JP2002517224A - 生体サンプル内におけるグアニジノ基由来進行グリコシル化最終生成物に特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents
生体サンプル内におけるグアニジノ基由来進行グリコシル化最終生成物に特異的なモノクローナル抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、生体内で生成したグアニジノ基由来進行グリコシル化最終生成物に対するモノクローナル抗体及び生体外で生成した進行グリコシル化最終生成物と交差反応性のモノクローナル抗体に関し、それに基づく診断及び治療方法に関する。より具体的には、本発明は、生体内産生進行グリコシル化最終生成物（ＡＧＥ）と反応性のモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントに関し、このモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントは、１９９８年３月３１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されており、ＨＢ‐１２５００の受託番号が与えられているハイブリドーマＦ５２‐４Ｅ１により産生されたときのモノクローナル抗体４Ｅ１の免疫結合特性を示す。
Description
【０００１】発明の分野 本発明は、一般的には、非酵素的にグリコシル化された蛋白質の検出及び測定に
関し、特に、アルギニンのグアニジノ基と３‐デオキシグルコソンとの反応によ
って生成したグアニジノ基由来進行グリコシル化最終生成物の検出及び測定の方
法並びに関連物質に関するものである。
関し、特に、アルギニンのグアニジノ基と３‐デオキシグルコソンとの反応によ
って生成したグアニジノ基由来進行グリコシル化最終生成物の検出及び測定の方
法並びに関連物質に関するものである。
【０００２】発明の背景 グルコース及びその他の還元糖は、濃度依存的な形で、蛋白質及びその他のバイ
オ分子（biomolecules）のアミノ基に非酵素的に結合する。これらの初期アマド
リ（Amadori）付加物は、他の蛋白質基との架橋の他に、更に転移、脱水、断片
化を受けて、進行グリコシル化最終生成物（ＡＧＥ）と呼ばれる一群の複合構造
体として蓄積することができる。メイラード（Maillard）又は褐変生成物として
も知られているＡＧＥは、貯蔵食物内及び調理過程中に、食品の糖類及び蛋白質
と他の食品成分との反応の結果として生成する。これらは、食品の組織の変化の
他に、調理された食料品の黄褐色と、堅さを高める傾向のある架橋反応の両方の
原因となる。人の健康にとって重要なのは、血糖、身体蛋白質及びその他のバイ
オ分子間の相互作用の結果として、生体内にＡＧＥが生成するということである
。老化及び糖尿病の合併症の有害な結果の多くは、身体の組織及び器官、特に長
く存在した蛋白質が含まれている部分において、ＡＧＥの生成及び蓄積が増大す
ることによるものであった。老化の有害な結果は、ＡＧＥがゆっくり生成し、生
涯を通じて蓄積することから生じるものと信じられており、糖尿病では、血糖濃
度が上昇すると、ＡＧＥの生成が増加し、若年での老化合併症を発現することに
なり易い。心臓血管及び脳血管疾患、代表的には心臓発症及び発作などの老化合
併症は、年配層では益々多く見られるようになっているが、糖尿病個体群では、
より若い年代で起こっており、腎臓障害、神経病及び網膜障害をはじめとする糖
尿病に特有な微小血管合併症は、慢性的に血糖濃度が上昇した重篤な合併症であ
る。糖尿病及び老化の病態生理学におけるグルコース及びその他の糖類の役割に
ついては、Bucala等、進行グリコシル化：糖尿病と老化の化学、生物学及びイン
プリケーション（Implication）、Advanced in Pharmacology, 23, 1-34 (1992)
に総説が書かれており、ここに参照のために記載した。 ＡＧＥの“系”としては、単離され、化学構造によって特徴づけられることがで
きる種が挙げられ、まったく安定なものもあれば、不安定であるか又は反応性で
あるものもある。いくつかの構造的に同定されたＡＧＥは、先に記載されており
、蛋白質、脂質及び核酸とグルコース、リボース、フラクトースをはじめとする
種々の生物学的に関連した糖類との相互作用に起因する。例としては、２‐（２
‐フロイル）‐４（５）‐（２‐フラニル）‐１Ｈ‐イミダゾール（米国特許第
４，６６５，１９２号参照）、ペントシジン、ＡＦＧＰ、ピラリン、シペントジ
ン（cypentodine）等が挙げられる。多数のＡＧＥ構造が、確認されていないか
、あるいは構造的に同定されていない。ＡＧＥを生ずる反応の中で、リジンの側
鎖のイプシロン‐アミノ基を関与させることが、モデルシステムとして用いられ
ており、更に最近では、ＡＧＥの生成におけるアルギニンの関与が研究されてい
る。特に関連した一つの反応は、高度に反応性の糖誘導体３‐デオキシグルコソ
ン（以下、３ＤＧと略す）を生成するアマドリ生成物の分解である。次いで、３
ＤＧを、アミノ基を有する高分子と反応させて、ＡＧＥを生成してもよい。 研究者たちは、蛋白質内でのアルギニンのグアニジノ基と３ＤＧとの反応に起因
するＡＧＥの研究も行っている。Konishi等（Biosci. Biotech. Biochem., 58,
1953-1955 (1994)）は、Ｓ１７又は２‐（４‐ベンゾイルアミノ‐５‐ペンタミ
ド）‐アミノ‐５‐(２，３，４‐トリヒドロキシブチル)‐４‐イミダゾロンと
呼ばれる新規なイミダゾロン化合物を述べており、この化合物は、３ＤＧと蛋白
質との間の反応をモデルにして、Ｎε‐ベンゾイル‐Ｌ‐アルギニンアミドと３
ＤＧとのモデル反応から生成する、クロマトグラフで分離できる１７のピークの
中から単離された一つの化合物であった。Hayase等（Biosci. Biotech. Biochem
., 58, 1953-1955 (1994)）は、この反応経路及び先に報告された他のピークを
更に確認して、Ｓ６及びＳ７〔２‐（４‐ベンゾイルアミノ‐５‐ペンタミド）
‐アミノ‐５‐（２，３，４‐トリヒドロキシブチル）‐４‐ジヒドロキシ‐２
‐イミダゾリンのジアステレオマー〕、Ｓ１０〔２‐（４‐ベンゾイルアミノ‐
５‐ペンタミド）‐アミノ‐５‐（２，３，４‐トリヒドロキシブチル）‐４‐
（５‐ヒドロキシ）‐イミダゾロン〕並びにＳ１２〔２‐（４‐ベンゾイルアミ
ノ‐５‐ペンタミド）‐アミノ‐５‐（２，３，４‐トリヒドロキシブチル）‐
４‐イミダゾロン〕と呼ばれるこの経路における中間体を同定した。次いで、化
合物Ｓ１７に対するモノクローナル抗体を産生し、齧歯類及びヒトからの糖尿病
組織内のイミダゾロンを定量し、免疫組織化学的に定着させるのに使用した（Ni
wa等、FEBS Letters, 407, 297-302 (1997); Niwa等、Clin. Invest., 99, 1272
-1280 (1997) ）。 更に最近では、隣接するアルギニン及びリジン残基から生成するＡＧＥが、Al-A
bed等、Ｄ‐リボースとＡｒｇ‐Ｌｙｓとのメイラード反応のモデル研究、Bioor
ganic & Medicinal Chemistry Letters, 5, 2929-2930)に記載されており、ここ
では、リジンが還元糖と反応して、アマドリ生成物を生成している。このスキー
ムでは、アマドリ生成物が脱水してアマドリ生成物ジオン中間体を生成し、その
後、隣接アルギニンのグアニジノ基と付加物を生成し、次いで、水和されて環状
の２‐アミノ‐４，５‐ジヒドロイミダゾール付加構造体（ａｒｇ‐ｌｙｓイミ
ダゾールについては、ＡＬＩと呼ぶ）を生成する。 本発明が目ざすのは、生体内及び生体外でのＡＧＥの生成における３ＤＧの役割
、及び３ＤＧとグアニジノ基含有化合物との間の反応を更に理解することである
。 ここでの参照文献の引用は、かかる文献が本発明に対する先行技術であることを
認めるものとして解釈されるものではない。
オ分子（biomolecules）のアミノ基に非酵素的に結合する。これらの初期アマド
リ（Amadori）付加物は、他の蛋白質基との架橋の他に、更に転移、脱水、断片
化を受けて、進行グリコシル化最終生成物（ＡＧＥ）と呼ばれる一群の複合構造
体として蓄積することができる。メイラード（Maillard）又は褐変生成物として
も知られているＡＧＥは、貯蔵食物内及び調理過程中に、食品の糖類及び蛋白質
と他の食品成分との反応の結果として生成する。これらは、食品の組織の変化の
他に、調理された食料品の黄褐色と、堅さを高める傾向のある架橋反応の両方の
原因となる。人の健康にとって重要なのは、血糖、身体蛋白質及びその他のバイ
オ分子間の相互作用の結果として、生体内にＡＧＥが生成するということである
。老化及び糖尿病の合併症の有害な結果の多くは、身体の組織及び器官、特に長
く存在した蛋白質が含まれている部分において、ＡＧＥの生成及び蓄積が増大す
ることによるものであった。老化の有害な結果は、ＡＧＥがゆっくり生成し、生
涯を通じて蓄積することから生じるものと信じられており、糖尿病では、血糖濃
度が上昇すると、ＡＧＥの生成が増加し、若年での老化合併症を発現することに
なり易い。心臓血管及び脳血管疾患、代表的には心臓発症及び発作などの老化合
併症は、年配層では益々多く見られるようになっているが、糖尿病個体群では、
より若い年代で起こっており、腎臓障害、神経病及び網膜障害をはじめとする糖
尿病に特有な微小血管合併症は、慢性的に血糖濃度が上昇した重篤な合併症であ
る。糖尿病及び老化の病態生理学におけるグルコース及びその他の糖類の役割に
ついては、Bucala等、進行グリコシル化：糖尿病と老化の化学、生物学及びイン
プリケーション（Implication）、Advanced in Pharmacology, 23, 1-34 (1992)
に総説が書かれており、ここに参照のために記載した。 ＡＧＥの“系”としては、単離され、化学構造によって特徴づけられることがで
きる種が挙げられ、まったく安定なものもあれば、不安定であるか又は反応性で
あるものもある。いくつかの構造的に同定されたＡＧＥは、先に記載されており
、蛋白質、脂質及び核酸とグルコース、リボース、フラクトースをはじめとする
種々の生物学的に関連した糖類との相互作用に起因する。例としては、２‐（２
‐フロイル）‐４（５）‐（２‐フラニル）‐１Ｈ‐イミダゾール（米国特許第
４，６６５，１９２号参照）、ペントシジン、ＡＦＧＰ、ピラリン、シペントジ
ン（cypentodine）等が挙げられる。多数のＡＧＥ構造が、確認されていないか
、あるいは構造的に同定されていない。ＡＧＥを生ずる反応の中で、リジンの側
鎖のイプシロン‐アミノ基を関与させることが、モデルシステムとして用いられ
ており、更に最近では、ＡＧＥの生成におけるアルギニンの関与が研究されてい
る。特に関連した一つの反応は、高度に反応性の糖誘導体３‐デオキシグルコソ
ン（以下、３ＤＧと略す）を生成するアマドリ生成物の分解である。次いで、３
ＤＧを、アミノ基を有する高分子と反応させて、ＡＧＥを生成してもよい。 研究者たちは、蛋白質内でのアルギニンのグアニジノ基と３ＤＧとの反応に起因
するＡＧＥの研究も行っている。Konishi等（Biosci. Biotech. Biochem., 58,
1953-1955 (1994)）は、Ｓ１７又は２‐（４‐ベンゾイルアミノ‐５‐ペンタミ
ド）‐アミノ‐５‐(２，３，４‐トリヒドロキシブチル)‐４‐イミダゾロンと
呼ばれる新規なイミダゾロン化合物を述べており、この化合物は、３ＤＧと蛋白
質との間の反応をモデルにして、Ｎε‐ベンゾイル‐Ｌ‐アルギニンアミドと３
ＤＧとのモデル反応から生成する、クロマトグラフで分離できる１７のピークの
中から単離された一つの化合物であった。Hayase等（Biosci. Biotech. Biochem
., 58, 1953-1955 (1994)）は、この反応経路及び先に報告された他のピークを
更に確認して、Ｓ６及びＳ７〔２‐（４‐ベンゾイルアミノ‐５‐ペンタミド）
‐アミノ‐５‐（２，３，４‐トリヒドロキシブチル）‐４‐ジヒドロキシ‐２
‐イミダゾリンのジアステレオマー〕、Ｓ１０〔２‐（４‐ベンゾイルアミノ‐
５‐ペンタミド）‐アミノ‐５‐（２，３，４‐トリヒドロキシブチル）‐４‐
（５‐ヒドロキシ）‐イミダゾロン〕並びにＳ１２〔２‐（４‐ベンゾイルアミ
ノ‐５‐ペンタミド）‐アミノ‐５‐（２，３，４‐トリヒドロキシブチル）‐
４‐イミダゾロン〕と呼ばれるこの経路における中間体を同定した。次いで、化
合物Ｓ１７に対するモノクローナル抗体を産生し、齧歯類及びヒトからの糖尿病
組織内のイミダゾロンを定量し、免疫組織化学的に定着させるのに使用した（Ni
wa等、FEBS Letters, 407, 297-302 (1997); Niwa等、Clin. Invest., 99, 1272
-1280 (1997) ）。 更に最近では、隣接するアルギニン及びリジン残基から生成するＡＧＥが、Al-A
bed等、Ｄ‐リボースとＡｒｇ‐Ｌｙｓとのメイラード反応のモデル研究、Bioor
ganic & Medicinal Chemistry Letters, 5, 2929-2930)に記載されており、ここ
では、リジンが還元糖と反応して、アマドリ生成物を生成している。このスキー
ムでは、アマドリ生成物が脱水してアマドリ生成物ジオン中間体を生成し、その
後、隣接アルギニンのグアニジノ基と付加物を生成し、次いで、水和されて環状
の２‐アミノ‐４，５‐ジヒドロイミダゾール付加構造体（ａｒｇ‐ｌｙｓイミ
ダゾールについては、ＡＬＩと呼ぶ）を生成する。 本発明が目ざすのは、生体内及び生体外でのＡＧＥの生成における３ＤＧの役割
、及び３ＤＧとグアニジノ基含有化合物との間の反応を更に理解することである
。 ここでの参照文献の引用は、かかる文献が本発明に対する先行技術であることを
認めるものとして解釈されるものではない。
【０００３】発明の要約 本発明は、アルギニン又は式Ｒ‐ＮＨ‐Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２（ここで、Ｒは水素
又は低級アルキル基、例えばメチル基である）の化合物のグアニジノ基と３‐デ
オキシグルコソンとの反応に由来する生体内産生進行グリコシル化最終生成物と
反応性の抗体又はその抗原結合性フラグメントに関するものである。本発明の抗
体は、グルコース由来のＡＧＥとも反応性である。更に、抗体又はそのフラグメ
ントは、アミノ‐５‐（２，３，４‐トリヒドロキシブチル）‐４‐イミダゾロ
ン、ペントシジン（pentosidine）、カルボキシメチルリジン、リボース由来進
行グリコシル化最終生成物と反応せず、Ｌ‐リジン又はアミノグアニジンと３‐
デオキシグルコソンとの反応生成物とも反応せず、メチルグリオキサールとＬ‐
アルギニンとの反応生成物とも反応しない。 好ましい実施態様は、１９９８年３月３１日にアメリカンタイプカルチャーコレ
クション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）に寄託されており
、ＨＢ‐１２５００の受託番号が与えられているハイブリドーマＦ５２‐４Ｅ１
により産生されたときのモノクローナル抗体４Ｅ１などの、上述のように免疫結
合特性を示すモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントである。 より具体的には、該モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントは、血
清‐ＡＧＥ蛋白質、ヘモグロビン‐ＡＧＥ、血清‐ＡＧＥ脂質、血清‐ＡＧＥペ
プチド、ＬＤＬ‐ＡＧＥ及びコラーゲン‐ＡＧＥとの反応性からなる群から選ば
れた特徴である免疫結合特性を有することができる。 好ましい態様においては、モノクローナル抗体は、ヒト化されているか又はヒト
‐マウスキメラ抗体である。抗体又はその活性フラグメント、あるいは作動薬及
び同種の分子、あるいは代わりにその拮抗薬を含む治療組成物、及びこれらの組
成物を用いて、病気の予防、診断又は治療にこのような組成物を使用する方法も
含まれ、このような治療が必要な患者に、有効量の組成物が投与される。 モノクローナル抗体の抗原結合性フラグメントは、単鎖Ｆｖフラグメント、Ｆ（
ａｂ′）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ′）２フラグメン
ト、又は任意の他の抗原結合性フラグメントであることができる。特定の実施態
様においては、抗体又はそのフラグメントは、マウスＩｇＧイソタイプ抗体であ
る。 当然、本発明は、モノクローナル抗体４Ｅ１を産生するハイブリドーマにも及び
、このハイブリドーマは、先に示したように、ＡＴＣＣに寄託されている。
又は低級アルキル基、例えばメチル基である）の化合物のグアニジノ基と３‐デ
オキシグルコソンとの反応に由来する生体内産生進行グリコシル化最終生成物と
反応性の抗体又はその抗原結合性フラグメントに関するものである。本発明の抗
体は、グルコース由来のＡＧＥとも反応性である。更に、抗体又はそのフラグメ
ントは、アミノ‐５‐（２，３，４‐トリヒドロキシブチル）‐４‐イミダゾロ
