DE69434223T2 - In der Behandlung von IL4 auslösenden Krankheiten nützliche rekombinante IL4-Antikörper - Google Patents

In der Behandlung von IL4 auslösenden Krankheiten nützliche rekombinante IL4-Antikörper Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen das Gebiet der Fusionsproteine, und Proteine, die bei der Behandlung und Diagnose von Zuständen von Nutzen sind, die von IL4 und einer übermäßigen IgE-Produktion ausgelöst werden, und spezifischer chimäre und humanisierte IL4-Antikörper.
  • Atopische allergische Erkrankungen reichen von relativ leichten wie jahreszeitlicher Rhinitis und Bindehautentzündung zu ernsteren wie atopischer Dermatitis und atopischem Asthma bis zu lebensbedrohenden Erkrankungen wie anaphylaktischem Schock. Verknüpft sind diese Zustände über die Immunantwort des Körpers gegen Allergene, wobei diese Antwort die Produktion von Immunglobulin E (IgE)-Antikörpern in genetisch prädisponierten Individuen involviert (Atopie). Die Inhibierung der IgE-Produktion ist seit langem ein Ziel bei der spezifischen Immuntherapie der allergischen Erkrankung unter Verwendung von desensibilisierenden Impfstoffen. In den letzten Jahren jedoch wurde die Sicherheit und Wirksamkeit der Impfstofftherapie in Frage gestellt, der Wunsch nach einer Reduktion der IgE-Niveaus ist jedoch nicht verschwunden.
  • Interleukin 4 (IL4) ist ein Proteinmediator im Lymphsystem. Die Untersuchung der Lymphocyten von atopischen Individuen hat als Reaktion auf Stimulierung die Anwesenheit einer größeren Zahl an T-Lymphocyten mit der Fähigkeit der Sezernierung von IL4 als normal gezeigt, und als Folge der Stimulierung wurden große Mengen an IL4 sezerniert.
  • Es wurde gefunden, daß anti-IL4-Antikörper IgE inhibiert, nicht aber IgG1 oder IgG2a [Finkelmann et al, Ann. Rev. Immunol., 8: 303 (1990)] und die Produktion von IL5 sezenierenden T-Zellen [Maggi et al, J. Immunol., 148: 2142 (1992)]. Weiterhin legen neue Ergebnisse nahe, daß IL4 die Ansammlung von Eosinophilen in Geweben beeinflussen könnte. Vgl. z. B. Tepper et al, Cell, 62: 457 (1990); Tepper et al, Cell, 57: 503 (1989)].
  • Im Stand der Technik besteht ein Bedarf an einem IL4-Antagonisten hoher Affinität, der die Entzündung durch die Eosinophilen sowohl durch die Reduzierung der Proliferation der IL5 sezenierenden Zellen als auch durch die Inhibition eines Adhärenzmechanismus reduzieren würde, wodurch sich Eosinophile in Geweben anreichern können, und der verwendet werden kann, um allergische Reaktionen zu behandeln, verhindern oder diagnostizieren.
  • Die Verwendung von biotinylierten Antigenen für die Durchmusterung von Hybridomkulturen nach monoclonalen Antikörpern mit hoher Affinität ist beschrieben in Hybridoma 12, 475, 8/93.
  • Zwei monoclonale Antikörper mit hoher Affinität gegen menschliches IL-4 sind in der Japanischen Patentanmeldung Nr. JP-A-3187395 (Ono Yakuhin Kogyo Corp.) offenbart. Die hauptsächliche Verwendung dieser Antikörper wurde in einem Immuntest für menschliches IL-4 beschrieben.
  • Die internationale Anmeldung Nummer WO 93/17106 beschreibt die Clonierung und Expression von monoclonalen Antikörpern gegen menschliches IL-4 für die Verwendung in Kits und Verfahren für den Nachweis, die Messung und die Immunreinigung von menschlichem IL-4 ebenso wie für die Behandlung von Krankheiten, die mit IL-4 in Zusammenhang stehen. Wie in Tabelle 5 auf Seite 66 der WO 93/17106 gezeigt, haben die nativen und humanisierten monoclonalen Antikörper, die in diesem Dokument beschrieben sind, eine Bindungsaffinität zu menschlichem IL-4, die durch einen Kd von bestenfalls etwa 1 × 10–9 M charakterisiert ist.
  • Die EMBL-Datenbank, Zugangs-Nr. M36222; Europäische Patentanmeldung Nr. EP-A-327000 (Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute); und Geneseq. Zugangs-Nr. R66143, R66144 und Q04039 offenbaren die SEQ ID Nr. 22, 17, 16, 18 bzw. 15 der vorliegenden Patentanmeldung. Diese Offenbarungen betreffen jedoch nicht monoclonale Antikörper gegen IL-4.
  • Die Erfindung wird durch den Inhalt der Ansprüche 1–33 definiert.
  • In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Fusionsprotein bereit, das eine Bindungsaffinität für menschliches Interleukin-4 hat, das die Komplementarität-bestimmenden Bereiche (CDRs), die von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper (MAb) abstammen, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist, und einen Fusionspartner umfaßt, bei dem mindestens eine und vorzugsweise alle Komplementarität-bestimmenden Bereiche (CDRs) des ersten Fusionspartners durch CDRs des nicht-menschlichen monoclonalen Antikörpers (MAb) ersetzt sind. Der nicht-menschliche, neutralisierende monoclonale Antikörper kann ausgewählt sein aus der Gruppe, die aus 3B9 und 6A1 besteht, wie vollständiger in der Ausführlichen Beschreibung beschrieben. Vorzugsweise ist das Fusionsprotein operativ auch mit einem zweiten Fusionsprotein verknüpft, das die gesamte oder einen Teil einer konstanten Immunglobulinkette umfaßt.
  • Die vorliegende Offenbarung beschreibt CDRs, die von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper (MAb) abstammen, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist, und Nucleinsäuremoleküle, die solche CDRs codieren.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung humanisierte Antikörper bereit, die mindestens eine und vorzugsweise sechs die Komplementarität-bestimmenden Bereiche (CDRs) haben, die von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper (MAb) abstammen, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als 2 × 10–10 für menschliches IL4 ist.
  • In noch einem anderen Aspekt wird ein chimärer Antikörper bereitgestellt, der konstante Regionen der menschlichen schweren und leichten Kette enthält und variable Regionen der schweren und leichten Kette, die von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper (MAb) abstammen, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel bereit, die eines (oder mehrere) der vorstehend beschriebenen Fusionsproteine oder MAbs (d. h. humanisiert, chimär, usw.) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.
  • Die vorliegende Offenbarung beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von und/oder Vorbeugung vor allergischen Zuständen beim Menschen durch Verabreichung einer wirksamen Menge des Arzneimittels der Erfindung an den Menschen.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren und dafür nützliche Komponenten bereit, die bei der rekombinanten Produktion der Fusionsproteine, MAbs (d. h. humanisiert, chimär, usw.), den CDRs davon, eines Fab, oder F(ab)2 oder eines Analogon davon von Nutzen sind, welches von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper (MAb) abstammt, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist. Diese Komponenten umfassen isolierte Nucleinsäuresequenzen, die diese codieren, ersetzt durch CDRs von dem nicht-menschlichen monoclonalen Antikörper (MAb). Der nicht-menschliche, neutralisierende monoclonale Antikörper (MAb) kann 6A1 sein, der von dem Hybridom ECACC 93100620 produziert wird, wie vollständiger in der Ausführlichen Beschreibung beschrieben. Vorzugsweise ist das Fusionsprotein funktionell auch mit einem zweiten Fusionsprotein verknüpft, das das gesamte oder einen Teil einer konstanten Kette eines Immunglobulins umfaßt.
  • In einem verwandten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Fusionsproteine bereit, die CDRs umfassen, die von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper (MAb) abstammt, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist, und Nucleinsäuremoleküle, die solche CDRs codieren. Dem entsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem zweiten Aspekt ein Fusionsprotein bereit, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus:
    • (a) HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnPro-SerLeuLysSer: SEQ ID NR: 24, und
    • (b) ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: SEQ ID NR: 26
    und einem Fusionsprotein, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus:
    • (a) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: SEQ ID NR: 28 und
    • (b) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: SEQ ID NR: 20.
