JP2003321499A - ミトコンドリアクレアチンキナーゼ抗体 - Google Patents
ミトコンドリアクレアチンキナーゼ抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ユビキタスｍＣＫ（ｕｍＣＫ）活性とサルコメ
リックｍＣＫ（ｓｍＣＫ）活性を区別して測定すること
により、より正確なｍＣＫアイソザイム定量方法ならび
にＣＫアイソザイムの分別定量方法を提供することであ
る。 【解決手段】上記課題は、ｕｍＣＫ蛋白質を特異的に認
識する抗体を用いて測定することにより達成される。さ
らに他の抗ｍＣＫ抗体（例えば抗ｓｍＣＫ抗体）や抗ヒ
トＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いることができる。上記抗体
は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であ
る。このような抗体の例として、ヒトｕｍＣＫを特異的
に認識しうるＩｇＧクラスのモノクローナル抗体であっ
て、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６０で特定されるハ
イブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（Ｕ
１−１８８１）が提供される。
リックｍＣＫ（ｓｍＣＫ）活性を区別して測定すること
により、より正確なｍＣＫアイソザイム定量方法ならび
にＣＫアイソザイムの分別定量方法を提供することであ
る。 【解決手段】上記課題は、ｕｍＣＫ蛋白質を特異的に認
識する抗体を用いて測定することにより達成される。さ
らに他の抗ｍＣＫ抗体（例えば抗ｓｍＣＫ抗体）や抗ヒ
トＣＫ−Ｍ阻害抗体を用いることができる。上記抗体
は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であ
る。このような抗体の例として、ヒトｕｍＣＫを特異的
に認識しうるＩｇＧクラスのモノクローナル抗体であっ
て、寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６０で特定されるハ
イブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（Ｕ
１−１８８１）が提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、臨床検査の分野に
おいて測定されるクレアチンキナーゼ（以下「ＣＫ」と
いう。）アイソザイムの定量方法および測定に使用する
抗体、測定用試薬ならびに測定用試薬キットに関する。
おいて測定されるクレアチンキナーゼ（以下「ＣＫ」と
いう。）アイソザイムの定量方法および測定に使用する
抗体、測定用試薬ならびに測定用試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトのＣＫは遺伝子を異にする４つの蛋
白が存在する。細胞質に由来する２種類の蛋白（局在に
より筋肉型（Ｍ型）と脳型（Ｂ型））ともう一つはミト
コンドリアに由来する蛋白である。細胞質由来のＣＫア
イソザイムはＭ型とＢ型との組み合わせによりなる２量
体で構成され、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの
３種類に分類される。ミトコンドリアＣＫ（ｍＣＫ）は
８量体で極めて安定的に２種存在するが、クレアチン、
Ｍｇ、ＡＤＰおよび硝酸塩の遷移状態類似物質複合体の
存在下では、数分のうちに２量体に加速的に解離する。
また、血液中では時間と共に徐々に２量体になるといわ
れている（Karin Fritz-Wolf et.al.:Nature, 381, 341
-345(1996)）。
白が存在する。細胞質に由来する２種類の蛋白（局在に
より筋肉型（Ｍ型）と脳型（Ｂ型））ともう一つはミト
コンドリアに由来する蛋白である。細胞質由来のＣＫア
イソザイムはＭ型とＢ型との組み合わせによりなる２量
体で構成され、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの
３種類に分類される。ミトコンドリアＣＫ（ｍＣＫ）は
８量体で極めて安定的に２種存在するが、クレアチン、
Ｍｇ、ＡＤＰおよび硝酸塩の遷移状態類似物質複合体の
存在下では、数分のうちに２量体に加速的に解離する。
また、血液中では時間と共に徐々に２量体になるといわ
れている（Karin Fritz-Wolf et.al.:Nature, 381, 341
-345(1996)）。
【０００３】これらアイソザイムの電気泳動の移動度は
陰極側からｍＣＫ（８量体）、ｍＣＫ（２量体）＝ＣＫ
−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの順になる。ｍＣＫ
（２量体）はＣＫ−ＭＭと同じ移動度を示すため保存血
液では電気泳動的にＣＫ−ＭＭとして測定されてしま
う。その他にアイソザイムではないが、免疫グロブリン
が結合したマクロＣＫも存在する。これらは移動度、免
疫向流法などによりザイモグラムから確認することがで
きる。
陰極側からｍＣＫ（８量体）、ｍＣＫ（２量体）＝ＣＫ
−ＭＭ、ＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−ＢＢの順になる。ｍＣＫ
（２量体）はＣＫ−ＭＭと同じ移動度を示すため保存血
液では電気泳動的にＣＫ−ＭＭとして測定されてしま
う。その他にアイソザイムではないが、免疫グロブリン
が結合したマクロＣＫも存在する。これらは移動度、免
疫向流法などによりザイモグラムから確認することがで
きる。
【０００４】臨床検査においてはＣＫ、ＣＫアイソザイ
ムの定量が広く行われている。中でもＣＫ−ＭＢは心筋
梗塞のマーカーとして重要である。ＣＫ−ＭＢの定量は
ＥＩＡ法、免疫阻害法、電気泳動法などにより行われて
いる。ＥＩＡ法はＣＫ−ＭＢだけを特異性高く測定でき
る反面、専用の機器が必要で迅速性に欠ける。電気泳動
法は操作が煩雑で熟練を要する上に、結果を出すまでに
デンシトメーターでＣＫ−ＭＢの存在比率を出す必要が
あり迅速性に欠ける。免疫阻害法は自動分析装置により
迅速簡便に測定ができる利点があるが、特異性に欠ける
欠点を有する。
ムの定量が広く行われている。中でもＣＫ−ＭＢは心筋
梗塞のマーカーとして重要である。ＣＫ−ＭＢの定量は
ＥＩＡ法、免疫阻害法、電気泳動法などにより行われて
いる。ＥＩＡ法はＣＫ−ＭＢだけを特異性高く測定でき
る反面、専用の機器が必要で迅速性に欠ける。電気泳動
法は操作が煩雑で熟練を要する上に、結果を出すまでに
デンシトメーターでＣＫ−ＭＢの存在比率を出す必要が
あり迅速性に欠ける。免疫阻害法は自動分析装置により
迅速簡便に測定ができる利点があるが、特異性に欠ける
欠点を有する。
【０００５】しかし現状では、急性心筋梗塞の早期診断
が求められる為、迅速簡便に測定ができる免疫阻害法が
広く使用されている。この方法は、ＣＫ−Ｍサブユニッ
トに対する特異抗体（以下、「抗ＣＫ−Ｍ抗体」とい
う。）を用いてＣＫ−Ｍサブユニット活性を失活させ、
残存するＣＫ−Ｂサブユニット活性を測定するものであ
る。この方法だと、ＣＫ−ＭＢの他にＣＫ−ＢＢ、ｍＣ
Ｋ（２量体＋８量体）を測定してしまう。この内ＣＫ−
ＢＢは、血中にほとんど存在しないため無視できるし、
ＣＫ−ＢＢが逸脱する疾患としては、脳挫傷や多臓器不
全が挙げられるがその例は多くない。しかし、ｍＣＫは
健常者の血清中でもＣＫ−ＭＢとほぼ同じ活性量含まれ
ており（豊田陽子 他：生物物理化学，41, 244 (199
7)、星野忠 他：生物物理化学，42補冊2, 21 (199
8)）、さらに肝疾患などの細胞壊死、悪性腫瘍などでｍ
ＣＫの逸脱が起こり結果の判定を混乱させる。最近で
は、ロタウイルスによる腸炎、新生児仮死などでｍＣＫ
の逸脱が起こることが報告されている（星野忠 他：臨
床病理,46,総会号，57 (1998)、金光房江 他：臨床病
理, 46, 総会号，56 (1998)）。また、ｍＣＫの存在に
より、酵素阻害法でのＣＫ−ＭＢ測定値に影響を及ぼす
ことも報告されている（第22回千葉県臨床衛生検査学会
抄録6_7（平成13年2月開催））。そこで、ｍＣＫ活性に
対する特異抗体（以下、「抗ｍＣＫ抗体」という。）を
作製し、ＣＫアイソザイムに対し、抗ＣＫ−Ｍ抗体のほ
かに抗ｍＣＫ抗体を作用させてＣＫ−Ｍサブユニット活
性およびｍＣＫ活性を阻害し、より正確なＣＫ−ＭＢを
測定する方法が報告されている（特開2002-270公開公
報）。
が求められる為、迅速簡便に測定ができる免疫阻害法が
広く使用されている。この方法は、ＣＫ−Ｍサブユニッ
トに対する特異抗体（以下、「抗ＣＫ−Ｍ抗体」とい
う。）を用いてＣＫ−Ｍサブユニット活性を失活させ、
残存するＣＫ−Ｂサブユニット活性を測定するものであ
る。この方法だと、ＣＫ−ＭＢの他にＣＫ−ＢＢ、ｍＣ
Ｋ（２量体＋８量体）を測定してしまう。この内ＣＫ−
ＢＢは、血中にほとんど存在しないため無視できるし、
ＣＫ−ＢＢが逸脱する疾患としては、脳挫傷や多臓器不
全が挙げられるがその例は多くない。しかし、ｍＣＫは
健常者の血清中でもＣＫ−ＭＢとほぼ同じ活性量含まれ
ており（豊田陽子 他：生物物理化学，41, 244 (199
7)、星野忠 他：生物物理化学，42補冊2, 21 (199
8)）、さらに肝疾患などの細胞壊死、悪性腫瘍などでｍ
ＣＫの逸脱が起こり結果の判定を混乱させる。最近で
は、ロタウイルスによる腸炎、新生児仮死などでｍＣＫ
の逸脱が起こることが報告されている（星野忠 他：臨
床病理,46,総会号，57 (1998)、金光房江 他：臨床病
理, 46, 総会号，56 (1998)）。また、ｍＣＫの存在に
より、酵素阻害法でのＣＫ−ＭＢ測定値に影響を及ぼす
ことも報告されている（第22回千葉県臨床衛生検査学会
抄録6_7（平成13年2月開催））。そこで、ｍＣＫ活性に
対する特異抗体（以下、「抗ｍＣＫ抗体」という。）を
作製し、ＣＫアイソザイムに対し、抗ＣＫ−Ｍ抗体のほ
かに抗ｍＣＫ抗体を作用させてＣＫ−Ｍサブユニット活
性およびｍＣＫ活性を阻害し、より正確なＣＫ−ＭＢを
測定する方法が報告されている（特開2002-270公開公
報）。
【０００６】このｍＣＫには偏在型のユビキタス(ubiqu
itous)型ｍＣＫ（ｕｍＣＫ）とサルコメリック(sarcome
ric)型ｍＣＫ（ｓｍＣＫ）のアイソフォームがあり、ｍ
ＣＫの遺伝子解析によればヒトのｍＣＫとＣＫ−Ｍおよ
びＣＫ−Ｂとのアミノ酸配列の相同性は62〜66％、ｕｍ
ＣＫとｓｍＣＫとの間には80％の相同性があることが報
告されている（J. Biol. Chem. 265:6921-6927 (199
8)）。さらに、ｕｍＣＫとｓｍＣＫを分離して各性状を
調べた結果、ｕｍＣＫとｓｍＣＫは各々２量体と８量体
を形成し、ｐＩがわずかに異なってること、８量体では
おのおの抗原性において大差がなく２量体とは識別され
たことが報告されている（金光房江 他：臨床病理,47,
総会号, 306 (1999)）。
itous)型ｍＣＫ（ｕｍＣＫ）とサルコメリック(sarcome
ric)型ｍＣＫ（ｓｍＣＫ）のアイソフォームがあり、ｍ
ＣＫの遺伝子解析によればヒトのｍＣＫとＣＫ−Ｍおよ
びＣＫ−Ｂとのアミノ酸配列の相同性は62〜66％、ｕｍ
ＣＫとｓｍＣＫとの間には80％の相同性があることが報
告されている（J. Biol. Chem. 265:6921-6927 (199
8)）。さらに、ｕｍＣＫとｓｍＣＫを分離して各性状を
調べた結果、ｕｍＣＫとｓｍＣＫは各々２量体と８量体
を形成し、ｐＩがわずかに異なってること、８量体では
おのおの抗原性において大差がなく２量体とは識別され
たことが報告されている（金光房江 他：臨床病理,47,
総会号, 306 (1999)）。
【０００７】ｍＣＫの逸脱と疾患との関係は上記説明し
たように数多く報告されているが、ｍＣＫの測定はアガ
ロースゲル電気泳動法が一般的に行われているため、ｕ
ｍＣＫとｓｍＣＫではほとんど同じ挙動を示すことか
ら、両者は区別することなく報告されてきた。抗ｓｍＣ
Ｋ活性を有する抗体は報告されているものの（特開2002
-270公開公報）、抗ｕｍＣＫ抗体についての報告はな
く、両者を容易に区別して解析することが困難であっ
た。
たように数多く報告されているが、ｍＣＫの測定はアガ
ロースゲル電気泳動法が一般的に行われているため、ｕ
ｍＣＫとｓｍＣＫではほとんど同じ挙動を示すことか
ら、両者は区別することなく報告されてきた。抗ｓｍＣ
Ｋ活性を有する抗体は報告されているものの（特開2002
-270公開公報）、抗ｕｍＣＫ抗体についての報告はな
く、両者を容易に区別して解析することが困難であっ
た。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ｕｍ