ン、ペントシジン（pentosidine）、カルボキシメチルリジン、リボース由来進
行グリコシル化最終生成物と反応せず、Ｌ‐リジン又はアミノグアニジンと３‐
デオキシグルコソンとの反応生成物とも反応せず、メチルグリオキサールとＬ‐
アルギニンとの反応生成物とも反応しない。 好ましい実施態様は、１９９８年３月３１日にアメリカンタイプカルチャーコレ
クション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）に寄託されており
、ＨＢ‐１２５００の受託番号が与えられているハイブリドーマＦ５２‐４Ｅ１
により産生されたときのモノクローナル抗体４Ｅ１などの、上述のように免疫結
合特性を示すモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントである。 より具体的には、該モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントは、血
清‐ＡＧＥ蛋白質、ヘモグロビン‐ＡＧＥ、血清‐ＡＧＥ脂質、血清‐ＡＧＥペ
プチド、ＬＤＬ‐ＡＧＥ及びコラーゲン‐ＡＧＥとの反応性からなる群から選ば
れた特徴である免疫結合特性を有することができる。 好ましい態様においては、モノクローナル抗体は、ヒト化されているか又はヒト
‐マウスキメラ抗体である。抗体又はその活性フラグメント、あるいは作動薬及
び同種の分子、あるいは代わりにその拮抗薬を含む治療組成物、及びこれらの組
成物を用いて、病気の予防、診断又は治療にこのような組成物を使用する方法も
含まれ、このような治療が必要な患者に、有効量の組成物が投与される。 モノクローナル抗体の抗原結合性フラグメントは、単鎖Ｆｖフラグメント、Ｆ（
ａｂ′）フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ′）２フラグメン
ト、又は任意の他の抗原結合性フラグメントであることができる。特定の実施態
様においては、抗体又はそのフラグメントは、マウスＩｇＧイソタイプ抗体であ
る。 当然、本発明は、モノクローナル抗体４Ｅ１を産生するハイブリドーマにも及び
、このハイブリドーマは、先に示したように、ＡＴＣＣに寄託されている。
【０００４】 本発明のモノクローナル抗体は、３ＤＧ又はグルコースとの反応に由来する生体
内産生ＡＧＥに、好都合に結合する。従って、他の態様においては、本発明は、
生体サンプル内に進行グリコシル化最終生成物（ＡＧＥ）が存在することを検出
する方法に関するものである。この方法は、グアニジノ基由来ＡＧＥを含んでい
る可能性のあるサンプルを、抗体又はその抗原結合性フラグメントとＡＧＥとを
含む反応複合体を生成させる条件下で、本発明のモノクローナル抗体又はその抗
原結合性フラグメントと接触させ、サンプル内でのモノクローナル抗体又はその
抗原結合性フラグメントとＡＧＥとを含むこのような反応複合体の生成を検出す
ることからなる。反応複合体の生成の検出によって、サンプル内にＡＧＥが存在
することが分かる。 一つの実施態様においては、サンプル分子を固体支持体に結合又は接着させても
よく、そのように固定化された任意のＡＧＥ変性分子を、本発明のモノクローナ
ル抗体又はその抗原結合性フラグメントとの反応複合体を生成することにより、
反応複合体を検出するその後の測定工程で認識してもよい。 更なる実施態様においては、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメン
トは、例えば、本発明の固定化されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フ
ラグメントと反応性であるＡＧＥ変性分子の“サンドイッチ型“測定の第一成分
として、固相支持体に結合され、第二の免疫結合パートナーは、本発明のモノク
ローナル抗体を制限なしで含むポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はそ
れらの混合物であってもよい。更なる実施態様においては、標識された進行グリ
コシル化最終生成物（ＡＧＥ）にサンプルを接触させ、競合測定フォーマットで
反応複合体の生成を検出する前に、遊離した物質を除去する。サンプルとの反応
複合体の生成は、測定において結合された標識ＡＧＥの量の減少を観察すること
により検出することができる。あるいは、標識抗ＡＧＥ抗体又はＡＧＥ担体に対
する抗体が、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントとＡＧＥの複
合体に結合したことを検出することにより、反応複合体の生成を観察することが
できる。ＡＧＥ担体としては、アルブミン、ヘモグロビン、低密度リポ蛋白質な
どが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 他の実施態様では、ＡＧＥを固相支持体に結合させる。更なる態様においては、
本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントの存在下で、サン
プルを、固相支持体に結合した該固定化ＡＧＥと接触させる。モノクローナル抗
体又はその抗原結合性フラグメントは、直接、あるいは本発明のモノクローナル
抗体又はその抗原結合性フラグメントを特異的に認識する入手可能な試薬を用い
る更なる測定工程により標識される。サンプル内でのＡＧＥ変性分子との反応複
合体の生成は、固相支持体に複合化された標識の量の減少を観察することにより
検出することができる。 本発明により、サンプル内にグアニジノ基由来ＡＧＥが存在することを検出する
方法は、生体サンプル内のＡＧＥ濃度を評価するのに有用である。従って、本発
明は、更に、生体サンプル内での反応複合体の生成を検出し、生体サンプル内の
ＡＧＥの濃度に対応する、生成した反応複合体の量を評価することからなる、生
体サンプル内のＡＧＥの濃度を評価する方法に関するものである。 生体サンプル内のＡＧＥの濃度は、重要な診断値又は予後徴候値を有することが
できる。従って、本発明は、更に、哺乳類被検体からの生体サンプル内のＡＧＥ
の濃度を評価し、検出された濃度を、哺乳類被検体に正常に存在するＡＧＥの濃
度と比較することからなる、哺乳類被検体中のＡＧＥ濃度の上昇と関連がある病
気の存在を検出又は診断する方法に関するものである。正常濃度と比較したとき
のＡＧＥ濃度の増加により、ＡＧＥ濃度の上昇と関連がある病気が分かる。同様
に、本発明は、哺乳類被検体から、異なる時点において得られた一連の生体サン
プル内のＡＧＥの濃度を評価することからなる、哺乳類被検体中のＡＧＥ濃度の
上昇と関連がある病気の経過を監視する方法に関するものである。時間によるＡ
ＧＥ濃度の上昇により病気の進行が分かり、時間によるＡＧＥ濃度の低下により
病気の退行が分かる。 他の実施態様においては、本発明は、ＡＧＥ濃度の上昇と関連がある病気の治療
を受けている哺乳類被検体から、異なる時点において得られた一連の生体サンプ
ル内のＡＧＥの濃度を評価することからなる、哺乳類被検体中のＡＧＥ濃度の上
昇と関連がある病気の治療を監視する方法に関するものである。時間によるＡＧ
Ｅ濃度の低下により、治療成果が有効であることが分かる。
内産生ＡＧＥに、好都合に結合する。従って、他の態様においては、本発明は、
生体サンプル内に進行グリコシル化最終生成物（ＡＧＥ）が存在することを検出
する方法に関するものである。この方法は、グアニジノ基由来ＡＧＥを含んでい
る可能性のあるサンプルを、抗体又はその抗原結合性フラグメントとＡＧＥとを
含む反応複合体を生成させる条件下で、本発明のモノクローナル抗体又はその抗
原結合性フラグメントと接触させ、サンプル内でのモノクローナル抗体又はその
抗原結合性フラグメントとＡＧＥとを含むこのような反応複合体の生成を検出す
ることからなる。反応複合体の生成の検出によって、サンプル内にＡＧＥが存在
することが分かる。 一つの実施態様においては、サンプル分子を固体支持体に結合又は接着させても
よく、そのように固定化された任意のＡＧＥ変性分子を、本発明のモノクローナ
ル抗体又はその抗原結合性フラグメントとの反応複合体を生成することにより、
反応複合体を検出するその後の測定工程で認識してもよい。 更なる実施態様においては、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメン
トは、例えば、本発明の固定化されたモノクローナル抗体又はその抗原結合性フ
ラグメントと反応性であるＡＧＥ変性分子の“サンドイッチ型“測定の第一成分
として、固相支持体に結合され、第二の免疫結合パートナーは、本発明のモノク
ローナル抗体を制限なしで含むポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はそ
れらの混合物であってもよい。更なる実施態様においては、標識された進行グリ
コシル化最終生成物（ＡＧＥ）にサンプルを接触させ、競合測定フォーマットで
反応複合体の生成を検出する前に、遊離した物質を除去する。サンプルとの反応
複合体の生成は、測定において結合された標識ＡＧＥの量の減少を観察すること
により検出することができる。あるいは、標識抗ＡＧＥ抗体又はＡＧＥ担体に対
する抗体が、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントとＡＧＥの複
合体に結合したことを検出することにより、反応複合体の生成を観察することが
できる。ＡＧＥ担体としては、アルブミン、ヘモグロビン、低密度リポ蛋白質な
どが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 他の実施態様では、ＡＧＥを固相支持体に結合させる。更なる態様においては、
本発明のモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントの存在下で、サン
プルを、固相支持体に結合した該固定化ＡＧＥと接触させる。モノクローナル抗
体又はその抗原結合性フラグメントは、直接、あるいは本発明のモノクローナル
抗体又はその抗原結合性フラグメントを特異的に認識する入手可能な試薬を用い
る更なる測定工程により標識される。サンプル内でのＡＧＥ変性分子との反応複
合体の生成は、固相支持体に複合化された標識の量の減少を観察することにより
検出することができる。 本発明により、サンプル内にグアニジノ基由来ＡＧＥが存在することを検出する
方法は、生体サンプル内のＡＧＥ濃度を評価するのに有用である。従って、本発
明は、更に、生体サンプル内での反応複合体の生成を検出し、生体サンプル内の
ＡＧＥの濃度に対応する、生成した反応複合体の量を評価することからなる、生
体サンプル内のＡＧＥの濃度を評価する方法に関するものである。 生体サンプル内のＡＧＥの濃度は、重要な診断値又は予後徴候値を有することが
できる。従って、本発明は、更に、哺乳類被検体からの生体サンプル内のＡＧＥ
の濃度を評価し、検出された濃度を、哺乳類被検体に正常に存在するＡＧＥの濃
度と比較することからなる、哺乳類被検体中のＡＧＥ濃度の上昇と関連がある病
気の存在を検出又は診断する方法に関するものである。正常濃度と比較したとき
のＡＧＥ濃度の増加により、ＡＧＥ濃度の上昇と関連がある病気が分かる。同様
に、本発明は、哺乳類被検体から、異なる時点において得られた一連の生体サン
プル内のＡＧＥの濃度を評価することからなる、哺乳類被検体中のＡＧＥ濃度の
上昇と関連がある病気の経過を監視する方法に関するものである。時間によるＡ
ＧＥ濃度の上昇により病気の進行が分かり、時間によるＡＧＥ濃度の低下により
病気の退行が分かる。 他の実施態様においては、本発明は、ＡＧＥ濃度の上昇と関連がある病気の治療
を受けている哺乳類被検体から、異なる時点において得られた一連の生体サンプ
ル内のＡＧＥの濃度を評価することからなる、哺乳類被検体中のＡＧＥ濃度の上
昇と関連がある病気の治療を監視する方法に関するものである。時間によるＡＧ
Ｅ濃度の低下により、治療成果が有効であることが分かる。
【０００５】 本発明は、前記方法を実施するための便利なテストキットフォーマットを有利に
提供する。従って、本発明は、分析体における生体内由来、グアニジノ基由来Ａ
ＧＥの存在又は量を測定するテストキットを提供する。かかるキットは、本発明
のモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント、モノクローナル抗体又
はその抗原結合性フラグメントとＡＧＥとの間の反応複合体の生成を検出する手
段、他の試薬及びキット使用の説明書からなることができる。 一つの実施態様において、このテストキットは、モノクローナル抗体によって認
識される、１つ若しくは複数のＡＧＥの製剤又は１つ若しくは複数のＡＧＥで変
性された分子を更に含むことができ、例えば、該ＡＧＥ分子は、固相に非可逆的
に結合している。他の実施態様においては、このテストキットは、標識抗ＡＧＥ
抗体又はその抗原結合性フラグメントを更に含むことができ、この標識抗ＡＧＥ
抗体は、生体内産生ＡＧＥと反応性であるか、あるいはＡＧＥ変性度を求めよう
としている分析体分子と直接反応性であり、例えば、標識抗低密度リポ蛋白質抗
体が挙げられる。 更に別の実施態様では、生体内かあるいは生体外で、ＡＧＥを循環系から隔離す
るために、患者の血清を抗ＡＧＥ抗体に触れさせることにより、グアニジノ基由
来ＡＧＥの過度の蓄積が特徴である病気又は障害の治療に、本発明の抗体を用い
てもよい。 かくして、本発明の主たる目的は、グアニジノ基を含む構造体から得られる生体
内産生ＡＧＥと反応性であるモノクローナル抗体を提供することである。 本発明の他の目的は、生体内産生グアニジノ基由来ＡＧＥと反応性である抗体の
限定されない源（indefinite source）を提供することであり、この抗体は、こ
の目的のために抗体を特に有用にする特定の免疫結合特性を有している。 本発明の更に他の目的は、本発明の抗体に基づくかあるいは含む、ＡＧＥの異常
濃度を特徴とする状態を治療する治療組成物及び対応する方法提供することであ
る。 本発明のこれら及びその他の目的は、次の図面、発明の詳細な説明及び実施例を
参照することにより、更に良く理解されるであろう。
提供する。従って、本発明は、分析体における生体内由来、グアニジノ基由来Ａ
ＧＥの存在又は量を測定するテストキットを提供する。かかるキットは、本発明
のモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント、モノクローナル抗体又
はその抗原結合性フラグメントとＡＧＥとの間の反応複合体の生成を検出する手
段、他の試薬及びキット使用の説明書からなることができる。 一つの実施態様において、このテストキットは、モノクローナル抗体によって認
識される、１つ若しくは複数のＡＧＥの製剤又は１つ若しくは複数のＡＧＥで変
性された分子を更に含むことができ、例えば、該ＡＧＥ分子は、固相に非可逆的
に結合している。他の実施態様においては、このテストキットは、標識抗ＡＧＥ
抗体又はその抗原結合性フラグメントを更に含むことができ、この標識抗ＡＧＥ
抗体は、生体内産生ＡＧＥと反応性であるか、あるいはＡＧＥ変性度を求めよう
としている分析体分子と直接反応性であり、例えば、標識抗低密度リポ蛋白質抗
体が挙げられる。 更に別の実施態様では、生体内かあるいは生体外で、ＡＧＥを循環系から隔離す
るために、患者の血清を抗ＡＧＥ抗体に触れさせることにより、グアニジノ基由
来ＡＧＥの過度の蓄積が特徴である病気又は障害の治療に、本発明の抗体を用い
てもよい。 かくして、本発明の主たる目的は、グアニジノ基を含む構造体から得られる生体
内産生ＡＧＥと反応性であるモノクローナル抗体を提供することである。 本発明の他の目的は、生体内産生グアニジノ基由来ＡＧＥと反応性である抗体の
限定されない源（indefinite source）を提供することであり、この抗体は、こ
の目的のために抗体を特に有用にする特定の免疫結合特性を有している。 本発明の更に他の目的は、本発明の抗体に基づくかあるいは含む、ＡＧＥの異常
濃度を特徴とする状態を治療する治療組成物及び対応する方法提供することであ
る。 本発明のこれら及びその他の目的は、次の図面、発明の詳細な説明及び実施例を
参照することにより、更に良く理解されるであろう。
【０００６】発明の詳細な説明 本発明は、抗体又はその抗原結合性フラグメントに関し、それらは、アルギニン
及び他のグアニジノ基含有分子と３‐デオキシグルコソン（３ＤＧ）との反応に
よって生ずる生体内産生グアニジノ基由来進行グリコシル化最終生成物（ＡＧＥ
）と反応性である。これらの抗体は、グルコースから生成するＡＧＥとも反応す
る。特に、本発明の抗体又はその抗原結合性フラグメントは、１９９８年３月３
１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されており
、ＨＢ‐１２５００の受託番号が与えられているハイブリドーマＦ５２‐４Ｅ１
により産生されたときのモノクローナル抗体４Ｅ１の免疫結合特性を示す。当然
、本発明は、同様にこのハイブリドーマにも及ぶ。かくして、本発明は、本発明
