TWI501975B - 針對抗澱粉樣蛋白-β肽之抗體及使用彼等之方法 - Google Patents

Description

針對抗澱粉樣蛋白－ β 肽之抗體及使用彼等之方法

本發明係關於抗澱粉樣蛋白－β肽之抗體。本發明進一步係關於該等抗體在諸如阿茲海默氏症之疾病的治療及/或預防中之用途。

阿茲海默氏症(AD)為退化性腦病症，其臨床特徵為進行性記憶力不足、精神錯亂、逐漸身體退化及最終死亡。世界範圍內大約有一千五百萬人受到阿茲海默氏症的侵害，且隨著壽命增加預期該數量將急劇增加。該疾病之組織學特徵為神經炎斑塊，其最初在聯絡皮質、邊緣系統及基底神經節中發現。此等斑塊之主要成份為澱粉樣蛋白β肽(Aβ)，其為β澱粉樣蛋白前驅體蛋白質(βAPP或APP)之裂解產物。APP為含有大異位N－末端域、跨膜域及小細胞質C－末端尾部之I型跨膜糖蛋白。單一APP基因之轉錄物在染色體21上之替代性拼接導致數種在胺基酸數量上不同之同功異型物。

Aβ似乎在阿茲海默氏症之神經病理學中具有主要作用。該家族形式之疾病已與APP及早老素基因(presenilin gene)中之突變有關(Tanzi等人，1996,Neurobiol.Dis.3：159－168；Hardy,1996,Ann.Med.28：255－258)。在此等基因中與疾病有關之突變導致Aβ之42個胺基酸形式之產量增加，此等胺基酸形式為在澱粉樣蛋白斑塊中發現之主要形式。此外，用人類Aβ對過度表現與疾病相關之突變形式的APP之轉基因小鼠進行的免疫降低斑塊負荷及相關病理學(Schenk等人，1999,Nature 400：173－177；WO 99/27944)，且針對抗Aβ之抗體的外周投藥亦降低腦中之斑塊負荷(Bard等人，2000,Nature Medicine 6(8)：916－919；WO 2004/032868；WO 00/72880)。

已報導藉由小神經膠質細胞及/或巨噬細胞進行之Fc調節噬菌作用對活體中之斑塊清除過程係重要的(Bard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100,2023－2028(2003))。然而，亦已報導非Fc調節機制涉及藉由免疫療法在活體中之澱粉樣蛋白－β之清除(Bacskai等人，J.Neurosci.22：7873－7878(2002)；Das等人，J.Neurosci.23：8532－8538(2003))。

因此抗體療法提供治療及預防阿茲海默氏症之有希望的手段。然而，以包括Aβ1－42之疫苗進行之人類臨床試驗由於患者子集中之腦膜腦炎(meningoencephalititis)而暫緩(Orgogozo等人，Neruology 61：7－8(2003)；Ferrer等人，Brain Pathol.14：11－20(2004))。已報導用N－末端特異性抗－Aβ抗體進行被動免疫導致主要彌散性澱粉樣蛋白之顯著降低，但其在轉基因小鼠中誘導大腦微出血頻率增加，該等小鼠展現與年齡相關之澱粉樣蛋白斑塊及神經退化以及類似於在人類AD腦中觀察到之大腦澱粉樣蛋白血管病(CAA)之發展(Pfeifer等人，Science 298：1379(2002))。已建議在以針對β－澱粉樣蛋白之抗體進行了被動免疫之APP轉基因小鼠中的與大腦澱粉樣蛋白血管病(CAA)相關之微出血的惡化係視對沈積形式的澱粉樣蛋白β肽之抗體識別而定(Racke等人，J.Neurosci.25：629－636(2005))。已建議以抗澱粉樣蛋白沈積之肽組份的抗體(該抗體缺乏Fc區)進行被動免疫以降低炎症之風險(WO 03/086310)。仍需要具有改良效力及安全概況且適用于人類患者之針對抗Aβ之抗體及其它免疫治療劑。

在此申請案中引用各種公開案(包括專利及專利申請案)。此等公開案之揭示之全文以引用的方式併入本文中。

本文所揭示之本發明涉及結合至Aβ肽之C－末端之抗體及多肽。在一態樣中，本發明提供結合至Aβ_{1 － 4 0} 、Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} 之抗體或多肽，其中該抗體或該多肽以比其結合至Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} 更高之親和力結合至Aβ_{1 － 4 0} ，且其中該抗體或該多肽結合至Aβ_{1 － 4 0} 上之包括胺基酸25－34及40之抗原決定基。在一些實施例中，該抗體以比其結合至Aβ_{1 － 4 2} 及/或Aβ_{1 － 4 3} 高至少約40倍之親和力結合至Aβ_{1 － 4 0} 。在一些實施例中，該抗體不為抗體2294。

在另一態樣中，本發明提供抗體6G(可交換地將其稱為"6G")。6G之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列係示於圖1中。抗體6G之互補判定區(CDR)部分(包括Chothia及Kabat CDR)亦示於圖1中。

在另一態樣中，本發明亦提供具有表3中所描述之胺基酸序列之6G的抗體變異體。

在另一態樣中，本發明提供包含表3中所示之抗體6G或其變異體的片段或區域之抗體。在一實施例中，該片段為抗體6G之輕鏈。在另一實施例中，該片段為抗體6G之重鏈。在又一實施例中，該片段含有一或多個來自抗體6G之輕鏈及/或重鏈之可變區。在又一實施例中，該片段含有一或多個來自圖1中所示之輕鏈及/或重鏈之可變區。在又一實施例中，該片段含有一或多個來自抗體6G之輕鏈及/或重鏈之CDR。

在另一態樣中，本發明提供包含任意一或多種以下各物之多肽(其可為或不為抗體)：a)表3中所示之抗體6G或其變異體之一或多個CDR；b)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之重鏈的CDR H3；c)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈的CDR L3；d)三個來自表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈的CDR；e)三個來自表3中所示之抗體6G或其變異體之重鏈的CDR；f)三個來自表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈的CDR及三個來自重鏈的CDR。本發明進一步提供包含任何一或多種以下各物之多肽(其可為或不為抗體)：a)一或多個(一、二、三、四、五或六個)源自表3中所示之抗體6G或其變異體的CDR；b)源自來自抗體6G之重鏈的CDR H3之CDR；及/或c)源自來自抗體6G之輕鏈的CDR L3之CDR。在一些實施例中，該CDR為圖1中所示之CDR。在一些實施例中，源自表3中所示之抗體6G或其變異體之一或多個CDR係至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%等同於6G或其變異體之至少一、至少二、至少三、至少四、至少五或至少六個CDR。

在一些實施例中，該CDR為Kabat CDR。在其他實施例中，該CDR為Chothia CDR。在其他實施例中，該CDR為Kabat及Chothia CDR之組合(亦將其稱為"組合CDR"或"擴展CDR")。換言之，對任何含有多於一個CDR之給定實施例而言，該等CDR可為任何Kabat、Chothia及/或所組合之CDR。

在一些實施例中，本發明之抗體為人類抗體。在其他實施例中，本發明之抗體為人源化抗體。在一些實施例中，該抗體為單株抗體。在一些實施例中，該抗體(或多肽)係經分離的。在一些實施例中，該抗體(或多肽)為大體上純的。

該等抗體之重鏈恒定區可來自任何類型之恒定區，諸如IgG、IgM、IgD、IgA及IgE；及任何同型，諸如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。

在一些實施例中，本文所述之抗體或多肽具有削弱之效應功能。在一些實施例中，該抗體或多肽包含具有削弱效應功能之重鏈恒定區，其中該重鏈恒定區包含一Fc區。在一些實施例中，移除該Fc區中之N－醣基化作用。在一些實施例中，該Fc區包含在N－醣基化作用識別序列之內的突變，藉以使抗體或多肽之Fc區不經N－醣基化。在一些實施例中，該Fc區係經PEG化。在一些實施例中，該抗體或該多肽之重鏈恒定區為含有以下突變之人類重鏈IgG2a恒定區：A330P331至S330S331(參照野生型IgG2a序列對胺基酸編號)。在一些實施例中，該抗體或該多肽包含IgG4之恒定區，該恒定區包含以下突變：E233F234L235至P233V234A235。此等胺基酸位置係基於Kabat編號。

在另一態樣中，本發明提供聚核苷酸(其可經分離)，其包含編碼表3中所示之抗體6G或其變異體之片段或區域的聚核苷酸。在一實施例中，該片段為抗體6G之輕鏈。在另一實施例中，該片段為抗體6G之重鏈。在又一實施例中，該片段含有一或多個來自抗體6G之輕鏈及/或重鏈之可變區。在又一實施例中，該片段含有一或多個(即，一、二、三、四、五、六個)來自抗體6G之輕鏈及/或重鏈之互補判定區(CDR)。

在另一態樣中，本發明為聚核苷酸(其可經分離)，其包含為表3中所示之抗體6G或其變體編碼的聚核苷酸。在一些實施例中，該聚核苷酸包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中所示之聚核苷酸之任一者或兩者。

在另一態樣中，本發明提供編碼本文所述之任何抗體(包括抗體片段)或多肽之聚核苷酸。

在另一態樣中，本發明提供包含本文所述之任何聚核苷酸之載體(vector)(包括表現載體及選殖載體)及宿主細胞。

在另一態樣中，本發明為包含編碼本文所述之任何抗體之聚核苷酸的宿主細胞。

在另一態樣中，本發明為由表3中所示之抗體6G或其變異體所結合之Aβ_{1 － 4 0} 之複合物。

在另一態樣中，本發明為由本文所述之任何抗體或多肽所結合之Aβ_{1 － 4 0} 之複合物。

在另一態樣中，本發明為一種醫藥組合物，其包含有效量之本文所述之任何抗體、多肽或聚核苷酸、及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，該等抗體或該等多肽包含抗體6G之一或多個CDR。

在另一態樣中，本發明為一種產生抗體6G之方法，其包含在允許製造抗體6G之條件下培養宿主細胞或其後裔，其中該宿主細胞包含為抗體6G編碼之表現載體；且在一些實施例中，純化該抗體6G。在一些實施例中，該表現載體包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中所示之聚核苷酸序列之一或兩者。

在另一態樣中，本發明提供藉由在適合細胞中表現編碼該抗體(可將其獨立表現為單一輕鏈或重鏈，或可自一載體表現輕及重鏈兩者)或該多肽之一或多種聚核苷酸、一般接著回收及/或分離相關抗體或多肽來產生本文所述之任何抗體或多肽之方法。

本發明亦提供預防、治療、抑制阿茲海默氏症及其它與經改變之Aβ或βAPP表現、或Aβ肽之積聚相關之疾病(諸如唐氏綜合症、帕金森氏症、多發性梗死性癡呆、輕度認知損害、大腦澱粉樣蛋白血管病、抑鬱、庫賈氏病(Creutzfeldt－Jakob disease)、具有路易體之癡呆及AIDS)或延遲其發展的方法。該方法包含向受檢者投與有效劑量之包含本發明之抗體、多肽或聚核苷酸的醫藥組合物。

本發明亦提供延遲與阿茲海默氏症及其它與受檢者中之Aβ肽之積聚相關之疾病相聯繫的症狀發展的方法，其包含向該受檢者投與有效劑量之包含本發明之抗體、多肽或聚核苷酸的醫藥組合物。

本發明亦提供抑制受檢者中澱粉樣蛋白斑塊之形成及澱粉樣蛋白積聚之方法，其包含向該受檢者投與有效劑量之包含本發明之抗體、多肽或聚核苷酸的醫藥組合物。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在該受檢者之腦(腦組織)中。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在大腦脈管系統中。在其他實施例中，該澱粉樣蛋白積聚係在循環系統中。

本發明亦提供降低受檢者中之澱粉樣蛋白斑塊及/或澱粉樣蛋白積聚之方法，其包含向該受檢者投與有效劑量之包含本發明之抗體、多肽或聚核苷酸的醫藥組合物。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在該受檢者之腦(腦組織)中。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在大腦脈管系統中。在其他實施例中，該澱粉樣蛋白積聚係在循環系統中。

本發明亦提供移除或清除受檢者中之澱粉樣蛋白斑塊及/或澱粉樣蛋白積聚之方法，其包含向該受檢者投與有效劑量之包含本發明之抗體、多肽或聚核苷酸的醫藥組合物。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在該受檢者之腦(腦組織)中。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在大腦脈管系統中。在其他實施例中，該澱粉樣蛋白積聚係在循環系統中。

另外，本發明提供抑制組織中Aβ肽之積聚的方法，其包含使該組織與本發明之抗體或多肽接觸。

本發明亦提供降低受檢者中之Aβ肽(諸如可溶、寡聚及沈積形式)之方法，其包含向該受檢者投與有效量之本發明之抗體、多肽或聚核苷酸。在一些實施例中，在腦中抑制及/或降低Aβ肽之積聚。在一些實施例中，抑制及/或降低Aβ肽之毒性效應。因此，可將本發明之方法用於治療任何其中存在或懷疑存在Aβ肽之積聚的疾病，諸如阿茲海默氏症、唐氏綜合症、帕金森氏症、多發性梗死性癡呆、輕度認知損害、大腦澱粉樣蛋白血管病、抑鬱、庫賈氏病或具有路易體之癡呆。

本發明亦提供改良認知或逆轉與受檢者中與Aβ之澱粉樣蛋白沈積相關之疾病(諸如阿茲海默氏症)相關的認識衰退之方法，其包含向該受檢者投與有效劑量之包含本發明之抗體、多肽或聚核苷酸的醫藥組合物。

可將本文所述之任何抗體、多肽或聚核苷酸用於本發明之方法中。在一些實施例中，該抗體為抗體6G。

可將本發明之抗體及多肽進一步用於阿茲海默氏症及其它與經改變之Aβ或βAPP表現相關之疾病(諸如唐氏綜合症及AIDS)的偵測、診斷及監控中。該方法包含使懷疑具有經改變之Aβ或βAPP表現之患者之樣本與本發明之抗體接觸且判定Aβ或βAPP之含量是否與對照或比較樣本之含量有差異。在一些實施例中，在投與抗－Aβ抗體之前及之後量測Aβ之血清含量；且評估Aβ之血清含量的任何增加。

可以任何此項技術中已知方式來投與本發明之任何抗體或多肽，該等方式包括：靜脈內、皮下、經由吸入、動脈內、肌肉內、心臟內、心室內、非經腸、鞘內及腹膜內。投藥可為全身性(例如，靜脈內)或局部投藥。一般亦將此應用至本發明之多肽及聚核苷酸。

在另一態樣中，本發明提供包含任何一或多種本文所述之組合物的套組及組合物。一般在適合之包裝中且具備適當使用說明之此等套組可適用于本文所述之任何方法。

本文所揭示之本發明提供結合至Aβ之C－末端之抗體及多肽。本發明亦提供編碼此等抗體及/或多肽之聚核苷酸。本發明亦提供製造及使用此等抗體及多肽之方法。

本發明亦提供藉由向受檢者投與有效量之醫藥組合物來治療或預防與個體中與β－澱粉樣蛋白沈積相關之疾病(諸如阿茲海默氏症、唐氏綜合症、多發性梗死性癡呆、輕度認知損害、大腦澱粉樣蛋白血管病、抑鬱、庫賈氏病及具有路易體之癡呆)的方法，該醫藥組合物包含本文所述之抗體、多肽、或編碼該抗體或該多肽之聚核苷酸。

一般技術

除非另有所示，否則本發明之實踐採用分子生物學(包括重組體技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術，其在此項技術之技巧之內。該等技術在文獻中得到進一步解釋，該等文獻係諸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell編，1993－1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos編，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人編，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.編，IRL Press,1988－1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd及C.Dean編，Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow及D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti 及J.D.Capra編，Harwood Academic Publishers,1995)。

定義

"抗體"為能經由至少一個抗原識別位點特異性結合至目標(諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等)的免疫球蛋白分子，該抗原識別位點係位於該免疫球蛋白分子之可變區中。如本文所用，該術語不僅涵蓋完整多株或單株抗體，而且涵蓋其片段(諸如Fab、Fab'、F(ab')₂ 、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分之融合蛋白質、及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子的任何其他經修飾之組態。抗體包括任何種類之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其亞類)，且該抗體不必為任何特定種類。視抗體重鏈之恒定域之胺基酸序列而定，可將免疫球蛋白指派為不同種類。存在5種主要種類之免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且可將數種此等免疫球蛋白進一步分為亞類(同型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。將對應不同種類之免疫球蛋白的重鏈恒定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。不同種類免疫球蛋白之次單元結構及三維組態為吾人所熟知。

如本文所用，"單株抗體"係指自大體上同源抗體之群獲得之抗體，即，除了可以微量存在之可能天然產生的突變之外，包含該群之個別抗體係相同的。單株抗體為高度特異性抗體，其係對抗單一抗原位點。此外，與多株抗體製備(其通常包括針對抗不同決定子(抗原決定基)之不同抗體)相反，各單株抗體係對抗抗原上之單一決定子。修飾語"單株"表示自抗體之大體上同源之群獲得之抗體的特徵，且不應將其解釋為需要藉由任何特定方法來製造該抗體。舉例而言，依照本發明而使用之單株抗體可藉由首先由Kohler及Milstein,1975,Nature,256：495描述之融合瘤方法來制得，或可藉由諸如美國專利第4,816,567號中所述之重組DNA方法制得。亦可自使用(例如)McCafferty等人，1990,Nature,348：552－554所述之技術生成之噬菌體庫分離該等單株抗體。

如本文所用，"人源化"抗體係指含有源自非人類免疫球蛋白之最小序列的特異性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂ 或抗體之其他抗原結合子序列)的非人類(例如，鼠科)抗體形式。對於絕大多部分而言，人源化抗體為人類免疫球蛋白(接受抗體)，其中來自接受抗體之互補判定區(CDR)之殘基係由來自具有所要特異性、親和性及能力之非人類物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔的CDR殘基置換。在一些實例中，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基係由對應之非人類殘基置換。此外，人源化抗體可包含在接受抗體或在引入之CDR或構架序列中皆未發現之殘基，但將其包括以進一步改進及優化抗體效能。一般而言，人源化抗體將包含大體上至少一個且通常為兩個可變域之全部，其中所有或大體上所有CDR區係對應於非人類免疫球蛋白之彼等且所有或大體上所有FR區為人類免疫球蛋白一致序列之彼等。人源化抗體最佳亦將包含至少一部分免疫球蛋白恒定區或域(Fc)，通常為人類免疫球蛋白之Fc。抗體可具有如WO 99/58572中所述經修飾之Fc區。人源化抗體之其他形式具有一或多個CDR(一、二、三、四、五、六)，該等抗體形式相關於原始抗體而受到更改，亦將其稱為"源自"一或多個來自原始抗體之CDR的一或多個CDR。

