JP3186647B2 - 病原菌感染の検査用キット及びモノクローナル抗体 - Google Patents
病原菌感染の検査用キット及びモノクローナル抗体Info
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- JP3186647B2 JP3186647B2 JP14096397A JP14096397A JP3186647B2 JP 3186647 B2 JP3186647 B2 JP 3186647B2 JP 14096397 A JP14096397 A JP 14096397A JP 14096397 A JP14096397 A JP 14096397A JP 3186647 B2 JP3186647 B2 JP 3186647B2
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この発明は、病原菌感染の検
査用キットに関し、特に蛋白分解酵素により断片化され
たα１アンチトリプシンを検出することにより病原菌感
染を調べる検査用キットに関する。
査用キットに関し、特に蛋白分解酵素により断片化され
たα１アンチトリプシンを検出することにより病原菌感
染を調べる検査用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】病原菌の感染は従来、喀痰や尿など感染
が疑われる部位に由来する生体試料を培養して菌を検出
する方法が主に行われてきている。
が疑われる部位に由来する生体試料を培養して菌を検出
する方法が主に行われてきている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、病原菌
を増殖させて検出する方法には、生体試料が採取された
後に外部から混入した菌が増殖してしまう偽陽性の問題
と、菌が培養開始までに死滅してしまい増殖しなくなる
偽陰性の問題がある。また、菌の培養は通常１日では結
果がでないため、治療の開始が遅れるという問題もあ
る。この発明は、これらの問題点に着目してなされたも
のであって、上記の従来の方法にかわる病原菌感染の検
査法を提供することを目的とする。
を増殖させて検出する方法には、生体試料が採取された
後に外部から混入した菌が増殖してしまう偽陽性の問題
と、菌が培養開始までに死滅してしまい増殖しなくなる
偽陰性の問題がある。また、菌の培養は通常１日では結
果がでないため、治療の開始が遅れるという問題もあ
る。この発明は、これらの問題点に着目してなされたも
のであって、上記の従来の方法にかわる病原菌感染の検
査法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに、この発明では、病原菌に由来する蛋白分解酵素に
より断片化されたα１アンチトリプシンを測定対象とし
ている。血液からの移行あるいは組織細胞の産出などに
より組織に含まれるα１アンチトリプシンは、病原性を
示す菌に含まれるある種の蛋白分解酵素により特定の箇
所で切断され特定の形に断片化することが知られてい
る。今回、本発明者らは、病原菌に由来する蛋白分解酵
素により断片化されたα１アンチトリプシンにのみ反応
する抗体を作製し、その抗体を用いた免疫的検査法で生
体試料中の断片化されたα１アンチトリプシンを検出す
る方法を確立した。この方法は断片化されたα１アンチ
トリプシンだけにしか反応せず、未処理のα１アンチト
リプシンには反応を示さなかった（図１）。以上のごと
く、生体試料中の蛋白分解酵素により断片化されたα１
アンチトリプシンを検出することにより病原菌の感染を
調べることができる。測定に要する時間は２〜３時間で
あり、短時間で感染の判定が可能である。本法において
も、生体試料が採取された後に外部から混入した菌が増
殖してしまう偽陽性の問題点が存在するが、これは、生
体試料採取後に細菌プロテアーゼに対する強力な阻止剤
を添加することにより回避できる。抗体を得るための抗
原としての断片化α１アンチトリプシンを作製する方法
としては、血清などから精製されたα１アンチトリプシ
ンを蛋白分解酵素で限定的に分解して、蛋白断片を得る
方法、あるいはα１アンチトリプシンが限定的に分解さ
れたときに生じるペプチドをアミノ酸から合成する方法
