JP2006117537A

JP2006117537A - 抗ａｄａｍｔｓ１３モノクローナル抗体

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Publication number: JP2006117537A
Application number: JP2004303784A
Authority: JP
Inventors: Yoshihiro Fujimura; 吉博藤村; Masanori Matsumoto; 松本雅則; Toshio Mori; 俊雄森
Original assignee: Japan Clinical Laboratories Inc
Current assignee: Japan Clinical Laboratories Inc
Priority date: 2004-10-19
Filing date: 2004-10-19
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2024-10-19
Also published as: JP4533995B2

Abstract

【課題】
本発明の課題は、ADAMTS13に特異的に親和性を有する種々のタイプのモノクローナル抗体の提供ならびに当該モノクローナル抗体の用途を提供することにある。また、本発明の別の課題は、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供することである。
【解決手段】
ADAMTS13の測定法、検査法又は機能解析法を鋭意研究し、ADAMTS13を特異的に認識するモノクローナル抗体（以下、ADAMTS13モノクローナル抗体）を得ることに成功し、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を確立し、さらに当該モノクローナル抗体を用いたADAMTS１３の検査方法を開発した。

Description

本発明はフォンヴィルブランド因子切断プロテアーゼ（ADAMTS13）分子に対して特異的に親和性を有するモノクローナル抗体およびその製造方法ならびにそれらの用途に関するものである。

血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura; TTP)は、血小板減少、溶血性貧血、動揺性精神神経障害などを特徴とする症候群である。かつては約８０%の患者が3ヶ月以内に死亡する予後不良の疾患であった。現在では血漿交換によって、予後が大幅に改善されるようになっている。

最近、TTPの病因としてフォンヴィルブランド因子(VWF)切断酵素活性の低下が報告された。すなわち、後天性のTTPは、VWF切断酵素に対するIgG型インヒビターが産生されることによって酵素活性が低下することが原因であることが明らかにされた(非特許文献1及び２)。また先天的なTTPであるUpshaw-Schulman症候群(USS)では、遺伝的にVWF切断酵素が欠損していることが判明した(非特許文献３)。このVWF切断酵素をコードする遺伝子は、ADAMTS13であることが判明した(非特許文献４及び５)。

ADAMTS13は亜鉛型メタロプロテアーゼで、VWFサブユニットのTyr８４２−Met８４３結合を特異的に切断する。この酵素活性の測定にはVWFを基質として、生じたVWFフラグメントの検出を電気泳動法で行うVWFマルチマー解析により行われている。この方法は、ADMATS13の活性を正確に測定できるという利点はあるが操作が煩雑であるため、とりわけ簡便な測定法の開発が望まれていた。
New Engl. J. Med.339,1578-1584,1998。 New Engl. J. Med.339,1585-1594,1988。 J. Hematol.74,101-108,2001 J Biochem.130,475-480,2001。 J. Biol. Chem.276,41059-41063,2001

本発明の目的は、ADAMTS13に特異的に親和性を有する種々のタイプのモノクローナル抗体の提供ならびに当該モノクローナル抗体の用途を提供することにある。また、本発明の別の目的は、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供することである。

本発明者らは、ADAMTS13の測定法、検査法又は機能解析法を鋭意研究し、ADAMTS13を特異的に認識するモノクローナル抗体（以下、ADAMTS13モノクローナル抗体）を得ることに成功し、当該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を確立し、さらに当該モノクローナル抗体の用途を見い出した。