のモノクローナル抗体の無期限に持続する細胞源（indefinitely prolonged cel
l source）、ハイブリドーマを有利に提供する。本発明は、更に、本発明のモノ
クローナル抗体を含む診断測定方法及びキットに関し、それに基づく治療方法に
関するものである。 ここでは種々の用語が用いられており、次の意味を有している。 存在する場合、“免疫結合特性”という用語又は抗原との抗体の他の結合特性は
、その文法上の形の全てにおいて、抗体の特異性、親和性、交差反応性及びその
他の結合特性を意味する。 “グアニジノ”基は、構造Ｈ２ＮＣ（＝ＮＨ）ＮＨ‐を有し、アミノ酸アルギニ
ンの側鎖として、生体内でよく見られ、従って、身体全体にわたって種々の蛋白
質に存在している。他のグアニジノ基含有化合物は、式Ｈ２ＮＣ（＝ＮＨ）ＮＨ
‐Ｒによって表されてもよく、ここで、Ｒは、水素又は低級アルキル基でよい。
Ｒが水素である場合は、化合物はグアニジンであり、メチルである場合は、化合
物はメチルグアニジン等である。メチルグアニジンは、腎機能が低下した個体に
高濃度で存在する循環代謝産物である。本明細書を通して、“グアニジノ基由来
”とは、蛋白質に存在するアルギニル側鎖との反応の他に、メチルアルギニン、
遊離アルギニン及びその誘導体などのグアニジノ基含有化合物との反応から生成
する化合物をも意味する。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、３‐デオキシ
グルコソン（反応性糖、３ＤＧと略称、アマドリ生成物の分解により得られる。 背景 参照）と反応して、進行グリコシル化最終生成物を生成してもよい。 本発明は、３ＤＧ‐ＲＮａｓｅ、３ＤＧ‐リゾチーム、３ＤＧ‐ＢＳＡ及び３Ｄ
Ｇ‐ＫＬＨなどの抗原で免疫することによりモノクローナル抗体４Ｅ１の結合特
性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する方法を有利に提供す
る。モノクローナル抗体４Ｅ１の免疫特性を有する抗体を作るのに、免疫原とし
て、任意のこのような抗原を用いてもよい。このような抗体としては、ポリクロ
ーナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ラ
イブラリーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 本発明の背景の上記記載並びに老化及び糖尿病の合併症の病態生理学における３
‐デオキシグルコソン（３ＤＧ）の重要性から理解されるように、３ＤＧ、特に
アミノ酸アルギニンとのその反応から生成するＡＧＥは、曝露時間及び体内の種
々の感受性器官、組織及び蛋白質塊と接触している血糖の濃度の両方を統合して
いる体内の長期グリコシル化障害の検出及び定量に対する別の有用なアプローチ
を表している。いくつかの他のＡＧＥの有用性及びそれらの検出手段が記載され
ているが、本発明の抗体は、ライフスタイルの変化及びグルコース濃度を低下さ
せ、身体からＡＧＥを除去することに向けられた治療法の有効性を評価する手段
の他に、このような障害の別の尺度、すなわち、非酸化由来ＡＧＥ（上記）から
のものを提供する。
及び他のグアニジノ基含有分子と３‐デオキシグルコソン（３ＤＧ）との反応に
よって生ずる生体内産生グアニジノ基由来進行グリコシル化最終生成物（ＡＧＥ
）と反応性である。これらの抗体は、グルコースから生成するＡＧＥとも反応す
る。特に、本発明の抗体又はその抗原結合性フラグメントは、１９９８年３月３
１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されており
、ＨＢ‐１２５００の受託番号が与えられているハイブリドーマＦ５２‐４Ｅ１
により産生されたときのモノクローナル抗体４Ｅ１の免疫結合特性を示す。当然
、本発明は、同様にこのハイブリドーマにも及ぶ。かくして、本発明は、本発明
のモノクローナル抗体の無期限に持続する細胞源（indefinitely prolonged cel
l source）、ハイブリドーマを有利に提供する。本発明は、更に、本発明のモノ
クローナル抗体を含む診断測定方法及びキットに関し、それに基づく治療方法に
関するものである。 ここでは種々の用語が用いられており、次の意味を有している。 存在する場合、“免疫結合特性”という用語又は抗原との抗体の他の結合特性は
、その文法上の形の全てにおいて、抗体の特異性、親和性、交差反応性及びその
他の結合特性を意味する。 “グアニジノ”基は、構造Ｈ２ＮＣ（＝ＮＨ）ＮＨ‐を有し、アミノ酸アルギニ
ンの側鎖として、生体内でよく見られ、従って、身体全体にわたって種々の蛋白
質に存在している。他のグアニジノ基含有化合物は、式Ｈ２ＮＣ（＝ＮＨ）ＮＨ
‐Ｒによって表されてもよく、ここで、Ｒは、水素又は低級アルキル基でよい。
Ｒが水素である場合は、化合物はグアニジンであり、メチルである場合は、化合
物はメチルグアニジン等である。メチルグアニジンは、腎機能が低下した個体に
高濃度で存在する循環代謝産物である。本明細書を通して、“グアニジノ基由来
”とは、蛋白質に存在するアルギニル側鎖との反応の他に、メチルアルギニン、
遊離アルギニン及びその誘導体などのグアニジノ基含有化合物との反応から生成
する化合物をも意味する。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、３‐デオキシ
グルコソン（反応性糖、３ＤＧと略称、アマドリ生成物の分解により得られる。 背景 参照）と反応して、進行グリコシル化最終生成物を生成してもよい。 本発明は、３ＤＧ‐ＲＮａｓｅ、３ＤＧ‐リゾチーム、３ＤＧ‐ＢＳＡ及び３Ｄ
Ｇ‐ＫＬＨなどの抗原で免疫することによりモノクローナル抗体４Ｅ１の結合特
性を有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製する方法を有利に提供す
る。モノクローナル抗体４Ｅ１の免疫特性を有する抗体を作るのに、免疫原とし
て、任意のこのような抗原を用いてもよい。このような抗体としては、ポリクロ
ーナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ラ
イブラリーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 本発明の背景の上記記載並びに老化及び糖尿病の合併症の病態生理学における３
‐デオキシグルコソン（３ＤＧ）の重要性から理解されるように、３ＤＧ、特に
アミノ酸アルギニンとのその反応から生成するＡＧＥは、曝露時間及び体内の種
々の感受性器官、組織及び蛋白質塊と接触している血糖の濃度の両方を統合して
いる体内の長期グリコシル化障害の検出及び定量に対する別の有用なアプローチ
を表している。いくつかの他のＡＧＥの有用性及びそれらの検出手段が記載され
ているが、本発明の抗体は、ライフスタイルの変化及びグルコース濃度を低下さ
せ、身体からＡＧＥを除去することに向けられた治療法の有効性を評価する手段
の他に、このような障害の別の尺度、すなわち、非酸化由来ＡＧＥ（上記）から
のものを提供する。
【０００７】 本発明のモノクローナル抗体は、グルコースから得られたＡＧＥと反応するとい
う点で、先に述べた抗ＡＧＥ抗体と性質を共有する。しかし、本発明の抗体は、
いくつかの手段により、従来技術のものとは区別されるであろう。まず、この抗
体は、リボース又は他の５炭素糖から得られるＡＧＥを検出せず、ペントシジン
（pentosidine）、カルボキシメチルリジンも検出せず、アミノグアニジン又は
リジンと３ＤＧとの反応生成物又はＬ‐アルギニンとメチルグリオキサールとの
反応生成物も検出しない。第二に、下記実施例１で更に説明されるように、３Ｄ
ＧとＮε‐ベンゾイル‐Ｌ‐アルギニンアミドとの反応に存在する種々の中間体
及び生成物のクロマトグラフ分離で採取された画分にモノクローナル抗体を用い
るＥＬＩＳＡにより、上で引用したようなKonishi等のイミダゾロンＳ１７〔ア
ミノ‐５‐（２，３，４‐トリヒドロキシブチル）‐４‐イミダゾロン〕が、本
発明の抗体が結合したエピトープから明確に区別された。第三に、Bucala等によ
り記載されているＡＬＩ化合物（アルギニル‐リシル‐イミダゾール）は、アル
ギニンとリジンの両方から得られ、従って、４Ｅ１免疫エピトープとは構造的に
異なる。 理論的根拠では、その生成に１つ以上の酸化工程を必要とするカルボキシメチル
リジンなどの他のＡＧＥと対比して、本発明の抗体により検出できるグアニジノ
基由来ＡＧＥは、非酸化経路から生ずる。 本発明の抗体により検出できる体内の免疫エピトープ濃度の時間による変化は、
グアニジノ基由来ＡＧＥの生成速度−その除去又は分解速度を反映する。血中グ
ルコース濃度の上昇、糖尿病の症状、並びにマクロファージ及びその他の細胞タ
イプによるＡＧＥスカベンジャー活性の低下や腎臓病などのＡＧＥ代謝及び排出
に関わる因子などの種々の因子が、それらの濃度を高めるであろう。グアニジノ
基由来ＡＧＥを減少させることになる因子としては、アミノグアニジンなどのそ
れらの生成の阻害剤、及びＡＧＥを化学的に分解して、体内のＡＧＥ量の減少を
促進すると共に、付帯する異常を処理する（addressing the attendant patholo
gy）剤による処理が挙げられる。このように、体液のサンプル又は組織サンプル
のグアニジノ基由来ＡＧＥ濃度を監視することによって、治療状況を監視する他
に、個人の健康の変化に関する診断上有用な情報が得られる。 本発明の抗体は、メチルグアニジンと３ＤＧの反応から生成する付加物も検出す
る。メチルグアニジンは、体内における窒素分解の代謝産物であり、腎臓病患者
において循環濃度が上昇する。この付加物を検出することによって、患者内の３
ＤＧ及び／又はメチルグアニジンの濃度が示され、従って、異常（pathology）
をもたらす毒性ＡＧＥを形成する性向が示される。 本発明によるグアニジノ基由来ＡＧＥ測定用サンプル源は、検出しようとする状
態又は評価しようとする治療に関連する適当な体液又は組織サンプルから選べば
よい。例えば、ＡＧＥは、血漿、血清、尿、赤血球膜、ヘモグロビン及びリポ蛋
白質で測定してもよい。血清、血漿又は尿は、直接測定に用いてもよい。ヘモグ
ロビンは、濃縮赤血球パックの溶解によって全血から単離されてもよい。リポ蛋
白質は、測定前、すなわち、リポ蛋白質を特定の抗体で、例えば、ＬＤＬの場合
は、アポリポ蛋白Ｂに対して、先ず捕捉し、標識された第二の抗体、例えば本発
明の抗体で捕捉して、グアニジノ基由来ＡＧＥを含む補足されたＬＤＬのその画
分を検出することにより、グアニジノ基由来ＡＧＥを検出する前に、単離されて
もよい。当業者に知られている他の検出方法を用いてもよい。 生検材料などの組織サンプルを、グアニジノ基由来ＡＧＥ測定用サンプル源とし
て用いてもよい。例えば、腎生検組織は、蛋白質を可溶化するために、コラゲナ
ーゼ又は他の適当な酵素で消化し、その後で、ＡＧＥ測定を行えばよい。
う点で、先に述べた抗ＡＧＥ抗体と性質を共有する。しかし、本発明の抗体は、
いくつかの手段により、従来技術のものとは区別されるであろう。まず、この抗
体は、リボース又は他の５炭素糖から得られるＡＧＥを検出せず、ペントシジン
（pentosidine）、カルボキシメチルリジンも検出せず、アミノグアニジン又は
リジンと３ＤＧとの反応生成物又はＬ‐アルギニンとメチルグリオキサールとの
反応生成物も検出しない。第二に、下記実施例１で更に説明されるように、３Ｄ
ＧとＮε‐ベンゾイル‐Ｌ‐アルギニンアミドとの反応に存在する種々の中間体
及び生成物のクロマトグラフ分離で採取された画分にモノクローナル抗体を用い
るＥＬＩＳＡにより、上で引用したようなKonishi等のイミダゾロンＳ１７〔ア
ミノ‐５‐（２，３，４‐トリヒドロキシブチル）‐４‐イミダゾロン〕が、本
発明の抗体が結合したエピトープから明確に区別された。第三に、Bucala等によ
り記載されているＡＬＩ化合物（アルギニル‐リシル‐イミダゾール）は、アル
ギニンとリジンの両方から得られ、従って、４Ｅ１免疫エピトープとは構造的に
異なる。 理論的根拠では、その生成に１つ以上の酸化工程を必要とするカルボキシメチル
リジンなどの他のＡＧＥと対比して、本発明の抗体により検出できるグアニジノ
基由来ＡＧＥは、非酸化経路から生ずる。 本発明の抗体により検出できる体内の免疫エピトープ濃度の時間による変化は、
グアニジノ基由来ＡＧＥの生成速度−その除去又は分解速度を反映する。血中グ
ルコース濃度の上昇、糖尿病の症状、並びにマクロファージ及びその他の細胞タ
イプによるＡＧＥスカベンジャー活性の低下や腎臓病などのＡＧＥ代謝及び排出
に関わる因子などの種々の因子が、それらの濃度を高めるであろう。グアニジノ
基由来ＡＧＥを減少させることになる因子としては、アミノグアニジンなどのそ
れらの生成の阻害剤、及びＡＧＥを化学的に分解して、体内のＡＧＥ量の減少を
促進すると共に、付帯する異常を処理する（addressing the attendant patholo
gy）剤による処理が挙げられる。このように、体液のサンプル又は組織サンプル
のグアニジノ基由来ＡＧＥ濃度を監視することによって、治療状況を監視する他
に、個人の健康の変化に関する診断上有用な情報が得られる。 本発明の抗体は、メチルグアニジンと３ＤＧの反応から生成する付加物も検出す
る。メチルグアニジンは、体内における窒素分解の代謝産物であり、腎臓病患者
において循環濃度が上昇する。この付加物を検出することによって、患者内の３
ＤＧ及び／又はメチルグアニジンの濃度が示され、従って、異常（pathology）
をもたらす毒性ＡＧＥを形成する性向が示される。 本発明によるグアニジノ基由来ＡＧＥ測定用サンプル源は、検出しようとする状
態又は評価しようとする治療に関連する適当な体液又は組織サンプルから選べば
よい。例えば、ＡＧＥは、血漿、血清、尿、赤血球膜、ヘモグロビン及びリポ蛋
白質で測定してもよい。血清、血漿又は尿は、直接測定に用いてもよい。ヘモグ
ロビンは、濃縮赤血球パックの溶解によって全血から単離されてもよい。リポ蛋
白質は、測定前、すなわち、リポ蛋白質を特定の抗体で、例えば、ＬＤＬの場合
は、アポリポ蛋白Ｂに対して、先ず捕捉し、標識された第二の抗体、例えば本発
明の抗体で捕捉して、グアニジノ基由来ＡＧＥを含む補足されたＬＤＬのその画
分を検出することにより、グアニジノ基由来ＡＧＥを検出する前に、単離されて
もよい。当業者に知られている他の検出方法を用いてもよい。 生検材料などの組織サンプルを、グアニジノ基由来ＡＧＥ測定用サンプル源とし
て用いてもよい。例えば、腎生検組織は、蛋白質を可溶化するために、コラゲナ
ーゼ又は他の適当な酵素で消化し、その後で、ＡＧＥ測定を行えばよい。
【０００８】 本発明のモノクローナル抗体に対応する単一特異性ポリクローナル抗体の産生に
は、当該技術において知られている種々の方法を用いてもよい。例えば、種々の
宿主動物の免疫化により、抗体の再産生が進行してもよい。この実施態様におい
ては、抗原が、免疫担体、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はキーホール
リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共役してもよく、あるいは、担体が、３‐
デオキシグルコソンと反応してもよい。更に、３‐デオキシグルコソンは、アマ
ドリ生成物の分解により得られ、生成物それ自身は、蛋白質又は他のアミン含有
分子のアミノ基とグルコースとの反応により得られてもよいので、免疫原を産生
するのにグルコースを用いてもよい。免疫応答を高めるために、宿主種に応じて
種々の補助物質を用いてもよい。 本発明のモノクローナル抗体を産生するには、培養において連続細胞株による抗
体分子の産生に用いられる任意の方法を用いればよい。これらの方法としては、
トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor等、Immunology Today, 4,
72 (1983)）及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ‐ハイブリド
ーマ法（Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Ala
n R. Liss, Inc. (1985)）の他に、Kohler及びMilstein（Nature, 256, 495-497
(1975)）によって初めて開発されたハイブリドーマ法が挙げられるが、これら
に限定されるものではない。本発明の別の実施態様においては、ＰＣＴ／ＵＳ９
０／０２５４５に記載された技術を利用して、無菌動物内でモノクローナル抗体
を産生することができる。本発明によれば、ヒト抗体を用いてもよく、ヒトハイ
ブリドーマ（Cote等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 2026-2030 (1983)
）を使用するか、あるいはヒトＢ細胞を生体外にてＥＢＶウイルスで形質転換す
る（Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R.
