SE434680B - Anvendning av en saltlosning av monoklonala antikroppar med relativt hog salthalt vid blodgruppsbestemning - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 asoaszo-år 2 motjon. Natrium- och kaliumklorider är lämpligast att använda som lösliga salter, varvid natriumklorid är speciellt föredra- gen. Bland andra salter kan nämnas kaliumklorid, kalciumklorid, kaliumjodid, magnesiumklorid, magnesiumsulfat etc.

Uppfinningen är sålunda inriktad på blodgruppsbestämning, där de monoklonala antikropparna är riktade mot antigenerna av blodgrupperna A, B eller A,B. Beredningen tillhandahålles före- trädesvis i form av en vattenlösning.

Beredningen använd enligt föreliggande uppfinning kan för- utom monoklonala antikroppar och det lösliga saltet även inne- hålla andra ingredienser som är konventionella inom tekniken i huvudsak härrörande från odlingsmediet. Uppfinningen är emeller- tid oberoende av variationer i detaljer beträffande sådana kon- ventionella ingredienser och är tillämpbar på alla typer av vat- tenbaserade beredningar innehållande monoklonala antikroppar av klinisk användning.g I föreliggande bilagda lista av referenser. Uppfinningen kommer nu att beskrivas ytterligare genom illustration i följande experimentella avsnitt inriktat på konkreta utföringsformer. Det bör emellertid.observe- ras, att uppfinníngen.ej är inskränkt till något specifikt känne- tecken som avslöjas i det experimentella avsnittet utan begränsas enbart av omfattningen av bilagda patentkrav.

Vid experimenten användes som immnnogener hela röda blodkrop- framställning avser siffrorna inom parentes Ipar, blodkroppsmembran eller lösliga blodgruppssubstanser beredda från individer med blodgrupp AT, A2, B eller AZB, och ett högdos- boosterprotokoll (8) tillämpades i de flesta.av försöken. Ett stort antal mus-mushybridom avgav antikroppar med anti-A-, anti-B- och anti-A,B-specificítet, och flera av dessa antikroppar visade sig vara överlägsna humanpolyklonaltestsera, både vid manuell och vid automatiserad blodgruppsbestämning.

EXPERIMENTELLT AVSNITT Möss ' Honmöss av den inavlade Balb/cABom-stammen erhölls från G1 Bomholtgaard, Ry, Danmark. Mössen var fem till nio veckor gamla när de först tillfördes antigen. De hölls på en standardpelletdiet och vatten ad lip. D Antigener Renade cystfluidglykoproteiner från humanovarier från indivi- der med blodgrupp A1, A2 och B var gåvor från Drs. W.M. Watkíns and 10 15 20 25 30 35 8300320-2 E.A. Kabat. Röda blodkroppar från normala bloddonatorer till blod- grupp A1, A2 och AZB användes, antingen som 10 % (vol/vol) suspen- sioner i koksaltlösning eller som membraner, (9), och suspenderade (10 %, vikt/vol) i koksaltlösning.

Immuniseringsprocedur Immunisering utfördes enligt protokollet i tabell I. Ett slut- ligt högdosboosterschema (8) följdes vanligen när lösliga blod- gruppsubstanser användes som antigener. Med röda blodkroppar till- lämpades för det mesta ett avkortat schema med två på varandra följande intraperitoneala injektioner utan adjuvant. Några experi- ment utfördes under användning av en enkel injektion av antigen med fusion under prímärresponset.

Hxbridomteknik Cellfusion, kloning och odling av hybridomcellinjer utfördes enligt standardprocedurer (10-12). Myelomacellinjerna SPZ/0, P3- NS1 Ag-4, eller P3x63 Ag-8-653.1 användes. Askitesvätska produce- rades i PristaneR (Aldrich, Beerse, Belgien)-behandlade möss.

Selektion av antikroppar och framställning av reagens Odlingsmediet från odling av hybridomas testades med avseen- de på hflwgglutinerande antikroppar i mikrotiterplattor (Línbro, Hamden Conn, USA) med röda blodkroppar av olika ABO-grupper och i ELISA (13) under användning av míkrotiterplattor (Microelisa immulon, Dynatech GMBH, Plachingen, V.Tysk1and) överdragna med blodgruppsaktiva glykoproteiner, Askitesvätskor och vävnadsodlings- medium från expanderade kulturer centrifugerades för avlägsnande av cellulära rester. Vävnadsodlingssupernatanterna avfärgades genom passage genom en träkolkolonn. Natríumklorid (se även resultat) och natriumazid (0,1%) tillsattes. Natrium bestämdes genom flam- fotometri och osmolaliteten genom fryspunktsnedsättning. Lösning- arna steriliserades genom filtrering och lagrades vid 4°C.