  • In einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das ein Fusionsprotein codiert, wie es in Anspruch 1 definiert ist, und das einen Komplementarität-bestimmenden Bereich (CDR) der schweren Kette eines Immunglobulins umfaßt, dessen Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus:
    • (a) ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC: SEQ ID NR: 21
    • (b) CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AACCCATCCCTGAGC: SEQ ID NR: 23
    • (c) AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC: SEQ ID NR: 25
    • (d) ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC: SEQ ID NR: 54
    • (e) CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC: SEQ ID NR: 55, und
    • (f) CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT: SEQ ID NR: 56
  • In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Nucleinsäuremolekül bereit, das ein Fusionsprotein codiert, wie es in Anspruch 1 definiert ist, und das einen Komplementarität-bestimmenden Bereich (CDR) der leichten Kette eines Immunglobulins umfaßt, dessen Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus:
    • (a) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC: SEQ ID NR: 53
    • (b) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: SEQ ID NR: 19, und
    • (c) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG: SEQ ID NR: 27.
  • In einem andern Aspekt stellt die Erfindung humanisierte Antikörper bereit, die mindestens eine und vorzugsweise sechs die Komplementarität-bestimmenden Bereiche (CDRs) haben, die von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper (MAb) abstammen, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem fünften Aspekt einen humanisierten Antikörper bereit, der eine schwere und eine leichte Kette enthält, wobei der Antikörper durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist, wobei die Gerüstbereiche der schweren und leichten Ketten von mindestens einem ausgewählten menschlichen Antikörper abgeleitet sind und die Aminosäuresequenzen der Komplementarität-bestimmenden Bereiche von jeder Kette von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper abstammen, der für menschliches IL4 spezifisch ist und der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist. Bei diesem Aspekt ist der Antikörper gegebenenfalls mit einem Effektorwirkstoff verbunden ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einem Nicht-Protein-Trägermolekül, Polystyrol und Plastikkügelchen besteht.
  • In noch einem anderen Aspekt wird ein chimärer Antikörper bereitgestellt, der konstante Regionen der menschlichen schweren und leichten Kette und variable Regionen der schweren und leichten Kette enthält, die von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper (MAb) abstammen, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist. Dementsprechend wird in einem sechsten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein chimärer Antikörper bereitgestellt, der eine schwere und eine leichte Kette enthält, wobei der besagte Antikörper durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als etwa 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist, wobei die Aminosäuresequenzen der die Komplementarität-bestimmenden Bereiche von der schweren Kette und der leichten Kette von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper abstammen, der für menschliches IL4 spezifisch ist und der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als etwa 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist.
  • In noch anderen Aspekten stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel bereit, die eines (oder mehrere) der vorstehend beschriebenen Fusionsproteine oder MAbs (d. h. humanisiert, chimär, usw.) und einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem siebten Aspekt ein Arzneimittel bereit, das ein Fusionsprotein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung oder den Antikörper gemäß dem fünften oder sechsten Aspekt der Erfindung umfaßt, und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Im achten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung das Fusionsprotein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung oder den Antikörper gemäß dem fünften oder sechsten Aspekt der Erfindung für die Verwendung bei der Behandlung von Allergien und anderen Zuständen bereit, die mit einer Überschußproduktion von IgE in einem Menschen einhergehen.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren für die Behandlung von und/oder Vorbeugung vor allergischen Zuständen im Menschen durch Verabreichung einer wirksamen Menge des Arzneimittels der Erfindung an den Menschen.
  • In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung Verfahren für die rekombinante Produktion von und Komponenten bereit, die nützlich sind bei der rekombinanten Produktion von Fusionsproteinen, MAbs (d. h. humanisiert, chimär, usw.), der CDRs davon, einem Fab oder F(ab)2 oder einem Analogon davon, welches von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper (MAb) abstammt, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist. Diese Komponenten umfassen isolierte Nucleinsäuresequenzen, die diese codieren, rekombinante Plasmide, die die Nucleinsäuresequenzen unter der Kontrolle von ausgewählten regulatorischen Sequenzen enthalten, die in der Lage sind, ihre Expression in Wirtszellen zu steuern, und Wirtszellen (vorzugsweise vom Säuger), die mit den rekombinanten Plamiden transfiziert sind. Das Produktionverfahren beinhaltet die Züchtung einer transfizierten Wirtszelllinie der vorliegenden Erfindung unter solchen Bedingungen, daß ein Antikörper, vorzugsweise ein humanisierter Antikörper, in den Zellen exprimiert wird, und die Isolierung des exprimierten Produkts. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem neunten Aspekt eine isolierte Nucleinsäuresequenz bereit, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus:
    • (a) einer Nucleinsäuresequenz, die das Fusionsprotein gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung codiert;
    • (b) einer Nucleinsäuresequenz, die zu (a) komplementär ist;
    • (c) einem Fragment oder Analogon von (a) oder (b), das ein Protein codiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es für menschliches Interleukin-4 eine Bindungsaffinität hat, die durch eine Kd von 2 × 10–10 M oder weniger charakterisiert ist; wobei die besagte Sequenz gegebenenfalls eine Restriktionsstelle enthält.
  • Bei diesem Aspekt kann die Sequenz, die das Fusionsprotein codiert, in geeigneter Weise die Nucleinsäuresequenz von 5, SEQ ID NR: 13, oder die Nucleinsäuresequenz von 4, SEQ ID NR: 11, enthalten.
  • Die vorliegende Offenbarung beschreibt eine isolierte Nucleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus:
    • (a) einer Nucleinsäuresequenz, die eine die Komplementarität-bestimmenden Bereich (CDR) codiert, wobei der CDR von einem neutralisierenden murinen monoclonalen Antikörper erhalten wird, der für menschliches Interleukin-4 spezifisch ist und der eine Dissoziationskonstante von 2 × 10–10 M oder weniger hat;
    • (b) einer Nucleinsäuresequenz, die zu (a) komplementär ist; und
    • (c) einem Fragment oder Analogon von (a) oder (b), das ein Protein codiert, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es für menschliches Interleukin-4 eine Bindungsaffinität hat, die durch eine Kd von 2 × 10–10 M oder weniger charakterisiert ist.
  • Die Sequenz kann in geeigneter Weise aus der Gruppe von codierenden Sequenzen für die die Komplementarität-bestimmenden Bereiche von der schweren Kette ausgewählt werden, die besteht aus:
    • (a) ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC: SEQ ID NR: 21
    • (b) CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC: SEQ ID NR: 23
    • (c) AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC: SEQ ID NR: 25
    • (d) ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC: SEQ ID NR: 54
    • (e) CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAA CCG AGC CTG AAA TCC: SEQ ID NR: 55, und
    • (f) CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT: SEQ ID NR: 56
    oder aus der Gruppe von codierenden Sequenzen für die die Komplementarität-bestimmenden Bereiche von der leichten Kette ausgewählt werden, die besteht aus:
    • (a) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC: SEQ ID NR: 53
    • (b) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: SEQ ID NR: 19, und
    • (c) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG: SEQ ID NR: 27.
  • In weiteren Aspekten stellt die Erfindung ein rekombinantes Plasmid bereit, das die Nucleinsäuresequenz gemäß dem neunten Aspekt der Erfindung umfasst, und eine Wirtszelle, die mit dem rekombinanten Plasmid entsprechend transfiziert ist.
  • In einem 13. Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Produktion eines humanisierten Antikörper bereit, der für menschliches Interleukin-4 spezifisch ist, welches die Züchtung einer Zelllinie umfaßt, die mit dem rekombinanten Plasmid unter der Kontrolle von ausgewählten regulatorischen Sequenzen transfiziert ist, die in der Lage sind, die Expression davon in den Zellen zu steuern.
