестве неограничивающих примеров рекомбинантные ретровирусы (см., например, публикации РСТ № XVΟ 90/07936; νΟ 94/03622; νΟ 93/25698; νΟ 93/25234; νΟ 93/11230; νΟ 93/10218; νΟ 91/02805; патенты США № 5219740; 4777127; патент Великобритании № 2200651; и ЕР 0345242), векторы на основе альфавирусов (например, векторы из вируса Синдбис, вируса леса Семлики (АТСС УК-67; АТСС УК-1247), вируса долины реки Росс (АТСС УК-373; АТСС УК-1246) и вируса венесуэльского энцефалита лошадей (АТСС УК-923; АТСС УК-1250; АТСС УК 1249; АТСС УК-532)), и аденоассоциированных вирусных (ААУ) векторов (см., например, публикации РСТ Ыо. νΟ 94/12649, νΟ 93/03769; νΟ 93/19191; νΟ 94/28938; νΟ 95/11984 и νΟ 95/00655). Можно применять также введение ДНК, связанной с убитым аденовирусом, как описано в Сипе1, Нит. Сепе ТНег. (1992) 3:147.

Можно применять также носители для доставки и способы, не на основе вирусов, включая в качестве неограничивающих примеров, конденсированную с поликатионами ДНК, связанную или не связанную с отдельным убитым аденовирусом (см., например, Сипе1, Нит. Сепе ТНег. (1992) 3:147); связанную с лигандом ДНК (см., например, νυ, ί. Вю1. СНет. (1989) 264:16985); клетки-носители для доставки в эукариотические клетки (см., например, патент США № 5814482; публикации РСТ № νΟ 95/07994; νΟ

- 28 016193

96/17072; \νθ 95/30763; и XVО 97/42338) и нейтрализацию нуклеинового заряда или слияние с мембранами клетки. Можно применять также голую ДНК. Примерные способы введения голой ДНК описаны в публикации РСТ № νθ 90/11092 и в патенте США № 5580859. Липосомы, которые могут действовать как носители для доставки генов, описаны в патенте США Ыо. 5422120; публикациях РСТ № νθ 95/13796; νθ 94/23697; νθ 91/14445; и ЕР 0524968. Дополнительные способы описаны в РЬШр, Мо1. Се11 Вю1. (1994) 14:2411, и в Vοίίеηб^η, Ргос. Ыа11. Αсаб. δα. (1994) 91:1581.

Наборы

Настоящее изобретение также относится к изделиям и наборам, содержащим вещества, применимые для лечения патологических состояний, таких как болезнь Альцгеймера или другие связанные с Αβ заболевания (такие как синдром Дауна, болезнь Паркинсона, мультиинфарктная деменция, синдром умеренных когнитивных нарушений, церебральная амилоидная ангиопатия, повреждение сосудов, вызванное накоплением пептида Аβ в кровеносных сосудах (такое как инсульт и ΗΟΗνΑ-Ω)), или для детекции или очистки Аβ или βАРР. Изделие содержит контейнер с этикеткой. Подходящие контейнеры включают в себя, например, флаконы, ампулы и пробирки. Контейнеры можно сформовать из множества материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию с активным средством, которое является эффективным для лечения патологических состояний, или для детекции или очистки Аβ или βАРР. Активное средство в композиции представляет собой антитело и предпочтительно содержит моноклональные антитела, специфические для Аβ или βАРР. В некоторых вариантах осуществления активное средство содержит антитело 6С или любые антитела или полипептиды, полученные из антитела 6С. В некоторых вариантах осуществления активное средство содержит описанные здесь анти-Аβ антитело или полипептид с нарушенной эффекторной функцией. В некоторых вариантах осуществления ан™^β антитело или полипептид содержит константную область тяжелой цепи, где константная область обладает нарушенной эффекторной функцией. В этикетке на контейнере указано, что композицию применяют для лечения патологических состояний, таких как болезнь Альцгеймера, или детекции или очистки Аβ или βАРР, и в этикетке можно также указывать инструкции для применения либо ш у1уо, либо ш У11го, такого как описанные выше применения.

Изобретение относится также к наборам, содержащим любое из описанных здесь антител (таких как 6С) , полипептидов, полинуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления набор по настоящему изобретению содержит описанный выше контейнер. В других вариантах осуществления набор по настоящему изобретению содержит описанный выше контейнер и второй контейнер, содержащий буфер. Он может дополнительно содержать другие вещества, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши с инструкциями для осуществления любых способов, описанных здесь (таких как способы лечения болезни Альцгеймера и способы ингибирования или уменьшения накопления пептида Аβ в мозге). В наборах, подлежащих применению для детекции или очистки Аβ или βАРР, антитело как правило, метят поддающимся детекции маркером, таким как, например, радиоактивный изотоп, флуоресцентное соединение, биолюминесцентное соединение, хемилюминесцентное соединение, хелатор металла или фермент.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композиции (описанной здесь) для применения в любом из описанных здесь способов, в контексте или использования в качестве лекарственного средства и/или использования для изготовления лекарственного средства.

Следующие примеры представлены для иллюстрации, но не для ограничения настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1. Определение аффинности связывания антитела 6С и его вариантов.

А. Общие методы.

Следующие общие методы использовали в этом примере и других примерах.

Экспрессирующий вектор, применяемый для характеризации клонов

Экспрессия ЕаЬ-фрагмента антител находилась под контролем индуцируемого 1РТС промотора 1ас2, сходного с описанным в ВагЬах (2001) РЬаде бйр1ау: а 1аЬога1огу тапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог, ΝΥ, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Рге§8 рд 2,10. (вектор рСот3Х), однако, модификации включали в себя добавление и экспрессию следующих дополнительных доменов: константный домен легкой цепи каппа человека и константный домен СН1 иммуноглобулина 1дС2а человека, С-область цепи 1д гамма-2, инвентарный номер белка Р01859; легкая цепь иммуноглобулина каппа (человека), инвентарный номер белка САА09181.

Мелкомасштабное получение ЕаЬ

Мелкомасштабную экспрессию ЕаЬ в 96-луночных планшетах проводили следующим образом. Начиная с Е. со11, трансформированной библиотекой ЕаЬ, отбирали колонии для инокуляции как эталонного планшета (ЬВ с агаром + ампициллин (50 мкг/мл) + 2% глюкоза), так и рабочего планшета (2 мл/лунку, 96 лунок/планшет, содержащих 1,5 мл ЬВ + ампициллин (50 мкг/мл) + 2% глюкоза). Оба планшета выращивали при 30°С в течение 8-12 ч. Эталонный планшет хранили при 4°С, а клетки из рабочего планшета осаждали при 5000 об./мин и ресуспендировали в 1 мл ЬВ+ампициллин (50 мкг/мл)+ 1 мМ 1РТС для индукции экспрессии ЕаЬ. Клетки собирали центрифугированием после времени экспрессии 5 ч при

- 29 016193

30°С, затем ресуспендировали в 500 мкл буфера НВ8-ЕР (100 мМ буфер НЕРЕ8 рН 7,4, 150 мМ №С1, 0,005% Р20). Лизиса ресуспендированных в НВ8-ЕР клеток достигали за один цикл замораживания (-80°С), затем оттаивания при 37°С. Лизаты клеток центрифугировали при 5000 об./мин в течение 30 мин для отделения обломков клеток от супернатантов, содержащих РаЬ. Затем супернатанты впрыскивали в аппарат плазмонного резонанса ΒΙΑοοκ для получения информации об аффинности для каждого РаЬ. Клоны, экспрессирующие РаЬ, размножали с эталонного планшета для секвенирования ДНК, крупномасштабного получения РаЬ и подробной характеризации, как описано ниже.