Isotzpbestämning Antikroppsisotypen bestämdes genom dubbel diffusion (14) under användning av kaninantimus IgGl, IgG2a, IgG2b och IgM anti- sera erhållna från Miles, Elkhart, Ind, USA.

Agglutinationstester Manuella tester utfördes under användning av outspätt od- lingsmedium eller askitesvätska utspädd i 0,9% NaCl och 5% suspen- sioner av röda blodkroppar vilka ínkuberades vid rumstemperatur, -10 15 20 25 30 35 . 8300320-2 endera på plattor i_20 minuter eller i rör i en timme. Reaktionerna avlästes genom en väl belyst bakgrund och positiva reaktioner gra- derades från (+) till 4+. Prov av röda blodkroppar från friska blod- donatorer, nyfödda barn (navelsträngsprover) och patienter testa- des. I titreringsstudier utfördes tvåfaldiga serieutspädningar med koksaltlösning. Rörteknik med 1 tim. inkubationstid användes. Avi- ditetstest utfördes både på slides med 40-50% suspensioner av röda blodkroppar i homologt serum och på plattor med 5% suspensioner av röda blodkroppar i koksaltlösning. Agglutinationsstyrkan registre- rades vid 30, 60, 90 och 120 sek. Specificitetstest utfördes under användning av en stor panel (35 donatorer) av långtgående feno- typiserade celler. Tvåstegs papain- och bromelinstandardmetoder och saltlösningstest användes i rörteknik med inkubation vid 4, 22 och 37°C. Reaktionerna avlästes mikroskopiskt. För jämförelse analyserades.även 20 kommersiella polyklonala testsera av humant ursprung (i fortsättningen kallade polyklonala sera). Automatise- rad test utfördes med Groupamatic 360 system under användning av antikropp utspädd i koksaltlösning och bromelíniserade celler i en standardprocedur (15). Helix pomatia-extract (Bíotest, Frankfurt, V.Tyskland3 användes för automatiserad A-gruppsbestämning. Förutom den automatiserade utvärderingen utfördes även visuell kontroll på samtliga reaktioner.

RESULTAT _ , iData från 18 fusioner är sammanställda i tabell II. Tio fusioner utfördes efter immunisering med blodgruppsaktiva substan- 'ser och åtta under användning av röda blodkroppar eller blodkropps- membran som antigen. De flesta fusíonerna gav upphov till flera hybridomas som alstrade ABO-specifika antikroppar, men majoriteten av dessa antikroppar agglutinerade ej eller endast svagt. Immuni- sering med A- eller B-substanser gav endast upphov till anti-A- respektive anti-B-antikroppar, medan immunisering med röda blod- kroppar även resulterade i anti-A,B- och anti-N-antikroppar och flera antikroppar av hittills okänd specificitet.

Under experimenten befanns det överraskande, att en förhöj- ning i saltkoncentratíonen ökade antikroppens aviditet såsom upp- mättes med tiden för erhållande av en 4+-reaktion. Ehuru observa- tionen gjordes i anslutning till användningen av natriumkloríd som lösligt salt observerades liknande effekter med andra salter, så- som KCl, CaCl2, KI, MgCl2, MgS04. Eftersom ingen av de övriga sal- 10 15 20 25 30 35 8300320-2 terna var bättre än natriumklorid utvaldes detta.salt som tillsats.

I bilagda fig. 1 visas ett diagram, vari tiden för erhållan- de av fullständig hemagglutination är avsatt mot koncentrationen av natriumklorid. Diagrammet i fig. 1 visar reaktionerna av anti- B 6.1.1. vid olika saltkoncentrationer, och supernatanten dialy- serades först mot 0,1 M natriumfosfatbuffert pH 7,5. Utan tillsats av salt befanns pH-optimum ligga inom intervallet 6,5 till 7,5, men när salt tillsattes vidgades detta pH-optimum, och fullständiga reaktioner erhölls snabbast om natriumjonkoncentrationen var mellan 350 och 550 mmol/liter, motsvarande en osmolalitet av 700 till 1100 mosm.