ＣＫ活性とｓｍＣＫ活性を区別して測定することで、よ
り正確なｍＣＫアイソザイム定量方法ならびにＣＫアイ
ソザイムの分別定量方法を提供することである。さらに
該測定方法に使用可能な各種ｍＣＫ抗体、特にｕｍＣＫ
活性を特異的に阻害する抗体を提供することである。
ＣＫ活性とｓｍＣＫ活性を区別して測定することで、よ
り正確なｍＣＫアイソザイム定量方法ならびにＣＫアイ
ソザイムの分別定量方法を提供することである。さらに
該測定方法に使用可能な各種ｍＣＫ抗体、特にｕｍＣＫ
活性を特異的に阻害する抗体を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記の課題を達成するた
めに検討した結果、正常ヒトｍＣＫアイソザイムのうち
大多数がｕｍＣＫであることが推察されたので、ｕｍＣ
Ｋ活性を特異的に阻害する抗体が得られればｕｍＣＫと
ｓｍＣＫを区別して測定することが容易となると考えら
れた。そこで、本研究者らは鋭意研究を重ねた結果、ｕ
ｍＣＫ活性を特異的に阻害する抗体の作製に成功し、本
発明を完成させるに至った。
めに検討した結果、正常ヒトｍＣＫアイソザイムのうち
大多数がｕｍＣＫであることが推察されたので、ｕｍＣ
Ｋ活性を特異的に阻害する抗体が得られればｕｍＣＫと
ｓｍＣＫを区別して測定することが容易となると考えら
れた。そこで、本研究者らは鋭意研究を重ねた結果、ｕ
ｍＣＫ活性を特異的に阻害する抗体の作製に成功し、本
発明を完成させるに至った。
【００１０】すなわち、本発明は、
１．ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼ（ｍＣＫ）
アイソザイムのうちユビキタスｍＣＫ（ｕｍＣＫ）活性
を阻害する抗ｍＣＫ抗体、 ２．ｕｍＣＫ活性を少なくとも６０％阻害する前項１に
記載に記載の抗体、 ３．クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの分別定
量において、単独または他の抗ｍＣＫ抗体と併用して用
いた場合に、実質的にｍＣＫアイソザイム以外のＣＫア
イソザイムの測定に影響が無い程度にまでｍＣＫ活性を
阻害する能力を有する前項１または２に記載の抗体、 ４．モノクローナル抗体であることを特徴とする前項１
〜３のいずれか１に記載の抗体、 ５．受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６０号により寄託さ
れたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体、 ６．受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６０号により寄託さ
れたハイブリドーマ、 ７．前項１〜５のいずれか１に記載の抗ｍＣＫ抗体を用
いてｍＣＫ量を測定する免疫測定方法、 ８．ｍＣＫアイソザイムのうちサルコメリックｍＣＫ
（ｓｍＣＫ）活性を阻害する抗ｍＣＫ抗体を用いてｍＣ
Ｋ量を測定する免疫測定方法、 ９．ｍＣＫ量がｕｍＣＫ量および／またはｓｍＣＫ量で
ある前項７または８に記載の免疫測定方法、 １０．前項１〜５のいずれか１に記載の抗体で試料を処
理し、ｍＣＫ活性を選択的に排除させる工程を含むＣＫ
アイソザイムの分別定量法、 １１．ｓｍＣＫ活性を阻害する抗体単独で処理し、また
は該抗ｍＣＫ抗体と前項１〜５のいずれか１に記載の抗
体を併用して処理して、ｍＣＫ活性を選択的に排除させ
る工程を含むＣＫアイソザイムの分別定量法、 １２．抗体処理前に試料中のＣＫ活性を測定し、その後
ｕｍＣＫ活性を阻害する抗ｍＣＫ抗体、ｓｍＣＫ活性を
阻害する抗ｍＣＫ抗体、抗ＣＫ−Ｍサブユニット抗体の
いずれか１または２以上を組み合わせて処理し、残存活
性を測定することを特徴とする、前項１０または１１に
記載のＣＫアイソザイムの分別定量法、 １３．ＣＫ−Ｍサブユニットに対する抗体で試料を処理
し、ＣＫ−Ｍ活性を選択的に排除させる工程を含む前項
１０〜１２のいずれか１に記載のＣＫアイソザイムの分
別定量法、 １４．ＣＫ−Ｍ活性およびｍＣＫ活性の選択的排除のた
めの処理を一つの工程で同時に行うことを特徴とする前
項１３に記載のＣＫアイソザイムの分別定量法、 １５．ＣＫ−Ｍ活性およびｍＣＫ活性の選択的排除のた
めの処理を二以上の工程で異時に行うことを特徴とする
前項１３に記載のＣＫアイソザイムの分別定量法、 １６．まずＣＫ−Ｍサブユニットに対する抗体を作用さ
せて残存ＣＫ活性を測定する工程、ついで抗ｕｍＣＫ抗
体および／または抗ｓｍＣＫ抗体を作用させて残存ＣＫ
活性を測定する工程を含む前項１５に記載のＣＫ−ＭＢ
活性およびｍＣＫ活性の分別定量法、 １７．前項１０〜１６のいずれか１に記載のＣＫアイソ
ザイムの分別定量方法により得られた測定値から全身疾
患との関連付けを行うことを特徴とするＣＫアイソザイ
ムの検査方法、 １８．前項７〜１７のいずれか１に記載のＣＫアイソザ
イム活性測定方法に必要な測定用試薬をキット化または
単品で構成されてなるＣＫアイソザイム測定用試薬、か
らなる。
アイソザイムのうちユビキタスｍＣＫ（ｕｍＣＫ）活性
を阻害する抗ｍＣＫ抗体、 ２．ｕｍＣＫ活性を少なくとも６０％阻害する前項１に
記載に記載の抗体、 ３．クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザイムの分別定
量において、単独または他の抗ｍＣＫ抗体と併用して用
いた場合に、実質的にｍＣＫアイソザイム以外のＣＫア
イソザイムの測定に影響が無い程度にまでｍＣＫ活性を
阻害する能力を有する前項１または２に記載の抗体、 ４．モノクローナル抗体であることを特徴とする前項１
〜３のいずれか１に記載の抗体、 ５．受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６０号により寄託さ
れたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体、 ６．受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６０号により寄託さ
れたハイブリドーマ、 ７．前項１〜５のいずれか１に記載の抗ｍＣＫ抗体を用
いてｍＣＫ量を測定する免疫測定方法、 ８．ｍＣＫアイソザイムのうちサルコメリックｍＣＫ
（ｓｍＣＫ）活性を阻害する抗ｍＣＫ抗体を用いてｍＣ
Ｋ量を測定する免疫測定方法、 ９．ｍＣＫ量がｕｍＣＫ量および／またはｓｍＣＫ量で
ある前項７または８に記載の免疫測定方法、 １０．前項１〜５のいずれか１に記載の抗体で試料を処
理し、ｍＣＫ活性を選択的に排除させる工程を含むＣＫ
アイソザイムの分別定量法、 １１．ｓｍＣＫ活性を阻害する抗体単独で処理し、また
は該抗ｍＣＫ抗体と前項１〜５のいずれか１に記載の抗
体を併用して処理して、ｍＣＫ活性を選択的に排除させ
る工程を含むＣＫアイソザイムの分別定量法、 １２．抗体処理前に試料中のＣＫ活性を測定し、その後
ｕｍＣＫ活性を阻害する抗ｍＣＫ抗体、ｓｍＣＫ活性を
阻害する抗ｍＣＫ抗体、抗ＣＫ−Ｍサブユニット抗体の
いずれか１または２以上を組み合わせて処理し、残存活
性を測定することを特徴とする、前項１０または１１に
記載のＣＫアイソザイムの分別定量法、 １３．ＣＫ−Ｍサブユニットに対する抗体で試料を処理
し、ＣＫ−Ｍ活性を選択的に排除させる工程を含む前項
１０〜１２のいずれか１に記載のＣＫアイソザイムの分
別定量法、 １４．ＣＫ−Ｍ活性およびｍＣＫ活性の選択的排除のた
めの処理を一つの工程で同時に行うことを特徴とする前
項１３に記載のＣＫアイソザイムの分別定量法、 １５．ＣＫ−Ｍ活性およびｍＣＫ活性の選択的排除のた
めの処理を二以上の工程で異時に行うことを特徴とする
前項１３に記載のＣＫアイソザイムの分別定量法、 １６．まずＣＫ−Ｍサブユニットに対する抗体を作用さ
せて残存ＣＫ活性を測定する工程、ついで抗ｕｍＣＫ抗
体および／または抗ｓｍＣＫ抗体を作用させて残存ＣＫ
活性を測定する工程を含む前項１５に記載のＣＫ−ＭＢ
活性およびｍＣＫ活性の分別定量法、 １７．前項１０〜１６のいずれか１に記載のＣＫアイソ
ザイムの分別定量方法により得られた測定値から全身疾
患との関連付けを行うことを特徴とするＣＫアイソザイ
ムの検査方法、 １８．前項７〜１７のいずれか１に記載のＣＫアイソザ
イム活性測定方法に必要な測定用試薬をキット化または
単品で構成されてなるＣＫアイソザイム測定用試薬、か
らなる。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明において、ｍＣＫ活性と
は、ｕｍＣＫ活性および／若しくはｓｍＣＫ活性、また
はこれらの活性を含むｍＣＫ活性の総称をいう。本発明
の抗ｍＣＫ抗体とはｍＣＫ活性を阻害する抗体をいう。
ｓｍＣＫ活性を阻害する抗体とは、ｓｍＣＫ型蛋白質を
特異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害する
抗体をいう。同様にｕｍＣＫ抗活性を阻害する抗体と
は、ｕｍＣＫ型蛋白質を特異的に認識し、且つその酵素
活性を特異的に阻害する抗体をいう。本発明のＣＫアイ
ソザイムの分別定量法において使用する抗体は、実質的
にｍＣＫ以外のＣＫアイソザイムの測定に影響が無い程
度にまでｍＣＫ活性を阻害できる抗体であればよい。ｍ
ＣＫは多くの場合、試料中に５〜２０Ｕ／Ｌ含まれ、こ
れらの８０％以上のｍＣＫ阻害能を有すれば臨床検査上
問題なく使用可能である。ｕｍＣＫ抗活性を阻害する抗
体（以下、「抗ｕｍＣＫ抗体」という。）単独ではｍＣ
Ｋ阻害能が低くとも、例えばｓｍＣＫ活性を阻害する抗
体や他の抗体を複数組み合わせ、またはｍＣＫを阻害し
うる化合物と共に使用することにより、実質的に８０％
以上のｍＣＫ阻害効果を得ることができればよい。本発
明の抗ｕｍＣＫ抗は、ｕｍＣＫ活性を６０％以上、好ま
しくは７０％以上、より好ましくは９０％以上阻害する
抗体であれば良い。
は、ｕｍＣＫ活性および／若しくはｓｍＣＫ活性、また
はこれらの活性を含むｍＣＫ活性の総称をいう。本発明
の抗ｍＣＫ抗体とはｍＣＫ活性を阻害する抗体をいう。
ｓｍＣＫ活性を阻害する抗体とは、ｓｍＣＫ型蛋白質を
特異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害する
抗体をいう。同様にｕｍＣＫ抗活性を阻害する抗体と
は、ｕｍＣＫ型蛋白質を特異的に認識し、且つその酵素
活性を特異的に阻害する抗体をいう。本発明のＣＫアイ
ソザイムの分別定量法において使用する抗体は、実質的
にｍＣＫ以外のＣＫアイソザイムの測定に影響が無い程
度にまでｍＣＫ活性を阻害できる抗体であればよい。ｍ
ＣＫは多くの場合、試料中に５〜２０Ｕ／Ｌ含まれ、こ
れらの８０％以上のｍＣＫ阻害能を有すれば臨床検査上
問題なく使用可能である。ｕｍＣＫ抗活性を阻害する抗
体（以下、「抗ｕｍＣＫ抗体」という。）単独ではｍＣ
Ｋ阻害能が低くとも、例えばｓｍＣＫ活性を阻害する抗
体や他の抗体を複数組み合わせ、またはｍＣＫを阻害し
うる化合物と共に使用することにより、実質的に８０％
以上のｍＣＫ阻害効果を得ることができればよい。本発
明の抗ｕｍＣＫ抗は、ｕｍＣＫ活性を６０％以上、好ま
しくは７０％以上、より好ましくは９０％以上阻害する
抗体であれば良い。
【００１２】また本発明の抗体は、ポリクローナル抗体
またはモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノク
ローナル抗体であることが好ましい。
またはモノクローナル抗体のいずれでもよいが、モノク
ローナル抗体であることが好ましい。
【００１３】（抗体の作製）本発明の抗体は、マウス由
来に限るものではなく、ラット、ハムスター、ウサギ、
ヤギ、ウマなどが例示されるが、好ましくはマウスであ
る。抗体はＩｇＧに限定されるものではなく、ＩｇＭな
どでもよい。
来に限るものではなく、ラット、ハムスター、ウサギ、
ヤギ、ウマなどが例示されるが、好ましくはマウスであ
る。抗体はＩｇＧに限定されるものではなく、ＩｇＭな
どでもよい。
【００１４】本発明の抗体は、従来公知の免疫学的手法
により、例えば抗原としてｕｍＣＫ蛋白質を用い、好ま
しくはアジュバントと共に哺乳類に免疫し、免疫した動
物の血清などから得ることができる。また、モノクロー
ナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマは、免疫した動物由来のＢリンパ球と各種骨髄
腫細胞とを融合することにより、具体的には以下に記載
する方法で作製することができる。
により、例えば抗原としてｕｍＣＫ蛋白質を用い、好ま
しくはアジュバントと共に哺乳類に免疫し、免疫した動
物の血清などから得ることができる。また、モノクロー
ナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマは、免疫した動物由来のＢリンパ球と各種骨髄