  • In noch einem anderen Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren für die Diagnose von Allergien und anderen Zuständen umfasst, die mit einer Überschußproduktion von Immunglobulin E in einem Menschen einhergehen, welches das Inkontaktbringen einer Probe von biologischer Flüssigkeit mit den Fusionsproteinen, MAbs (d. h. humanisiert, chimär, usw.) und Fabs der vorliegenden Erfindung umfaßt und das Testen auf das Eintreten der Bindung zwischen dem Fusionsprotein, MAb oder Fab und menschlichem Interleukin-4. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem 14. Aspekt ein Verfahren für die Diagnose von Allergien und anderen Zuständen bereit, die mit einer Überschußproduktion von Immunglobulin E in einem Menschen einhergehen, welches das Inkontaktbringen einer Probe von biologischer Flüssigkeit mit einem Antikörper umfaßt, der durch eine Dissoziationskonstante von etwa 2 × 10–10 M oder weniger für menschliches IL4 charakterisiert ist, und das Testen auf das Eintreten der Bindung zwischen dem monoclonalen Antikörper und menschlichem Interleukin.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt auch ein Verfahren für die Durchmusterung auf monoclonale Antikörper, die einen hohen Titer für menschliches Interleukin-4 haben, welches umfaßt: (a) die Herstellung einer Hybridomzelllinie, die durch die Sezernierung eines monoclonalen Antikörpers gegen menschliches Interleukin-4 charakterisiert ist; und (b) Durchmusterung der Hybridomzelllinie mit Aldehyd-gekoppeltem menschlichem Interleukin-4 oder biotinyliertem menschlichem Interleukin-4. Vorzugsweise wird die Hybridomzelllinie mit biotinyliertem menschlichem Interleukin-4 gesucht. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem 15. Aspekt ein Verfahren für die Durchmusterung auf monoclonale Antikörper bereit, die durch eine Dissoziationskonstante von etwa 2 × 10–10 M oder weniger für menschliches IL4 charakterisiert sind, welches umfaßt:
    • a) Herstellung einer Hybridomzelllinie, die durch die Sezernierung eines monoclonalen Antikörpers gegen menschliches Interleukin-4 charakterisiert ist; und
    • b) Durchmusterung der Hybridomzelllinie mit Aldehyd-gekoppeltem menschlichem Interleukin-4.
  • Es wird auch ein neutralisierender MAb, der eine hohe Affinität für IL4 hat, ein Fab-Fragment oder F(ab')2-Fragment davon beschrieben, produziert durch Durchmusterung einer Bibliothek von Hybridomprodukten mit Aldehyd-gekoppeltem menschlichem Interleukin-4 oder biotinyliertem menschlichem IL4. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem 16. Aspekt einen neutralisierenden monoclonalem Antikörper bereit, der durch eine Dissoziationskonstante von etwa 2 × 10–10 M oder weniger für menschliches Interleukin-4 charakterisiert ist, erhältlich durch Durchmusterung einer Bibliothek von Hybridomprodukten mit Aldehyd-gekoppeltem menschlichem Interleukin-4.
  • In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung neutralisierende monoclonale Antikörper des Nagers, die spezifisch für menschliches Interleukin-4 sind und die eine Bindungsaffinität haben, die durch eine Dissoziationskonstante von etwa 2 × 10–10 M oder weniger charakterisiert ist. Exemplarisch für solche monoclonalen Antikörper ist der MAb, 6A1 der Ratte und andere MAbs, die dieselben identifizierenden Charakteristika haben (d. h. an dasselbe/dieselben Epitop(e) binden wie 6A1 mit einer Spezifität für menschliches IL4 und einer Dissoziationskonstante von etwa 2 × 10–10 M oder weniger). Dementsprechend stellt die Erfindung in einem 17. Aspekt einen neutralisierenden monoclonalen Antikörper des Nagers bereit, der spezifisch für menschliches Interleukin-4 ist und der eine Bindungsaffinität hat, die durch eine Dissoziationskonstante von etwa 2 × 10–10 M oder weniger charakterisiert ist. Bei diesem Aspekt kann der Nager in geeigneter Weise eine Maus sein, in welchem Fall der monoclonale Antikörper in geeigneter Weise die Aminosäuresequenz der leichten Kette von SEQ ID NR: 2 und die Aminosäuresequenz der schweren Kette von SEQ ID NR: 4 umfaßt. In einer anderen Ausführungsform kann der Nager eine Ratte sein, in welchem Fall der monoclonale Antikörper in geeigneter Weise die Bindungsspezifität für menschliches IL4 des Antikörpers hat, der von dem Hybridom EC ACC 93100621 produziert wird.
  • Im 18. Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Hybridomzelllinie bereit, die einen Antikörper gemäß dem 17. Aspekt produziert. Das Hybridom EC ACC 93100621 ist ein weiterer Aspekt der Erfindung.
  • Diese Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind weiterhin in der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon beschrieben.
  • 1 [SEQ ID NR: 1 und 2] zeigt den variablen Bereich der leichten Kette (Aminosäuren 21–132) für den murinen IL4-Antikörper 3B9 und den chimären menschlichen/murinen Antikörper 3B9 ebenso wie die native Signalsequenz (Aminosäuren 1–20). Die unterstrichen Teile zeigen die CDRs [SEQ ID NR: 15 und 16; SEQ ID NR: 17 und 18; SEQ ID NR: 19 und 20].
  • 2 [SEQ ID NR: 3 und 4] zeigt den variablen Bereich der schweren Kette (Aminosäuren 20–140) des murinen 3B9 und die native Signalsequenz (Aminosäuren 1–19). Die unterstrichen Teile zeigen die CDRs [SEQ ID NR: 21 und 22; SEQ ID NR: 23 und 24; SEQ ID NR: 25 und 26].
  • 3 [SEQ ID NR: 9 und 10] zeigt den variablen Bereich der schweren Kette (Aminosäuren 20–141) des chimären menschlichen/murinen Antikörpers 3B9 und seine Signalsequenz (Aminosäuren 1–19, SEQ ID NR: 5 und 6). Die unterstrichenen Teile zeigen die CDRs, abgeleitet von 3B9 [SEQ ID NR: 21 und 22; SEQ ID NR: 23 und 24; SEQ ID NR: 25 und 26].
  • 4 [SEQ ID NR: 11 und 12] zeigt den variablen Bereich der schweren Kette (Aminosäuren 20–141) des humanisierten Antikörpers 3B9 und eine Signalsequenz (Aminosäuren 1–19, SEQ ID NR: 5 und 6). Die unterstrichen Teile zeigen die CDRs, abgeleitet von 3B9 [SEQ ID NR: 54 und 22; SEQ ID NR: 55 und 24; SEQ ID NR: 56 und 26].
  • 5 [SEQ ID NR: 13 und 14] zeigt den variablen Bereich der leichten Kette (Aminosäuren 21–131) des humanisierten Antikörpers 3B9 und eine Signalsequenz (Aminosäuren 1–20, SEQ ID NR: 7 und 8). Die unterstrichenen Teile zeigen die CDRs, abgeleitet von 3B9 [SEQ ID NR: 53 und 16; SEQ ID NR: 17 und 18; SEQ ID NR: 27 und 28].
  • 6A [SEQ ID NR: 5 und 6] ist eine Signalsequenz für die schwere Kette, die nachstehend in Beispiel 4 verwendet wird.
  • 6B [SEQ ID NR: 7 und 8] ist eine Signalsequenz für die leichte Kette, die nachstehend in Beispiel 4 verwendet wird.
  • 7. ist eine schematische Darstellung des Plamids pIL4chhc3-pcd, das verwendet wird, um eine chimäre schwere Kette gegen IL4 in Säugerzellen zu exprimieren. Das Plasmid enthält ein beta-Lactamasegen (BETA LAC), einen SV-40-Replikationsursprung (SV40), eine Cytomegalievirus-Promotorsequenz (CMV), eine Signalsequenz, die chimäre variable schwere Kette der SEQ ID NR: 9 und 10, eine konstante Region der menschlichen schweren Kette, ein Poly A-Signal vom Rinderwachstumshormon (BGH), einen Betaglobin-Promotor (beta glopro), ein Dihydrofolat-Reduktasegen (DHFR) und ein anderes Poly A-Signal der BGH-Sequenz in einem pUC19-Hintergrund.