Totalt sju hybrídomas utvaldes för ytterligare studium: tre som producerade anti-A, två anti-B och två anti-A,B. Samtliga sju var IgM-antikroppar och deras specificitet bekräftades med ELISA.

En av hybrodomcellinjerna (S.1.2, producerande anti-A,B) gick för- lorad till följd av infektion och inkluderas därför ej i samtliga tester. Både vävnadskultur-supernatanten och askitesvätskan produ- cerad av dessa hybridomas användes i denna studie, men de flesta av agglutinationsförsöken har utförts med supernatanter. Resulta- ten av de manuella agglutinationstesterna återges i tabellerna III-V.

Blodprov från individer med blodgrupperna A1, A2, A1B, B och 0 studerades (tabell III). Samtliga monoklonala reagens gav aktiva reaktioner helt jämförbara med sådana för de polyklonala sera bortsett från 1.1.1, vilket hade agglutinationsegenskaper liknande dem för ett Dolichos-biflorus-extract.

Tabell IV visar resultaten av agglutinationstester med blod- prover från 10 AZB-donatorer. Med röda blodkroppar av denna typ var både de monoklonala anti-A-sera och anti-A,B klart överlägsna testade polyklonala sera. Reaktionerna med monoklonalt och poly- klonalt anti-B var av lika styrka (4+) och anges ej i tabellen.

Tabell V visar reaktioner med svaga ABO-varianter. Båda monoklo- nala anti-A-reagens gav positiva reaktioner med de två Ax-prover- na efter 20 min. inkubation vid 22°C. Efter inkubation i 1 timme i rör gav de polyklonala sera även (+) till 1+-reaktioner med AX-cellerna, men under dessa betingelser gav monoklonala sera 1+ - till 2+ -reaktioner. Båda monoklonala anti-A-reagens gav sva- ga reaktioner med ett av A81-proverna men reagerade ej med det andra. Inget av de polyklonala reagensen reagerade med dessa celler. 10 15 20 25 30 35 8300320-2 Det enda anti-B-reagenset som reagerade med ett B3-prov (klassifi- cerat enligt Race and Sanger (16)) var det monoklonala reagenset 6.1.1 efter inkubation i 1 timme vid 4°C och centrifugering (500 g, 60 sek). Monoklonalt anti-A,B reagerade starkare än polyklonala sera med ASB-prov och A-grupper andra än AX.

Resultaten av automatiserad ABO-blodgruppsbestämníng anges i tabell VI. Varje sats av prover analyserades först under använd- ning av rutinreagensen och testades sedan åter under användning av monoklonala antisera. Antalet förkastade försök genom svaga reak- tioner var av samma storleksordning för samtliga reagens.

Alla testade reagens var helt specifika bortsett från anti- A,B 5.1.2, som gav svaga ((+) till 1+)-reaktioner med enzymbehand- lade celler av grupp 0. Alla andra monoklonala reagens var negati- va med dessa celler. i i Vid aviditetstest med 40-50% suspensioner av röda blodkrop- par var antikroppen 2Ä3.2 mera avid än polyklonalt anti-A, spe- ciellt med AZB röda blodkroppar, och anti-B-antikroppen 6.1.1 var avidare än polyklonal anti-B, speciellt med A1B-röda blodkroppar.

De monoklonala antíkropparna 1.4.1 och 3.1.1 reagerade långsamma- re än polyklonala sera, men tiden för uppnàende av en 4+-reaktion låg inom den tvåmínuters-gräns som anges i European Agreement (17).

Vid test med 5% suspensioner av röda blodkroppar på plattor var aviditeten i allmänhet högre med monoklonala än med polyklonala sera.

En monoklonal och en polyklonal antíkropp av varje specifi- citet (A; B; A,B)testades med avseende på förmåga att agglutinera Balb/c-muserytrocyter. Som framgår av tabell VII reagerade inget av de monoklonala reagensen med muríncellerna, medan polyklonal anti-B och anti-A,B gav svagt positiva reaktioner.