如本文所用，"人類抗體"意謂具有對應於由人類產生之抗體的胺基酸序列或已使用此項技術中已知或本文所揭示之製造人類抗體的任何技術製造的胺基酸序列之抗體。人類抗體之此定義包括包含至少一個人類重鏈多肽或至少一個人類輕鏈多肽之抗體。一種此實例為包含鼠科輕鏈及人類重鏈多肽之抗體。可使用各種此項技術中已知之技術來製造人類抗體。在一實施例中，該人類抗體係選自一噬菌體庫，其中該噬菌體庫表現人類抗體(Vaughan等人，1996,Nature Biotechnology,14：309－314；Sheets等人，1998,PNAS,(USA)95：6157－6162；Hoogenboom及Winter,1991,J.Mol.Biol.,227：381；Marks等人,1991,J.Mol.Biol.,222：581)。亦可藉由引入人類免疫球蛋白基因座至轉基因動物(例如，其中已將內源免疫球蛋白部分或完全鈍化之小鼠)中來制得人類抗體。此方法係在美國專利第5,545,807號；第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；及第5,661,016號中描述。或者，人類抗體可藉由使產生對抗目標抗原之抗體的人類B淋巴細胞永生化來製備(此等B淋巴細胞可自個體回收或可已在活體外免疫化)。參見，例如，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，1991,J.Immunol.,147(1)：86－95；及美國專利第5,750,373號。

如本文所用，術語"6G"及"抗體6G"可交換地使用，其係指具有SEQ ID NO：11中所示之重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO：12中所示之輕鏈胺基酸序列的抗體。該重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列係示於圖1中。圖1中以圖解方式來描述抗體6G之CDR部分(包括Chothia及Kabat CDR)。編碼重及輕鏈之聚核苷酸係示於SEQ ID NO：13及SEQ ID NO：14中。6G之表徵係在實例中描述。

術語"多肽"、"寡肽"、"肽"及"蛋白質"在本文中可交換地使用，其係指任何長度之胺基酸的聚合物。該聚合物可為直鏈或支鏈，其可包含經修飾之胺基酸，且其可由非胺基酸來中斷。該等術語亦涵蓋經天然修飾或藉由干擾或諸如與標記組份共軛的任何其他操作及修飾來修飾之胺基酸聚合物；該等干擾係例如二硫鍵形成、醣基化作用、脂質化作用、乙醯化作用、磷酸化作用。在該定義之內亦包括(例如)含有胺基酸之一或多個類似物之多肽(包括(例如)非天然胺基酸等)以及其他此項技術中已知之修飾。當然，因為本發明之多肽係基於抗體，所以該等多肽可作為單鏈或聯合鏈存在。

如本文所交換地使用，"聚核苷酸"或"核酸"係指任何長度之核苷酸之聚合物，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或堿基、及/或其類似物、或任何可藉由DNA或RNA聚合酶併入聚合物中之基質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在組裝聚合物之前或之後對核苷酸結構進行修飾。核苷酸序列可由非核苷酸組份中斷。可在諸如藉由與標記組份共軛而聚合之後進一步修飾聚核苷酸。其他類型之修飾包括(例如)"加帽"、以一類似物取代一或多個天然產生之核苷酸、核苷酸間修飾，諸如彼等具有不帶電荷之鍵(例如，膦酸甲酯、磷三酯(phosphotriester)、磷醯胺酸、胺基甲酸酯等)及具有帶電荷之鍵(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)者；彼等含有附挂部分者，諸如蛋白質(例如，核酸酶、毒素、抗體、訊號肽、ply－Ll離胺酸等)；彼等具有嵌入劑(intercalator)者(例如，吖啶、補骨脂素等)、彼等含有螯合劑者(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、彼等含有烷化劑者、彼等具有經修飾之鍵者(例如，α變旋異構核酸等)、以及該(等)聚核苷酸之未經修飾之形式。此外，任何平常存在於糖類中之羥基可(例如)由膦酸酯基團、磷酸酯基團置換、由標準保護基保護、或將其活化以製備另外核苷酸的另外之鍵、或可使其與固體載體共軛。5'及3'末端OH可經磷酸化或以胺或1至20個碳原子之有機加帽基來取代。亦可將其他羥基衍生至標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之核糖或脫氧核糖之類似形式，包括，例如：2'－O－甲基－、2'－O－烯丙基、2'－氟－或2'－疊氮基－核糖、碳環糖類似物、α－變旋異構糖、諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖之差向異構糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、無環類似物及諸如甲基核糖甙之abasic核苷酸類似物。一或多個磷酸二酯鍵可由替代性連接基團來置換。此等替代性連接基團包括但不限於其中磷酸酯係由P(O)S("硫代酯")、P(S)S("二硫代酯")、(O)NR₂ ("醯胺化物")、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂ ("formacetal")置換之實施例，其中各R或R'獨立為H或經取代或未經取代之烷基(1－20C)，其視情況含有醚(－O－)鍵、芳基、烯基、環烷基、環烯基或araldyl。並非聚核苷酸中之所有鍵必需相同。將之前描述應用至本文涉及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。

抗體之"可變區"係指抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區，其單獨或組合存在。重及輕鏈之可變區各自係由四個構架區(FR)組成，該等構架區係由三個亦已知為高度可變區之互補判定區(CDR)相連。各鏈中之CDR係藉由FR緊密維持在一起，且其與來自其他鏈之CDR一起貢獻抗體之抗原結合位點之形成。存在至少兩種判定CDR之技術：(1)基於交叉物種序列可變性之方式(即，Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda MD))；及(2)基於抗原－抗體複合物之結晶研究的方式(Al－lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273：927－948))。如本文所用，CDR可指由兩種方式之任一者或藉由其組合所界定之CDR。

抗體之"恒定區"係指抗體輕鏈之恒定區或抗體重鏈之恒定區，其係單獨或組合存在。

"優先地結合"或"特異性結合"(本文中交換地使用)至抗體或多肽之抗原決定基為在此項技術中熟知之術語，且判定此特異性或優先結合之方法亦在此項技術中熟知。若與替代性細胞或物質相比，分子與特定細胞或物質更為頻繁、更為迅速、以更長之持續時間及/或以更大之親和力反應或聯合，則據稱該分子展現"特異性結合"或"優先地結合"。若抗體以比其結合至其他物質更大之親和力、活動性、更為快速及/或以更長之持續時間結合至一目標，則該抗體"特異性結合"或"優先地結合"至該目標。舉例而言，特異性或優先地結合至Aβ_{1 － 4 0} 抗原決定基之抗體為以比其結合至其他Aβ_{1 － 4 0} 抗原決定基或非Aβ_{1 － 4 0} 抗原決定基更大之親和力、活動性、更為快速及/或以更長之持續時間結合此抗原決定基之抗體。藉由閱讀此定義亦應瞭解(例如)特異性或優先地結合至第一目標之抗體(或部分或抗原決定基)可特異性或優先地結合或不結合至第二目標。因此，"特異性結合"或"優先地結合"並非必需(雖然其可包括)獨佔式結合。大體而言(但並非必需)該結合意謂優先地結合。

如本文所用，"大體上純的"係指至少50%純的(即，無污染物)、更佳至少90%純的、更佳至少95%純的、更佳至少98%純的、更佳至少99%純的材料。

"宿主細胞"包括可為或已為用於併入聚核苷酸插入物之一或多個載體的接受體之個體細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之後裔，且由於天然、意外或故意之突變，所以該後裔不必完全等同(在形態或在染色體組DNA補體上)於原始母細胞。宿主細胞包括在活體中以一或多種本發明之聚核苷酸轉染之細胞。

術語"Fc區"係用於界定免疫球蛋白重鏈之C－末端區域。"Fc區"可為天然序列Fc區或變異體Fc區。雖然免疫球蛋白重鏈之Fc區的邊界可變化，但是常將人類IgG重鏈Fc區界定為自位置Cys226處之胺基酸殘基或自Pro230伸展至其羧基－末端。對Fc區中殘基之編號為如Kabat。Kabat等人，Sequences of Proteins of Imunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991中之EU指數之編號。免疫球蛋白之Fc區一般包含兩個恒定域CH2及CH3。

如本文所用，"Fc受體"及"FcR"描述結合至抗體之Fc區之受體。較佳之FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳之FcR為結合IgG抗體(γ受體)者且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII亞類之受體，其包括此等受體之等位基因變異體及替代性剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA("活性受體")及FcγRIIB("抑制受體")，其具有主要在其細胞質域上不同之類似胺基酸序列。在Ravetch及Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9：457－92；Capel等人，1994,Immunomethods,4：25－34；及de Haas等人，1995,J.Lab.Clin.Med.,126：330－41中評論FcR。"FcR"亦包括新生受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，1976,J.Immunol.,117：587；及Kim等人，1994,J.Immunol.,24：249)。

"補體依賴性細胞毒性"及"CDC"係指在補體之存在下目標之溶解。補體活化路徑係由補體系統之第一組份(C1q)與以同源抗原錯合之分子(例如，抗體)之結合來引發。為評估補體活化，可執行(例如)如Gazzano－Santoro等人，J.Immunol.Methods,202：163(1996)中所述之CDC檢定。

"功能性Fc區"擁有天然序列Fc區之至少一種效應功能。例示性"效應功能"包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞調節細胞毒性(ADCC)；噬菌作用；細胞表面受體(例如，B細胞受體；BCR)之下調等。此等效應功能一般需要Fc區與結合域(例如，抗體可變域)組合且可使用各種此項技術中已知的用於評估此等抗體效應功能的檢定來評價。

"天然序列Fc區"包含等同于天然發現之Fc區之胺基酸序列的胺基酸序列。"變異體Fc區"包含藉由至少一種胺基酸修飾而區別于天然序列Fc區的胺基酸序列，其仍保留天然序列Fc區之至少一種效應功能。較佳，變異體Fc區與天然序列Fc區相比或與母體多肽之Fc區相比具有至少一個胺基酸取代，例如，約一至約十個胺基酸取代，且較佳在天然序列Fc區中或在母體多肽之Fc區中有約一至約五個胺基酸取代。本文中之變異體Fc區較佳將擁有與天然序列Fc區及/或與母體多肽之Fc區至少約80%之序列一致性，且最佳與其有至少約90%之序列一致性，更佳與其有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%之序列一致性。

如本文所用，"抗體依賴性細胞調節細胞毒性"及"ADCC"係指細胞調節反應，其中表現Fc受體(FcR)之非特異性細胞毒性細胞(例如，自然殺傷(NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬細胞)識別在目標細胞上之結合抗體且隨後導致目標細胞之溶解。可使用活體外ADCC檢定來評估相關分子之ADCC活性，諸如在美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中描述之檢定。可適用於此等檢定之效應細胞包括外周血單核細胞(PBMC)及NK細胞。或者或另外，可在活體中評估相關分子之ADCC活性，例如，在諸如Clynes等人，1998,PNAS(USA),95：652－656中所揭示之動物模型中。

如本文所用，"有效劑量"或"有效量"之藥物、化合物或醫藥組合物為足以有效達成有益或所要結果之量。對於預防性用途，有益或所要結果包括諸如消除或降低疾病之風險、減輕其嚴重性或延遲其發作的結果，包括疾病之生物化學、組織學及/或行為症狀，在疾病之發展過程中存在的其並發症及中間病理表型。對於治療用途，有益或所要結果包括以下臨床結果：諸如抑制、抑止或降低澱粉樣蛋白斑塊之形成；降低、移除、清除澱粉樣蛋白斑塊；改良認知、使認知衰退逆轉或減緩；螯合或增加在生物流體中迴圈的可溶Aβ肽；降低由疾病產生之一或多個症狀(生物化學、組織學及/或行為)(包括在疾病之發展過程中存在之其並發症及中間病理表型)；增加彼等遭受該疾病者之生命品質；降低治療該疾病所需之其他藥劑之劑量；增強另一藥劑之效應；延緩疾病之進展及/或延長患者之生存期。可在一或多次投藥中投與一有效劑量。為達成本發明之目的，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量為足以直接或間接地完成預防性或治療性治療之量。如在臨床背景中所瞭解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可與或不與另一藥物、化合物或醫藥組合物聯合達成。因此，在投與一或多種治療劑之背景下可考慮"有效劑量"，且若與一或多種其他試劑聯合則可考慮以有效量來給予單一藥劑，由此可達成或達成所要結果。

如本文所用，"治療"為獲得有益或所要結果(包括臨床結果)之手段。為達成本發明之目的，有益或所要臨床結果包括但不限於一或多種以下結果：抑制、抑止或降低澱粉樣蛋白斑塊之形成；降低、移除或清除澱粉樣蛋白斑塊；改良認知、使認知衰退逆轉或減緩；螯合在生物流體中迴圈之可溶Aβ肽；降低組織(諸如腦)中之Aβ肽(包括可溶、寡聚及沈積的)；抑制、減緩及/或降低Aβ肽在腦中之積聚；抑制、減緩及/或降低Aβ肽在組織(諸如腦)中之毒性效應；減少由疾病所產生之症狀；增加彼等遭受該疾病者之生命品質；降低治療該疾病所需之其他藥劑的劑量；延緩疾病之進展及/或延長患者之生存期。

如本文所用，"延緩"阿茲海默氏症之發展意謂推遲、阻礙、減緩、妨礙、穩定及/或延遲疾病之發展。視疾病之病史及/或待治療之個體而定，此延緩可為各種時間長度之延緩。如熟習此項技術者所明瞭，充分或顯著之延緩實際上可涵蓋預防，其中該個體並不發展該疾病。"延緩"阿茲海默氏症之發展的方法為與不使用該方法相比在給定期限中降低疾病發展之可能性及/或在給定期限中降低疾病之程度的方法。此等比較通常係基於臨床研究，其使用統計學上顯著數量之受檢者。

阿茲海默氏症之"發展"意謂阿茲海默氏症在個體內之發作及/或進展。阿茲海默氏症之發展可使用如本文所述之標準臨床技術來偵測。然而，發展亦係指起始不可偵測之疾病進展。為達成本發明之目的，進展係指疾病狀態之生物進程，在此狀況中，如由標準神經學檢查或與患者之面談所判定，或可由更專業的測試來判定。多種此等診斷測試包括但不限於神經成像、偵測血清或腦脊液中特異性蛋白質(例如，澱粉樣蛋白肽及Tau)之含量的變化、電腦斷層攝影術(CT)及磁共振成像(MRI)。"發展"包括發生、復發及發作。如本文所用，阿茲海默氏症之"發作"或"發生"包括起始發作及/或復發。

如本文所用，"聯合"投藥包括同時投藥及/或在不同時間之投藥。聯合投藥亦涵蓋作為共調配物之投藥或作為分離組合物之投藥。如本文所用，聯合投藥意謂涵蓋任何其中投與抗－Aβ抗體及另一試劑至一個體(其可同時及/或分開發生)的情況。如本文所進一步討論，當然，可以不同之給藥頻率或間隔來投與抗－Aβ抗體及其它試劑。舉例而言，可每周投與抗－Aβ抗體，而可較不頻繁地投與其他試劑。當然，可使用相同投藥路線或不同投藥路線來投與抗－Aβ抗體及其它試劑。

"生物樣品"涵蓋多種得自個體之樣品類型且可將其用於診斷或監控檢定。該定義涵蓋血液及生物來源之其他液體樣品、固體組織樣品，諸如活組織檢查樣品或組織培養物或自其衍生之細胞及其後裔。該定義亦包括在獲得樣品之後以任何方式操作的樣品，該等方式係諸如藉由用試劑之處理、對某些組份(諸如蛋白質或聚核苷酸)之增溶或富集、或出於切片目的而埋入半固體或固體基質中。術語"生物樣品"涵蓋臨床樣品，且亦包括培養物中之細胞、細胞上清液、細胞溶胞物、血清、血漿、生物流體及組織樣品。

"受檢者"(或者稱為"個體")為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物亦包括但不限於家畜(諸如牛)、運動動物、寵物(諸如貓、狗、馬)、靈長類動物、小鼠及大鼠。

如本文所用，"載體"意謂一種構造體，其能在宿主細胞中傳遞、且較佳能表現一或多種相關基因或序列。載體之實例包括但不限於病毒載體、裸露DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子縮合劑相關之DNA或RNA表現載體、在脂質體中包裹之DNA或RNA表現載體、及特定真核細胞諸如生產細胞。

如本文所用，"表現控制序列"意謂指導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子(諸如構成性或可誘導之啟動子)或增強子。可將表現控制序列可操作地連接至待轉錄之核酸序列。

如本文所用，"醫藥學上可接受之載劑"包括在與活性成份組合時使該成份保留生物活性且不與受檢者之免疫系統反應的任何材料。實例包括但不限於任何標準醫藥載劑，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)、及各種類型之濕潤劑。用於氣霧劑或非經腸投藥之較佳稀釋劑為磷酸鹽緩衝鹽水或生理鹽水(0.9%)。包含此等載劑之組合物可藉由熟知之習知方法來調配(參見，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro編，Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing,2000)。

如本文所用，術語"k_{o n} "欲指抗體至抗原之締合的開始速率常數。

如本文所用，術語"k_{o f f} "欲指抗體自抗體/抗原複合物解離之離開速率常數。

如本文所用，術語"K_D "欲指抗體－抗原相互作用之平衡解離常數。

組合物及製造組合物之方法 抗－β－澱粉樣蛋白抗體及多肽

本發明提供結合至Aβ肽之C－末端之抗體。本發明提供結合至Aβ_{1 － 4 0} 、Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} 之抗體或多肽。在一些實施例中，該抗體或該多肽以比其結合至Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} 更高之親和力結合至Aβ_{1 － 4 0} 。在一些實施例中，該抗體結合至Aβ_{1 － 3 6} 、Aβ_{1 － 3 7} 、Aβ_{1 － 3 8} 及Aβ_{1 － 3 9} 。在一些實施例中，該抗體結合至Aβ_{2 2 － 3 5} 。在一些實施例中，該抗體結合至Aβ_{2 8 － 4 0} 。在一些實施例中，該抗體或該多肽結合至包括胺基酸25－34及40之Aβ_{1 － 4 0} 上的抗原決定基。

本發明亦提供包括醫藥組合物之組合物，其包含任何本文所述之抗體或多肽(諸如表3中所示之抗體6G及其變異體或自表3中所示之抗體6G或其變異體衍生之多肽)；或本文所述之聚核苷酸。如本文所用，組合物包含一或多種結合至Aβ_{1 － 4 0} 之C－末端的抗體或多肽(其可為或不為抗體)、及/或一或多種包含編碼一或多種結合至Aβ_{1 － 4 0} 之C_－ 末端的抗體或多肽之序列的聚核苷酸。此等組合物可進一步包含適合之賦形劑，諸如包括緩衝液之醫藥學上可接受之賦形劑，其在此項技術中為吾人所熟知。

