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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der
Enzymaktivitäten
der Kreatin-Kinase-Isoenzyme (creatin kinase; CK), die im Rahmen
eines klinischen Tests untersucht werden, Antikörper, die in dem Assay verwendet
werden, und einen Satz von Reagenzien für den Assay.
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HINTERGRUND DES STANDES DER TECHNIK
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Die
humanen Kreatin-Kinasen umfassen vier Proteine, die durch verschiedene
Gene kodiert werden. Zwei Proteine, die aus dem Zytoplasma stammen,
werden in Abhängigkeit
von ihrem Vorkommen als „Muskel-Typ
(muscel type; M-Typ)" und „Gehirn-Typ
(brain type; B-Typ)" bezeichnet,
und andere stammen aus den Mitochondrien. Die Kreatin-Kinase-Isoenzyme,
die aus dem Cytoplasma stammen, sind Dimere, die aus dem M-Typ und/oder
dem B-Typ bestehen, und sie werden als CK-MM, CK-MB und CK-BB klassifiziert.
Die mitochondrialen Kreatin-Kinasen (mCKs) sind Oktamere, und zwei
Arten existieren in sehr stabiler Form, sie dissoziieren jedoch
in Dimere innerhalb weniger Minuten in Gegenwart eines Komplexes,
der einem Übergangszustand
analog ist und aus Kreatin, Mg, ADP und Nitrat besteht. Es ist bekannt,
dass sie schrittweise im Blut dissoziieren (Karin Fritz-Wolf et
al., Nature, 361, 341–345,
1996).
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Diese
Isoenzyme wandern in der Elektrophorese von der Kathodenseite in
der folgenden Reihenfolge: mCK (Oktamer) > mCK (Dimer) = CK-MM > CK-MB > CK-BB.
Das mCK (Dimer) besitzt eine Beweglichkeit, die gleich jener von
CK-MM ist, so dass das erstere fälschlicherweise
als „CK-MM" in konserviertem
Blut identifiziert werden kann. Die Makro-Kreatin-Kinase, die an
Immunglobulin gebunden ist, existiert ebenso, obwohl sie kein Isoenzym
darstellt. Diese können
aus einem Zymogramm anhand der Beweg lichkeit, mittels des Immunitäts-Gegenstrom-Verfahrens
und dergleichen, identifiziert werden.
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Die
Untersuchung von CK und CK-Isoenzymen wird im klinischen Test in
großem
Umfang verwendet. CK-MB ist unter diesen Verbindungen wichtig als
ein Marker für
den Herzinfarkt. CK-MB wird durch das EIA-Verfahren, durch eine
Immunhemmung, durch ein Elektrophorese-Verfahren und dergleichen
untersucht. Obwohl das EIA-Verfahren eine spezifische Untersuchung
nur von CK-MB ermöglicht,
erfordert es ein speziell gestaltetes Instrument und weist ein Problem
bezüglich
der Schnelligkeit auf. Das Elektrophorese-Verfahren erfordert eine
komplizierte Bedienung und bestimmte Fähigkeiten, und ein Densitometer
ist notwendig, um ein Verhältnis
des CK-MB zu erhalten, d. h. das Verfahren weist ebenso ein Problem
in Bezug auf die Schnelligkeit auf. Obwohl die Immunhemmung eine
schnelle und einfache Untersuchung ermöglicht, wenn ein automatisiertes
Analysegerät
verwendet wird, ist es ein Nachteil, dass es keine Spezifität aufweist.
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Bei
der derzeitigen Situation ist es jedoch erforderlich, den Herzinfarkt
in einem frühen
Stadium zu diagnostizieren. Daher wird die Immunhemmung, welche
eine schnelle und einfache Untersuchung ermöglicht, in großem Umfang
eingesetzt. Bei diesem Verfahren wird die Enzymaktivität der Untereinheit
CK-M unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers inaktiviert, der gegen
die Untereinheit CK-M gerichtet ist („anti-CK-M-Antikörper"), und die verbleibende
Aktivität
der Untereinheit CK-B wird untersucht. Durch dieses Verfahren werden
CK-BB und mCK (Dimer + Oktamer) sowie CK-MB ebenso untersucht. Von
diesen Enzymen ist wenig CK-BB im Blut vorhanden, d. h. zu vernachlässigen.
Obwohl die Krankheiten, welche mit der Abweichung des CK-BB-Spiegels
in Zusammenhang stehen, eine Gehirn-Prellung sowie das multiple
Or ganversagen umfassen, sind diese Fälle selten. Sogar im Serum
einer gesunden Person ist mCK in einer wirksamen Menge vorhanden,
die nahezu gleich dem CK-MB ist (Yoko Toyoda et al., Seibutsu Butsurikagaku
41, 244, 1997; Tadashi Hoshino et al., Seibutsu Butsurikagaku 42,
Supplement 2, 21, 1998). Darüber
hinaus weicht der mCK-Spiegel im Falle einer Zellnekrose, wie zum
Beispiel einer Lebererkrankung und im Falle eines malignen Tumors,
ab, und die Beurteilung des Ergebnisses wird gestört. Kürzlich wurde
es beschrieben, dass eine Abweichung des mCK-Werts durch eine Darmentzündung aufgrund
von Rotaviren sowie im Falle des plötzlichen Erstickungstodes von
Neugeborenen auftritt (Tadashi Hoschino et al., Rinsho Byori 46,
Meeting Issue, 57, 1998; Fusae Kanemetsu et al., Rinsho Byori 46,
Meeting Issue, 58, 1998). Es wurde ebenso beschrieben, dass die
Gegenwart von mCK die Messungen von CK-MB durch das Enzym-Hemmungsverfahren
beeinflusst (Abstracts des 22. Meeting of the Chiba Pref. Society
for Clinical and Hygienic Tests 6–7, Februar 2001). Anschließend wurde
ein Verfahren beschrieben, bei dem ein Antikörper hergestellt wurde, der
spezifisch für
die mCK-Aktivität
ist (anti-mCK-Antikörper),
und bei dem der anti-mCK-Antikörper
zusammen mit dem anti-CK-M-Antikörper
hergestellt wurde, um auf die CK-Isoenzyme einzuwirken, und die
Aktivität
der CK-M-Untereinheit und die mCK-Aktivität zu hemmen, um einen genaueren
Assay für
CK-MB zu erhalten (
JP P2002-270A ).
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Die
mCK umfasst ubiquitäre
mCK- (umCK) und sarkomere mCK-(smCK)Isoformen. Es wurde von der genetischen
Analyse von mCK berichtet, dass die Aminosäure-Sequenzen der humanen mCK,
der CK-M und der CK-B zu 62–66%
miteinander homolog sind, und dass die Aminosäure-Sequenzen von umCK und
smCK zu 80% miteinander homolog sind (J. Biol. Chem. 265, 6921–6927, 1998).
Die Isolation der umCK und der smCK und die Untersuchung der Eigenschaften derselben
ergab, dass umCK bzw. smCK ein Dimer bzw. Oktamer bilden, und dass
sie geringfügig
unterschiedliche pI-Werte aufweisen, und dass das Oktamer eine Antigenität in einem ähnlichen
Ausmaß aufwies
und vom Dimer unterschieden wurde (Fusae Kanemitsu et al., Rinsho
Byori 47, Meeting Issue, 306, 1999).
EP
1072889 offenbart ein Verfahren zur Messung der Aktivität des CK-MB-Isoenzyms
durch a. o. Hemmung der mCK durch eine Kombination eines hemmenden
Antikörpers
gegen umCK und eines hemmenden Antikörpers gegen smCK. Beide Antikörper hemmen
kreuzweise das jeweilige andere Enzym, nicht jedoch CK-MB.