En serie av fusioner utfördes under användning av ett flertal immuniserings- och fusionsprotokoll och ett antal potentiellt lämp- liga antigener. Ehuru totalt 18 fusioner utfördes utesluter använd- ningen av tre olika immuniseringsvägar, tre olika myelomacellinjer och tre olika typer av antigen (tabell I) definitionen av ett opti- malt fusionsschema. Emellertid kan vissa observationer göras. I' fyra fusioner under användning av immuniseríngsschemat 3 erhölls relativt få positiva hybrddom, samtliga i avsaknad av hemaggluti- nerande aktivitet (i ABO-system). Det bör emellertid påpekas, att i tre av fyra fusioner under användning av detta schema användes 10 15 20 25 30 35 40 8300320-2 NS1-myelomaceller, vilka gav färre hybrídom än vare sig 653- eller SP2/0-celler.

Både immuniseringsschema 1 under användning av blodgrupps- substanser och schema 2 under användning av erytrocyter gav ett stort antal positiva hybridom, varvid både 653- och SP2/0-cellerna var lika effektiva. Antalet hemagglutinationspositiva hybridom varie- rade emellertid väsentligt med båda celltyperna. Av åtta "använd- bara" kloner som erhållits kom fem från fusioner med 653-celler, två med SP2/0-celler och en från NS1-celler, varvid den senare är en av endast två hemagglutinationspositiva hybridom erhållna från fem fusioner med dessa celler.

Både odlingskultursupernatanter och askitesvätskor från varje hybrodom studerades. Fördelen med askitesvätskeantikroppar är dess höga koncentration i detta medium, som gör dem användbara i hög utspädning. Denna utspädning har även effekten av att utspäda musens egna naturliga antikroppar, vilka har visats reagera med determi- nanter uttryckta på humanfetala och andra glykoproteiner (18). Kon- centrationen av antikroppar från askitesvätskan vid detta studium var alltför låg för att möjliggöra den önskade höga utspädningen, troligen till följd av nedbrytning in vivo av IgM-molekylerna bildade genom hybridomcellerna (19). Vävnadsodlingssupernatanterna var tillräckligt aktiva för att användas i rutinblodgruppsbestäm- ning, varför de helt allmänt var föredragna i hemagglutinations- 11651261' .

Specificiterna för de hemagglutinerande antikroppar som er- hölls från varje fusion under användning av möss imuniserade med blodgruppssubstanser var såsom förväntats specifika för den speciel- la blodgruppen med undantaget för en antikropp av okänd specifici- tet från fusion 1.4 och en anti-A(A1) erhållen från fusion 2.3 under användning av substans från blodgrupp AZ. Det senare kan för- klaras genom närvaron av en A1-domän i A2-substansen, dvs. en liten region i glykoproteinet som har högre än normal densitet av A- determinanter.

Immunisering med röda blodkroppar gav en mera komplex bild av syntesen av hemagglutinerande antikropp. Ingen fusion under an- vändning av A -, AZB- eller A1+A2-röda blodkroppar resulterade i bildning av en anti-A. Mest anmärkningsvärd var bildningen av 21 anti-A(A1)§ två anti-A,B och två antikroppar av okänd specificitet från en fusion (5.1) under användning av A2-celler. Anmärkninsvärt var även bildningen av 10 anti-B, en anti-A,B och 12 okända men 10 15 20 25 30 35 8300320-2 ingen anti-A från fusion 6.1 under användning av AZB-celler.

Produktionen av en anti-B-antikropp i möss är av intresse eftersom de flesta musstammar innefattande Balb/c anses ha ett blod- grupp B-liknande antigen på sina erytrocyter och kan sålunda för- väntas ej producera ett anti-B (3). Röda blodkroppar från mus tes- tades med monoklonala och polyklonala reagens (tabell VII) och befanns reagera svagt med polyklonalt anti-B och anti-A,B men ej med anti-A. Inget av de motsvarande monoklonala reagensen reage- rade med murincellerna, vilket förklarar varför dessa antikroppar kan produceras i möss. Det "B-liknande" musantigenet igenkännes därför av andra antikroppar i polyklonala anti-B-sera vilka defi- nitionsmässigt saknas i de monoklonala reagensen. s Tillsatsen av salter till de monoklonala antikropparna för- höjer agglutinationsreaktionens hastighet¿yilken förhlirrkgnstànt öyer_e;t re- lativt brett intervall men medför dramatiskt reducerad aviditet utanför vissa gränser. Isotonisk koksaltlösning (0,15 M) användes i allmänhet för blodgruppsbestämningsändamål, men det är väl känt, att reaktionshastigheten mellan polyklonala IgG-antikroppar och antigen förhöjes genom reduktion av jonstyrkan från 0,15 M till 0,03 M (20, 21). Reaktíonen mellan renad polyklonal_IgM anti-A och röda A-blodkroppar å andra sidan förhöjes ej i media av låg jonstyrka (22). Mekanismen av förändradeassocíationshastigheter i media med olika jonstyrkor är ej känd och endera kan antigen eller antikropp påverkas. Ehuru uppfinningen ej är inskränkt till någon teori är en tänkbar förklaring den att tíllsatsen av salter kan förorsaka konformationsförändringar vilka favoriserar bindning till den antigenkombinerande siten.

