JPH04505253A

JPH04505253A - 血液中のニューモシスティスカリニ抗原の存在を検出する方法およびシステム

Info

Publication number: JPH04505253A
Application number: JP50760990A
Authority: JP
Inventors: ホッフマン　ジョン　ダブリュー; ウッドリング　シンシア　エス
Original assignee: ザイトロニックス　インコーポレイテッド
Priority date: 1989-05-11
Filing date: 1990-05-11
Publication date: 1992-09-17
Also published as: EP0472599A4; CA2016524A1; WO1990013670A1; AU5644390A; PT94002A; GR1001087B; IE901719L; GR900100355A; EP0472599A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は血液中のニューモジステイスカリニ抗原の存在を検出する診断法に関するものである。

は一般に無症状的に健康な個人に感染し、かつ発育不良の幼児および他の免疫障害患者、例えば移植または種々の悪性腫瘍の治療を受けている患者およびＡＩＤＳまたは先天性異常に冒されている人々に重度の感染を引き起こす。

一般に、肺炎の決定的診断は肺組織におけるＰ、カリニシストの存在を調べることにより行われる。しかしながら、肺組織の試料を得るのに使用する様々な手続きに関連する大きな危険があり、またこの関連する危険性は呼吸困難を伴う患者に対しては一層大きくなる。侵入性の低い免疫診断法が報告されており、この方法ではＰ、カリニ抗原と免疫反応する抗体（抗−Ｐ、カリニ抗体）を使用して、痰、ホモジナイズ肺試料または気管支吸引試料中のＰ、力仄三抗原の存在を検出している。これについては、リム（Ｌｉｍ）の米国特許第３．９９２．５１６号およびＡ、ピッチェニク（Ｐｉｔｃｈｅｎｉｋ）等の論文、Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、　１９８６．１３３．　ｐｐ、　２２６−２２９を参照のこと。

患者の血清中の抗−Ｐ、カリニ抗体またはＰ、カリニ抗原の何れかもしくはその両者の検出にもとず＜Ｐ、カリニ肺炎の診断の多数の試みが報告されている。間質性形質細胞性肺炎に関する最近の血清学的診断法の研究では、間接的免疫螢光法（ＩＩＦ）および酵素結合抗体免疫吸着アッセイ法（ＩＥＬＩＳＡ）両者を利用して患者の血清中（Ｈｕｇｈｅｓ　）の論文、−ニーモジステイスカリニ肺炎（Ｐ、　ｃａｒｉｎｉｉＰｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ）、　ＣＲＣプレス、フロリダ州、ポカラトン（ＢｏｃａＲａｔｏｎ）、　１９８７．第１Ｉ巻を参照のこと。

しかしながら、Ｐ、カリニに対する抗体の検出は、正常な多くの個人がＰ、カリニ抗原に対する抗体をもつとされている疾患の指標として信頼できるものではなく、かつ免疫異常患者はＰ９カリニ抗原に対する抗体を検知し得る濃度で生成する十分な免疫機能をもたない可能性がある。Ｌ、ピッｙ−（Ｐｊｆｅｒ）等のＰｅｄｉａｔｒｉｃｓ、　１９７８．６１．　ｐｐ、　３５−４１における論文を参照のこと。

血液（抗原面）中のＰ、カリニ抗原を検出することを試みたいくつかのアッセイが報告されているが、そのいずれもどの抗原を見出したかを明確にしていない。

Ｓ、マディスン（Ｍａｄｄｉｓｏｎ）等の論文、Ｊｏｕｒｎ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９８２．　１５．　ｐｐ、　１０３６−１０４３およびり、ピファー等の論文、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９８４．２０．　ｐｐ、　８８７−８９０を参照のこと。これらの研究は、肺組織からの部分的に精製されたＰ、カリニシストに対するポリクローナル抗血清を使用して、血液中の不特定の抗原を検出している。しかしながら、Ｐ、カリニ肺炎の検出におけるこれらのアッセイの信頼性はその低い特異性のために批判されている。ヒユーズ（Ｈｕｇｈｅｓ）の論文、Ｃｈｅｓｔ、　１９８５゜ト結果を示し、結果としてＰ、カリニ肺炎の診断におけるポリクローナル抗体にもとずくテストが不精確であることを立証している。

メイヤーズ（Ｍｅｙｅｒｓ　）等の論文、Ａｍｅｒ、　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｒｅ５ｐ、　Ｄｉｓ、。

１９７９、１２０．　ｐｐ、　１２８３−１２８７；　７デイスン（Ｍａｄｄｉｓｏｎ）等の論文、Ｄｉａｇ、　Ｍｉｃｒｏ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１９８４．２．　ｐｐ、　６９−７３；およびピア７−等の論文、Ｃｈｅｓｔ、　１９８５．８７．　ｐｐ、　６９８−６９９を参照のこと。

このＰ、カリニの抗原特性はポリクローナルおよびモノクローナル抗体両者を使用して探究された。見掛は上の分子量４５．５０および１１６キロダルトン（ＫＤ）を有する３種の主なラットＰ、カリニ抗原がポリクローナル抗血清を使用したウェスタンプロット法により同定された。ポリクローナル抗血清を使用したウェスタンプロット法により検出し得る主なラットのＰ、カリニ抗原とヒトのＰ、カリニ抗原との直接比較がＰ、ワルツアー（Ｗａｌｚｅｒ）等の論文、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　１９８７．　１３８．　ｐｐ、２２５７−２２６７に報告されている。同定されたヒトＰ、カリニ抗原は見掛は上の分子量４０．６６および１１６ＫＤの抗原を含んでいた。ポリクローナル抗血清を使用した研究に加えて、ラットの肺から分子量３５．５５．９０．１１０および１１６　ＫＤのＰ、カリニ抗原を単離したことが、Ｄ、グレープズ（Ｇｒａｖｅｓ　）により報告された（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、　１９８６．匪ｐｐ、　１２５−１３３）　。

Ｐ、カリニにより引き起こされる疾病は、殆ど完全に感染したラットに限定されている。感染の決定的な診断は肺組織、痰、肺吸引物または呼吸気管吸引物中のＰ、カリニ微生物の検出に依存している。Ｐ、カリニ微生物は咽頭の塗抹標本、気管吸引物、痰、胃の吸引物、気管支肺の洗浄液および稀な場合には骨髄に検出されている。しかしながら、上記のポリクローナル血清または抗−Ｐ９カ発明の概要今や、臨床的にＰ、カリニに感染した個体の血液中には、Ｐ、カリニ栄養型関連抗原か存在することが見出された。