本發明之抗體或多肽之特徵為以下特徵之任一者(一或多種)：(a)結合至Aβ_{1 － 4 0} 、Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} ；(b)結合至Aβ_{1 － 4 0} 、Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} ，其中以與其結合至Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} 相比更高之親和力結合至Aβ_{1 － 4 0} ；(c)結合至包括胺基酸25－34及40之Aβ_{1 － 4 0} 上的抗原決定基；(d)結合至Aβ_{1 － 3 6} 、Aβ_{1 － 3 7} 、Aβ_{1 － 3 8} 及Aβ_{1 － 3} 9，但以與其結合至Aβ_{1 － 4 0} 相比更低之親和力來結合；(e)以小於約1 μM之K_D 結合至Aβ_{2 2 － 3 7} ；(f)結合至Aβ_{2 2 － 3 5} ；(g)結合至Aβ_{2 8 － 4 0} ；(h)不結合至在細胞中表現之APP；(i)抑止澱粉樣蛋白斑塊在受檢者中之形成；(j)降低受檢者中之澱粉樣蛋白斑塊；(k)治療、預防、改善阿茲海默氏症或其他與Aβ積聚相關之疾病(例如，唐氏綜合症、帕金森氏症、多發性梗死性癡呆、輕度認知損害、大腦澱粉樣蛋白血管病、抑鬱、庫賈氏病、具有路易體之癡呆)的一或多種症狀；(l)改良認知功能。本發明之抗體及多肽亦可具有本文所述之削弱之效應功能。與其他所報導之抗－Aβ抗體相比，具有削弱之效應功能之抗體及多肽可展現所要之安全概況。舉例而言，本發明之組合物可不引起以下任何一或多種情況之顯著或不可接受之水平：在腦脈管系統中出血(腦出血)；腦膜腦炎(包括改變磁共振掃描)；腦脊液中升高之白血球數；中樞神經系統炎症。

因此，本發明提供任一以下物質、或包含任一以下物質之組合物(包括醫藥組合物)：(a)表3中所示之抗體6G或其變異體；(b)表3中所示之抗體6G或其變異體之片段或區域；(c)表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈；(d)表3中所示之抗體6G或其變異體之重鏈；(e)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈及/或重鏈之一或多個可變區；(f)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之一或多個CDR(一、二、三、四、五或六個CDR)；(g)來自抗體6G之重鏈的CDR H3；(h)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈的CDR L3；(i)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈的三個CDR；(j)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之重鏈的三個CDR；(k)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈之三個CDR及來自重鏈之三個CDR；及(l)包含(b)至(k)之任一者的抗體。本發明亦提供包含任何一或多種以上物質之多肽。

圖1中圖示性地描述抗體6G之CDR部分(包括Chothia及Kabat CDR)。CDR區之判定在此項技術中為吾人所熟知。當然，在一些實施例中，CDR可為Kabat與Chothia CDR之組合(亦稱為"組合CDR"或"延伸CDR")。在一些實施例中，該等CDR為Kabat CDR。在其他實施例中，該等CDR為Chothia CDR。換言之，在具有多於一個CDR之實施例中，該等CDR可為任何之Kabat、Chothia、組合CDR或其組合。

在一些實施例中，本發明提供一種多肽(其可為或可不為抗體)，其包含大體上等同於表3中所示之6G或其變異體之至少一個CDR、至少二個、至少三個、至少四個、至少五個或全部六個CDR的至少一個CDR、至少二個、至少三個、或至少四個、至少五個或全部六個CDR。其他實施例包括具有大體上等同於6G或自6G衍生之至少二個、三個、四個、五個或六個CDR的至少二個、三個、四個、五個或六個CDR的抗體。在一些實施例中，該等至少一個、二個、三個、四個、五個或六個CDR的至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%等同於表3中所示之6G或其變異體之至少一個、二個、三個、四個、五個或六個CDR。當然，為達成本發明之目的，一般保留結合特異性及/或總體活性，雖然活性程度與表3中所示之6G或其變異體相比可變化(可更大或更小)。

本發明亦提供一種多肽(其可為或不為抗體)，其包含具有以下任一物質之表3中所示之6G或其變異體之胺基酸序列：表3中所示之6G或其變異體的至少5個鄰近胺基酸、至少8個鄰近胺基酸、至少約10個鄰近胺基酸、至少約15個鄰近胺基酸、至少約20個鄰近胺基酸、至少約25個鄰近胺基酸、至少約30個鄰近胺基酸之序列，其中至少3個胺基酸係來自表3中所示之6G(圖1)或其變異體的可變區。在一實施例中，該可變區係來自6G之輕鏈。在另一實施例中，該可變區係來自6G之重鏈。一例示性多肽具有來自6G之重及輕鏈可變區兩者的鄰近胺基酸(前述長度)。在另一實施例中，5(或更多)個鄰近胺基酸係來自圖1中所示之6G之互補判定區(CDR)。在一些實施例中，鄰近胺基酸係來自6G之可變區。

本發明之抗體及多肽之結合親和力可變化，且不必為(但可為)如以下例示性實例所述之特定值或範圍。本發明之抗體及多肽至Aβ_{1 － 4 0} 之結合親和力(K_D )可為約0.10 nM至0.80 nM、約0.15 nM至0.75 nM及約0.18 nM至0.72 nM。在一些實施例中，該結合親和力為約2 pM、約5 pM、約10 pM、約15 pM、約20 pM、約40 pM或大於約40 pM。在一實施例中，該結合親和力在約2 pM與22 pM之間。在其他實施例中，該結合親和力小於約10 nM、約5 nM、約4 nM、約3 nM、約2 nM、約1 nM、約900 pM、約800 pM、約700 pM、約600 pM、約500 pM、約400 pM、約300 pM、約200 pM、約150 pM、約100 pM、約90 pM、約80 pM、約70 pM、約60 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約10 pM。在一些實施例中，該結合親和力為約10 nM。在其他實施例中，該結合親和力為小於約10 nM、小於約50 nM、小於約100 nM、小於約150 nM、小於約200 nM、小於約250 nM、小於約500 nM或小於約1000 nM。在其他實施例中，該結合親和力小於約5 nM。在其他實施例中，該結合親和力小於約1 nM。在其他實施例中，該結合親和力為約0.1 nM或約0.07 nM。在其他實施例中，該結合親和力小於約0.1 nM或小於約0.07 nM。在其他實施例中，該結合親和力係來自約10 nM、約5 nM、約1 nM、約900 pM、約800 pM、約700 pM、約600 pM、約500 pM、約400 pM、約300 pM、約200 pM、約150 pM、約100 pM、約90 pM、約80 pM、約70 pM、約60 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約10 pM之任一者至約2 pM、約5 pM、約10 pM、約15 pM、約20 pM、或約40 pM之任一者。在一些實施例中，該結合親和力為約10 nM、約5 nM、約1 nM、約900 pM、約800 pM、約700 pM、約600 pM、約500 pM、約400 pM、約300 pM、約200 pM、約150 pM、約100 pM、約90 pM、約80 pM、約70 pM、約60 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約10 pM之任一者。在其他實施例中，該結合親和力為約2 pM、約5 pM、約10 pM、約15 pM、約20 pM、約40 pM或大於約40 pM。

本發明之抗體及多肽亦可結合至Aβ_{1 － 3 6} 、Aβ_{1 － 3 7} 、Aβ_{1 － 3 8} 、Aβ_{1 － 3 9} 、Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} 中任一個或多個，但與此等肽之任一個或多個之結合親和力小於其與Aβ_{1 － 4 0} 之結合親和力。在一些實施例中，該等抗體或多肽結合至Aβ_{1 － 3 6} 、Aβ_{1 － 3 7} 、Aβ_{1 － 3 8} 、Aβ_{1 － 3 9} 、Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} 中任一個或多個之K_D 為結合至Aβ_{1 － 4 0} 之K_D 的至少約5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約80倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍、或至少約250倍。

本發明亦提供製造任何此等抗體或多肽之方法。本發明之抗體可藉由此項技術中已知之步驟製得。舉例而言，藉由以Aβ肽(諸如作為免疫原之Aβ25－40)免疫一哺乳動物可產生該抗體，藉由抗體之蛋白水解或其他降解，藉由如前所述之重組方法(即，單一或融合多肽)或藉由化學合成可產生該等多肽。藉由化學合成作用可便利地製造抗體之多肽，尤其是至多約50個胺基酸之較短多肽。化學合成之方法在此項技術中係已知且為可購得的。舉例而言，可藉由採用固相方法之自動多肽合成器來製造抗體。亦參見美國專利第5,807,715號；第4,816,567號；及第6,331,415號。

在另一替代性實施例中，可使用此項技術中熟知之步驟以重組技術來製造該等抗體。在一個實施例中，聚核苷酸包含編碼SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中所示之抗體6G之重鏈及/或輕鏈可變區之序列。在另一實施例中，將包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中所示之核苷酸序列的聚核苷酸選殖至一或多個用於表現或繁殖之載體中。可將編碼相關抗體之序列維持在宿主細胞中之載體中，且接著可使宿主細胞膨脹及冷凍以便將來之用。在本文中進一步描述載體(包括表現載體)及宿主細胞。

本發明亦涵蓋諸如6G之本發明之抗體的單鏈可變區片段("scFv")。單鏈可變區片段係藉由使用短連接肽來連接輕及/或重鏈可變區制得(Bird等人(1988)Science 242：423－426)。連接肽之一實例為(GGGGS)₃ ，其將介於一可變區之羧基末端與另一可變區之胺基末端之間的約3.5 nm橋連。已設計及使用其他序列之連接子(Bird等人(1988))。接著可將連接子修飾而用於額外之功能，諸如藥物之附著或至固體載體之附著。可以重組或合成方式來製造單鏈變異體。對於scFv之合成生產，可使用自動合成器。對於scFv之重組生產，可將含有編碼scFv之聚核苷酸之適合質體導入適合之宿主細胞中，該宿主細胞可為真核細胞諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞或原核細胞諸如大腸埃希氏菌。編碼相關scFv之聚核苷酸可藉由常規操作諸如聚核苷酸之連接反應而制得。可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化技術來分離所得scFv。

亦涵蓋單鍵抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價、雙特異性抗體，其中在單一多肽鏈上表現VH及VL域，但使用太短以致不能使相同鏈上之兩域之間成對的連接子，藉此迫使該等域與另一鏈之互補域成對且創造兩個抗原結合位點(參見，例如，Holliger,P.等人(1993)Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444－6448；Poljak,R.J.，等人(1994)Structure 2：1121－1123)。

舉例而言，可使用本文所揭示之抗體來製備雙特異性抗體，其為具有對至少兩種不同抗原之結合特異性的單株抗體。製造雙特異性抗體之方法係在此項技術中已知(參見，例如，Suresh等人，1986,Methodsin Enzymology 121：210)。傳統上，雙特異性抗體之重組生產係基於兩個免疫球蛋白重鏈－輕鏈對之共表現，其中兩條重鏈具有不同特異性(Millstein及Cuello,1983,Nature 305,537－539)。

根據製造雙特異性抗體之一途徑，使具有所要結合特異性之抗體可變域(抗體－抗原組合位元點)融合至免疫球蛋白恒定域序列。該融合較佳係與免疫球蛋白重鏈恒定域進行，該重鏈恒定域包含至少部分之鉸鏈區、CH2及CH3區。最好使第一重鏈恒定區(CH1)(其含有輕鏈結合所必需之位元點)存在于至少一個融合中。使編碼免疫球蛋白重鏈融合及(若需要)免疫球蛋白輕鏈之DNA插入分離之表現載體中，且將其共轉染至適合之宿主有機體中。以此方式在當該構造中所用之三種多肽鏈之不等比率提供最佳產率時的實施例中對調節三種多肽片段之共同比例提供極大的靈活性。然而，當以相等比率存在之至少條兩多肽鏈之表現導致高產率時或當該等比率無特別重要性時可能在一表現載體中插入兩條或全部三條多肽鏈之編碼序列。

在一途徑中，該等雙特異性抗體包含在一臂中具有第一結合特異性的雜交免疫球蛋白重鏈及另一臂中之雜交免疫球蛋白重鏈－輕鏈對(提供第二結合特異性)。此不對稱結構(僅在雙特異性分子之一半中具有免疫球蛋白輕鏈)促進所要雙特異性化合物自不必要之免疫球蛋白鏈組合中之分離。在1994年3月3日公開之PCT公開案第WO 94/04690號中描述此途徑。

包含兩個經共價接合之抗體的異質共軛物(Heteroconjugate)抗體亦在本發明之範疇內。已將此等抗體用於將免疫系統細胞靶向不必要之細胞(美國專利第4,676,980號)，且用於HIV傳染之治療(PCT申請公開案第WO 91/00360及WO 92/200373號；EP 03089)。可使用任何習知交叉連接方法制得異質共軛物抗體。適合之交叉連接劑及技術在此項技術中為吾人所熟知，且係在美國專利第4,676,980號中描述。

亦可使用合成蛋白質化學之已知方法(包括彼等涉及交叉連接劑的方法)在活體外製備嵌合或雜交抗體。舉例而言，可使用二硫交換反應或藉由形成硫醚鍵來構造免疫毒素。為達成此目的，適合試劑之實例包括亞胺基硫醇鹽及甲基－4－巰基丁醯亞胺酯。

可使用此項技術中已知之任何方法製造包含抗體6G之一或多個CDR或源自抗體6G之一或多個CDR的人源化抗體。舉例而言，可使用四個一般步驟以使單株抗體人源化。此等步驟為：(1)判定起始抗體輕及重鏈可變域之核苷酸及預知胺基酸序列；(2)設計該人源化抗體，即，決定在人源化方法中使用何種抗體構架區；(3)實際之人源化方法/技術及(4)人源化抗體之轉染及表現。參見，例如，美國專利第4,816,567號；第5,807,715號；第5,866,692號；第6,331,415號；第5,530,101號；第5,693,761號；第5,693,762號；第5,585,089號；第6,180,370號；第5,225,539號；第6,548,640號。

在重組人源化抗體中，可將Fcγ部分修飾以避免與Fcγ受體及補體免疫系統之相互作用。此類型之修飾係由來自康橋大學(Cambridge University)之病理學系(Department of Pathology)的Mike Clark博士設計，且在1999年11月18日公開之WO 99/58572中描述製備此等抗體之技術。

舉例而言，若在臨床試驗及人類之治療中使用該抗體，則可將恒定區加工成更為類似之人類恒定區以避免免疫反應。參見，例如，美國專利第5,997,867號及第5,866,692號。

本發明涵蓋對抗體6G之修飾，包括不顯著影響其性質的功能上相當之抗體及具有增強或降低之活性及/或親和力之變異體。舉例而言，可使抗體6G之胺基酸序列變異以獲得具有結合至Aβ_{1 － 4 0} 肽所要之結合親和力的抗體。多肽之修飾為此項技術中之常規實踐且在本文中不需要詳細描述。多肽之修飾係在實例中例證化。經修飾之多肽之實例包括具有胺基酸殘基之保守取代、一或多個不顯著有害地改變功能活性之胺基酸的缺失或添加、或使用化學類似物的多肽。

胺基酸序列插入包括長度範圍為一個殘基至含有一百或更多殘基之多肽的胺基－及/或羧基－末端融合、以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N－末端甲硫胺醯基殘基之抗體或融合至抗原決定基卷標之抗體。抗體分子之其他插入式變異體包括增加抗體之血清半衰期的與酶或多肽之N－或C－末端的融合。

取代變異體在已移除之抗體分子中具有至少一個胺基酸殘基且在其位置處插入之一不同殘基。對取代突變形成最相關之位點包括高變區，但亦涵蓋FR改變。保守取代在表1中於"保守取代"之標題下顯示出。若此等取代導致生物活性變化，則可導入更多實質變化(在表1中命名為"例示性取代"，或如下將就胺基酸類別進行進一步描述)且可篩選產物。

藉由選擇其在維持以下化學結構中具有顯著不同作用之取代來完成抗體之生物性質中之實質修飾：(a)取代區域中多肽骨架之結構，例如，呈現片狀或螺旋狀構形；(b)在目標位元點處分子之電荷或疏水性；或(c)側鏈之尺寸。可基於常見側鏈性質將天然產生之殘基分組：(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)極性且不帶電荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(帶負電荷)：Asp、Glu；(4)鹼性(帶正電荷)：Lys、Arg；(5)影響側鏈方向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe、His。

藉由將此等類別中之一成員交換成另一類別來製造非保守取代。

亦可取代任何不涉及維持抗體之適當構形的半胱胺酸殘基，一般以絲胺酸來取代以改良分子之氧化穩定性且防止異常之交叉連接。相反，可將一或多個半胱胺酸鍵添加至抗體中以改良其穩定性，尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段處。

胺基酸修飾之範圍可自改變或修飾一或多個胺基酸延伸至完全再設計一諸如可變區之區域。在可變區中之變化可改變結合親和力及/或特異性。在一些實施例中，在CDR域中製造不超過一至五個保守胺基酸取代。在其他實施例中，在CDR域中製造不超過一至三個保守胺基酸取代。在其他實施例中，該CDR域為CDR H3及/或CDR L3。

修飾亦包括醣基化及非醣基化多肽、以及具有其他轉譯後修飾之多肽，該等轉譯後修飾係諸如具有不同糖類之醣基化作用、乙醯化作用及磷酸化作用。在其恒定區中之保守位置處將抗體醣基化(Jefferis及Lund,1997,Chem.Immunol.65：111－128；Wright及Morrison,1997,TibTECH 15：26－32)。免疫球蛋白之寡醣側鏈影響蛋白質之功能(Boyd等人，1996,Mol.Immunol.32：1311－1318；Wittwe及Howard,1990,Biochem.29：4175－4180)及在糖蛋白之部分之間的分子內相互作用，其可影響糖蛋白之構形及所存在之三維表面(Hefferis及Lund，同上；Wyss及Wagner,1996,Current Opin.Biotech.7：409－416)。基於特異性識別結構，寡醣亦可用來將給定糖蛋白靶向至某些分子。亦已報導抗體之醣基化作用影響抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。詳言之，報導具有β(1,4)－N－乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII)之經四環素調節之表現的CHO細胞(截開之GlcNAc之糖基轉移酶催化形成)具有改良之ADCC活性(Umana等人，1999,Mature Biotech.17：176－180)。

抗體之醣基化作用通常為N－連接或經O－連接。N－連接係指碳水化合物部分附著至天冬醯胺酸殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺酸－X－絲胺酸、天冬醯胺酸－X－蘇胺酸及天冬醯胺酸－X－半胱胺酸(其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)為碳水化合物部分至天冬醯胺酸側鏈之酶附著的識別序列。因此，此等三肽序列在多肽中之存在創造潛在之醣基化位點。O－連接之醣基化作用係指糖類N－乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖之一者附著至羥胺基酸，最常見為絲胺酸或蘇胺酸，雖然亦可使用5－羥基脯胺酸或5－羥基離胺酸。