Manuella tester (tabellerna III-V) under användning av 5% suspension av röda blodkroppar angav att de monoklonala antikroppar som valts för studium samtliga var aktiva och specifika som de polyklonala reagensen vid test med A1, A2, A13, B och 0~celler och A- och B-navelsträngsceller (tabell III). Undantaget var klon 1.1.1 som hade en anti-A1-antikropps karakteristika. Under användning v AZB-celler var de monoklonala anti-A- och anti-A,B-reagensen klart bättre än motsvarande polyklonala sera (tabell IV), medan samtliga anti-B-reagens gav en fullständig reaktion. Mera krävande tester under användning av erytrocyter med svagare A- eller B-antigen (tabell V) angav, att när reaktion över huvud taget uppträdde de monoklonala anti-A- och anti-B-reagensen var något bättre. Reaktio- 10 15 20 25 8300320-2 nerna för anti-A,B-sera var relativt variabla. Även vid automatiserad blodgruppsbestämning var funktionen för de monoklonala reagensen utmärkt (tabell VI). Monoklonal an- ti-A fungerade lika bra som Helix-extraktet som normalt användes vid automatiserad blodgruppsbestämning eftersom reaktionerna av polyklonala anti-A-reagens är för svaga med AZB-celler (15). Den svaga, skenbarligen ospecifika reaktion som kan iakttas med enzym- behandlade röda blodkroppar av grupp 0 och det monoklonala anti- A,B-reagenset vid specificitetstest observerades vid automatise- rad blodgruppsbestämning ej hos mer än 1000 prover i Groupamatic- systemet, där bromeliniserade röda blodkroppar användes.

Under användning av en 40-50% suspension av röda blodkroppar var vissa av de monoklonala reagensen mindre avida än de polyklo- nala reagensen, men detta kunde lätt avhjälpas genom fem- till tiofaldig koncentrering av de monoklonala antikroppsupernatanter- na. Detta är emellertid ej nödvändigt (7) för rutinmässig använd- ning.

Hittills har de monoklonala reagensen icke uppvisat förlust av titer vid lagring vid 4°C under minst ett år eller vid rumstem- peratur under två månader.

Det bör observeras, att uppfinningen ej är inskränkt till de begränsade detaljer avseende utförande eller exakta antikroppar, antigener eller procedurer som visats och beskrivits, eftersom uppenbara modifikationer och ekvivalenter är givna för fackmannen på området, och uppfinningen begränsas därför endast av omfatt- ningen av bilagda patentkrav under tillämpning av ekvivalent- doktrinen. 1 azoozzo-2 10 REFERENCES 1. 10.

Anstee, D.J.: Characterization of human blood group alloantigens. Monoclonal antíbodies in clinical medicine.

(Ed. McMichael, A.J; Pabre, J.W. Academic Press, London 1982). p. 237-249.

Voak, D.; Sacks, S.; Alderson, T.; Takei, F.; Lennox, E Jarvis, JJ; Milsteín, C.; Darnborough, J.: Monoclonal anti-A from a hybrid-myeloma: Evaluation as a blood groupíng reagent. Vox Sang. šgz 134-140(1980).

Sacks. S.H.; Lennox, E.S.: Monoclonal anti-B as a new blood-typing reagent. Vox Sang. 10: 99-104 (1981).