本発明は、従って、哺乳動物における臨床的Ｐ、カリニ感染の存在を検出するのに有用なアッセイ法およびキット形状の診断システムを提供する。

一態様において、本発明は哺乳動物における臨床的Ｐ、カリニ感染の存在を検出するアッセイ法を意図し、該方法は哺乳動物から得た脈管流体試料を、１１６　ＫＤのＰ、カリニ抗原あるいは抗原的に交叉反応性のそのフラグメントに対して免疫特異性の抗体と混合することにり免疫反応混合物を形成する工程を含む。この混合物を、該血液試料中に存在する該１１６　ＫＤのＰ、カリニ抗原の何れかと抗−１１６ＫＤ抗体とを免疫反応させて、１１６　ＫＤＰ、カリニ抗原含有免疫反応生成物を形成するのに十分な時間維持する。これにより形成される任意の１１６　ＫＤＰ、カリニ抗原含有免疫反応生成物の検出は該哺乳動物中におけるＰ、カリニ感染の存在の尺度を与える。

本発明は、更に上記のアッセイ法を実施するのに有用なキット形状の診断システムを意図する。このシステムはパッケージを含み、該パッケージは約１１６　ＫＤの還元した見掛は上の分子量を有するＰ、カリニ抗原および見掛は上の分子量２３および５６　ＫＤを有する該抗原の抗原的に交叉反応性のフラグメントに対して免疫特異性のモノクローナル抗体、ｃａ−３を含む。

か（して、本発明はいくつかの利点をもたらす。本発明の診断法およびシステムによりもたらされる一つの利点は、臨床的Ｐ、カリニ感染の存在について各個体を血清学的にスクリーニングして、肺生検などの侵入性の手続きを実施する必要性を排除できることにある。

図面の簡単な説明本発明の開示の一部をなす添付図において、第１図は実施例３に従って血清中のＰ、カリニ抗原を検出した結果を示す。Ｐ、カリニ肺炎に罹患した患者の血清には明確なバンドが観測された（レーンＩ）。Ｐ、カリニ抗原はＰ、カリニ肺炎に罹患していない患者の血清中には存在しない（レーン２）。

出された１１６　ＫＤＰ、カリニ抗原および２種の２３ＫＤの抗原的に交叉反応性のフラグメントを示す。

発明の詳細な説明臨床的および潜伏的Ｐ、カリニ感染を識別するのに有用である。ここで使用する「臨床的感染」なる用語は、個体の肺上またはその中にかなりの数のＰ、カリニ微生物が存在することによる、臨床的に検知し得る症状、例えば呼吸困難、発熱、咳、チアノーゼおよび散在性両側性浸潤物（ｄｉｆｆｕｓｅ　ｂｉｌａｔｅｒａｌ　１ｎｆｉｌｔｒａｔｅ）などが存在することを意味する。Ｐ、カリニ誘発性疾病の臨床的かつ組織学的証拠の詳細については、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ。

第７．８および１０章、　ＣＲＣブレス社、フロリダ州ポカラトン（ＢｏｃａＲａｔｏｎ）、　１９８７を参照のこと。（ここで引用する文献を本発明の参考文献とする）。これとは逆に、ここで使用する「潜伏的感染（ｌａｔｅｎｔ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）Ｊなる用語は無症状のＰ、カリニ感染、即ち少数の微生物の存在または疾病の顕著な臨床的かつ組織学的証拠がないことを意味する。

広い意味で言えば、本発明の方法並びにシステムは、脈管流体試料、例えば血液、血清、血漿等に存在するＰ、カリニ抗原の存在を検出し、臨床的Ｐ、カリニ感染の存在を決定する。臨床的感染に対する血液起原のマーカーとして機能する好ましいＰ、カリニ抗原は、Ｐ、カリニ栄養体により表現される１１６　ＫＤ蛋白および抗原的に交叉反応性のそのフラグメントである。

ここで使用するｒｌ１６　ＫＤＰ、カリニ抗原」または「Ｐ、カリニ１１６ＫＤ抗原」なる用語はＰ、カリニ栄養体の表面に存在し、および温和な還元条件下、例えば約０．２Ｍ以下の２−メルカプトエタノールを使用した、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により測定された見掛けの分子量１１６　ＫＤを有する蛋白抗原を意味する。

ここで使用する「抗原的に交叉反応性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃａｌｌｙ　ｃｒｏｓｓｒｅａｃｔｉｖｅ）　Ｊなる用語は全体的なアミノ酸残基配列の異なる２種のポリペプチドを意味し、このポリペプチドは１つの抗原決定基（エピトープ）の実質的な部分を有し、その結果競争的阻害により明らかにされている所定の抗体と免疫反応し得る。

蛋白の抗原的に交叉反応性のフラグメントの生成法は当分野で公知であり、酵素開裂、化学的開裂、化学的合成などを含む。有用な蛋白分解酵素はトリプシン、キモトリプシンなどを包含する。

蛋白を化学的に開裂するのに有用な試薬は臭化シアンなどを含む。

該蛋白の一部のアミノ酸残基配列が公知である場合、この部分は、例えばメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅｌｄ）の固相法などにより合成することができる。Ｊ、Ｍ、スチュワード（Ｓｔｅｗａｒｄ）およびＪ、　Ｄ、ヤング（Ｙｏｕｎｇ）の論文（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　１９６９．　Ｗ、Ｈ，フリーマン社（Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ、　）、サンフランシスコ）を参照のこと。

従って、本発明は抗体、即ちポリクローナルまたはモノクローナル抗体の何れかを使用して、試料中の１１６　ＫＤ抗原の存在に直接または間接的に関連する免疫反応生成物を形成することによる、１１６　ＫＤＰ、カリニ抗原を免疫的にアッセイする方法を意図する。当業者は、免疫反応生成物を形成するのに抗体が利用できるような多数の周知の臨床的化学的診断法があり、該生成物の存在が脈管流体試料中の１１６　ＫＤＰ、カリニ抗原の存在に関連することを理解しているであろう。かくして、例示的なアッセイ法をここに記載するが、本発明はこれにより限定されない。

本発明のアッセイ法を実施するには、種々の競争的または非競争的な、不均一なおよび均一なプロトコールを使用することが可能である。と（に好ましいプロトコールは米国特許第４．２３３．４０１号；同第４．２３３．４０１号；同第４．３７６、１１０号；同第３．６５４．０９０号；同第３．８５０．７５２号および同第４．２３３．４０２号に記載されている。例えば、−態様においては、本発明は以下の諸工程を含む免疫アッセイ法を意図する。

（ａ）脈管流体試料と、Ｐ、カリニ１１６　ＫＤ抗原または抗原的に交叉反応性のそのフラグメントにより表現されるエピトープに対して免疫特異性の抗体、好ましくはモノクローナル抗体とを混合することにより免疫反応混合物を形成する工程。このような抗体の製法は当分野で周知である。好ましくは、該脈管流体試料は既知量の血液由来の生成物、例えば血清または血漿として与えられる。