本発明は以下の構成からなる。
１、フォンヴィルブランド因子切断プロテアーゼ（ADAMTS13）分子に対して特異的に親和性を有し、ADAMTS13の酵素活性を少なくとも３０％阻害するモノクローナル抗体。
２、配列表配列番号１に記載のADAMTS13分子のアミノ酸配列の３８７番目よりN末端側の上流部分に特異的に親和性を有する前記１に記載のモノクローナル抗体。
３、配列表配列番号１に記載のADAMTS13分子のアミノ酸配列の２８５番目から３８７番目のアミノ酸までの領域に存在するエピトープを認識することを特徴とする前記１又は２に記載のモノクローナル抗体。
４、配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部または一部を有する蛋白質に対して特異的に親和性を有する前記２又は３に記載のモノクローナル抗体
。
５、配列表配列番号１に記載のADAMTS13分子のアミノ酸配列の１０１６番目よりC末端側の下流部分に特異的に親和性を有する前記１に記載のモノクローナル抗体。
６、配列表配列番号１に記載のADAMTS13分子の１０１６番目のアミノ酸から１１３５番目のアミノ酸までの領域に存在するエピトープを認識することを特徴とする前記１又は５に記載のモノクローナル抗体
７、配列表配列番号３に記載のアミノ酸配列の全部または一部を有する蛋白質に対して特異的に親和性を有する前記５又は６に記載のモノクローナル抗体
。
８、受託番号がＦＥＲＭ
Ｐ−２０１８９又はＦＥＲＭＰ−２０１９０であるハイブリドーマにより産生される、前記１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
９、前記１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
１０、受託番号がＦＥＲＭＰ−２０１８９又はＦＥＲＭＰ−２０１９０である前記９に記載のハイブリドーマ。
１１、前記１に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体と試料とを反応させる工程を含む、試料中のADAMTS13の測定方法。
１２、前記２〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体と試料とを反応させる工程を含む、試料中のADAMTS13の測定方法。
１３、前記５〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体と試料とを反応させる工程を含む、試料中のADAMTS13の測定方法。
１４、前記２〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体及び請求項５〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を組み合わせてもちいる試料中のADAMTS13の測定方法。
１５、前記１１〜１４のいずれかに記載の方法によって、血栓性疾患を検査する方法。
１６、前記１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む試薬またはキット。

本発明の抗ADMATS13モノクローナル抗体は、ADAMTS13酵素抗原分子を特異的に認識するモノクローナル抗体である。当該モノクローナル抗体を用いることにより、ADAMTS13酵素分子の測定、検査することが可能になり、さらにADAMTS13の機能を解析することが可能になる。即ち、本発明の抗ADAMTS13モノクローナル抗体を用いることにより、（１）ウエスタンブロット法によるADAMTS13の迅速な検出及び同定、（２）免疫沈降法(Immunoprecipitation法) による、発現したADAMTS１３の検出及び同定、さらに、ADAMTS１３と結合性を有する他の蛋白質の検出及び解析、（３）免疫化学的手段によるADAMTS１３の測定、検査（４）それらの成果に基づく治療薬、診断薬等の開発等に大きな意義を持つ。

ADAMTS13は、１４２７個のアミノ酸で構成される酵素蛋白質（配列表配列番号１）で、分子量は約２００KDである。その一次構造はマルチドメインからなり、N末端側よりプロペプチド、メタロプロテアーゼドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、トロンボスポンディン−1モチーフ、システイン−リッチドメイン、スペーサードメイン、トロンボスポンディン−1モチーフの7回繰り返し構造、そして最後に２つのＣＵＢドメインが続いている。本発明のモノクローナル抗体は、ディスインテグリン様ドメインよりもN末端側を抗原認識している。ADAMTS１３に特異的に親和性を有することを特徴とする本発明のモノクローナル抗体（本発明の抗ADAMTS１３モノクローナル抗体）はフォンヴィルブランド因子切断プロテアーゼ（ADAMTS13）の酵素活性を少なくとも３０％阻害するモノクローナル抗体に関するものである。本発明の抗ADAMTS１３モノクローナル抗体はADAMTS13分子のディスインテグリン様ドメインを認識していることを特徴としている。本発明の抗ADAMTS１３モノクローナル抗体が認識するエピトープは、該モノクローナル抗体がADAMTS１３を特異的に認識し得る限り特に限定されないが、好ましくはADAMTS１３の２８５番目のアミノ酸から３８７番目のアミノ酸までの領域（配列表配列番号１）内に存在している。

また、本発明のモノクローナル抗体の別の態様としては、ADAMTS１３分子のトロンボスポンディン−1モチーフの7回繰り返し構造部位を特異的に認識していることを特徴としている。本発明の抗ADAMTS１３モノクローナル抗体が認識するエピトープは、該モノクローナル抗体がADAMTS１３を特異的に認識し得る限り特に限定されないが、好ましくはADAMTS１３の１０１６番目のアミノ酸から１１３５番目のアミノ酸までの領域（配列表配列番号２）内に存在している。

本発明のモノクローナル抗体は、当分野で通常実施されている方法により調製される。即ち、ADAMTS１３に特異的に親和性を有する抗体産生細胞を、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成させ、該ハイブリドーマをクローン化し、各蛋白質に特異的な抗体を産生するクローンを選択することによって製造される。