  • 8 ist eine schematische Darstellung des Plamids pIL4chlc-pcdn, das verwendet wird, um den chimären variablen Bereich der leichten Kette gegen IL4 der SEQ ID NR: 1 und 2 in Säugerzellen zu exprimieren. Das Plasmid unterscheidet sich von dem der 7, indem es die chimäre variable Region einer leichten Kette statt der der chimären schweren Kette enthält, die konstante Region einer menschlichen leichten Kette und ein Neomycingen (Neo) zusätzlich zu DHFR.
  • 9 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pIL4hzhc-1-pcd, das verwendet wird, um den synthetischen variablen Bereich der schweren Kette gegen IL4 der SEQ ID NR: 11 und 12 in Säugerzellen zu exprimieren. Das Plasmid unterscheidet sich von dem der 7, indem es den humanisierten variablen Bereich einer schweren Kette enthält statt den der chimären schweren Kette.
  • 10 ist eine schematische Darstellung des Plasmids pIL4hz1c1-0-Pcn, das verwendet wird, um den humanisierten variablen Bereich der leichten Kette gegen IL4 der SEQ ID NR: 13 und 14 in Säugerzellen zu exprimieren. Das Plasmid unterscheidet sich von dem der 8, indem es den humanisierten variablen Bereich einer leichten Kette enthält statt den der chimären leichten Kette und nicht das DHFR-Gen codiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine Vielzahl an Antikörpern bereit, Fragmente von ihnen und Fusionsproteine, insbesondere humanisierte Antikörper, die durch Bindungspezifität von menschlichem IL4, eine neutralisierende Aktivität und eine hohe Affinität für menschliches IL4 charakterisiert sind, exemplifiziert in dem murinen MAb 3B9 und dem MAb 6A1 der Ratte. Diese Produkte sind in therapeutischen und pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung von durch IL4 vermittelten und durch IgE verursachten allergischen Reaktionen von Nutzen. Diese Produkte sind auch bei der Diagnose eines durch IL4 vermittelten Zustandes von Nutzen, indem man die Niveaus von zirkulierendem, endogenen IL4 im Menschen mißt (z. B. durch einen Enzym-verknüpften Immunadsorptionstest ELISA)).
  • I. Definitionen
  • „Fusionsprotein" betrifft ein Protein, das von einem Fusionsmolekül codiert wird und das durch Expression in einer ausgewählten Wirtszelle erhalten werden kann. Solche Fusionsproteine sind konstruierte Antikörper, d. h. chimäre oder humanisierte Antikörper oder Antikörperfragmente, denen die gesamte oder ein Teil der konstanten Immunglobulinregion fehlt, d. h. Fv, Fab oder F(ab)2 und dergleichen.
  • "Fusionsmolekül" betrifft eine Nucleinsäuresequenz, die die Komplementarität-bestimmenden Bereiche (CDRs) von einem nicht-menschlichen Immunglobulin codieren, die in einen ersten Fusionspartner inseriert sind, der die menschlichen variablen Gerüstsequenzen umfaßt. Gegebenenfalls ist der erste Fusionspartner funktionell mit einem zweiten Fusionspartner verknüpft.
  • "Erster Fusionspartner" betrifft eine Nucleinsäuresequenz, die eine menschliche Gerüstregion oder den variablen Bereich eines menschlichen Immunglobulins codiert, bei dem die nativen (oder natürlicherweise vorkommenden) CDRs durch die CDRs eines Spenderantikörpers ersetzt sind. Der menschliche variable Bereich kann die schwere Kette eines Immunglobulins sein, eine leichte Kette (oder beide Ketten), ein Analogon oder funktionelle Fragmente davon. Solche CDRs oder CDR-Bereiche, die innerhalb des variablen Bereichs von Antikörpern (Immunglobulinen) liegen, können mittels Verfahren bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Zum Beispiel offenbaren Kabat et al., [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4te Ausg. U.S. Department of Health and Human Sercives, National Institutes of Health (1987)] Regeln für die Lokalisierung von CDRs. Außerdem sind Computerprogramme bekannt, die bei der Identifikation von CDRs-Bereichen/Strukturen von Nutzen sind.
  • Der Ausdruck "hoher Titer" betrifft einen Antikörper, der eine hohe Bindungsaffinität hat, die durch eine Kd von gleich oder weniger als 2 × 10–10 M für menschliches IL4 charakterisiert ist.
  • Mit "Bindungsspezifität für menschliches IL4" ist ein hoher Titer (oder Affinität) für menschliches, nicht Rinder- oder murines IL4 gemeint.
  • "Zweiter Fusionspartner" betrifft eine andere Nucleotidsequenz, die ein Protein oder Peptid codiert, mit der der erste Fusionspartner im Rahmen oder gegebenfalls mittels einer herkömmlichen Linkersequenz fusioniert ist (d. h. funktionell verknüpft). Vorzugsweise ist es ein Immunglobulin. Der zweite Fusionspartner kann eine Nucleinsäuresequenz umfassen, die den gesamten konstanten Bereich desselben (d. h. homologen – das erste und das zweite Fusionsprotein stammen von derselben Quelle) oder eines zusätzlichen (d. h. heterologen) Antikörpers von Interesse codiert. Es kann die schwere Kette oder die leichte Kette eines Immunglobulins sein (oder beide Ketten als Teil eines einzigen Polypeptids). Der zweite Fusionspartner ist nicht beschränkt auf eine spezielle Immunglobulinklasse oder -isotyp. Außerdem kann der zweite Fusionspartner einen Teil des konstanten Bereichs eines Immunglobulins umfassen, wie er in einem Fab oder F(ab)2 gefunden wird (d. h. einen gesonderten Teil eines geeigneten menschlichen konstanten Bereichs oder Gerüstbereichs). Solch ein zweiter Fusionspartner kann auch eine Sequenz umfassen, die ein integrales Membranprotein codiert, das auf der äußeren Oberfläche der Wirtszelle exponiert ist, z. B. als Teil einer Phagenpräsentationsbibliothek, oder eine Sequenz, die ein Protein für den analytischen oder diagnostischen Nachweis codiert, z. B. Meerrettich-Peroxidase, β-Galactosidase, usw.)
  • Die Ausdrücke Fv, Fc, Fab oder F(ab)2 werden mit ihren normalen Bedeutungen verwendet (vgl. Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)).
  • Wie hier verwendet, beschreibt ein "konstruierter Antikörper" eine Art von Fusionsprotein, d. h. synthetischer Antikörper (d. h. chimärer Antikörper oder humanisierter Antikörper), bei dem ein Teil die variablen Domänen der leichten und/oder schweren Kette eines ausgesuchten Donorantikörpers ersetzt sind durch analoge Teile von einem oder mehreren Donorantikörpern, die spezifisch für das ausgewählte Epitop sind. Zum Beispiel können solche Moleküle Antikörper umfassen, die durch eine humanisierte schwere Kette charakterisiert sind, assoziiert mit einer nicht modifizierten leichten Kette (oder chimären leichten Kette), oder umgekehrt. Konstruierte Antikörper können auch durch Veränderungen der Nucleinsäuresequenzen charakterisiert sein, die die leichten und/oder schweren Gerüstbereiche der variablen Domäne des Akzeptorantikörpers codieren, um die Antikörperbindungsspezifität des Donorantikörpers zu erhalten. Diese Antikörper können den Ersatz von einem oder mehreren CDRs (vorzugsweise alle) des Akzeptorantikörpers durch CDRs von einem Donorantikörper umfassen, wie hier beschrieben ist.
  • Ein "chimärer Antikörper" betrifft eine Art von konstruiertem Antikörper, der natürlicherweise vorkommende variable Bereiche (leichte Kette und schwere Kette), die von einem Donorantikörper stammen, in Verbindung mit den konstanten Bereichen der leichten und schweren Kette enthält, die von einem Akzeptorantikörper abgeleitet sind.