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Die
Beziehung zwischen der Abweichung des mCK-Spiegels und den Krankheiten
wurde sehr häufig berichtet,
wie vorstehend beschrieben. Der mCK-Wert wird im Allgemeinen durch
Agarose-Elektrophorese
untersucht, und umCK und smCK verhalten sich ähnlich, so dass beide beschrieben
wurden, ohne sie voneinander zu unterscheiden. Obwohl ein Antikörper mit
einer anti-smCK-Aktivität
beschrieben wurde (
JP P2002-270A ),
wurde keine Darstellung veröffentlicht,
welche den anti-umCK-Antikörper
betrifft, und es war schwierig, eine einfache Unterscheidung durchzuführen und
beide zu analysieren.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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(Das Problem, welches die Erfindung zu
Lösen versucht)
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Es
ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für eine genauere
Untersuchung von mCK-Isoenzymen sowie ein Verfahren für die getrennte
Untersuchung von CK-Isoenzymen bereitzustellen, indem die Enzymaktivitäten von
umCK und smCK gesondert untersucht werden. Es ist eine weitere Aufgabe
der Erfindung, verschiedene mCK-Antikörper bereitzustellen, die für den Assay
verwendet werden können,
insbesondere einen Antikörper,
der die Enzymaktivität
von umCK spezifisch hemmt.
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(Mittel zur Lösung des vorstehenden Problems)
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Als
ein Ergebnis der Forschungen zur Lösung der vorstehenden Aufgaben
wurde es angenommen, dass die Mehrheit der normalen humanen mCK-Isoenzyme
umCK darstellt, so dass man davon ausging, dass die Gewinnung eines
Antikörpers,
der die Enzymaktivität
von umCK spezifisch hemmt, es einfach machen würde, umCK und smCK getrennt
zu untersuchen. Daher wurden Untersuchungen durchgeführt, um
erfolgreich in der Lage zu sein, einen Antikörper herzustellen, der die
Enzymaktivität
von umCK spezifisch hemmt, um die vorliegende Erfindung zu vervollständigen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt bereit:
- 1. Ein
anti-mCK-Antikörper,
der durch die Hemmung einer Enzymaktivität von ubiquitärer mCK
(umCK) unter den Kreatin-Kinase-Isoenzymen,
die in den Mitochondrien lokalisiert sind (mCK), gekennzeichnet
ist.
- 2. Der Antikörper
gemäß dem vorstehenden
Absatz 1, wobei der Antikörper
die Enzymaktivität
von umCK um 60% oder mehr hemmt.
- 3. Der Antikörper
gemäß dem vorstehenden
Absatz 1 oder 2, wobei der Antikörper
in der Lage ist, die Enzymaktivität von mCK bis zu einem solchen
Ausmaß zu
hemmen, dass ein Assay der CK-Isoenzyme, die von den mCK-Isoenzymen
verschieden sind, nicht wesentlich beeinträchtigt wird.
- 4. Der Antikörper
gemäß dem vorstehenden
Absatz 1, 2 oder 3, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
- 5. Ein monoklonaler Antikörper,
der durch ein Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-8342
hergestellt wird.
- 6. Ein Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-8342.
- 7. Ein Verfahren zur immunologischen Untersuchung von mCK, dadurch
gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: Bereit stellen
einer Probe; und Behandeln der Probe mit dem Antikörper gemäß dem vorstehenden
Absatz 1, 2, 3, 4 oder 5.
- 8. Das Verfahren gemäß dem vorstehenden
Absatz 7, welches folgende Schritte umfasst: Behandeln der Probe
mit einem anti-mCK-Antikörper, der
eine Enzymaktivität
der sarkomeren mCK (smCK) unter den mCK-Isoenzymen hemmt.
- 9. Das Verfahren gemäß dem vorstehenden
Absatz 8, wobei der Schritt der Behandlung der Probe mit dem Antikörper zur
Hemmung der Enzymaktivität
von umCK und der Schritt der Behandlung der Probe mit dem Antikörper zur
Hemmung der Enzymaktivität
von smCK in einem Schritt durchgeführt werden.
- 10. Ein Verfahren zur Untersuchung der CK-Isoenzyme, dadurch
gekennzeichnet, dass es folgende Schritte umfasst: Bereitstellen
einer Probe; und Behandeln der Probe mit dem Antikörper gemäß dem vorstehenden
Absatz 1, 2, 3, 4 oder 5.
- 11. Das Verfahren gemäß dem vorstehenden
Absatz 10, wobei der Behandlungsschritt aufgrund der Behandlung
der Probe mit dem Antikörper
zur Hemmung der Enzymaktivität
von umCK und mit einem Antikörper
zur Hemmung einer Enzymaktivität
von smCK durchgeführt
wird.
- 12. Das Verfahren gemäß dem vorstehenden
Absatz 10, welches einen Schritt der Untersuchung einer Enzymaktivität von CK
in der Probe vor dem Schritt der Behandlung mit dem Antikörper und
einen Schritt der Untersuchung der verbleibenden Enzymaktivität nach dem
Schritt der Behandlung mit dem Antikörper umfasst.
- 13. Das Verfahren gemäß dem vorstehenden
Absatz 10, welches einen Schritt der Behandlung der Probe mit einem
Antikörper
gegen die Untereinheit CK-M (anti-CK-M subunit antibody) umfasst.
- 14. Das Verfahren gemäß dem vorstehenden
Absatz 13, wobei der Schritt der Behandlung der Probe mit dem Antikörper und
der Schritt der Behandlung der Probe mit dem Antikörper gegen
die Untereinheit CK-M in einem Schritt durchgeführt werden.
- 15. Das Verfahren gemäß dem vorstehenden
Absatz 13, wobei der Schritt der Behandlung der Probe mit dem Antikörper und
der Schritt der Behandlung der Probe mit dem Antikörper gegen
die Untereinheit CK-M in zwei Schritten durchgeführt werden.
- 16. Das Verfahren gemäß dem vorstehenden
Absatz 15, welches die folgenden Schritte umfasst: Behandeln der
Probe mit dem Antikörper
gegen die Untereinheit CK-M; Untersuchen einer ersten verbleibenden Enzymaktivität der Probe;
Behandeln der Probe mit dem Antikörper; und Untersuchen einer
zweiten verbleibenden Enzymaktivität der Probe.
- 17. Ein Verfahren zum Testen von CK-Isoenzymen, dadurch gekennzeichnet,
dass ein Ergebnis, das durch das Verfahren zur Untersuchung der
CK-Isoenzyme gemäß dem vorstehenden
Absatz 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder 16 erhalten wurde, mit einer
Krankheit in Beziehung gesetzt wird.
- 18. Ein Reagenz zur Untersuchung von CK-Isoenzymen, welches
den Antikörper
gemäß dem vorstehenden
Absatz 1, 2, 3, 4 oder 5 umfasst.
- 19. Das Reagenz gemäß dem vorstehenden
Absatz 18, welches einen Antikörper
gegen die Untereinheit CK-M umfasst.
- 20. Das Reagenz gemäß dem vorstehenden
Absatz 19, welches einen anti-mCK-Antikörper zur Hemmung der Enzymaktivität von smCK
unter den mCK-Isoenzymen umfasst.
- 21. Ein Reagentien-Satz zur Untersuchung von CK-Isoenzymen,
welcher das Reagenz gemäß dem vorstehenden
Absatz 18 umfasst.
- 22. Der Reagentien-Satz gemäß dem vorstehenden
Absatz 21, welcher ein Reagenz einschließlich eines Antikörpers gegen
die Untereinheit CK-M umfasst.
- 23. Der Reagentien-Satz gemäß dem vorstehenden
Absatz 21, wobei das Reagenz einen anti-mCK-Antikörper zur
Hemmung einer Enzymaktivität
der smCK unter den mCK-Isoenzymen umfasst.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 erläutert die
Fähigkeiten
des Überstandes
der Hybridomkultur zur Hemmung der Enzymaktivitäten von Isoenzymen (experimentelles
Beispiel 1).
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2 erläutert die
Fähigkeiten
des monoklonalen anti-umCK-Antikörpers
(UI-1881) zur Hemmung der Enzymaktivitäten (experimentelles Beispiel
4).
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3 erläutert die
Fähigkeiten
des monoklonalen anti-smCK-Antikörpers
(mCKI-578) zur Hemmung der Enzymaktivitäten (experimentelles Beispiel
4).
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DIE BESTE ART ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
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Der
Ausdruck „Enyzmaktivität von mCK" wird in der vorliegenden
Erfindung verwendet, um die Enzymaktivität von umCK und/oder die Enzymaktivität von smCK
oder die gesamten Enzymaktivitäten
von mCK, einschließlich
dieser Aktivitäten,
zu bezeichnen.