Крупномасштабное получение РаЬ

Для получения подробных параметров кинетики РаЬ экспрессировали и выделяли из крупномасштабных культур. Колбы Эрленмейера, содержащие 200 мл ЬВ+ампициллин (50 мкг/мл) + 2% глюкозы, инокулировали 5 мл ночной культуры из выбранного РаЬ-экспрессирующего клона Е. ^1ί. Клоны инкубировали при 30°С до достижения 0О_550НМ 1,0, и затем индуцировали посредством замены среды на 200 мл ЬВ+ампициллин (50 мкг/мл) + 1 мМ ΙΡΤΟ. После времени экспрессии 5 ч при 30°С клетки осаждали центрифугированием, затем ресуспендировали в 10 мл РВ8 (рН 8). Лизиса клеток достигали двумя циклами замораживания/оттаивания (при -80°С и 37°С соответственно). Супернатант лизатов клеток наносили на колонки с сефарозой №-ОТА хирегГЫт (Р1адеп, Уа1епаа. СА), уравновешенные РВ8, рН 8, затем промывали 5 объемами колонки РВ8, рН 8. Отдельные РаЬ элюировали в различных фракциях РВ8 (рН 8) + 300 мМ имидазол. Фракции, содержащие РаЬ, объединяли и диализовали в РВ8, затем количественно оценивали посредством ЕЫ8А перед характеризацией аффинности.

Получение полноразмерного антитела

Для экспрессии полноразмерных антител вариабельные области тяжелой и легкой цепи клонировали в экспрессирующие векторы для млекопитающих и трансфицировали с использованием липофектамина в клетки НЕК 293 для временной экспрессии. Антитела очищали с использованием белка А, применяя общепринятые способы.

Вектор рОЬ.6С.11Ес2а представляет собой экспрессирующий вектор, содержащий тяжелую цепь антитела 6С, и подходит для временной или стабильной экспрессии тяжелой цепи. Вектор рЬЬ.6С.НЕс2а обладает нуклеотидными последовательностями, соответствующими следующим областям: промоторная область цитомегаловируса мышей (нуклеотиды 1-612); синтетический интрон (нуклеотиды 619-1507); кодирующая область ОНРЯ (нуклеотиды 707-1267); сигнальный пептид гормона роста человека (нуклеотиды 1525-1602); вариабельная область тяжелой цепи 6С; константная область тяжелой цепи ΙβΟ2η человека, содержащая следующие мутации: А330Р331 до 83308331 (нумерация аминокислот по отношению к последовательности Ι§62η дикого типа; см. Еиг. 1. Iттиηο1. (1999) 29:2613-2624); поздний сигнал полиаденилирования 8У40; энхансерная область 8У40; область фага Г1 и кодирующая область бета-лактамазы (АтрЯ).

Вектор рЕЬ.6С.ЬК представляет собой экспрессирующий вектор, содержащий легкую цепь антитела 6С, и подходит для временной экспрессии легкой цепи. Вектор рЕЬ.6С.ЬК содержит нуклеотидные последовательности, соответствующие следующим областям: промоторная область цитомегаловируса мыши (нуклеотиды 1-612); интрон ЕР-1 человека (нуклеотиды 619-1142); сигнальный пептид гормона роста человека (нуклеотиды 1173-1150); вариабельная область легкой цепи антитела 6С; константная область каппа-цепи человека; поздний сигнал полиаденилирования 8У40; энхансерная область 8У40; область фага Г1 и кодирующая область бета-лактамазы (АтрЯ).

Анализ Ыаеоге

Аффинности моноклонального антитела 6С определяли с использованием системы поверхностного плазмонного резонанса (8РЯ) ΒIΑсο^е3000™ (ВШ^те, ШС, Р|хса\\'ау N1). Один способ определения аффинности представлял собой иммобилизацию 6С на чипе СМ5 и измерение кинетики связывания пептида Ав1_-40 или других пептидов Ав с антителом. Чипы СМ5 активировали гидрохлоридом №этилШ'-(3диметиламинопропил)-карбодиимида (ЕЭС) и №гидроксисукцинимидом (N48) согласно инструкциям производителя. Антитело 6С или его варианты растворяли в 10 мМ ацетате натрия рН 4,0 или 5,0 и впрыскивали поверх активированного чипа в концентрации 0,005 мг/мл. С использованием различного времени протекания через отдельные каналы чипа достигали диапазон плотности антитела: 1000-2000 или 2000-3000 единиц ответа (ЯИ). Чип блокировали этаноламином. Исследованиями регенерации показали, что раствор, содержащий 2 объема буфера для элюции РШЯСЕ и 1 объем 4 М №С1, эффективно удаляет связанный пептид Ав при сохранении активности 6С на чипе в течение более 200 впрыскиваний. Буфер НВ8-ЕР (0,01М НЕРЕ8, рН 7,4, 0,15 №С1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% сурфактант Р20) использовали в качестве рабочего буфера для всех анализов ВТАс^те. Серийные разведения (0,1-10х ожидаемой К_с) очищенного синтетического пептида Ав:_-40 или других образцов пептида Ав впрыскивали в течение 1 мин при 100 мкл/мин и обеспечивали периоды времени диссоциации по 10 мин. Кинетические константы ассоциации (1<_οιι) и константы диссоциации (Κ_ο[Γ) получали одновременно посредством подстановки данных в модель связывания 1:1 Ленгмюра ([υπΈχοη, Я. Εοοχ, Н. Радетх1ат, Ь. Ρеιе^xxοη. В. (1994). Способы Εηζ\τηο1ο§\· 6. 99-110) с использованием программы ΒIΑеνа1иаΐ^οη. Значения константы равновесия диссоциации (КО) рассчитывали как кой/кт.

- 30 016193

Άльтернативно, аффинность определяли посредством иммобилизации пептида Аβ1_-40 или других пептидов Άβ на чипе 8А и измерения кинетики связывания БаЬ из 60 и БаЬ из вариантов 60 с иммобилизованным пептидом Άβ. Άффинности БаЬ-фрагмента 60 и БаЬ-фрагментов его вариантов определяли посредством системы поверхностного плазмонного резонанса (8РЯ) (В1Асоге 3000™, В1Асоге, 1пс., Р1ксамау, N1). Чипы 8А (стрептавидин) использовали согласно инструкциям производителя. Биотинилированный пептид Άβ растворяли в НВ8-ЕР (100 мМ НЕРЕ8 рН 7,4, 150 мМ №С1, 3 мМ ЭДТ^ 0,005% Ρ20) и инъецировали поверх чипа в концентрации 0,005 мг/мл. С использованием различного времени протекания через отдельные каналы чипа, достигали двух диапазонов плотности антитела: 100-400 единиц ответа (ЯИ) для детальных кинетических исследований и 500-2000 ЯИ для исследований концентрации и скрининга. Исследованиями регенерации показали, что 100 мМ фосфорная кислота (за которой также может следовать раствор, содержащий 2 объема 50 мМ №011 и 1 объем 70% этанола) эффективно удаляет связанный БаЬ при сохранении активности пептида Άβ на чипе в течение более 200 впрыскиваний. Буфер НВ8-ЕР использовали в качестве рабочего буфера для всех анализов В1Асоге. Серийные разведения (0,1-10х ожидаемой ΚΌ) очищенных образцов БаЬ впрыскивали в течение 2 мин при 100 мкл/мин и обеспечивали периоды времени диссоциации по 10 мин. Концентрации белков БаЬ определяли посредством ЕБ18А и/или электрофореза 8Б8-РА0Е с использованием стандарта БаЬ известной концентрации (определенной посредством анализа аминокислот). Кинетические константы ассоциации (к_оп) и константы диссоциации (к_оПП) получали одновременно посредством подстановки данных в модель связывания 1:1 Ленгмюра (Каг1ккоп, Я. Яоок, Н. Бадегк!ат, Б. Ре!егккоп, В. (1994). Ме!Ьобк Еп/уто1оду 6. 99-110) с использованием программы ΒIАеνа1иа!^оп. Значения константы равновесия диссоциации (К_о) рассчитывали как коПП/ коп.