抗原としては目的とする特異性によって異なるが、ADAMTS１３蛋白質に対して特異的に親和性を有する抗体を得る場合には、ADAMTS１３の全部またはその一部を有するオリゴペプチド等が用いられる。又、抗原性を保持している限りは、当該抗原は、そのアミノ酸配列において、１乃至数個のアミノ酸の欠失や置換、若しくは付加といった変更がなされていてもよい。

当該抗原は遺伝子工学的に、あるいは選択した部分的なアミノ酸配列に基づいて合成することによっても調製できる。感作抗原としては、得られたADAMTS１３等の蛋白質分子あるいは選択した部分的なアミノ酸配列に基づいたオリゴペプチドをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）等の適当な緩衝液中に溶解、あるいは懸濁したものが用いられる。抗原溶液は通常抗原物質の量として５０〜５００μｇ／ｍｌ程度の濃度に調製すればよい。また、ペプチド抗原等、それだけでは抗原性が低い場合は、アルブミンやキーホールリンペットヘモシアニン等の適当なキャリヤータンパク質に架橋して用いることが好ましい。該抗原を免疫感作させる動物としてはマウス、ラット、ウマ、ヤギ、ウサギなどが例示される。好ましくはマウス、より好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウスである。このとき、被免疫動物の抗原への応答性を高めるため、当該抗原溶液をアジュバントと混合して投与することができる。本発明において用いられるアジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン(Bordetella pertussis vaccine)、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組合せが例示されるが、初回免疫時にＦＣＡ、追加免疫時にＦＩＡを使用する組み合わせが特に好ましい。

免疫方法は、使用する抗原の種類やアジュバント混合の有無等により、注射部位、スケジュールなどを適宜変化させることができるが、例えば、被免疫動物としてマウスを用いる場合は、アジュバント混合抗原溶液０．０５〜１ｍｌ（抗原物質１０〜２００μｇ）を腹腔内、皮下、筋肉内または（尾）静脈内に注射し、初回免疫から約４〜１４日毎に１〜４回追加免疫を行い、さらに約１〜４週間後に最終免疫を行う。該抗原溶液をアジュバントを使用せずに投与する場合には、抗原量を多くして腹腔内注射してもよい。抗体価は追加免疫の約５〜６日後に採血して調べる。抗体価の測定は、後述の抗体アッセイに準じ、通常行われる方法で行うことができる。最終免疫より約３〜５日後、該免疫動物から脾細胞を分離して抗体産生細胞を得る。

骨髄腫細胞としては、マウス、ラット、ヒト等由来のものが使用される。例えばマウスミエローマＰ３Ｘ６３−Ａｇ８、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１、Ｐ３ＮＳ１−Ａｇ４、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８・６５３等が例示されるが、抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは同種動物、特に同系統の動物由来であることが好ましい。骨髄腫細胞は凍結保存するか、ウマ、ウサギまたはウシ胎児血清を添加した一般的な培地で継代して維持することができる。細胞融合には対数増殖期の細胞を用いるのが好ましい。

抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを形成させる方法としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法、センダイウイルスを用いる方法、電気融合装置を用いる方法などが例示される。例えばＰＥＧ法の場合、約３０〜６０％のＰＥＧ（平均分子量１０００〜６０００）を含む適当な培地または緩衝液中に脾細胞と骨髄腫細胞を１〜１０：１、好ましくは５〜１０：１の混合比で懸濁し、温度約２５〜３７℃、ｐＨ６〜８の条件下で、約３０秒〜３分間程度反応させればよい。反応終了後、ＰＥＧ溶液を除いて培地に再懸濁し、セルウエルプレート中に播種して培養を続ける。

融合操作後の細胞を選択培地で培養して、ハイブリドーマの選択を行う。選択培地は、親細胞株が死滅し、融合細胞のみが増殖し得る培地であり、通常ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地が使用される。ハイブリドーマの選択は、通常融合操作の１〜７日後に、培地の一部、好ましくは約半量を選択培地と交換することによって開始し、さらに２、３日毎に同様の培地交換を繰り返しながら培養することにより行う。顕微鏡観察によりコロニーが生育しているウエルを確認する。