（ｂ）該免疫反応混合物を、該試料中に存在するＰ、カリニ１１６　ＫＤ抗原のいずれかがＰ、カリニ１１６　ＫＤ抗原含有免疫反応生成物を形成するのに十分な時間、生物学的アッセイ条件下に維持する工程。該生物学的アッセイ条件とは、本発明の免疫化学試薬およびアッセ〜約９のＩ）Ｈ１蒸溜水のイオン強度乃至約１モルの塩化ナトリウムのイオン強度までの範囲内のイオン強度を含む。これらの条件を最適化する方法は当分野で周知である。このような生物学的条件の下での典型的な維持時間は、約４〜約４５°Ｃの範囲の温度の下で、約１０分〜約１６−２０時間の範囲内である。

物の存在の測定法は当分野において周知である。これらの方法は典型的には、標識物質を付着させて、該標識物質の存在を検出することを含む。標識の例は本明細書の診断システムの部分において、標識を必要としない「検出手段」として議論される。

好ましい態様においては、該第−の免疫反応生成物は上記工程（Ｃ）の前に以下の如く更に処理、即ち標識する。

（ｄ）標識抗−１１６ＫＤ抗体、好ましくは上記の第一の抗体とは異なるエピトープ特異性を有する抗体を混合して、第二の免疫反応生成物を形成する工程。

（ｅ）か（して形成した該第二の混合物を、該標識抗体が第二の標識免疫反応生成物を形成するのに十分な所定の時間、生物学的アッセイ条件下に維持する工程。（ｆ）該標識免疫反応生成物の存在を測定する工程。

もう一つの態様では、本発明は以下のような工程を含む二重抗体即ち「サンドウィッチ」免疫アッセイを意図する。

（ａ）脈管流体試料と、第一の抗体、好ましくはモノクローナル抗体とを混合することにより第一の免疫反応混合物を形成する工程。

ここで、該試料中に存在する該抗体と任意のＰ、カリニ１１６　ＫＤ抗原は第一の免疫反応生成物を形成することができ、該生成物は第二の抗体、好ましくはモノクローナル抗体およびより好ましくはＭＡＢ　Ｃａ−３と免疫反応することができる。好ましくは、該第−の抗体は機能可能に固体マトリックスに結合されている。

（ｂ）該免疫反応混合物を、該試料中に存在するＰ、カリニ１１６　ＫＤ抗原のいずれかが存在する抗−１１６ＫＤ抗体結合サイトの一部と免疫反応（免疫学的に結合）するのに十分な時間生物学的アッセイ条件下に維持して、Ｐ、カリニ１１６　ＫＤ抗原含有免疫反応生成物を形成する工程。好ましくは、該第−免疫反応生成物を、次いで該試料から分離する。

（Ｃ）該第−の免疫反応生成物と、該第−の抗体と結合した場合に、該Ｐ、カリニ１１６　ＫＤ抗原と結合することのできる第二の抗体、好ましくは標識した第二の抗体とを混合することにより、第二の免疫反応混合物を形成する工程。好ましくは、該第二の抗体はモノクローナル抗体であり、更に好ましくは該第−の抗体がＭＡＢ　Ｃａ−３ではない場合には、ＭＡＢ　Ｃａ−３である。

（ｄ）該工程（Ｃ）で形成された第二の免疫反応生成物を、第二のまたは「サンドウィッチ」型の免疫反応生成物を形成するのに十分な時間生物学的アッセイ条件下に維持する工程。

（ｅ）形成される第二の免疫反応生成物の量を測定し、結果として該試料中のＰ、カリニ１１６　ＫＤ抗原の量を測定する工程。

好ましくは、工程（Ｃ）の該第二の抗体は、好ましくは酵素で標識され、その結果形成される該第二の免疫反応生成物は標識生成物である。

好ましい二抗体アッセイ法では、工程（ｅ）で測定される免疫反応生成物の量は、同様に形成され、かつ脈管流体試料の代わりに対照試料を使用して測定した免疫反応生成物の量に関連する。ここで、該対照試料は既知の量のＰ、カリニ１１６　ＫＤ抗原を含む。

もう一つの好ましい不均一プロトコールでは、本発明は以下の工程を含む免疫アッセイ法を意図する。

（ａ）脈管流体試料中に存在するアルブミンから、標準的還元条件下での５ＤＳ −ＰＡＧＥにより測定した見掛けの分子量約１１０　ＫＤ〜約１２０ＫＤを有する蛋白を単離する工程。この蛋白の単離法は当分野で周知であり、５ＤＳ−ＰＡＧＥなどのゲル電気泳動技術、濾過およびクロマトグラフィー技術、例えば高速液体クロマトグラフィー法などを含む。

（ｂ）吸着、化学的結合などにより、該単離蛋白を固体マトリックスに固定する工程。有用な固体マトリックスはセルロース誘導体、プラスチックなどを含む。

（Ｃ）固体マトリックスに固定された、任意のＰ、カリニ１１．６ＫＤ抗原または抗原的に交叉反応性のそのフラグメントと免疫反応し得る抗体を混合して、免疫反応混合物を形成する工程。

（ｄ）工程（Ｃ）の該免疫反応混合物を、任意の固体マトリックスに固定されたＰ、カリニ１１６　ＫＤ抗原または抗原的に交叉反応性のそのフラグメントが該抗体と免疫反応するのに十分な時間、生物学的アッセイ条件下に維持する工程。

に交叉反応性のフラグメントの存在を検出する工程。

直接または間接的なＰ、カリニ１１６　ＫＤ抗原含有免疫反応生成物の存在の検出は当分野で周知のアッセイ法により達成でき、典型的には使用する指示手段の形式に依存する。

Ｂ、　抗体およびモノクローナル抗体用語、「抗体」および種々のその文法的な変形は免疫グロブリン分子および／または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち抗体結合サイトまたはパラトープを含む分子を含む組成物を意味する。

「抗体結合サイトｊとは、特異的に抗原に結合する、重鎮および軽鎖可変および高度可変領域を含む抗体分子の構造部分を意味する。

ここで使用する用語、「抗体分子Ｊおよび種々のその文法的な変形は、完全な免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を意味するものとする。

抗体分子の例は、完全な免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子および当分野においてＦａｂ　、　Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’　）ｚおよびＦ（ｖ）として公知の部分を包含する、該パラトープを含む免疫グロブリン分子の部分である。

抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’　）２部分は、周知の方法により、実質的に完全な抗体上でのそれぞれパパインおよびペプシンの蛋白分解反応により調製される。例えば、チオフィロポラス（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ　）およびディクソン（［）ｉｘｏｎ）に付与された米国特許第４．３４２．５６６号を参照のこと。Ｆａｂ’抗体部分も周知であり、メルカプトエタノールなどで２個の重鎮部分を結合しているジスルフィド結合を還元し、次いで生成する蛋白メルカプタンをインドアセタミドなどの試薬でアルキル化することにより、ｐ（ａｂ’　Ｌ部分から形成される。完全な抗体分子を含む抗体が好ましく、またここに例示するように使用される。