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Der
Ausdruck „anti-mCK-Antikörper" wird in der vorliegenden
Erfindung verwendet, um einen Antikörper zu bezeichnen, der die
Enzymaktivität
von mCK hemmt. Der Ausdruck „ein
Antikörper,
der die Enzymaktivität
von smCK hemmt" wird
verwendet, um einen Antikörper
zu bezeichnen, der spezifisch ein Protein vom smCK-Typ erkennt und
spezifisch seine Enzymaktivität
hemmt. In ähnlicher
Weise wird der Ausdruck „ein
Antikörper,
der die Enzymaktivität von
umCK hemmt" verwendet,
um einen Antikörper
zu bezeichnen, der spezifisch ein Protein vom umCK-Typ erkennt und
spezifisch seine Enzymaktivität
hemmt. Ein beliebiger Antikörper, der
in der Lage ist, die Enzymaktivität von mCK bis zu einem Grad
zu hemmen, der den Assay der CK-Isoenzyme, die von mCK verschieden
sind, nicht wesentlich beeinträchtigt,
kann als ein Antikörper
für die
gesonderte Untersuchung von CK-Isoenzymen gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden. Die mCK ist in vielen Fällen in der Probe mit 5–20 U/l
enthalten, und ein Antikörper,
der in der Lage ist, die Enzymaktivitäten der mCK zu 80% oder mehr
zu hemmen, kann für
klinische Tests ohne irgendein Problem verwendet werden. Ein solches
System, das hergestellt wurde, um damit im Wesentlichen in der Lage
zu sein, die Enzymaktivität der
mCK zu 80% oder mehr zu hemmen, kann zum Beispiel dadurch verwendet
werden, dass ein Antikörper, der
die Enzymaktivität
von smCK hemmt, mit einem anderen Antikörper (mit anderen Antikörpern) kombiniert wird,
und/oder dadurch, dass eine Verbindung verwendet wird, die in der
Lage ist, mCK zu hemmen, auch wenn ein Antikörper, der die Enzymaktivität von umCK
(„anti-umCK-Antikörper") hemmt, eine geringe
Fähigkeit zur
Hemmung von mCK aufweist, wenn er einzeln eingesetzt wird. Ein Antikörper, der
die Enzymaktivität
von umCK zu 60% oder mehr, vorzugsweise zu 70% oder mehr, stärker bevorzugt
zu 90% oder mehr hemmt, kann als anti-umCK-Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung
verwendet werden.
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Obwohl
sowohl polyklonale Antikörper
als auch monoklonale Antikörper
als Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
ist letzterer bevorzugt.
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(Herstellung eines Antikörpers)
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Die
Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung können
solche sein, die aus der Maus oder aus der Ratte, dem Hamster, dem
Kaninchen, der Ziege und dem Pferd, vorzugsweise aus der Maus stammen.
Die Antikörper
können
IgG- sowie IgM-Antikörper
und dergleichen sein.
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Die
Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung können
durch gut bekannte, immunologische Verfahren erhalten werden, zum
Beispiel aus dem Serum eines Tieres, das unter Verwendung von umCK-Protein als
Antigen immunisiert wurde, vorzugsweise zusammen mit einem Adjuvans.
Monoklonale Antikörper
und Hybridome, welche die monoklonalen Antikörper produzieren, können durch
Fusion eines B-Lymphozyten, der aus einem immunisierten Tier stammt,
mit verschiedenen Myelomzellen hergestellt werden, konkret durch
das nachfolgend beschriebene Verfahren.
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(Antigen, das für die Herstellung des Antikörpers verwendet
wird)
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Für die vorliegende
Erfindung wird umCK aus dem Menschen oder aus einem Säugetier
im Allgemeinen als ein Antigen für
die Herstellung eines Antikörpers
verwendet, der eine spezifische Affinität, zum Beispiel für umCK,
besitzt und seine Enzymaktivität
hemmt. Um die Spezifität
zu steigern, ist es vorzuziehen, einen Antikörper zu verwenden, der für die gewünschte Spezies
der Messung spezifisch ist. Zum Beispiel ist es vorzuziehen, ein
humanes umCK als Antigen zu verwenden, falls ein Antikörper hergestellt
wird, der eine spezifische Affinität gegenüber der humanen umCK aufweist
und spezifisch die Enzymaktivität
der humanen umCK hemmt. Ein umCK-Antikörper kann zum Beispiel aus
einem biologischen Gewebe durch Reinigung oder durch ein genetisches
Verfahren erhalten werden. Die Antigene sind im Handel erhältlich, zum
Beispiel vom Institut für
Zellbiologie der Eidgenössischen
Technischen Hochschule (ETH), Zürich.
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(Immunisierungsverfahren)
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Gereinigtes
umCK-Protein, umCK-Protein, das durch ein gentechnisches Verfahren
exprimiert wurde, und das auf seiner Aminosäure-Sequenz oder einem Teilpeptid
desselben beruht, wird gelöst
oder in einem geeigneten Puffer, wie zum Beispiel einer Lösung eines
Phosphatpuffers (PBS), suspendiert, um sie als eine Antigen-Lösung einzusetzen,
welche üblicherweise
so hergestellt werden kann, dass sie ein Antigen mit 50–500 μg/ml und
dergleichen enthält.
Peptid-Antigene oder dergleichen, die eine geringe Antigenität aufweisen,
wenn sie einzeln verwendet werden, können nach der Verknüpfung mit
einem geeigneten Trägerprotein, wie
zum Beispiel Albumin und dem Hämocyanin
der Schlüssellochschnecke
(keyhole limpet hemocyanin; KLH), verwendet werden. Die Tiere, die
mit dem Antigen immunisiert werden, sind Maus, Ratte, Hamster, Pferd,
Ziege und Kaninchen, vorzugsweise Maus, insbesondere BALG/c-Maus.
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Um
die Antwort eines Tieres zu steigern, das mit dem Antigen immunisiert
werden soll, kann die Antigen-Lösung
als eine Mischung mit einem Adjuvans verabreicht werden. Verträgliche Adjuvantien
umfassen das vollständige
Freund'sche Adjuvans
(FCA), das unvollständige
Freund'sche Adjuvans
(FIA), Ribi (MPL), Ribi (TDM), Ribi (MPL + TDM), den Impfstoff gegen
Bordetella pertussis, das Muramyl-Dipeptid (MDP), das Aluminium-Adjuvans
(ALUM) und eine Kombination derselben. Es ist besonders vorzuziehen,
das vollständige Freund'sche Adjuvans für die erste
Immunisierung zu verwenden, und das unvollständige Freund'sche Adjunvans oder
Ribi für
die zusätzlichen
Immunisierungen als Adjuvans zu verwenden.
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Das
Immunisierungsverfahren schwankt in Abhängigkeit von der Art des Antigens
für die
Verwendung und vom Vorliegen oder Fehlen eines Adjuvans zur Beimischung
in Bezug auf die Injektions-Stelle
und das -Schema. Falls zum Beispiel eine Maus als Tier für die Immunisierung
verwendet wird, werden 0,05–1
ml einer Mischung des Adjuvans und des Antigens (Antigen 10–200 μg) intraperitoneal,
hypodermal, intramuskulär oder
intravenös
(Schwanz) injiziert, und die zusätzliche
Immunisierung wird 1–4
mal jeweils etwa 4–21
Tage nach der ersten Immunisierung durchgeführt, und die abschließende Immunisierung
wird anschließend
nach etwa 1–4
Wochen durchgeführt.
Es ist ebenso möglich,
eine Lösung,
die das Antigen in einer großen
Menge enthält,
durch eine intraperitoneale Injektion ohne Adjuvans zu verabreichen.
Der Antikörper-Titer
wird durch Sammeln von Blut nach etwa 5–10 Tagen nach der zusätzlichen
Immunisierung anhand eines normalen Verfahrens untersucht, das nachfolgend
beschrieben wird. Die Milzzellen werden aus dem immunisierten Tier etwa
3–5 Tage
nach der letzten Immunisierung gesammelt, um Antikörper produzierende
Zellen zu erhalten.
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(Herstellung eines monoklonalen Antikörpers)
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Ein
monoklonaler Antikörper
(MoAb) kann zum Beispiel nach Köhler
und Milstein (Nature 256, 495–497,
1975) hergestellt werden. Es werden Myelomzellen verwendet, die
von einer Maus, einer Ratte oder einem Menschen stammen. Zum Beispiel
werden das Maus-Myelom
P3X63-Ag8, P3X63-Ag8-U1, P3NS1-Ag4, S2/o-Ag14 und P3X63-Ag8-653 verwendet.