藉由改變胺基酸序列以使其含有一或多個前述三肽序列(對於N－連接之醣基化位點而言)來便利地完成向抗體中添加醣基化位點。亦可藉由向原始抗體序列添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或藉由以一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基對原始抗體序列之取代(對於O－連接之醣基化位點而言)來產生該改變。

亦可在改變基本核苷酸序列之情況下改變抗體之醣基化圖案。醣基化作用很大程度上視用於表現該抗體之宿主細胞而定。由於作為潛在治療劑用於表現重組糖蛋白質(例如，抗體)之細胞類型很少為天然細胞，因此可預期抗體之醣基化圖案中之變化(參見，例如，Hse等人，1997,J.Biol.Chem.272：9062－9070)。

除了宿主細胞之選擇之外，在抗體之重組製造期間影響醣基化作用之因素包括生長模式、培養基調配、培養物密度、氧合作用、pH值、純化流程及其類似因素。已提出用於改變在特定宿主有機體中達成之醣基化圖案的各種方法，包括導入或過度表現某些涉及寡醣生產之酶(美國專利第5,047,335號；第5,510,261號及第5,278,299號)。可自糖蛋白以酶促方式移除醣基化作用或某些類型之醣基化作用，例如使用醣苷內切酶H(內切H)、如實例1中所述之N－醣苷酶F、醣苷內切酶F1、醣苷內切酶F2、醣苷內切酶F3。另外，可利用遺傳工程學將重組宿主細胞建造成在處理某些類型之多醣中有缺陷。此等及類似技術在此項技術中為吾人所熟知。

修飾之其他方法包括使用此項技術中已知之偶合技術，包括但不限於酶手段、氧化取代及螯合。可將修飾用於(例如)免疫檢定之標記物之附著。使用此項技術中已建立之程式製造經修飾之6G多肽且可使用此項技術中已知之標準檢定篩選之，其中一些係在以下及實例中描述。

其他抗體修飾包括已如1999年11月18日公開之PCT公開案第WO 99/58572號中所述來修飾之抗體。此等抗體包含(除針對目標分子之結合域之外)具有大體上與人類免疫球蛋白重鏈之所有或部分恒定域同源的胺基酸序列之效應域。此等抗體能結合目標分子而不觸發目標之顯著補體依賴性溶解、或細胞調節之破壞。在一些實施例中，效應域能特異性結合FcRn及/或FcγRIIb。此等通常係基於源自兩個或兩個以上人類免疫球蛋白重鏈C_H 2域之嵌合域。以此方式修飾之抗體尤其適用於慢性抗體療法，以避免習知抗體療法之炎症及其它有害反應。

本發明包括親和力成熟之實施例。舉例而言，可藉由此項技術中已知之程式生產親和力成熟之抗體(Marks等人，1992,Bio/Technology,10：779－783；Barbas等人，1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809－3813；Schier等人，1995,Gene,169：147－155；Yelton等人，1995,J.Immunol.,155：1994－2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.,154(7)：3310－9；Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.,226：889－896；及WO 2004/058184)。

可將以下方法用於調節抗體之親和力及用於表徵CDR。將表徵抗體之CDR及/或改變(諸如改良)多肽(諸如抗體)之結合親和力之一方式稱為"文庫掃描突變形成"。大體而言，文庫掃描突變形成係如下作用的。使用此項技術中公認之方法以兩個或兩個以上(諸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)胺基酸替代CDR中之一或多個胺基酸位置。以此方式產生純系之小文庫(在一些實施例中，對每一經分析之胺基酸位置產生一文庫)，各具有兩個或兩個以上成員之複雜性(若在每一位置取代兩個或兩個以上胺基酸)。大體而言，該文庫亦包括包含天然(未經取代)胺基酸之純系。對來自各文庫之小數量之純系(例如，約20－80個純系(視庫之複雜性而定))結合至目標多肽(或其他結合目標)之結合親和力進行篩選，且鑒別具有增加、相同、降低或無結合之候選者。用於判定結合親和力之方法在此項技術中為吾人所熟知。可使用BIAcore表面電漿共振分析來判定結合親和力，該分析偵測約2倍或更大之結合親和力中的差異。在當起始抗體早已以相對高之親和力(例如，約10 nM或更低之K_D )結合時BIAcore尤其適用。在本文之實例中描述使用BIAcore表面電漿共振之篩選。

可使用Kinexa Biocensor、閃爍親近檢定、ELISA、ORIGEN免疫檢定(IGEN)、螢光淬滅、螢光轉移及/或酵母呈現來判定結合親和力。亦可使用適合之生物檢定來篩選結合親和力。

在一些實施例中，使用此項技術中公認之突變形成方法(其中一些在本文中描述)以全部20種天然胺基酸替代CDR中每一個胺基酸位置。以此方式產生純系之小文庫(在一些實施例中，對每一經分析之胺基酸位置產生一文庫)，各自具有20個成員之複雜性(若在每一位置取代全部20種胺基酸)。

在一些實施例中，待篩選之文庫包含兩個或兩個以上位置中之取代，其可在相同CDR中或在兩個或兩個以上CDR中。因此，該文庫可包含在一CDR中兩個或兩個以上位置中之取代。該文庫可包含在兩個或兩個以上CDR中兩個或兩個以上位置中之取代。該文庫可包含在3、4、5或更多位置中之取代，該等位置係於二、三、四、五或六個CDR中發現。使用低冗餘密碼子來製備該取代。參見，例如，Balint等人，(1993)Gene 137(l)：109－18之表2。

該CDR可為CDR H3及/或CDR L3。該CDR可為CDR L1、CDR L2、CDR L3、CDR H1、CDR H2及/或CDR H3中之一或多個。該CDR可為Kabat CDR、Chothia CDR或延伸CDR。

可對具有改良結合之候選者定序，藉此鑒別導致改良親和力之CDR取代突變體(亦稱為"改良"取代)。亦可對結合之候選者定序，藉此鑒別保留結合之CDR取代。

可進行多輪篩選。舉例而言，具有改良結合之候選者(各自包含在一或多個CDR之一或多個位置處之胺基酸取代)亦適用於含有至少原始胺基酸及在各改良CDR位置(即，在取代突變體顯示改良結合處之CDR中的胺基酸位置)處經取代之胺基酸的第二文庫之設計。以下進一步討論此文庫之製備、及篩選或選擇。

文庫掃描突變形成亦提供表徵CDR之手段，就具有改良結合、相同結合、降低結合或無結合之純系的頻率而言，亦提供關於各胺基酸位置對抗體－抗原複合物之穩定性的重要性之資訊。舉例而言，若CDR之一位置在變成所有20種胺基酸時保持結合，則將彼位置鑒別為抗原結合不太可能需要之位置。相反，若CDR之一位置僅在小百分數之取代中保持結合，則將彼位置鑒別為對CDR功能重要之位置。因此，文庫掃描突變形成方法產生關於CDR中可變成許多不同胺基酸(包括全部20種胺基酸)之位置、及CDR中不能變成或僅可變成少數胺基酸之位置的資訊。

可在第二文庫中組合具有改良親和力之候選者，該第二文庫包括改良之胺基酸、在彼位置處之原始胺基酸，且視所要或使用所要篩選或選擇方法所允許之文庫的複雜性而定，其可進一步包括在彼位置處額外之取代。另外，若需要，則可將相鄰胺基酸位置隨機化為至少兩種或兩種以上之胺基酸。相鄰胺基酸之隨機化可允許在突變體CDR中之額外構形可撓性，其接著可允許或促進更大數量的改良突變之導入。該文庫亦可包含在第一輪篩選中不顯示改良親和力之位置處的取代。

使用此項技術中已知之任何方法(包括使用BIAcore表面電漿共振分析來篩選)對第二文庫篩選或選擇具有改良及/或變化之結合親和力的庫成員，且使用此項技術中已知之任何選擇方法進行選擇，該等方法包括噬菌體呈現、酵母呈現及核糖體呈現方法。

本發明亦涵蓋融合蛋白質，其包含來自本發明之抗體(諸如6G)或多肽的一或多個片段或區域。在一實施例中，提供包含SEQ ID NO：2(圖1)中所示之可變輕鏈區之至少10個鄰近胺基酸及/或SEQ ID NO：1(圖1)中所示之可變重鏈區之至少10個胺基酸的融合多肽。在其他實施例中，提供包含SEQ ID NO：2(圖1)中所示之可變輕鏈區之至少約10、至少約15、至少約20、至少約25或至少約30個鄰近胺基酸及/或SEQ ID NO：1(圖1)中所示之可變重鏈區之至少約10、至少約15、至少約20、至少約25或至少約30個鄰近胺基酸的融合多肽。在另一實施例中，該融合多肽包含如圖1之SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：1中所示之6G之輕鏈可變區及/或重鏈可變區。在另一實施例中，該融合多肽包含6G之一或多個CDR。在其他實施例中，該融合多肽包含抗體6G之CDR H3及/或CDR L3。為達成本發明之目的，6G融合蛋白質含有一或多個6G抗體及在天然分子中並不連接至其的另一胺基酸序列，例如，異源序列或來自另一區域之同源序列。例示性異源序列包括但不限於"卷標"諸如FLAG卷標或6His卷標。卷標在此項技術中為吾人所熟知。

可藉由此項技術中已知之方法(例如，合成或重組)來創造6G融合多肽。通常本發明之6G融合蛋白質係藉由使用本文所述之重組方法製備編碼該蛋白質的表現聚核苷酸來制得，雖然其亦可藉由此項技術中已知之包括(例如)化學合成之其他手段來製備。

本發明亦提供包含共軛至(例如，連接至)一試劑之6G抗體或多肽之組合物，該試劑促進向固體載體(諸如生物素或抗生物素蛋白)之偶合。簡言之，應將一般對6G或抗體之引用理解為此等方法應用至本文所述之任何Aβ_{1 － 4 0} 結合實施例。共軛一般係指連接如本文所述之此等組份。該連接(其一般至少出於投藥而將此等組份固定於緊密締合中)可以任何數量之方式達成。舉例而言，在各擁有能與另一組份反應之取代基時，在試劑與抗體之間的直接反應係可能的。舉例而言，在一組份上之親核基團(諸如胺基或巰基)能與另一組份上含有羰基之基團(諸如酐或醯基鹵)或與含有良好離去基之烷基(例如鹵化物)反應。

可將本發明之抗體或多肽連接至標記試劑(或者稱為"標記物")，諸如螢光分子、放射性分子或此項技術中已知之任何其他標記物。標記物為此項技術中已知，其一般提供(直接或間接地)一訊號。

本發明亦提供包含抗體6G及(如本揭示內容所清楚描述)任何或全部本文所述之抗體及/或多肽的組合物(包括醫藥組合物)及套組。

具有削弱之效應功能的抗－Aβ抗體及多肽

本文所述之抗體或多肽(包括包含該等抗體或多肽之醫藥組合物)可具有削弱之效應功能。如本文所用，具有"削弱之效應功能"(與"免疫上惰性"或"部分免疫上惰性"可交換地使用)之抗體或多肽係指不具有任何效應功能或具有效應功能之一或多種降低之活性(與具有未經修飾或天然產生之恒定區的抗體或多肽相比)的抗體或多肽，例如，不具有以下任何一或多者之活性或具有其降低之活性：a)觸發經補體調節之溶解；b)刺激抗體依賴性細胞調節細胞毒性(ADCC)；及c)活化微神經膠質細胞。效應功能活性可降低約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%及100%之任一者。在一些實施例中，該抗體結合至β－澱粉樣蛋白肽而不觸發目標之顯著補體依賴性溶解、或經細胞調節之破壞。舉例而言，在恒定區上之Fc受體結合位點可經修飾或突變以移除或降低至某些Fc受體(諸如FcγRI、FcγRII及/或FcγRIII)之結合親和力。簡言之，應將對抗體之引用理解為此等實施例亦應用至多肽。將EU編號系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest；第5版Public Health Service,National Institutes of Healthy,Bethesda,Md.,1991)用於指示恒定區(例如，IgG抗體之恒定區)之哪個胺基酸殘基(一或多個)變化或突變。可將該編號用於特定類型之抗體(例如IgG1)或物種(例如，人類)，將此理解為可在抗體及物種之類型之中製造類似變化。

在一些實施例中，特異性結合至Aβ肽之抗體包含具有削弱之效應功能的重鏈恒定區。該重鏈恒定區可具有天然產生之序列或其可為一變異體。在一些實施例中，藉由(例如)胺基酸取代、插入及/或缺失來使天然產生之重鏈恒定區之胺基酸序列突變，藉以削弱恒定區之效應功能。在一些實施例中，亦可改變重鏈恒定區之Fc區之N－醣基化作用，例如，可將其完全或部分移除，藉以削弱恒定區之效應功能。

在一些實施例中，該效應功能係藉由移除抗－Aβ肽之Fc區(例如，在IgG之CH2域中)之N－醣基化作用來削弱。在一些實施例中，藉由使醣基化胺基酸殘基或為恒定區中之醣基化識別序列之一部分的側接殘基突變來移除Fc區之N－醣基化作用。三肽序列天冬醯胺酸－X－絲胺酸(N－X－S)、天冬醯胺酸－X－蘇胺酸(N－X－T)及天冬醯胺酸－X－半胱胺酸(N－X－C)(其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸)為N－醣基化作用中碳水化合物部分至天冬醯胺酸側鏈之酶附著的識別序列。使恒定區中的該等三肽序列中之任何胺基酸突變以產生配醣基化(aglycosylated)IgG。舉例而言，人類IgG1及IgG3之N－醣基化位點N297可突變為A、D、Q、K或H。參見，Tao等人，J.Immunology 143：2595－2601(1989)；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59－76(1998)。已報導具有用Gln、His或Lys來取代之Asn－297的人類IgG1及IgG3不結合至人類FcγRI且不活化補體，其中IgG1之Clq結合能力完全喪失且IgG3急劇降低。在一些實施例中，使三肽序列中之胺基酸N突變為胺基酸A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、Y之任一者。在一些實施例中，使三肽序列中之胺基酸N突變為保守取代。在一些實施例中，使三肽序列中之胺基酸X突變為脯胺酸。在一些實施例中，使三肽序列中之胺基酸S突變為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些實施例中，使三肽序列中之胺基酸T突變為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些實施例中，使三肽序列中之胺基酸C突變為A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、V、W、Y。在一些實施例中，使該三肽之後的胺基酸突變為P。在一些實施例中，以酶促方式(諸如如實例1中所述之N－醣苷酶F、醣苷內切酶F1、醣苷內切酶F2、醣苷內切酶F3及醣苷內切酶H)移除恒定區中之N－醣基化作用。移除N－醣基化作用亦可藉由生產具有缺乏N－醣基化作用之細胞系中的抗體來達成(Wright等人，J Immunol.160(7)：3393－402(1998))。

在一些實施例中，使與附著至恒定區之N－醣基化位點的寡醣相互作用之胺基酸殘基突變以降低至FcγRI之結合親和力。舉例而言，可使人類IgG3之F241、V264、D265突變。參見，Lund等人，J.Immunology 157：4963－4969(1996)。

在一些實施例中，藉由修飾區諸如如PCT WO 99/58572及Armour等人，Molecular Immunology 40：585－593(2003)；Reddy等人，J.Immunology 164：1925－1933(2000)中所述之人類IgG之233－236、297及/或327－331來削弱效應功能。PCT WO 99/58572及Armour等人中所述之抗體包含(除了針對目標分子之結合域之外)具有大體上與全部或部分之人類免疫球蛋白重鏈之恒定區同源的胺基酸序列之效應域。此等抗體能結合目標分子而不觸發目標之顯著補體依賴性溶解或經細胞調節之破壞。在一些實施例中，該效應域具有對FcγRI、FcγRIIa及FcγRIII之降低的親和力。在一些實施例中，該效應域能特異性結合FcRn及/或FcγRIIb。此等通常係基於源自兩個或兩個以上人類免疫球蛋白重鏈C_H 2域之嵌合域。以此方式修飾之抗體尤其適用於慢性抗體療法，以避免習知抗體療法之炎症及其它有害反應。在一些實施例中，該抗體之重鏈恒定區為具有任何以下突變之人類重鏈IgG1：1)A327A330P331至G327S330S331；2)E233L234L235G236至P233V234A235，其中缺失G236；3)E233L234L235至P233V234A235；4)E233L234L235G236A327A330P331至P233V234A235G327S330S331，其中缺失G236；5)E233L234L235A327A330P331至P233V234A235G327S330S331；及6)N297至A297或除N之外的任何其他胺基酸。此等突變可組合，例如，可使1)－5)之任一者與6)組合。在一些實施例中，該抗體之重鏈恒定區為具有以下突變之人類重鏈IgG2：A330P331至S330S331；N297至Q297；及N297G327A330P331至Q297G327S330S331。在一些實施例中，該抗體之重鏈恒定區為具有任何以下突變之人類重鏈IgG4：E233F234L235G236至P233V234A235，其中缺失G236；E233F234L235至P233V234A235；P228L235至S228E235；N297至Q297；及E233F234L235G236N297至P233V234A235G236Q297。

亦可修飾抗體之恒定區以削弱補體活化。舉例而言，IgG抗體在補體之C1組份結合之後的補體活化可藉由使C1結合主結構(例如，C1q結合主結構)中恒定區中之胺基酸殘基突變來降低。已報導人類IgG1之各個D270、K322、P329、P331之Ala突變顯著降低抗體結合至C1q及活化補體之能力。對鼠科IgG2b而言，C1q結合主結構組成殘基E318、K320及K322(Idusogie等人，J.Immunology 164：4178－4184(2000)；Duncan等人，Nature 322：738－740(1988))。

據信對鼠科IgG2b鑒別之C1q結合主結構E318、K320及K322常見於其他抗體同型(Duncan等人，Nature 322：738－740(1988))。IgG2b之C1q結合活性可藉由以在其側鏈上具有不適當官能度之胺基替代該等三個特定殘基之任一者來消除。不必僅以Ala替代離子殘基以消除C1q結合。亦可能使用其他經烷基取代之諸如Gly、Ile、Leu或Val之非離子殘基，或諸如Phe、Tyr、Trp及Pro之芳族非極性殘基替代該等三個殘基之任一者以消除C1q結合。另外，亦可能使用諸如Ser、Thr、Cys及Met之極性非離子殘基替代殘基320及322但不替代318以消除C1q結合活性。

本發明亦提供具有削弱效應功能之抗體，其中該抗體具有經修飾之鉸鏈區。可藉由修飾鉸鏈區來調節人類IgG與其Fc受體之結合親和力(Canfield等人，J.Exp.Med.173：1483－1491(1991)；Hezareh等人，J.Virol.75：12161－12168(2001)；Redpath等人，Human Immunology 59：720－727(1998))。特異性胺基酸殘基可突變或缺失。經修飾之鉸鏈區可包含源自與CH1域之彼者不同的抗體類別或子類之抗體之完全鉸鏈區。舉例而言，可將IgG類別之抗體之恒定域(CH1)附著至IgG4類別之抗體之鉸鏈區。或者，新型鉸鏈區可包含部分天然鉸鏈或其中重復中之各單元係源自天然鉸鏈區之重復單元。在一些實施例中，藉由將一或多個半胱胺酸殘基轉化為中性殘基(諸如丙胺酸)、或藉由將經適合取代之殘基轉化為半胱胺酸殘基來改變天然鉸鏈區(美國專利第5,677,425號)。使用此項技術中公認之蛋白質化學且較佳使用遺傳工程技術且如本文所述進行此等改變。