などがある。また、測定対象の生体試料としては喀痰、
尿、歯周ポケット部プラーク、唾液など、病原菌感染の
考えられる部位由来試料が利用できる。
めに、この発明では、病原菌に由来する蛋白分解酵素に
より断片化されたα１アンチトリプシンを測定対象とし
ている。血液からの移行あるいは組織細胞の産出などに
より組織に含まれるα１アンチトリプシンは、病原性を
示す菌に含まれるある種の蛋白分解酵素により特定の箇
所で切断され特定の形に断片化することが知られてい
る。今回、本発明者らは、病原菌に由来する蛋白分解酵
素により断片化されたα１アンチトリプシンにのみ反応
する抗体を作製し、その抗体を用いた免疫的検査法で生
体試料中の断片化されたα１アンチトリプシンを検出す
る方法を確立した。この方法は断片化されたα１アンチ
トリプシンだけにしか反応せず、未処理のα１アンチト
リプシンには反応を示さなかった（図１）。以上のごと
く、生体試料中の蛋白分解酵素により断片化されたα１
アンチトリプシンを検出することにより病原菌の感染を
調べることができる。測定に要する時間は２〜３時間で
あり、短時間で感染の判定が可能である。本法において
も、生体試料が採取された後に外部から混入した菌が増
殖してしまう偽陽性の問題点が存在するが、これは、生
体試料採取後に細菌プロテアーゼに対する強力な阻止剤
を添加することにより回避できる。抗体を得るための抗
原としての断片化α１アンチトリプシンを作製する方法
としては、血清などから精製されたα１アンチトリプシ
ンを蛋白分解酵素で限定的に分解して、蛋白断片を得る
方法、あるいはα１アンチトリプシンが限定的に分解さ
れたときに生じるペプチドをアミノ酸から合成する方法
などがある。また、測定対象の生体試料としては喀痰、
尿、歯周ポケット部プラーク、唾液など、病原菌感染の
考えられる部位由来試料が利用できる。
【０００５】
１．抗ヒト断片化α１アンチトリプシンモノクローナル
抗体の作製法 〔抗原の調整〕 血清などから精製されたα１アンチトリプシンを蛋白分
解酵素で限定的に分解して、抗原としての断片化α１ア
ンチトリプシンを精製する。ここで、蛋白分解酵素は、
検査対象となる病原菌に由来するものであり、典型的に
は、下表のような関係が成立する。
抗体の作製法 〔抗原の調整〕 血清などから精製されたα１アンチトリプシンを蛋白分
解酵素で限定的に分解して、抗原としての断片化α１ア
ンチトリプシンを精製する。ここで、蛋白分解酵素は、
検査対象となる病原菌に由来するものであり、典型的に
は、下表のような関係が成立する。
【０００６】
【表１】
【０００７】また、α１アンチトリプシンが上記の各蛋
白分解酵素によって分解されたときに生じるペプチド
を、アミノ酸から合成して抗原として使用しても良い。
なお、以降に説明する実施例は、抗原として緑膿菌産生
のアルカリプロテアーゼで断片化したα１アンチトリプ
シンを使用したものであり、その結果、図１に示す反応
特性が得られた。 〔動物への免疫〕 これらの抗原をリン酸緩衝生理食塩液で１mg/ml 溶液と
なるように調整し、この溶液とフロインドアジュバンド
を等量混合して得られるエマルジョンを、６週令のマウ
ス（Balb／Ｃ系マウス）の腹腔内に５００μｌ投与し
た。この作業を２週間おきに計３回免疫を行った。 〔細胞融合〕 最終免疫後４日目にこのマウスの脾臓から採取した脾リ
ンパ球細胞をマウス骨髄腫細胞(P3-X63-Ag8-U1）と融合
させた。融合方法は５０％ポリエチレングリコール４０
００溶液を融合促進剤として用い、融合促進剤の添加、
混合及び希釈の各操作からなる融合時間を１０分間、３
７℃で行った。次に、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン・ア
ミノプテリン・チミジン・１０％ウシ胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ培地）に融合終了後の融合細胞を分散させ、つい
で、１０枚の９６穴マイクロプレートの各ウエルに２０
０μｌ分注し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養し
た。 〔抗ヒト断片化α１アンチトリプシンモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマの選択及び単一化〕 約１週間後、各ウエルのＨＡＴ培地を１００μｌ吸引