Solche Myelomzellen produzieren die leichte Kette des Immunglobulin-Moleküls. Falls
diese Kette als ein Gegenstand für
die Fusion verwendet wird, können
die schwere Kette des Immunglobulins, die durch Antikörper produzierende
Zellen hergestellt wird, und die leichte Kette willkürlich verknüpft werden,
so dass es bevorzugt ist, Myelomzellen zu verwenden, die keine leichte
Kette des Immunglobulins produzieren, wie zum Beispiel P3X63-Ag8-653
und SP2/o-Ag14. Es ist bevorzugt, dass die Antikörper produzierende Zelle und
die Myelomzelle aus einem allogenen Tier stammen, insbesondere von jenem
derselben Abkunft. Myelomzellen können nach einem gut bekannten
Verfahren konserviert werden, zum Beispiel durch Subkultivieren
in einem allgemeinen Medium, zu dem ein fötales Serum von Pferd, Kaninchen
oder Rind zugegeben wurde, gefolgt von der Lyophilisierung der erhaltenen
Kultur. Es ist bevorzugt, Zellen in der logarithmischen Phase für die Zellfusion
zu verwenden.
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Die
Verfahren zur Herstellung eines Hybridoms durch Verschmelzung einer
Antikörper
produzierenden Zelle mit einer Myelomzelle umfassen ein Verfahren
unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG), ein Verfahren unter
Verwendung des Sendai-Virus',
sowie ein Verfahren unter Verwendung einer Elektrofusions-Vorrichtung.
Falls das PEG-Verfahren verwendet wird, werden Milzzellen und Myelomzellen
in einem geeigneten Medium oder Puffer, der etwa 30–60% PEG
(durchschnittliches Molekulargewicht von 1.000–6.000) enthält, in einem
Verhältnis
von 1:1 bis 10:1, vorzugsweise von 5:1 bis 10:1 suspendiert, und
sie werden bei etwa 25–37°C, pH 6–8 für etwa 30
Sekunden bis 3 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation werden die
erhaltenen Zellen gewaschen, um PEG zu entfernen, und sie werden
erneut in einem Medium suspendiert und auf eine Mikrotiterplatte überimpft,
um die Kultur fortzusetzen.
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Die
Zellen nach dem Fusionsverfahren stellen eine Kultur in einem Selektionsmedium
dar, um ein Hybridom zu selektieren. Das Selektionsmedium ist ein
Medium, das es den Elternzellen erlaubt, zu sterilisieren, und das
es den fusionierten Zellen er laubt, zu wachsen. Es wird üblicherweise
das Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-Medium
(HAT-Medium) als Selektionsmedium verwendet. Ein Hybridom wird durch
Austauschen eines Teils, vorzugsweise einer Hälfte des Mediums durch frisches
Selektionsmedium gewöhnlicherweise
1–7 Tage
nach dem Fusionsverfahren selektiert, und anschließend wird
alle 2–3
Tage ein ähnliches
Verfahren zum Austausch des Mediums wiederholt. Die Kolonien von
Hybridomen in den Vertiefungen werden durch das Mikroskop beobachtet.
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Ob
ein wachsendes Hybridom einen gewünschten Antikörper produziert
oder nicht, kann dadurch bestimmt werden, dass der Überstand
der Kultur gesammelt wird, und anschließend der Antikörper-Titer
durch ein gut bekanntes Verfahren untersucht wird. Zum Beispiel
erlaubt die Zugabe von seriell verdünntem Überstand zu einem immobilisierten
Protein-Antigen für
die Reaktion sowie die anschließende
Zugabe eines zweiten Antikörpers
(zum Beispiel eines anti-Globulin-Antikörpers, eines anti-IgG-Antikörpers, eines
anti-IgM-Antikörpers),
der mit einem fluoreszierenden Material, einem Enzym oder einem
radioaktiven Isotop (RI) markiert ist, zu der erhaltenen Reaktionsmischung
den Nachweis eines Antikörpers,
der in dem Überstand
hergestellt wurde, und die Untersuchung eines Antikörper-Titers.
Falls das Antigen ein Enzym ist, erlaubt die Umsetzung des Enzyms
mit dem Überstand
und die anschließende
Untersuchung der Enzymaktivität
unter Verwendung eines geeigneten Substrates den Nachweis eines
Antikörpers
und die Untersuchung eines Antikörper-Titers. Somit
wird der Kulturüberstand
in jeder Vertiefung gescreent, und ein Hybridom, das einen geeigneten
Antikörper
produziert, wird erhalten.
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Darüber hinaus
wird ein einzelner Klon durch das Grenzverdünnungs-Verfahren, durch das
Verfahren mit weichem Agar, oder durch das Verfahren unter Verwendung
einer fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung isoliert. Zum Beispiel
erlauben im Falle des Grenzverdünnungs-Verfahrens
die serielle Verdünnung
einer Kolonie eines Hybridoms mit einem Medium, so dass eine Vertiefung
eine Zelle oder dergleichen enthalten kann, und die Kultur der Zellen
die Isolierung eines Hybridom-Klons, der den gewünschten Antikörper produziert.
Das Einfrieren des erhaltenen Antikörper produzierenden Hybridom-Klons
in Gegenwart von etwa 10% (v/v) eines Mittels, das vor Schädigungen
durch das Einfrieren schützt,
wie zum Beispiel Dimethylsulfoxid (DMSO) und Glycerin, und die Konservierung
der gefrorenen Zellen bei –70
bis –196°C erlauben
die Konservierung der Zellen für
etwa ein halbes Jahr oder mehr oder nahezu dauerhaft. Falls nötig werden
die Zellen rasch in einem Inkubator bei 37°C oder dergleichen aufgetaut.
Es ist bevorzugt, die Zellen nach einer geeigneten Entfernung jenes
Mittels, das vor Schädigungen
durch das Einfrieren schützt
und das überdies
zytotoxisch sein kann, zu verwenden.
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Die
Immunglobulin-Subklasse des vom Hybridom hergestellten Antikörpers kann
durch Kultivierung des Hybridoms unter allgemeinen Bedingungen bestimmt
werden, gefolgt von einer Analyse des in den Kulturüberstand
sezernierten Antikörpers
durch einen im Handel erhältlichen
Reagentien-Satz zur Bestimmung der Antikörper-Klasse/Subklasse.
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Ein
monoklonaler Antikörper
kann aus einem Hybridom erhalten werden, zum Beispiel aus der Peritoneal-Flüssigkeit
der Maus, in die das Hybridom transplantiert wurde, oder aus einem
Kulturüberstand
einer Zellkultur, in Abhängigkeit
von der notwendigen Menge oder den Eigenschaften des Hybridoms.
Falls ein Hybridom verwendet wird, das sich in der Bauchhöhle der
Maus vermehren kann, kann eine hohe Konzentration (einige mg/ml)
eines monoklonalen Antikörpers
aus der Peritoneal-Flüssigkeit
einer Zellkultur erhalten werden. Ein Hybridom, das sich nicht in
vivo vermehren kann, wird aus einem Kulturüberstand erhalten. Obwohl ein monoklonaler
Antikörper
durch die Zellkultur mit einer geringeren Ausbeute als in vivo erhalten
wird, ist der Antikörper
weniger verunreinigt mit Immunglobulinen und Verunreinigungen, die
in der Peritoneal-Flüssigkeit der
Maus enthalten sind, und der Antikörper kann leicht gereinigt
werden, d. h. es ist vorteilhaft.
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Falls
ein Antikörper
aus der Bauchhöhle
der Maus, in die das Hybridom transplantiert wurde, erhalten wird,
wird die Peritoneal-Flüssigkeit
nach etwa 1–3
Wochen gesammelt, nachdem die Hybridome (mehr als etwa 106 Zellen) in die Bauchhöhle der BALG/c-Maus transplantiert
wurden, an welche Maus ein das Immunsystem unterdrückende Mittel,
wie zum Beispiel Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan), verabreicht
wurde. Im Falle eines heterologen Hybridoms (zum Beispiel eines
Hybridoms, das von der Maus und der Ratte stammt) werden nackte
Mäuse und
bestrahlte Mäuse
bevorzugt verwendet.