Анализ ЕЫ8А

ЕБ18А использовали для измерения связывания антитела 60 и вариантов с не биотинилированными пептидами Аβ. Планшеты NυNС тах1когр покрывали пептидами Άβ по 2,5 мкг/мл в РВ8 рН 7,4 в течение более чем 1 ч при 4°С. Планшеты блокировали 1% В8А в буфере РВ8 рН 7,4. Первичное антитело (из супернатантов клеток, из сыворотки, содержащей анти-Άβ антитело, или очищенное полноразмерное антитело, или БаЬ в желаемом разведении) инкубировали с иммобилизованными пептидами Άβ в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки планшеты инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с НЯР антителом козы против каппа-цепи человека (МР Вютеб1са1к, 55233), в разведении 1:5000. После промывки связывание вторичного антитела измеряли посредством добавления субстрата ТМВ (КРБ, 50-76-02, 50-65-02). Ρеакцию НЯР останавливали добавлением 1М фосфорной кислоты и измеряли поглощение при 450 нм.

ЕБ18А использовали для измерения связывания антитела 60 и его вариантов с биотинилированными пептидами Άβ. Планшеты NυNС тах1когр покрывали 6 мкг/мл стрептавидина (Р1егсе, 21122) в РВ8 рН 7,4 в течение более чем 1 ч при 4°С. Планшеты блокировали 1% В8А в буфере РВ8 рН 7,4. После промывки биотинилированные пептиды Άβ в РВ8 рН 7,4 инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Первичное антитело (из супернатантов клеток, из сыворотки, содержащей анти-Άβ антитело, или очищенное полноразмерное антитело или ТаЬ в желаемом разведении) инкубировали с иммобилизованными пептидами Άβ в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки планшеты инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с НЯР антителом козы против каппа-цепи человека (МР Вютеб1са1к, 55233), в разведении 1:5000. После промывки связывание вторичного антитела измеряли посредством добавления субстрата ТМВ (КРБ, 50-76-02, 50-65-02). Ρеакцию НЯР останавливали добавлением 1М фосфорной кислоты и измеряли поглощение при 450 нм.

В. Άффинность связывания антитела 60 и вариантов с Άβι_-40, Аβ1_-42 и другими пептидами Άβ.

Άминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела 60 показаны на фиг. 1. Άффинность связывания антитела 60 с Άβι_-40, Аβ1_-42 и Аβ_22-37, определенная с использованием В1асоге, описанного выше, показана в таблице 2 ниже.

Таблица 2.

связывания БаЬантитела 60

	%η (1/мсек)	%££ (1/сек)	Кп (нМ)
Биотинилированный Αβι-4ο, иммобилизованный на стрептавидиновом чипе, с протеканием поверх него ЕаЬ 60	3,0 х 105	7,0 х 10-4	2
Би о т инилир о в а нный Α β 4 4 2, иммобилизованный на стрептавидиновом чипе, с протеканием поверх него БаЬ 60	1,8 х 104	1,6 х 10~3	80
Биотинилированный Αβ22_37, иммобилизованный на стрептавидиновом чипе, с протеканием поверх него ГаЬ 60	3,6 х 105	3,9 х 10~3	11

- 31 016193

Аминокислотная последовательность вариантов 60 показана в табл. 3 ниже. Все замены аминокислот в вариантах, показанных в табл. 3, описаны относительно, последовательности 60. Относительное связывание вариантов 60 также показано в таблице

3. Связывание определяли посредством ЕЬ1БА, описанного выше, с небиотинилированными Ав_1-40 или в_1-42, иммобилизованными на поверхности планшета для ЕЬ1БА.

Таблица 3. Аминокислотные последовательности и_данные_связывания для вариантов антитела 60

- 32 016193

Пример 2. Характеризация эпитопа на пептиде Ав, который связывает антитело 60.

Для определения эпитопа на пептиде Ав, узнаваемого антителом 60, использовали анализы связывания ЕЫ8А. Различные пептиды Ав (01оЬа1 РерИбе 8егу1се§, СО) иммобилизовали на планшете для ЕЫ8А. Связывание полноразмерного антитела 60 (при 20 нМ) с иммобилизованным Ав определяли посредством ЕЫ8А, как описано выше. Аминокислотные последовательности Ав_1-40, Ав_1-42 и Ав_1-43 показаны в таблице 5 ниже. Как показано на фиг. 2, антитело 60 связывается с пептидами Ав 17-40, 17-42, 22-35, 28-40, 1-38, 1-40, 1-42, 1-43 и 28-42; однако связывание с 28-42 намного слабее, чем с другими пептидами Ав. Антитело 60 не связывается с пептидами Ав 1-16, 1-28 и 33-40. Таким образом, антитело 60 связывается с С-концом различных усеченных пептидов Ав, например, 22-35, 1-38, 1-40, 1-42 и 1-43.

В табл. 4 ниже показано сравнение аффинности связывания 60 для Ав_1-40 с другими пептидами Ав, как измерено по к_оГГ (1/с) с использованием анализа В1асоге. Антитело 60 связывает Ав_1-40 с наивысшей аффинностью по сравнению с другими пептидами, со значительно более низкой аффинностью к усеченному Ав_1-40 (такому как 1-36, 1-37, 1-38 и 1-39), Ав_1-42 и Ав_1-43. Это указывает на то, что боковая цепь или остов аминокислоты 40 (валин) Ав вовлечены в связывание 60 с Ав_1-40; и связывание значительно уменьшено в отсутствие этой аминокислоты (например, от приблизительно 10-кратной до приблизительно 50-250-кратной потери аффинности). Связывание с более низкой аффинностью с амидированным по С-концу Ав_1-40, показывает, что связывание 60 с Ав_1-40, вовлекает свободный С-конец Ав_1-40, но не является зависимым от него. Более низкая аффинность связывания с Ав_1-42 и Ав_1-43 может быть обусловлена конформационными различиями между мономерной формой Ав_1-40 и Ав_1-42 или Ав_1-43. Показано, что в растворе мономер Ав_1-42 обладает конформационными отличиями от мономера Ав_1-40. Смотри координаты структуры мономера для Ав_1-42, показанные в Базе данных белка (файлы рбЬ) с инвентарным номером по. 1ΙΥΤ; и координаты структуры мономера для Ав_1-40, показанные в Базе данных белка (файлы рбЬ) с инвентарным номерами по. 1ВА6 и 1 ВА4.

Таблица 4

Пептид заливали в качестве аналита на чип СМ5 с моноклональным антителом 60 (лигандом), иммобилизованным посредством химической реакции с аминогруппой #пептид с амидированным Сконцом.

Картирование эпитопов антитела 60 проводили посредством анализа ЕЫ8А. Биотинилированные 15-членные или 10-членные различные пептиды Ав (эти пептиды обладают глицином, добавленным к Сконцу) иммобилизовали на покрытых стрептавидином планшетах. Антитело 60 (от 2,5 мкг/мл до 10 мкг/мл) инкубировали с иммобилизованными пептидами и измеряли связывание, как описано выше. Как показано на фиг. 3, антитело 60 связывается с пептидами Ав с аминокислотами 20-34, 21-35, 22-36, 2337, 24-38, 25-39 и 25-34 с глицином на С-конце; но не связывается с пептидами Ав с аминокислотами 1933, 26-40, 27-41, 24-33 и 26-35, обладающими глицином на С-конце этих пептидов. Это позволяет предполагать, что эпитоп, с которым связывается антитело 60, содержит аминокислоты от 25 до 34.

На основании показанных выше данных, эпитоп, с которым связывается антитело 60, по-видимому

- 33 016193 содержит аминокислоты 25-34 и 40. Фиг. 4 представляет собой схематическое изображение, показывающее эпитоп антитела 60.

Таблица 5. Аминокислотные последовательности β-амилоидных пептидов

1-40 (ИТ)	ОАЕРКНОЗСУЕУННОКЬУРГАЕОУСЗЫКСАИСТ Μνοενν (8Εζ) Ю N0:15)
1-42 (ИТ)	ОАЕЕКНОЗОУЕУННОКЦУЕЕАЕОУСЗМКОАНОЪ ΜνΟΟννίΑ (8Ε0 Ю N0:16)
1-43 (ИТ)	0ΑΕΓΚΗϋ80ΥΕνΗΗ0ΚΕνΓΕΑΕ0ν08ΝΚ0ΑΙЮЬ ΜΥΟΟννίΑΤ (5Εζ) Ιϋ N0:17)

В. Антитело 60 не связывается с АРР.