生育しているハイブリドーマが所望の抗体を産生しているかどうかを知るには、培養上清を採取して抗体アッセイを行えばよい。抗体価は、例えば固相化したADAMTS１３酵素分子に該上清を加えて反応させ、さらに蛍光物質、酵素、ＲＩ等で標識した二次抗体（抗グロブリン、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ血清等）を反応させて測定することができる。このようにして適切な抗体を産生しているウエルを得る。さらに限界希釈法、軟寒天法、蛍光励起セルソーターを用いた方法等により単一クローンを分離する。例えば限界希釈法の場合、ハイブリドーマコロニーを１細胞／ウエル前後となるように培地で段階希釈し、培養することにより目的とするモノクローナル抗体を産生するクローンを単離することができる。得られた抗体産生ハイブリドーマは、約１０％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）あるいはグリセリン等の凍結保護剤の共存下に凍結させて−７０〜−１９６℃で保存すると、約半年〜半永久的に保存可能である。細胞は用時３７℃前後の恒温槽中で急速融解して使用する。凍結保護剤の細胞毒性が残存しないようによく洗浄してから使用するのが望ましい。

上記の方法で得られる本発明のモノクローナル抗体は、具体的には、例えばマウス由来かつＩｇＧクラスのモノクローナル抗体であって、Ａ１０及びＣ７と命名されたものである。ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスを調べるためには、該ハイブリドーマを一般的な条件で培養し、その培養上清中に分泌された抗体のクラスを市販の抗体クラス・サブクラス判定用キットなどを用いて分析することにより知ることができる。

本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、モノクローナル抗体A10及びC7を産生するハイブリドーマA10株及びC7株は本発明者らによって新たに分離され、具体的には、ブタペスト条約に基づく国際寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
（〒305-8566 茨城県つくば市東1-1-1 中央第6）に２００４年８月３１日付けで国内寄託され、受託番号としてＦＥＲＭＰ−２０１８９及びＦＥＲＭＰ−２０１９０が付されている。

モノクローナル抗体の取得は、その必要量やハイブリドーマの性状等によってマウス腹水から取得するか、細胞培養によるか適宜選択できる。マウス腹腔内で増殖可能なハイブリドーマは腹水から数ｍｇ／ｍｌの高濃度で得ることができる。インビボで増殖できないハイブリドーマは細胞培養の培養上清から取得する。細胞培養によれば、抗体産生量はインビボより低いが、腹腔内に含まれる免疫グロブリンや他の夾雑物質の混入が少なく、精製が容易であるという利点がある。

マウス腹腔内から取得する場合、例えば、予めプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）等の免疫抑制作用を有する物質を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内へハイブリドーマ（約１０⁶
個以上）を移植し、約１〜３週間後に貯留した腹水を採取する。異種ハイブリドーマ（例えばマウスとラット）の場合には、ヌードマウス、放射線処理マウスを使用することが好ましい。

一方、細胞培養上清から抗体を取得する場合、例えば、細胞維持に用いられる静置培養法の他に、高密度培養方法あるいはスピンナーフラスコ培養方法などの培養法を用い、当該ハイブリドーマを培養し抗体を含有する培養上清を得る。血清には、他の抗体やアルブミン等の夾雑物が含まれ、抗体精製に不便な点が多いので培養液への添加は少なくすることが望ましい。

腹水、培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、免疫グロブリンの精製法として従来既知の硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ポリエチレングリコール分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲル濾過法等を応用することで、容易に達成される。さらに、本発明の抗ADAMTS１３モノクローナル抗体が、マウスＩｇＧ抗体である場合には、プロテインＡ結合担体あるいは抗マウスイムノグロブリン結合担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することが可能であり、簡便である。

本発明の新規モノクローナル抗体を用いて試料中のADAMTS１３を迅速に測定することが可能である。本発明のモノクローナル抗体の1種又は2種以上を組み合わせて用いることが可能である。本発明の１種類のモノクローナル抗体と、もう一種類のモノクローナル抗体の組み合わせ、１種類の本発明のモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の組み合わせ、さらには、本発明の一種類のモノクローナル抗体と本発明のモノクローナル抗体の機能以外の機能を有するモノクローナル抗体を組み合わせて用いることも本発明に含まれる。測定方法としては、通常当分野で行われる各種のイムノアッセイが利用され得る。該方法は検体と該抗体とを反応させ、形成される免疫複合体を測定する工程を含むものであれば特に限定されず、沈降反応や凝集反応を光学的に検出する免疫比濁法や、分別検出の容易な物質で標識した抗体を用いる標識化免疫測定法などがある。後者には、免疫複合体の検出に標識としてＲＩを用いるラジオイムノアッセイ、アルカリホスファターゼやパーオキシダーゼ等の酵素を用いるエンザイムイムノアッセイ、蛍光物質を用いる蛍光イムノアッセイなどが含まれる。標識する対象によって、検出すべき抗体を直接標識する直接法の他、検出すべき抗体の抗体つまり二次抗体を標識する間接法などがある。間接法を用いる場合、例えば本発明の抗ADAMTS１３モノクローナル抗体がマウスＩｇＧモノクローナル抗体である場合、二次抗体としては例えば抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体等を使用すればよい。該二次抗体の調製法、並びに抗体の蛍光物質、ＲＩおよび酵素等による標識は、当分野で慣用の方法を用いて行うことができる。また、当該測定法にビオチン−アビジン（又はストレプトアビジン）の反応を利用する方法も可能であり、高い感度が要求される測定の場合には好ましく採用される。当該方法としては、例えばビオチンで標識した抗ADAMTS１３モノクローナル抗体と蛍光物質等で標識したストレプトアビジンとを組み合わせて用いるものが挙げられる。抗ADAMTS１３モノクローナル抗体のビオチンでの標識、ストレプトアビジンの蛍光物質等での標識は、当分野で通常行われる方法を用いて行うことができ、例えば蛍光物質等で標識したストレプトアビジンは商業的にも入手可能である。