本発明のポリクローナル抗体は見掛けの分子量約１１６　ＫＤを有するＰ６カリニ抗原またはその抗原的に交叉反応性のフラグメントに対して免疫特異性である。

ここで使用する用語、「モノクローナル抗体」および種々のその文法的な変形は、特定の抗原と免疫反応できる抗体結合サイトを一種のみもつ組成物を含む抗体分子を意味する。かくして、モツクローナル抗体は、典型的には免疫反応する抗原に対して唯一つの結合親和性を示す。従って、モノクローナル抗体は、それぞれ異なる抗原に対して免疫特異性の複数の抗体結合サイトを有する抗体分子、例えば二重特異性モノクローナル抗体を含むことができる。

本発明のモノクローナル抗体（ＭＡＢ；課題のＭＡＲ）は、そのイディオタイプにより、およびＰ、カリニ１１６　ＫＤ抗原またはその抗原的に交叉反応性のフラグメントにより表現されるエピトープに対して免疫特異性であることにより特徴ずけられる。好ましいＭＡＲはハイブリドーマＣａ−３により生成されるＭＡＲと同様にして、Ｐ、カリニ１１６ＫＤ抗原と免疫反応し、即ちこれに対する免疫反応性を示す。

本明細書で使用する用語「免疫反応性」および種々のその文法的な変形は、所定量の該抗体と所定量の１１６　ＫＤＰ、カリニ抗原との間の免疫反応の５０％阻害を達成するのに必要な抗原の濃度を意味する。即ち、免疫反応性とは、０．５な−るＢ／ＢＯを達成するのに必要とされる抗原の濃度であり、ここで、Ｂｏは競合抗原の不在下で結合する抗体の最大量であり、Ｂは競合抗原の存在下で結合する抗体の量であり、ＢｏおよびＢは両者共にバックグラウンドに対して調節されている。これについては、例えばロッドバード（Ｒｏｄｂａｒｄ）。

Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、　１９７４．２０．　ｐｐ、　１２５５−１２７０を参照のこと。

典型的には全抗体分子を含む課題のモノクローナル抗体は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　バーロウ及レーン（Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄＬａｎｅ　）編、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、　ＮＹ、　１９８８　（この文献を本発明の参考文献とする）に記載のハイブリドーマ技術を利用して調製することができる。簡単に言えば、該モノクローナル抗体組成物を生産するハイブリドーマを形成するために、ミエローマまたは他の自己保全性セルラインを、Ｐ、カリニに感染した肺から得た部分的に精製したＰ、カリニ微生物で高度に免疫化した哺乳動物の牌臓から得たリンパ細胞と融合する。

このミエローマセルラインは該リンパ細胞と同種の哺乳動物由来のものであることが好ましい。典型的には、１２９　ＧＩＸ“種のマウスが好ましい哺乳動物である。本発明で使用するのに適したマウスミエローマ細胞はハイポキサンチン− アミノプテリン−チミジン感受性（ＨＡＴ）セルラインＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳｐ２１０−Ａｇ１４を包含し、これらはそれぞれ寄託番号ＣＲＬ　１５８０およびＣＲＬ　１５８１の下でメリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）のアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｌ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から入手できる。

牌細胞は、典型的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　６０００を使用してミエローマ細胞と融合される。融合されたハイブリッドをＨＡＴに対する感度にもとずいて選別する。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマを、実施例２で記載するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を利用して同定する。

本発明のモノクローナル抗体は、適当な抗原特異性を有する抗体分子を分泌するハイブリドーマ含有栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養物から出発して製造することができる。

この培養物を、該ハイブリドーマが該培地中に抗体分子を分泌する条件下に、該分泌のために十分な時間維持する。次いで、この抗体含有培地を集める。次に、該抗体分子を周知の方法で単離する。

これらの組成物を調製するのに有用な培地は周知であり、かつ市販品として入手でき、合成培地、近親交配のマウスなどを包含する。合成培地の例は、４．５ｇ／ｌのグルコース、２０ｍＭのグルタミンおよび２０％の子牛血清を補充したドゥルベコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の最小基本培地（ＤＭＥＭ；　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ等、　Ｖｉｒｏｌ、、　１９５９．８．　ｌ）、　３９６）である。

近親交配マウス種の例はＢａ１ｂ／ｃマウスである。

上記の方法で精製されるモノクローナル抗体は、例えばＰ、カリ丑１１６　ＫＤ抗原含有免疫反応生成物の形成が望まれる診断形式において利用し得る。

課題とするモノクローナル抗体を生産するのに有用なハイブリドーマ、即ちＭＡＢ　Ｃａ−３はハイブリドーマＣａ−３であり、該ハイブリドーマはブタペスト条約の要求に従って１９８９年５月ｌＯ日付けで寄託番号ＨＢ　１０１３９の下でＡＴＣＣに寄託されている。当分野で周知の如く、ハイブリドーマＣａ−３は、課題のモノクローナル抗体を生産する他の安定なセルラインを生産するために利用することができ、かくして課題のモノクローナル抗体の生産はハイブリドーマＣａ−３自体の培養に依存するものではない。欧州特許庁公開ＷＯ３９１００９９９を参照のこと。

ここで、用語「抗−１１６ＫＤ抗体」および様々な文法的なその表現形態は、免疫グロブリン分子および／または還元した１１６　ＫＤＰ。

カリニ抗原または該抗原の抗原的に交叉反応性のフラグメント上で表現されるエピトープに対して免疫特異性の免疫グロブリン分子の免疫的に活性な部分を含む組成物を意味する。

ここで使用する用語「免疫特異性」および様々な文法的なその表現形態は、Ｐ、カリニ１１６　ＫＤ抗原により表現される特定のエピトープまたは該エピトープの実質的な部分と免疫学的に結合するが、他の無関係のエピトープとは免疫学的に結合しない抗体分子を意味するものとする。

ここで使用する用語［エピトープＪおよび様々な文法的なその表現形態は、抗体結合サイトにより特異的に認識される抗原の部分を意味する。これは、また決定基もしくは抗原決定基とも呼ばれる。

ここで使用する「還元（ｒｅｄｕｃｅｄ）　Ｊなる用語は、還元剤、例えば２− メルカプトエタノールを蛋白に添加し、かつドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ３）の存在下で沸騰することにより開裂もしくは還元されたペプチド内またはペプチド間ジスルフィド結合を有する該蛋白を意味する。