Для определения, связывается ли 60 с белками-предшественниками амилоида (АРР), определяли связывание 60 с клетками, трансфицированными АРР дикого типа. Клетки НЕК2 93 трансфицировали кДНК, кодирующей человеческий белок-предшественник амилоида дикого типа. Через 48 ч после трансфекции клетки инкубировали во льду в течение 45 мин с моноклональными антителами анти-Ав_1-16, (т2324) или 60 (5 мкг/мл в ЭМЕМ с 10% ГС8). Затем клетки промывали три раза в РВ8 в течение 5 мин, фиксировали 4% РГА. Клетки снова промывали три раза в РВ8, и связывание антитела детектировали с вторичным Су3-конъюгированным антителом козы против антител мыши (разведение 1:500) из баскзоп 1ттипоге8еагсй под флуоресцентным микроскопом.

Как показано на фиг. 5, для анти-Ав1_-1₆ антитела, узнающего Ν-концевые эпитопы на Ав, показали значительное связывание с белками-предшественниками АРР, экспрессированными на клетках. Напротив, 60 не связывается с экспрессирующими АРР клетками.

Пример 3. Характеризация эпитопа на пептиде Ав, с которым связывается антитело 2294.

Антитело 2294 представляет собой антитело мыши, индуцируемое посредством иммунизации мыши Ав1_-40. Это антитело описано в И8 2004/0146512 и АО 04/032868.

Аффинность связывания с Ав_1-40, Ав1_-42 или Ав_22-37 для антитела 2294 измеряли с использованием В1асоге, как описано выше. В табл. 6 ниже показана аффинность ГаЬ-фрагмента антитела 2294 для различных пептидов Ав.

Таблица 6. Аффинность связывания ГаЬ-фрагмента антитела 2294

	коп (1/мсек)	ко££ (1/сек)	Ко (нМ)
Биотинилированный Αβι_4ο, иммобилизованный на стрептавидиновом чипе, с протеканием поверх него ГаЬ 2294	6,6 χ 104	3,95 х 10~4	6
Биотинилированный Άβι-42< иммобилизованный на стрептавидиновом чипе, с протеканием поверх него ГаЬ 2294 Биотинилированный Αβ22-37 τ иммобилизованный на стрептавидиновом чипе, с протеканием поверх него ГаЬ 2294	1,1 х 104 5 х 103	4,87 х 10~3 0,049	400 10000

Картирование эпитопов антитела 2294 проводили посредством анализа ЕЫ8А. Биотинилированные 15-членные или 10-членные различные пептиды Ав (эти пептиды обладают глицином, добавленным к Сконцу) иммобилизовали на покрытых стрептавидином планшетах. Планшеты ΝΟΝΟ тахЕогр покрывали 6 мкг/мл стрептавидина (Р1егсе, 21122) в РВ8 рН 7,4 в течение более чем 1 ч при 4°С. Планшеты блокировали 1% В8А в буфере РВ8 рН 7,4. После промывки биотинилированные пептиды Ав в РВ8 рН 7,4 инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Антитело 2294 (от 2,5 мкг/мл до 10 мкг/мл) инкубировали с иммобилизованными пептидами Ав в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки планшеты инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с НРР антителом козы против каппацепи человека (МР ВютеФсаЕ, 55233), в разведении 1:5000. После промывки связывание вторичного антитела измеряли посредством добавления субстрата ТМВ (КРБ, 50-76-02, 50-65-02). Реакцию НИР останавливали добавлением 1М фосфорной кислоты и измеряли поглощение при 450 нм. Как показано на фиг. 6, антитело 2294 связывается с пептидами Ав с аминокислотами 20-34, 21-35, 22-36, 23-37, 24-38, 25-39, 26-40 и 25-34 с глицином на С-конце; но не связывается с пептидами Ав с аминокислотами 19-33, 27-41, 24-33 и 27-35, обладающими глицином на С-конце этих пептидов. Это позволяет предполагать, что эпитоп, с которым связывается антитело 2294, содержит аминокислоты от 26 до 34.

Для дополнительного определения эпитопа на пептиде Ав, узнаваемого антителом 2294, использо

- 34 016193 вали анализы связывания ΕΕΙ8Α. Различные пептиды Аβ (0кЬа1 Рерббе ЗегОсек, С0) иммобилизовали на планшете для ΕΕΙ8Α. Связывание полноразмерного антитела 2294 (при 20 нМ) с иммобилизованным Ар определяли посредством ΕΕΙ8Α, как описано выше. Антитело 2294 связывается с пептидами Аβ 1740, 17-42, 28-40, 1-38, 1-40, 1-42 и 1-43. Антитело 2294 не связывается с пептидами Аβ 1-16, 1-28, 28-42, 22-35 и 33-40. Таким образом, антитело 2294 связывается с С-концом различных усеченных пептидов Ар, например, 1-38, 1-40, 1-42 и 1-43.

В табл. 7 ниже показано сравнение связывания 2294 с Αβ_1-40 и с другими пептидами Аβ. как измерено в анализе Βί;κοΐΌ. Антитело 2294 (полноразмерное антитело) обладает самым сильным связыванием с Λβι_-40 по сравнению с другими пептидами, со значительно более низким связыванием с усеченным Αβι_-4ο (таким как 1-36, 1-37, 1-38 и 1-39), Λβ₁.42 и Λβ₁.4з. Это указывает на то, что боковая цепь или остов аминокислоты 40 (валин) Аβ вовлечены в связывание 2294 с Αβμ^; и связывание значительно уменьшено в отсутствие этой аминокислоты.

Таблица 7

+ обозначает очень низкое связывание;

++ обозначает среднее связывание;

+++ обозначает сильное связывание и ++++ обозначает очень сильное связывание.

На основании показанных выше данных, эпитоп, который связывает антитело 2294, по-видимому, содержит аминокислоты 26-34 и 40. Антитело 2294 связывается с эпитопом, очень похожим на эпитоп для антитела 60, как показано на фиг. 6. Однако связывание антитела 60 менее зависит от аминокислоты 40, чем связывание антитела 2294.

Проводили эксперименты конкурентного связывания антител для 2294, 60, 2Н6 и 2289 с использованием анализа Βί;κοΐΌ. Антитело 2Н6 представляет собой антитело, которое связывается с Аβзз.4₀ и описано в предварительной патентной заявке США 60/653197, поданной 14 февраля 2005 г. Антитело 2289 представляет собой антитело, которое связывается с Αβ^β и описано в публикации США № 2004/0146512 и РСТ Ж) 04032868. Конкурентные эксперименты проводили с использованием анализа Βί;κοΐΌ. Антитела 2294, 60, 2Н6 и 2289 иммобилизовали на различных каналах чипа СМ5. Каналы СМ5 активировали гидрохлоридом №этил-№-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (ЕБС) и ^гидроксисукцинимидом (N48) согласно инструкциям производителя. Каждое из антител 2294, 60, 2Н6 и 2289 разводили 10 мМ ацетатом натрия рН 4,0 и впрыскивали поверх активированного чипа в концентрации 0,005 мг/мл. Каждый канал блокировали этаноламином. Пептид Αβι_-40 (150 мкМ) заливали на чип в течение 2 мин. Затем антитело 2294 (подлежащее тестированию по конкурентному связыванию) при 0,6 мкМ заливали на чип в течение 1 мин. Буфер НВ8-ЕР (0,01М НЕРЕ8, рН 7,4, 0,15 М №С1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% сурфактант Р20) использовали в качестве рабочего буфера для всех анализов ΒΙΑσοι^. После измерения связывания Αβμ^, все каналы на чипе регенерировали посредством промывания дважды смесью буфера для элюции Р1егсе (Рюбис! ^. 21004, Р1егсе ΒίοίβοΗηο1ο§γ, Κοскίο^б, ЕБ) и 4 М №С1 (2:1) в течение 6 с. Затем проводили конкурентное связывание для антитела 60, 2Н6 и затем антитела 2289. Наблюдали конкуренцию за связывание с Αβμ^ между 2294 и 60, и между 2294 и 2Н6, однако не обнаружили конкуренции между 2294 и 2289 или между 60 и 2289. Наблюдения конкуренции между иммобилизованным антителом и тем же самым антителом, заливаемым на чип, служили положительным контролем. Данные показывают, что антитело 2294 конкурирует с 2Н6 и 60 за связывание с Αβμ^.