本発明の測定方法により測定される検体は特に制限はなく血液が一般的であるが、当該測定は細胞、組織レベルで測定可能である他、当該細胞、組織からの抽出物を用いても測定可能である。これらの測定方法は通常当分野で行われている方法を適用し得る。

さらに本発明においては、本発明の新規モノクローナル抗体を試薬に含めることができる。ここでいう試薬には、例えば試料中のADAMTS１３の検出用試薬、キット、当該酵素分子に密接に関与する分子の検出用試薬、当該酵素分子の精製の為の試薬等が挙げられる。

ADAMTS１３の検出用試薬としては、測定原理として直接法を用いる場合、該試薬は、例えばＲＩ、酵素、蛍光物質等で標識された該モノクローナル抗体を適当な緩衝液中に溶解した溶液の他、標識検出用試薬、ブロッキング液、洗浄液等から構成される。洗浄液としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートなどのイオン性または非イオン性界面活性剤あるいはゼラチン等を含有するＰＢＳ等の緩衝液（さらにアジ化ナトリウムを含有してもよい）が、ブロッキング液としてはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）や非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等）などを含有するＰＢＳ等の緩衝液（さらにアジ化ナトリウムを含有してもよい）が例示される。バックグラウンドの高い試料を測定する場合などには、ブロッキング液はさらにヤギ等の動物由来血清を含んでいることが好ましい。一方、間接法を用いる場合には、該試薬は、例えば未標識の該モノクローナル抗体および該モノクローナル抗体に特異性を有する、ＲＩ、酵素、蛍光物質等で標識された二次抗体、ブロッキング液、洗浄液等から構成される。さらに、電気泳動法等と組み合わせて測定を行う場合、該電気泳動法に使用する試薬等を共に梱包しておくことも可能である。蛍光顕微鏡による蛍光測定を行う為の試薬には、試料（細胞や組織など）の封入剤を共に梱包しておくこともでき、かかる封入剤としては、グリセロール含有ＰＢＳ、ポリビニルアルコール含有ＰＢＳ等が好ましく例示される。

ADAMTS１３の精製用の試薬としては、例えば当該モノクローナル抗体の他に、当分野で一般的に行われているアフィニティー精製の方法に従って、必要なものを含めることができる。具体的には、本発明のモノクローナル抗体
の他、当該モノクローナル抗体を固定化する場合にはその為の担体や試薬、洗浄用や抗原溶出用の緩衝液等が挙げられる。

ADAMTS１３酵素分子に関与する分子の検出用試薬としては、目的とする分子の性質によっても異なるが、例えば、免疫沈降法を利用した検出法に用いられる試薬が挙げられる。具体的には、本発明のモノクローナル抗体の他、当該モノクローナル抗体を固定化する為の担体、洗浄用の緩衝液等が挙げられ、沈降後の当該分子及びADAMTS１３酵素分子の検出には通常の電気泳動用試薬や前述のウエスタンブロット法で用いる試薬と同様のものが例示される。

本発明はADAMTS１３測定による臨床検査にも適用される。適用される臨床検査は、血栓性血小板減少紫斑症（TTP）、溶血性尿毒症候群（HUS）、播種性血管内凝固症候群（DIC）、脳梗塞、慢性肝疾患、悪性腫瘍、HIV,心筋梗塞、自己免疫疾患、妊娠合併症、急性腎不全等の病状進展のリスクファクターの検査に適用される。