亦可將特異性結合至Aβ肽及融合至具有削弱之效應功能的重鏈恒定區之多肽用於本文所述之方法中。在一些實施例中，該多肽包含源自表3中所示之抗體6G或其變異體之序列。在一些實施例中，該多肽係源自結合至Aβ肽之單一域抗體。可使用此項技術中已知之方法產生單一域抗體(Omidfar等人，Tumour Biol.25：296－305(2004)；Herring等人，Trends in Biotechnology 21：484－489(2003))。

在一些實施例中，該抗體或多肽為F(ab')₂ 片段。在一些實施例中，該抗體或多肽為Fab片段。在一些實施例中，該抗體或多肽為單鏈抗體scFv。在一些實施例中，該抗體或多肽為PEG化之F(ab')₂ 片段。在一些實施例中，該抗體或多肽為PEG化之Fab片段。在一些實施例中，該抗體或多肽為PEG化之單鏈抗體scFv。

亦可使用此項技術中已知之製造具有削弱之效應功能之抗體的其他方法。

可在一或多個檢定中測試具有經修飾之恒定區之抗體及多肽以評價與起始抗體相比之生物活性中的效應功能降低之程度。舉例而言，可使用本文中所揭示之檢定或任何此項技術中公認之檢定來評估具有經改變之Fc區之抗體或多肽結合補體或Fc受體(例如，在微神經膠質細胞上之Fc受體)或經改變之鉸鏈區的能力(PCT WO 99/58572；Armour 等人，Molecular Immunology 40：585－593(2003)；Reddy等人，J.Immunology 164：1925－1933(2000)；Song等人，Infection and Immunity 70：5177－5184(2002))。

競爭性檢定可用於判定是否兩種抗體藉由識別相同或空間上重疊之抗原決定基而結合相同的抗原決定基或判定是否一抗體競爭性抑制另一抗體結合至抗原。此等檢定係在此項技術中已知。通常將抗原固定在多孔板上且量測未經標記之抗體阻斷經標記之抗體之結合的能力。此等競爭檢定之常見標記物為放射性標記物或酶標記物。

可篩選出在移除澱粉樣蛋白沈積中具有效力及其它有益效應(諸如改良認知)的特異性結合至Aβ之抗體及多肽。舉例而言，可將抗體或多肽投予具有阿茲海默氏症病變之動物。阿茲海默氏症之各種動物模型係在此項技術中已知。在投藥之後，可使用此項技術中已知及實例2中詳述之方法測試壓縮及擴散澱粉樣蛋白斑塊之程度、對認知之行為分析及微神經膠質細胞活化及微出血(PCT WO 2004/032868；Wilcock等人，J.Neurosci.23：3745－3751(2003)；Wilcock等人，J.Neuroinflammation 1：24(2004))。

聚核苷酸、載體及宿主細胞

本發明亦提供編碼本發明之抗體及多肽(包括包含圖1中所示之輕鏈及重鏈可變區之多肽序列的抗體)之經分離之聚核苷酸、及包含該聚核苷酸之載體及宿主細胞。

因此，本發明提供聚核苷酸(或組合物，包括醫藥組合物)，包含編碼以下任一項之聚核苷酸：(a)表3中所示之抗體6G或其變異體；(b)表3中所示之抗體6G或其變異體之片段或區域；(c)表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈；(d)表3中所示之抗體6G或其變異體之重鏈；(e)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈及/或重鏈之一或多個可變區；(f)表3中所示之抗體6G或其變異體之一或多個CDR(一、二、三、四、五或六個CDR)；(g)來自抗體6G之重鏈之CDR H3；(h)來自表3中所示之抗體6G或其變異體的CDR L3；(i)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈的三個CDR；(j)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之重鏈的三個CDR；(k)來自表3中所示之抗體6G或其變異體之輕鏈之三個CDR及來自重鏈之三個CDR；及(l)包含(b)至(k)之任一者之抗體。在一些實施例中，該聚核苷酸包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中所示之聚核苷酸之任一者或兩者。

在另一態樣中，本發明提供編碼任何本文所述之抗體(包括抗體片段)及多肽之聚核苷酸，諸如具有削弱之效應功能之抗體及多肽。可藉由此項技術中已知之程式製造聚核苷酸。

在另一態樣中，本發明提供包含任何本發明之聚核苷酸之組合物(諸如醫藥組合物)。在一些實施例中，該組合物包含一表現載體，該表現載體包含編碼如本文所述之6G抗體之聚核苷酸。在其他實施例中，該組合物包含一表現載體，該表現載體包含編碼任何本文所述之抗體或多肽之聚核苷酸。在其他實施例中，該組合物包含SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10中所示之聚核苷酸之任一者或兩者。本文中進一步描述表現載體、及聚核苷酸組合物之投藥。

在另一態樣中，本發明提供製造任何本文所述之聚核苷酸之方法。

本發明亦涵蓋對任何此等序列互補之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，且可為DNA(染色體組、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(其含有內含子且以一一對應方式與DNA分子對應)及不含有內含子之mRNA分子。另外之編碼或非編碼序列可(但不必需)存在于本發明之聚核苷酸之內，且聚核苷酸可(但不必)連接至其他分子及/或載體材料。

聚核苷酸可包含天然序列(即，編碼抗體或其部分之內源序列)或可包含此序列之變異體。聚核苷酸變異體含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入以使得經編碼之多肽之免疫反應性相對於天然免疫反應性分子並不減弱。一般可如本文所述評估在經編碼之多肽之免疫反應性上之效應。變異體較佳展現與編碼天然抗體或其一部分之聚核苷酸序列至少約70%之一致性、更佳至少約80%之一致性且最佳至少約90%之一致性。

若當為如下所述之最大相關性對準時兩個聚核苷酸或多肽序列中之核苷酸或胺基酸序列相同，則將該等兩個聚核苷酸或多肽序列稱為"相同"。兩個序列之間的比較通常係藉由經比較窗口比較該等序列來執行以鑒別及比較序列相似性之局部區域。如本文所用，"比較窗口"係指至少約20個鄰近位置、常常為30至約75、40至約50個鄰近位置之區段，其中在將兩個序列優化對準之後可將一序列與相同數量之鄰近位置之參照序列對比。

可使用生物資訊學軟體之Lasergene套裝中之Megalign程式(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)使用默認參數來執行為了比較而進行之序列之優化對準。此程式收錄在以下參考文獻中所述之數種對準流程：Dayhoff,M.O.(1978)A model of evolutionary change in proteins －Matrices for detecting distant relationships。在Dayhoff,M.O.(編者)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC，第5卷，增刊3，第345－358頁中；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes，第626－645頁，Methods in Enzymology，第183卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.及Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5：151－153；Myers,E.W.及Muller W.,1988,CABIOS 4：11－17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11：105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4：406－425；Sneath,P.H.A.及Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.及Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726－730。

較佳藉由經至少20個位置之比較窗口來比較兩個經優化對準之序列而判定"序列一致性之百分數"，其中就兩個序列之優化對準而言，與參照序列(其不包含添加或缺失)相比，在比較視窗中之聚核苷酸或多肽序列之部分可包含20%或更少、通常5%至15%、或10%至12%之添加或缺失(即，間隙)。藉由以下步驟來計算該百分數：測定其中在兩個序列中皆出現之相同核酸堿基或胺基酸殘基之位置的數量以產生匹配位置之數量、將匹配位置之數量除以參照序列中之位置之總數(即，窗口尺寸)且將結果乘以100以產生序列一致性之百分數。

變異體亦可或另外在大體上與天然基因同源、或為其一部分或補體。此等聚核苷酸變異體能在適度嚴格條件下雜交至編碼天然抗體(或互補序列)之天然產生之DNA序列。

適合之"適度嚴格條件"包括在5 X SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA(pH 8.0)之溶液中預洗滌；在50℃－65℃、5 X SSC下雜交隔夜；繼之在65℃下各以含有0.1% SDS之2X、0.5X及0.2X SSC洗滌兩次歷時20分鐘。

如本文所用，"高度嚴格條件"或"高嚴格性條件"為彼等符合以下條件者：(1)採用低離子強度及高溫以進行洗滌，例如在50℃下採用0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如在42℃下採用50%(體積/體積)甲醯胺與0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/pH 6.5之50 mM磷酸鈉緩衝液與750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉；或(3)在42℃下採用50%甲醯胺、5 x SSC(0.75 M NaCl、0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5 x Denhardt氏溶液、經超音波處理之鮭魚精DNA(50 μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸右旋糖酐，在42℃下於0.2 x SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中且在55℃下於50%甲醯胺中洗滌，繼而在55℃下進行由含有EDTA之0.1 x SSC組成之高嚴格性洗滌。熟練技師將瞭解如何調節對適應諸如探針長度及其類似物之因素所必需之溫度、離子強度等。

彼等熟習此項技術者應瞭解：由於遺傳密碼之簡並，所以存在許多編碼如本文所述之多肽的核苷酸序列。此等聚核苷酸中之一些具有與任何天然基因之核苷酸序列之最小同源性。儘管如此，由於密碼子用途之差異而改變之聚核苷酸係由本發明特定地涵蓋。此外，包含本文所提供之聚核苷酸序列之基因之等位基因係在本發明之範疇之內。等位基因為由於一或多個突變(諸如核苷酸之缺失、添加及/或取代)而改變之內源基因。所得mRNA及蛋白質可(但不必)具有改變之結構或功能。可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)來鑒別等位基因。

可使用化學合成、重組方法或PCR來獲得本發明之聚核苷酸。化學聚核苷酸合成之方法在此項技術中為吾人所熟知且在本文中不需要詳細描述。熟習此項技術者可使用本文所提供之序列及市售DNA合成器來製造所要DNA序列。

如本文中進一步所討論，對於使用重組方法製備聚核苷酸而言，可將包含所要序列之聚核苷酸插入適合之載體中，且接著將該載體導入適合之宿主細胞中以便複製及擴增。可藉由此項技術中已知之任何手段將聚核苷酸插入宿主細胞中。藉由導入外源聚核苷酸而使細胞轉型，該導入係藉由直接攝取、胞吞作用、轉染、F－交配或電穿孔來進行。一旦導入，則可在作為非整合載體(諸如質體)之細胞之內維持該外源聚核苷酸，或將其整合至宿主細胞染色體組中。可藉由此項技術中熟知之方法自宿主細胞分離由此擴增之聚核苷酸。參見Sambrook等人(1989)。

或者，PCR允許DNA序列之再現。PCR技術在此項技術中為吾人所熟知且係描述於美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202號以及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis等人編，Birkauswer Press,Boston(1994)中。

藉由使用在適當載體中經分離之DNA且將其插入適合之宿主細胞中來獲得RNA。當該細胞複製且使DNA轉錄至RNA中時，接著可使用彼等熟習此項技術者所熟知之方法分離RNA，例如，如Sambrook等人，(1989)中所闡述。

可根據標準技術來構造、或可自大量此項技術中可利用之選殖載體選擇適合之選殖載體。雖然可根據待使用之宿主細胞來改變所選擇之選殖載體，但適用之選殖載體一般將具有自我複製之能力、可擁有對特定限制性核酸內切酶之單一目標、及/或可為能在選擇含有該載體之純系中使用的標記物載運基因。適合之實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK＋)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA、及諸如pSA3及pAT28之穿梭載體。此等及多種其他選殖載體可自商業賣主諸如BioRad、Strategene及Invitrogen購得。

表現載體一般為含有根據本發明之聚核苷酸的可複製之聚核苷酸建構體。此意謂表現載體必須作為附加體或作為染色體DNA之整體部分在宿主細胞中可複製。適合之表現載體包括(但不限於)質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、逆轉錄酶病毒)、黏質體及PCT公開案第WO 87/04462號中所揭示之一或多種表現載體。載體組份一般可包括(但不限於)一或多種以下物質：訊號序列；複製源；一或多個標記基因；適合之轉錄控制元件(諸如啟動子、強化子及終止子)。對於表現(即，轉譯)而言，常常亦需要一或多個轉譯控制元件，諸如核糖體結合位元點、轉譯起始位元點及終止密碼子。

可藉由任何多種適當手段將含有相關聚核苷酸之載體導入宿主細胞中，該等手段包括電穿孔；採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE－葡聚糖或其他物質之轉染；微彈轟擊；脂質轉染；及傳染(例如，在載體為諸如牛痘病毒之傳染劑處)。導入載體或聚核苷酸之選擇常將視宿主細胞之特點而定。

本發明亦提供包含任何本文所述之聚核苷酸之宿主細胞。出於分離編碼相關抗體、多肽或蛋白質之基因的目的，可使用能過度表現異源DNA之任何宿主細胞。哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括(但不限於)COS、HeLa及CHO細胞。亦參見PCT公開案第WO 87/04462號。適合之非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸埃希氏菌(E.coli)或枯草芽孢桿菌(B.subtillis))及酵母(諸如芽生酵母(S.cerevisae)、分裂酵母(S.pombe)；或乳酸克魯維酵母(K.lactis))。較佳該等宿主細胞以比宿主細胞中相應內源抗體或相關蛋白質(若存在)之含量高約5倍、更佳高10倍、尤佳高20倍之含量來表現cDNA。篩選特異性結合至Aβ_{1 － 4 0} 之宿主細胞受到免疫檢定或FACS之影響。可鑒別過度表現相關抗體或蛋白質之細胞。

具有削弱之效應功能的源自6G之抗體及抗Aβ抗體之診斷用途可將結合至Aβ之C－末端之抗體6G用於鑒別或偵測Aβ之存在與否。簡言之，將一般對6G或抗體之引用理解為此等方法應用至本文所述之任何Aβ結合實施例(諸如多肽)。偵測一般涉及使生物樣品與本文所述結合至Aβ之抗體接觸及在Aβ與特異性結合至Aβ之抗體(例如6G)之間形成複合物。此複合物之形成可在活體外或在活體內。如本文所用，術語"偵測"包括在引用或不引用對照之情況下定性及/或定量偵測(量測含量)。

可將多種已知方法之任一者用於偵測，該等方法包括(但不限於)免疫檢定、使用結合多肽之抗體，舉例而言，藉由酶聯結免疫吸附分析法(ELISA)、放射性免疫檢定(RIA)及其類似方法；及對經編碼之多肽的功能檢定，例如結合活性或酶檢定。在一些實施例中，該抗體經可偵測地標記。其他實施例係此項技術中已知且在本文中描述之。

可將本發明之抗體及多肽用於偵測、診斷及監控與經改變或異常之Aβ或βAPP表現相關之疾病、病症或失調症，諸如阿茲海默氏症及唐氏綜合症。因此，在一些實施例中，本發明提供包含使懷疑具有經變更或異常之Aβ或βAPP表現的個體之樣本(樣品)與本發明之抗體或多肽接觸且判定Aβ之含量是否與對照組或比較樣本之含量不同的方法。在其他實施例中，本發明提供包含接觸個體之樣本(樣品)且判定Aβ表現之含量的方法。

對於診斷應用而言，可用可偵測部分來標記該抗體，該可偵測部分包括但不限於放射性同位素、螢光標記物及各種酶基質標記物。使標記物與抗體共軛之方法係在此項技術中已知。在本發明之其他實施例中，不必標記本發明之抗體，且可使用結合至本發明之抗體之經標記抗體來偵測其存在。

可在任何已知檢定方法中採用本發明之抗體，該等檢定方法係諸如競爭性結合檢定、直接或間接夾層檢定及免疫沈澱檢定(Zola,Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques，第147－158頁(CRC Press,Inc.1987))。

亦可將該等抗體用於活體內診斷檢定，諸如活體內成像。大體而言，以放射性核素(諸如^{1 1 1} In、^{9 9} Tc、^{1 4} C、^{1 3 1} I、^{1 2 5} I或³ H)標記該抗體以便可使用免疫閃爍法將相關細胞或組織局限化。

亦可遵循此項技術中熟知之技術將該抗體用作病變中之染色劑。

可將具有削弱效應功能之抗Aβ抗體用於量測腦部澱粉樣蛋白負荷以便診斷受檢者患上AD之風險或診斷其患有AD、且評估任何治療及疾病階段之進程。已報導單株抗Aβ抗體之外周投藥導致血漿Aβ之快速增加且此增加之幅度與海馬狀突起及皮質中澱粉樣蛋白負荷高度相關(DeMattoS等人，Science 295：2264－2267(2002))。在一些實施例中，向受檢者投與具有削弱之效應功能之抗Aβ抗體，且量測血漿中Aβ之含量，藉以血漿Aβ之增加指示受檢者中腦部澱粉樣蛋白負荷之存在及/或含量。可將此等方法用於監控治療之有效性及疾病階段及判定進一步給藥及頻率。具有削弱之效應功能之抗體可具有良好之安全概況且對此等診斷用途提供優勢。

出於治療目的使用抗Aβ抗體之方法可將本文所述之抗體(包括多肽)、聚核苷酸及醫藥組合物用於治療、預防及抑制阿茲海默氏症及其它與經改變之Aβ或βAPP表現、或Aβ肽之積聚或沈積相關之疾病(共同稱為"與Aβ相關之疾病")(諸如唐氏綜合症、帕金森氏症、多發性梗死性癡呆、輕度認知損害、大腦澱粉樣蛋白血管病、藉由Aβ肽在血管中之沈積導致之脈管症(諸如中風及HCHWA－D)、抑鬱、庫賈氏病及具有路易體之癡呆)之發展的方法中。此等方法包含向該受檢者投與抗體、多肽、或聚核苷酸或醫藥組合物。在預防性應用中，係將足以消除或降低風險、減輕嚴重性、或延遲疾病發作(包括該疾病之生物化學、組織學及/或行為症狀、在疾病發展期間存在之其並發症及中間病理表型)之量之醫藥組合物或藥劑投予易感阿茲海默氏症(或其他與Aβ相關之疾病)或其他處於罹患該病風險之患者。在治療性應用中，係將足以治癒或至少部分抑制疾病之症狀(生物化學、組織學及/或行為症狀)(包括在疾病發展中之其並發症及中間病理表型)之量之組合物或藥劑投予易感或已罹患此疾病之患者。

本發明亦提供延緩受檢者發展與阿茲海默氏症(或其他與Aβ相關之疾病)相關症狀之方法，該方法包含向該受檢者投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。與阿茲海默氏症相關之症狀包括但不限於記憶、解決問題、語言、計算、視覺空間感知、判斷及行為之異常。