Пример 4. Аффинность связывания Ес-областей антитела 2294 с Есу-рецепторами мыши.

Аффинность связывания Ес-областей антитела с Есу-рецепторами измеряли с использованием

- 35 016193

В1Асоге, как описано выше. Коротко, очищенные Есу-рецепторы мыши (из Κ&Ό 8ук!етк) иммобилизовали на чипе СМ5 В1Асоге посредством химической реакции с аминогруппой. Впрыскивали серийные разведения моноклональных антител (в диапазоне от 2 нМ до максимальной концентрации, как указано в таблице 8). НВ8-ЕР (0,01М НЕРЕ8, рН 7,4, 0,15 М №аС1, 3 мМ ЭДТА, 0,005% сурфактант Р20) служил рабочим буфером и буфером для образцов. Данные связывания анализировали с использованием модели взаимодействия 1:1 Ленгмюра для взаимодействий с высокой аффинностью, или модель равновесной аффинности для взаимодействий с низкой аффинностью.

В табл. 8 ниже показана аффинность связывания антитела 2294, как измерено по К_о (нМ) для мышиных ЕсуК1, ЕсуК11Ь и ЕсуКШ. Дегликозилированные антитела обладали константной областью с удаленным Ν-гликозилированием. Как показано в табл. 8, дегликозилированное 2294 обладает уменьшенной аффинностью для всех тестированных Есу-рецепторов мыши по сравнению с каждым соответствующим антителом без удаления Ν-гликозилирования.

Таблица 8. Аффинность связывания антител ,для мышиных Есу-рецепторов, как измерено по Кр (нМ)

Антитело	ΓογΚΙ	ГсуКИЬ	ГсуКШ	Изотип	Максимальная концентрация антитела, тестируемая по связыванию с Гсурецепторами (нМ)
2294	1200	13000	19000	1дС2Ь мыши	18000
Дегликозилир ованное 2294	8600	ΝΒ	ΝΒ	Дегликозилирован ное 1дС2Ь мыши	22000

ΝΒ: отсутствие существенного связывания при использовании антитела в максимальной тестируемой концентрации.

Пример 5. Эффект антитела 2294 и дегликозилированного антитела 22 94 на уменьшение отложения Ав и когнитивную функцию в модели болезни Альцгеймера на животных.

Дегликозилированное антитело 2294 получали посредством инкубации очищенного антитела 2294 при 37°С в течение 7 суток с пептид-Ν-гликозидазой Е (Рго/уте, 0,05 ед. на мг антитела) в 20 мМ ТпкНС1 рН 8,0. Завершение дегликозилирования подтверждали посредством МАЬО1-Т0Е-М8 и гельэлектрофореза белка. Дегликозилированные антитела очищали посредством хроматографии с белком А и эндотоксин удаляли с помощью Р-сефарозы. Аффинность связывания дегликозилированного 22 94 с Ав_1-40 тестировали с использованием анализа В1асоге, описанного выше, и обнаружили, что аффинность связывания дегликозилированного 2294 с Ав_1-40 такая же, как у интактного антитела 2294.

Антитело 2294 и дегликозилированное 2294 тестировали в трансгенных мышах АРР Тд2576 по их эффекту обращения когнитивных нарушений, гистологических симптомов и микрогеморрагии. Введение антитела, гистологические анализы и анализы поведения проводили, как описано ниже.

Введение антител. Для экспериментов использовали трансгенных мышей со сверхэкспрессией шведского мутанта белка-предшественника амилоида (АРР Тд2576 с К670N/М671; Нк1ао е! а1., 8с1еисе 274:99-102 (1996)). Подобный болезни Альцгеймера фенотип, присутствующий у этих мышей, хорошо охарактеризован. Но1сотЬ е! а1., №а!. МеФ. 4:97-100 (1998); Но1сотЬ е! а1., Βейаν. 0еи. 29:177-185 (1999); и Мс0о^аи Е., №игоЬю1. Э1к. 6:231-244 (1999). Для шестнадцатинедельного исследования лечения АРРтрансгенных мышей в возрасте 20 месяцев записывали в одну из четырех групп. Первой группе еженедельно вводили внутрибрюшинные инъекции анти-Ав антитела 2294 в течение периода 16 недель (и = 4). Второй группе еженедельно вводили внутрибрюшинные инъекции дегликозилированного анти-Ав антитела 2294 в течение периода 16 недель (и = 5). Третьей группе еженедельно вводили внутрибрюшинные инъекции анти-АМ№ антитела (2906; мышиное моноклональное 1д01 против связанного с амнезией белка дрозофилы) в течение периода 16 недель (и = 6) . Не трансгенных однопометных животных обрабатывали в течение 16 недель либо анти-АМ№ антителом (и = 4), либо 2294 (и = 2).

Анализ поведения. После 16 недель обработки антителами мышей из исследования подвергали двухсуточному испытанию в водном лабиринте с радиальными ответвлениями, как описано ранее. ^ίίсоск е! а1., Е №иготГ ίаш^ηа!^оη 1:24 (2004). Аппарат представляет собой 6-лучевой лабиринт, как описано ранее. 0огФои е! а1., №игоЬюЕ Адтд 22:377-385 (2001). На первые сутки проводили 15 испытаний в трех блоках по 5. Каждый блок проводили последовательно для когорты из 4 мышей (т.е., каждая из 4 мышей проходила испытание один, затем та же самая мышь проходила испытание два, и т.д.). После каждого блока из 5 испытаний проводили испытания для второй когорты мышей, обеспечивая дополнительный период отдыха перед тем, как подвергнуть мышей второму блоку из 5 испытаний. Целевые ответвления отличались для каждой из мышей, чтобы минимизировать сигнализацию запахом. Стартовое ответвление меняли для каждого испытания, сохраняя целевое ответвление постоянным для данного ин- 36 016193 дивидуума в течение обоих суток. В течение первых 11 испытаний платформа являлась попеременно видимой, затем спрятанной (спрятанной в течение последних 4 испытаний). На вторые сутки для мышей проводили испытания точно таким же образом, как на первые сутки, за исключением того, что платформа являлась спрятанной в течение всех испытаний. Число ошибок (входов в неправильное ответвление) измеряли в одноминутном интервале времени. Для мышей, не сумевших сделать выбор ответвления в течение 20 с, записывали одну ошибку, однако в данном исследовании ни для одной из мышей не записали ошибку таким образом. Благодаря номерам мышей в данном исследовании испытателю неизвестна принадлежность каждой мыши к группе лечения. Поскольку зависимые измерения в испытании в водном лабиринте с радиальными ответвлениями являлись количественными, не оценочными, возможность предубеждения исследователя снижена. Чтобы минимизировать влияние индивидуальной вариабельности в исследовании, находили среднее число ошибок для каждой мыши в течение 3 последовательных испытаний, получая 5 экспериментальных точек для каждых суток, которые анализировали статистически посредством ΑNΟVΑ с использованием 8(а(У1е\у (8Α8 1п5(1(н(е 1пс., N0).