本発明のモノクローナル抗体は、ADAMTS13分子に対する機能が特定されているため、ADAMTS13の測定や検査法に適用されるばかりでなく、ADAMTS13の機能解析のツールとしても用いられる。例えば、基質であるVWFとADAMTS13の結合が正常に行われているか否かの機能解析、プロテアーゼ活性が有るか否かの機能解析等に用いることが可能である。さらには、後天的にADAMTS13分子に対する自己抗体出現により、ADAMTS13の活性が減少したり、抗原量が減少したりすることがあるが、このような場合においても、本発明のモノクローナル抗体を用いることにより、自己抗体の性質を検索するツールに用いることも可能である。

本発明は、ADAMTS13を測定するための試薬、キット及び上述の検査用の試薬、キットにも及ぶ。試薬、キットの例としては、前記の免疫学的測定法に適したものを適宜選択して用いる。例えばEIA法であれば、抗体を固相化したマイクロプレートや磁性粒子等の固相試薬、標識抗体試薬、酵素基質試薬、標準液、洗浄液等を適宜組み合わせてキット化することが可能である。

ハイブリドーマならびに抗ADAMTS１３モノクローナル抗体の作製
ハイブリドーマの作製方法
（１）マウス：７乃至８週令の近交系ＢＡＬＢ／ｃ系マウス雌を、動物飼育チェンバー内（２３±１℃、湿度７０％）で、標準ペレットを使用して飼育し、任意に給水して飼育した。
（２）免疫抗原：Ｃ末端フラッグ配列を有するＡＤＡＭＴＳ１３遺伝子をＰＣＲによりｃＤＮＡライブラリーより増幅させ、それを発現ベクターｐＣＡＧＣに繋ぎ、ＨｅＬａ細胞に導入した。細胞を無血清培地ＯＰＴＹＩＭＥＭＩ培地で44時間培養し、培養上清を集め抗ＦＬＡＧＭ２モノクローナル抗体で精製したものをＡＤＡＭＴＳ１３抗原として用いた。
（３）免疫方法：
ADAMTS13抗原を１００μｇ／０．５ｍｌとなる様にＰＢＳで調製し、同量（０．５ｍｌ）のフロイント完全アジュバント（Freund's
complete adjuvant) （Ｄｉｆｃｏ社製）を混合して乳化した。この乳化状の抗原を７週令の４匹の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔に１匹あたり２００μｌ投与した。さらに２週間毎に、ＧＥＲＢＵＶＡＮＴ（ＧＥＲＢＵ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ，ＧｍｂＨ，Ｄ−６９０１Ｇｕｉｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ製）で１００μｇ／ｍｌとなるように調製した上記抗原をマウスあたり２０μｇずつ４回投与した。さらに１ヶ月後、ＧＥＲＢＵＶＡＮＴで１００μｇ／ｍｌとなるように調製した上記抗原を同様に追加免疫した後、マウスの抗体価を測定した。抗体価の高いマウスはさらに２週間後にＰＢＳで１００μｇ／ｍｌに調製したADAMTS13抗原を、マウス尾静脈より注射して最終免疫とした。尚、抗体価の測定は、当該抗原で免疫したマウスの血清を用いて、後述のスクリーニングの方法に準じて行った。
（４）細胞融合：最終免疫から３日後にＢＡＬＢ／ｃマウスの摘脾を行い、ＤＭＥＭ培養液中で脾細胞を浮遊させて、脾細胞の浮遊液を作製した。ついで、細胞数を算定し、１．９×１０⁸
個の脾細胞を得た。細胞融合は、２−アミノ−６−メルカプトプリン（６−チオグアニン［2-amino-6-mercaptopurine] ）耐性のＢＡＬＢ／ｃマウス由来骨髄腫培養細胞株（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８・６５３、以下Ｘ６３細胞ともいう）を親細胞株として用いた。Ｘ６３細胞は、牛胎児血清（fetal
calf serum: ＦＣＳ）１０％を含むDMEM培養液（5μｇ／ｍｌ、6-チオグアニン含有）で継代培養し、細胞融合の３日前より６−チオグアニンを含有しない１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ培養液でさらに培養し、対数増殖期の細胞を用いた。Ｘ６３細胞の細胞数を算定し、１．９×１０^８個の生細胞を得た。ＤＭＥＭ培養液で、ポリエチレングリコール−１５００が５０（ｗ／ｖ）％濃度となるように溶解し、上記の脾細胞とＸ６３細胞の比が１：１となるように混合し、公知の方法（ケラーとミルスタイン共著，Nature,
第256 巻, 495-497 頁, 1975年、Eur. J. Immunol.
第6 巻, 511-519 頁, 1976年）に準じて細胞融合を行った。その後、１０％ＦＣＳおよび５％ブリクローン（Ａｒｃｈｐｏｒｔ社製）を添加したＤＭＥＭ培養液に、１×１０^-4Ｍのヒポキサンチン、４×１０^-7Ｍのアメソプテリン及び１．６×１０^-5Ｍのチミジンを含有するＨＡＴ選択液を加え、脾細胞が２．０×１０⁶
個／ｍｌとなるように浮遊させた。ついで、この細胞浮遊液の１００μｌを、９６ウエルのマイクロタイタープレートの各ウエルに分注した後、ＣＯ₂
無菌培養器において温度３７℃、湿度１００％、５％のＣＯ₂条件下で培養を行った。培養開始後、３日目にＨＡＴ培地１００μＬを各ウエルに加え、その後３日おきに半分量のＨＡＴ培地を交換しながら培養を行った。その後、２〜３週間後に、目的の抗ADAMTS１３モノクローナル抗体を産生するクローンを、ADAMTS１３抗原を固相に吸着させたマイクロプレートを用いたエライザ法によるスクリーニングによって検索した。
（５）スクリーニング：上記ハイブリドーマ細胞の培養上清を用いて、ADAMTS１３抗原固定化エライザプレートとの反応により選択した。尚、非特異オリゴペプチド固相化エライザプレートに反応する非特異反応性クローンを除去し、ADAMTS１３抗原にのみ特異的に反応するクローンを選別した。抗原液として、ADAMTS13抗原を２μｇ／ｍｌの濃度に調製し、各々、１ウエル当たり５０μｌずつマイクロタイタープレートに添加し、一晩吸着させた後、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％含むリン酸緩衝液（以下洗浄液と略す）で５回洗浄し、さらに１０％スキムミルクを含むリン酸緩衝液でブロッキングしADAMTS１３抗原固相化プレートを調製した。上記で得られたハイブリドーマ細胞系の培養上清１００μＬを、当該固相化プレートに添加し、３７℃で３０分間反応させた後、洗浄液で５回洗浄し、さらにホースラディッシュペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略す）標識した抗マウスイムノグロブリン抗体（ヤギ由来）を３７℃で３０分反応させた。この反応の後、洗浄液で４回洗浄し、基質液（ｏ−フェニレンジアミン0.4ｍｇ／ｍｌ及び０．０２％Ｈ₂
Ｏ₂を含む）を３７℃で３０分間反応させた後、この反応を２Ｎ硫酸で停止させ、主波長４９２ｎｍでエライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。ADAMTS１３抗原を固相化したエライザプレートに特異的に反応するハイブリドーマ細胞系を選別した後、限界機釈法によりクローニングし、受託番号FERM P-20189及びP-20190のハイブリドーマより、それぞれ抗ADAMTS１３モノクローナル抗体、クローンA10とC7を得た。