Edelman, L.; Rouger, Ph.; Dionel, Ch.; Garchon, H.; Bach, -; .J.F.; Reviron, J.; Salmon, Ch.: Thermodynamic and immuno- logical properties of a monoclonal antíbody to human blood group A. Immunology ii: S49-S54 (1981).

Bundle, D.R.; Gidney, M.A.J.; Kassam, N.; Raisur Rahman, A.F.: Hybrídomas specific for carbohydratesk Synthetic human blood group antigens for the production, selection, and characterization of monoclonal typing reagents. J. Immunol. ¿gg= avs-ssz (1982). - ' ' Majdic, 0.; Knapp, W.; Vetterlein, M.; Mayr, W.R.; Speiser, P.: Hybridomas secreting monoclonal antibodies to human group A erythrocytes. Immunobiology l§§: 226-227 (1979).

Voak, D.; Lennox, E.; Sacks, 5.; Milstein, C.; Darnborough, J.: Monoclonal anti-A and anti-B: Development as cost- effective reagents. Med. Lab. Sci. šgz 109-122 (1982).

Stähli, C.; Staehelin, T.; Miggíano, V.; Schmidt, J.; Häring, P.: High frequencies of antigen-specific hybridomas: Dependence on immunization parameters and prediction by spleen cell analysis. J. Immunol. Meth. §2: 297-304 (1980).

Dodge, J.T.; Mitchell, C.; Hanahan, 0.J.: The preparation_ and chemical characteristics of hemoglobin-free ghosts of human erythrocytes. Arch. Biochem. Biophys. 100: 119-130 (1963). ' Nowínski, R.C.: Lostrom, M.E.; Tam, M.R.; Stone, M.R.: Burnette, W.M.: The isolatíon of hybrid cell lines producing monoclonal antibodies against the p15(E) protein of ecotro- pic murine leukemia. Virology gå: lll-126 (1979). 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. zo, 21. 22. 8300320-2 ,TT_ e Kennett, R.H.: Monoclonal antibodies (Ed Kennett, R.H.; McKearn, T.J.; Bechtol, K.B.) Plenum Press, New York 1980. p 365-367.

Fazekas de St. Groth, S.; Scheidegger, D.: Production of monoclonal antibodies: Strategy and tactícs. J. Immunol.

Meth. §§: 1-21 (1980).

Engwall, E.; Perlman, P.: Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA. III. Quantitation of specific antibodies by enzyme- labeled anti-immunoglobulin antigen-coated tubes. J Immunol. ;gg= 129-135 (1912).

Ouchterlony, Ö.: Diffusion-in-gel methods for immunological analysis I. Progr. Allergy §: 1-78 (1958).

Messeter, L.; Löw, B.: Automated blood grouping of patients and blood donors using Groupamatic 360 S and a separate mini- computer. Vox Sang. šåz 116-123 (1977).

Race, R.R.; Sanger, R.: Blood Groups in Man. Sth Ed. (Black- well, Oxford 1968). p. 23.

European Agreement on the exchanges of blood-grouping reagents. European Treaty Series Nzo 39 (Council of Europe, Strasbourg, 1962). _ _ Gooi, H.C.; Feizi, T.E Natural antibodies as contaminants of hybrídoma products. Biochem. Biophys. Res. Comm. 196: 539-545 (19szj.

Lennox; 5.: Personal communication.

Hughes-Jones, N.C.; Polley, M.J.; Telford, R.; Gardner, B.; Kleínschmídt, G.: Optimal conditions for detecting blood group antibodíes by the antiglobulín test. Vox Sang. 2: ses-395 (1964). “ I Elliot, M.; Bossom, E.; Dupuy, M.E.; Masouredis, S.P.: Influence of ionic strength on the serologíc behaviour of red cell isoantíbodies. Vox Sang. 9: 396-414 (1964).