ここで使用する「見掛けの分子量」とは、Ｇｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ハーネス＆リックウッド（Ｈａｎｅｓ　ａｎｄ　Ｒｉｃｋｗｏｏｄ）ｉ！、ＩＲＬブレス、ワシントンＤ、Ｃ，，１９８１に記載されているように、分離系、例えば５ＤＳ−ＰＡＧＥ中での該蛋白の移動度を、キロダルトンで表した既知の大きさの他の蛋白の移動度と比較することにより決定されるキロダルトン（ＫＤ）で表した蛋白の大きさを意味する。

Ｃ１・診断システム本発明のキット形状の診断システムは、少なくとも一回のアッセイに対して十分な量で、抗−１１６ＫＤ抗体を、別々に包装された免疫化学試薬として含む。この診断システムは、典型的には該包装された免疫化学試薬の使用上の指針をも含むものである。

ここで使用する用語「包装またはパッケージ」とは、定められた限界内で本発明のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を支持することのできる固体マトリックスまたは材料、例えばガラス、プラスチック、紙、箔などを意味する。

かくして、例えばｍｇ径程度量で意図する抗体を包むのに使用するガラスバイアルであり得、またはμｇ程度の量の意図した抗体を機能可能に固定した、即ち免疫学的に抗原を結合し得るように結合させたマイクロタイタープレートであってもよい。

使用上の指針は、典型的には試薬の濃度または少なくとも−回のアッセイのパラメータ、例えば混合すべき試薬と試料との相対的な量、試薬／試料混合物の維持時間、温度、緩衝条件などを記載する明瞭な表現を含む。

一態様において、本発明の診断システムは更に１１６　ＫＤＰ、カリニ抗原およ ′び／または抗１１６　ＫＤ抗体分子を含む錯体の形成を信号化できる検出手段をも含む。

ここで使用する用語「検出手段」とは、いかなる標識も必要としない１１６　ＫＤＰ、カリニ抗原含有錯体の存在を検出する任意の方法を意味する。このような検出手段は臨床的診断化学においてはそれ自体周知であり、新規な蛋白、方法およびシステムを利用する限りにおいてのみ本発明の一部を構成する。検出手段の例はバイオセンサーとして知られる方法を含み、表面の反射率の変化、光ファイバによる一過性の波の吸収における変化または表面音響波の伝播における変化を検出することにもとすくバイオ検知法を含む。

好ましい態様において、本発明の診断システムは、更に１１６　ＫＤＰ、カリニ抗原または抗１１６　ＫＤ抗体分子を含む錯体の形成を信号化できる標識または指示手段をも含む。

ここで使用する用語「錯体」とは、特定の結合反応、例えば抗体−抗原またはレセプターリガンド形成反応の生成物を意味する。

錯体の例は免疫反応生成物である。

ここで使用する用語「標識」および「指示手段」並びに様々な文法的なその表現形態は、錯体の存在を示す検知可能な信号の形成に直接または間接的に関与する単一の原子および分子を意味する。任意の標識または指示手段は、本発明の抗体またはモノクローナル抗体組成物の一部と結合またはこれに配合することができ、あるいは別々に使用することができ、これらの原子または分子は単独でまたは付随的な試薬と組み合わせて使用することができる。

このような標識は臨床的診断化学において、それ自体周知であり、新規な蛋白、方法および／またはシステムと共に使用する限引こおいて本発明の一部を構成する。

この標識は、変性を起こすことなしに抗体または抗原と化学的に結合して、免疫螢光トレーサとして有用な螢光色素（色素）を形成する螢光標識剤であり得る。

適当な螢光標識剤の例は螢光色素、例えばフルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）　、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン −１−ナフタ、レンスルフォニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）　、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミンローダミン８２００スルフォニルクロリド力（ＤｅＬｕｃａ）、　Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　（道具としての抗体：　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｓ　ａ　Ｔｏｏｌ）、　？ルカロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ）等線、ジョンウィリー＆サンズ、１９８２，　ｐｐ．　１８９−２３１に見られる。これを本発明の参考文献とする。

好ましい態様において、該指示手段は酵素、例えζｆホースラディツシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）　、グルコースオキシダーゼ、アルカリンフォスファターゼなどである。主な指示手段力（酵素、例えばＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼであるような場合、付随的な試薬は抗体−抗原錯体（免疫反応生成物）が形成されたとＧ１つ事実を可視化するものである必要がある。ＨＲＰ用の力１力）る付随的試薬は過酸化水素および酸化染料プリカーサ、例えばジアミノベンジジンなどを含む。ＨＲＰと共に使用するのに有用な付随的試薬は２，２°−アジ八ジー（３−エチル−ベンズチア゛ノリンー６ースルフォン酸）　（ＡＢＴＳ）である。

放射性元素も有用な標識剤であり、ここでの説明に使用する。

放射性標識剤の例はγ−線を放出する放射性元素である。γ−線を放出する元素、例えば１２４■、！１５Ｉ，　＋！＃［、１３２Ｉおよび”Ｃｒｌｔ７−線放出放射性元素標識群の一組を表す。特に好ましいの１よ、…Ｉである。有用な標識手段のもう一つの群はそれ自体ポジトロンを放出する元素、例えばＩＩｃ　、　Ｉｍｐ　、　＋５□および１３Ｎなどである。かくして放出されるポジトロンは動物体内に存在する電子と遭遇した場合にγ−線を放出する。β−線放出体、例えｉｆ”ＨのＩｌｌＩｎ化合物も有用である。

標識の結合、即ちポリペプチドおよび蛋白の標識は当分野で周知である。例えば、ハイブリドーマにより生成された抗体分子（よ、培地中の一成分として与えられる放射性同位元素含有アミノ酸を代謝系に組み込むことにより標識できる。例えば、ガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）等の論文、Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．、　１９８１，　７３．　ｐｐ．　３−４６を参照のこと。特に、活性化官能基を介しての蛋白複合化またはカップＩＪング法を利用することができる。例えば、オーラメアス（Ａｕｒａｍｅａｓ　）等の論文、Ｓｃａｎｄ．　Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏｌ．、　１９７８，　８．（別冊？）、　ｐｌ）、　７−２３；ロッドウェル（Ｒｏｄｗｅｌｌ）等の論文、Ｂｉｏｔｅｃｈ．、　１９８４，　３，　ｐｐ．　８８９−８９４お米国特許第４，　４９３，　７９５号を参照のこと。

本発明の診断システムはまた、好ましくは別々のツク・ソケージとして、特定の結合剤を含む。「特定の結合剤」とは、本発明の試薬種またはかかる種を含む錯体と選択的に結合し得るが、それ自体は本発明の抗体分子組成ではない分子部分である。特定の結合剤の例は第二の抗体分子、補体蛋白またはそのフラグメント、Ｓ。