Гистологический анализ. На сутки умерщвления мышей взвешивали, вводили избыточную дозу 100 мг/кг нембутала (АЬЬо(( 1аЬога(опе8, №г(11 Сйсадо, 1Ь), и затем проводили интракардиальную перфузию 25 мл 0,9% хлорида натрия. Мозг быстро удаляли, и левые половины мозга подвергали иммерсионной фиксации в течение 24 ч в свежеприготовленном 4% параформальдегиде в 100 мМ КРО₄ (рН 7,2) для гистопатологического анализа. Затем половины мозга инкубировали в течение 24 ч последовательно в 10, 20 и 30% сахарозе для криопротекции. Собирали горизонтальные срезы толщиной 25 мкм с использованием санного микротома и хранили при 4°С в забуференном фосфатом физиологическом растворе Дульбекко с азидом натрия (рН 7,2) для предупреждения микробного роста. Серии из 8 одинаково отделенных срезов ткани на расстоянии 600 мкм, перекрывающие весь мозг, выбирали случайно и окрашивали по тотальному Ав с использованием иммунохимических методов в растворах (поликлональные антитела кролика анти-пан Ав; Вюкоигсе, СашапПо, СА, 1:10,000), как описано ранее. 0огбоп е( а1., Ехр. №иго1. 173:183-195 (2002); ХУПсоск е( а1., 1. №иго8ск 24:6144-6151 (2004). Вторую серию срезов на расстоянии 600 мкм окрашивали с использованием 0,2% Конго красного в №1С1-насыщенном 80% этаноле. Другой набор срезов также фиксировали и окрашивали по гемосидерину с использованием 2% ферроцианида калия в 2% соляной кислоте в течение 15 мин, с последующим контрастирующим окрашиванием в 1% растворе нейтрального красного в течение 10 мин. Количественную оценку окрашивания Конго красным и иммуногистохимического анализа Ав проводили с использованием 1таде-Рго Р1и§ (Меб1а СуЬетеБск, 8Пуег 8ргшд, ΜΌ) для анализа процента площади, занятого положительным окрашиванием. Анализировали одну лобную область коры головного мозга и три области гиппокампа (чтобы убедиться, в отсутствии регионального сдвига значений для гиппокампа). Начальный анализ с Конго красным проводили для получения суммарного значения. Второй анализ проводили после вычеркивания вручную всех паренхимных отложений амилоида, чтобы получить процент площади, ограниченной по окрашиванию сосудов Конго красным. Для определения паренхимной площади для Конго красного, значения для амилоида сосудов вычитали из общего процента. Для окрашивания по гемосидерину подсчитывали число положительных для Прусского голубого участков на всех срезах и вычисляли среднее число участков на срез. Качественные различия между животными наблюдали на срезах при низком увеличении. Обследовали восемь одинаково отделенных срезов и определяли число положительных параметров с усреднением значений для среза. Для оценки возможных различий, связанных с обработкой, значения для каждой группы обработки анализировали посредством одностороннего ΑNΟVΑ с последующими сравнениями средних Ь8И по Фишеру.

Измерение уровня пептида Ав в сыворотке с использованием ЕЫ8А. Сыворотку, собранную через одни сутки после последнего введения антител, разбавляли и инкубировали в 96-луночных титрационных микропланшетах (Мах18огр; Νιιηα ВоккНбе, Иепшагк), предварительно покрытых антителом 6Е10 (антитело против бета-амилоида, которое связывается с Ав_1-17; 81дие(, Иебйат, МА) при 5 мкг/мл в буфере РВ8, рН 7,4. Вторичным антителом являлось биотинилированное 408 (антитело против бетаамилоида, которое связывается с Авг_7-24; 81дие() в разведении 1:5000. Детекцию осуществляли с использованием конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена (Атешйаш Вюкаеисек) с последующим использованием субстрата ТМВ (КРЬ, 0аййег8Ьигд, ΜΌ). Для стандартных кривых использовали Ав1_-40 (Атепсаи РерЕбе), возрастающий от 6 до 400 пМ.

Понятно, что примеры и варианты осуществления, описанные здесь, приведены только для иллюстративных целей и что специалисты в данной области будут предполагать различные модификации или изменения в свете этого, которые следует включать в сущность и содержание настоящей заявки. Содержание всех процитированных здесь публикаций, патентов и патентных заявок полностью приведено здесь в качестве ссылки для всех целей в той же степени, как если бы для каждой отдельной публикации, патента или патентной заявки было указано, что они таким образом приведены в качестве ссылки.

- 37 016193

Депонирование биологического материала

Следующие материалы депонированы в Американской коллекции типовых культур, 10801 Ешсегзйу Вои1еуагб, Маиаккак, Упупш 20110-2209, ϋ8Α (АТСС):

Материал рОЬ.6С.НГс2а рЕЬ.66.НК

Νο. антитела тяжелая цепь 66 легкая цепь 66

Инвентарный

Νο. В АТСС

РТА-6786

РТА-6787

Дата депонирования 15 июня 2005 г. 15 июня 2005 г.

Вектор рЕЬ.60.11К представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную область легкой цепи 60 и константную область легкой цепи каппа; и вектор р1)Ь.60.11Ес2а представляет собой полинуклеотид, кодирующий вариабельную: область тяжелой цепи 60 и константную область тяжелой цепи 1д02а, содержащую следующие мутации: А330Р331 до 83308331 (нумерация аминокислот основана на нумерации КаЬа! относительно последовательности 1д02а дикого типа; см. Еиг. I. ^ттоЕ (1999) 29:2613-2624).

Данные депонирования сделаны по условиям Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры и регламентирования в силу этого договора (Будапештского договора). Это обеспечивает поддержание жизнеспособной культуры в депозите в течение 30 лет от даты депонирования. Депозит будет сделан доступным через АТСС по условиям Будапештского договора, и является субъектом соглашения между Кта! Хечп'окае'исе' Согр. и АТСС, которое обеспечивает постоянную и неограниченную публичную доступность потомства культуры из депозита после выдачи соответствующего патента США или после опубликования любой патентной заявки США или иностранной, какая бы ни вышла первой, и обеспечивает доступность потомства лицу, определенному комиссаром по выдаче патентов и торговых знаков США, как имеющему на это полномочия, согласно статье 122 35 и8С и правилам комиссара в соответствии с этим (включая статью 1.14 37 СРВ с конкретной ссылкой на 886 О0 638).

Патентообладатель настоящей заявки подписал соглашение, что, если депонированная культура материалов погибнет, или будет потеряна, или уничтожена при культивировании в подходящих условиях, материал будет сразу после уведомления заменен другим таким же. Доступность депонированного материала не следует рассматривать как лицензию на практическое осуществление настоящего изобретения в нарушение прав, предоставленных властью любого правительства в соответствии с его патентным законодательством.

Последовательности антител

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи 60 (8ΕΕ) ΙΌ NО: 1) <2У<23 6АЕУККРСАЗУКУЗ СКАЗ6ΥΤ ЕТТ ΥΑΙ ΗΐΛίνΚζ)

АРСОСЬЕИМСЕТ3ΡΥ56ν3ΝΥΝ0ΚΕΚ6ΚУТМТКОТ3Т3Т νΥΜΕΕ33ΕΚ3ΕΟΤΑνΥΥΟΑΚΕΟΝΥΟΚ6ΥνΚΟΥΜ606ΤΕν ТУЗ

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи 60 (8ΕΕ) ΙΌ NО:2) ϋΐУМТ£)8 Ρ ϋ3 ЬАУЗИЗЕК.АТ I N0 РАЗ Е 8 νϋΝϋΚ I 3 ЕЬЫИ

УООКРСОРРКЕЫУААТКОСТСУРОКЕЗСЗбЗСТОГТЬТ

I5ЗЬОАЕОУАУУУСООЗКЕЕРЭД5ΕΟΟΟΤΚνΕΙККТУ

СЭВ Н1 60 (расширенная СЭВ) (8Ερ ГО Ш: 3)

СУТЕТТУА1Н

СЭВ Н2 60 (расширенная СЭВ) (8Ερ ГО Ш: 4)

ЕТЗΡΥ8Θν3ΝΥΝ3ΚΓΚ6

СЭВ Н3 60 (расширенная СЭВ) (8ΕΡ ΙΌ NО: 5)

ΓϋΝΥΟΚΟΥνΚΟΥ

СЭВ Е1 60 (расширенная СЭВ) (8ΕΡ ΙΌ ΝΡ: 6)

ΚΆ3Ε3ν0Ν0ΚΙ3ΓΣΝ

СЭВ Е2 60 (расширенная СЭВ) (8Ε(,) ГО Ш: 7)

ААТКОСТ

СЭВ Ь3 60 (расширенная СЭВ) (8Ε(,) ГО Ш: 8) (205КЕЕРМ5

- 38 016193

Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи 60 (БЕ^ ΙΌ NΟ:9)