  • Ein "humanisierter Antikörper" betrifft eine Art von konstruiertem Antikörper, bei dem die CDRs von einem nicht-menschlichen Donorimmunglobulin abgeleitet sind und die verbleibenden Immunglobulin-abgeleiteten Teile des Moleküls von einem (oder mehreren) menschlichen Immunglobulinen abgeleitet sind. Außerdem können den Gerüstbereich unterstützende Reste verändert werden, um die Bindungsaffinität zu bewahren (vgl. z. B. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029–10032 (1989), Hodgons et al., Bio/Technology 9: 421 (1991)).
  • Der Ausdruck "Donorantikörper" betrifft einen Antikörper (polyclonal, monoclonal oder rekombinant), der die Nucleinsäuresequenzen seiner variablen Bereiche, CDRs oder anderer funktioneller Fragmente oder Analoga davon zu einem ersten Fusionspartner beiträgt, um somit das Fusionsmolekül bereitzustellen und in exprimierten Fusionsproteinen mit der antigenen Spezifität und neutralisierenden Aktivitätscharakteristika des Donorantikörper zu resultieren. Ein Donorantikörper, der zur Verwendung in dieser Erfindung geeignet ist, aber kein Bestandteil von ihr ist, ist ein nicht-menschlicher neutralisierender monoclonaler Antikörper (d. h. murin), der als 3B9 bezeichnet wird. Der Antikörper 3B9 ist definiert als ein für menschliches IL4 spezifischer (d. h. er erkennt nicht Rinder- oder murines IL4) neutralisierender Antikörper des Isotyps IgG1 mit hohem Titer, der die DNA der variablen leichten Kette und die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NR: 1 und 2 und die DNA der variablen schweren Kette und die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NR: 3 und 4 auf einem geeigneten konstanten Bereich von murinem IgG aufweist.
  • Der Ausdruck "Akzeptorantikörper" betrifft einen Antikörper (polyclonal, monoclonal oder rekombinant), der zum Donorantikörper heterolog ist und der alle (oder einen Teil, vorzugsweise aber alle) Nucleinsäuresequenzen zum zweiten Fusionspartner beiträgt, die die Gerüstbereiche seiner schweren und/oder leichten Kette und die konstanten Bereiche seiner schweren und/oder seiner leichten Kette codieren. Vorzugsweise ist der Akzeptorantikörper eine menschlicher Antikörper.
  • "CDRs" sind definiert als die Aminosäuresequenzen des Komplementarität-bestimmenden Bereichs eines Antikörpers, welches die hypervariablen Bereiche der schweren und leichten Ketten eines Immunglobulins sind. Vgl. z. B. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4te Ausg. U.S. Department of Health and Human Sercives, National Institutes of Health (1987). Es gibt drei CDRs (oder CDR-Bereiche) der schweren Kette und drei CDRs (oder CDR-Bereiche) der leichten Kette im variablen Bereich eines Immunglobulins. Somit betreffen "CDRs", wie sie hier verwendet werden, alle drei CDRs der schweren Kette oder alle drei CDRs der leichten Kette (oder ggf. alle CDRs der schweren und der leichten Kette).
  • CDRs stellen die Mehrzahl der Kontaktreste für die Bindung des Antikörpers an das Antigen oder Epitop bereit. CDRs, die in dieser Erfindung von Interesse sind, sind abgeleitet von Sequenzen der variablen Bereiche der schweren und leichten Kette eines Donorantikörpers und umfassen Analoga der natürlicherweise vorkommenden CDRs, wobei die Analoga auch dieselbe Antigenbindungsspezifität und/oder Fähigkeit zur Neutralisation teilen oder behalten haben wie der Donorantikörper, von dem sie abgeleitet wurden.
  • Mit "Teilen der Antigenbindungsspezifität oder der Fähigkeit zur Neutralisation" ist zum Beispiel gemeint, daß obwohl MAb 3B9 durch ein gewisses Niveau an Antigenaffinität charakterisiert werden kann und ein CDR, der durch die Nucleinsäuresequenz von 3B9 in einer geeigneten strukturellen Umgebung codiert wird, eine höhere oder niedrigere Affinität haben kann, erwartet wird, daß die CDRs von 3B9 in solchen Umgebungen dennoch dasselbe/dieselben Epitop(e) wie 3B9 erkennen werden. Exemplarische CDRs der schweren Kette von 3B9 umfassen SEQ ID NR: 22; SEQ ID NR: 24; SEQ ID NR: 26; und exemplarische CDRs der leichten Kette von 3B9 umfassen SEQ ID NR: 16; SEQ ID NR: 18; und SEQ ID NR: 20.
  • "Funktionelles Fragment" ist eine partielle variable Sequenz der schweren oder leichten Kette (d. h. kleinere Deletionen am Amino- oder Carboxy-Terminus des variablen Bereichs des Immunglobulins), die dieselbe Antigenbindungsspezifität und/oder Fähigkeit zur Neutralisation wie der Antikörper behält, von dem das Fragment abgeleitet wurde.
  • Ein "Analogon" ist eine Aminosäuresequenz, die mindestens bezüglich einer Aminosäure modifiziert wurde, wobei die Modifikation chemisch sein kann oder eine Substitution oder eine Umlagerung von wenigen Aminosäuren (d. h. nicht mehr als 10) und wobei die Modifikation der Aminosäuresequenz die Beibehaltung der biologischen Charakteristika erlaubt, d. h. Antigenspezifität und hoher Titer oder hohe Affinität der nicht modifizierten Sequenz. Zum Beispiel können mittels Substitutionen stille Mutationen konstruiert werden, um Endonuclease-Restriktionsstellen in den CDR-Bereichen oder ihrer Umgebung zu schaffen.
  • Analoga können auch als allelische Variationen entstehen. Eine "allelische Variation oder Modifikation" ist eine Veränderung in der Nucleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenzen oder Peptidsequenzen der Erfindung codieren. Solche Variationen oder Modifikationen können auf der Degenerierung des genetischen Codes beruhen oder sie können vorsätzlich konstruiert sein, um gewünschte Charakteristika bereitzustellen. Diese Variationen oder Modifikationen können in Veränderungen bei jeder codierten Aminosäuresequenz resultieren, oder auch nicht. Zum Beispiel sind die Aminosäuresequenzen des CDR der leichten Kette SEQ ID NR: 16 identisch beim nativen murinen und humanisierten Antikörper 3B9. Diese CDR-Sequenz wird jedoch von SEQ ID NR: 15 und SEQ ID NR: 53 codiert. In ähnlicher Weise wird der CDR SEQ ID NR: 22 von SEQ ID NR: 21 und SEQ ID NR: 54 codiert; CDR SEQ ID NR: 24 wird von SEQ ID NR: 23 und SEQ ID NR: 55 codiert; und CDR SEQ ID NR: 26 wird von SEQ ID NR: 25 und SEQ ID NR: 56 codiert.
  • Der Ausdruck "Effektormittel" betrifft ein Nicht-Protein-Trägermolekül, mit dem die Fusionsproteine und/oder die natürliche oder synthetische leichte oder schwere Kette des Donorantikörpers oder die anderen Fragmente des Donorantikörpers mittels herkömmlicher Mittel assoziiert sein können. Solche Nicht-Protein-Träger können herkömmliche Träger umfassen, die auf dem Gebiet der Diagnostik verwendet werden, z. B. Polystyrol- oder andere Plastikkügelchen, Polysaccharide, z. B. wie sie im BIAcore [Pharmacia]-System verwendet werden, oder andere Nicht-Protein-Substanzen, die auf dem Gebiet der Medizin von Nutzen sind und sicher bei der Verabreichung an Menschen und Tiere sind. Andere Effektormittel können einen Makrozyklus für die Chelatbildung mit einem Schwermetallatom umfassen oder Radioisotope. Solche Effektormittel können auch bei der Erhöhung der Halbwertszeit der Fusionsproteine von Nutzen sein, z. B. Polyethylenglycol.