本發明亦提供抑制或抑止受檢者形成澱粉樣蛋白斑塊及/或Aβ積聚之方法，該方法包含向該受檢者投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在該受檢者之腦中。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在該受檢者之大腦脈管系統中。在其他實施例中，該Aβ積聚係在該受檢者之循環系統中。

本發明亦提供降低受檢者中之澱粉樣蛋白斑塊及/或減少或減緩Aβ積聚之方法，該方法包含向該受檢者投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在該受檢者之腦中。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在該受檢者之大腦脈管系統中。在其他實施例中，該Aβ積聚係在該受檢者之循環系統中。

本發明亦提供移除或清除受檢者中澱粉樣蛋白斑塊及/或Aβ積聚之方法，該方法包含向該受檢者投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在該受檢者之腦中。在一些實施例中，該等澱粉樣蛋白斑塊係在該受檢者之大腦脈管系統中。在其他實施例中，該Aβ積聚係在該受檢者之循環系統中。

本發明亦提供降低受檢者組織(諸如腦部)中之Aβ肽、抑制及/或降低組織(諸如腦部)中Aβ肽之積聚、及抑制及/或降低組織(諸如腦部)中Aβ肽之毒性效應的方法，該方法包含向該受檢者投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。Aβ多肽可以可溶、寡聚或沈積形式存在。Aβ之寡聚形式可包含2－50個Aβ多肽，其可為全長1－40及1－42肽及/或此等肽之任何截短型式的混合物。

本發明亦提供改良認知或逆轉與受檢者中Aβ之澱粉樣蛋白沈積相關之疾病(諸如阿茲海默氏症)有關的認知衰退的方法，該方法包含向該受檢者投與有效劑量之包含本文所述之抗體、多肽或聚核苷酸之醫藥組合物。

可藉由在單一時間點或多個時間點向單一位點或多個位點單一直接注射來完成本文所述之方法(包括預防或治療)。亦可近乎同時投藥至多個位點。可經治療之進程且基於完成之所要結果來判定及調節投藥之頻率。在一些狀況中，本發明之抗體(包括多肽)、聚核苷酸及醫藥組合物之持續連續釋放調配物係適合的。達成持續釋放之各種調配物及設備係在此項技術中已知。

患者、受檢者或個體包括哺乳動物，諸如人類、牛、馬、犬、貓、豬及綿羊類動物。該受檢者較佳為人類，且可罹患或不罹患疾病或於當前顯示症狀。在阿茲海默氏症之狀況中，若他或她活得足夠長，則事實上任何人係處於患上阿茲海默氏症之風險中。因此，可將本方法預防性投與至一般人群而無需對任何受檢患者之風險進行評估。本發明方法可適用于確實具有阿茲海默氏症之已知遺傳風險的個體中。此等個體包括彼等具有有此疾病經歷之親屬者、及彼等由遺傳及生物化學標記物判定其風險者。對於阿茲海默氏症之風險之遺傳標記物包括在APP基因中之突變，尤其是在位置717及位置670及671處之突變，將其分別稱為Hardy及瑞典(Swedish)突變(參見Hardy(1997)Trends Neurosci.20：154－9)。風險之其他標記物為早老蛋白基因中之突變PS1及PS2、及ApoE4、AD、高膽固醇血症或動脈硬化症之家族史。當前患有阿茲海默氏症之個體可自特徵性癡呆、以及上述風險因數之存在而得到識別。另外，可將衆多診斷測試用於鑒別具有AD之個體。此等包括CSF τ及Aβ42含量之量測。升高之τ及降低之Aβ42含量表示AD之存在。亦可藉由ADRDA(阿茲海默氏症及相關病症協會)標準來診斷患有阿茲海默氏症之個體。在無症狀患者中，可在任何年齡(例如，10、20、30)開始治療。然而，常常不必開始治療直至患者達到40、50、60或70。治療通常要求經一時間階段之多個劑量。可藉由此項技術中已知之各種方式隨著時間來監控治療。在潛在唐氏綜合症患者之狀況中，可藉由向母親投與治療劑開始產前治療或在出生之後不久開始治療。

可用於以上方法中之醫藥組合物包括任何本文所述之抗體、多肽及/或聚核苷酸。在一些實施例中，抗體為表3中所示之抗體6G或其變異體。在一些實施例中，該抗體為特異性結合至Aβ肽之抗體且包含具有削弱之效應功能之恒定區。

投藥及劑量

較佳將該抗體於載劑中投與哺乳動物；該載劑較佳為醫藥學上可接受之載劑。在Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro編，Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing,2000中描述適合之載劑及其調配物。通常將適當量之醫藥學上可接受之鹽用於該調配物中以使調配物等滲。載劑之實例包括鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。該溶液之pH值較佳為約5至約8，且更佳為約7至約7.5。另外之載劑包括持續釋放之製劑諸如含有該抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質以成形物品之形式存在，該等形式係例如，膜、脂質體或微粒。彼等熟習此項技術者應瞭解視(例如)投藥路線及待投藥之抗體濃度而定，某些載劑可更佳。

可藉由注射(例如，全身性、靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、門靜脈內(intraportal)、大腦內、腦室內及鼻內)或藉由其他方法(諸如輸注，該方法確保其以有效形式傳遞至血流中)將抗體投與哺乳動物。亦可藉由分離之輸注技術(諸如分離之組織輸注)來投與抗體以發揮局部治療效應。較佳為靜脈內注射。

可自經驗上判定投與該抗體之有效劑量及時程，且使此等判定在此項技術之技巧內。彼等熟習此項技術者將瞭解必需投與之抗體之劑量將視(例如)將接受該抗體之哺乳動物、投藥路線、所用抗體之特定類型及待投藥至該哺乳動物之其他藥物而變化。選擇抗體之適當劑量的指導係發現於抗體之治療用途的文獻中，例如，Handbook of Monoclonal Antibodies,Ferrone等人編，Noges Publications,Park Ridge,N.J.,1985，第22章及第303－357頁；Smith等人，Antibodies in Human Diagnosis and Therapy,Haber等人編，Raven Press,New York,1977，第365－389頁。單獨使用之抗體之一般每天劑量可視以上提及之因素而定在每天約1 μg/kg至高達100 mg/kg體重或更多之範圍內。大體而言，可使用任何以下劑量：投與至少約50 mg/kg體重；至少約10 mg/kg體重；至少約3 mg/kg體重；至少約1 mg/kg體重；至少約750 μg/kg體重；至少約500 μg/kg體重；至少約250 μg/kg體重；至少約100 μg/kg體重；至少約50 μg/kg體重；至少約10 μg/kg體重；至少約1 μg/kg體重、或更多劑量。在開始治療時可以較低劑量或較小頻率來投與抗體以避免潛在之副作用，諸如臨時性大腦澱粉樣蛋白血管病(CAA)。

在一些實施例中，可存在多於一種抗體。此等組合物可含有至少一種、至少二種、至少三種、至少四種、至少五種不同之本發明之抗體(包括多肽)。

亦可將該抗體與有效量之一或多種其他治療劑組合投與該哺乳動物。可將該抗體與該一或多種其他治療劑連續或同時投藥。抗體及治療劑之量視(例如)使用何種類型之藥物、待治療之病理病症、及投藥之時程及路線而定但大體上將小於若各自個別使用情況下之量。

在向哺乳動物投與抗體之後，可以熟練從業者熟知之各種方式來監控該哺乳動物之病理病症。

投藥及劑量之以上原理可適合本文所述之多肽。

亦可將編碼本文所述之抗體或多肽之聚核苷酸用於在所要細胞中傳遞及表現該抗體或該多肽。顯然可將表現載體用於指導該抗體之表現。可全身性、腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、鞘內、心室內、經口、經腸、非經腸、鼻內、經皮或藉由吸入來投與該表現載體。舉例而言，表現載體之投與包括局部或全身性投藥，包括注射、經口投藥、粒子槍(particle gun)或導管插入式投藥及局部投藥。熟習此項技術者熟悉表現載體之投與以獲得外源蛋白質在活體中之表現。參見，例如，美國專利第6,436,908號；第6,413,942號；及第6,376,471號。

亦可使用包含編碼本發明之抗體之聚核苷酸的治療組合物之靶向傳遞。舉例而言，在Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993)11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer(J.A.Wolff編)(1994)；Wu等人，J.Biol Chem.(1988)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994)269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1990)87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991)266：338中描述經受體調節之DNA傳遞技術。對於基因療法協定中之局部投藥而言，以約100 ng至約200 mg之DNA之範圍投與含有聚核苷酸之治療組合物。在基因療法協定期間亦可使用約500 ng至約50 mg、約1 μg至約2 mg、約5 μg至約500 μg、及約20 μg至約100 μg之DNA之濃度範圍。可使用基因傳遞媒劑來傳遞本發明之治療性聚核苷酸及多肽。該基因傳遞媒劑可為病毒或非病毒源媒劑(一般參見：Cancer Gene Therapy(1994)1：51；Kimura,Human Gene Therapy(1994)5：845；Connelly,Human Gene Therapy(1995)1：185；及Kaplitt,Nature Genetics(1994)6：148)。可使用內源哺乳動物或異源啟動子來誘導此等密碼序列之表現。密碼序列之表現可為組成性或經調節的。

用於所要聚核苷酸之傳遞及所要細胞中之表現的基於病毒之載體在此項技術中為吾人所熟知。例示性基於病毒之媒劑包括但不限於重組逆轉錄酶病毒(參見，例如，PCT公開案第WO 90/07936號；第WO 94/03622號；第WO 93/25698號；第WO 93/25234號；第WO 93/11230號；第WO 93/10218號；第WO 91/02805號；美國專利第5,219,740號；第4,777,127號；英國專利第2,200,651號；及EP 0 345 242)、基於α病毒之載體(例如，Sindbis病毒載體、Semliki森林病毒(ATCC VR－67；ATCC VR－1247)、羅斯河病毒(ATCC VR－373；ATCC VR－1246)及委內瑞拉馬腦炎病毒(ATCC VR－923；ATCC VR－1250；ATCC VR1249；ATCC VR－532))、及與腺相關之病毒(AAV)載體(參見，例如，PCT公開案第WO 94/12649號、第WO 93/03769號；第WO 93/19191號；第WO 94/28938號；第WO 95/11984號及第WO 95/00655號號)。亦可採用如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3：147中所述與殺死之腺病毒連接之DNA之投藥。

亦可採用非病毒傳遞媒劑及方法，包括但不限於單獨連接或未連接至殺死之腺病毒的聚陽離子縮合之DNA(參見，例如Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3：147)；配位體連接之DNA(參見，例如，Wu,J.Biol.Chem.(1989)264：16985)；真核細胞傳遞媒劑細胞(參見，例如，美國專利第5,814,482號；PCT公開案第WO 95/07994；第WO 96/17072號；第WO 95/30763號；及第WO 97/42338號)及核電荷中和或與細胞膜之融合。亦可採用裸露DNA。在PCT公開案第WO 90/11092號及美國專利第5,580,859號中描述例示性裸露DNA導入方法。在美國專利第5,422,120號；PCT公開案第WO 95/13796號；第WO 94/23697號；第WO 91/14445號；及EP 0 524 968中描述可擔當基因傳遞媒劑之脂質體。在Philip,Mol.Cell Biol.(1994)14：2411且在Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91：1581中描述另外之途徑。

套組

本發明亦提供含有適用于治療諸如阿茲海默氏症及其它與Aβ相關之疾病(諸如唐氏綜合症、帕金森氏症、多發性梗死性癡呆、輕度認知損害、大腦澱粉樣蛋白血管病、藉由Aβ肽在血管中之沈積導致之脈管失調症(諸如中風及HCHWA－D))之病理病症、或偵測或純化Aβ或βAPP之材料的製造物品及套組。該製造物品包含具有卷標之容器。適合之容器包括(例如)瓶、小瓶及試管。該等容器可自多種材料諸如玻璃或塑膠形成。該容器保存具有有效於治療病理病症或有效偵測或純化Aβ或βAPP的活性劑之組合物。該組合物中之活性劑為一抗體且較佳包含對Aβ或βAPP有特異性之單株抗體。在一些實施例中，該活性劑包含抗體6G或源自抗體6G之任何抗體或多肽。在一些實施例中，該活性劑包含具有削弱之效應功能的本文所述之抗Aβ抗體或多肽。在一些實施例中，該抗Aβ抗體或多肽包含一重鏈恒定區，其中該恒定區具有削弱之效應功能。在該容器上之卷標指示該組合物係用於治療諸如阿茲海默氏症之病理病症或偵測或純化Aβ或βAPP，且亦可指示對活體內或活體外用途之指導，諸如彼等以上所述者。

本發明亦提供包含任何本文所述之抗體(諸如6G)、多肽、聚核苷酸之套組。在一些實施例中，本發明之套組包含前述容器。在其他實施例中，本發明之套組包含前述容器及包含緩衝液之第二容器。其可進一步包括由商業及用戶立場所需要之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、篩檢程式、針、注射器及具有執行本文所述之任何方法(諸如治療阿茲海默氏症之方法、及抑制或降低腦部中Aβ肽之積聚的方法)之說明的包裝說明書。在待用於偵測或純化Aβ或βAPP之套組中，通常以可偵測之標記物來標記該抗體，該等標記物係諸如(例如)放射性同位素、螢光化合物、生物發光化合物、化學發光化合物、金屬螯合劑或酶。

在一些實施例中，本發明提供用於任何本文所述之方法中的組合物(本文所述)，無論是在用作藥劑及/或用於藥劑之製造的背景中。

提供以下實例以說明但非限制本發明。

實例 實例1.抗體6G及其變異體之結合親和力判定 A.一般方法

在此實例及其它實例中使用以下一般方法。

在純系表徵中所用之表現載體 抗體之Fab片段之表現係在類似於Barbas(2001)Phage display：a laboratory manual,Cold Spring Harbor,NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2.10.頁載體pComb3X中所述之彼者的IPTG可誘導之lacZ啟動子的控制下，然而，修飾包括以下額外域之添加及表現：人類輕鏈恒定域及IgG2a人類免疫球蛋白之CHI恒定域、Ig γ－2鏈C區、蛋白質入藏登記號P01859；免疫球蛋白輕鏈(智人)、蛋白質入藏登記號CAA09181。

小規模Fab製備 如下在96孔板中進行Fab之小規模表現。自以Fab文庫轉型之大腸埃希氏菌起始，採集菌落以對主板(瓊脂LB＋安匹西林(50 μg/ml)＋2%葡萄糖)及工作板(2毫升/孔，96孔/板，含有1.5 mL之LB＋安匹西林(50 μg/ml)＋2%葡萄糖)兩者進行接種。使兩板皆在30℃下生長8－12小時。在4℃下儲存該主板且在5000 rpm下將該工作板粒化且以1 mL之LB＋安匹西林(50 μg/ml)＋1 mM IPTG再懸浮以誘導Fab之表現。在30℃下歷經5 h之表現時間後藉由離心來收集細胞，隨後將其再懸浮於500 μL之緩衝HBS－EP(100 mM HEPES緩衝液pH 7.4、150 mM NaCl、0.005% P20)中。藉由冷凍(－80℃)隨後在37℃下解凍之迴圈獲得經HBS－EP再懸浮之細胞之溶解。在5000 rpm下將細胞溶胞物離心30 min以自含有Fab之上清液分離細胞碎片。隨後將上清液注射至BIAcore電漿共振裝置中以獲得各Fab之親和力資訊。自主板營救表現Fab之純系以對DNA定序及進行如下所述之大規模Fab生產及詳細表徵。

大規模Fab製備 為獲得詳細的動力學參數，自大培養物表現及純化Fab。將含有200 mL之LB＋安匹西林(50 μg/ml)＋2%葡萄糖之錐形瓶以5 mL來自所選擇之表現Fab的大腸埃希氏菌純系之隔夜培養物來接種。在30℃下培養純系直至達到1.0之OD_{5 5 0 n m} ，且接著藉由將培養基替代成200 ml之LB＋安匹西林(50 μg/ml)＋1 mM IPTG來誘導之。在30℃下歷經5 h之表現時間後，藉由離心來粒化細胞，隨後將其再懸浮於10 mL PBS(pH 8)中。藉由兩次冷凍/解凍(分別在－80℃及37℃下)迴圈獲得細胞之溶解。將細胞溶胞物之上清液載入以PBS(pH 8)平衡之Ni－NTA超流瓊脂糖(Qiagen,Valencia.CA)管柱上，隨後以5管柱體積之PBS(pH 8)來洗滌之。個別Fab係於具有PBS(pH 8)＋300 mM咪唑(Imidazol)之不同溶離份中洗提。在PBS中彙聚及透析(dialized)含有Fab之溶離份，隨後在親和力表徵之前藉由ELISA將其量化。

全抗體製備 對於全抗體之表現而言，在哺乳動物表現載體中選殖重鏈及輕鏈可變區且使用陽離子脂質體(lipofectamine)將其轉染至HEK 293細胞中以便暫態表現。使用標準方法使用蛋白質A純化抗體。

載體pDb.6G.hFc2a為包含6G抗體之重鏈的表現載體，且適用於該重鏈之暫態或穩定表現。載體pDb.6G.hFc2a具有對應於以下區域之核苷酸序列：鼠科細胞巨大病毒啟動子區(核苷酸1－612)；合成內含子(核苷酸619－1507)；DHFR密碼區(核苷酸707－1267)；人類生長激素訊號肽(核苷酸1525－1602)；6G之重鏈可變區；含有以下突變之人類重鏈IgG2a恒定區：A330P331至S330S331(關於野生型IgG2a序列進行胺基酸編號；參見Eur.J.Immunol.(1999)29：2613－2624)；SV40後聚腺苷化訊號；SV40強化子區；噬菌體f1區及β內醯胺酶(AmpR)密碼區。

載體pEb.6G.hK為包含6G抗體之輕鏈的表現載體，且適用於輕鏈之暫態表現。載體pEb.6G.hK具有對應於以下區域之核苷酸序列：鼠科細胞巨大病毒啟動子區(核苷酸1－612)；人類EF－1內含子(核苷酸619－1142)；人類生長激素訊號肽(核苷酸1173－1150)；抗體6G輕鏈可變區；人類鏈恒定區；SV40後聚腺苷化訊號；SV40強化子區；噬菌體f1區及β內醯胺酶(AmpR)密碼區。