腫細胞とを融合することにより、具体的には以下に記載
する方法で作製することができる。
【００１５】（抗体作製に使用する抗原）本発明におい
て、例えばｕｍＣＫに対して特異的に親和性を有し且つ
その酵素活性を阻害する抗体の作製に使用する抗原は、
ヒトまたは哺乳類のｕｍＣＫが一般的に使用される。特
異性を高めるために、目的とする測定対象物の由来と種
特異的な抗原を用いることが好ましい。具体的にはヒト
ｕｍＣＫに対して特異的に親和性を有し、且つその酵素
活性を特異的に阻害する抗体を得る場合は、ヒトｕｍＣ
Ｋを抗原として用いるのが好ましい。ｕｍＣＫ抗原は、
生体組織などから精製して得ることができ、また遺伝子
工学的手法によっても得ることができる。市販の抗原と
して、例えばインスティチュートオブセルバイオロジー
（Instituteof Cell Biology：Swiss Federal Institut
e of Techonology (ETH)）製のものが使用される。
て、例えばｕｍＣＫに対して特異的に親和性を有し且つ
その酵素活性を阻害する抗体の作製に使用する抗原は、
ヒトまたは哺乳類のｕｍＣＫが一般的に使用される。特
異性を高めるために、目的とする測定対象物の由来と種
特異的な抗原を用いることが好ましい。具体的にはヒト
ｕｍＣＫに対して特異的に親和性を有し、且つその酵素
活性を特異的に阻害する抗体を得る場合は、ヒトｕｍＣ
Ｋを抗原として用いるのが好ましい。ｕｍＣＫ抗原は、
生体組織などから精製して得ることができ、また遺伝子
工学的手法によっても得ることができる。市販の抗原と
して、例えばインスティチュートオブセルバイオロジー
（Instituteof Cell Biology：Swiss Federal Institut
e of Techonology (ETH)）製のものが使用される。
【００１６】（免疫方法）精製ｕｍＣＫ蛋白質、または
そのアミノ酸配列に基づき遺伝子工学的手法により発現
させたｕｍＣＫ蛋白質やその部分ペプチドを、リン酸緩
衝液（ＰＢＳ）などの適当な緩衝液中に溶解あるいは懸
濁したものを抗原液として使用する。抗原液は通常抗原
物質を50〜500μg/mL程度含む濃度に調製すればよい。
また、ペプチド抗原など、それだけでは抗原性が低い場
合は、アルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）などの適当なキャリアータンパク質に架橋し
て用いることができる。当該抗原で免疫感作する動物
は、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギ
などが例示される。好ましくはマウス、より好ましくは
BALB/cマウスである。
そのアミノ酸配列に基づき遺伝子工学的手法により発現
させたｕｍＣＫ蛋白質やその部分ペプチドを、リン酸緩
衝液（ＰＢＳ）などの適当な緩衝液中に溶解あるいは懸
濁したものを抗原液として使用する。抗原液は通常抗原
物質を50〜500μg/mL程度含む濃度に調製すればよい。
また、ペプチド抗原など、それだけでは抗原性が低い場
合は、アルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン
（ＫＬＨ）などの適当なキャリアータンパク質に架橋し
て用いることができる。当該抗原で免疫感作する動物
は、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ヤギ、ウサギ
などが例示される。好ましくはマウス、より好ましくは
BALB/cマウスである。
【００１７】このとき、被免疫動物の抗原への応答性を
高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投
与することができる。ここで使用可能なアジュバント
は、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイン
ト不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ribi（ＭＰＬ）、Ri
bi（ＴＤＭ）、Ribi（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）。百日咳ワクチ
ン（Boredetella pertussis vaccine）、ムラミルジペ
プチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵ
Ｍ）、およびこれらの組合せが例示されるが、初回免疫
時にＦＣＡ、追加免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉアジュバン
トを使用する組合せが特に好ましい。
高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投
与することができる。ここで使用可能なアジュバント
は、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイン
ト不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ribi（ＭＰＬ）、Ri
bi（ＴＤＭ）、Ribi（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）。百日咳ワクチ
ン（Boredetella pertussis vaccine）、ムラミルジペ
プチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵ
Ｍ）、およびこれらの組合せが例示されるが、初回免疫
時にＦＣＡ、追加免疫時にＦＩＡやＲｉｂｉアジュバン
トを使用する組合せが特に好ましい。
【００１８】免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュ
バント混合の有無などにより、注射部位、スケジュール
などを適宜変化させることができるが、例えば、被免疫
動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗
原液0.05〜１ｍＬ（抗原物質10〜200μｇ）を腹腔内、
皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回免疫か
ら約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約
１〜４週間後に最終免疫を行う。抗原量を多くして腹腔
内注射することで、当該抗原溶液をアジュバントを使用
せずに投与することもできる。抗体価は追加免疫の約５
〜１０日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の
抗体価アッセイに準じ、通常行われる方法で行うことが
できる。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物から脾
細胞を分離して抗体産生細胞を得る。
バント混合の有無などにより、注射部位、スケジュール
などを適宜変化させることができるが、例えば、被免疫
動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗
原液0.05〜１ｍＬ（抗原物質10〜200μｇ）を腹腔内、
皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回免疫か
ら約４〜２１日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約
１〜４週間後に最終免疫を行う。抗原量を多くして腹腔
内注射することで、当該抗原溶液をアジュバントを使用
せずに投与することもできる。抗体価は追加免疫の約５
〜１０日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の
抗体価アッセイに準じ、通常行われる方法で行うことが
できる。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物から脾
細胞を分離して抗体産生細胞を得る。
【００１９】（モノクローナル抗体の作製）モノクロー
ナル抗体（以下「ＭｏＡｂ」という。）は、例えばケー
ラーとミルシュタインの方法（Kohler and Milstein, N
ature 256, 495-497, 1975）にしたがって作製すること
ができる。骨髄腫細胞として、マウス、ラット、ヒトな
ど由来のものが使用され、例えばマウスミエローマP3X6
3-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3X63-
Ag8・653などの株化骨髄腫細胞が例示される。骨髄腫細
胞には免疫グロブリン軽鎖を産生しているものがあり、
これを融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生す
る免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダムに結合す
ることがあるので、特に免疫グロブリン軽鎖を産生しな
い骨髄腫細胞、例えばP3X63-Ag8・653やSP2/o-Ag14など
を用いることが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
は、同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ま
しい。骨髄腫細胞の保存方法は自体公知の手法に従って
行えばよく、例えばウマ、ウサギもしくはウシ胎児血清
を添加した一般的な培地で継代培養したものについて凍
結により保存される。また細胞融合には対数増殖期の細
胞を用いるのが好ましい。
ナル抗体（以下「ＭｏＡｂ」という。）は、例えばケー
ラーとミルシュタインの方法（Kohler and Milstein, N
ature 256, 495-497, 1975）にしたがって作製すること
ができる。骨髄腫細胞として、マウス、ラット、ヒトな
ど由来のものが使用され、例えばマウスミエローマP3X6
3-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-Ag4、SP2/o-Ag14、P3X63-
Ag8・653などの株化骨髄腫細胞が例示される。骨髄腫細
胞には免疫グロブリン軽鎖を産生しているものがあり、
これを融合対象として用いると、抗体産生細胞が産生す
る免疫グロブリン重鎖とこの軽鎖とがランダムに結合す
ることがあるので、特に免疫グロブリン軽鎖を産生しな
い骨髄腫細胞、例えばP3X63-Ag8・653やSP2/o-Ag14など
を用いることが好ましい。抗体産生細胞と骨髄腫細胞と
は、同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ま
しい。骨髄腫細胞の保存方法は自体公知の手法に従って
行えばよく、例えばウマ、ウサギもしくはウシ胎児血清
を添加した一般的な培地で継代培養したものについて凍
結により保存される。また細胞融合には対数増殖期の細
胞を用いるのが好ましい。
【００２０】抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させて
ハイブリドーマを作製する方法は、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用い
る方法、電気融合装置を用いる方法などが例示される。
例えばＰＥＧ法の場合、約30〜60％のＰＥＧ（平均分子
量1,000〜6,000）を含む適当な培地または緩衝液中に脾
細胞と骨髄腫細胞を1〜10：1、好ましくは5〜10：1の混
合比で懸濁し、温度約25〜37℃、pH6〜8の条件下で、約
30秒〜3分間程度反応させればよい。反応終了後、細胞
を洗浄しＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、マイクロ
タイタープレート中に播種して培養を続ける。
ハイブリドーマを作製する方法は、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用い
る方法、電気融合装置を用いる方法などが例示される。
例えばＰＥＧ法の場合、約30〜60％のＰＥＧ（平均分子
量1,000〜6,000）を含む適当な培地または緩衝液中に脾
細胞と骨髄腫細胞を1〜10：1、好ましくは5〜10：1の混
合比で懸濁し、温度約25〜37℃、pH6〜8の条件下で、約
30秒〜3分間程度反応させればよい。反応終了後、細胞
を洗浄しＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、マイクロ
タイタープレート中に播種して培養を続ける。
【００２１】融合操作後の細胞は選択培地で培養して、