マウスイムノグロブリンサブクラスの同定：上記、クローニングにより単一クローンとして得られたハイブリドーマ細胞系の産生するモノクローナル抗体のマウスイムノグロブリンサブクラスを決定した。マウスイムノグロブリンサブクラスの同定には、各ハイブリドーマ細胞系の培養上清を用い、セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ）社製ＭｏｕｓｅＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＩｓｏｔｙｐｉｎｇｋｉｔを用いた。その結果、クローンA10はIgG2ｂ−κ、クローンC7はIgG1-κであることが判った。

マウスモノクローナル抗体の機能の確認：正常ヒト血漿２０μLに対してＩｇＧ濃度、０．２−２００μｇ／ｍLの実施例１で得たモノクローナル抗体を等量混合し、終濃度０．１−１００μｇ／ｍLとなるように調整し、３７℃で１２０分間インキュベートした後、ヒト血漿中に残存しているADAMTS13活性をVWFマルチマー解析法により測定した。その結果を図１に示した。クローンA10は10μｇ／ｍLの濃度で約５０％の阻害活性を示し、５０μｇ／ｍL以上では１００％ADAMTS13の活性を阻害した。一方、クローンC７は２５μｇ／ｍL以上の濃度でADAMTS１３の活性を約３５％阻害した。以上より、得られたモノクローナル抗体は何れもADMATS１３の活性を少なくとも３０％阻害することが判った。