Biacore檢定 使用BIAcore3000^{T M} 表面電漿共振(SPR)系統(BIAcore,INC,Piscaway NJ)來判定6G單株抗體之親和力。一種判定親和力之方式為將6G固定在CM5晶片上且量測Aβ_{1 － 4 0} 肽或其他Aβ肽至抗體之結合動力學。根據供應者之使用說明以N－乙基－N'－(3－二甲胺基丙基)－碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化CM5晶片。將抗體6G或其變異體稀釋至10 mM乙酸鈉pH 4.0或5.0中且以0.005 mg/mL之濃度經活化之晶片來注射。使用通過個別晶片通道之可變流動時間，達成抗體密度之一範圍：1000－2000或2000－3000回應單位(RU)。以乙醇胺阻斷該晶片。再生研究顯示含有2體積之PIERCE溶離緩衝液及1體積之4 M NaCl之溶液有效移除所結合之Aβ肽同時在晶片上保持6G之活性歷經200次注射。將HBS－EP緩衝液(0.01 M HEPES(pH 7.4)、0.15 NaCl、3 mM EDTA、0.005%介面活性劑P20)用作所有BIAcore檢定之運行緩衝液。以100 μL/min歷時1 min注射經純化之Aβ_{1 － 4 0} 合成肽或其他Aβ肽樣品之連續稀釋液(0.1－10x估計之K_D )且允許10 min之解離時間。藉由使用BIA評價程式將資料擬合至1：1 Langmuir結合模型同時獲得動力學締合速率(k_{o n} )及解離速率(k_{o f f} )(KarlsSon,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99－110)。將平衡解離常數(K_D )值計算為k_{o f f} /k_{o n} 。

或者，藉由在SA晶片上固定Aβ_{1 － 4 0} 肽或其他Aβ肽及量測6G Fab及6G變異體之Fab至經固定之Aβ肽之結合動力學來判定結合親和力。藉由表面電漿共振(SPR)系統(BIAcore 3000^{T M} ,BIAcore,Inc.,Piscaway,NJ)判定6G Fab片段及其變異體Fab片段之親和力。根據供應者之使用說明使用SA晶片(抗生蛋白鏈菌素)。將生物素化之Aβ肽稀釋至HBS－EP(100 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.005% P20)中且以0.005 mg/mL之濃度經晶片注射。使用可變之跨過個別晶片通道之流動時間，達成抗原密度之兩個範圍：對詳細之動力學研究而言為100－400回應單位(RU)且對於濃度研究及篩選而言為500－2000 RU。再生研究顯示100 mM磷酸(繼之亦可為含有2體積之50 mM NaOH及1體積之70%乙醇之溶液)有效移除所結合之Fab同時在晶片上保持Aβ肽之活性歷時超過200次注射。將HBS－EP緩衝液用作所有BIAcore檢定之運行緩衝液。以100 μL/min歷時2 min注射經純化之Fab樣品之連續稀釋液(0.1－10x估計之KD)且允許10 min之解離時間。藉由ELISA及/或SDS－PAGE電泳使用已知濃度之標準Fab(藉由胺基酸分析來判定)來判定Fab蛋白質之濃度。藉由使用BIA評價程式將資料擬合至1：1 Langmuir結合模型同時獲得動力學締合速率(k_{o n} )及解離速率(k_{o f f} )(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).Methods Enzymology 6.99－110)。將平衡解離常數(K_D )值計算為k_{o f f} /k_{o n} 。

ELISA檢定 將ELISA用於量測抗體6G及變異體至未經生物素化之Aβ肽之結合。在4℃下以PBS pH 7.4中之2.5 μg/ml之Aβ肽塗覆NUNC maxisorp板歷時超過1小時。以PBS緩衝液pH 7.4中之1% BSA阻斷該等板。在室溫下以經固定之Aβ肽培養一次抗體(來自細胞上清液、含有抗Aβ抗體之血清、或在所要稀釋液中之經純化之全抗體或Fab)歷時1 h。在洗滌之後，以二次抗體培養該等板，該二次抗體為在1：5000稀釋液中經HRP共軛之山羊抗人類鏈抗體(MP Biomedicals,55233)。在洗滌之後，藉由添加TMB基質(KPL,50－76－02,50－65－02)來量測經結合之二次抗體。藉由添加1M磷酸使HRP反應終止且量測在450 nm處之吸光率。

將ELISA用於量測抗體6G及變異體至經生物素化之Aβ肽之結合。在4℃下以PBS pH 7.4中之6 μg/ml之抗生蛋白鏈菌素(Pierce,21122)塗覆NUNC maxisorp板歷時超過1小時。以PBS緩衝液pH 7.4中之1% BSA阻斷該等板。在洗滌之後，在室溫下培養PBS pH 7.4中之經生物素化之Aβ肽1小時。在室溫下以經固定之Aβ肽培養一次抗體(來自細胞上清液、含有抗Aβ抗體之血清、或在所要稀釋液中之經純化之全抗體或Fab)歷時1 h。在洗滌之後，以二次抗體培養該等板，該二次抗體為在1：5000稀釋液中經HRP共軛之山羊抗人類鏈抗體(MP Biomedicals,55233)。在洗滌之後，藉由添加TMB基質(KPL,50－76－02,50－65－02)來量測經結合之二次抗體。藉由添加1M磷酸使HRP反應終止且量測在450 nm處之吸光率。

B.抗體6G及變異體至Aβ_{1 － 4 0} 、Aβ_{1 － 4 2} 及其它Aβ肽之結合親和力

圖1中顯示抗體6G之重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列。下表2中顯示使用上述Biacore所判定之6G抗體至Aβ_{1 － 4 0} 、Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{2 2 － 3 7} 之結合親和力。

下表3中顯示6G之變異體之胺基酸序列。表3中所示之變異體之所有胺基酸取代係相對於6G之序列而描述。表3中亦顯示6G變異體之相對結合。藉由前述ELISA以固定在ELISA板表面上未經生物素化之Aβ_{1 － 4 0} 或Aβ_{1 － 4 2} 來判定結合。

實例2：抗體6G結合之Aβ肽上之抗原決定基之表徵

為判定由抗體6G識別之Aβ肽上之抗原決定基，使用ELISA結合分析。將各種Aβ肽(Global Peptide Services,CO)固定在ELISA板上。藉由如前述之ELISA判定6G全抗體(濃度為20 nM)至經固定之Aβ之結合。下表5中顯示Aβ_{1 － 4 0} 、Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} 之胺基酸序列。如圖2中所示，抗體6G結合至Aβ肽17－40、17－42、22－35、28－40、1－38、1－40、1－42、1－43及28－42；但與28－42之結合遠弱於與其他Aβ肽之結合。抗體6G並不結合至Aβ肽1－16、1－28及33－40。因此，抗體6G結合至各種截短Aβ肽之C－末端，例如，22－35、1－38、1－40、1－42及1－43。

下表4顯示如藉由使用Biacore檢定所得之k_{o f f} (l/s)量測的6G至Aβ_{1 － 4 0} 與6G至其他Aβ肽之結合親和力的比較。與其他肽相比，抗體6G以最高親和力結合至Aβ_{1 － 4 0} ，以顯著較低之親和力結合至截短之Aβ_{1 － 4 0} (諸如1－36、1－37、1－38及1－39)、Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} 。此指出Aβ之胺基酸40(纈胺酸)之側鏈或骨架涉及6G至Aβ_{1 － 4 0} 之結合；且該結合在此胺基酸之不存在下顯著降低(例如，損失親和力自約10至約50－250倍)。以較低親和力至羧基末端之醯胺化Aβ_{1 － 4 0} 之結合指出6G至Aβ_{1 － 4 0} 之結合涉及但不依賴於Aβ_{1 － 4 0} 之游離C－末端。與Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} 之較低親和力結合可歸因於Aβ_{1 － 4 0} 與Aβ_{1 － 4 2} 或Aβ_{1 － 4 3} 之單體形式之間的構形差異。已顯示Aβ_{1 － 4 2} 之單體具有與溶液中之Aβ_{1 － 4 0} 單體不同之構形。參見，蛋白質資料庫(Protein Data Bank)(pdb文件)中以入藏登記號1IYT所示的Aβ_{1 － 4 2} 之單體結構座標(coordinate)；及蛋白質資料庫(pdb文件)中以入藏登記號1BA6及1BA4所示的Aβ_{1 － 4 0} 之單體結構座標。

肽作為分析物流動至具有藉由胺化學所固定之6G單株抗體(配位體)的CM5晶片上#具有醯胺化之羧基－末端之肽

藉由ELISA檢定執行抗體6G之抗原決定基定位。將經生物素化之15－mer或10－mer之各種Aβ肽(此等肽具有添加至C－末端之甘胺酸)固定在經抗生蛋白鏈菌素塗覆之板上。以經固定之肽培養抗體6G(自2.5 μg/ml至10 μg/ml)且如前述來量測結合。如圖3中所示，抗體6G以在C－末端具有甘胺酸之胺基酸20－34、21－35、22－36、23－37、24－38、25－39及25－34結合至Aβ肽；但並不以在此等肽之C－末端處具有甘胺酸的胺基酸19－33、26－40、27－41、24－33及26－35結合至Aβ肽。此提示抗體6G結合之抗原決定基包括自25至34之胺基酸。

基於上示資料，抗體6G結合之抗原決定基似乎包括胺基酸25－34及40。圖4為顯示抗體6G之抗原決定基之示意圖。

B.抗體6G不結合至APP

為判定6G是否結合至澱粉樣蛋白前驅體蛋白質(APP)，判定6G與以野生型APP轉染之細胞的結合。以編碼野生型人類澱粉樣蛋白前驅體蛋白質之cDNA轉染HEK293細胞。在轉染之後四十八小時，以單株抗體抗Aβ_{1 － 1 6} 、(m2324)或6G(在具有10% FCS之DMEM中5 μg/ml)在冰上培養細胞歷時45分鐘。隨後在PBS中洗滌該等細胞三次歷時5分鐘，以4% PFA固定之。再次在PBS中洗滌該等細胞三次，且在螢光顯微鏡下以來自Jackson Immunoresearch之二次Cy3共軛之山羊抗小鼠抗體(1：500之稀釋液)偵測抗體結合。

如圖5中所示，識別Aβ中之N－末端抗原決定基之抗Aβ_{1 － 1 6} 抗體顯示與在細胞上表現之APP前驅體蛋白質的顯著結合。相反，6G並不結合至表現APP之細胞。

實例3.在抗體2294結合之Aβ肽上之抗原決定基之表徵

抗體2294為藉由用Aβ_{1 － 4 0} 對小鼠免疫化募集之鼠科抗體。US 2004/0146512及WO 04/032868中描述此抗體。

如上述使用Biacore來量測抗體2294與Aβ_{1 － 4 0} 、Aβ_{1 － 4 2} 或Aβ_{2 2 － 3 7} 之結合親和力。下表6中顯示抗體2294 Fab片段與各種Aβ肽之結合親和力。

藉由ELISA檢定執行抗體2294之抗原決定基定位。將經生物素化之15－mer或10－mer之各種Aβ肽(此等肽具有添加至C－末端之甘胺酸)固定在經抗生蛋白鏈菌素塗覆之板上。在4℃下以PBS pH 7.4中之6 μg/ml之抗生蛋白鏈菌素(Pierce,21122)塗覆NUNC maxisorp板歷時超過1小時。以PBS緩衝液pH 7.4中之1% BSA阻斷該等板。在洗滌之後，在室溫下培養PBS pH 7.4中之經生物素化之Aβ肽1小時。在室溫下以經固定之Aβ肽培養抗體2294(自2.5 μg/ml至10 μg/ml)歷時1 h。在洗滌之後，以二次抗體培養該等板，該二次抗體為在1：5000稀釋液中經HRP共軛之山羊抗人類鏈抗體(MP Biomedicals,55233)。在洗滌之後，藉由添加TMB基質(KPL,50－76－02,50－65－02)來量測經結合之二次抗體。藉由添加1M磷酸使HRP反應終止且量測在450 nm處之吸光率。如圖6中所示，抗體2294以在C－末端具有甘胺酸之胺基酸20－34、21－35、22－36、23－37、24－38、25－39、26－40及25－34結合至Aβ肽；但並不以在此等肽之C－末端處具有甘胺酸的胺基酸19－33、27－41、24－33及27－35結合至Aβ肽。此提示抗體2294結合之抗原決定基包括自26至34之胺基酸。

為進一步判定由抗體2294識別之Aβ肽上之抗原決定基，使用ELISA結合分析。將各種Aβ肽(Global Peptide Services,CO)固定在ELISA板上。如前所述藉由ELISA判定2294全抗體(濃度為20 nM)與經固定之Aβ之結合。抗體2294結合至Aβ肽17－40、17－42、28－40、1－38、1－40、1－42及1－43。抗體2294並不結合至Aβ肽1－16、1－28、28－42、22－35及33－40。因此，抗體2294結合至各種截短Aβ肽之C－末端，例如，1－38、1－40、1－42及1－43。

下表7中顯示如藉由Biacore檢定量測之2294至Aβ_{1 － 4 0} 與2294至其他Aβ肽之結合比較。與其他肽相比，抗體2294(全抗體)具有與Aβ_{1 － 4 0} 之最強結合，具有與截短Aβ_{1 － 4 0} (諸如1－36、1－37、1－38及1－39)、Aβ_{1 － 4 2} 及Aβ_{1 － 4 3} 顯著較弱之結合。此指示Aβ之胺基酸40(纈胺酸)之側鏈或骨架涉及2294與Aβ_{1 － 4 0} 之結合；且該結合在此胺基酸之不存在下顯著降低。

"－"指示無結合；"＋"指示極低之結合；"＋＋"指示中等結合；"＋＋＋"指示強結合；且"＋＋＋＋"指示極強之結合。

基於前示資料，抗體2294結合之抗原決定基似乎包括胺基酸26－34及40。抗體2294結合至極類似於圖6中所示之抗體6G之抗原決定基。然而，抗體6G之結合比抗體2294更少依賴於胺基酸40。

執行使用Biacore檢定在2294、6G、2H6及2289之間的抗體結合競爭實驗。抗體2H6為結合至Aβ_{3 3 － 4 0} 之抗體且描述於2005年2月14日申請之美國臨時申請案60/653,197中。抗體2289為結合至Aβ_{1 6 － 2 8} 之抗體且描述於美國公開案第2004/0146512號及PCT WO 04.032868中。使用Biacore檢定執行競爭實驗。將抗體2294、6G、2H6及2289固定在CM5晶片之不同通道上。根據供應商之使用說明以N－乙基－N'－(3－二甲胺基丙基)－碳化二醯亞胺鹽酸鹽(EDC)及N－羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化CM5晶片通道。將抗體2294、6G、2H6及2289各自稀釋至10 mM乙酸鈉pH 4.0中且以0.005 mg/mL之濃度經活化之晶片注射之。以乙醇胺阻斷各通道。使Aβ_{1 － 4 0} 肽(150 μM)流動至該晶片上歷時2 min。隨後將濃度為0.6 μM之抗體2294(結合競爭的待測試之樣品)流動至該晶片上歷時1 min。將HBS－EP緩衝液(0.01 M HEPES(pH 7.4)、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%介面活性劑P20)用作所有BIAcore檢定之運行緩衝液。在量測Aβ_{1 － 4 0} 之結合之後，藉由用Pierce溶離緩衝液(產品號21004，Pierce Biotechnology,Rockford,IL)及4 M NaCl(2：1)之混合物歷時6秒洗滌兩次來再生該晶片之所有通道。隨後對抗體6G、2H6，接著對抗體2289執行競爭結合。觀察到在2294與6G之間及2294及2H6之間對結合至Aβ_{1 － 4 0} 的的競爭，但未觀察到在2294與2289之間或在6G與2289之間的競爭。將在經固定之抗體與流動至該晶片之上的相同抗體之間的競爭之觀察擔當陽性對照。資料指示抗體2294與2H6及6G對結合至Aβ_{1 － 4 0} 進行競爭。

實例4. 抗體2294 Fc區至鼠科Fcγ受體之結合親和力

使用如前述之BIAcore來量測抗體Fc區至Fcγ受體之結合親和力。簡言之，藉由胺化學將經純化之鼠科Fcγ受體(來自R&D Systems)固定在BIAcore CM5晶片上。注射單株抗體之連續稀釋液(在2 nM至如表8中所示之最大濃度的範圍內)。將HBS－EP(0.01 M HEPES(pH 7.4)、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005%介面活性劑P20)用作運行及樣品緩衝液。對高親和力相互作用使用1：1 langmuir相互作用模型或對低親和力相互作用使用穩態親和力模型來分析結合資料。

下表8中顯示如藉由至鼠科FcγRI、FcγRIIb及FcγRIII之K_D (nM)所量測之抗體2294之結合親和力。去醣基化之抗體具有一恒定區，該恒定區具有已移除之N－醣基化作用。如表8中所示，與未經移除N－醣基化作用之各相應抗體相比，去醣基化之2294對所測試之所有鼠科Fcγ受體具有降低之親和力。

NB：當使用以所測試之最大濃度的抗體時，顯示無顯著結合。

實例5.抗體2294及去醣基化之抗體2294在降低Aβ沈積及阿茲海默氏症之動物模型中認知中的效應

藉由在37℃下以20 mM Tris－HCl pH 8.0中之肽－N－糖苷酶F(Prozyme，每毫克抗體0.05 U)培養經純化之抗體2294歷時7天來製備去醣基化之抗體2294。藉由MALDI－TOF－MS及蛋白質凝膠電泳來驗證去醣基化作用之完全性。藉由蛋白質A層析法純化經去醣基化之抗體且藉由Q－瓊脂糖移除內毒素。使用前述Biacore檢定測試經去醣基化之2294至Aβ_{1 － 4 0} 之結合親和力，且發現經醣基化之2294至Aβ_{1 － 4 0} 之結合親和力等同於完整抗體2294。

在轉基因小鼠APP Tg2576中測試抗體2294及去醣基化之2294在認知不足、組織學症狀及微出血之逆轉上的效應。如下述執行抗體投藥、組織學及行為分析。

抗體之投藥。將過度表現"瑞典(Swedish)"突變體澱粉樣蛋白前驅體蛋白質(具有K670N/M671之APP Tg2576；Hsiao等人，Science 274：99－102(1996))之轉基因小鼠用於該等實驗。已良好地表徵存在於此等小鼠中之類阿茲海默氏症表型(Holcomb等人，Nat.Med.4：97－100(1998)；Holcomb等人，Behav.Gen.29：177－185(1999)；及McGowan E,Neurobiol.Dis.6：231－244(1999))。在十六周之治療研究中，將20月齡之APP－轉基因小鼠指派至四組之一組中。第一組接受每周之腹膜內抗Aβ抗體2294注射歷時16周之階段(n＝4)。第二組接受每周之腹膜內經去醣基化之抗Aβ抗體2294注射歷時16周之階段(n＝5)。第三組接受每周之腹膜內抗AMN抗體(2906；小鼠單株抗果蠅遺忘蛋白質IgG1)注射歷時16周之階段(n＝6)。以抗AMN抗體(n＝4)或2294(n＝2)兩者之任一者治療非轉基因之同窩出生之小鼠歷時16周。