ハイブリドーマの選択を行う。選択培地は、親細胞株を
死滅させ、融合細胞のみが増殖しえる培地であり、通常
ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）
培地が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合
操作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を
選択培地と交換し、さらに２、３日毎に同様の培地交換
を繰り返しながら培養することにより行う。顕微鏡観察
によりハイブリドーマのコロニーが生育しているウエル
を確認する。
ハイブリドーマの選択を行う。選択培地は、親細胞株を
死滅させ、融合細胞のみが増殖しえる培地であり、通常
ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）
培地が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合
操作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を
選択培地と交換し、さらに２、３日毎に同様の培地交換
を繰り返しながら培養することにより行う。顕微鏡観察
によりハイブリドーマのコロニーが生育しているウエル
を確認する。
【００２２】生育しているハイブリドーマが所望の抗体
を産生しているかどうかを知るには、培養上清を採取し
て抗体価アッセイを自体公知の方法により行えばよい。
例えば固相化した抗原タンパク質に段階希釈した該上清
を加えて反応させ、さらに蛍光物質、酵素、もしくは放
射性同位体（ＲＩ）などで標識した二次抗体（抗グロブ
リン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体など）を反応さ
せれば、該上清中に産生されている抗体を検出すること
ができ、また抗体価を測定することができる。抗原が酵
素などの場合は、その酵素と該上清とを反応させた後、
適当な基質を反応させて酵素阻害活性の有無により、抗
体の検出および抗体価の測定を行うことができる。この
ように各ウエルの培養上清をスクリーニングし、適切な
抗体を産生しているハイブリドーマを得る。
を産生しているかどうかを知るには、培養上清を採取し
て抗体価アッセイを自体公知の方法により行えばよい。
例えば固相化した抗原タンパク質に段階希釈した該上清
を加えて反応させ、さらに蛍光物質、酵素、もしくは放
射性同位体（ＲＩ）などで標識した二次抗体（抗グロブ
リン抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ＩｇＭ抗体など）を反応さ
せれば、該上清中に産生されている抗体を検出すること
ができ、また抗体価を測定することができる。抗原が酵
素などの場合は、その酵素と該上清とを反応させた後、
適当な基質を反応させて酵素阻害活性の有無により、抗
体の検出および抗体価の測定を行うことができる。この
ように各ウエルの培養上清をスクリーニングし、適切な
抗体を産生しているハイブリドーマを得る。
【００２３】さらに限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セ
ルソーターを用いた方法などにより単一クローンを分離
する。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマのコロ
ニーを１細胞／ウエル前後となるように培地で段階希釈
して培養することにより目的とする抗体を産生するハイ
ブリドーマクローンを単離することができる。得られた
抗体産生ハイブリドーマクローンは、約10％（v/v）ジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）あるいはグリセリンな
どの凍結保護剤の共存下に凍結させて、-70〜-196℃で
保存すると、約半年〜半永久的に保存可能である。細胞
は用時37℃前後の恒温槽中で急速に融解して使用する。
凍結保護剤の細胞毒性が残存しないようによく洗浄して
から使用するのが望ましい。
ルソーターを用いた方法などにより単一クローンを分離
する。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマのコロ
ニーを１細胞／ウエル前後となるように培地で段階希釈
して培養することにより目的とする抗体を産生するハイ
ブリドーマクローンを単離することができる。得られた
抗体産生ハイブリドーマクローンは、約10％（v/v）ジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）あるいはグリセリンな
どの凍結保護剤の共存下に凍結させて、-70〜-196℃で
保存すると、約半年〜半永久的に保存可能である。細胞
は用時37℃前後の恒温槽中で急速に融解して使用する。
凍結保護剤の細胞毒性が残存しないようによく洗浄して
から使用するのが望ましい。
【００２４】ハイブリドーマが産生する抗体の免疫グロ
ブリンサブクラスを調べるためには、該ハイブリドーマ
を一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された
抗体を市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなど
を用いて分析することにより知ることができる。
ブリンサブクラスを調べるためには、該ハイブリドーマ
を一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された
抗体を市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなど
を用いて分析することにより知ることができる。
【００２５】ハイブリドーマからのＭｏＡｂの取得方法
は、必要量やハイブリドーマの性状などによって適宜選
択することができる。例えば、該ハイブリドーマを移植
したマウス腹水から取得する方法、細胞培養により培養
上清から取得する方法などが例示される。マウス腹腔内
で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数mg/m
Lの高濃度のＭｏＡｂを得ることができる。インビボで
増殖できないハイブリドーマは細胞培養の培養上清から
取得する。細胞培養によるＭｏＡｂの取得は、抗体産生
量はインビボより低いが、マウス腹腔内に含まれる免疫
グロブリンや他の夾雑物質の混入が少なく、精製が容易
であるという利点がある。
は、必要量やハイブリドーマの性状などによって適宜選
択することができる。例えば、該ハイブリドーマを移植
したマウス腹水から取得する方法、細胞培養により培養
上清から取得する方法などが例示される。マウス腹腔内
で増殖可能なハイブリドーマであれば、腹水から数mg/m
Lの高濃度のＭｏＡｂを得ることができる。インビボで
増殖できないハイブリドーマは細胞培養の培養上清から
取得する。細胞培養によるＭｏＡｂの取得は、抗体産生
量はインビボより低いが、マウス腹腔内に含まれる免疫
グロブリンや他の夾雑物質の混入が少なく、精製が容易
であるという利点がある。
【００２６】抗体をハイブリドーマを移植したマウス腹
腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（2,
6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン）などの免疫抑制
作用を有する物質を投与したBALB/cマウスの腹腔内へハ
イブリドーマ（約106個以上）を移植し、約１〜３週間
後に貯留した腹水を採取する。異種ハイブリドーマ（例
えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射
線処理マウスを使用することが好ましい。
腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（2,
6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン）などの免疫抑制
作用を有する物質を投与したBALB/cマウスの腹腔内へハ
イブリドーマ（約106個以上）を移植し、約１〜３週間
後に貯留した腹水を採取する。異種ハイブリドーマ（例
えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射
線処理マウスを使用することが好ましい。
【００２７】一方、細胞培養上清から抗体を取得する場
合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、
高密度培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法な
どの培養法を用い、当該ハイブリドーマを培養し抗体を
含有する培養上清を得る。培養液に含まれる血清は、他
の抗体やアルブミンなどの夾雑物が含まれ、抗体精製が
煩雑になることが多いので、培養液への添加は少なくす
ることが望ましい。さらに好ましくは、ハイブリドーマ
を常法により無血清培地に馴化させ、無血清培地を用い
て培養することである。無血清培地で培養することによ
り、抗体精製が容易になる。
合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、
高密度培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法な
どの培養法を用い、当該ハイブリドーマを培養し抗体を
含有する培養上清を得る。培養液に含まれる血清は、他
の抗体やアルブミンなどの夾雑物が含まれ、抗体精製が
煩雑になることが多いので、培養液への添加は少なくす
ることが望ましい。さらに好ましくは、ハイブリドーマ
を常法により無血清培地に馴化させ、無血清培地を用い
て培養することである。無血清培地で培養することによ
り、抗体精製が容易になる。
【００２８】腹水や培養上清からのＭｏＡｂの精製は、
自体公知の方法により行うことができる。例えば、免疫
グロブリンの精製法として従来既知の硫酸アンモニウム
や硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ポリエチ
レングリコール分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイ
オン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法などを応用
することで、容易に達成される。
自体公知の方法により行うことができる。例えば、免疫
グロブリンの精製法として従来既知の硫酸アンモニウム
や硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ポリエチ
レングリコール分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイ
オン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法などを応用
することで、容易に達成される。
【００２９】さらに、ＭｏＡｂが、マウスＩｇＧである
場合には、プロテインＡ結合単体あるいは抗マウスイム
ノグロブリン結合単体を用いたアフィニティークロマト
グラフィー法により精製することが可能であり、簡便で
ある。
場合には、プロテインＡ結合単体あるいは抗マウスイム
ノグロブリン結合単体を用いたアフィニティークロマト
グラフィー法により精製することが可能であり、簡便で
ある。
【００３０】本発明では、ヒトｕｍＣＫ（インスティチ
ュートオブセルバイオロジー（Institute of Cell Biol
ogy）製：Lot No.ETH010122）を抗原とし、上記手法に
よりｕｍＣＫを特異的に認識して阻害しうるＭｏＡｂを
作製した。当該抗体は、マウス由来かつＩｇＧクラスの
抗体であって、ｕｍＣＫ酵素活性を特異的に60％以上、
好ましくは80％以上、より好ましくは90％阻害すること
ができるものをスクリーニングして得た。当該抗体は、
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６０号により平成１４年
３月１３日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されているハイブリドーマにより産生さ
れ、Ｕ１−１８８１と命名される。本発明の抗体は、こ
の具体例に限定されるものではなく、ヒトｕｍＣＫを特
異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害しうる
抗体であればよい。また、本発明の抗ｕｍＣＫ抗体は、
ｍＣＫ酵素活性を阻害する目的で使用する時、単独で用