  • II. Monoclonale IL4-Antikörper mit hoher Affinität
  • Zur Verwendung bei der Konstruktion der Antikörper, Fragmente und Fusionsproteine dieser Erfindung kann eine nicht-menschliche Art (zum Beispiel Rind, Schaf, Primat, Nager (d. h. murin und Ratte) usw.) verwendet werden, um bei der Begegnung mit nativem menschlichem IL4 oder einem Peptidepitop davon ein gewünschtes Immunglobulin zu erzeugen. Herkömmliche Hybridomtechniken werden verwendet, um eine Hybridomzelllinie bereitzustellen, die einen nicht-menschlichen MAb gegen IL4 sezerniert. Solche Hybridome werden dann unter Verwendung von IL4, das kovalent an Platten mit 96 Mulden gebunden ist, durchmustert oder in einer anderen Ausführungsform mit biotinyliertem IL4 zur Verwendung in einem Durchmusterungstest, wie im Detail nachstehend in Beispiel 2 beschrieben. Somit ist ein Kennzeichen der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von MAbs gegen menschliches IL4, wobei die Testsysteme die Denaturierung von IL4 verhindern. Auf solche Weise wurde gefunden, daß MAbs gegen menschliches IL4 mit hohem Titer (oder hoher Affinität) nachgewiesen werden können.
  • Als ein Beispiel wird die Produktion eines neutralisierenden MAb mit hohem Titer von einem murinen Spender zum ersten Mal offenbart. MAb 3B9, der ein erwünschter muriner (Donor) Antikörper zur Verwendung bei der Entwicklung eines chimären oder humanisierten Antikörpers ist, wird im Detail nachstehend in Beispiel 1 beschrieben. Der MAb 3B9 ist charakterisiert durch eine Antigenbindungsspezifität für menschliches IL4 mit einer Kd von weniger als 2,0 × 10–10 M (etwa 1,8 × 10–10 M) für IL4. Die Kd eines Fab-Fragments dieses 3B9 für IL4 ist weniger als etwa 3 × 10–10 M. Das Epitop dieses Antikörpers konnte mit linearen Peptiden nicht bei IL4 kartiert werden und daher nimmt man an, daß der Antikörper an ein Epitop bindet, das nicht zusammenhängend ist. Das Muster der Bindung legt eine Bindungsstelle im Bereich der B-C-Schleifen (Reste 60–69) → C-Helix (Reste 70–93)-Region nahe. Diese Bereiche beziehen sich auf die Kartenbezeichnungen, die von Cook et al, J. Mol. Biol., 218: 675–678 (1991), Walter et al, J. Biol. Chem. 267: 20371–20376 (1992), Wlodaver et al, FEBS Lett., 309: 59–64 (1992), Redfield et al, Biochem., 30: 11029–11035 (1991), Smith et al, J. Mol. Biol., 224: 899–904 (1992), Garrett et al, (1992), und Powers et al, Biochem., 31: 4334–4346 (1992) und Science, 256: 1673–1677 (1992) bereitgestellt werden, die alle durch Bezugnahme hier eingeschlossen werden.
  • Ein anderer wünschenswerter Donorantikörper ist der MAb, 6A1, der Ratte. Die Produktion dieses MAb wird in Beispiel 7, nachstehend, bereitgestellt. Dieser MAb ist dadurch charakterisiert, daß er vom Isotyp IgG2a ist und eine Dissoziationskonstante von weniger als 2 × 10–10 M (etwa 1,6 × 10–10 M) für hIL4 hat. Wie bei 3B9 wird das Zielepitop von 6A1 nicht linearen Peptiden von IL4 kartiert und man nimmt daher von dem Epitop an, daß es nicht zusammenhängend und dreidimensional ist. Das Muster der Bindung an IL4-Muteine und seine biologische Aktivität zeigen Bindung im Bereich der D-Helix von menschlichem IL4 (Aminosäurereste 109–127) an, am wahrscheinlichsten um das Tyrosin am Aminosäurerest #124 herum.
  • Diese Erfindung ist nicht auf die Verwendung von MAb 3B9, MAb 6A1 oder ihrer hypervariablen (d. h. CDR) Sequenzen beschränkt. Jeder andere geeignete IL4-Antikörper mit hohem Titer, der durch eine Dissoziationskonstante von 2 × 10–10 M oder weniger für menschliches hIL4 charakterisiert ist und die entsprechenden anti IL4-CDRs, können als Ersatz dienen. Wo immer in der folgenden Beschreibung der Donorantikörper als 3B9 oder 6A1 identifiziert wird, wird diese Bezeichnung nur zur Illustration und wegen der Einfachheit der Beschreibung vorgenommen.
  • III. Antikörperfragmente
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung von Fab-Fragmenten oder F(ab')2-Fragmenten, die von MAbs abgeleitet sind, die gegen menschliches IL4 gerichtet sind. Diese Fragmente sind in vivo als schützende Mittel gegen von IL4 und IgE vermittelten Zuständen und in vitro als Teil eines IL4 diagnostischen Mittels von Nutzen. Ein Fab-Fragment enthält die gesamte leichte Kette und den Teil am Amino-Terminus der schweren Kette; und ein F(ab')2-Fragment ist das Fragment, das durch zwei Fab-Fragmente gebildet wird, die über Disulfid-Bindungen verbunden sind. Die MAbs 3B9, 6A1 und andere ähnliche IL4 bindende Antikörper mit hoher Affinität bilden die Quellen für Fab-Fragmente und F(ab')2-Fragmente, die mittels herkömmlicher Verfahren erhalten werden können, z. B. Spaltung des MAb mit den geeigneten proteolytischen Enzymen Papain und/oder Pepsin oder mittels rekombinanter Verfahren. Diese Fab- und F(ab')2-Fragmente sind selbst von Nutzen als therapeutische, prophylaktische oder diagnostische Mittel und als Donor von Sequenzen, einschließlich der variablen Bereiche und der CDR-Sequenzen, die bei der Bildung von rekombinanten oder humanisierten Antikörpern von Nutzen sind, wie hier beschrieben.
  • IV. Anti-IL4-Aminosäure- und Nucleotidsequenzen von Interesse
  • Der Mab 3B9 oder andere vorstehend beschriebene Antikörper können Sequenzen wie variable Peptidsequenzen der schweren und/oder leichten Kette, Gerüstbereichssequenzen, CDR-Sequenzen, funktionelle Fragmente und Analoga davon und die Nucleinsäuresequenzen beisteuern, die sie codieren und die bei der Planung und Darstellung verschiedener Fusionsproteine (einschließlich konstruierter Antikörper) von Nutzen sind, die durch die Antigenbindungsspezifität des Donorantikörpers charakterisiert sind.
  • Als ein Beispiel stellt die vorliegende Erfindung somit variable Sequenzen der schweren und leichten Kette von dem murinen IL4-Antikörper 3B9 und davon abgeleitete Sequenzen bereit. Der variable Bereich der schweren Kette von 3B9 ist durch die Aminosäurereste 20 bis 140 von SEQ ID NR: 4 charakterisiert. Die CDR-Bereiche sind in 2 durch Unterstreichen angezeigt und werden in SEQ ID NR: 22; SEQ ID NR: 24; und SEQ ID NR: 26 bereitgestellt. Der variable Bereich des Clons der leichten Kette von 3B9 ist durch die Aminosäurereste 21 bis 132 von 1 [SEQ ID NR: 2] charakterisiert. Die CDR-Bereiche sind von Aminosäurerest 44–58 [SEQ ID NR: 16]; 74–80 [SEQ ID NR: 18]; und 113–121 [SEQ ID NR: 20].
  • Es werden die Signalnucleotid- und -Aminosäuresequenzen des chimären variablen Bereichs der chimären schweren Kette bereitgestellt. Die Sequenzen sind identisch mit der schweren Kette von 3B9 mit Ausnahme der Signalsequenz. Die Signalsequenz der chimären schweren Kette wird in den SEQ ID NR: 5 und 6 bereitgestellt. Die CDR-Bereiche sind in 3 durch Unterstreichen angezeigt und sind bei der Aminosäuresequenz identisch mit den nativen murinen CDRs [SEQ ID NR: 21–26]. Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen des chimären variablen Bereichs der leichten Kette sind identisch mit den nicht modifizierten 3B9- Sequenzen (Aminosäurereste 21–132 von SEQ ID NR: 2) unter Verwendung der natürlichen Signalsequenzen der Maus (Aminosäurereste 1–20 von SEQ ID NR: 2).