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Falls
andererseits ein Antikörper
aus dem Überstand
einer Zellkultur gesammelt wird, wird das Hybridom durch ein Kulturverfahren
kultiviert, wie zum Beispiel durch ein Kulturverfahren von hoher
Dichte (high density culture method) und durch das Kulturverfahren
mit gedrehten Flaschen sowie durch das stationäre Kulturverfahren, das zur
Aufrechterhaltung der Zellen verwendet wird, und ein Kultur-Überstand,
der einen Antikörper
enthält,
wird erhalten. Das in der Kulturflüssigkeit enthaltene Serum enthält Verunreinigungen,
wie zum Beispiel andere Antikörper
und Albumin, und diese Verunreinigungen können es schwierig machen, den
Antikörper-Komplex
zu reinigen. Daher ist es wünschenswert,
die Menge des Serums für
die Zugabe zur Kulturflüssigkeit
zu vermindern. Es ist stärker
bevorzugt, ein Hybridom gemäß dem üblichen
Verfahren auf ein serumfreies Medium einzustellen, um das Hybridom
mit einem serumfreien Medium zu kultivieren. Die Kultur mit einem
serumfreien Medium macht es leicht, den Antikörper zu reinigen.
-
Der
monoklonale Antikörper
kann leicht aus der Peritoneal-Flüssigkeit oder aus dem Kulturüberstand mittels
eines gut bekannten Verfahrens gereinigt werden, wie zum Beispiel
mittels der Fraktionierung durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder
Natriumsulfat, mittels der Fraktionierung durch Polyethylenglykol,
mittels der Fraktionierung durch Ethanol, durch die Ionenaustausch-Chromatographie
mit einem DEAE enthaltenden Material, und durch die Gelfiltration,
welche als Verfahren zur Reinigung von Immunglobulinen bekannt sind.
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Falls
der monoklonale Antikörper
ein Maus-IgG-Antikörper
ist, kann dieser einfach durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt
werden, wobei ein Träger
verwendet wird, der Protein A in gebundenem Zustand enthält, oder
ein Träger,
der einen gegen Maus-Immunglobulin
gerichteten Antikörper
in gebundenem Zustand enthält.
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In
der vorliegenden Erfindung wurde ein monoklonaler Antikörper, der
in der Lage ist, umCK spezifisch zu erkennen und zu hemmen, durch
das vorstehende Verfahren unter Verwendung von humanem umCK (Institut
für Zellbiologie,
Lot. Nr. ETH 010122) als Antigen hergestellt. Dieser Antikörper stammt
aus der Maus, gehört
der Antikörperklasse
IgG an, und wurde durch Screening unter dem Gesichtspunkt erhalten,
ob er in der Lage ist, die Enzymaktivität von umCK zu 60% oder mehr,
bevorzugt zu 80% oder mehr, stärker
bevorzugt zu 90% oder mehr, zu hemmen. Das Hybridom, welches den
Antikörper
ergab, wurde hinterlegt bei der International Patent Organism Depositary,
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
(ehemals National Institute of Bioscience and Human Technology,
Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International
Trade and Industry) am 13. März
2002 mit der Hinterlegungsnummer FERN P-18760 und der Antikörper wurde
UI-1881 genannt. Das Hybridom von FERN P-18760 wurde am 24. März 2003
mit der Hinterlegungsnummer FERN BP-8342 von der hauseigenen Hinterlegung
in eine Hinterlegung gemäß dem Budapester
Vertrag überführt. Ein
Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung ist nicht auf das Beispiel beschränkt. Ein Antikörper, der
spezifisch humanes umCK erkennt und in der Lage ist, diese Enzymaktivität spezifisch
zu hemmen, dient als Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung. Ein anti-umCK-Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung kann einzeln oder, falls notwendig, zusammen mit anti-mCK-Antikörpern verwendet
werden, zum Beispiel solchen, die unterschiedliche Erkennungsstellen
aufweisen, wenn sie zur Hemmung der Enzymaktivität von mCK verwendet werden.
Er kann einzeln verwendet werden oder, falls notwendig, zusammen
mit anti-umCK-Antikörpern,
zum Beispiel solchen, die ebenfalls unterschiedliche Erkennungsstellen
aufweisen, wenn sie für
die Hemmung der Enzymaktivität
von umCK verwendet werden.
-
Ein
Antikörper,
der in der Lage ist, die sarkomere mCK (smCK, „anti-smCK-Antikörper") spezifisch zu erkennen
und zu hemmen, kann ebenso für
das Assay-Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Ein Hybridom, welches den monoklonalen
Antikörper
(
JP 22002-270A )
ergab, das im National Institut of Bioscience and Human Technology,
Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International
Trade and Industry am 13. April 2000 mit der Hinterlegungsnummer
FERM BP-7133 hinterlegt wurde, und dessen monoklonaler Antikörper mCKI-578
genannt wurde, kann einzeln oder in einer Kombination als ein Beispiel
eines anti-smCK-Antikörpers
verwendet werden.
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Daher
erlaubt die Verwendung des anti-umCK-Antikörpers und des anti-smCK-Antikörpers einzeln oder
in Kombination die selektive Hemmung der Enzymaktivität von mCK,
umCK oder smCK in einer Probe. Darüber hinaus ermöglicht die
Verwendung dieser Antikörper
zusammen mit einem Antikörper,
der selektiv die Untereinheit CK-M entfernt, die gesonderte Untersuchung
der Enzymaktivitäten
der CK-Isoenzyme (CK-MB, CK-MM, CK-BB und mCK), insbesondere von
umCK und/oder smCK.
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(Verfahren für einen immunologischen Assay)
-
Ein
anti-umCK-Antikörper
und ein anti-smCK-Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung können für das EIA-Verfahren,
das RIA-Verfahren,
für den
immunologischen Agglutinations-Test und alle anderen Verfahren zur
Messung verwendet werden, die unter Verwendung eines Antikörpers möglich sind.
In diesem Fall kann zum Beispiel ein auf einem Träger immobilisierter
Antikörper,
ein Antikörper
zur Markierung, und weitere Reagenzien in geeigneter Weise gemäß dem zu
untersuchenden Gegenstand ausgewählt
und unter optimalen Bedingungen verwendet werden. Zum Beispiel ermöglicht die
Untersuchung mittels eines immunologischen Verfahrens, welches gesondert
einen anti-umCK-Antikörper
und einen anti-smCK-Antikörper verwendet,
die gesonderte Untersuchung von umCK und smCK, deren Unterscheidung
durch Elektrophorese bisher nicht möglich war.
-
(Verfahren zur Untersuchung des Isoenzyms
durch immunologische Hemmung)
-
Das
grundlegende Prinzip eines Verfahrens zur Untersuchung von CK-Isoenzymen
verwendet ein Verfahren zur selektiven Untersuchung der Enzymaktivität eines
CK-Isoenzyms durch die immunologische Hemmung. Im Allgemeinen wird
die CK-MB-Aktivität
durch dieses Verfahren wie folgt untersucht: die CK-MB-Aktivität wird untersucht,
indem die Aktivität
der M-Untereinheit (etwa eine Hälfte
der MB-Aktivität
wird gehemmt), in CK-MM und MB in einer Probe gehemmt wird, wobei
ein Antikörper
verwendet wird, der spezifisch gegen die humane CK-M-Untereinheit
gerichtet ist, gefolgt von einer Verdopplung der verbleibenden Aktivität der B-Untereinheit. Die
CK-MB-Aktivität
wird untersucht, indem die Konzentration von NADPH bestimmt wird,
das aus ATP durch die nach links verlaufende Reaktion von Gleichung
1, durch den Verbrauch des gebildeten ATP durch Hexokinase (HK)
nach Gleichung 2 (oben) und anschließend durch Bildung von NADPH
mit Glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G-6-PDH) nach Gleichung 2
(unten) gebildet wird.