し、ＨＴ培地（ヒポキサンチン・チミジン・１０％ウシ
胎児血清を含むＲＰＭＩ培地）を各ウエルに分注し、２
〜３日後、抗体産生ハイブリドーマの選択を行った。選
択方法は、断片化α１アンチトリプシンを固定化した９
６穴マイクロプレートに、各ウエルのハイブリドーマ形
成コロニーの培養上清を１００μｌ分注して反応させ、
ついで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグ
ロブリン抗体を１００μｌ添加し、反応後洗浄を行い目
的とする抗体をペルオキシダーゼ活性にて検出した。次
に、抗体産生を示したコロニーを回収し、限界希釈法に
てハイブリドーマの単一コロニーを得るようにクローニ
ングを行った。その方法は、回収したコロニーをＨＴ培
地で希釈し、９６穴マイクロプレートの各ウエルにハイ
ブリドーマがウエル当たり１個以下となるようにフィー
ダー細胞と共に散布した。以上の操作を２回行い、モノ
クローン化された抗ヒト断片化α１アンチトリプシン抗
体産生ハイブリドーマを得た。 〔抗ヒト断片化α１アンチトリプシンモノクローナル
抗体の腹水化〕 ８週令のマウス（Balb／Ｃ系マウス）の腹腔内にプリス
タン（免疫抑制剤）を投与した。３〜７日後に抗体産生
ハイブリドーマを腹腔内に投与し、約７日後にマウスの
腹腔から腹水化された抗体を回収した。 〔抗体の精製〕 腹水化して得られた抗体を５０％硫酸アンモニウムで２
回塩析分離を行い、リン酸緩衝生理食塩液にて透析して
精製した。
白分解酵素によって分解されたときに生じるペプチド
を、アミノ酸から合成して抗原として使用しても良い。
なお、以降に説明する実施例は、抗原として緑膿菌産生
のアルカリプロテアーゼで断片化したα１アンチトリプ
シンを使用したものであり、その結果、図１に示す反応
特性が得られた。 〔動物への免疫〕 これらの抗原をリン酸緩衝生理食塩液で１mg/ml 溶液と
なるように調整し、この溶液とフロインドアジュバンド
を等量混合して得られるエマルジョンを、６週令のマウ
ス（Balb／Ｃ系マウス）の腹腔内に５００μｌ投与し
た。この作業を２週間おきに計３回免疫を行った。 〔細胞融合〕 最終免疫後４日目にこのマウスの脾臓から採取した脾リ
ンパ球細胞をマウス骨髄腫細胞(P3-X63-Ag8-U1）と融合
させた。融合方法は５０％ポリエチレングリコール４０
００溶液を融合促進剤として用い、融合促進剤の添加、
混合及び希釈の各操作からなる融合時間を１０分間、３
７℃で行った。次に、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン・ア
ミノプテリン・チミジン・１０％ウシ胎児血清を含むＲ
ＰＭＩ培地）に融合終了後の融合細胞を分散させ、つい
で、１０枚の９６穴マイクロプレートの各ウエルに２０
０μｌ分注し、３７℃、５％炭酸ガス存在下で培養し
た。 〔抗ヒト断片化α１アンチトリプシンモノクローナル
抗体産生ハイブリドーマの選択及び単一化〕 約１週間後、各ウエルのＨＡＴ培地を１００μｌ吸引
し、ＨＴ培地（ヒポキサンチン・チミジン・１０％ウシ
胎児血清を含むＲＰＭＩ培地）を各ウエルに分注し、２
〜３日後、抗体産生ハイブリドーマの選択を行った。選
択方法は、断片化α１アンチトリプシンを固定化した９
６穴マイクロプレートに、各ウエルのハイブリドーマ形
成コロニーの培養上清を１００μｌ分注して反応させ、
ついで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグ
ロブリン抗体を１００μｌ添加し、反応後洗浄を行い目
的とする抗体をペルオキシダーゼ活性にて検出した。次
に、抗体産生を示したコロニーを回収し、限界希釈法に
てハイブリドーマの単一コロニーを得るようにクローニ
ングを行った。その方法は、回収したコロニーをＨＴ培
地で希釈し、９６穴マイクロプレートの各ウエルにハイ
ブリドーマがウエル当たり１個以下となるようにフィー
ダー細胞と共に散布した。以上の操作を２回行い、モノ
クローン化された抗ヒト断片化α１アンチトリプシン抗
体産生ハイブリドーマを得た。 〔抗ヒト断片化α１アンチトリプシンモノクローナル
抗体の腹水化〕 ８週令のマウス（Balb／Ｃ系マウス）の腹腔内にプリス