いてもよいし、複数の抗ｍＣＫ抗体、例えば認識部位が
異なる抗体を適宜組み合わせて用いることも可能であ
る。またｕｍＣＫ酵素活性を阻害する目的で使用すると
きも同様に、単独で用いてもよいし、例えば認識部位が
異なる複数の抗ｕｍＣＫ抗体を適宜組み合わせて用いる
ことも可能である。
ュートオブセルバイオロジー（Institute of Cell Biol
ogy）製：Lot No.ETH010122）を抗原とし、上記手法に
よりｕｍＣＫを特異的に認識して阻害しうるＭｏＡｂを
作製した。当該抗体は、マウス由来かつＩｇＧクラスの
抗体であって、ｕｍＣＫ酵素活性を特異的に60％以上、
好ましくは80％以上、より好ましくは90％阻害すること
ができるものをスクリーニングして得た。当該抗体は、
受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６０号により平成１４年
３月１３日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されているハイブリドーマにより産生さ
れ、Ｕ１−１８８１と命名される。本発明の抗体は、こ
の具体例に限定されるものではなく、ヒトｕｍＣＫを特
異的に認識し、且つその酵素活性を特異的に阻害しうる
抗体であればよい。また、本発明の抗ｕｍＣＫ抗体は、
ｍＣＫ酵素活性を阻害する目的で使用する時、単独で用
いてもよいし、複数の抗ｍＣＫ抗体、例えば認識部位が
異なる抗体を適宜組み合わせて用いることも可能であ
る。またｕｍＣＫ酵素活性を阻害する目的で使用すると
きも同様に、単独で用いてもよいし、例えば認識部位が
異なる複数の抗ｕｍＣＫ抗体を適宜組み合わせて用いる
ことも可能である。
【００３１】さらに、本発明の測定方法では、サルコメ
リックｍＣＫ（ｓｍＣＫ）を特異的に認識して阻害しう
る抗体（以下「抗ｓｍＣＫ抗体」という。）も使用する
ことができる。抗ｓｍＣＫ抗体の例として、例えば受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により平成１２年４月
１３日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託されているハイブリドーマにより産生された
ｍＣＫＩ−５７８と命名されたＭｏＡｂ（特開2002-270
号公開公報）を単独で、または組み合わせて使用するこ
とができる。
リックｍＣＫ（ｓｍＣＫ）を特異的に認識して阻害しう
る抗体（以下「抗ｓｍＣＫ抗体」という。）も使用する
ことができる。抗ｓｍＣＫ抗体の例として、例えば受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７１３３号により平成１２年４月
１３日付けで通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託されているハイブリドーマにより産生された
ｍＣＫＩ−５７８と命名されたＭｏＡｂ（特開2002-270
号公開公報）を単独で、または組み合わせて使用するこ
とができる。
【００３２】従って、抗ｕｍＣＫ抗体および抗ｓｍＣＫ
抗体を単独または組み合わせて使用することにより、試
料中のｍＣＫまたはｕｍＣＫ若しくはｓｍＣＫ酵素活性
を選択的に排除することができる。さらにＣＫ−Ｍサブ
ユニットを選択的に排除せしめる抗体と共に使用するこ
とで、ＣＫアイソザイムであるＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−Ｍ
Ｍ、ＣＫ−ＢＢおよびｍＣＫ、より詳しくはｕｍＣＫ酵
素活性および／若しくはｓｍＣＫ酵素活性を分別定量す
ることが可能となる。
抗体を単独または組み合わせて使用することにより、試
料中のｍＣＫまたはｕｍＣＫ若しくはｓｍＣＫ酵素活性
を選択的に排除することができる。さらにＣＫ−Ｍサブ
ユニットを選択的に排除せしめる抗体と共に使用するこ
とで、ＣＫアイソザイムであるＣＫ−ＭＢ、ＣＫ−Ｍ
Ｍ、ＣＫ−ＢＢおよびｍＣＫ、より詳しくはｕｍＣＫ酵
素活性および／若しくはｓｍＣＫ酵素活性を分別定量す
ることが可能となる。
【００３３】（免疫学的測定方法）本発明の抗ｕｍＣＫ
抗体ならびに抗ｓｍＣＫ抗体は、ＥＩＡ、ＲＩＡ法、免
疫凝集反応、その他抗体を用いて測定可能なあらゆる測
定方法に使用することができる。この場合、例えば担体
に固定する抗体、標識抗体、その他の試薬等、測定対象
物に応じて適宜選択し、最適な条件で使用することがで
きる。例えば、抗ｕｍＣＫ抗体ならびに抗ｓｍＣＫ抗体
を各々単独で用いて、免疫学的手法により測定を行うこ
とで、従来電気泳動などでは区別できなかったｕｍＣＫ
ならびにｓｍＣＫを区別して測定することが可能とな
る。
抗体ならびに抗ｓｍＣＫ抗体は、ＥＩＡ、ＲＩＡ法、免
疫凝集反応、その他抗体を用いて測定可能なあらゆる測
定方法に使用することができる。この場合、例えば担体
に固定する抗体、標識抗体、その他の試薬等、測定対象
物に応じて適宜選択し、最適な条件で使用することがで
きる。例えば、抗ｕｍＣＫ抗体ならびに抗ｓｍＣＫ抗体
を各々単独で用いて、免疫学的手法により測定を行うこ
とで、従来電気泳動などでは区別できなかったｕｍＣＫ
ならびにｓｍＣＫを区別して測定することが可能とな
る。
【００３４】（免疫阻害法によるアイソザイム測定方
法）ＣＫアイソザイム測定法の基本原理は、免疫阻害法
によるＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に測定する
方法を利用する。一般に、例えばこの方法によるＣＫ−
ＭＢの活性測定は次のようにして行われている。すなわ
ち、ヒトＣＫ−Ｍサブユニットに特異的な活性抗体を使
用し、試料中のＣＫ−ＭＭおよびＭＢ中のＭサブユニッ
ト活性（ＭＢは約半分の活性が阻害される）を阻害した
のち、残存するＢサブユニット活性を２倍することによ
りＣＫ−ＭＢ活性を測定する。ＣＫ−ＭＢ活性の測定
は、下述の反応式（化１）の左行反応によって生成する
ＡＴＰを、さらにヘキソキナーゼ（ＨＫ）とグルコース
６リン酸脱水素酵素（G-6-PDH）からなる共役反応によ
りNADPHを生成させ、NADPHの量的変化を定量することに
より行う（化２）。
法）ＣＫアイソザイム測定法の基本原理は、免疫阻害法
によるＣＫアイソザイムの酵素活性を選択的に測定する
方法を利用する。一般に、例えばこの方法によるＣＫ−
ＭＢの活性測定は次のようにして行われている。すなわ
ち、ヒトＣＫ−Ｍサブユニットに特異的な活性抗体を使
用し、試料中のＣＫ−ＭＭおよびＭＢ中のＭサブユニッ
ト活性（ＭＢは約半分の活性が阻害される）を阻害した
のち、残存するＢサブユニット活性を２倍することによ
りＣＫ−ＭＢ活性を測定する。ＣＫ−ＭＢ活性の測定
は、下述の反応式（化１）の左行反応によって生成する
ＡＴＰを、さらにヘキソキナーゼ（ＨＫ）とグルコース
６リン酸脱水素酵素（G-6-PDH）からなる共役反応によ
りNADPHを生成させ、NADPHの量的変化を定量することに
より行う（化２）。
【００３５】
【化１】
【００３６】
【化２】
【００３７】上記発明のＣＫ−ＭＢ測定法では、抗ＣＫ
−Ｍ抗体と抗ｕｍＣＫ抗体および／若しくは抗ｓｍＣＫ
抗体とを同一の工程で使用し、測定試料の処理を行うこ
とができる。例えば、上記の抗体を測定用酵素液中に含
ませることで、同一工程で試料を処理することができ
る。一方、異なる工程で処理する場合は、例えば抗ｕｍ
ＣＫ抗体および／または抗ｓｍＣＫ抗体を基質液に添加
し、抗ＣＫ−Ｍ抗体は測定用酵素液に含ませることで、
処理することができる。活性測定を目的とするアイソザ
イムがＣＫ−ＭＢの場合は、抗ＣＫ−Ｍ抗体および抗ｍ
ＣＫ抗体（抗ｕｍＣＫ抗体および／若しくは抗ｓｍＣＫ
抗体）で試料を同一工程で処理して測定を行うのが簡便
でよい。
−Ｍ抗体と抗ｕｍＣＫ抗体および／若しくは抗ｓｍＣＫ
抗体とを同一の工程で使用し、測定試料の処理を行うこ
とができる。例えば、上記の抗体を測定用酵素液中に含
ませることで、同一工程で試料を処理することができ
る。一方、異なる工程で処理する場合は、例えば抗ｕｍ
ＣＫ抗体および／または抗ｓｍＣＫ抗体を基質液に添加
し、抗ＣＫ−Ｍ抗体は測定用酵素液に含ませることで、
処理することができる。活性測定を目的とするアイソザ
イムがＣＫ−ＭＢの場合は、抗ＣＫ−Ｍ抗体および抗ｍ
ＣＫ抗体（抗ｕｍＣＫ抗体および／若しくは抗ｓｍＣＫ
抗体）で試料を同一工程で処理して測定を行うのが簡便
でよい。
【００３８】さらに本発明は、抗ｕｍＣＫ抗体および／
または抗ｓｍＣＫ抗体で試料を処理することで、ｍＣＫ
酵素活性を選択的に排除することを特徴とするｍＣＫの
測定方法を提供する。また、抗ｕｍＣＫ抗体若しくは抗
ｓｍＣＫ抗体で試料を処理することにより、ｕｍＣＫ若
しくはｓｍＣＫの酵素活性を選択的に排除することを特
徴とするｕｍＣＫ若しくはｓｍＣＫの測定方法を提供す
る。すなわち、本発明のｍＣＫまたはｕｍＣＫ若しくは
ｓｍＣＫ測定法においては、試料中のｍＣＫを含むクレ
アチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の抗ｕｍＣＫ
抗体および抗ｓｍＣＫ抗体を用いてｍＣＫ以外のクレア
チンキナーゼ活性の測定とを行い、得られた２つの測定
値の差からｍＣＫまたはｕｍＣＫ若しくはｓｍＣＫ活性
のみを求めることができる。この時、試料中のｍＣＫを
含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の抗
ｍＣＫ抗体を用いてｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活
性の測定は、抗ＣＫ−Ｍ抗体などを含んでいる測定用試
薬を使用してもよいし、含んでいない測定用試薬を使用
してもよい。２つの測定において使用する測定用試薬が
抗ＣＫ−Ｍ抗体の含有に関して同条件であればよい。
または抗ｓｍＣＫ抗体で試料を処理することで、ｍＣＫ
酵素活性を選択的に排除することを特徴とするｍＣＫの
測定方法を提供する。また、抗ｕｍＣＫ抗体若しくは抗
ｓｍＣＫ抗体で試料を処理することにより、ｕｍＣＫ若
しくはｓｍＣＫの酵素活性を選択的に排除することを特
徴とするｕｍＣＫ若しくはｓｍＣＫの測定方法を提供す
る。すなわち、本発明のｍＣＫまたはｕｍＣＫ若しくは
ｓｍＣＫ測定法においては、試料中のｍＣＫを含むクレ
アチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の抗ｕｍＣＫ
抗体および抗ｓｍＣＫ抗体を用いてｍＣＫ以外のクレア
チンキナーゼ活性の測定とを行い、得られた２つの測定
値の差からｍＣＫまたはｕｍＣＫ若しくはｓｍＣＫ活性
のみを求めることができる。この時、試料中のｍＣＫを
含むクレアチンキナーゼ活性の測定と、上記本発明の抗
ｍＣＫ抗体を用いてｍＣＫ以外のクレアチンキナーゼ活
性の測定は、抗ＣＫ−Ｍ抗体などを含んでいる測定用試
薬を使用してもよいし、含んでいない測定用試薬を使用
してもよい。２つの測定において使用する測定用試薬が
抗ＣＫ−Ｍ抗体の含有に関して同条件であればよい。
【００３９】例えば、試料中の全ＣＫ活性を測定し、測
定後さらに本発明の抗ｕｍＣＫ抗体および／若しくは抗
ｓｍＣＫ抗体を加えて再度測定を行い、得られた２つの
測定値の差によりｍＣＫ活性、より詳しくはｕｍＣＫお
よび／若しくはｓｍＣＫ活性を求めることができる。試
料をまず抗ＣＫ−Ｍ抗体を用いて処理し、ＣＫ−ＭＭ活
性とＣＫ−ＭＢの約半分の活性とを阻害したのちに一旦
測定を行い、１／２ＣＫ−ＭＢ＋ｍＣＫ酵素活性を測定
し（測定値Ａ）、測定後さらに本発明の抗ｕｍＣＫ抗体
および／若しくは抗ｓｍＣＫ抗体を加えて再度測定を行
い、１／２ＣＫ−ＭＢ酵素活性（測定値Ｂ）を測定する
ことにより、ｍＣＫまたはｕｍＣＫ若しくはｓｍＣＫの
みならずＣＫ−ＭＢ活性を同一試料を用いて同時に簡便
迅速に測定できる。すなわち、ＣＫ−ＭＢ活性は測定値
Ｂを２倍することにより求めることができ、ｍＣＫまた
はｕｍＣＫ若しくはｓｍＣＫ活性は、測定値Ａと測定値
Ｂとの差により求めることができる。
定後さらに本発明の抗ｕｍＣＫ抗体および／若しくは抗
ｓｍＣＫ抗体を加えて再度測定を行い、得られた２つの
測定値の差によりｍＣＫ活性、より詳しくはｕｍＣＫお
よび／若しくはｓｍＣＫ活性を求めることができる。試
料をまず抗ＣＫ−Ｍ抗体を用いて処理し、ＣＫ−ＭＭ活
性とＣＫ−ＭＢの約半分の活性とを阻害したのちに一旦
測定を行い、１／２ＣＫ−ＭＢ＋ｍＣＫ酵素活性を測定
し（測定値Ａ）、測定後さらに本発明の抗ｕｍＣＫ抗体
および／若しくは抗ｓｍＣＫ抗体を加えて再度測定を行
い、１／２ＣＫ−ＭＢ酵素活性（測定値Ｂ）を測定する
ことにより、ｍＣＫまたはｕｍＣＫ若しくはｓｍＣＫの
みならずＣＫ−ＭＢ活性を同一試料を用いて同時に簡便
迅速に測定できる。すなわち、ＣＫ−ＭＢ活性は測定値
Ｂを２倍することにより求めることができ、ｍＣＫまた