Liss, Inc. (1985)）ことにより得ることができる。事実、本発明によれば、適
当な生理活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共に、本発明のマウス抗体分子から
の遺伝子をスライスすることによる“キメラ抗体”又は“ヒト化抗体”（Morris
on等、J. Bacteriol., 159-870 (1984)、Neuberger等、Nature, 312, 604-608 (
1984)、Takeda等、Nature, 314, 452-454 (1985)）の産生のために開発された方
法を用いることができる。このような抗体は、本発明の範囲内である。キメラ抗
体は、ヒトＦｃ部分及びマウス（又は他の非ヒト）Ｆｖ部分を含むものであり、
ヒト化抗体は、マウス（又は他の非ヒト）相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体
に組み込まれているものであって、キメラ及びヒト化抗体は、共にモノクローナ
ルである。このようなヒト又はヒト化キメラ抗体は、免疫応答、特にアレルギー
応答を引き起こす異種抗体である可能性がはるかに少ないので、ヒトの病気又は
障害の生体内診断又は治療（後述）に使用するのに好ましい。
は、当該技術において知られている種々の方法を用いてもよい。例えば、種々の
宿主動物の免疫化により、抗体の再産生が進行してもよい。この実施態様におい
ては、抗原が、免疫担体、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又はキーホール
リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共役してもよく、あるいは、担体が、３‐
デオキシグルコソンと反応してもよい。更に、３‐デオキシグルコソンは、アマ
ドリ生成物の分解により得られ、生成物それ自身は、蛋白質又は他のアミン含有
分子のアミノ基とグルコースとの反応により得られてもよいので、免疫原を産生
するのにグルコースを用いてもよい。免疫応答を高めるために、宿主種に応じて
種々の補助物質を用いてもよい。 本発明のモノクローナル抗体を産生するには、培養において連続細胞株による抗
体分子の産生に用いられる任意の方法を用いればよい。これらの方法としては、
トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kozbor等、Immunology Today, 4,
72 (1983)）及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ‐ハイブリド
ーマ法（Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Ala
n R. Liss, Inc. (1985)）の他に、Kohler及びMilstein（Nature, 256, 495-497
(1975)）によって初めて開発されたハイブリドーマ法が挙げられるが、これら
に限定されるものではない。本発明の別の実施態様においては、ＰＣＴ／ＵＳ９
０／０２５４５に記載された技術を利用して、無菌動物内でモノクローナル抗体
を産生することができる。本発明によれば、ヒト抗体を用いてもよく、ヒトハイ
ブリドーマ（Cote等、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 2026-2030 (1983)
）を使用するか、あるいはヒトＢ細胞を生体外にてＥＢＶウイルスで形質転換す
る（Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R.
Liss, Inc. (1985)）ことにより得ることができる。事実、本発明によれば、適
当な生理活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共に、本発明のマウス抗体分子から
の遺伝子をスライスすることによる“キメラ抗体”又は“ヒト化抗体”（Morris
on等、J. Bacteriol., 159-870 (1984)、Neuberger等、Nature, 312, 604-608 (
1984)、Takeda等、Nature, 314, 452-454 (1985)）の産生のために開発された方
法を用いることができる。このような抗体は、本発明の範囲内である。キメラ抗
体は、ヒトＦｃ部分及びマウス（又は他の非ヒト）Ｆｖ部分を含むものであり、
ヒト化抗体は、マウス（又は他の非ヒト）相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体
に組み込まれているものであって、キメラ及びヒト化抗体は、共にモノクローナ
ルである。このようなヒト又はヒト化キメラ抗体は、免疫応答、特にアレルギー
応答を引き起こす異種抗体である可能性がはるかに少ないので、ヒトの病気又は
障害の生体内診断又は治療（後述）に使用するのに好ましい。
【０００９】 本発明によれば、単鎖抗体の産生に関して記載されている方法（米国特許第４，
９４６，７７８号）を、本発明の単鎖抗体を提供するのに適応させることができ
る。本発明の別の実施態様では、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に関して記載さ
れている方法（Huse等、Science, 246, 1275-1281 (1989)）を利用して、本発明
の抗体、その誘導体又は類似体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦ
ａｂフラグメントを、速く、容易に同定することができる。 抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、既知の方法により生成す
ることができる。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシ
ン消化によって産生することができるＦ（ａｂ′）２フラグメント、Ｆ（ａｂ′
）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成することができ
るＦａｂ′フラグメント、及びパパインと還元剤で抗体分子を処理することによ
り生成することができるＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定され
るものではない。このような抗体フラグメントは、本発明のポリクローナル又は
モノクローナル抗体のいずれからも生成することができ、好ましくは、モノクロ
ーナル抗体４Ｅ１を用いて、このような抗体フラグメントを生成する。 抗体の産生に際しては、当該技術において知られている方法、例えば、放射免疫
測定法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、“サンドイッチ”免疫測定法、免
疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、原位置（in situ）免
疫測定法（例えば、コロイド状金、酵素又は放射性同位元素標識を使用）、ウエ
スタンブロット法、沈降反応、凝集測定法（例えば、ゲル凝集測定法、血球凝集
反応測定法）、補体結合測定法、免疫蛍光測定法、プロテインＡ測定法、免疫電
気泳動測定法などによって、所望の抗体を得るためのスクリーニングを行うこと
ができる。一つの実施態様においては、一次抗体の標識を検出することにより、
抗体結合を検出する。他の実施態様においては、一次抗体への二次抗体又はその
他の試薬の結合を検出することにより、一次抗体を検出する。更に他の実施態様
においては、二次抗体が標識される。免疫測定法において結合を検出するには、
多くの手段が当該技術において知られており、それらは本発明の範囲内である。
例えば、本発明により抗体を選択するためには、生体内生成又は生体外生成グア
ニジノ基由来ＡＧＥに結合している生成物についての生成ハイブリドーマを測定
してもよい。あるいは、このようなＡＧＥへのモノクローナル抗体４Ｅ１の結合
に対する競合能に基づいて、このような抗体を選択することができる。 上記抗体は、ＡＧＥ変性蛋白質又は組織の局在化及び活性に関連する、当該技術
において知られている方法、例えば、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ
、原位置（in situ）でのＡＧＥ変性組織の検出、血清及び尿サンプルなどの適
当な生理的サンプル内の、例えば、蛋白質、ペプチド、脂質及び核酸、特にヘモ
グロビン‐ＡＧＥ、イムノグロブリン‐ＡＧＥ及びＬＤＬ‐ＡＧＥをはじめとす
るＡＧＥ変性分子の濃度の測定に用いることができる。 本発明を用いて、グアニジノ基由来進行グリコシル化最終生成物の対応する存在
を測定することにより、哺乳類における刺激性、自発性又は特発性の病的状態の
存在を評価及び／又は検出することができる。より具体的には、例えば、適当に
標識された量のこの抗ＡＧＥ抗体、好ましくはモノクローナル抗体を、ここに述
べたように使用して、ここで論じたもののような測定方法により、ＡＧＥの存在
又は量を直接求めてもよい。 進行グリコシル化に起因する組織及び終末器官の障害は、何ヶ月から何年にもわ
たって蓄積する。糖尿病合併症は、同様の期間にわたって進行するので、このよ
うな病状における異常（pathology）の進行とリンクしているＡＧＥの蓄積を、
より早く検出することが有利である。 特に、本発明の抗体は、ヘモグロビン‐ＡＧＥ、アルブミン‐ＡＧＥ、脂質‐Ａ
ＧＥ及びＡＧＥ変性ペプチドなどのＡＧＥの存在を検出するのに用いることがで
きるが、ＡＧＥはこれらに限定されるものではない。一般に、ＡＧＥと関連する
病気又は障害の存在は、正常な個体に比較して、このような病気又は障害に罹っ
ている被検体からの生体サンプルでは、より高濃度のＡＧＥが検出されることに
よって、評価することができる。剤、例えばアミノグアニジンの、ＡＧＥ生成防
止又は阻害効果は、時間間隔をおいて被検体から得られた生体サンプルのＡＧＥ
濃度の減少を観察することによって評価することができる。 例えば、ヘモグロビン‐ＡＧＥ（Ｈｂ‐ＡＧＥ）は、血流中ヒトヘモグロビンの
約０．４２％になるものと測定されている。この割合は、糖尿病による高血糖症
の患者では、約０．７５％に上昇する。重要なのは、生体内でのＡＧＥ生成の阻
害剤であるアミノグアニジンで、糖尿病患者を２８日間治療すると、治療期間の
終わりには、Ｈｂ‐ＡＧＥの濃度が著しく低下するということである（国際公開
番号ＷＯ９３／１３４２１）。
９４６，７７８号）を、本発明の単鎖抗体を提供するのに適応させることができ
る。本発明の別の実施態様では、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に関して記載さ
れている方法（Huse等、Science, 246, 1275-1281 (1989)）を利用して、本発明
の抗体、その誘導体又は類似体に対する所望の特異性を有するモノクローナルＦ
ａｂフラグメントを、速く、容易に同定することができる。 抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、既知の方法により生成す
ることができる。例えば、このようなフラグメントとしては、抗体分子のペプシ
ン消化によって産生することができるＦ（ａｂ′）２フラグメント、Ｆ（ａｂ′
）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成することができ
るＦａｂ′フラグメント、及びパパインと還元剤で抗体分子を処理することによ
り生成することができるＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定され
るものではない。このような抗体フラグメントは、本発明のポリクローナル又は
モノクローナル抗体のいずれからも生成することができ、好ましくは、モノクロ
ーナル抗体４Ｅ１を用いて、このような抗体フラグメントを生成する。 抗体の産生に際しては、当該技術において知られている方法、例えば、放射免疫
測定法、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、“サンドイッチ”免疫測定法、免
疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散測定法、原位置（in situ）免
疫測定法（例えば、コロイド状金、酵素又は放射性同位元素標識を使用）、ウエ
スタンブロット法、沈降反応、凝集測定法（例えば、ゲル凝集測定法、血球凝集
反応測定法）、補体結合測定法、免疫蛍光測定法、プロテインＡ測定法、免疫電
気泳動測定法などによって、所望の抗体を得るためのスクリーニングを行うこと
ができる。一つの実施態様においては、一次抗体の標識を検出することにより、
抗体結合を検出する。他の実施態様においては、一次抗体への二次抗体又はその
他の試薬の結合を検出することにより、一次抗体を検出する。更に他の実施態様
においては、二次抗体が標識される。免疫測定法において結合を検出するには、
多くの手段が当該技術において知られており、それらは本発明の範囲内である。
例えば、本発明により抗体を選択するためには、生体内生成又は生体外生成グア
ニジノ基由来ＡＧＥに結合している生成物についての生成ハイブリドーマを測定
してもよい。あるいは、このようなＡＧＥへのモノクローナル抗体４Ｅ１の結合
に対する競合能に基づいて、このような抗体を選択することができる。 上記抗体は、ＡＧＥ変性蛋白質又は組織の局在化及び活性に関連する、当該技術
において知られている方法、例えば、ウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ
、原位置（in situ）でのＡＧＥ変性組織の検出、血清及び尿サンプルなどの適
当な生理的サンプル内の、例えば、蛋白質、ペプチド、脂質及び核酸、特にヘモ
グロビン‐ＡＧＥ、イムノグロブリン‐ＡＧＥ及びＬＤＬ‐ＡＧＥをはじめとす
るＡＧＥ変性分子の濃度の測定に用いることができる。 本発明を用いて、グアニジノ基由来進行グリコシル化最終生成物の対応する存在
を測定することにより、哺乳類における刺激性、自発性又は特発性の病的状態の
存在を評価及び／又は検出することができる。より具体的には、例えば、適当に
標識された量のこの抗ＡＧＥ抗体、好ましくはモノクローナル抗体を、ここに述
べたように使用して、ここで論じたもののような測定方法により、ＡＧＥの存在
又は量を直接求めてもよい。 進行グリコシル化に起因する組織及び終末器官の障害は、何ヶ月から何年にもわ
たって蓄積する。糖尿病合併症は、同様の期間にわたって進行するので、このよ
うな病状における異常（pathology）の進行とリンクしているＡＧＥの蓄積を、
より早く検出することが有利である。 特に、本発明の抗体は、ヘモグロビン‐ＡＧＥ、アルブミン‐ＡＧＥ、脂質‐Ａ
ＧＥ及びＡＧＥ変性ペプチドなどのＡＧＥの存在を検出するのに用いることがで
きるが、ＡＧＥはこれらに限定されるものではない。一般に、ＡＧＥと関連する
病気又は障害の存在は、正常な個体に比較して、このような病気又は障害に罹っ
ている被検体からの生体サンプルでは、より高濃度のＡＧＥが検出されることに
よって、評価することができる。剤、例えばアミノグアニジンの、ＡＧＥ生成防
止又は阻害効果は、時間間隔をおいて被検体から得られた生体サンプルのＡＧＥ
濃度の減少を観察することによって評価することができる。 例えば、ヘモグロビン‐ＡＧＥ（Ｈｂ‐ＡＧＥ）は、血流中ヒトヘモグロビンの
約０．４２％になるものと測定されている。この割合は、糖尿病による高血糖症
の患者では、約０．７５％に上昇する。重要なのは、生体内でのＡＧＥ生成の阻
害剤であるアミノグアニジンで、糖尿病患者を２８日間治療すると、治療期間の
終わりには、Ｈｂ‐ＡＧＥの濃度が著しく低下するということである（国際公開
番号ＷＯ９３／１３４２１）。