Moore, H.C.; Sipes, B.R.: The effects of ionic strength on antibody uptake with special reference to the antiglobulin test. Ortho second internat. symp. on "The nature and signi- ficance of complement activatíon", Raritan. N.J. 1976. szoozzo-2 12 Gofiuxmflnfi Hævmouflhmnmhuna mH dowuxøfififi cnusxnsw. um ñoumwov u:«>:fiu« m.u:sønm wuoHnEou=H ñ=fivm m.fl::mHm oumflmsou zoHw=H _ .MW HH w: QQH _ H Nm HH m: OCH _ H H» HH wa OCH H om HH wa om QN zoHw=H H _ HH HH He H.° . HH zøHw=H . » m HH M: °m\He H.Q HH He H.° um o :É :X u~% Hmfiflmuh Aammcmumnnmv Houmoon_ mnwmfluæmxzm hmflfio Hwfiflmuv mcnnmøn äwëflnmï wmë ufiflæwmficzëëwm nwoflmmm mflflunfim _mmQ_ «s@Humm=@Hw»H.Hu° -mw=HHømH==esH .H HHmm .QBHÜAMWUMWÉWMQ .fi HNMOHMQL .PS1 H Émnmu mm .N 2 N E Nää N .PNNNONVPNQNN När N<+P< PN W 3 1 NNP Nä N __ _ Nä 2 Nää NP 3 N.P.N Nfüë P nÛu P. Pä N-Üë E NNN Nä N .QÉONVPNOPN NPÉrNNPN Pä »W _ P .N . N zèpâ P NNN QNNN N ._ N . N Nää P NNP Nä N _. N.N Nää N N. PN _ Näää N 243.32 PN äP Nä N .Nåmøš N -PëB NNE. < P.N o NP Pwz N __ N; N PNz N ÉBEÉLN. Pé 3 P. P. N NANE. N NN Nä P Näpwâäm P. N 1 PPSPTNPE NN N.N.N N âP Nää P __ N.N N NN Pwz P Nâäâää P . N.

- Nä P __ N.P PPäíflê P INN QNNNN P ._ N. P Näää P Pé. P Präå N NN Nä P __ P.. P 15 ïflå N QNN Nä P __ N. P o NPP PNz N ._ N.P P. P. P NPÉTNNÉ N NN PNz P mâeåäurPfl. P . P .Hmcog wwENNmPnwsHmwmEms _ PES mnænwcmßnm umufiuflmwumaw flofiumfipøflwwßäon H Eowflnêí nïuøu « maøaum .HmÉBQ NE. mfifioopom nmcofiumfiuøfimwmeæm Eåfimom Eowfinnzm Haag fimuoæ äofioàå :mmfihmmflššw :vwfiuå cofiwzm .vwpfismmnmcofimsw å.. wfizflmumcåešw .Ü .ämm/NH azoozzo-z í TABEy. 111, 14 Agg1ut§nationsreaktioner med rödawblodkrggpgr av_o1ika_ABD¿grupper.