タン（免疫抑制剤）を投与した。３〜７日後に抗体産生
ハイブリドーマを腹腔内に投与し、約７日後にマウスの
腹腔から腹水化された抗体を回収した。 〔抗体の精製〕 腹水化して得られた抗体を５０％硫酸アンモニウムで２
回塩析分離を行い、リン酸緩衝生理食塩液にて透析して
精製した。
【０００８】２．酵素免疫法による歯周プラーク中の病
原菌の検出 〔マイクロプレートへの抗体の固相化〕 マイクロプレートの各ウェルに抗断片化α１アンチトリ
プシン抗体５μg/mlを含むトリス−塩酸緩衝液(0.05M p
H8.4) を 100μl ずつ分注し、一夜４℃で放置して抗体
を物理吸着の原理でウェルに固相化する。 〔酵素標識抗体の調製〕 別途、過ヨーソ酸法により、アルカリホスファターゼを
抗α１アンチトリプシン抗体に標識して調製する。 〔歯周ポケット試料の採取〕 濾紙片を歯周ポケットに差し込み、歯周ポケット成分を
染み込ませ、容器中で0.1％の牛血清アルブミンを含む
トリス−塩酸緩衝液(0.05M pH7.5) を用いてα１アンチ
トリプシンを抽出する。 〔歯周ポケット中α１アンチトリプシンの測定〕 各ウェルに歯周ポケット抽出サンプルを 100μl 分注
し、混和した後、37℃で１時間反応させる。次にマイク
ロプレートをTween 20を0.05％含むトリス−塩酸緩衝液
(0.05M pH7.5) で３回洗浄する。その後、酵素標識抗α
１アンチトリプシン抗体 2.5μg/mlおよび１％の牛血清
アルブミンを含むトリス−塩酸緩衝生理食塩水(0.1M pH
8.0)を 100μl ずつ分注し、混和した後、37℃で１時間
反応させる。次にマイクロプレートをTween 20を0.05％
含むトリス−塩酸緩衝液(0.05M pH7.5) で３回洗浄す
る。その後、 Kind-King法の基質緩衝液 100μl を各ウ
ェルに加え、37℃で30分間反応させる。ここで基質緩衝
液は、Disodium Phenyl phosphate 0.215gと4-aminoant
ipyrine 0.09g を炭酸緩衝液(0.05M pH10.15) 100ml に
溶解したものである。次いで、 100μl の呈色液を各ウ
ェルに加えて、呈色させる。ここで呈色液は、200ml の
脱イオン水に2.6gのホウ酸を溶解させた後、0.38g のPo
tassium Ferricyanideを溶解させたものである。最後
に、各ウェルの呈色をマイクロプレート用比色計を用い
て510/630nm の波長で比色し検量線から歯周ポケット中
断片化α１アンチトリプシン濃度を算出する。
原菌の検出 〔マイクロプレートへの抗体の固相化〕 マイクロプレートの各ウェルに抗断片化α１アンチトリ
プシン抗体５μg/mlを含むトリス−塩酸緩衝液(0.05M p
H8.4) を 100μl ずつ分注し、一夜４℃で放置して抗体
を物理吸着の原理でウェルに固相化する。 〔酵素標識抗体の調製〕 別途、過ヨーソ酸法により、アルカリホスファターゼを
抗α１アンチトリプシン抗体に標識して調製する。 〔歯周ポケット試料の採取〕 濾紙片を歯周ポケットに差し込み、歯周ポケット成分を
染み込ませ、容器中で0.1％の牛血清アルブミンを含む
トリス−塩酸緩衝液(0.05M pH7.5) を用いてα１アンチ
トリプシンを抽出する。 〔歯周ポケット中α１アンチトリプシンの測定〕 各ウェルに歯周ポケット抽出サンプルを 100μl 分注
し、混和した後、37℃で１時間反応させる。次にマイク
ロプレートをTween 20を0.05％含むトリス−塩酸緩衝液
(0.05M pH7.5) で３回洗浄する。その後、酵素標識抗α
１アンチトリプシン抗体 2.5μg/mlおよび１％の牛血清
アルブミンを含むトリス−塩酸緩衝生理食塩水(0.1M pH
8.0)を 100μl ずつ分注し、混和した後、37℃で１時間
反応させる。次にマイクロプレートをTween 20を0.05％
含むトリス−塩酸緩衝液(0.05M pH7.5) で３回洗浄す
る。その後、 Kind-King法の基質緩衝液 100μl を各ウ
ェルに加え、37℃で30分間反応させる。ここで基質緩衝
液は、Disodium Phenyl phosphate 0.215gと4-aminoant
ipyrine 0.09g を炭酸緩衝液(0.05M pH10.15) 100ml に