オーレウス（ａｕｒｅｕｓ　）蛋白Ａなどを含む。好ましくは、該特定の結合試薬は上記の試薬種が錯体の一部として存在する場合を二ｉｔ、該試薬種と結合する。

好ましい態様において、該特定の結合試薬は標識される。し力）しながら、該診断システムが標識されていない特定の結合試薬を含む場合には、該試薬は典型的には増幅手段または試薬として使用される。これらの態様において、標識された特定の結合試薬（ま、該増幅手段が試薬種−含有錯体に結合している場合、該増幅手段と特異的に結合できる。

本発明の診断キットは、“ＥＬＩＳＡ”フォーマットで使用して、血液、血清または血漿中の１１６　ＫＤＰ．カリニ抗原の量を測定することができる。“ＥＬＩＳＡ”とは酵素結合免疫吸着ア・ソセイ法を意味し、このアッセイは固相に結合された抗体または抗原並びに酵素−抗原または酵素−抗体結合体を使用して、試料中に存在する抗原を検出しかつその量を定量することからなる。このＥＬＩＳＡ法の説明は、Ｄ．　Ｐ．サイプ（Ｓｉｔｅｓ）等のＢａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．第４版、第２２章、ランジメディカル社（Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、カリフォルニア州、ロスアルトス（Ｌｏｇ　Ａｌｔｏｓ）、　１９８２および米国特許第３．　６５４，　０９０号；同第３．　８５０，　７５２号および同第４．　０１６，　０４３号に記載されている。これらを本発明の参考文献とする。

かくして、好ましい態様においては、本発明の抗−１１６　ＫＤ抗体は固体マトリックスに固定して、課題の診断システムにおける，＜ッケージを構成する固体担体を形成することができる。

典型的には、試薬は水性媒質からの吸着により固体マトリックスに固定されるが、当業者には周知の蛋白および抗体に適用し得る他の固定様式を利用することも可能である。

有用な固体マトリックスも当分野で周知である。このような材料は水−不溶性であり、商標セフアゾ・ソクス（ＳＢＰＨＡＤＢＸ　）の下でファルマシア７フインケミカル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ；　二．　−シャーシー州、ビス力タウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，　ＮＪ））力λら入手できる架橋デキストラン、アガロース、イリノイ州ノースジカゴのアポットラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手できる径約１〜５μｍのポリスチレンビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースまたはナイロンを主成分とするウェブ、例えばシート、ストリップまたはパドル、あるいはチューブ、プレートまたはポリスチレンまたはポリ塩化ビニル製のものなどのマイクロリッタープレートの壁などを含む。

ここに記載する任意の診断システムの上記反応試薬、標識された特定の結合試薬または増幅試薬は溶液、液状分散体、または実質的に乾燥した粉末形状、例えば凍結乾燥品として与えることができる。指示手段が酵素である場合、該酵素の基質もシステムの別のパッケージとして与えることができる。固体担体、例えば上記のマイクロリッタープレートおよび一種以上の緩衝液も、本発明の診断アッセイシステムの別途にパッケージされた要素として含むことができる。

診断システムに関連してここで議論する包装材料は、一般に診断システムで利用されているものである。かかる材料はガラス、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート）、ビン、バイアル、プラスチックおよびプラスチック−箔をラミネートした包封体などを含む。

実施例１、Ｐ、カリニシスト抗原の調製ギグリオッティ（Ｇｉｇｌｉｏｔｔｉ）等の方法（Ｊｏｕｒｎ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、。

１．９８６．１５４．　ｐｐ、　３１５−３２２）を利用して、但し、唯一の変更点として該組織をホモジナイズするためにストマツカー（Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）（チクマールプロダクツ（Ｔｅｃｈ　Ｍａｒｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オハイオ州、シンシナティー）製）を使用して、Ｐ、カリニ微生物を感染したヒトの肺組織から精製した。簡単にいえば、該感染した肺組織をストマ、ツか−によりホモジナイズした。該ホモジネートを綿ガーゼに通して、あらゆる粗大な組織の塊を除去し、次いで１２μフイルター２（ヌクレボア（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）、カリフォルニア州、プレサントン（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ））を通した。濾過したこのホモジネートを室温にて、４００ｇで３０分間遠心処理した。生成する上澄を捨て、ペレットを、０．０１Ｍの燐酸ナトリウム、０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含み、かつあらゆる細菌および真菌の育成を阻害するための２０００７ｍ１のペニシリン、２００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ギブコラボラトリーズ（ＧＩＢＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、グランドアイランド（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ）、　ＮＹ）および４ｍｇ／ｍ　ｌのアンフォテリシンＢを補充したｐＨ７，２の燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ）約５倍答中に再懸濁した。存在するＰ、カリニ微生物の数をピッ７−（ｐｉｆｅｒ）等の方法（Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅｓ、、　１９７７、１１．　ｐｐ、　３０５−３１６）に従って決定した。単離したＰ、カリニ微生物を少量のアリコートとして一７０°Ｃにて保存した。

ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　１９８８．　バー０つ＆ロウエ（Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌｏｗｅ）　ｉｉ、コールドスプリングハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、　ＮＹに記載の方法を利用して生成した。簡単にいえば、粗製の未感染のヒトの肺組織のホモジネートとシクロフォスフアミド−水和物（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）、ミズーリー州、セントルイス）とを２倍容の完全７０インドアジユバントと共に混合し、ギグリオッティ（Ｇｉｇｌｉｏｔｔｉ）等の方法（Ｊｏｕｒｎ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、、　１９８６゜１５４、　ｐｐ、　３１５−３２２）に従って雌Ｂａ１ｂ／ｃマウスに注射した。この最初の誘発後、該マウスを更に２倍容の不完全フロインドアジュバントと混合したＰ、カリニ感染ヒト肺組織ホモジネートで誘発した。

かくして免疫化した牌細胞を、デセントゲロス（Ｄｅ　Ｓｔ、　Ｇｒｏｔｈ）等の方法（Ｉｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１９８０．１−２）およびホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）等の方法（ＩＸ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｍｙｃｏｌｏｇｙ、　Ｐ３−１．１９８５）に従って、二十日ネズミミエローマＰ３−Ｘ６３Ａ６８．　ＡＴＣＣＮｏ、　ＴＩＢ −９と融合した。得られたハイブリッドをＥＬＩＳＡアッセイを利用して抗体産生につきスクリーニングした。抗体産生ハイブリッドを、更にウェスタンプロット法に従ってＰ、カリニ特異的モノクローナル抗体産生につきスクリーニングした。Ｐ、カリニ特異的モノクローナル抗体産生ハイブリッドを、限界希釈法に従って２回継代培養し、クローンセルラインを得た。これらのセルラインにより生成された抗体のイソタイプは標準的な方法を使用して決定した。これらのセルラインをＢａ１ｂ／ｃマウス内に注入して抗体に富む腹水を得た。この抗体を、硫酸アンモニウム分別を利用して該腹水から精製し、次いでファンブナキス（Ｖａｎ　Ｖｕｎａｋｉｓ）＆ランボン（Ｌａｎｇｏｎｅ）編のＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１９８０．７０．　ｐｐ、　１−５２５の免疫化学的技術（Ｉｍ［［ｌｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）に従ってアルカリフォスファターゼに結合した。