はｕｍＣＫ若しくはｓｍＣＫ活性は、測定値Ａと測定値
Ｂとの差により求めることができる。
【００４０】例えば、試料中のｍＣＫを含むＣＫ活性の
測定と、試料中のｍＣＫ以外のＣＫ活性の測定とを別々
に行い、得られた２つの測定値の差からｍＣＫ活性を得
ることもできる。例えば、次のようなキットＡならびに
Ｂを用いて各々の活性を測定し、得られた２つの測定値
の差からｍＣＫ活性を得ることができる。この時、キッ
トＡに抗ＣＫ−Ｍ抗体を添加したＣＫ−ＭＢ活性測定試
薬を使用すれば、ｍＣＫ活性のみならず、ＣＫ−ＭＢ活
性をも求めることができる。
測定と、試料中のｍＣＫ以外のＣＫ活性の測定とを別々
に行い、得られた２つの測定値の差からｍＣＫ活性を得
ることもできる。例えば、次のようなキットＡならびに
Ｂを用いて各々の活性を測定し、得られた２つの測定値
の差からｍＣＫ活性を得ることができる。この時、キッ
トＡに抗ＣＫ−Ｍ抗体を添加したＣＫ−ＭＢ活性測定試
薬を使用すれば、ｍＣＫ活性のみならず、ＣＫ−ＭＢ活
性をも求めることができる。
【００４１】（キットＡ）試料中のｍＣＫを含む全ＣＫ
活性測定用試薬キット（キットＢ）抗ｕｍＣＫ抗体およ
び／または抗ｓｍＣＫ抗体をキットＡに添加した試料中
のｍＣＫ（より詳しくはｕｍＣＫおよび／またはｓｍＣ
Ｋ活性）以外のＣＫ活性測定用試薬キット
活性測定用試薬キット（キットＢ）抗ｕｍＣＫ抗体およ
び／または抗ｓｍＣＫ抗体をキットＡに添加した試料中
のｍＣＫ（より詳しくはｕｍＣＫおよび／またはｓｍＣ
Ｋ活性）以外のＣＫ活性測定用試薬キット
【００４２】さらに、本発明のＣＫアイソザイムの分別
定量法で、抗ｕｍＣＫ抗体および／若しくは抗ｓｍＣＫ
抗体を用いて試料中のｍＣＫ（より詳しくはｕｍＣＫお
よび／若しくはｓｍＣＫ活性）以外のクレアチンキナー
ゼ活性の測定を行い（測定値Ｃ）、抗ＣＫ−Ｍ抗体と抗
ｕｍＣＫ抗体および／または抗ｓｍＣＫ抗体とを用いて
ｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、および１／２ＣＫ−ＭＢ以外のＣ
Ｋ活性の測定を行い（測定値Ｄ）、測定値Ｃと測定値Ｄ
の２倍の値との差により、ＣＫ−ＭＭ活性を求めること
ができる。
定量法で、抗ｕｍＣＫ抗体および／若しくは抗ｓｍＣＫ
抗体を用いて試料中のｍＣＫ（より詳しくはｕｍＣＫお
よび／若しくはｓｍＣＫ活性）以外のクレアチンキナー
ゼ活性の測定を行い（測定値Ｃ）、抗ＣＫ−Ｍ抗体と抗
ｕｍＣＫ抗体および／または抗ｓｍＣＫ抗体とを用いて
ｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、および１／２ＣＫ−ＭＢ以外のＣ
Ｋ活性の測定を行い（測定値Ｄ）、測定値Ｃと測定値Ｄ
の２倍の値との差により、ＣＫ−ＭＭ活性を求めること
ができる。
【００４３】本発明の方法により測定される試料は特に
制限はないが、通常臨床検査の分野で行われているＣＫ
アイソザイムが測定されている方法や試料に適用しう
る。従来ＣＫアイソザイムの分画活性のうちｍＣＫの異
常出現は、心肺停止、外傷、幼児性下痢症、悪性腫瘍、
肝硬変症、うっ血性心不全等において観察されていた
（検査と技術,vol.28,no.13,p.1499-1504(2000)）。従
来ではｕｍＣＫとｓｍＣＫは電気泳動で同一の挙動する
ため区別されなかったが、本発明の測定方法を採用する
ことにより、上記疾患の他、ｕｍＣＫとｓｍＣＫの異常
出現や、その割合を調べることが可能となる。したがっ
て、本発明の測定方法は、各疾患の指標となるｕｍＣＫ
および／若しくはｓｍＣＫの検査方法を提供するもので
ある。
制限はないが、通常臨床検査の分野で行われているＣＫ
アイソザイムが測定されている方法や試料に適用しう
る。従来ＣＫアイソザイムの分画活性のうちｍＣＫの異
常出現は、心肺停止、外傷、幼児性下痢症、悪性腫瘍、
肝硬変症、うっ血性心不全等において観察されていた
（検査と技術,vol.28,no.13,p.1499-1504(2000)）。従
来ではｕｍＣＫとｓｍＣＫは電気泳動で同一の挙動する
ため区別されなかったが、本発明の測定方法を採用する
ことにより、上記疾患の他、ｕｍＣＫとｓｍＣＫの異常
出現や、その割合を調べることが可能となる。したがっ
て、本発明の測定方法は、各疾患の指標となるｕｍＣＫ
および／若しくはｓｍＣＫの検査方法を提供するもので
ある。
【００４４】また本発明は、本発明のＣＫアイソザイム
測定法、ＣＫ−ＭＢ測定法、ｍＣＫ測定法に必要な試薬
をキット化または単品で構成してなるＣＫアイソザイム
活性測定用試薬を提供する。本発明のＣＫアイソザイム
活性測定用試薬は、本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害Ｍｏ
Ａｂを試薬中に含むかまたは単品として構成してなる。
ここでいう試薬には、全ＣＫ活性測定試薬や、急性心筋
梗塞の生化学的診断に用いられているＣＫ−ＭＢ測定用
試薬を、その一部として利用できるがこれに限定される
ものではない。
測定法、ＣＫ−ＭＢ測定法、ｍＣＫ測定法に必要な試薬
をキット化または単品で構成してなるＣＫアイソザイム
活性測定用試薬を提供する。本発明のＣＫアイソザイム
活性測定用試薬は、本発明の抗ｍＣＫ酵素活性阻害Ｍｏ
Ａｂを試薬中に含むかまたは単品として構成してなる。
ここでいう試薬には、全ＣＫ活性測定試薬や、急性心筋
梗塞の生化学的診断に用いられているＣＫ−ＭＢ測定用
試薬を、その一部として利用できるがこれに限定される
ものではない。
【００４５】
【実施例】以下の実施例は本発明を具体的に説明するも
のであるが、これによって本発明の範囲を制限するもの
ではない。
のであるが、これによって本発明の範囲を制限するもの
ではない。
【実施例１】モノクローナル抗体（MoAb）を産生するハ
イブリドーマの作製 （１）免疫原（抗原）の調製 本発明では、ヒトｕｍＣＫ（インスティチュートオブセ
ルバイオロジー（Institute of Cell Biology）製：Lot
No.ETH010122）を抗原とした。
イブリドーマの作製 （１）免疫原（抗原）の調製 本発明では、ヒトｕｍＣＫ（インスティチュートオブセ
ルバイオロジー（Institute of Cell Biology）製：Lot
No.ETH010122）を抗原とした。
【００４６】（２）被免疫動物５〜８週令の近交系BALB
/c系マウス雌を、動物飼育チェンバー内（23±1℃、湿
度70％）で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給
水して飼育した。
/c系マウス雌を、動物飼育チェンバー内（23±1℃、湿
度70％）で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給
水して飼育した。
【００４７】（３）免疫方法上記（１）で調製した精製
ヒトｕｍＣＫを抗原として用い、100μg/0.5mLとなる様
にＰＢＳで調製し、同量（0.5mL）のフロイント完全ア
ジュバント（freund's comlete adjubant:Difco社製）
を混合して乳化した。この乳化状の抗原を、５週令の４
匹の雌のBALB/cマウスの腹腔に１匹あたり200μL投与し
た。さらに２週間毎に、Ribiアジュバントにて100μg/m
Lとなるように調製した上記抗原をマウス当たり20μｇ
ずつ４回投与した。さらに１ヶ月の後Ribiアジュバント
で100μg/mLとなるように調製した上記抗原を同様に追
加免疫した後、マウスの抗体価を測定した。抗体価の高
いマウスはさらに２週間後、抗原である精製ヒトｍＣＫ
をＰＢＳで100μg/mLに調製し、マウス尾静脈より注射
して最終免疫した。
ヒトｕｍＣＫを抗原として用い、100μg/0.5mLとなる様
にＰＢＳで調製し、同量（0.5mL）のフロイント完全ア
ジュバント（freund's comlete adjubant:Difco社製）
を混合して乳化した。この乳化状の抗原を、５週令の４
匹の雌のBALB/cマウスの腹腔に１匹あたり200μL投与し
た。さらに２週間毎に、Ribiアジュバントにて100μg/m
Lとなるように調製した上記抗原をマウス当たり20μｇ
ずつ４回投与した。さらに１ヶ月の後Ribiアジュバント
で100μg/mLとなるように調製した上記抗原を同様に追
加免疫した後、マウスの抗体価を測定した。抗体価の高
いマウスはさらに２週間後、抗原である精製ヒトｍＣＫ
をＰＢＳで100μg/mLに調製し、マウス尾静脈より注射
して最終免疫した。
【００４８】（４） 抗体価測定（抗体価アッセイ）
免疫開始時より定期的にマウス眼底網膜より少量の全血
を採取し、血清を分離した後ｕｍＣＫに対する抗体価を
ｕｍＣＫ酵素活性抗体法により調べた。各マウスの抗血
清をＰＢＳで10〜1,000倍希釈して調製した抗体液25μL
と25μLのｕｍＣＫ酵素液（200U/L）とを96穴マイクロ
タイタープレートに加え、室温で10分間反応した後、10
0μLの酵素試薬〔100mM イミダゾール、２mM EDTA、10m
M酢酸マグネシウム、２mM アデノシン-5'-ニリン酸（AD
P）、５mM アデノシン-5'-一リン酸（AMP）、40μM P1P
5、P5-ジ（アデノシン-5'）5リン酸（AP5A）、30mM 1-
チオグリセロール、28mM D-グルコース、２mM NADP、３
U/mL HK、２U/mL グルコース-6-リン酸脱水素酵素、30m
M クレアチンリン酸二ナトリウム、0.3mg/mLニトロブル
ーテトラゾリウムクロライド、0.6 U/mL ダイアフォラ
ーゼ、pH6.6〕を96穴マイクロタイタープレートに加
え、37℃で10分間反応させた。ついで、波長570ｎｍに
おける吸光度を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体
陰性コントロールとして抗血清の代わりに非免疫マウス
血清を添加し、陰性コントロールとした。
を採取し、血清を分離した後ｕｍＣＫに対する抗体価を
ｕｍＣＫ酵素活性抗体法により調べた。各マウスの抗血
清をＰＢＳで10〜1,000倍希釈して調製した抗体液25μL
と25μLのｕｍＣＫ酵素液（200U/L）とを96穴マイクロ
タイタープレートに加え、室温で10分間反応した後、10
0μLの酵素試薬〔100mM イミダゾール、２mM EDTA、10m
M酢酸マグネシウム、２mM アデノシン-5'-ニリン酸（AD
P）、５mM アデノシン-5'-一リン酸（AMP）、40μM P1P
5、P5-ジ（アデノシン-5'）5リン酸（AP5A）、30mM 1-
チオグリセロール、28mM D-グルコース、２mM NADP、３
U/mL HK、２U/mL グルコース-6-リン酸脱水素酵素、30m
M クレアチンリン酸二ナトリウム、0.3mg/mLニトロブル
ーテトラゾリウムクロライド、0.6 U/mL ダイアフォラ
ーゼ、pH6.6〕を96穴マイクロタイタープレートに加
え、37℃で10分間反応させた。ついで、波長570ｎｍに
おける吸光度を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体
陰性コントロールとして抗血清の代わりに非免疫マウス
血清を添加し、陰性コントロールとした。
【００４９】
【表１】
【００５０】ｕｍＣＫ酵素活性阻害特異抗体が血液中に
産生されていればｕｍＣＫの酵素活性が阻害され、基質
反応が抑制されて吸光度の変化量が低くなる。得られた
吸光度からｕｍＣＫ酵素活性阻害特異抗体の存在が確認
される。その結果、表１に示すように、各マウスにおい
てｕｍＣＫの酵素活性の阻害が確認された。
産生されていればｕｍＣＫの酵素活性が阻害され、基質
反応が抑制されて吸光度の変化量が低くなる。得られた
吸光度からｕｍＣＫ酵素活性阻害特異抗体の存在が確認
される。その結果、表１に示すように、各マウスにおい
てｕｍＣＫの酵素活性の阻害が確認された。
【００５１】（５）細胞融合のための細胞
最終免疫から３日後にBALB/cマウスの摘脾を行い、ＥＭ
ＥＭ培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の浮遊液を
作製した。ついで、脾細胞をＥＭＥＭ培養液で４回洗浄
した後、細胞数を算定し、7.0×108個の脾細胞を得た。
細胞融合は、8-アザグアニン（2-amino-6-oxy-８azapur
ine） 耐性のBALB/cマウス由来骨髄腫培養細胞株（P3X6
3-Ag8・653、以下、「Ｘ６３細胞」という。）を親細胞
株として用いた。Ｘ６３細胞は、非働化した牛胎児血清
（fetal calf serum : ＦＣＳ）10％を含むRPMI-1640培
養液（20μg/mL，8-アザグアニン含有）で継代培養し
た。細胞融合の３日前より８-アザグアニンを含有しな
い10％ＦＣＳ含有RPMI-1640培養液でさらに培養し、対
数増殖期の細胞を用いた。Ｘ６３細胞はRPMI-1640培養