Al A2 A, AlB B B. . 0 ._ navelsiräng navelsträne Anti-A 1.1.1* 4 (+) to 1 (+) to 4 4 neg neg neg 1.4.1* 4 4 3 to 4 4 nog neg neg 2.3.2** 4 4 4 4 neg neg neg Polyclonal I 4 4 _ 4 -4 neg neg neg Polyclonal II 4 4 3 to 4 4 neg _neg neg Anti-B -3.1.1* neg .neg neg 4 4 4- neg 6.1.1* neg neg neg 4 4 4 nego Polyclonal I neg neg neg 4 _ 4' 4 neg .Polyclonal II neg neg neg I 4 4 4 neg Anti-A,B_ s. 1. zH* 4 4 4 ' 4 4 4 neg 6.1.5** 4 4 ¶ 4 '.4 4 4 neg Polyclonal I 4 44 4 4 4 4 neg Polyclonal II 4 4 4 4 4 4 neg * Ascítes, u;snädd.1:2S0 ** Supernatant _ *** Ascítes, uÉ$Pädfi 1:200 8300320-2 15 WW W W W W W W W W W W W> = WW W W W W W W W W W W > = WW W W W W W W W. W W W >W = WW W W W .W W W W W W W WWW = WW W W W W W W W W W W WW = WW W W W W W W W W W W W WW=°Wu>W°W WW W W W W W W W W. W W W.W.W W.<-WW=« WW W W W W W W W W W W W> = WW W W W W W W W W W W > = WW W W W W W W .W W W W >W = WW W W W W W W W W W W WWW = WW W W W W W W W W W .W WW = WW W W W .W W. W W W W W W WWWWWUWWWW .WW W W W W W W W W .W W W.W.W WW .W W W W W. W W W W W W.W.W <-WW=< WWWWW WW. W W W W W W W W W _ nmGowWmn|m«< QW nmnw WoW>uoW:u>nw. vmä WmcoWWxwwWm:oWuæ:Wu:Hww< .wa A4mm a3oo32o-2 16 øofluxumn mm>m n 3 wvcwumhøønsufiww umucæfim a ao: man mo: mo: ao: uu: wfi *H m fiw fløcøfluæflvm .~+v *^+v wo: wo: mo: wo: *~ *~ m H Hm=oflu>Hom L ma: wa: ...H ...H ...Tv ma: ...TL q mÄÄ.. . m..<.||||.É=< mo: uu: man wa: wa: mo: . mv: wo: w MH Hmnofiuæflom uu: wa: won, wo: uu: wa: mo: wo: e ~ Hucofiuæfiom mo: *ñ+v man wo: won um: wo: .won Q H.fl.ø uu: uu: um: mw: man man man won Q _ .a.H.n . 93.2. mo: uu: wo: uu: mw: mo: wo: wo: *fl+U HH.fim:oHuaflom wo: wo: wa: wo: _. ua: uu: wo: 3 *H H Hncofiuæflom uu: man §fi+U man man man . § H + H *N .~.n.N wa: mur §ñ+v mm: aan. uu: *n+v *~+v_ fw H.e.H í. 73.2 mm mm få B< E6< e< x< å. my... . .. mwu>m uoë :o«um:«u:Hum< .> ;¿mm .huuCmfiHm>|Om< 8300320-2 17 O NW mm mß«__ _o«« o Q N m w m op Nßm m< Q « q N m ¶ _.N_ m Q m cp w ß mmwm < muw o~"~ cvnp øm"~_ own? ocownw m.~.ø _._.m ~.<.~ .fiuxfiom .fluæfiom xflfimm umufiswma mmänw m.<-fi~=< m-«»=< <-fi~=< m.<-H»=< m|«p=< <-fi~=< @v«»«~@@Uu< -wofim wocofiu wcwwwm» mflmnoflxocoz mcowæønnfiuøm -xmmfl wxfiw |«uomm|:oz nonowwxmon wwm>w .møwøm Eommm mwflmmmun Hm> ømmdmwmmm .mhmmfiøcæ mflmdofixofloå suo møowmon .~> Aqmm<æ mfifimfimwøäëox >u w=w:wcm>dm Howøs wnfi:Empmmnmm:Hw|om< wmhmmfiuwsousm >m wmfiwwmmëmw 8300320-2 ' TABELL VII- Agglurinatidnsreakc:°ß§r¶meäffö§§h1¿flkIQDnaf fråfi ¶Balh/c~möss.

Mus nummer_ Reagens 1 2 ' 3 4 5 . w Anti-A ¶ 1.2.1 -- ¶ 9- - - ¶ - Polyclonal I -_ ' - - -än - Anti-B 3.1.1 - f -_ f' - ' ¶ - Polyçlonal I 1* 1* . 1* 1* 1* Anti-A,B 6.1.5 - - - - - Polyclonal I 2* 2* 2* 2* 2* * ß1anda: fält-uppträdande

Claims (7)

azoozzo-2 PATENTKRAV

1. Användning för blodgruppsbestämning baserad på haemag- glutinationsreaktion av en vattenbaserad beredning, vilken in- nehàller monoklonala antikroppar aktiva gentemot cellbundna antigener, speciellt antigener av humana röda blodkroppar, jämte ett lösligt salt, k ä n n e t e c k n a d därav, att saltkon- centratíonen i beredningen ligger inom intervallet från 250 mmol/1 till 650 mmol/l.

2. Användning enligt krav 1, vari nämnda koncentration ligger inom intervallet från 350 mmol/l till S50 mmol/1.

3. Användning enligt krav 1 eller 2, vari det lösliga saltet är utvalt bland salterna av alkalí- och jordalkalimetaller- na. _

4. Användning enligt krav 3, vari saltet är utvalt bland alkalimetallerna, företrädesvis med en halogenid som motjon.

S. Användning enligt krav 4, vari saltet är natrium- eller kaliumklorid.

6. Användning enligt något av föregående krav, vari de monoklonala antikropparna är riktade mot antigener av blodgrupp A, B eller A,B.

7. Användning enligt krav 1 eller 2 i form av en vatten- lösning, vari det lösliga saltet är natriumklorid.