上記方法により生成されたモノクローナル抗体Ｃａ−３は、ウェスタンプロット法を利用して、温和な還元条件下での見掛けの分子量１１６　ＫＤ、即ち約０．１４　Ｍ　２ＭＢを有するＰ、カリニ抗原に対して特異性であることが示された。簡単にいえば、実施例Ｉに従って調製されたＰ、カリニ微生物はドデシル硫酸ナトリウムを含む１０％のポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　）。これについては、蛋白のゲル電気泳動（Ｇｅｔ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｌｉｉ）、ハーネス（ｌａｎｅｓ　）およびリックウッド（Ｒｉ　ｃｋｗｏｏｄ　）編、ＩＲＬブレス、ワシントンＤ、Ｃ，，１９８１に記載されている。この電気泳動した蛋白を、次いでサリノビツチ（Ｓａｌｉｎｏｖｉｃｈ）等の論文、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９８６．１５６．　ｐｐ、　３４１−３４７に記載の方法に従って、標準的なウェスタンプロット法により、改良したニトロセルロースにトロプラス（Ｎｉｔｒｏ　Ｐｌｕｓ）　２０００．ミクロセパレーションズ社（Ｍｉｃｒｏ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ、　））のシートに転写（固定）した。転写した蛋白を含有する該改良ニトロセルロースは実施例２で記載するように処理して、免疫反応生成物を形成しかつ検出した。該モノクローナル抗体Ｃａ−３は見掛けの分子量約１１６　ＫＤを有する単一の蛋白種と免疫反応した。

上記の結果は、モノクローナル抗体Ｃａ−３が見掛けの分子量約１１６　ＫＤを有するＰ、カリニ抗原上に表現されたエピトープに対して特異性であることを示している。

３、　血液試料中のＰ、カリニ１１６　ＫＤ抗原の検出血液試料中におけるＰ、カリニ１１６　ＫＤ抗原の存在を以下の方法で検出した。

血液試料をＰ、カリニ肺炎を患う患者から収集した。該血液試料の血清画分を当分野で周知の方法により分離した。４μｌの該血清試料を０．５ｘアガロースゲル（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ、カリフォルニア州、ブレア（Ｂｒｅａ））に適用した。該血清試料を含有するゲルを室温にて５分間維持し、次いで１０ｍＭの５．５−ジエチルバルビッル酸および５０ｍＭの５，５−ジエチルバルビッル酸のナトリウム塩を含むｐＨ８，６のバルビタール緩衝液含有電気泳動系（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ、カリフォルニア州、ブレア（Ｂｒｅａ））に置いた。

この血清試料を含むゲルを１００ｖにて２５分間電気泳動じた。次いで、このゲルを該電気泳動系から除去し、０．４５ｍＭの孔径を変更したニトロセルロース、ニトロプラス（Ｎｉｔｒｏ　Ｐｌｕｓ）２０００　（ミクロセパレーションズ社（Ｍｉｃｒｏ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ、）、　７サーチユセ・ソツ州、ウエストボロ（Ｗｅｓｔｂｏｒｏ））のシート上に載せた。該シートは予め転写バッフｙ−（０，４Ｍ　トリス、０．３５Ｍ塩化マグネシウム、および０．０５２Ｍのグリシンを含むＤＨ８，０の２７％メタノール溶液）中に漬けておいた。次いで、該ゲルおよび変性ニトロセルロースシートを、転写バッファーに予め浸漬したファツトマン（Ｗｈａｔｍａｎ）の３　ＭＭ濾紙（バイオラドラボラトリーズ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州、リッチモンド）２枚の間に挟み、かくして転写パックを形成した。この転写パックを室温にて約０．５〜約１８時間、あるいは全ての蛋白が該ゲルから該変性ニトロセルロースシートに転写されるまで、即ち該ニトロセルロースに固定されるまで維持した。次いで、この転写パックを分解して、該変性ニトロセルロースシートを、ベリー（Ｂｅｒｒｙ）等のＪｏｕｒｎ、　１ｍｍ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　１９８５゜７６、　ｐ、　２９９に記載の方法に従って、ｌ　ＯｍＭの燐酸ナトリウム、０．３５Ｍの塩化ナトリウム、０．０５％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ） −２０および０、０２５％のカゼインを含有する溶液中に入れた。該変性ニトロセルロースシートを室温にて１５分間この溶液中に維持した。この変性ニトロセルロースシートを、１０ｍＭの燐酸ナトリウムと０．３５Ｍの塩化ナトリウムを含むｐＨ７，４の溶液で２度洗浄した。次いで、この変性ニトロセルロースシートを、ファンブナキス（Ｖａｎ　Ｖｕｎａｋｉｓ）およびランボン（Ｌａｎｇｏｎｅ）編のＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１９８０．７０．　ｐｐ。

１−５２５に記載の論文、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載された方法に従って、１０ｍＭの燐酸ナトリウムと０．３５Ｍの塩化ナトリウムとアルカリホスファターゼ（ＡＰ）　（バイオラドラボラトリーズ（Ｂｉ。

Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州、リッチモンド）と結合した抗−１１６ＫＤモノクローナル抗体、ＭＡＢ　Ｃａ−３の１−１０００希釈液とを含むｐＨ７，４の溶液に入れた。該変性ニトロセルロースシートを室温にて２時間、該ＡＰ−結合結合クツクローナル抗体む溶液に維持した。この期間中に、該変性ニトロセルロースシートに固定１．０２％の２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、０．１％の塩度性ニトロセルロースシートを水道水で２回すすぎ、全ての未反１１６　ＫＤ抗原が該血液試料中に存在することを示した（第１図、しに交叉反応性のフラグメントがＰ、カリニ肺炎に罹っている患者の血清中に検出できることを示している。

下に置いた。該２ＭＢで処理した試料をＰＢＳで１：２０（ｖ／ｖ）に希釈して、該２ＭＢを該試料から除去した。次いで、この希薄溶液を５００×ｇにて１０分間遠心処理して、ペレット化した物質を回収した。