【００１０】 本発明は、他のＡＧＥ、特に血清及び尿ＡＧＥ変性蛋白質並びにＡＧＥ変性ペプ
チドの測定にも及ぶ。脂質‐ＡＧＥ及びＨｂ‐ＡＧＥなどの血清及び尿ＡＧＥ変
性ペプチドは、ＡＧＥ蓄積が特徴である異常及びその他の機能障害の発現並びに
程度を反映するＡＧＥ蓄積の循環マーカーに相当する。このように、例えば、ア
テローム性硬化症、白内障及び糖尿病性神経障害などの、ＡＧＥ濃度の上昇が観
察されているＡＧＥ関連糖尿病容態を、これらのＡＧＥの測定、特にここに述べ
る診断方法によって、長期間にわたり監視、評価してもよい。 同様に、血清ペプチド‐ＡＧＥは、糸球体濾過率（ＧＦＲ）及び腎臓障害を反映
するインジケータとして用いることができる。尿ペプチド‐ＡＧＥは、組織蛋白
質、より詳しくは、ＡＧＥ変性を有する組織蛋白質におけるターンオーバー（tu
rnover）を測定するインジケータとして用いてもよい。 ＬＤＬ‐ＡＧＥ、Ｈｂ‐ＡＧＥ及び血清ペプチド‐ＡＧＥ測定において、血液サ
ンプルを抜き、分離操作を用いることができる。ＬＤＬ‐又は脂質‐ＡＧＥの濃
度を測定するには、Bucala等による国際公開番号ＷＯ９３／１３４２１に記載さ
れているもののような操作を用いることができる。ヘモグロビン‐ＡＧＥを検出
するには、細胞血液成分を血清から分離し、ヘモグロビンを赤血球から抽出する
ことができる。次いで、ＬＤＬ‐ＡＧＥの濃度、ペプチド‐ＡＧＥ、Ｈｂ‐ＡＧ
Ｅの存在と程度を評価することができる。 単一の血液サンプルを用いてこれらのテストを行うことにより、血中グルコース
濃度がコントロールされなくなるより広い時間枠を見積もることができる。例え
ば、Ｈｂ‐ＡＧＥにより予測できる６０日の範囲は、糖血症管理のために評価さ
れるべき期間を、Ｈｂ‐Ａ１ｃ定量により測定される３〜４週間の時間枠前まで
延長する。所望であれば、Ｈｂ‐ＡＧＥ及び血清ペプチド‐ＡＧＥの分析を、血
液及び尿中のグルコース濃度定量、グルコース負荷試験及び尿ペプチド‐ＡＧＥ
の測定をはじめとする糖尿病管理を評価するのに有用なその他のテストと共に行
い、完全な患者プロフィールを得ることができる。本発明の好ましい態様におい
ては、グアニジノ基由来ＡＧＥに対して、抗ＬＤＬ抗体（抗ＡｐｏＢなど、これ
に限定されない）と組み合わせて、ポリクローナル又は本発明の好ましいモノク
ローナル抗体を用い、ＬＤＬ‐ＡＧＥを測定する。 本発明の他の態様は、尿中で検出されることのできる進行グリコシル化最終生成
物に関する。ペプチドを含めて、蛋白質は、正常な個体では、非常に少量尿中に
排泄され、腎機能が低下するにつれて、腎不全で濃度が低下するまで、濃度が上
昇しつづける。組織ＡＧＥのターンオーバーを反映する尿ペプチド‐ＡＧＥの存
在及び／又は濃度は、測定され、特定の病気又は容態と関連付けされ、それらを
予測することができる。 尿中にグアニジノ基由来ＡＧＥ‐ペプチドが存在することは、宿主又は患者が感
染によるような侵入を受けている場合に存在する最終的異化状態（net cataboli
c state）を反映する極めて多数の病気や容態の症状である可能性がある。その
ような状況下では、宿主は、蛋白同化エネルギー貯蔵活性及び細胞修復活性を停
止し、代わりに、エネルギー貯蔵の分解消耗及び白血球の増強を促進するサイト
カインや、刺激と戦ってこれを無効にする因子などの多数の因子を分泌すること
によって、侵入刺激に対して動員される。尿ペプチド‐ＡＧＥの測定は、悪液質
及びショックなどの、宿主において可能性のある侵入活性の更なる別の指標を提
供する。 このように、尿中のペプチド‐ＡＧＥの存在又は濃度を測定することができ、こ
の濃度を標準に関係づけることができる。正常な個体においては、正常濃度はお
そらく低いであろう。糖尿病患者では、ペプチド‐ＡＧＥの濃度はおそらくより
高くなるであろう。あるいは、ＡＧＥ関連進行性腎臓病に罹っている被検体では
、腎不全の発症のために、尿ペプチドの濃度は著しく低下するであろう。感染症
に罹っているか、他の外傷がある患者では、ペプチド‐ＡＧＥの濃度が、正常な
個体よりも著しく高くなるであろう。このように、ペプチド‐ＡＧＥの尿中濃度
を検出することにより、腎臓合併症の発症前における糖尿病の進行及び悪化、糖
尿病若しくはその他のＡＧＥ関連病に関連する腎臓合併症の発症、又は感染の存
在を検出することができた。
チドの測定にも及ぶ。脂質‐ＡＧＥ及びＨｂ‐ＡＧＥなどの血清及び尿ＡＧＥ変
性ペプチドは、ＡＧＥ蓄積が特徴である異常及びその他の機能障害の発現並びに
程度を反映するＡＧＥ蓄積の循環マーカーに相当する。このように、例えば、ア
テローム性硬化症、白内障及び糖尿病性神経障害などの、ＡＧＥ濃度の上昇が観
察されているＡＧＥ関連糖尿病容態を、これらのＡＧＥの測定、特にここに述べ
る診断方法によって、長期間にわたり監視、評価してもよい。 同様に、血清ペプチド‐ＡＧＥは、糸球体濾過率（ＧＦＲ）及び腎臓障害を反映
するインジケータとして用いることができる。尿ペプチド‐ＡＧＥは、組織蛋白
質、より詳しくは、ＡＧＥ変性を有する組織蛋白質におけるターンオーバー（tu
rnover）を測定するインジケータとして用いてもよい。 ＬＤＬ‐ＡＧＥ、Ｈｂ‐ＡＧＥ及び血清ペプチド‐ＡＧＥ測定において、血液サ
ンプルを抜き、分離操作を用いることができる。ＬＤＬ‐又は脂質‐ＡＧＥの濃
度を測定するには、Bucala等による国際公開番号ＷＯ９３／１３４２１に記載さ
れているもののような操作を用いることができる。ヘモグロビン‐ＡＧＥを検出
するには、細胞血液成分を血清から分離し、ヘモグロビンを赤血球から抽出する
ことができる。次いで、ＬＤＬ‐ＡＧＥの濃度、ペプチド‐ＡＧＥ、Ｈｂ‐ＡＧ
Ｅの存在と程度を評価することができる。 単一の血液サンプルを用いてこれらのテストを行うことにより、血中グルコース
濃度がコントロールされなくなるより広い時間枠を見積もることができる。例え
ば、Ｈｂ‐ＡＧＥにより予測できる６０日の範囲は、糖血症管理のために評価さ
れるべき期間を、Ｈｂ‐Ａ１ｃ定量により測定される３〜４週間の時間枠前まで
延長する。所望であれば、Ｈｂ‐ＡＧＥ及び血清ペプチド‐ＡＧＥの分析を、血
液及び尿中のグルコース濃度定量、グルコース負荷試験及び尿ペプチド‐ＡＧＥ
の測定をはじめとする糖尿病管理を評価するのに有用なその他のテストと共に行
い、完全な患者プロフィールを得ることができる。本発明の好ましい態様におい
ては、グアニジノ基由来ＡＧＥに対して、抗ＬＤＬ抗体（抗ＡｐｏＢなど、これ
に限定されない）と組み合わせて、ポリクローナル又は本発明の好ましいモノク
ローナル抗体を用い、ＬＤＬ‐ＡＧＥを測定する。 本発明の他の態様は、尿中で検出されることのできる進行グリコシル化最終生成
物に関する。ペプチドを含めて、蛋白質は、正常な個体では、非常に少量尿中に
排泄され、腎機能が低下するにつれて、腎不全で濃度が低下するまで、濃度が上
昇しつづける。組織ＡＧＥのターンオーバーを反映する尿ペプチド‐ＡＧＥの存
在及び／又は濃度は、測定され、特定の病気又は容態と関連付けされ、それらを
予測することができる。 尿中にグアニジノ基由来ＡＧＥ‐ペプチドが存在することは、宿主又は患者が感
染によるような侵入を受けている場合に存在する最終的異化状態（net cataboli
c state）を反映する極めて多数の病気や容態の症状である可能性がある。その
ような状況下では、宿主は、蛋白同化エネルギー貯蔵活性及び細胞修復活性を停
止し、代わりに、エネルギー貯蔵の分解消耗及び白血球の増強を促進するサイト
カインや、刺激と戦ってこれを無効にする因子などの多数の因子を分泌すること
によって、侵入刺激に対して動員される。尿ペプチド‐ＡＧＥの測定は、悪液質
及びショックなどの、宿主において可能性のある侵入活性の更なる別の指標を提
供する。 このように、尿中のペプチド‐ＡＧＥの存在又は濃度を測定することができ、こ
の濃度を標準に関係づけることができる。正常な個体においては、正常濃度はお
そらく低いであろう。糖尿病患者では、ペプチド‐ＡＧＥの濃度はおそらくより
高くなるであろう。あるいは、ＡＧＥ関連進行性腎臓病に罹っている被検体では
、腎不全の発症のために、尿ペプチドの濃度は著しく低下するであろう。感染症
に罹っているか、他の外傷がある患者では、ペプチド‐ＡＧＥの濃度が、正常な
個体よりも著しく高くなるであろう。このように、ペプチド‐ＡＧＥの尿中濃度
を検出することにより、腎臓合併症の発症前における糖尿病の進行及び悪化、糖
尿病若しくはその他のＡＧＥ関連病に関連する腎臓合併症の発症、又は感染の存
在を検出することができた。
【００１１】 本発明の抗ＡＧＥ抗体は、患者の治療に使用して、濃度を下げるか、あるいは循
環ＡＧＥ若しくはＡＧＥ変性分子、又は同様のこのようなＡＧＥ若しくはＡＧＥ
変性分子の除去を促進することもできる。これらは、ある種の組織、例えば脾臓
、肝臓、腎臓又は脳に異常に高い濃度で存在しており、これらのＡＧＥは好まし
くないであろう。治療は、個体に対する投与によって行えばよく、ここではヒト
化モノクローナル抗体が好ましい。高濃度の循環グアニジノ基由来ＡＧＥは、体
外処理によって除去されてもよく、それによって、本発明の固定化抗体が結合し
、グアニジノ基由来ＡＧＥを有する分子を血液から隔離する装置に、個体の血液
を生体外で循環させる。 更に、高濃度のＡＧＥを生体内で処理するのに有用な薬剤又は化合物の設計、ス
クリーニング及び／又は強化のために抗ＡＧＥモノクローナル抗体を利用するこ
とは、ここに述べた本発明の範囲内である。この関連で、抗ＡＧＥモノクローナ
ル抗体は、治療剤として使用するのに特別に培養又は産生された蛋白質を精製す
るために使用されてもよい。このような蛋白質の治療使用は、重要性が高くなり
つつあり、このような外因性蛋白質（宿主自身の組織及び循環蛋白質のような）
は、グリケイション（glycation）及びＡＧＥ生成の影響を受けやすい。このよ
うなＡＧＥは、化学的に反応性で、生物学的に活性であるので、治療中に、宿主
内へのそれらの導入を制限することは望ましい。その結果、本発明は、例えば、
適当な基体に固定化された多量の本発明の抗ＡＧＥモノクローナル抗体又はその
抗原結合性フラグメントにこのような蛋白質を接触させることにより、このよう
な蛋白質のバッチを精製する方法を含むものである。この方法では、グリコシル
化された蛋白質を、通常の方法でバッチの残余から分離することができた。工業
的方法の例においては、基体を周期的に更新又は置換することができたので、基
体を通過する蛋白質材料の連続循環及びそれに続く蛋白質‐ＡＧＥ成分の分離を
行うことができた。当然のことながら、上記概要は、説明の目的のためのみに示
されたものであり、技術の熟練及び本発明の範囲内で、設計及び実施における種
々の改変が可能である。 ここに記載されているプロトコルの全ては、進行グリコシル化最終生成物の定性
法及び定量法並びに進行グリコシル化最終生成物の増加が関係している異常の付
随診断及び監視に適用されてもよい。アテローム性硬化症や皮膚のしわなどの、
糖尿病のような容態及び老化に関連する容態は、制限されることのない例を示す
ものであり、従って、これらの容態を診断及び監視する方法は、本発明の範囲内
である。
環ＡＧＥ若しくはＡＧＥ変性分子、又は同様のこのようなＡＧＥ若しくはＡＧＥ
変性分子の除去を促進することもできる。これらは、ある種の組織、例えば脾臓
、肝臓、腎臓又は脳に異常に高い濃度で存在しており、これらのＡＧＥは好まし
くないであろう。治療は、個体に対する投与によって行えばよく、ここではヒト
化モノクローナル抗体が好ましい。高濃度の循環グアニジノ基由来ＡＧＥは、体
外処理によって除去されてもよく、それによって、本発明の固定化抗体が結合し
、グアニジノ基由来ＡＧＥを有する分子を血液から隔離する装置に、個体の血液
を生体外で循環させる。 更に、高濃度のＡＧＥを生体内で処理するのに有用な薬剤又は化合物の設計、ス
クリーニング及び／又は強化のために抗ＡＧＥモノクローナル抗体を利用するこ
とは、ここに述べた本発明の範囲内である。この関連で、抗ＡＧＥモノクローナ
ル抗体は、治療剤として使用するのに特別に培養又は産生された蛋白質を精製す
るために使用されてもよい。このような蛋白質の治療使用は、重要性が高くなり
つつあり、このような外因性蛋白質（宿主自身の組織及び循環蛋白質のような）
は、グリケイション（glycation）及びＡＧＥ生成の影響を受けやすい。このよ
うなＡＧＥは、化学的に反応性で、生物学的に活性であるので、治療中に、宿主
内へのそれらの導入を制限することは望ましい。その結果、本発明は、例えば、
適当な基体に固定化された多量の本発明の抗ＡＧＥモノクローナル抗体又はその
抗原結合性フラグメントにこのような蛋白質を接触させることにより、このよう
な蛋白質のバッチを精製する方法を含むものである。この方法では、グリコシル
化された蛋白質を、通常の方法でバッチの残余から分離することができた。工業
的方法の例においては、基体を周期的に更新又は置換することができたので、基
体を通過する蛋白質材料の連続循環及びそれに続く蛋白質‐ＡＧＥ成分の分離を
行うことができた。当然のことながら、上記概要は、説明の目的のためのみに示
されたものであり、技術の熟練及び本発明の範囲内で、設計及び実施における種
々の改変が可能である。 ここに記載されているプロトコルの全ては、進行グリコシル化最終生成物の定性
法及び定量法並びに進行グリコシル化最終生成物の増加が関係している異常の付
随診断及び監視に適用されてもよい。アテローム性硬化症や皮膚のしわなどの、
糖尿病のような容態及び老化に関連する容態は、制限されることのない例を示す
ものであり、従って、これらの容態を診断及び監視する方法は、本発明の範囲内
である。
【００１２】 本発明は、進行グリコシル化最終生成物の存在の程度の定性及び／又は定量分析
用測定法並びにテストキットをも含む。このような測定システム及びテストキッ
トは、例えば、本発明の抗ＡＧＥモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグ
メント又はその結合パートナーに標識を結合させる、ここで論じた放射及び／又
は酵素技術の一つによって調製される標識成分を含んでもよい。ここに述べたキ
ットの成分の一つは、標識されるかあるいは標識されない形での、本発明の抗Ａ
ＧＥモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントである。 先に述べたように、キットは、組換え体又はその他の精製蛋白質、特に治療用途
にあてるものにおける進行グリコシル化最終生成物の存在を測定するのに使用し
てもよく、第一の例では、ＡＧＥの存在についてそれらを測定し、第二の例では
、好ましくないＡＧＥ変性を有する物質を含まないように、それらを更に精製す
るのを助ける。 上で論じたテスト方法によれば、このようなキットの一種は、少なくとも本発明
のモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント、生体サンプル内のＡＧ
Ｅ成分に対する該抗体又はそのフラグメントの免疫特異性結合を検出する手段、
及び、勿論、選択される方法、例えば“競合”、“サンドイッチ”、“ＤＡＳＰ
”などに応じた使用説明書を含んでいるであろう。 より具体的には、好ましい診断テストキットは、一般には固相に結合して免疫吸
着剤を形成するか、そうでなければ、適当な標識に結合した、上記のような抗Ａ
ＧＥ抗体に対する既知量の結合パートナーを更に含んでいてもよい。 本発明のテストキットは、更に、第二の抗体を含んでいてもよく、それは標識さ
れていてもよく、あるいは固体支持体の付属品（又は固体支持体に結合して）で
提供されてもよい。このような抗体は、例えば、抗ＡＧＥ抗体、又はＡＧＥ変性
について監視されようとする分析体の非ＡＧＥ部分若しくはＡＧＥ成分に特異的
な抗体であってもよい。後者の例としては、抗ヘモグロビン、抗アルブミン及び
ここに示したような抗ＡｐｏＢが挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。ＡＧＥ成分の“担体”部分に対するこのような抗体は、ポリクローナル又は