САССТССААСТССТССААТССССТССССАССТСАААААСССАССССССТСССТСАААСТСТСС

ТССАААСССТССССТТАСАССТТТАССАССТАТСССАТССАТТСССТСССССАССССССАССС

САСССТСТССАСТССАТССССТТТАСТТСССССТАСТССССССТСТССААТТАСААТСАСААС

ТТСАААСССССССТСАССАТСАССССССАСАССТССАССТССАСАСТСТАТАТССАССТСТСС

ТСТСТССССТСССААСАСАССССССТЗТАТТАСТСТССССССТТСбАСААТТАССАТСССССС

ТАТСТСССТСАСТАТТССССССАССССАСССТССТСАСССТСТСС

Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи 60 (БЕ^ ΙΌ NΟ:10)

САСАТССТСАТСАСССАСТССССАСАСТСССТСССССТСТСССТСССССАСССССССАССАТС

ААСТССССССССАСССААТСССТССАТААССАТССТАТТТССТТТСТСААСТССТАССАССАС

АААССАССССАСССТССТААССТССТСАТТТАСССССССАССАААСАССЗТАССССССТСССТ

САССССТТСТСССССАССССТТСССССАСССАТТТСАСТСТСАССАТСТССТСССТССАСССС

СААСАТСТСССАСТСТАТТАСТСТСАССАСТССАААСАСТТТСССТССТССТТТСССбеТССС

АССАА6СТССАСАТСАААСССАСТСТС

Аминокислотная последовательность тяжелой цепи полноразмерного антитела 60 (включающая модифицированное 1д02а, как описано здесь) (БЕ^ ΙΌ NΟ:11) □УСЬУСЗСАЕУККРСАЗУКУЗСКАЗСУТГТТУАТНИУКОАРСОСЬЕММСГТЗРУЗСУБМУЦСК

ΓΚΟΚνΤΜΤΡΌΤ3Τ3ΤνΥΜΕΕ33ΕΕ3ΕΌΤΑνΥΥΟΑΚΓΌΝΥΟΚ3ΥνΡΟΥΜΟ0ΟΤΐντν33Α3ΤΚΘ ₽3νΕΡΕΑΡ03Β3Τ3Ε3ΤΑΑΕ0ϋΕνΚ0ΥΕΡΕΡντν3ΐΛΪΝ30ΑΕΤ30νΗΤΕΡΑνΕα336ΕΥ3Ε33ν ντνΡ33ΝΓετςΤΥΤΟΝνθΗΚΡ3ΝΤΚνθΚΤνΕΕΚΟθνΕΟΡΡΟΡΑΡΡνΑΟΡ3νΓΕΓΡΡΚΡΚΟΤΕΜ

Ι8ΚΤΡΕνΤ0ννν0ν3ΗΕ0ΡΕν<2ΕΝΜΥνΡσνΕνΗΝΑΚΤΚΡΚΕΕ(2ΓΝ8ΤΕΚνν3νΕΤννΗΩ0ΜΕΝ

ΟΚΕΥΚΟΚν5ΝΚσΕΡ83ΙΕΚΤΙ8ΚΤΚΟ0ΡΚΕΡ0νΥΤΕΡΡ5ΚΕΕΜΤΚΝ0ν8ΕΤαΕνΚΕΕΥΡ8ΟΙΑ νΕΜΕ8Ν02ΡΕΝΝΥΚΤΤΡΡΜΕ03θα3ΓΕΕΥ3ΚΕΤνθΚ3ΚννςςσΝνΓ303νΜΗΕΑΕΗΝΗΥΤ<2Κ3Ε

8ЕЗРСК

Аминокислотная последовательность легкой цепи полноразмерного антитела 60 (БЕ^ ΙΌ NΟ:12)

О1УМТ08Р03ЬАУ5ЪСЕКАТ1ЫСКА8Е8УОЕОК15Г1Ж№аСЖРС2РРКЪЪ^ААТК0СТСУР

ΟΚΓ3σ5Ο50ΤΟΓΤΕΤΙ58Ε0ΑΕθνΑνΥΥθς03ΚΕΕΡν73ΓΟΟΘΤΚνΕΙΚΗΤνΑΑΡ5νΓΙΕΡΡ30

ΕςΕΚ3ΟΤΑδνν0ΕΕΝΝΕΥΡΚΕΑΚνζ2νίΚνθΝΑΕ036Ν50Ε3νΤΕΩΟ3ΚΟ3ΤΥ3Ε33ΤΕΤΙ8ΚΑΟ

ΥΕΚΗΚνΥΑ0ΕνΤΗςεΕ33ΡνΤΚ3ΕΝΕΘΕ0

Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи полноразмерного антитела 60 (включающая модифицированное 1д02а, как описано здесь) (БЕ^ ΙΌ NΟ:13)

САССТССААСТССТеСААТССЗЗТССССАЗСТСАААААСССАССССССТСССТСАААЗТСТСС

ТССАААСССТССССТТАСАССТТТАССАССТАТСССАТССАТТСССТСССССАССССССАССС

САСССТСТССАСТЗСАТССССТТТАСТТСССССТАСТССССЗЗТСТССААТТАСААТСАСААС

ТТСАААСЗСССССТСАССАТ6АССССССАСАССТССАССТССАСАСТСТАТАТССАССТСТСС

ТСТСТССЗСТСССААСАСАССССССТЗТАТТАСТСТССССССТТССАСААТТАССАТСССССС

ТАТСТСССТСАСТАТТССССССАССССАСССТССТСАСССТСТССТСАСССТССАССААСССС

ССАТСТСТСТТСССАСТССССССАТССТСССССАССАССТСССАСАССАСАСССССССТСЗЗС

ТСССТСЗТСААССАСТАСТТСССАСААССТЗТЗАССЗТЗТССТЗбААСТСТЗЗСЗСТСТСАСС

АОСЗССЗТССАСАССТТСССАССТСТССТССАЗТССТСАСЮТСТСТАСТСССТСАССАСССТС

СТЗАССЗТСССАТССАСЮААСТТССЗСАСССАСАССТАСАССТЗСААССТАСАТСАСААСССА

АССААСАССААССТССАСААСАСССТССАСАСАААСТСТТСТЗТССАСТСТССАССТТСЗТССА

СССССТССАСТССССССАССАТСССТСТТССТОТТСССТССАААСССАААССАСАСССТСАТС

АТСТССАСААССССАСАССТСАССТСТСТССТССТССАССТСТСССАССАССАСССАСАССТС

САСТТСААСТССТАТСТССАСССАСТСбАСЗТССАСААССССААСАССААСССААСАСАССАС

САСТТСААСТССАССТТСАСАСТССТЗАСССТССТСАСССТСЗТССАССАССАСТСССТСААС

ССАААЗСАСТАТААСТСТААЗСТЗТССААСААСЗСАСТСССАТССАЗСАТССАСААСАССАТС

ТССААЗАССААССЗАСАСССААСАСАСССАСАССТСТАТАСССТССССССАТССАСАСАССАС

АТСАССААЗААССАССТСТСССТЗАССТСТСТССТЗААСЗСАТТСТАТССАТСССАСАТСССС

ЗТЗСАЗТЗСЗАЗТССААСЗЗАСАЗССАСАЗААСААСТАТААСАССАССССТССААТЗСТЗСАС

ТСССАССЗАТССТТСТТССТСТАТТССААЗСТСАССЗТССАСААСТССАЗАТЗЗСАССАеССА

ААССТСТТСТСТТСТТСССТЗАТЗСАССАЗССССТССАСААССАСТАТАСССАСААСАСССТЗ

ТСССТСТСТССАССАААС

- 39 016193

Нуклеотидная последовательность легкой цепи полноразмерного антитела 60 (8Е^ ΙΌ N0:14)