マウスモノクローナル抗体の特異性の確認：ADAMTS13分子のN末端アミノ酸より２８５番目までのポリペプチド、３８７番目までのポリペプチド、
４４９番目までのポリペプチド、６８８番目までのポリペプチド、７４６番目までのポリペプチド、８０８番目までのポリペプチド、８９７番目までのポリペプチド、１０１６番目までのポリペプチド、１１３５番目までのポリペプチド及び１４２７アミノ酸よりなるADAMTS13分子全体を用いて、ウエスタンブロット法により特異性を確認した。その結果を図２に示した。クローンA10とC7の両クローン共にADAMTS13分子と強く反応した。このことから両クローン共にADAMTS１３のウエスタンブッロト法による免疫化学的分析に有用であることが判った。そして、クローンA10は少なくともADAMTS13分子のN末端より３８７番目のアミノ酸よりもN末端側の上流部分にエピトープを有し、２８５番目までのポリペプチドでは反応を認めないことから、２８５番目と３８７番目の領域にエピトープを有していることが判った。一方、クローンC7は１０１６番目までのポリペプチドとは反応せずに、１１３５番目までのポリペプチドに反応することから１０１６番目よりC末端側下流にエピトープが存在し、１０１６番目から１１３５番目までの領域にエピトープが存在することが判った。

本発明の抗ADAMTS13モノクローナル抗体を用いることにより、（１）ウエスタンブロット法によるADAMTS13の迅速な検出及び同定、（２）免疫沈降法(Immunoprecipitation法) による、発現したADAMTS１３の検出及び同定、さらに、ADAMTS１３と結合性を有する他の蛋白質の検出及び解析、（３）免疫化学的手段によるADAMTS１３の測定、検査（４）それらの成果に基づく治療薬、診断薬等の開発に利用できる。

本発明のモノクローナル抗体のADAMTS１３の酵素活性の阻害機能を示した図である。本発明のモノクローナル抗体によるADAMTS13分子のウエスタンブロットの結果を示した図である。

Claims

フォンヴィルブランド因子切断プロテアーゼ（ADAMTS13）に対して特異的に親和性を有し、ADAMTS13の酵素活性を少なくとも３０％阻害するモノクローナル抗体。
配列表配列番号１に記載のADAMTS13分子のアミノ酸配列の３８７番目よりN末端側の上流部分に特異的に親和性を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
配列表配列番号１に記載のADAMTS13分子のアミノ酸配列の２８５番目から３８７番目のアミノ酸までの領域に存在するエピトープを認識することを特徴とする請求項１又は２に記載のモノクローナル抗体。
配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列の全部または一部を有する蛋白質に対して特異的に親和性を有する請求項２又は３に記載のモノクローナル抗体
。
配列表配列番号１に記載のADAMTS13分子のアミノ酸配列の１０１６番目よりC末端側の下流部分に特異的に親和性を有する請求項１に記載のモノクローナル抗体。
配列表配列番号１に記載のADAMTS13分子の１０１６番目のアミノ酸から１１３５番目のアミノ酸までの領域に存在するエピトープを認識することを特徴とする請求項１又は５に記載のモノクローナル抗体
配列表配列番号３に記載のアミノ酸配列の全部または一部を有する蛋白質に対して特異的に親和性を有する請求項５又は６に記載のモノクローナル抗体
。
受託番号がＦＥＲＭ
Ｐ−２０１８９又はＦＥＲＭＰ−２０１９０であるハイブリドーマにより産生される、請求項１〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
受託番号がＦＥＲＭＰ−２０１８９又はＦＥＲＭＰ−２０１９０である請求項９記載のハイブリドーマ。
請求項１に記載の少なくとも１種のモノクローナル抗体と試料とを反応させる工程を含む、試料中のADAMTS13の測定方法。
請求項２〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体と試料とを反応させる工程を含む、試料中のADAMTS13の測定方法。
請求項５〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体と試料とを反応させる工程を含む、試料中のADAMTS13の測定方法。
請求項２〜４のいずれかに記載のモノクローナル抗体及び請求項５〜７のいずれかに記載のモノクローナル抗体を組み合わせてもちいる試料中のADAMTS13の測定方法。
請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法によって、血栓性疾患を検査する方法。
請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体を含む試薬またはキット。