  • Der humanisierte variable Bereich einer schweren Kette und die Signalsequenzen sind in 4 [SEQ ID NR: 11 und 12] dargestellt. Die Signalsequenz wird auch in SEQ ID NR: 5 und 6 bereitgestellt. Andere geeignete Signalsequenzen, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, können die hier exemplarisch dargestellten Signalsequenzen ersetzen. Die CDR-Aminosäuresequenzen dieses Konstrukts sind identisch mit den CDRs der nativen murinen und chimären schweren Kette und werden in der SEQ ID NR: 22 (codiert durch SEQ ID NR: 54), SEQ ID NR: 24 (codiert durch SEQ ID NR: 55) und SEQ ID NR: 56 (codiert SEQ ID NR: 26) bereitgestellt.
  • Ein beispielhafte (synthetische) humanisierte variable Sequenz einer leichten Kette ist in 5 [SEQ ID NR: 13 und 14] dargestellt. Die Signalsequenz überspannt die Aminosäurereste 1–19 von SEQ ID NR: 8. Die CDR-Sequenzen dieser Figur sind durch Unterstreichen hervorgehoben und unterscheiden sich von dem CDR des nativen murinen CDR durch eine einzelne Aminosäure der SEQ ID NR: 20. Somit werden die CDRs einer humanisierten leichten Kette durch SEQ ID NR: 53 und 16, SEQ ID NR: 17 und 18 und SEQ ID NR: 27 und 28 bereitgestellt. Dieser Unterschied ist im Detail in Beispiel 3 beschrieben.
  • Die Nucleinsäuresequenzen dieser Erfindung oder Fragmente davon, die die Peptidsequenzen der variablen leichten und schweren Kette codieren, werden in unmodifizierter Form verwendet oder werden synthetisiert, um gewünschte Modifikationen einzuführen, z. B. Restriktionsstellen. Die isolierten, natürlicherweise vorkommenden oder alternativ synthetischen Nucleinsäuresequenzen, die von dem MAb 3B9 oder von anderen gewünschten IL4-Antikörpern mit hohem Titer abgeleitet sind, können gegebenenfalls Restriktionsstellen enthalten, um die Insertion oder Ligierung in eine geeignete Nucleinsäuresequenz wie die, die einen gewünschten Antikörpergerüstbereich codiert, Ligierung mit mutagenisierten CDRs oder Fusion mit einer Nucleinsäuresequenz zu erleichtern, die einen ausgewählten zweiten Fusionspartner codiert.
  • Unter Berücksichtigung der Degeneration des genetischen Codes können verschiedene codierende Sequenzen konstruiert werden, die variable Aminosäuresequenzen der leichten und schweren Kette und CDR-Sequenzen der Erfindung ebenso wie funktionelle Fragmente und Analoga davon codieren, die mit dem Donorantikörper die Antigenspezifität teilen. Die isolierten Nucleinsäuresequenzen dieser Erfindung oder Fragmente davon, die die Peptidsequenzen der variablen Kette oder CDRs codieren, können verwendet werden, um Fusionsproteine, chimäre oder humanisierte Antikörper oder andere konstruierte Antikörper dieser Erfindung zu produzieren, wenn sie funktionell mit einem zweiten Fusionspartner kombiniert werden.
  • Diese Sequenzen sind auch von Nutzen für die mutagene Einführung von spezifischen Veränderungen innerhalb der Nucleinsäuresequenzen, die die CDRs oder Gerüstbereiche codieren, und für die Einführung der resultierenden modifizierten oder Fusionsnucleinsäuresequenzen in ein Plasmid für die Expression. Zum Beispiel wurden stille Substitutionen in der Nucleinsäuresequenz der Gerüstbereich und CDR codierenden Bereiche verwendet, um Restriktionsenzymstellen zu schaffen, die die Inserierung von mutagenisierten CDR (und/oder Gerüst)-Bereichen erleichterten. Diese CDR-Bereiche wurden bei der Konstruktion einer humanisierten Antikörpers dieser Erfindung verwendet.
  • Es sollte festgehalten werden, daß zusätzlich zu den isolierten Nucleinsäuresequenzen, die Teile des Fusionsproteins und der Antikörper codieren, die hier beschrieben werden, andere solche Nucleinsäuresequenzen verwendet werden können, so wie diejenigen, die zu den nativen Sequenzen komplementär sind. Nützliche DNA-Sequenzen umfassen diejenigen Sequenzen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen [vgl. T. Maniatis et al, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), Seiten 387–389] mit den DNA-Sequenzen hybridisieren. Ein Beispiel für eine solche stringente Hybridisierungsbedingung ist die Hybridisierung bei 4 × SSC bei 65°C, gefolgt von einer Stunde Waschen in 0,1 × SSC bei 65°C. In einer anderen Ausführungsform ist eine exemplarische stringente Hybridisierungsbedingung in 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C. Vorzugsweise sind diese hybridisierenden DNA-Sequenzen mindestens 18 Nucleotide lang, d. h. etwa die Größe eines CDR.
  • V. Fusionsmoleküle und Fusionsproteine
  • Fusionsmoleküle können Fusionsproteine codieren, was konstruierte Antikörper wie chimäre Antikörper und humanisierte Antikörper einschließt. Ein gewünschtes Fusionsmolekül enthält CDR-Sequenzen, die Peptide codieren, die die Antigenspezifität eines IL4-Antikörpers haben, vorzugsweise eines Antikörpers mit hoher Affinität, wie er von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt wird, inseriert in einen ersten Fusionspartner (einen menschlichen Gerüstbereich oder der variable Bereich eines menschlichen Immunglobulins).
  • Vorzugsweise ist der erste Fusionspartner funktionell verknüpft mit einem zweiten Fusionspartner. Der zweite Fusionspartner wird vorstehend definiert und kann eine Sequenz umfassen, die einen zweiten Antikörperbereich von Interesse codiert, zum Beispiel einen Fc- Bereich. Zweite Fusionspartner können auch Sequenzen umfassen, die andere Immunglobuline codieren, mit denen der konstante Bereich der leichten oder schweren Kette im Rahmen oder mittels einer Linkersequenz fusioniert ist. Konstruierte Antikörper, die gegen funktionelle Fragmente oder Analoga von IL4 gerichtet sind, können so geplant werden, daß sie eine verbesserte Bindung mit demselben Antikörper zeigen.
  • Der zweite Fusionspartner kann auch mit vorstehend definierten Effektormitteln assoziiert sein, einschließlich Nicht-Protein-Trägermolekülen, mit denen der zweite Fusionspartner funktionell mittels herkömmlicher Mittel verknüpft sein kann.
  • Die Fusion oder Verknüpfung zwischen dem zweiten Fusionspartner, d. h. Antikörpersequenzen, und dem Effektormittel kann durch jedes herkömmliche Mittel sein, z. B. durch herkömmliche kovalente oder ionische Bindung, Proteinfusion oder hetero-bifunktionelle Verknüpfung, z. B. durch Carbodiimid, Glutaraldehyd und dergleichen. Solche Techniken sind im Stand der Technik bekannt und in herkömmlichen Chemie- und Biochemietexten einfach beschrieben.
  • Es können außerdem auch herkömmliche Linkersequenzen, die einfach das erwünschte Maß an Raum zwischen dem zweiten Fusionspartner und dem Effektormittel bereitstellen, in das Fusionsmolekül hineinkonstruiert werden. Die Planung für solche Linker ist dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Außerdem können Signalsequenzen für die Moleküle der Erfindung modifiziert werden, um die Expression zu erhöhen. Als ein Beispiel war bei einem gewünschten Fusionsprotein, das eine Aminosäuresequenz der Sequenz der murinen schweren Kette hatte, die identisch ist mit der chimären variablen schweren Kette (VH) von 2 [SEQ ID NR: 4], das ursprüngliche Signalpeptid ausgetauscht gegen eine andere Signalsequenz (Aminosäurereste 1–20) [SEQ ID NR: 6].