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-
In
dem vorstehenden Verfahren zur Untersuchung von CK-MB können der
anti-CK-M-Antikörper
und der anti-umCK-Antikörper
und/oder der anti-smCK-Antikörper
für die
Behandlung einer Probe zur Untersuchung in einem Schritt verwendet
werden, zum Beispiel durch Zugabe der vorstehenden Antikörper zu
der Enzymlösung
für die
Untersuchung. Es ist ebenso möglich,
die Probe durch Zugabe des anti-umCK-Antikörpers und/oder des anti-smCK-Antikörpers zu
einer Substratlösung
und durch Zugabe des anti-CK-M-Antikörpers zu der Enzymlösung für die Untersuchung
zu behandeln, d. h. in getrennten Schritten. Falls das Isoenzym,
dessen Aktivität
untersucht werden soll, CK-MB ist, ist es einfach, eine Probe mit
dem anti-CK-M-Antikörper
und mit dem anti-mCK-Antikörper
(anti-umCK-Antikörper und/oder
anti-smCK-Antikörper)
in einem Schritt zu behandeln.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Untersuchung
von mCK bereit, das durch die selektive Entfernung der mCK-Enzymaktivität gekennzeichnet
ist, indem eine Probe mit anti-umCK-Antikörper und/oder anti-smCK-Antikörper behandelt
wird. Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur
Untersuchung von umCK oder smCK bereit, das durch selektive Entfernung
einer Enzymaktivität
von umCK oder smCK gekennzeichnet wird, indem eine Probe mit anti-umCK-Antikörper oder
anti-smCK-Antikörper behandelt
wird. In dem Verfahren zur Untersuchung von mCK, umCK oder smCK
gemäß der vorliegenden Erfindung
erlauben die Untersuchung der Aktivität von Kreatin-Kinase einschließlich mCK
in einer Probe und der Aktivität
von Kreatin-Kinase, die von mCK verschieden ist, wobei der vorstehend
erwähnte
anti-umCK-Antikörper und
der anti-smCK-Antikörper
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, sowie die Berechnung einer Differenz
zwischen den erhaltenen beiden Messungen die Bestimmung der jeweiligen
Aktivität von
mCK, umCK oder smCK. In diesem Assay kann die Aktivität der Kreatin-Kinase
einschließlich
mCK in einer Probe und die Aktivität der Kreatin-Kinase, die von
mCK verschieden ist, wobei der vorstehend erwähnte anti-mCK-Antikörper gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet wird, unter Verwendung eines Assay-Reagentien-Satzes
untersucht werden, der einen anti-CK-M-Antikörper enthält, oder unter Verwendung eines
Assay-Reagentien-Satzes,
der ihn nicht enthält,
sofern der für
die zwei Assays verwendete Assay-Reagentien-Satz die gleiche Menge
eines anti-CK-M-Antikörpers
enthält.
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Zum
Beispiel ermöglichen
die Untersuchung der Aktivität
der gesamten Kreatin-Kinasen in einer Probe, die Untersuchung der
Aktivität
in Gegenwart des anti-umCK-Antikörpers
und/oder des anti-smCK-Antikörpers
gemäß der vorliegenden
Erfindung und die Berechnung der Differenz zwischen den beiden Messungen die
Bestimmung der mCK-Aktivität,
insbesondere die Bestimmung der umCK-Aktivität und/oder der smCK-Aktivität.
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Die
Behandlung einer Probe mit anti-CK-M-Antikörper, die Hemmung etwa der
Hälfte
der CK-MM-Aktivität
und der CK-MB-Aktivität,
die Untersuchung der Enzymaktivität von 1/2CK-MB + mCK, um die
Messung A zu ergeben, die Zugabe eines anti-umCK-Antikörpers und/oder
eines anti-smCK-Antikörpers
gemäß der vorliegenden
Erfindung, und die Bestimmung der Enzymaktivität von 1/2CK-MB, um die Messung
B zu ergeben, ermöglichen
eine gleichzeitige, einfache und schnelle Untersuchung der mCK-
oder umCK- oder smCK- sowie der CK-MB-Aktivität unter Verwendung einer einzelnen
Probe. Die Verdopplung der Messung B ermöglicht die Bestimmung der CK-MB-Aktivität, und die
Bestimmung des Unterschieds zwischen der Messung A und der Messung
B ermöglicht
die Untersuchung der mCK- oder
umCK- oder smCK-Aktivität.
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Zum
Beispiel ermöglicht
die getrennte Untersuchung der Aktivität von CK, einschließlich mCK,
und der Aktivität
von CK, die von mCK verschieden ist, in einer Probe und die Bestimmung
des Unterschieds zwischen den zwei erhaltenen Messungen die Bestimmung
der mCK-Aktivität.
Zum Beispiel ermöglichen
die Untersuchung einer jeden Aktivität, wobei der Reagentien-Satz
A und der Reagentien-Satz B wie nachstehend beschrieben verwendet
werden, und die Bestimmung des Unterschieds zwischen den zwei erhaltenen
Messungen die Bestimmung der mCK-Aktivität. Zu dieser Zeit ermöglicht die
Verwendung eines Assay-Reagentien-Satzes für die CK-MB-Aktivität, welcher
Reagentien-Satz den Reagentien-Satz A und den anti-CK-M-Antikörper enthält, die
Untersuchung der mCK-Aktivität sowie
der CK-MB-Aktivität.
Reagentien-Satz
A: Reagentien-Satz zur Untersuchung der gesamten CK-Aktivität einschließlich mCK
in einer Probe
Reagentien-Satz B: Reagentien-Satz zur Untersuchung
der CK-Aktivität,
die von mCK verschieden ist (insbesondere einer umCK- und/oder smCK-Aktivität), in einer
Probe, hergestellt durch Zugabe eines anti-umCK-Antikörpers und/oder
eines anti-smCK-Antikörpers
zu dem Reagentien-Satz A.
-
Darüber hinaus
erlauben die Untersuchung der Aktivität von Kreatin-Kinase, die von
mCK verschieden ist (insbesondere einer umCK- und/oder smCK-Aktivität), in einer
Probe unter Verwendung eines anti-umCK-Antikörpergers und/oder eines anti-smCK-Antikörpers, um
die Messung C zu ergeben, die Untersuchung der Aktivität von CK,
die von mCK, CK-MM und 1/2CK-MB verschieden ist, unter Verwendung
eines anti-CK-M-Antikörpers
und eines anti-umCK-Antikörpers und/oder
eines anti-smCK-Antikörpers,
um die Messung D zu ergeben, und die Bestimmung des Unterschiedes
zwi schen der Messung C und eines Wertes, der durch Verdopplung der
Messung D erhalten wird, die Bestimmung der CK-MM-Aktivität.
-
Es
gibt keine besondere Begrenzung in der Probe, die durch das Verfahren
der vorliegenden Erfindung untersucht wird. Die vorliegende Erfindung
ist auf Verfahren und Proben anwendbar, die üblicherweise auf dem Gebiet
eines klinischen Tests verwendet werden, und in denen CK-Isoenzyme
untersucht werden. Das abnormale Auftreten von mCK unter den aktiven
Fraktionen von CK-Isoenzymen
wurde bei einem kardio-respiratorischen Arrest, bei einer Verletzung,
beim Durchfall kleiner Kinder, bei Krebs, bei Leberzirrhose und
bei einer kongestiven Herzinsuffizienz beobachtet (Kensa to Gijutsu,
Vol. 28, Nr. 13, 1499–1504,
2000). Das Assay-Verfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung ermöglicht
die Diagnose der vorstehenden Krankheiten und den Nachweis des abnormalen
Auftretens von umCK und smCK und die Bestimmung ihrer Verhältnisse,
obwohl umCK und smCK aufgrund ihres ähnlichen Verhaltens in der
Elektrophorese nicht unterschieden werden. Somit liefert das Assay-Verfahren
gemäß der vorliegenden
Erfindung ein Verfahren zum Testen von umCK und/oder smCK, die als
Indices für
die jeweilige Krankheit dienen.
-
Die
vorliegende Erfindung liefert ebenso einen Reagentien-Satz (Kit)
für die
Untersuchung der Aktivität eines
CK-Isoenzyms, das aus Reagenzien besteht, die für das Verfahren zur Untersuchung
der CK-Isoenzyme notwendig sind, das Verfahren zur Untersuchung
von CK-MB, und das Verfahren zur Untersuchung von mCK gemäß der vorliegenden
Erfindung. Der Reagentien-Satz (Kit) zur Untersuchung der Aktivität eines
CK-Isoenzyms gemäß der vorliegenden
Erfindung enthält
einen monoklonalen Antikörper,
der gegen mCK gerichtet ist und die Enzymaktivität hemmt, einzeln oder zusammen
mit einem anderen Bestandteil (mit anderen Bestandteilen).