液で３回洗浄した後、細胞数を算定し、7×107個の生細
胞を得た。
ＥＭ培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の浮遊液を
作製した。ついで、脾細胞をＥＭＥＭ培養液で４回洗浄
した後、細胞数を算定し、7.0×108個の脾細胞を得た。
細胞融合は、8-アザグアニン（2-amino-6-oxy-８azapur
ine） 耐性のBALB/cマウス由来骨髄腫培養細胞株（P3X6
3-Ag8・653、以下、「Ｘ６３細胞」という。）を親細胞
株として用いた。Ｘ６３細胞は、非働化した牛胎児血清
（fetal calf serum : ＦＣＳ）10％を含むRPMI-1640培
養液（20μg/mL，8-アザグアニン含有）で継代培養し
た。細胞融合の３日前より８-アザグアニンを含有しな
い10％ＦＣＳ含有RPMI-1640培養液でさらに培養し、対
数増殖期の細胞を用いた。Ｘ６３細胞はRPMI-1640培養
液で３回洗浄した後、細胞数を算定し、7×107個の生細
胞を得た。
【００５２】RPMI-1640培養液で、ポリエチレングリコ
ール-4000が50(W/V)％濃度となるように溶解し、上記の
脾細胞とＸ６３細胞との比が10：1となるように混合
し、ケーラーおよびミルシュタイン共著：ネイチャー
（Nature 第256巻，495-497 (1975)）およびヨーロピア
ン ジャーナル オブ イムノロジー（Eur. J.Immunol.第
6巻，511-519, (1976)）の方法に準じて細胞融合を行っ
た。
ール-4000が50(W/V)％濃度となるように溶解し、上記の
脾細胞とＸ６３細胞との比が10：1となるように混合
し、ケーラーおよびミルシュタイン共著：ネイチャー
（Nature 第256巻，495-497 (1975)）およびヨーロピア
ン ジャーナル オブ イムノロジー（Eur. J.Immunol.第
6巻，511-519, (1976)）の方法に準じて細胞融合を行っ
た。
【００５３】その後、10％ＦＣＳを添加したRPMI-1640
培養液に、1×10-4Ｍ のヒポキサンチン、4×10-7Ｍの
アミノプテリンおよび1.6×10-5Ｍ のチミジン（ＨＡ
Ｔ）を含有するＨＡＴ選択培地に、脾細胞が2.0×106個
/mLとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液
を50μLずつ、96穴マイクロタイタープレートの各ウエ
ルに分注した後、ＣＯ２無菌培養器において温度37℃、
湿度95％、８％のＣＯ２雰囲気で培養を行なった。培養
開始後、１日目と２日目にＨＡＴ選択培地を各ウエルに
１滴ずつ、また培養開始後７日目と９日目にＨＡＴ選択
培地を、各ウエルに２滴ずつ添加してさらに培養を行っ
た。その後、ＨＡＴを含まない培養液で育成させ、約10
日〜２週間後に、選択培地で増殖ハイブリドーマを確認
した。
培養液に、1×10-4Ｍ のヒポキサンチン、4×10-7Ｍの
アミノプテリンおよび1.6×10-5Ｍ のチミジン（ＨＡ
Ｔ）を含有するＨＡＴ選択培地に、脾細胞が2.0×106個
/mLとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液
を50μLずつ、96穴マイクロタイタープレートの各ウエ
ルに分注した後、ＣＯ２無菌培養器において温度37℃、
湿度95％、８％のＣＯ２雰囲気で培養を行なった。培養
開始後、１日目と２日目にＨＡＴ選択培地を各ウエルに
１滴ずつ、また培養開始後７日目と９日目にＨＡＴ選択
培地を、各ウエルに２滴ずつ添加してさらに培養を行っ
た。その後、ＨＡＴを含まない培養液で育成させ、約10
日〜２週間後に、選択培地で増殖ハイブリドーマを確認
した。
【００５４】（６）スクリーニング
上記で得られたバイブリドーマのうち、ヒトｕｍＣＫ酵
素の活性阻害能を有する抗体（抗ヒトｕｍＣＫMoAb）を
産生する株を以下の方法により選択する。
素の活性阻害能を有する抗体（抗ヒトｕｍＣＫMoAb）を
産生する株を以下の方法により選択する。
【００５５】25μLのハイブリドーマ培養上清と25μLの
ヒトｕｍＣＫ酵素液（200U/L）とを96穴マイクロタイタ
ープレートに加え室温で10分間反応した後、200μLの酵
素試薬〔100mM イミダゾール、２mM EDTA、10mM酢酸マ
グネシウム、２mM アデノシン-5'-ニリン酸（ADP）、５
mM アデノシン-5'-一リン酸（AMP）、40μＭ Ｐ１，P5-
ジ（アデノシン-5'）5リン酸（AP5A）、30mM 1-チオグ
リセロール、28mM Ｄ-グルコース、２mM NADP、３U/mL
HK、２U/mLグルコース-6-リン酸脱水素酵素、30mM クレ
アチンリン酸二ナトリウム、0.3mg/mL ニトロブルーテ
トラゾリウムクロライド、0.6U/mL ダイアフォラーゼ、
pH6.6〕を 96穴マイクロタイタープレートに加え、37℃
で10分間反応させた。ついで、波長570ｎｍにおける吸
光度を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体陰性コン
トロールとしてハイブリドーマ培養上清の代わりに培養
液のみを添加し、陰性コントロールとした。得られた吸
光度から抗ヒトｕｍＣＫMoAbを産生するハイブリドーマ
を特定することができる。
ヒトｕｍＣＫ酵素液（200U/L）とを96穴マイクロタイタ
ープレートに加え室温で10分間反応した後、200μLの酵
素試薬〔100mM イミダゾール、２mM EDTA、10mM酢酸マ
グネシウム、２mM アデノシン-5'-ニリン酸（ADP）、５
mM アデノシン-5'-一リン酸（AMP）、40μＭ Ｐ１，P5-
ジ（アデノシン-5'）5リン酸（AP5A）、30mM 1-チオグ
リセロール、28mM Ｄ-グルコース、２mM NADP、３U/mL
HK、２U/mLグルコース-6-リン酸脱水素酵素、30mM クレ
アチンリン酸二ナトリウム、0.3mg/mL ニトロブルーテ
トラゾリウムクロライド、0.6U/mL ダイアフォラーゼ、
pH6.6〕を 96穴マイクロタイタープレートに加え、37℃
で10分間反応させた。ついで、波長570ｎｍにおける吸
光度を試薬盲検を対照に測定した。なお、抗体陰性コン
トロールとしてハイブリドーマ培養上清の代わりに培養
液のみを添加し、陰性コントロールとした。得られた吸
光度から抗ヒトｕｍＣＫMoAbを産生するハイブリドーマ
を特定することができる。
【００５６】ハイブリドーマの増殖が認められた96穴マ
イクロタイタープレートの2496穴についてスクリーニン
グを実施した結果、７穴について抗ヒトｕｍＣＫMoAbを
産生するハイブリドーマが認められた。
イクロタイタープレートの2496穴についてスクリーニン
グを実施した結果、７穴について抗ヒトｕｍＣＫMoAbを
産生するハイブリドーマが認められた。
【００５７】（実験例１）培養上清についての酵素阻害
特異性 上記のスクリーニングにより得られた７穴中のハイブリ
ドーマ産生細胞の培養上清について、ヒトｕｍＣＫ、ヒ
トｓｍＣＫ、ヒトＣＫ−ＭＭ、ヒトＣＫ−ＢＢまたはヒ
トＣＫ−ＭＢを用いて各酵素活性阻害を調べ、ヒトＣＫ
アイソザイムに対する特異性を確認する。対照として、
受託番号FERM BP-7133号により寄託されているハイブリ
ドーマにより産生されたmCKI-578（特開2002-270号公開
公報）のMoAbについても調べた。
特異性 上記のスクリーニングにより得られた７穴中のハイブリ
ドーマ産生細胞の培養上清について、ヒトｕｍＣＫ、ヒ
トｓｍＣＫ、ヒトＣＫ−ＭＭ、ヒトＣＫ−ＢＢまたはヒ
トＣＫ−ＭＢを用いて各酵素活性阻害を調べ、ヒトＣＫ
アイソザイムに対する特異性を確認する。対照として、
受託番号FERM BP-7133号により寄託されているハイブリ
ドーマにより産生されたmCKI-578（特開2002-270号公開
公報）のMoAbについても調べた。
【００５８】その結果を図１に示した。クローン番号UI
-178, UI-281, UI-956, UI-1111, UI-1125, UI-1881お
よびUI-1-1299の上清はｕｍＣＫ酵素活性を82％以上阻
害したがｓｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢ、およびＣ
Ｋ−ＭＢの酵素活性は全く阻害しなかった。特に、UI-1
881の上清はｕｍＣＫ酵素活性を94％阻害した。一方、m
CKI-578はｓｍＣＫ酵素活性を94％阻害したが、ｕｍＣ
Ｋ酵素活性や他のアイソザイムの酵素活性は阻害しなか
った。
-178, UI-281, UI-956, UI-1111, UI-1125, UI-1881お
よびUI-1-1299の上清はｕｍＣＫ酵素活性を82％以上阻
害したがｓｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢ、およびＣ
Ｋ−ＭＢの酵素活性は全く阻害しなかった。特に、UI-1
881の上清はｕｍＣＫ酵素活性を94％阻害した。一方、m
CKI-578はｓｍＣＫ酵素活性を94％阻害したが、ｕｍＣ
Ｋ酵素活性や他のアイソザイムの酵素活性は阻害しなか
った。
【００５９】（実験例２）ＭｏＡｂ産生ハイブリドーマ
株の樹立（クローニング） 上記のスクリーニングにより得られた７穴中のハイブリ
ドーマを限界希釈法によりクローニングし、安定にｍＣ
Ｋ酵素活性阻害を示すMoAbを産生するハイブリドーマ細
胞を１クロ−ン選択した。この細胞を樹立株として受託
番号FERM P-18760号として通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託した。
株の樹立（クローニング） 上記のスクリーニングにより得られた７穴中のハイブリ
ドーマを限界希釈法によりクローニングし、安定にｍＣ
Ｋ酵素活性阻害を示すMoAbを産生するハイブリドーマ細
胞を１クロ−ン選択した。この細胞を樹立株として受託
番号FERM P-18760号として通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託した。
【００６０】（実験例３）マウスイムノグロブリンサブ
クラスの同定 受託番号FERM P-18760号細胞が産生するMoAb（UI-188
1）のマウスイムノグロブリンサブクラスを、ザイメッ
ド（Ｚｙｍｅｄ）社製 モノアブタイピングキット（MON
OAb typing kit）を使用して同定した。その結果、UI-1
881はイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ２ｂ，κ）であっ
た。
クラスの同定 受託番号FERM P-18760号細胞が産生するMoAb（UI-188
1）のマウスイムノグロブリンサブクラスを、ザイメッ
ド（Ｚｙｍｅｄ）社製 モノアブタイピングキット（MON
OAb typing kit）を使用して同定した。その結果、UI-1
881はイムノグロブリンＧ（ＩｇＧ２ｂ，κ）であっ
た。
【００６１】（実験例４）UI-1881のヒトＣＫアイソザ
イムに対する特異性 UI-1881について、ヒトＣＫアイソザイムに対する特異
性を確認するため、ヒトｕｍＣＫ、ヒトｓｍＣＫ、ヒト
ＣＫ−ＭＭ、ヒトＣＫ−ＢＢまたはヒトＣＫ−ＭＢを用
いて各酵素活性阻害を確認した。対照としてmCKI-578
（抗smCK MoAb）についても調べた。その結果を図２お
よび図３に示した。UI-1881はｕｍＣＫの酵素活性を約9
0％阻害したがｓｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢ、お
よびＣＫ−ＭＢの酵素活性は全く阻害しなかった。一
方、mCKI-578はｓｍＣＫの酵素活性を約90％阻害したが
ｕｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢ、およびＣＫ−ＭＢ
の酵素活性は全く阻害しなかった。
イムに対する特異性 UI-1881について、ヒトＣＫアイソザイムに対する特異
性を確認するため、ヒトｕｍＣＫ、ヒトｓｍＣＫ、ヒト
ＣＫ−ＭＭ、ヒトＣＫ−ＢＢまたはヒトＣＫ−ＭＢを用
いて各酵素活性阻害を確認した。対照としてmCKI-578
（抗smCK MoAb）についても調べた。その結果を図２お
よび図３に示した。UI-1881はｕｍＣＫの酵素活性を約9
0％阻害したがｓｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢ、お
よびＣＫ−ＭＢの酵素活性は全く阻害しなかった。一
方、mCKI-578はｓｍＣＫの酵素活性を約90％阻害したが
ｕｍＣＫ、ＣＫ−ＭＭ、ＣＫ−ＢＢ、およびＣＫ−ＭＢ
の酵素活性は全く阻害しなかった。
【発明の効果】以上説明したように本発明の抗体は、ｕ
ｍＣＫ酵素活性を特異的に阻害し、他のアイソザイムの
活性を阻害しなかった。一方、抗ｓｍＣＫ抗体はｓｍＣ