САСАТССТСАТСАСССАСТССССАСАСТСССТСССССТСТСССТСССССАСССССССАССАТС

ААСТССССССССАСССААТСССТССАТААССАТССТАТТТССТТТСТСААСТССТАССАССАС

АААССАССССАСССТССТААССТССТСАТТТАСССССССАССАААСАСССТАССССССТСССТ

САССССТТСТСССССАССССТТСССССАСССАТТТСАСТСТСАССАТСТССТСССТССАСССС

СААСАТСТСССАСТСТАТТАСТСТСАССАСТССАААСАСТТТСССТССТССТТТСССССТССС

АССААССТССАСАТСАААСССАСТСТСССТССАССАТСТСТСТТСАТСТТСССТССАТСТСАТ

САССАСТТСАААТССССААСТСССТСТСТТСТСТСССТССТСААТААСТТСТАТССАССССАО

СССАААСТАСАСТеСААССТССАТААСССССТССААТССССТААСТСССАССАСАСТСТСАСА

САССАССАСАССААССАСАССАССТАСАСССТСАССАССАСССТСАСССТСАССАААССАСАС ТАССАСАААСАСАААСТСТАССССТСССААСТСАСССАТСАСССССТСАСТТСТССАСТСАСА ААСАССТТСААССССССТСАСТСС

Claims (34)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Моноклональное антитело, специфически связывающееся с амилоидным пептидом Ав, где указанное антитело связывается с эпитопом на Ав_1-40, включающим аминокислоты 25-34 и 40, причем указанное антитело связывается с Ав1_-40 с более высокой аффинностью, чем с Ав1_-42 и Ав1_-43, и связывается с Ав_22-37 с К_о меньше 1 мкМ, и где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три СИК, которые по меньшей мере на 85% идентичны трем СИК вариабельной области тяжелой цепи 8 ЕС) ΙΌ N0:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую три СИК, которые по меньшей мере на 85% идентичны трем СИК вариабельной области легкой цепи 8ЕС) ΙΌ N0:2.
2. 2. Антитело по п.1, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три СИК вариабельной области тяжелой цепи 8ЕС) ΙΌ N0:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую три СИК вариабельной области легкой цепи 8ЕС) ΙΌ N0:2.
3. 3. Антитело по п.2, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три СИК, показанные как последовательности 8ЕС) ΙΌ N0:3, 8ЕС) ΙΌ N0:4 и 8ЕС) ΙΌ N0:5.
4. 4. Антитело по п.2 или 3, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую три СИК, показанные как последовательности 8ЕС) ΙΌ N0:6, 8ЕС) ΙΌ N0:7 и 8ЕС) ΙΌ N0:8.
5. 5. Антитело по п.4, где указанное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕС) ΙΌ N0:1.
6. 6. Антитело по п.4 или 5, которое содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕС) ΙΌ N0:2.
7. 7. Антитело по п.6, которое содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи 8ЕС) ΙΌ N0:11, и аминокислотную последовательность легкой цепи 8ЕС) ΙΌ N0:12.
8. 8. Антитело по п.1, которое связывается с Ав1_-40 с аффинностью, по меньшей мере приблизительно в 40 раз превышающей аффинность его связывания с Ав1_-42 или Ав1_-43.
9. 9. Антитело по п.1 или 8, РаЬ-фрагмент которого связывается с Ав1_-40 с аффинностью приблизительно 10 нМ или меньше.
10. 10. Антитело по п.9, РаЬ-фрагмент которого связывается с Ав1_-40 с аффинностью приблизительно 5 нМ или меньше.
11. 11. Антитело по любому из пп.1-10, изотип которого выбран из группы, состоящей из Ι§01, Ι§02, Ι§03 и Ι§04.
12. 12. Антитело по любому из пп.1-11, содержащее константную область тяжелой цепи, содержащую Рс-область, причем константная область тяжелой цепи обладает нарушенной эффекторной функцией.
13. 13. Антитело по п.12, в котором Рс-область не является ^гликозилированной.
14. 14. Антитело по п.12, константная область тяжелой цепи которого представляет собой константную область Ι§02β человека, содержащую мутации аминокислот А330Р331-83308331, где положение аминокислот основано на нумерации Кабат по сравнению с последовательностью Ι§02β дикого типа человека.
15. 15. Антитело по п.12, константная область тяжелой цепи которого представляет собой константную область Ι§04 человека, содержащую мутации аминокислот Е233Р234Б235-Р233У234А235, где положение аминокислот основано на нумерации Кабат по сравнению с последовательностью Ι§04 дикого типа человека.
16. 16. Антитело по любому из пп.1-15, которое представляет собой антитело человека.
17. 17. Антитело по любому из пп.1-15, которое представляет собой гуманизированное антитело.
18. 18. Моноклональное антитело, специфически связывающееся с эпитопом Ав1_-40 амилоидного пептида, включающим аминокислоты 25-34 и 40, причем указанное антитело связывается с Ав_1-40 с более высокой аффинностью, чем с Ав_1-42 и Ав_1-43, и связывается с Ав_22-37 с К_о меньше 1 мкМ, причем моноклональное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три СИК, показанные

    - 40 016193 как последовательности 8Е0 ΙΌ N0:3, 8Е0 ΙΌ N0:4 и 8Е0 ΙΌ N0:5; и вариабельную область легкой цепи, содержащую три СОЯ вариабельной области легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0:2.
19. 19. Моноклональное антитело, специфически связывающееся с эпитопом Αβι_-40 амилоидного пептида, включающим аминокислоты 25-34 и 40, причем указанное антитело связывается с Αβι_-40 с более высокой аффинностью, чем с Αβι_-42 и Ав1_-43, и связывается с Ав_22-37 с К_с меньше 1 мкМ, причем моноклональное антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи 8Е0 ΙΌ N0:11 и аминокислотную последовательность легкой цепи 8Е0 ΙΌ N0:12.
20. 20. Фрагмент моноклонального антитела по любому из пп.2-7, который обладает или сохраняет специфичность связывания с указанным моноклональным антигеном.
21. 21. Фрагмент по п.20, который представляет собой РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂ или Ρν.
22. 22. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой или легкой цепи антитела по любому из пп.1-19.
23. 23. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.22.
24. 24. Вектор по п.23, указанный вектор представляет собой рОЬ.6С.№с2а, ΑТСС N0. РТА-6786 или рЕЬ.6С.ЬК, АТСС N0. РТА-6787.
25. 25. Клетка-хозяин, содержащая один или несколько полинуклеотидов по п.22.
26. 26. Способ получения антитела по любому из пп.1-19, включающий культивирование клеткихозяина по п.25, содержащей один или несколько полинуклеотидов по п.22, в условиях, подходящих для продукции антитела; и выделение антитела из клетки-хозяина или культуры.
27. 27. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество антитела по любому из пп.1-19 или фрагмента по любому из п.20 или 21, и фармацевтически приемлемый носитель.
28. 28. Применение фармацевтической композиции по п.27 для получения лекарственного средства для профилактики, лечения ингибирования или задержки проявления заболевания, связанного с измененной экспрессией Ав или предшественника бета-амилоидного белка фАРР) или накоплением Ав пептида.
29. 29. Применение по п.28, причем лекарственное средство используется для лечения болезни Альцгеймера или задержки проявления симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера, у индивида.
30. 30. Применение антитела по любому из пп.1-19 или фрагмента по любому из пп.20, 21 для профилактики, лечения, ингибирования или задержки проявления заболевания, связанного с измененной экспрессией Ав или вАРР или накопления Ав пептида.
31. 31. Применение по п.30, причем антитело или фрагмент используются для лечения болезни Альцгеймера или задержки проявления симптомов, связанных с болезнью Альцгеймера у индивида.
32. 32. Применение по п.28 или 30, где заболеванием является деменция при множественном инфаркте, синдром умеренных когнитивных нарушений, церебральная амилоидная ангиопатия, синдром Дауна, болезнь Паркинсона, болезнь Крейтцфельда-Якоба, деменция с тельцами Леви или СПИД.
33. 33. Применение фармацевтической композиции по п.27 для получения лекарственного средства для подавления образования или уменьшения амилоидных бляшек у индивида.
34. 34. Применение фармацевтической композиции по п.27 для получения лекарственного средства для улучшения когнитивных способностей или обращения когнитивных нарушений, связанных с отложением амилоида Ав у индивида.