-
Obwohl
der Reagentien-Satz (Kit) zur Untersuchung der gesamten Aktivität von CK
und/oder der Reagentien-Satz (Kit) zur Untersuchung von CK-MB, der
bzw. die für
die biochemische Diagnose des akuten Herzmuskel-Infarkts verwendet
wird bzw. werden, als ein Teil des Reagentien-Satzes (des Kits)
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden kann, kann ein anderer Reagentien-Satz
ebenso verwendet werden.
-
Beispiele
-
Die
folgenden Beispiele werden nicht gegeben, um den Umfang der vorliegenden
Erfindung zu beschränken,
sondern um die vorliegende Erfindung konkret zu beschreiben.
-
(Beispiel 1)
-
Herstellung
eines Hybridoms, das monoklonale Antikörper (MoAb) produziert
-
(1) Herstellung eines Immunogens (Antigens)
-
Humane
umCK (Institute für
Zellbiologie, Chargen-Nr. ETH 010122) wurde als Antigen für die vorliegende
Erfindung verwendet.
-
(2) Tier für die Immunisierung
-
5
bis 8 Wochen alte, weibliche Inzucht-BALB/c-Mäuse wurden in einem Tierzuchtkäfig gezüchtet, indem
ihnen Standardnahrung gefüttert
wurde, und indem ihnen willkürlich
Wasser angeboten wurde (23 ± 1°C, Feuchtigkeit
70%).
-
(3) Immunisierungsverfahren
-
Gereinigte
humane umCK (Antigen), das unter (1) hergestellt wurde, wurde in
PBS gelöst,
um eine Konzentration von 100 μg/0,5
ml zu ergeben, und die erhaltene Lösung wurde mit dem gleichen
Volumen (0,5 ml) eines vollständigen
Freund'schen Adjuvans' (Difco) gemischt,
um ein homogenes Produkt zu ergeben. Die homogenisierte Antigen-Lösung wurde
in die Bauchhöhle
von vier 5 Wochen alten, weiblichen BALB/c-Mäusen mit einer Dosis von 200 μl pro Maus
verabreicht. Alle zwei Wochen wurde das vorstehende Antigen, das mit
dem Ribi-Adjuvans hergestellt wurde, um eine Konzentration von 100 μg/ml zu ergeben,
viermal an Mäuse mit
einer Dosis von 20 μg
pro Maus verabreicht. Nach einem Monat wurde das vorstehende Antigen,
das mit dem Ribi-Adjuvans hergestellt wurde, um eine Konzentration
von 100 μg/ml
zu ergeben, für
eine weitere Immunisierung verabreicht, und die Antikörper-Titer
der Mäuse
wurden untersucht. Nach 2 Wochen wurde eine Lösung von 100 μg/ml gereinigtem
humanem mCK (Antigen) in PBS an Mäuse verabreicht, um hohe Antikörper-Titer
durch intravenöse
Injektion für
die abschließende
Immunisierung zu ergeben.
-
(4) Assay des Antikörper-Titers
-
Seit
dem Beginn der Immunisierung wurde eine geringe Menge Vollblut in
regelmäßigen Zeitabständen aus
der Netzhaut des Auges der Maus gesammelt, und das Serum wurde getrennt,
und ein Antikörper-Titer
gegen umCK wurde mit Hilfe des Antikörper-Verfahrens für die umCK-Enzymaktivität untersucht.
-
25 μl einer Antikörper-Lösung, die
durch 10–1.000-fache
Verdünnung
des Antiserums von jeder Maus mit PBS erhalten wurde, und 25 μl der umCK-Enzymlösung (200
U/l) wurden zu einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben,
und die Platte wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert, und
100 μl eines Enzym-Reagenz' [100 mM Imidazol,
2 mM EDTA, 10 mM Magnesiumacetat, 2 mM Adenosin-5'-diphosphat (ADP),
5 mM Adenosin-5'-monophosphat (AMP),
40 μM P1,P5-Di(adenosin-5')pentaphosphat (Ap5A), 30 mM 1-Thioglycerin, 28 mM D-Glucose,
2 mM NADP, 3 U/ml HK, 2 U/ml Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, 30 mM
Dinatrium kreatinphosphat, 0,3 mg/ml Nitroblau-Tetrazoliumchlorid,
0,6 U/ml Diapholase, pH 6,6] wurden zur Mikrotiterplatte mit 96
Vertiefungen gegeben, und die Platte wurde bei 37°C für 10 Minuten
inkubiert.
-
Anschließend wurde
die Absorption bei 570 nm gemessen, wobei das reine Reagenz als
Kontrolle diente, mit einem System, dem ein Serum aus einer nicht-immunisierten
Maus anstelle des Serums, das als Negativkontrolle dient, zugegeben
wurde. Tabelle 1
| Immunität | Tag | Maus
Nr. 1 | Maus
Nr. 2 | Maus
Nr. 3 |
| 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 35 | n.
b. | n.
b. | n.
b. |
| 3 | 56 | 7 | 24 | 57 |
| 4 | 91 | 1 | 25 | 37 |
| | 102 | 22 | 34 | 51 |
| 5 | 116 | 35 | 24 | 53 |
| | 129 | 18 | 39 | 48 |
| | 137 | 32 | 37 | 52 |
| 6 | 150 | 25 | 38 | 36 |
| 7 | 167 | 0 | 43 | 41 |
-
Falls
der Antikörper,
welcher die umCK-Enzymaktivität
spezifisch hemmt, im Blut produziert wird, wird die Enzymaktivität von umCK
gehemmt, und die Substratreaktion wird unterdrückt, um die Veränderung
in der Absorption zu vermindern. Das Vorliegen des Antikörpers, der
die umCK-Enzymaktivität
spezifisch hemmt, kann durch die erhaltene Absorption nachgewiesen
werden, so dass die Hemmung der umCK-Enzymaktivität in jeder
Maus nachgewiesen wurde, wie in Tabelle 1 gezeigt.
-
(5) Zellen für die Zellfusion
-
Drei
Tage nach der abschließenden
Immunisierung wurde die Milz aus der BALG/c-Maus entfernt, und die
Milzzellen wurden in EMEM-Medium
suspendiert, um eine Suspension der Milzzellen zu ergeben. Die Milzzellen
wurden viermal mit frischem EMEM-Medium gewaschen, und die Zellzahl
wurde zu 7,0 × 108 bestimmt. Die Myelom-Zelllinie (P3X63-Ag8-653, „X63-Zelle"), die resistent
gegen 8-Azaguanin (2-Amino-6-oxy-8-azapurin) ist und aus der BALG/c-Maus
stammt, wurde als die Eltern-Zelllinie für die Zellfusion verwendet. X63-Zellen
wurden mit RPMI-1640-Medium subkultiviert, (das 8-Azaguanin bei
einer Konzentration von 20 μg/ml
enthält),
und das inaktiviertes fötales
Kälberserum
(FCS) mit einer Konzentration von 10% enthält. Die Zellen wurden mit RPMI-1640-Medium,
das 10% FCS, jedoch kein 8-Azaguanin enthält, während eines Zeitraums von 3
Tagen vor der Zellfusion kultiviert, und die Zellen wurden in einer
logarithmischen Phase für
die Zellfusion verwendet. X63-Zellen wurden dreimal mit RPMI-1640-Medium gewaschen,
und die Zellzahl wurde bestimmt, um zu zeigen, dass die Probe 7 × 107 Zellen enthält.
-
Polyethylenglykol
4000 wurde in RPMI-1640-Medium gelöst, um eine Konzentration von
50% (w/v) zu ergeben, und die vorstehenden Milzzellen und X63-Zellen
wurden miteinander gemischt, um ein Verhältnis der Zellzahlen von 10:1
zu ergeben, und die Zellfusion wurde gemäß dem von Köhler und Milstein beschriebenen Verfahren
(Köhler,
G. J. F. und Milstein, C., Nature 256, 495–497, 1975; Eur. J. Immunol.
6, 511–519,
1976) durchgeführt.