モノクローナル抗体であることができる。 本発明は、次の実施例を参照することにより、更によく理解されるであろう。こ
れらの実施例は、本発明の具体例を示すものであって、本発明を限定しようとす
るものではない。ここで、“ＰＢＳ”という表示は、リン酸緩衝食塩水を示す。
ＰＢＳは、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ ４ 及び０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４を、８００ｍｌの蒸留水に溶解し、ｐＨを７．
４、容積を１リットルに調整して作製すればよい。得られた溶液は、都合のよい
容量に分けて、高圧蒸気滅菌法により滅菌してもよく、室温で保存してもよい。
同様に、“洗浄液”及び“ＴＢＳ‐Ｔ洗浄液”という用語は、次のものを意味す
る：トリス緩衝食塩水‐Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ‐Ｔ）（０．１Ｍトリズマ（Trizma
）、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ‐２０、０．０２％アジ化ナト
リウム、ＨＣｌでｐＨ７．４に調整）。“測定緩衝液”という用語は、２％ＢＳ
Ａ、０．２％Ｔｗｅｅｎ‐２０及び０．２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳの溶
液を意味する。以下に挙げる実施例に見られるような測定緩衝液を含む成分の濃
度は、本発明の範囲内で変更してもよい。勿論、上記フォーミュレーションは、
具体例を示すものであって、技術の熟練内で変更してもよく、発明の実施の最良
の態様を示す義務を果たすためにここに示されるものである。
用測定法並びにテストキットをも含む。このような測定システム及びテストキッ
トは、例えば、本発明の抗ＡＧＥモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグ
メント又はその結合パートナーに標識を結合させる、ここで論じた放射及び／又
は酵素技術の一つによって調製される標識成分を含んでもよい。ここに述べたキ
ットの成分の一つは、標識されるかあるいは標識されない形での、本発明の抗Ａ
ＧＥモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントである。 先に述べたように、キットは、組換え体又はその他の精製蛋白質、特に治療用途
にあてるものにおける進行グリコシル化最終生成物の存在を測定するのに使用し
てもよく、第一の例では、ＡＧＥの存在についてそれらを測定し、第二の例では
、好ましくないＡＧＥ変性を有する物質を含まないように、それらを更に精製す
るのを助ける。 上で論じたテスト方法によれば、このようなキットの一種は、少なくとも本発明
のモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント、生体サンプル内のＡＧ
Ｅ成分に対する該抗体又はそのフラグメントの免疫特異性結合を検出する手段、
及び、勿論、選択される方法、例えば“競合”、“サンドイッチ”、“ＤＡＳＰ
”などに応じた使用説明書を含んでいるであろう。 より具体的には、好ましい診断テストキットは、一般には固相に結合して免疫吸
着剤を形成するか、そうでなければ、適当な標識に結合した、上記のような抗Ａ
ＧＥ抗体に対する既知量の結合パートナーを更に含んでいてもよい。 本発明のテストキットは、更に、第二の抗体を含んでいてもよく、それは標識さ
れていてもよく、あるいは固体支持体の付属品（又は固体支持体に結合して）で
提供されてもよい。このような抗体は、例えば、抗ＡＧＥ抗体、又はＡＧＥ変性
について監視されようとする分析体の非ＡＧＥ部分若しくはＡＧＥ成分に特異的
な抗体であってもよい。後者の例としては、抗ヘモグロビン、抗アルブミン及び
ここに示したような抗ＡｐｏＢが挙げられるが、これらに限定されるものではな
い。ＡＧＥ成分の“担体”部分に対するこのような抗体は、ポリクローナル又は
モノクローナル抗体であることができる。 本発明は、次の実施例を参照することにより、更によく理解されるであろう。こ
れらの実施例は、本発明の具体例を示すものであって、本発明を限定しようとす
るものではない。ここで、“ＰＢＳ”という表示は、リン酸緩衝食塩水を示す。
ＰＢＳは、８．０ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ ４ 及び０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４を、８００ｍｌの蒸留水に溶解し、ｐＨを７．
４、容積を１リットルに調整して作製すればよい。得られた溶液は、都合のよい
容量に分けて、高圧蒸気滅菌法により滅菌してもよく、室温で保存してもよい。
同様に、“洗浄液”及び“ＴＢＳ‐Ｔ洗浄液”という用語は、次のものを意味す
る：トリス緩衝食塩水‐Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳ‐Ｔ）（０．１Ｍトリズマ（Trizma
）、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ‐２０、０．０２％アジ化ナト
リウム、ＨＣｌでｐＨ７．４に調整）。“測定緩衝液”という用語は、２％ＢＳ
Ａ、０．２％Ｔｗｅｅｎ‐２０及び０．２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳの溶
液を意味する。以下に挙げる実施例に見られるような測定緩衝液を含む成分の濃
度は、本発明の範囲内で変更してもよい。勿論、上記フォーミュレーションは、
具体例を示すものであって、技術の熟練内で変更してもよく、発明の実施の最良
の態様を示す義務を果たすためにここに示されるものである。
【００１３】
【実施例】実施例１ ： グアニジノ基由来の、加齢特異性モノクローナル抗体を分泌するハ
イブリドーマ免疫原の調製 キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）またはＢＳＡ（ウシ血清アル
ブミン）を、濃度１０ｍｇ／ｍｌで、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）中の３−デオキシングルコソーン溶液（３ＤＧ、０．１Ｍ）に加え、５
０℃で９６時間インキュベートした。インキュベーションのあと、ＫＬＨ溶液を
０．１ｍＮａＢＨ４を含むＰＢＳに対して１時間にわたって透析し、次にＰＢＳ
を２回交換し、それぞれ４時間にわたって透析した。３ＤＧ修飾したＫＬＨのタ
ンパク質濃度をＬｏｗｒｙアッセイを用いて測定し、サンプルを−２０℃で貯蔵
した。免疫化スケジュール 用いたマウスは、約８週齢のメスＢＡＬＢ／Ｃであった。各マウスをＲｉｂｉア
ジュバント中に１００μｇのＫＬＨ−３ＤＧを含む調整液１００μｌで、皮下お
よび腹腔内注射により免疫化した。マウスを同じ調製液で第１４日に皮下および
腹腔内注射によりブースト（促進投与）した。第２１日に、尾部静脈から試験用
血液を採取し、血清を調製した。下記の抗血清試験血液力価決定法により最高の
力価を示すマウスを選び、ＰＢＳ中に１００μｇのＫＬＨ−３ＤＧを含む溶液で
腹腔内注射により増強(boost)し、その後、第１日および第２日に、ＰＢＳ中に
５０μｇのＫＬＨ−３ＤＧを含む溶液で再びブーストした。第３日に、脾臓を取
り出した。抗血清試験血液力価決定 力価決定のため、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で、力価を決定すべき各血清サ
ンプルの１／１００希釈液を調製した。上記の免疫前血清を、免疫血清と同じよ
うに希釈し、対照として用いた。マイクロタイターウェルに、ＢＳＡ−３ＤＧ抗
原１．０μｇを塗布した。抗原を塗布したウェルをＭｙｌａｒ密封テープ（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ社）で密封し、４℃で一晩インキュベートした。次に、マイクロタイ
タープレートをＴＢＳ−Ｔ洗浄液で洗浄し、０．２％ＢＳＡと０．２％アジ化ナ
トリウムを含むＰＢＳ溶液を加えることによって３７℃で１時間ブロック（遮断
）した。マイクロタイタープレートを前と同じように洗浄し、免疫前血清および
免疫血清の希釈液１００μｌを加えた。室温で２時間インキュベートしたあと、
マイクロタイタープレートを上記と同じように洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ガ
ンマ鎖特異性）アルカリ性ホスファターゼ複合抗体（ＩＣＮ）をすべてのウェル
に加え、室温で１時間インキュベートした。マイクロタイタープレートを前と同
じように洗浄し、リン酸ｐ−ニトロフェノール基質（Ｓｉｇｍａ社）をすべての
ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーションのあと
、マイクロタイタープレートリーダー上で、各プレートについて４１０ｎｍで読
み取りを行った。 別に報告されているように（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ、「抗原：
実験室マニュアル」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、１９８８）、マウス脾臓細胞を、骨髄腫Ｘ６３ＡＧ８．６５３細胞系と融
合することによって、ハイブリドーマ産生を行った。ハイブリドーマ・スクリーニング手順 脾臓細胞を骨髄腫細胞系と融合させたあと、５０ｍｌ融合混合物１００μｌを、
５個のマイクロウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の９６個のウェル
にそれぞれ加えた。プレートに１から５までの番号をつけ、各プレートの行を文
字により、また列を番号により表して融合混合物の各１滴から生じる親細胞培養
物を識別するコーディング方式を用いた。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（上記）
に述べられたように選択培地で培養したあと、ハイブリドーマ培養物を、ＡＧＥ
抗原に対する抗体産生について、次のようにスクリーニングした。 上記の「抗血清試験血液力価決定」の項で述べたように、ＢＳＡ−３ＤＧを塗布
したウェルを調製した。抗原塗布プレートを用いて、各親培養物からの細胞培養
物の上澄液をスクリーニングした。細胞培養物の上澄液を、０．２％ＢＳＡを含
むＰＢＳ中で、１：２に希釈し、各１００μｌを、ＢＳＡ−ＡＧＥを塗布したマ
イクロタイタープレートの各ウェルに加えた。各プレートを２時間にわたって室
温でインキュベートし、その後、ＴＢＳ−Ｔ洗浄液で６回洗浄した。１％ＢＳＡ
を含むＰＢＳ中で１：２０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（ガンマ鎖特異性
）アルカリ性ホスファターゼ複合抗体１００μｌを各ウェルに加え、上記の「抗
血清試験血液力価決定」の項に述べた手順を行った。 １１μＭカルボキシメチルリジンまたは１００μＭベンジルアルギニン−３ＤＧ
を含むウェルで、２回の追加スクリーニングを行った。ＢＳＡ−３ＤＧと強く結
合し、カルボキシメチルリジンによって阻害されず、ベンジルアルギニン−３Ｄ
Ｇにより阻害される２４個の親細胞培養物を選んだ。これら２４個の培養物から
、成長率、抗体力価、特異性の最良の組合せを示すクローン指定４Ｅ１を選んだ
。この細胞系を、希釈を限定することによりクローンして、１０％ジメチルスル
ホキシドを含む仔ウシ血清１ｍｌあたり、細胞約１００万個の率で冷凍し、液体
窒素の気相で貯蔵した。 モノクローナル抗体４Ｅ１を産生するハイブリドーマＦ５２−４Ｅ１を、１９９
８年３月３１日に、アメリカ培養コレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１ Ｐａ
ｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ ２０８５２）に寄託し
、受付番号ＨＢ−１２５００を受けた。
イブリドーマ免疫原の調製 キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）またはＢＳＡ（ウシ血清アル
ブミン）を、濃度１０ｍｇ／ｍｌで、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７．４）中の３−デオキシングルコソーン溶液（３ＤＧ、０．１Ｍ）に加え、５
０℃で９６時間インキュベートした。インキュベーションのあと、ＫＬＨ溶液を
０．１ｍＮａＢＨ４を含むＰＢＳに対して１時間にわたって透析し、次にＰＢＳ
を２回交換し、それぞれ４時間にわたって透析した。３ＤＧ修飾したＫＬＨのタ
ンパク質濃度をＬｏｗｒｙアッセイを用いて測定し、サンプルを−２０℃で貯蔵
した。免疫化スケジュール 用いたマウスは、約８週齢のメスＢＡＬＢ／Ｃであった。各マウスをＲｉｂｉア
ジュバント中に１００μｇのＫＬＨ−３ＤＧを含む調整液１００μｌで、皮下お
よび腹腔内注射により免疫化した。マウスを同じ調製液で第１４日に皮下および
腹腔内注射によりブースト（促進投与）した。第２１日に、尾部静脈から試験用
血液を採取し、血清を調製した。下記の抗血清試験血液力価決定法により最高の
力価を示すマウスを選び、ＰＢＳ中に１００μｇのＫＬＨ−３ＤＧを含む溶液で
腹腔内注射により増強(boost)し、その後、第１日および第２日に、ＰＢＳ中に
５０μｇのＫＬＨ−３ＤＧを含む溶液で再びブーストした。第３日に、脾臓を取
り出した。抗血清試験血液力価決定 力価決定のため、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で、力価を決定すべき各血清サ
ンプルの１／１００希釈液を調製した。上記の免疫前血清を、免疫血清と同じよ
うに希釈し、対照として用いた。マイクロタイターウェルに、ＢＳＡ−３ＤＧ抗
原１．０μｇを塗布した。抗原を塗布したウェルをＭｙｌａｒ密封テープ（Ｃｏ
ｒｎｉｎｇ社）で密封し、４℃で一晩インキュベートした。次に、マイクロタイ
タープレートをＴＢＳ−Ｔ洗浄液で洗浄し、０．２％ＢＳＡと０．２％アジ化ナ
トリウムを含むＰＢＳ溶液を加えることによって３７℃で１時間ブロック（遮断
）した。マイクロタイタープレートを前と同じように洗浄し、免疫前血清および
免疫血清の希釈液１００μｌを加えた。室温で２時間インキュベートしたあと、
マイクロタイタープレートを上記と同じように洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ガ
ンマ鎖特異性）アルカリ性ホスファターゼ複合抗体（ＩＣＮ）をすべてのウェル
に加え、室温で１時間インキュベートした。マイクロタイタープレートを前と同
じように洗浄し、リン酸ｐ−ニトロフェノール基質（Ｓｉｇｍａ社）をすべての
ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートした。インキュベーションのあと
、マイクロタイタープレートリーダー上で、各プレートについて４１０ｎｍで読
み取りを行った。 別に報告されているように（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ、「抗原：
実験室マニュアル」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ、１９８８）、マウス脾臓細胞を、骨髄腫Ｘ６３ＡＧ８．６５３細胞系と融
合することによって、ハイブリドーマ産生を行った。ハイブリドーマ・スクリーニング手順 脾臓細胞を骨髄腫細胞系と融合させたあと、５０ｍｌ融合混合物１００μｌを、
５個のマイクロウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）の９６個のウェル
にそれぞれ加えた。プレートに１から５までの番号をつけ、各プレートの行を文