このペレット化した物質を、ハーネス（Ｈａｎｅｓ　）＆リックウッド（Ｒｊｃｋｗｏｏｄ）編のＧｅｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　１９８１．　ＩＲＬプレス刊、ワシントンＤ、　Ｃ，に記載の方法に従って、標準的な量（約０．１４Ｍ）の２ＭＥを含む、ＳＤＳを添加したバッファー中に再懸濁した。この試料を、１０％のポリアクリルアミドゲルを含有する標準的なドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。この電気泳動した試料を、次いでサリノビッチ（Ｓａｌｉｎｏｖｉｃｈ）等の論文、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９８６．１５６．　ｐｐ、　３４１−３４７に記載された標準的なウェスタンプロット法を利用して、変性ニトロセルロースにトロプラス（Ｎｉｔｒｏ　Ｐｌｕｓ）　２０００；マイクロセパレーションズ社（Ｍｉｃｒｏ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｉｎｃ、　））のシート上に転写した。

該転写した蛋白を含有する該変性ニトロセルロースシートを実施酸物と免疫反応し、かつ見掛けの分子量約５６ＫＤの還元生成物とも２ＭＥで処理すると、実施例２で記載した１１６　ＫＤ蛋白と同様の抗原決定基を有するいくつかのＰ、カリニ由来の変種蛋白を生成することを示している。従って、これらの変種蛋白、即ち２３ＫＤの２種および５６ＫＤの１種、は付随的なＰ、カリニに特異的な蛋白を表し、これらは該１１６　ＫＤＰ、カリニ抗原の交叉反応性のフラグメントである。

ピッチェニック（Ｐｉｔｃｈｅｎｉｋ）等のＡｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　Ｄｉｓ、、　１９８６゜泌させた。１ｍｌの痰試料を５００　μｌのスプトリシン（ｓｐｕｔｏｌｙｓｉｎ；べ−リングダイアグノスティックス（Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、カリフォルニア州、サンジエゴ）と混合した。次いで、この混合物を１５ｍ１の遠心管に入れ、等体積のスプトリシンをその上に載せた。

この混合物を含む鎖管を１０分間３５°Ｃに維持した。等体積の、６７シントンＤ、　Ｃ，に記載の方法に従って、１０％のポリアクリルアミドゲルを含有するドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル中で電気泳動した。次いで、このゲルをクーマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ）　Ｒで、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョンウィリー＆サンズ、ＮＹ、　１９８７に記載の方法に従って染色した。１１６　ＫＤの蛋白および／または２種の２３中に、１１６　ＫＤの蛋白および／または２種の２３ＫＤの蛋白が検出できることを示している。

特定の実施例および態様を含む上記の明細書の記載は、本発明多数の他の変更並びに改良力呵能である。

国際調査報告リカ合衆国　カリフォルニア州　９２０３７　ラ　ジヨウ　エルレア　マリヨー力　８４３０

Claims

【特許請求の範囲】

１．哺乳動物中の臨床的Ｐ．カリニ感染の存在のアッセイ方法であって、以下の工程：（ａ）該哺乳動物の脈管流体試料と、１１６ＫＤＰ．カリニ抗原または抗原的に交叉反応性のそのフラグメントに対して免疫特異性の抗体とを混合することにより免疫反応混合物を形成する工程、（ｂ）該免疫反応混合物を、該試料中に存在する該１１６ＫＤＰ．カリニ抗原のいずれかが該抗体と免疫反応して、１１６ＫＤＰ．カリニ抗原含有免疫反応生成物を形成するのに十分な時間、生物学的アッセイ条件下に維持する工程、および（ｃ）形成された任意のＰ．カリニ１１６ＫＤ抗原含有免疫反応生成物の存在を検出し、結果として該哺乳動物におけるＰ．カリニ感染の存在を検出する工程、を含む上記アッセイ法。
２．該抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１項記載の方法。
３．該モノクローナル抗体が免疫反応性を示し、かつ該免疫反応性を有するモノクローナル抗体がハイブリドーマＣａ−３により産生される請求の範囲第２項記載の方法。
４．該１１６ＫＤＰ．カリニ抗原含有免疫反応生成物が上記工程（ｃ）で検出されるように、該生成物を以下の工程：（ｉ）該１１６ＫＤＰ．カリニ抗原含有免疫反応生成物と、該生成物に特異的に結合し得る標識された特異的な結合試薬と混合することにより、標識反応混合物を形成する工程、（ｉｉ）かくして形成した該標識反応混合物を、該標識された特異的な結合試薬が存在する任意の該１１６ＫＤＰ．カリニ抗原含有免疫反応生成物と結合するのに十分な時間、生物学的アッセイ条件下に維持して、標識錯体を形成する工程、（ｉｉｉ）該標識錯体の存在およびその結果としてのＰ．カリニ感染の存在を検出する工程、により処理する請求の範囲第１項記載の方法。
５．上記工程（ａ）の抗体が固体マトリックスに固定されている請求の範囲第１項記載の方法。
６．該工程（ａ）で該混合物を形成する前に、該Ｐ．カリニ抗原を単離し、固体マトリックスに固定する請求の範囲第１項記載の方法。
７．該抗原的に交叉反応性のフラグメントが、分子量約２３ＫＤおよび約５６ＫＤを有する、該１１６ＫＤ抗原の還元生成物である請求の範囲第１項記載の方法。
８．哺乳動物中の臨床的Ｐ．カリニ感染の存在につきアッセイするためのキット型の診断システムであって、モノクローナル抗体Ｃａ−３を含むパッケージを含み、該抗体が還元された見掛けの分子量約１１６ＫＤを有するＰ．カリニ抗原により表現されるエピトープに対して免疫特異性であることを特徴とする上記診断システム。
９．更に、別のパッケージとして、Ｐ．カリニ抗原含有免疫反応生成物の存在を信号化するための標識された特異性結合試薬をも含む請求の範囲第８項記載の診断システム。
１０．該モノクローナル抗体が固体マトリックスに固定されている請求の範囲第８項記載の診断システム。
１１．ハイブリドーマＣａ−３により産生されたモノクローナル抗体の免疫特異性および免疫反応性を有し、該ハイブリドーマかＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１０１３９を有することを特徴とする単一特異性抗体。
１２．哺乳動物中の臨床的Ｐ．カリニ感染の存在につきアッセイするる方法であって、以下の工程：（ａ）１１６ＫＤＰ．カリニ抗原に対する異種抗体分子を含まない体液試料にサイズ分画媒体を適用する工程、（ｂ）該媒体中で、該試料をサイズ分画する工程、（ｃ）該媒体中のサイズ分画された１１６ＫＤ蛋白の存在およびその結果としての臨床的Ｐ．カリニ感染の存在を検出する工程、を含むことを特徴とする上記アッセイ法。
１３．該サイズ分画媒体がアガロースまたは架橋ポリアクリルアミドのゲルであり、該サイズ分画が該ゲル中での電気泳動により行われる請求の範囲第１２項記載の方法。