溶解したものである。次いで、 100μl の呈色液を各ウ
ェルに加えて、呈色させる。ここで呈色液は、200ml の
脱イオン水に2.6gのホウ酸を溶解させた後、0.38g のPo
tassium Ferricyanideを溶解させたものである。最後
に、各ウェルの呈色をマイクロプレート用比色計を用い
て510/630nm の波長で比色し検量線から歯周ポケット中
断片化α１アンチトリプシン濃度を算出する。
【０００９】
【発明の効果】以上説明したように、生体試料中の断片
化α１アンチトリプシンを測定すれば、簡便に病原菌の
感染を調べることができる。
化α１アンチトリプシンを測定すれば、簡便に病原菌の
感染を調べることができる。
【図１】本発明法による反応特性を図示したものであ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｄ 33/577 33/577 Ｂ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/009 - 1/62 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (3)
- 【請求項１】 病原菌由来の蛋白分解酵素により断片化
されたα１アンチトリプシンを検出することを特徴とす
る病原菌感染の検査用キット。 - 【請求項２】 酵素免疫法やラテックス凝集反応などの
免疫学的測定法を用いることを特徴とする請求項１に記
載の病原菌感染の検査用キット。 - 【請求項３】 マウス骨髄腫細胞と、病原菌由来の蛋白
分解酵素により断片化されたα１アンチトリプシンで免
疫された哺乳類の脾臓細胞とを融合させて得られるハイ
ブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体であっ
て、 α１アンチトリプシンには反応せず、前記蛋白分解酵素
により断片化されたα１アンチトリプシンに特異的に反
応し、 喀痰、尿、歯周ポケット部プラーク、または唾液中の断
片化されたα１アンチトリプシンを免疫学的測定法によ
って認識できることを特徴とするモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14096397A JP3186647B2 (ja) | 1997-05-14 | 1997-05-14 | 病原菌感染の検査用キット及びモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14096397A JP3186647B2 (ja) | 1997-05-14 | 1997-05-14 | 病原菌感染の検査用キット及びモノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10313897A JPH10313897A (ja) | 1998-12-02 |
| JP3186647B2 true JP3186647B2 (ja) | 2001-07-11 |
Family
ID=15280898
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14096397A Expired - Fee Related JP3186647B2 (ja) | 1997-05-14 | 1997-05-14 | 病原菌感染の検査用キット及びモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3186647B2 (ja) |
-
1997
- 1997-05-14 JP JP14096397A patent/JP3186647B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｃｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．２，ｐ．２４９−２５０（１９７７） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10313897A (ja) | 1998-12-02 |
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