字により、また列を番号により表して融合混合物の各１滴から生じる親細胞培養
物を識別するコーディング方式を用いた。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（上記）
に述べられたように選択培地で培養したあと、ハイブリドーマ培養物を、ＡＧＥ
抗原に対する抗体産生について、次のようにスクリーニングした。 上記の「抗血清試験血液力価決定」の項で述べたように、ＢＳＡ−３ＤＧを塗布
したウェルを調製した。抗原塗布プレートを用いて、各親培養物からの細胞培養
物の上澄液をスクリーニングした。細胞培養物の上澄液を、０．２％ＢＳＡを含
むＰＢＳ中で、１：２に希釈し、各１００μｌを、ＢＳＡ−ＡＧＥを塗布したマ
イクロタイタープレートの各ウェルに加えた。各プレートを２時間にわたって室
温でインキュベートし、その後、ＴＢＳ−Ｔ洗浄液で６回洗浄した。１％ＢＳＡ
を含むＰＢＳ中で１：２０００に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（ガンマ鎖特異性
）アルカリ性ホスファターゼ複合抗体１００μｌを各ウェルに加え、上記の「抗
血清試験血液力価決定」の項に述べた手順を行った。 １１μＭカルボキシメチルリジンまたは１００μＭベンジルアルギニン−３ＤＧ
を含むウェルで、２回の追加スクリーニングを行った。ＢＳＡ−３ＤＧと強く結
合し、カルボキシメチルリジンによって阻害されず、ベンジルアルギニン−３Ｄ
Ｇにより阻害される２４個の親細胞培養物を選んだ。これら２４個の培養物から
、成長率、抗体力価、特異性の最良の組合せを示すクローン指定４Ｅ１を選んだ
。この細胞系を、希釈を限定することによりクローンして、１０％ジメチルスル
ホキシドを含む仔ウシ血清１ｍｌあたり、細胞約１００万個の率で冷凍し、液体
窒素の気相で貯蔵した。 モノクローナル抗体４Ｅ１を産生するハイブリドーマＦ５２−４Ｅ１を、１９９
８年３月３１日に、アメリカ培養コレクション（ＡＴＣＣ）（１２３０１ Ｐａ
ｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ ２０８５２）に寄託し
、受付番号ＨＢ−１２５００を受けた。
【００１４】実施例２ ： グアニジノ基由来の、加齢特異性モノクローナル抗体４Ｅ１の結合
および免疫特性 各種のＡＧＥ修飾タンパク質を認知するため、３ＤＧと反応させたＫＬＨに対し
て調製したモノクローナル抗体Ｍａｂ ４Ｅ１の能力を測定した。材料と方法 ＡＧＥタンパク質と付加物の産生 タンパク質およびＮε−ベンゾイル−Ｌ−ア
ルギニンアミドを、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７．４）中で、グ
ルコース、リボース、または３ＤＧと、４〜１０週間、３７℃で反応させた。一
部のインキュベーションには、アミノグアニジンが含まれていた。 アルギニン、メチルグアニジンおよびグアニジン（０．１ｍ）を、２００ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で３ＤＧ（０．２Ｍ）と、２４〜７２時
間、３７℃で反応させた。次に、これらの混合物を、同じ濃度の対照化合物とと
もに、一次抗体として４Ｅ１を用いて、（ＡＧＥ−ＢＳＡ塗布プレート上で）競
合的ＥＬＩＳＡにより試験した。阻害曲線は対数ロジット変換データの最小二乗
回帰分析で得た。５０％阻害点での濃度を線型回帰分析から計算した。直接ＥＬＩＳＡおよび競合的ＥＬＩＳＡ 直接ＥＬＩＳＡでは、ＢＳＡ−ＡＧＥ
または３ＤＧ修飾ＢＳＡをマイクロタイタープレートに塗布し、不結合部位をア
ッセイ緩衝液とインキュベートすることによってブロックした。各プレートを６
回洗浄し、アッセイ緩衝液中のＭａｂの濃度を次第に高くして加えた。このイン
キュベーションのあと、プレートを再び洗浄し、アッセイ緩衝液中で１：２００
０で希釈したアルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗マウス抗体（ＩＣＮ、Ｃｏｓ
ｔａ Ｍｅｓａ ＣＡ）とともにインキュベートした。不結合抗体を徹底的洗浄に
より除去し、結合した抗体を、リン酸ｐ−ニトロフェノールを加えて検出し、光
学密度を４１０ｎｍで記録した。 競合的ＥＬＩＳＡは、マイクロタイタープレートにＢＳＡ−ＡＧＥを前塗布し、
アッセイ緩衝液でブロックすることにより行った。プレートを洗浄し、Ｍａｂ
４Ｅ１と、表１に示した競合剤の濃度を増したものを加え、同時に２２℃で１時
間インキュベートした。不結合抗体を徹底的洗浄により除去し、結合したＭａｂ
を、直接ＥＬＩＳＡと同様のアルカリ性ホスファターゼ標識抗マウス抗体で検出
した。すべての洗浄物はＴＢＳ−Ｔ洗浄液中にあった。すべてのインキュベーシ
ョンは１時間、２２℃で行った。結果 各種化合物に対してモノクローナル抗体４Ｅ１を用いて行ったＥＬＩＳＡの定性
結果を表１に示す。
および免疫特性 各種のＡＧＥ修飾タンパク質を認知するため、３ＤＧと反応させたＫＬＨに対し
て調製したモノクローナル抗体Ｍａｂ ４Ｅ１の能力を測定した。材料と方法 ＡＧＥタンパク質と付加物の産生 タンパク質およびＮε−ベンゾイル−Ｌ−ア
ルギニンアミドを、２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ７．４）中で、グ
ルコース、リボース、または３ＤＧと、４〜１０週間、３７℃で反応させた。一
部のインキュベーションには、アミノグアニジンが含まれていた。 アルギニン、メチルグアニジンおよびグアニジン（０．１ｍ）を、２００ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）中で３ＤＧ（０．２Ｍ）と、２４〜７２時
間、３７℃で反応させた。次に、これらの混合物を、同じ濃度の対照化合物とと
もに、一次抗体として４Ｅ１を用いて、（ＡＧＥ−ＢＳＡ塗布プレート上で）競
合的ＥＬＩＳＡにより試験した。阻害曲線は対数ロジット変換データの最小二乗
回帰分析で得た。５０％阻害点での濃度を線型回帰分析から計算した。直接ＥＬＩＳＡおよび競合的ＥＬＩＳＡ 直接ＥＬＩＳＡでは、ＢＳＡ−ＡＧＥ
または３ＤＧ修飾ＢＳＡをマイクロタイタープレートに塗布し、不結合部位をア
ッセイ緩衝液とインキュベートすることによってブロックした。各プレートを６
回洗浄し、アッセイ緩衝液中のＭａｂの濃度を次第に高くして加えた。このイン
キュベーションのあと、プレートを再び洗浄し、アッセイ緩衝液中で１：２００
０で希釈したアルカリ性ホスファターゼ標識ヤギ抗マウス抗体（ＩＣＮ、Ｃｏｓ
ｔａ Ｍｅｓａ ＣＡ）とともにインキュベートした。不結合抗体を徹底的洗浄に
より除去し、結合した抗体を、リン酸ｐ−ニトロフェノールを加えて検出し、光
学密度を４１０ｎｍで記録した。 競合的ＥＬＩＳＡは、マイクロタイタープレートにＢＳＡ−ＡＧＥを前塗布し、
アッセイ緩衝液でブロックすることにより行った。プレートを洗浄し、Ｍａｂ
４Ｅ１と、表１に示した競合剤の濃度を増したものを加え、同時に２２℃で１時
間インキュベートした。不結合抗体を徹底的洗浄により除去し、結合したＭａｂ
を、直接ＥＬＩＳＡと同様のアルカリ性ホスファターゼ標識抗マウス抗体で検出
した。すべての洗浄物はＴＢＳ−Ｔ洗浄液中にあった。すべてのインキュベーシ
ョンは１時間、２２℃で行った。結果 各種化合物に対してモノクローナル抗体４Ｅ１を用いて行ったＥＬＩＳＡの定性
結果を表１に示す。
【００１５】
【表１】 上に示したデータから、Ｍａｂ ４Ｅ１が、３ＤＧにより修飾されたグアニジノ
基含有化合物について特異的であること、またこのようなエピトープがＡＧＥ−
ＢＳＡ上に存在し、これはおそらく３ＤＧと、ＢＳＡを含むアルギニン残基のグ
アニジノ基との間の反応の結果であることは明らかである。リボース由来ＡＧＥ
の免疫反応性は検出されなかった。図１は、３ＤＧとアルギニン、メチルグアニ
ジンおよびグアニジンの反応生成物の阻害曲線を示している。親和性は、アルギ
ニン産生物が最も高く、続いてメチルグアニジン産生物、最後にグアニジン産生
物が高かったが、すべて抗体により検出可能であった。３ＤＧが存在しないとき
の、グアニジノ基含有化合物の対照インキュベーションは、抗体では免疫反応性
を示さなかった。
基含有化合物について特異的であること、またこのようなエピトープがＡＧＥ−
ＢＳＡ上に存在し、これはおそらく３ＤＧと、ＢＳＡを含むアルギニン残基のグ
アニジノ基との間の反応の結果であることは明らかである。リボース由来ＡＧＥ
の免疫反応性は検出されなかった。図１は、３ＤＧとアルギニン、メチルグアニ
ジンおよびグアニジンの反応生成物の阻害曲線を示している。親和性は、アルギ
ニン産生物が最も高く、続いてメチルグアニジン産生物、最後にグアニジン産生
物が高かったが、すべて抗体により検出可能であった。３ＤＧが存在しないとき
の、グアニジノ基含有化合物の対照インキュベーションは、抗体では免疫反応性
を示さなかった。
【００１６】実施例３ ： モノクローナル抗体４Ｅ１のその他の特徴付け 上記の実施例２の表１に示した結合特異性のほかに、Ｍａｂ ４Ｅ１が認知する
エピトープは、次のような実験によって先行技術のモノクローナル抗体から区別
することができる。３ＤＧと、Ｎε−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンアミドとの間
の反応の産生物を、逆相ＨＰＬＣと、そのあと上記のＫｏｎｉｓｈｉらの方法に
似た方法によって分離した。ベンジルアルギニンアミン（０．１ｍ）と３ＤＧ（
０．２ｍ）を、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、４週間、３７℃で
反応させた。次に、この物質を、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ８ ＯＤＳ−３（３ｃｍ ｘ
２５ｃｍ）カラム（Ｍｅｔａｃｈｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を
用いて、逆相ＨＰＬＣにより分画した。溶出プログラムは、水中で２０％メタノ
ールを２０分間、流量１０ｍｌ／ｍｉｎで、次に水中で４０分間、２０〜６０％
メタノールの勾配で行った。カラム溶出液を、２３５ｎｍで紫外線でモニターし
た。興味ある分画が４０〜５５分の間で溶出した。この時間内での７つの主要ピ
ークを集め、ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて乾燥した。乾燥したサンプルを１ｍｌの
水の中で再構成し、紫外線スペクトルを得た。分画１を基準（１：３０，０００
）として用いて、すべての分画を希釈して、紫外線による物質が等しい量で存在
するようにした。次に、これらのサンプルを、４Ｅ１を一次抗体として用いて（
ＡＧＥ−ＢＳＡ塗布プレートを用いた）競合的ＥＬＩＳＡで試験した。７つの分
画のそれぞれについて、ＵＶ吸光度によるＨＰＬＣ溶出パターンと、ＥＬＩＳＡ
の結果を、図２ＡおよびＢに示す。 分画４が、最大量の４Ｅ１抗体反応物質を含み、そのあとに分画３、１および５
が続くことは明らかである。分画７には、抗体反応物質は、ほとんど、または全
く存在しない。別のＨＰＬＣ実験で、３ＤＧとベンジルアルギニンの間で同じ反
応を、Ｋｏｎｉｓｈｉらの方法（１９９４年、Ｂｉｏｓｃｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、５８：１９５３−１９５８）により５０℃で行い、以前見られ
たのと同じようなＨＰＬＣ溶出プロフィル（図３Ａ）を得た。この実験では、Ｉ
ｎｅｒｔｓｉｌ ５ ＯＢＳ−２（１ｃｍ ｘ ２５ｃｍ）カラム（Ｍｅｔａｃｈ
ｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、溶出プログラムは、水中で１０−４
０％メタノール、流量２．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。１１個の分画を採取し、４
Ｅ１を用いて競合的ＥＬＩＳＡを行った（図３Ｂ）。モノクローナル抗体４Ｅ１
との最大反応性は分画４と５で見出された。あとの方のピークでは反応性はほと
んど見られなかった。ＨＰＬＣ溶出プロフィルと化合物の分離をＫｏｎｉｓｈｉ
らのものと比較するために、分画１１中に存在する化合物にＮＭＲ分析を行った
。存在する化合物は、化合物Ｓ１７、アミノ−５−（２，３，４−トリヒドロキ
シブチル）−４−イミダゾロン化合物と同じであることが分かった。 ＥＬＩＳＡの結果にもとづいて、４Ｅ１がＳ１７を認知しないことは明らかであ
る。これは、アミノ−５−（２，３，４−トリヒドロキシブチル）−４−イミダ
ゾロン化合物として同定された分画１１を含めて、保持時間の最も長い分画に免
疫反応性が欠如しているからである。 本発明は、その趣旨または主要な特徴から逸脱することなしに、他の形で具体化
することができ、また実施できる。したがって、この開示は、すべての点で例示
的なものであり、制限的なものではないと考えるべきであり、添付の各請求項に
より示される発明の範囲、および同じ意味と範囲内にあるすべての変更は、本発
明に含まれることが意図されている。 この明細書を通じ、文献の引用が各所に見られるが、これらはすべて本書に組入
れられ、一体化されている。
エピトープは、次のような実験によって先行技術のモノクローナル抗体から区別
することができる。３ＤＧと、Ｎε−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンアミドとの間
の反応の産生物を、逆相ＨＰＬＣと、そのあと上記のＫｏｎｉｓｈｉらの方法に
似た方法によって分離した。ベンジルアルギニンアミン（０．１ｍ）と３ＤＧ（
０．２ｍ）を、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、４週間、３７℃で
反応させた。次に、この物質を、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ８ ＯＤＳ−３（３ｃｍ ｘ
２５ｃｍ）カラム（Ｍｅｔａｃｈｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）を
用いて、逆相ＨＰＬＣにより分画した。溶出プログラムは、水中で２０％メタノ
ールを２０分間、流量１０ｍｌ／ｍｉｎで、次に水中で４０分間、２０〜６０％
メタノールの勾配で行った。カラム溶出液を、２３５ｎｍで紫外線でモニターし
た。興味ある分画が４０〜５５分の間で溶出した。この時間内での７つの主要ピ
ークを集め、ＳｐｅｅｄＶａｃを用いて乾燥した。乾燥したサンプルを１ｍｌの
水の中で再構成し、紫外線スペクトルを得た。分画１を基準（１：３０，０００
）として用いて、すべての分画を希釈して、紫外線による物質が等しい量で存在
するようにした。次に、これらのサンプルを、４Ｅ１を一次抗体として用いて（
ＡＧＥ−ＢＳＡ塗布プレートを用いた）競合的ＥＬＩＳＡで試験した。７つの分
画のそれぞれについて、ＵＶ吸光度によるＨＰＬＣ溶出パターンと、ＥＬＩＳＡ
の結果を、図２ＡおよびＢに示す。 分画４が、最大量の４Ｅ１抗体反応物質を含み、そのあとに分画３、１および５
が続くことは明らかである。分画７には、抗体反応物質は、ほとんど、または全
く存在しない。別のＨＰＬＣ実験で、３ＤＧとベンジルアルギニンの間で同じ反
応を、Ｋｏｎｉｓｈｉらの方法（１９９４年、Ｂｉｏｓｃｉ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、５８：１９５３−１９５８）により５０℃で行い、以前見られ
たのと同じようなＨＰＬＣ溶出プロフィル（図３Ａ）を得た。この実験では、Ｉ
ｎｅｒｔｓｉｌ ５ ＯＢＳ−２（１ｃｍ ｘ ２５ｃｍ）カラム（Ｍｅｔａｃｈ
ｅｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、溶出プログラムは、水中で１０−４
０％メタノール、流量２．５ｍｌ／ｍｉｎで行った。１１個の分画を採取し、４