Ｋ酵素活性を特異的に阻害し、他のアイソザイムの活性
を阻害しなかった。これらの抗体を、組み合わせて使用
することにより、試料中の各アイソザイムの分別測定が
可能となる。さらには、ｕｍＣＫとｓｍＣＫを分別測定
することにより、これらの異常出現や割合を検査するこ
とが可能となり、これらに起因する疾病との関係を見極
めることにより、臨床検査測定値から各種疾患の診断お
よび早期治療が可能となる。
ｍＣＫ酵素活性を特異的に阻害し、他のアイソザイムの
活性を阻害しなかった。一方、抗ｓｍＣＫ抗体はｓｍＣ
Ｋ酵素活性を特異的に阻害し、他のアイソザイムの活性
を阻害しなかった。これらの抗体を、組み合わせて使用
することにより、試料中の各アイソザイムの分別測定が
可能となる。さらには、ｕｍＣＫとｓｍＣＫを分別測定
することにより、これらの異常出現や割合を検査するこ
とが可能となり、これらに起因する疾病との関係を見極
めることにより、臨床検査測定値から各種疾患の診断お
よび早期治療が可能となる。
【図１】ハイブリドーマ培養上清の各アイソザイムの酵
素活性の阻害能を示した図である。（実験例１）
素活性の阻害能を示した図である。（実験例１）
【図２】抗ｕｍＣＫモノクローナル抗体（UI-1881）の
酵素活性の阻害能を示した図である。（実験例４）
酵素活性の阻害能を示した図である。（実験例４）
【図３】抗ｓｍＣＫモノクローナル抗体（mCKI-578）の
酵素活性の阻害能を示した図である。（実験例４）
酵素活性の阻害能を示した図である。（実験例４）
−○− ｕｍＣＫ酵素活性阻害効果
−△− ｓｍＣＫ酵素活性阻害効果
−◆− ＣＫ−ＭＭ酵素活性阻害効果
−■− ＣＫ−ＢＢ酵素活性阻害効果
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
(72)発明者 岸 浩司
兵庫県神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際
試薬株式会社研究開発センター内
(72)発明者 山下 和昭
兵庫県神戸市西区室谷１丁目１−２ 国際
試薬株式会社研究開発センター内
Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13
4B065 AA90X AA93Y AB04 BA08
CA24 CA25 CA46
4H045 AA11 BA10 CA40 DA76 EA50
Claims (18)
- 【請求項１】 ミトコンドリア局在クレアチンキナーゼ
（ｍＣＫ）アイソザイムのうちユビキタスｍＣＫ（ｕｍ
ＣＫ）活性を阻害する抗ｍＣＫ抗体。 - 【請求項２】 ｕｍＣＫ活性を少なくとも６０％阻害す
る請求項１に記載に記載の抗体。 - 【請求項３】 クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アイソザ
イムの分別定量において、単独または他の抗ｍＣＫ抗体
と併用して用いた場合に、実質的にｍＣＫアイソザイム
以外のＣＫアイソザイムの測定に影響が無い程度にまで
ｍＣＫ活性を阻害する能力を有する請求項１または２に
記載の抗体。 - 【請求項４】 モノクローナル抗体であることを特徴と
する請求項１〜３のいずれか１に記載の抗体。 - 【請求項５】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６０号に
より寄託されたハイブリドーマが産生するモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項６】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８７６０号に
より寄託されたハイブリドーマ。 - 【請求項７】請求項１〜５のいずれか１に記載の抗ｍＣ
Ｋ抗体を用いてｍＣＫ量を測定する免疫測定方法。 - 【請求項８】 ｍＣＫアイソザイムのうちサルコメリッ
クｍＣＫ（ｓｍＣＫ）活性を阻害する抗ｍＣＫ抗体を用
いてｍＣＫ量を測定する免疫測定方法。 - 【請求項９】ｍＣＫ量がｕｍＣＫ量および／またはｓｍ
ＣＫ量である請求項７または８に記載の免疫測定方法。 - 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれか１に記載の抗
体で試料を処理し、ｍＣＫ活性を選択的に排除させる工
程を含むＣＫアイソザイムの分別定量法。 - 【請求項１１】 ｓｍＣＫ活性を阻害する抗体単独で処
理し、または該抗ｍＣＫ抗体と請求項１〜５のいずれか
１に記載の抗体を併用して処理して、ｍＣＫ活性を選択
的に排除させる工程を含むＣＫアイソザイムの分別定量
法。 - 【請求項１２】 抗体処理前に試料中のＣＫ活性を測定
し、その後ｕｍＣＫ活性を阻害する抗ｍＣＫ抗体、ｓｍ
ＣＫ活性を阻害する抗ｍＣＫ抗体、抗ＣＫ−Ｍサブユニ
ット抗体のいずれか１または２以上を組み合わせて処理
し、残存活性を測定することを特徴とする、請求項１０
または１１に記載のＣＫアイソザイムの分別定量法。 - 【請求項１３】 ＣＫ−Ｍサブユニットに対する抗体で
試料を処理し、ＣＫ−Ｍ活性を選択的に排除させる工程
を含む請求項１０〜１２のいずれか１に記載のＣＫアイ
ソザイムの分別定量法。 - 【請求項１４】 ＣＫ−Ｍ活性およびｍＣＫ活性の選択
的排除のための処理を一つの工程で同時に行うことを特
徴とする請求項１３に記載のＣＫアイソザイムの分別定
量法。 - 【請求項１５】 ＣＫ−Ｍ活性およびｍＣＫ活性の選択
的排除のための処理を二以上の工程で異時に行うことを
特徴とする請求項１３に記載のＣＫアイソザイムの分別
定量法。 - 【請求項１６】 まずＣＫ−Ｍサブユニットに対する抗
体を作用させて残存ＣＫ活性を測定する工程、ついで抗
ｕｍＣＫ抗体および／または抗ｓｍＣＫ抗体を作用させ
て残存ＣＫ活性を測定する工程を含む請求項１５に記載
のＣＫ−ＭＢ活性およびｍＣＫ活性の分別定量法。 - 【請求項１７】 請求項１０〜１６のいずれか１に記載
のＣＫアイソザイムの分別定量方法により得られた測定
値から全身疾患との関連付けを行うことを特徴とするＣ
Ｋアイソザイムの検査方法。 - 【請求項１８】 請求項７〜１７のいずれか１に記載
のＣＫアイソザイム活性測定方法に必要な測定用試薬を
キット化または単品で構成されてなるＣＫアイソザイム
測定用試薬。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002129070A JP2003321499A (ja) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | ミトコンドリアクレアチンキナーゼ抗体 |
| CN03122126.2A CN1454902A (zh) | 2002-04-30 | 2003-04-17 | 线粒体肌酸激酶抗体 |
| US10/424,740 US7148063B2 (en) | 2002-04-30 | 2003-04-29 | Mitochondrial creatine kinase antibody |
| DE60318271T DE60318271T2 (de) | 2002-04-30 | 2003-04-30 | Antikörper gegen allgegenwärtige mitochondriale Kreatinkinase und dessen Verwendung |
| EP03008898A EP1359162B1 (en) | 2002-04-30 | 2003-04-30 | Antibody specific for ubiquitous mitochondrial creatine kinase and its use |
| AT03008898T ATE382062T1 (de) | 2002-04-30 | 2003-04-30 | Antikörper gegen allgegenwärtige mitochondriale kreatinkinase und dessen verwendung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002129070A JP2003321499A (ja) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | ミトコンドリアクレアチンキナーゼ抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003321499A true JP2003321499A (ja) | 2003-11-11 |
| JP2003321499A5 JP2003321499A5 (ja) | 2005-09-29 |
Family
ID=29208212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002129070A Pending JP2003321499A (ja) | 2002-04-30 | 2002-04-30 | ミトコンドリアクレアチンキナーゼ抗体 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7148063B2 (ja) |
| EP (1) | EP1359162B1 (ja) |
| JP (1) | JP2003321499A (ja) |
| CN (1) | CN1454902A (ja) |
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| DE (1) | DE60318271T2 (ja) |
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| CN106093386A (zh) * | 2016-05-27 | 2016-11-09 | 安徽伊普诺康生物技术股份有限公司 | 一种测定肌酸激酶同工酶（ck‑mb）的试剂盒 |
| CN111647086B (zh) * | 2020-04-28 | 2022-04-19 | 武汉百杰康生物科技有限公司 | 一种重组小鼠抗人肌酸激酶单克隆抗体、制备方法和应用 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6440710B1 (en) * | 1998-12-10 | 2002-08-27 | The Scripps Research Institute | Antibody-catalyzed deuteration, tritiation, dedeuteration or detritiation of carbonyl compounds |
| JP4455767B2 (ja) * | 1999-01-19 | 2010-04-21 | シスメックス株式会社 | クレアチンキナーゼアイソザイム活性測定法および測定試薬 |
| JP5058403B2 (ja) * | 2000-06-27 | 2012-10-24 | シスメックス株式会社 | Ｃｋ−ｍｂ活性測定法およびｃｋ−ｍｂ活性測定試薬 |
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2002
- 2002-04-30 JP JP2002129070A patent/JP2003321499A/ja active Pending
-
2003
- 2003-04-17 CN CN03122126.2A patent/CN1454902A/zh active Pending
- 2003-04-29 US US10/424,740 patent/US7148063B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 AT AT03008898T patent/ATE382062T1/de not_active IP Right Cessation
- 2003-04-30 EP EP03008898A patent/EP1359162B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-04-30 DE DE60318271T patent/DE60318271T2/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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| DE60318271T2 (de) | 2008-12-11 |
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| US20030228316A1 (en) | 2003-12-11 |
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