-
Anschließend wurden
die Milzzellen im HAT-Selektionsmedium suspendiert, welches durch
Zugabe von 10% FCS zu RPMI-1640-Medium
hergestellt wurde und 1 × 10–4 M
Hypoxanthin, 4 × 10–7 M Aminopterin und
1,6 × 10–5 M
Thymidin (HAT-Medium) enthält,
um eine Populationsdichte von 2,0 × 106 Zellen/ml
zu ergeben. Als nächstes
wurden Portionen von 50 μl
der Zellsuspension zu jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96
Vertiefungen gegeben, und die erhaltene Platte wurde bei einer Temperatur
von 37°C,
einer relativen Luftfeuchtigkeit von 95%, und einer CO2-Konzentration
von 8% inkubiert. Einen Tag und zwei Tage nach dem Beginn der Inkubation
wurde ein Tropfen des HAT-Selektionsmediums zu jeder Vertiefung
gegeben. Sieben Tage und neun Tage nach dem Beginn der Inkubation
wurden zwei Tropfen des HAT-Selektionsmediums zu jeder Vertiefung
gegeben, und die erhaltene Platte wurde weiter inkubiert. Anschließend wurden
die Zellen in einem Medium, das kein HAT enthält, für etwa 10 Tage bis 2 Wochen
vermehrt, und die vermehrten Hybridome wurden mit einem Selektionsmedium
identifiziert.
-
(6) Screening
-
Unter
den so erhaltenen Hybridomen wird ein Stamm, der einen Antikörper (monoklonaler
Antikörper gegen
humanes umCK) mit einer Fähigkeit,
die Enzymaktivität
von humanem umCK zu hemmen, durch das nachfolgend beschriebene Verfahren
selektiert.
-
Nachdem
25 μl des Überstands
der Hybridomkultur und 25 μl
Enzymlösung
von humaner umCK (200 U/ml) zu einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen
gegeben wurden, und die erhaltene Platte bei Raumtemperatur, für 20 Minuten
inkubiert wurde, und 200 μl
eines Enzym-Reagenz [100 mM Imidazol, 2 mM EDTA, 10 mM Magnesiumacetat,
2 mM Adenosin-5'-diphosphat
(ADP), 5 mM Adenosin-5'-monophosphat (AMP),
40 μM P1,P5-Di(adenosin-5')pentaphosphat (Ap5A), 30 mM 1-Thioglycerin, 28 mM D-Glucose,
2 mM NADP, 3 U/ml HK, 2 U/ml Glucose-6-phosphat-dehydrogenase, 30
mM Dinatriumkreatinphosphat, 0,3 mg/ml Nitroblau-Tetrazoliumchlorid, 0,6
U/ml Diapholase, pH 6,6] zu der Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen
gegeben wurden, wurde die Platte bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurde
die Absorption bei 570 nm gemessen, wobei das reine Reagenz als
Kontrolle diente, mit einem System, zu welchem nur Kulturflüssigkeit
gegeben wurde anstelle des Überstandes
der Hybridomkultur, die als Negativkontrolle diente. Die erhaltene
Absorption erlaubt die Identifizierung eines Hybridoms, das einen
monoklonalen Antikörper
gegen humanes umCK produziert.
-
Das
Screening von 2.496 Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen,
in denen sich das Hybridom vermehrte, erlaubte die Identifizierung
von Hybridomen, die einen monoklonalen Antikörper gegen humanes umCK produzieren,
in 7 Vertiefungen.
-
(Experimentelles Beispiel 1)
-
Spezifität der Enzymhemmung des Kulturüberstandes
-
In
Bezug auf den Kulturüberstand
des Hybridoms der Antikörperproduzierenden
Zellen in 7 Vertiefungen, die durch das vorstehende Screening gefunden
wurden, wurde die jeweilige Hemmung der Enzymaktivität unter
Verwendung von humanem umCK, humanem smCK, humanem CK-MM, humanem
CK-BB oder humanem CK-MB bestimmt, um die Spezifität gegen
humanes CK-Isoenzym zu bestätigen,
wobei der monoklonale Antikörper
mCKI-578 (
JP P2002-270A ),
der von einem Hybridom mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-7133
produziert wurde, als Kontrolle verwendet wurde.
-
Das
Ergebnis ist in 1 gezeigt. Die Überstände der
Klone UI-178, UI-281,
UI-956, UI-1111, UI-1125, UI-1881 und UI-1-1299 hemmten die Enzymaktivität von umCK
zu 82% oder mehr, jedoch hemmten sie die Enzymaktivitäten von
smCK, CK-MM, CK-BB und CK-MB überhaupt
nicht. Der Überstand
von UI-1881 hemmte die Enzym aktivität von umCK zu 94%. Andererseits
hemmte mCKI-578 die Enzymaktivität
von smCK zu 94%, jedoch hemmte der Antikörper die Enzymaktivitäten von
umCK oder anderen Isoenzymen nicht.
-
(Experimentelles Beispiel 2)
-
Etablierung einer Hybridom-Zelllinie,
die monoklonale Antikörper
produziert (Klonierung)
-
Jedes
der Hybridome in den sieben Vertiefungen, die durch das vorstehende
Screening gefunden wurden, wurde durch das Grenzverdünnungs-Verfahren
isoliert, und eine Hybridomzelle, die monoklonale Antikörper produziert
und die Enzymaktivität
von umCK in stabiler Weise hemmt, wurde als ein Klon isoliert, der
beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency
of Industrial Science and Technology, Ministry of International
Trade and Industry mit der Hinterlegungsnummer FERN BP-8342 hinterlegt
wurde.
-
(Experimentelles Beispiel 3)
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Identifizierung der Subklasse des Maus-Immunglobulins
-
Die
Subklasse des Maus-Immunglobulins des monoklonalen Antikörpers (UI-1881),
das von FERN BP-8342-Zellen hergestellt wurde, wurde unter Verwendung
eines Reagentien-Satzes zur MONOAb-Typisierung (Zymed) identifiziert,
und es wurde gefunden, dass UI-1881
ein Immunglobulin G (IgG2b, κ)
darstellt.
-
(Experimentelles Beispiel 4)
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Spezifität von UI-1881 gegenüber humanen
CK-Isoenzymen
-
Um
die Spezifität
von UI-1881 gegenüber
humanen CK-Isoenzymen zu untersuchen, wurde die Hemmung der Enzymaktivitäten mit
humanem umCK, humanem smCK, humanem CK-MM, humanem CK-BB und humanem
CK-MB bestimmt.
mCKI-578 (anti-smCK monoklonaler Antikörper) wurde als eine Kontrolle
untersucht.
-
Die
Ergebnisse werden in den 2 und 3 erläutert. UI-1881
hemmte die Enzymaktivität
von umCK zu etwa 90%, jedoch hemmte sie die Enzymaktivitäten von
smCK, CK-MM, CK-BB oder CK-MB überhaupt
nicht. Andererseits hemmte mCKI-578 die Enzymaktivität von smCK
zu etwa 90%, jedoch hemmte sie die Enzymaktivitäten von smCK, CK-MM, CK-BB
oder CK-MB überhaupt
nicht.
-
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
-
Wie
vorstehend beschrieben hemmten die Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung
spezifisch die Enzym-Aktivität
von umCK, jedoch hemmten sie die Aktivitäten von anderen Isoenzymen
nicht. Andererseits hemmte der anti-smCK-Antikörper spezifisch die Enzymaktivität von smCK,
jedoch hemmte er die Aktivitäten
von anderen Isoenzymen nicht. Die Verwendung dieser Antikörper in
einer Kombination erlaubt die gesonderte Untersuchung von Isoenzymen
in einer Probe. Darüber
hinaus ermöglicht
die gesonderte Untersuchung von umCK und smCK den Nachweis des abnormalen
Auftretens dieser Enzyme und die Bestimmung ihres Verhältnisses.
Die Untersuchung der Beziehung zwischen diesen Daten eines klinischen
Tests und den Krankheiten, welche durch diese Enzyme verursacht
werden, ermöglicht
die Diagnose und die Behandlung solcher Krankheiten in einem frühen Stadium.
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(Beschreibung der Symbole)
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- -O- hemmende Wirkung auf die Enzymaktivität von umCK
- -Δ-
hemmende Wirkung auf die Enzymaktivität von smCK
- -✦- hemmende Wirkung auf die Enzymaktivität von CK-MM
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hemmende Wirkung auf die Enzymaktivität von CK-BB