行為分析。在16周之抗體治療之後，使來自該研究之小鼠經受如先前所述之兩天的輻射臂式水迷宮範例(radial－arm water－maze paradigm)(Wilcock等人，J.Neuroinflammation 1：24(2004))。該裝置為如先前所述之6－臂迷宮(Gordon等人，Neurobiol.Aging 22：377－385(2001))。在第一天，在5塊中之3塊中運行15次試驗。對各塊連續運行4小鼠之群組(即，4小鼠之每個進行實驗一，隨後相同小鼠進行實驗二，如此類推)。在各5實驗塊之後，運行第二小鼠群組，其允許在將小鼠暴露至5實驗之第二塊之前歷經延長之休息階段。群組中之各小鼠之目標臂係不同的以最小化氣味提示。起始臂隨各試驗而變化，其中目標臂對給定之個體保持恒定歷時兩天。對首先之11試驗，該平臺在可見隨後隱藏(對至少4試驗隱藏)之間交替。在第二天，以與第一天嚴格相同之方式運行小鼠，除了該平臺對所有試驗隱藏之外。在一分鐘之期限中量測錯誤(不正確之臂入口)之數量。將小鼠在20秒內對臂之選擇失敗指派為一錯誤，但無須以此方式將此研究中之小鼠指派一錯誤。由於該研究中小鼠之數量，測試者不知各小鼠之治療組一致性。因為輻射臂式水迷宮任務中之依賴性量測為定量而非評估性量測，所以降低了測試者偏差之可能。為了最小化個別試驗可變性之影響，將3連續試驗之各小鼠之錯誤平均以得到各天之5資料點，藉由ANOVA使用StatView(SAS Institute Inc.,NC)對其進行統計學上之分析。

組織學分析。在將小鼠殺死的當天，對小鼠稱重，以100 mg/kg Nembutal(Abbott laboratories,North Chicago,IL)對其過度給藥，且接著以25 mL之0.9%氯化鈉經心臟內灌輸。快速移除腦，且將左半腦浸漬固定於用於組織學之新鮮製備的在100 mM KPO₄ (pH 7.2)中之4%多聚甲醛中歷時24 h。隨後出於細胞保護(cyroprotection)連續在10%、20%及30%蔗糖中培養該等半腦歷時24 h。使用滑動切片機採集25 μ厚度之水平部分且在4℃下將其儲存於具有疊氮化鈉之杜貝卡氏磷酸鹽緩衝鹽水(pH 7.2)中以防止微生物生長。跨越完整腦部隨機選擇相距600 μ之8個相等間距之組織系列且如先前所述使用對總Aβ(兔多株抗－pan Aβ；Biosource,Camarillo,CA,1：10,000)之自由漂移之免疫組織化學對其染色(Gordon等人，Exp.Neurol.173：183－195(2002)；Wilcock等人，J.Neurosci.24：6144－6151(2004))。使用在經NaCl飽和之80%乙醇中之0.2%剛果紅(Congo red)對相距600 μm之組織的第二系列染色。亦將第二組之部分安置且使用2%鹽酸中之2%亞鐵氰化鉀歷經15 min、繼而使用1%中性紅溶液中之複染劑歷時10 min為血鐵黃素對其染色。使用Image－Pro Plus(Media Cybernetics,Silver Spring,MD)執行剛果紅染色之量化及Aβ免疫組織化學以分析由陽性染色佔據之面積百分數。分析前額皮質之一區域及海馬狀突起之三區域(以確保不存在海馬狀突起值中之區域偏差)。執行剛果紅之起始分析以得到總值。在手動刪除所有實質澱粉樣蛋白沈積之後執行第二分析以產生限制于脈管剛果紅染色之面積百分數。為估算剛果紅之實質面積，自總百分數減去脈管澱粉樣蛋白值。對於血鐵黃素染色而言，在所有部分上對普魯士藍陽性位置之數量進行計數且計算每部分之位置的平均數量。在低放大倍率下在該等部分處觀察在動物之間的定性差異。檢查八個相等間距之部分且判定陽性概況之數量且將其平均為每一部分之值。為評估可能之治療相關差異，藉由單向ANOVA繼而藉由Fisher氏LSD手段對比來分析各治療組之值。

使用ELISA進行Aβ肽之血清含量之量測。將在最後給予抗體之後一天所收集的血清稀釋且在96孔微滴定板(MaxiSorp；Nunc,Rosklide,Denmark)中培養，該板已用在PBS緩衝液(pH 7.4)中濃度為5 μg/ml之抗體6E10(結合至Aβ_{1 － 1 7} 之抗－β澱粉樣蛋白抗體；Signet,Dedham,MA)預塗覆。二次抗體為在1：5000稀釋液中經生物素化之4G8(結合至Aβ_{1 7 － 2 4} 之抗－β澱粉樣蛋白抗體；Signet)。使用抗生蛋白鏈菌素－辣根過氧化物酶共軛物(Amersham Biosciences)、繼而使用TMB基質(KPL,Gaithersburg,MD)來完成偵測。將座標為6 pM至400 pM之Aβ_{1 － 4 0} (American Peptide)用作標準曲線。

當然，本文所述之實例及實施例係僅為了達成說明性目的且熟習此項技術者將提出根據其作出的各種改變及變化且將該等改變及變化包括於本申請案之精神及範圍之內。出於所有目的，本文所引用之所有公開案、專利及專利申請案係以引用的方式全部並入本文中，該引用的程度就如同已特定地及個別地將各個公開案、專利案或專利申請案以引用的方式並入一般。

生物材料之寄存 已用American Type Culture Collection,10801 University Boulevard,Manassas,Virginia 20110－2209,USA(ATCC)寄存以下材料：

載體pEb.6G.hK為編碼6G輕鏈可變區及輕鏈恒定區之聚核苷酸；且載體pDb.6G.hFc2a為編碼6G重鏈可變區及含有以下突變之重鏈IgG2a恒定區的聚核苷酸：A330P331至S330S331(胺基酸編號係基於關於野生型IgG2a序列之Kabat編號；見Eur.J.Immunol.(1999)29：2613－2624)。

出於專利程式之目的(Purpose of Patent Procedure)及在其下之規章(布達佩斯條約(Budapest Treaty))在微生物之寄存(Deposit of Microorganisms)之國際公認上(International Recognition)的布達佩斯條約之規定下制得此等寄存。以此方式確保寄存物之可行培養物自寄存日期起維持30年。將可藉由在布達佩斯條約之條款下的ATCC制得該沈積，且其服從在Rinat Neuroscience Corp.及ATCC之間的協定，其基於有關美國專利之發佈或基於任何美國或外國專利申請案揭露至公衆(無論何者首先出現)，確保寄存物之培養物之後裔至公衆的永久及不受限制之可用性，且確保該後裔至由題名至其之美國專利及商標委員(U.S.Commissioner of Patents and Trademarks)根據35 USC部分122(35 USC Section 122)及依照至其之委員規則(包括37 CFR部分1.14(37 CFR Section 1.14)，尤其關於886 OG 638)判定者之可用性。

本申請案之受讓人已同意若寄存上之材料之培養物在適合條件下培養時消逝或丟失或破壞，則將迅速以另一相同材料公告替代該等材料。所寄存之材料之可用性不應被解釋為違反在任何政府依照其專利法之職權下所同意的權利實踐本發明之許可。

抗體序列 6G重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：1) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQAPGQGLEWMGFTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWGQGTLVTVS

6G輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNWYQQKPGQPPKLLIYAATKQGTGVPDRFSGSGsGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTV

6G CDR H1(延伸CD)(SEO ID NO：3) GYTFTTYAIH

6G CDR H2(延伸CD)(SEQ ID NO：4) FTSPYSGVSNYNQKFKG

6G CDR H3(延伸CD)(SEQ lD NO：5) FDNYDRGYVRDY

6G CDR L1(延伸cr)(SEQ ID NO：6) RASESVDNDRISFLN

6G CDR L2(延伸CD)(SEQ ID NO：7) AATKQGT

6G CDR L3(延伸CD)(SEQ ID NO：8) QQSKEFPWS

6G重鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：9) CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCCTCCGTGAAAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTTACCACCTATGCCATCCATTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCCGGGGTGTCGAATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGCGTCACCATGACCCGCGACACCTCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCTCCGAAGACACCGCCGTGTATTACTGTGCCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCC

6G輕鏈可變區核苷酸序列(SEQ ID NO：10) GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTGGATAACGATCGTATTTCCTTTCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGCCACCAAACAGGGTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCTCCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTTGGCGGTGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGTG

6G重鏈全抗體胺基酸序列(包括如本文所述之經修飾之IgG2a)(SEQ ID NO：11) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYAIHWVRQAPGQGLEWMGFTSPYSGVSNYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARFDNYDRGYVRDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

6G輕鏈全抗體胺基酸序列(SEQ ID NO：12) DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDNDRISFLNWYQQKPGQPPKLLIYAATKQGTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYcQQSKEFPWSFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

6G重鏈全抗體核有酸序列(包括如本文所述之經修飾之IgG2a)(SEQ ID NO：13) CAGGTGCAACTGGTGCAATCCGGTGCCGAGGTGAAAAAGCCAGGCGCCTCCGTGAAAGTGTCCTGCAAAGCCTCCGGTTACACCTTTACCACCTATGCCATCCATTGGGTGCGCCAGGCCCCAGGCCAGGGTCTGGAGTGGATGGGCTTTACTTCCCCCTACTCCGGGGTGTCGAATTACAATCAGAAGTTCAAAGGCCGcGTCACCATGACCCGCGACACCTCCACCTCCACAGTGTATATGGAGCTGTCCTCTCTGCGCTCCGAAGACACCGCCGTGTATTACTGTGCCCGCTTCGACAATTACGATCGCGGCTATGTGCGTGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCTGTCTTCCCACTGGCCCCATGCTCCCGCAGCACCTCCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCAGAACCTGTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCCTCAGGTCTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCATCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCAAGCAACACCAAGGTCGACAAGACCGTGGAGAGAAAGTGTTGTGTGGAGTGTCCACCTTGTCCAGCCCCTCCAGTGGCCGGACCATCCGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAGCCAAAGGACACCCTGATGATCTCCAGAACCCCAGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCAGAGGTGCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGAGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGGAGCAGTTCAACTCCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGAAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGACTGCCATCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGACCAAGGGACAGCCAAGAGAGCCACAGGTGTATACCCTGCCCCCATCCAGAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGATTCTATCCATCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACAGCCAGAGAACAACTATAAGACCACCCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGATCCTTCTTCCTGTATTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCAGATGGCAGCAGGGAAACGTGTTCTCTTGTTCCGTGATGCACGACGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGTCTCCAGGAAAG

6G輕鏈全抗體核甘酸序列(SEQ ID NO：14) GACATCGTGATGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGCGCGCCACCATCAACTGCCGCGCCAGCGAATCCGTGGATAACGATCGTATTTCCTTTCTGAACTGGTACCAGCAGAAACCAGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTCATTTACGCCGCCACCAAACAGGGTACCGGCGTGCCTGACCGCTTCTCCGGCAGCGGTTCCGGCACCGATTTCACTCTGACCATCTCCTCCCTGCAGGCCGAAGATGTGGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTCCAAAGAGTTTCCCTGGTCCTTTGGCGGTGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGCACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCTCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCCGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCACGCGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCCGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACCCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCTCCAGTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGC

圖1顯示6G抗體之重鏈可變區(SEQ ID NO：1)及輕鏈可變區(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列。Kabat CDR係以黑體文本表示，且Chothia CDR係以下劃線表示。對重鏈及輕鏈可變區之胺基酸殘基依次編號。

圖2顯示藉由ELISA進行之抗體6G之抗原決定基定位。將Aβ肽(1－16、1－28、17－40、17－42、22－35、28－40、28－42、1－38、1－40、1－42、1－43及33－40)固定在ELISA板上。以各種經固定之肽培養單株抗體6G(20 nM)歷時1 h。使用與山羊抗人類HRP共軛之二次抗體量測結合至經固定之Aβ肽的抗體6G。

圖3顯示藉由ELISA進行之抗體6G之抗原決定基定位。將各種Aβ肽(將頂部至底部序列指派為SEQ ID NO：18－29)固定在ELISA板上。以各種經固定之肽培養抗體6G歷時1 h。使用與山羊抗人類HRP共軛之二次抗體量測結合至經固定之Aβ肽的抗體6G。"NB"係指未偵測到結合。

圖4為顯示抗體6G在Aβ上結合之抗原決定基之示意圖。其顯示在細胞膜中Aβ在澱粉樣蛋白前驅體蛋白質(APP)及APP之一部分中的相對位置。"CT99"係指APP之C－末端99胺基酸。將所示之胺基酸序列指派為SEQ ID NO：30。

圖5為顯示以針對Aβ_{1 － 1 6} (m2324)之單株抗體及抗體6G對表現APP之細胞進行免疫染色的照片。頂部面板顯示在以m2324或6G(各5 μg/ml)培養細胞之後在螢光顯微鏡下的該等細胞且藉由二次與Cy3共軛之山羊抗小鼠或抗人類抗體來偵測結合。底部面板顯示在顯微鏡下觀察到之細胞。

圖6顯示藉由ELISA進行之抗體2294及6G之抗原決定基定位。將各種Aβ肽(將自頂部至底部序列指派為SEQ ID NO：18－26、31、及27－29)固定在ELISA板上。以各種經固定之肽培養抗體歷時1 h。使用與山羊抗人類HRP共軛之二次抗體量測結合至經固定之Aβ肽上的抗體6G。使用結合至重及輕鏈兩者且為與HRP共軛之二次抗體的山羊抗小鼠來量測結合至經固定之Aβ肽上的抗體2294。"NB"係指未偵測到結合。在"2294"及"6G"下之行中的數位代表在450 nm處之吸光率。

<110> 美商雷那特神經科學股份有限公司<120> 針對抗澱粉樣蛋白－β肽之抗體及使用彼等之方法<130> 514712002861 <140> TW 095115371 <141> 2006－04－28 <150> US 60/704,818 <151> 2005－08－01 <150> US 60/676,093 <151> 2005－04－29 <160> 32 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 1<210> 2 <211> 114 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 2<210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 3<210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 4<210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 5<210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 6<210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 7<210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 8<210> 9 <211> 360 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 9<210> 10 <211> 342 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 10<210> 11 <211> 447 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 11 <210> 12 <211> 218 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 12<210> 13 <211> 1341 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 13<210> 14 <211> 654 <212> DNA <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 14<210> 15 <211> 40 <212> PRT <213> 人類<400> 15<210> 16 <211> 42 <212> PRT <213> 人類<400> 16<210> 17 <211> 43 <212> PRT <213> 人類<400> 17<210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 18<210> 19 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 19<210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 20<210> 21 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 21<210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 22<210> 23 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 23<210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 24<210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 25<210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 26<210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 27<210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 28<210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 29<210> 30 <211> 49 <212> PRT <213> 人類<400> 30<210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 31<210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> 人工序列<220> <223> 合成構築體<400> 32

Claims (27)

1. 一種特異性地結合至Aβ肽之單株抗體，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含從SEQ ID NO：1所示之重鏈可變區而來之三個CDR，及輕鏈可變區，此輕鏈可變區包含從SEQ ID NO：2所示之輕鏈可變區而來之三個CDR。
2. 如請求項1之單株抗體，其中該抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5所示之三個CDR。
3. 如請求項1或2之單株抗體，其中該抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8所示之三個CDR。
4. 如請求項3之單株抗體，其中該重鏈胺基酸序列示於SEQ ID NO：11，且該輕鏈胺基酸序列示於SEQ ID NO：12。
5. 如請求項1之單株抗體，其中該抗體係以比其結合至Aβ_1-42 及Aβ_1-43 高至少約40倍之親和力結合至Aβ_1-40 。
6. 如請求項5之單株抗體，其中該抗體之Fab片段係以約10nM或更低之親合力結合Aβ_1-40 。
7. 如請求項6之單株抗體，其中該抗體之Fab片段係以約5nM或更低之親和力結合Aβ_1-40 。
8. 2及5中任一項之單株抗體，其中該抗體之同型係選自由IgG1、IgG2、IgG3及IgG4組成之群。
9. 2及5中任一項之單株抗體，其中該抗體包含重鏈恒定區，該重鏈恒定區包含Fc區，其中該重鏈恒定區具有削弱之效應子功能。
10. 如請求項9之單株抗體，其中在該Fc區之N-醣基化作用係經移除。
11. 如請求項9之單株抗體，其中該單株抗體之重鏈恒定區為包含A330P331至S330S331之胺基酸突變之人類IgG2a恒定區，其中該胺基酸位置係以關於人類野生型IgG2a序列之Kabat編號為基礎。
12. 如請求項9之單株抗體，其中該單株抗體之重鏈恒定區為包含自E233F234L235至P233V234A235之胺基酸突變之人類IgG4恒定區，其中該胺基酸位置係以關於人類野生型IgG4序列之Kabat編號為基礎。
13. 2及5中任一項之單株抗體，其中該抗體為一人類抗體。
14. 2及5中任一項之單株抗體，其中該抗體為一人源化抗體。
15. 一種如請求項1至4中任一項之單株抗體之片段，其中該片段為Fab、Fab'、F(ab')₂ 或Fv，且具有或保留該單株抗體之結合特異性。
16. 一種聚核苷酸，其包含編碼如請求項1至14中任一項之抗體之核苷酸序列。
17. 一種載體，其包含如請求項16之聚核苷酸。
18. 如請求項17之載體，其中該載體為具有寄存編號ATCC第PTA-6786號之pDb.6G.hFc2a或其中該載體為具有寄存編號ATCC第PTA-6787號之pEb.6G.hK。
19. 一種宿主細胞，其包含如請求項16之聚核苷酸。
20. 一種製備抗體之方法，其包含在可製造該抗體之條件下培養如請求項19之宿主細胞，該宿主細胞包含如請求項16之聚核苷酸；及自該宿主細胞或培養物分離該抗體。
21. 一種醫藥組合物，其包含有效量之如請求項1至14中任一項之抗體或如請求項15之片段及醫藥學上可接受之賦形劑。
22. 一種如請求項21之醫藥組合物之用途，其係用於製造預防、治療、抑制或延緩與經改變之Aβ或βAPP表現或Aβ肽之聚積相關之疾病之發展之藥劑。
23. 如請求項22之用途，其中該藥劑係用於治療阿茲海默氏症或延緩患者發展與阿茲海默氏症相關之症狀。
24. 如請求項22之用途，其中該疾病係多發性梗死性癡呆、輕度認知損害、大腦澱粉樣蛋白血管病、唐氏綜合症、帕金森氏症、庫賈氏病(Creutzfeld-Jakob disease)、具有路易體之癡呆或AIDS。
25. 一種如請求項21之醫藥組合物之用途，其係用於製造在患者中抑制形成或降低澱粉樣蛋白斑塊之藥劑。
26. 一種如請求項21之醫藥組合物之用途，其係用於製造在患者中改善認知或逆轉患者與Aβ澱粉樣蛋白沉積相關之認知衰退之藥劑。
27. 一種抗體，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：5所示之三個CDR，且進一步包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7及SEQ ID NO：8所示之三個CDR。