Ｅ１を用いて競合的ＥＬＩＳＡを行った（図３Ｂ）。モノクローナル抗体４Ｅ１
との最大反応性は分画４と５で見出された。あとの方のピークでは反応性はほと
んど見られなかった。ＨＰＬＣ溶出プロフィルと化合物の分離をＫｏｎｉｓｈｉ
らのものと比較するために、分画１１中に存在する化合物にＮＭＲ分析を行った
。存在する化合物は、化合物Ｓ１７、アミノ−５−（２，３，４−トリヒドロキ
シブチル）−４−イミダゾロン化合物と同じであることが分かった。 ＥＬＩＳＡの結果にもとづいて、４Ｅ１がＳ１７を認知しないことは明らかであ
る。これは、アミノ−５−（２，３，４−トリヒドロキシブチル）−４−イミダ
ゾロン化合物として同定された分画１１を含めて、保持時間の最も長い分画に免
疫反応性が欠如しているからである。 本発明は、その趣旨または主要な特徴から逸脱することなしに、他の形で具体化
することができ、また実施できる。したがって、この開示は、すべての点で例示
的なものであり、制限的なものではないと考えるべきであり、添付の各請求項に
より示される発明の範囲、および同じ意味と範囲内にあるすべての変更は、本発
明に含まれることが意図されている。 この明細書を通じ、文献の引用が各所に見られるが、これらはすべて本書に組入
れられ、一体化されている。
【００１７】
【図１】 図1は、３‐デオキシグルコソンと種々のグアニジノ基含有化合物との間の
反応生成物及び対照に対する４Ｅ１抗体の特異性を示す。
反応生成物及び対照に対する４Ｅ１抗体の特異性を示す。
【図２】 図2は、ｐＨ７．４の２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で、３７℃、４８
時間インキュベートしたＮε‐ベンゾイル‐Ｌ‐アルギニンアミドと、３‐デオ
キシグルコソンとの反応生成物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラフ分離及び競合ＥＬ
ＩＳＡデータを示す。図２Ａに示すように、７つの画分を採取した。この７つの
画分についてのＥＬＩＳＡデータを図２Ｂに示す。
時間インキュベートしたＮε‐ベンゾイル‐Ｌ‐アルギニンアミドと、３‐デオ
キシグルコソンとの反応生成物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラフ分離及び競合ＥＬ
ＩＳＡデータを示す。図２Ａに示すように、７つの画分を採取した。この７つの
画分についてのＥＬＩＳＡデータを図２Ｂに示す。
【図３】 図3は、ｐＨ７．４の２００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で、５０℃、４週
間インキュベートしたＮε‐ベンゾイル‐Ｌ‐アルギニンアミドと、３‐デオキ
シグルコソンとの反応生成物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラフ分離及び競合ＥＬＩ
ＳＡデータを示す。図３Ａに示すように、１１の画分を採取した。この１１の画
分についてのＥＬＩＳＡデータを図３Ｂに示す。
間インキュベートしたＮε‐ベンゾイル‐Ｌ‐アルギニンアミドと、３‐デオキ
シグルコソンとの反応生成物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラフ分離及び競合ＥＬＩ
ＳＡデータを示す。図３Ａに示すように、１１の画分を採取した。この１１の画
分についてのＥＬＩＳＡデータを図３Ｂに示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 5/10 33/577 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:91） 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA42 CA07 GA05 GA18 HA15 4B064 AG27 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA90X AA91Y AA93Y AB08 AC14 BA08 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA17 NA14 ZA361 ZA362 ZA401 ZA402 ZC331 ZC332 ZC351 ZC352 4C085 AA14 CC02 CC13 4H045 AA11 AA20 AA30 BA41 CA40 DA76 EA20 EA50 FA74
Claims (42)
- 【請求項１】 アルギニンのグアジニル基又は式Ｒ‐ＮＨ‐Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ
Ｈ２（ここで、Ｒは水素又は低級アルキル基である）の化合物のグアニジノ基と
３‐デオキシグルコソンとの反応に由来する生体内産生進行グリコシル化最終生
成物と反応性の抗体又はその抗原結合性フラグメントであって、アミノ‐５‐（
２，３，４‐トリヒドロキシブチル）‐４‐イミダゾロン、ペントシジン（pent
osidine）、カルボキシメチルリジン、リボース由来進行グリコシル化最終生成
物と反応せず、Ｌ‐リジン又はアミノグアニジンと３‐デオキシグルコソンとの
反応生成物とも反応せず、Ｌ‐アルギニンとメチルグリオキサールとの反応生成
物とも反応しないことを特徴とする該抗体又はその抗原結合性フラグメント。 - 【請求項２】 請求項１記載の抗体の免疫結合特性を示すモノクローナル抗
体又はその抗原結合性フラグメント。 - 【請求項３】 Ｒが、水素及びメチル基からなる群から選ばれる請求項２記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 １９９８年３月３１日にアメリカンタイプカルチャーコレク
ション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）に寄託されており、
ＨＢ‐１２５００の受託番号が与えられているハイブリドーマＦ５２‐４Ｅ１に
より生産されるモノクローナル抗体４Ｅ１である請求項２記載のモノクローナル
抗体。 - 【請求項５】 血清‐ＡＧＥ蛋白質、ヘモグロビン‐ＡＧＥ、血清‐ＡＧＥ
脂質、血清‐ＡＧＥペプチド、ＬＤＬ‐ＡＧＥ及びコラーゲン‐ＡＧＥと特異的
に結合する請求項１記載の抗体又はその抗原結合性フラグメント。 - 【請求項６】 ヒト化(humanized)されるか又はヒト‐マウス(murine)キメ
ラ抗体である請求項２記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項７】 単鎖Ｆｖフラグメント、Ｆ（ａｂ′）フラグメント、Ｆ（ａ
ｂ）フラグメント及びＦ（ａｂ′）２フラグメントからなる群から選ばれる請求
項２記載のモノクローナル抗体の抗原結合性フラグメント。 - 【請求項８】 マウス(murine)ＩｇＧイソタイプ抗体である請求項２記載の
モノクローナル抗体又はそのフラグメント。 - 【請求項９】 標識されている請求項２記載のモノクローナル抗体。
- 【請求項１０】 請求項２記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ。 - 【請求項１１】 モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマＦ５２‐４
Ｅ１であり、１９９８年３月３１日にアメリカンタイプカルチャーコレクション
（ＡＴＣＣ）に寄託され、ＨＢ‐１２５００の受託番号が与えられている該ハイ
ブリドーマ。 - 【請求項１２】 ｉ）進行グリコシル化最終生成物（ＡＧＥ）を含んでいる
可能性のあるサンプルを、抗体又はその抗原結合性フラグメントとＡＧＥとを含
む反応複合体を生成させる条件下で、請求項１記載の抗体又はその抗原結合性フ
ラグメントと接触させ、 ｉｉ）サンプル内での抗体又はその抗原結合性フラグメントとＡＧＥとを含む反
応複合体の生成を検出する工程からなり、反応複合体の生成の検出によって、サ
ンプル内にＡＧＥが存在することを知ることからなる、生体サンプル内にＡＧＥ
が存在することを検出する方法。 - 【請求項１３】 抗体又はその抗原結合性フラグメントが固相支持体に結合し
ている請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 更に、工程（ｉ）においてサンプルを標識進行グリコシル化
最終生成物（ＡＧＥ）に接触させ、工程（ｉｉ）の前に未結合物質を除去し、サ
ンプル内の標識ＡＧＥ量の減少を観察することにより、サンプル内での反応複合
体の生成を検出することを含む請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 ＡＧＥが存在する分子に特異的に結合している標識抗体の結
合を検出することにより、反応複合体の生成を観察する請求項１３記載の方法。 - 【請求項１６】 標識抗体が、血清蛋白質、血清脂質、血清ペプチド、ＬＤＬ
及びコラーゲンからなる群から選ばれた分子と反応性である請求項１５記載の方
法。 - 【請求項１７】 抗体又はその抗原結合性フラグメントが標識されている請求
項１２記載の方法。 - 【請求項１８】 ＡＧＥが固相支持体に結合している請求項１２記載の方法。
- 【請求項１９】 更に、工程（ｉ）においてサンプルをＡＧＥに接触させ、工
程（ｉｉ）の前に未結合物質を除去し、抗体又はその抗原結合性フラグメントを
標識し、標識の量の減少を観察することにより、サンプル内での反応複合体の生
成を検出することを含む請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 ＡＧＥが低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）‐ＡＧＥ又はヘモグロ
ビン‐ＡＧＥである請求項１２記載の方法。 - 【請求項２１】 （ｉ）請求項１２記載の方法により生体サンプル内での反応
複合体の生成を検出し、 （ｉｉ）生体サンプル内のＡＧＥの濃度に対応する、生成した反応複合体の量を
評価することからなる、生体サンプル内のＡＧＥの濃度を評価する方法。 - 【請求項２２】 （ｉ）哺乳類被検体からの生体サンプル内のＡＧＥの濃度を
、請求項１２によって評価し、 （ｉｉ）工程（ｉ）で検出された濃度を、哺乳類被検体に正常に存在するＡＧＥ
の濃度と比較して、正常濃度と比較したときのＡＧＥ濃度の増加により、ＡＧＥ
濃度の上昇と関連がある病気を知ることからなる、哺乳類被検体中のＡＧＥ濃度
の上昇と関連がある病気の存在を検出又は診断する方法。 - 【請求項２３】 哺乳類被検体から、異なる時点において得られた一連の生体
サンプル内のＡＧＥの濃度を、請求項２１記載の方法により評価し、時間による
ＡＧＥ濃度の上昇により病気の進行を知り、時間によるＡＧＥ濃度の低下により
病気の退行を知ることからなる、哺乳類被検体中のＡＧＥ濃度の上昇と関連があ
る病気の経過を監視する方法。 - 【請求項２４】 ＡＧＥ濃度の上昇と関連がある病気の治療を受けている哺乳
類被検体から、異なる時間において得られた一連の生体サンプル内のＡＧＥの濃
度を、請求項２１記載の方法により評価し、時間によるＡＧＥ濃度の低下により
、治療成果が有効であることを知ることからなる、哺乳類被検体中のＡＧＥ濃度
の上昇と関連がある病気の治療を監視する方法。 - 【請求項２５】 請求項１２記載の方法を実施することからなる、糖尿病の発
症を検出するか、又はその経過を監視する方法。 - 【請求項２６】 患者の血清を抗ＡＧＥ抗体に触れさせて、抗ＡＧＥ抗体：Ａ
ＧＥ複合体を生成し、その複合体を血清から除去することを含み、該抗ＡＧＥ抗
体が請求項１記載の抗体を含むものである、一つの症状がＡＧＥの異常濃度であ
る患者の病気を治療する方法。 - 【請求項２７】 該ＡＧＥが、ヘモグロビン‐ＡＧＥ、ＬＤＬ‐ＡＧＥ、Ｉｇ
Ｇ‐ＡＧＥ、血清‐ＡＧＥ蛋白質、血清‐ＡＧＥペプチド及び尿ペプチド‐ＡＧ
Ｅからなる群から選ばれる請求項２６記載の方法。 - 【請求項２８】 請求項１による抗ＡＧＥ抗体により認識され、結合し、哺乳
類ＡＧＥ受容体によるＡＧＥの認識を阻害する化合物を、薬理学的に許容されう
る担体と組み合わせて含む医薬組成物。 - 【請求項２９】 薬理学的に許容されうる担体と組み合わせて抗ＡＧＥ抗体を
含み、該抗ＡＧＥ抗体が請求項２によるモノクローナル抗体を含む医薬組成物。 - 【請求項３０】 該生体内産生進行グリコシル化最終生成物が、ヘモグロビン
‐ＡＧＥ、ＬＤＬ‐ＡＧＥ、ＩｇＧ‐ＡＧＥ、血清‐ＡＧＥ蛋白質、血清‐ＡＧ
Ｅペプチド及び尿ペプチド‐ＡＧＥからなる群から選ばれる請求項２９記載の医
薬組成物。 - 【請求項３１】 請求項２９記載の有効量の組成物を哺乳類に投与することか
らなる、一つの症状がＡＧＥの異常濃度である哺乳類の病気を治療する方法。 - 【請求項３２】 （ｉ）１９９８年３月３１日にアメリカンタイプカルチャー
コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託されており、ＨＢ‐１２５００の受託番号が与
えられているハイブリドーマＦ５２‐４Ｅ１により生産されるモノクローナル抗
体４Ｅ１からなる群から選ばれたモノクローナル抗体の免疫結合特性を示すモノ
クローナル抗体又はその抗原結合性フラグメント、 （ｉｉ）モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントとＡＧＥとの間の
反応複合体の生成を検出する手段、 （ｉｉｉ）他の試薬、及び （ｉｖ）キット使用の説明書からなる分析体におけるＡＧＥの存在又は量を測定
するテストキット。 - 【請求項３３】 モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントが、血
清‐ＡＧＥ蛋白質、血清‐ＡＧＥ脂質、血清‐ＡＧＥペプチド、ヘモグロビン‐
ＡＧＥ、ＬＤＬ‐ＡＧＥ及びコラーゲン‐ＡＧＥとの反応性からなる群から選ば
れた活性を特徴とする請求項３２記載のテストキット。 - 【請求項３４】 抗ＡＧＥ抗体が、固相に非可逆的に結合している請求項３２
記載のテストキット。 - 【請求項３５】 生体内産生ＡＧＥと反応性である標識抗ＡＧＥ抗体を更に含
む請求項３２記載のテストキット。 - 【請求項３６】 標識抗低密度リポ蛋白質抗体を更に含む請求項３２記載のテ
ストキット。 - 【請求項３７】 低密度リポ蛋白質に対する該抗体がＡｐｏＢと反応する請求
項３６記載のテストキット。 - 【請求項３８】 標識ＡＧＥを更に含む請求項３２記載のテストキット。
- 【請求項３９】 ＡＧＥを更に含む請求項３２記載のテストキット。
- 【請求項４０】 ＡＧＥが固相に結合しており、抗体が標識されている請求項
３９記載のテストキット。 - 【請求項４１】 ｉ）既知量の希釈緩衝液を用いて、ＡＧＥを含んでいる可能
性のあるサンプルの一連の希釈溶液を調製し、 ｉｉ）ＡＧＥを含んでいる可能性のある希釈サンプルを、抗体又はその抗原結合
性フラグメントとＡＧＥとを含む反応複合体を生成させる条件下で、請求項１記
載の抗体又はその抗原結合性フラグメントと接触させ、 ｉｉｉ）既知量の標識ＡＧＥを抗体又はその抗原結合性フラグメントと接触させ
、その標識ＡＧＥが、サンプルに結合しなかった抗体又はその抗原結合性フラグ
メントと結合し、サンプル内での抗体又はその抗原結合性フラグメントと標識Ａ
ＧＥとを含む反応複合体の生成の程度を検出する工程からなり、標識ＡＧＥ‐抗
体複合体の生成の程度がＡＧＥの濃度に逆比例することで検出する、生体サンプ
ル内の進行グリコシル化最終生成物（ＡＧＥ）の濃度を検出する方法。 - 【請求項４２】 ＡＧＥが、血清‐ＡＧＥ蛋白質、血清‐ＡＧＥ脂質、血清‐
ＡＧＥペプチド、ＬＤＬ‐ＡＧＥ、ヘモグロビン‐ＡＧＥ又はコラーゲン‐ＡＧ
Ｅである請求項４１記載の方法。
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|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20060905 |