  • Ein beispielhaftes Fusionsprotein enthält eine Peptid- oder Proteinsequenz der variablen schweren und/oder leichten Kette, die die Antigenspezifität des MAb 3B9 hat, d. h. die VH [Aminosäurereste 21–141 von SEQ ID NR: 9 und 10]- und VL-Ketten [Aminosäurereste 21–132 von SEQ ID NR: 1 und 2]. Noch ein anderes erwünschtes Fusionsprotein dieser Erfindung ist durch die Aminosäuresequenz charakterisiert, die mindestens einen und vorzugsweise alle CDRs des variablen Bereichs der schweren und/oder leichten Kette des murinen Antikörpermoleküls 3B9 enthält, wobei die verbleibenden Sequenzen von einer menschlichen Quelle abgeleitet sind, oder ein funktionelles Fragment oder Analogon davon. Vgl. z. B. die humanisierten VH- und VL-Bereiche von SEQ ID NR: 11 und 12 und SEQ ID NR: 12 und 14 (4 und 5).
  • Bei noch einer weiteren Ausführungsform kann der konstruierte Antikörper der Erfindung mit einem zusätzlichen Mittel verbunden sein. Zum Beispiel kann das Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden, um einen konstruierten Antikörper der Erfindung zu produzieren, bei dem das Fc-Fragment der CH3-Domäne eines vollständigen Antikörpermoleküls durch ein Enzym oder ein anderes nachweisbares Molekül ersetzt wurde (z. B. ein Polypeptideffektor- oder Reportermolekül)
  • Der zweite Fusionspartner kann auch funktionell mit einem Nicht-Immunglobulinpeptid, -protein oder Fragment davon verknüpft sein, das heterolog zu der CDR-enthaltenden Sequenz ist, die die Antigenspezifität des murinen 3B9 hat. Das resultierende Protein kann bei Expression sowohl die Antigenspezifität von anti-IL4 zeigen als auch die Charakteristika des Nicht-Immunglobulins. Die Charakteristik des Fusionspartners kann z. B. eine funktionelle Charakteristik wie eine andere Bindungs- oder Rezeptordomäne sein, oder eine therapeutische Charakteristik, wenn der Fusionspartner selbst ein therapeutisches Protein ist, oder zusätzliche antigene Charakteristika.
  • Ein anderes erwünschtes Protein dieser Erfindung kann ein vollständiges Antikörpermolekül, das die schweren und leichten Ketten voller Länge hat, oder jedes einzelne Fragment davon wie die Fab- oder F(ab')2-Fragmente, ein Dimeres der schweren Kette oder jedes minimale rekombinante Fragment davon wie ein Fv oder einen einzelkettigen Antikörper (SCA) oder jedes andere Molekül mit derselben Spezifität wie der ausgewählte Donor-MAb, z. B. MAb 3B9 oder 6A1, umfassen. Ein solches Protein kann in der Form eines Fusionsproteins verwendet werden oder es kann in seiner nicht fusionierten Form verwendet werden.
  • Wann immer der zweite Fusionspartner von einem anderen Antikörper abgeleitet ist, d. h. jedem Isotyp oder jeder Klasse eines Immunglobulingerüstbereichs oder konstantem Bereichs, resultiert ein konstruierter Antikörper. Konstruierte Antikörper können aus einer Quelle konstante Bereiche enthalten und variable Gerüstbereiche von Immunglobulinen (Ig), z. B. dem Akzeptorantikörper, und eine oder mehr (vorzugsweise alle) CDRs vom Donorantikörper, z. B. dem hier beschriebenen anti-IL4-Antikörper. Außerdem können Veränderungen, z. B. Deletionen, Substitutionen oder Additionen des Gerüstbereichs der leichten und/oder schweren variablen Domäne des Akzeptor-MAb auf der Ebene der Nucleinsäure oder Aminosäure oder der CDR-Bereiche des Donors gemacht werden, um die Antigenbindungsspezifität des Donorantikörpers zu erhalten.
  • Solche konstruierten Antikörper werden so geplant, daß sie eine (oder beide) der variablen schweren und/oder leichten Ketten des IL4-MAb verwenden (gegebenenfalls wie beschrieben modifiziert) oder eine oder mehrere der nachstehend identifizierten CDRs der schweren oder leichten Kette (vgl. Beispiel 3). Die konstruierten Antikörper der Erfindung sind neutralisierend, d. h. sie blockieren wünschenswerterweise die Bindung des IL4-Proteins an den Rezeptor. Zum Beispiel ist der konstruierte Antikörper, der von MAb 3B9 abgeleitet ist, gegen ein spezifisches tertiäres Proteinepitop von menschlichem IL4 gerichtet, von dem man glaubt, daß es sich an dem B-C-Schleifen → C-Helix-Bereich befindet, wie vorstehend beschrieben.
  • Solche konstruierten Antikörper können einen humanisierten Antikörper umfassen, der die Gerüstbereiche eines ausgewählten menschlichen Immunglobulins oder eines Subtyps enthält, oder einen chimären Antikörper, der die konstanten Bereiche der menschlichen schweren und leichten Kette fusioniert mit den funktionellen Fragmenten des IL4-Antikörpers enthält. Ein geeigneter menschlicher (oder anderer tierischer) Akzeptorantikörper kann einer sein, der aus einer gewöhnlichen Datenbank, z. B. der Datenbank KABAT®, der Datenbank Los Alamos und der Datenbank Swiss Protein wegen seiner Homologie zu der Nucleotid- und Aminosäuresequenz des Donorantikörpera ausgewählt wurde. Ein menschlicher Antikörper, der durch Homologie zu den Gerüstbereichen des Donorantikörpers (auf der Basis der Aminosäuren) charakterisiert ist, kann geeignet sein, einen konstanten Bereich der schweren Kette und/oder variablen Gerüstbereich der schweren Kette zur Insertion der Donor-CDRs bereitzustellen. Ein geeigneter Akzeptorantikörper, der in der Lage ist, den konstanten Bereich oder den variablen Gerüstbereich der leichten Kette bereitzustellen, kann auf ähnliche Weise ausgewählt werden. Es sollte festgehalten werden, daß es nicht erforderlich ist, daß die schweren und leichten Ketten des Akzeptorantikörpers von demselben Akzeptorantikörper stammen.
  • Es ist wünschenswert, daß die heterologen Gerüstbereiche und konstanten Bereiche von menschlichen Immunglobulinklassen und -isotypen wie IgG (Subtypen 1 bis 4), IgM, IgA und IgE ausgewählt werden. Der Akzeptorantikörper muß jedoch nicht nur menschliche Immunglobulinproteinsequenzen umfassen. Zum Beispiel kann ein Gen konstruiert werden, bei dem eine DNA-Sequenz, die einen Teil einer menschlichen Immunglobulinkette codiert, mit einer DNA-Sequenz fusioniert sein, die eine Nicht-Immunglobulin-Aminosäuresequenz codiert, wie ein Polypeptid-Effektor- oder Reportermolekül.
  • Ein Beispiel eines besonders wünschenswerten humanisierten Antikörpers enthält die CDRs von 3B9 in die Gerüstbereiche einer ausgewählten menschlichen Antikörpersequenz inseriert. Für neutralisierende humanisierte Antikörper werden ein, zwei oder vorzugsweise drei CDRs von den variablen Bereichen der schweren und/oder leichten Kette des IL4-Antikörpers in die Gerüstbereiche der ausgewählten menschlichen Antikörpersequenz inseriert, wobei die nativen CDRs des letzteren Antikörpers ersetzt werden.
  • Vorzugsweise wurden in einem humanisierten Antikörper die variablen Domänen bei den menschlichen schweren und leichten Ketten durch Ersatz von einem oder mehreren CDRs konstruiert. Es ist möglich, alle sechs CDRs oder verschiedene Kombinationen von weniger als den sechs CDRs zu verwenden. Vorzugsweise werden alle sechs CDRs ersetzt. Es ist möglich, die CDRs nur in der menschlichen schweren Kette zu ersetzen, wobei als leichte Kette die nicht modifizierte leichte Kette von dem menschlichen Akzeptorantikörper verwendet wird. In einer noch anderen Ausführungsform kann eine kompatible leichte Kette durch Rückgriff auf herkömmliche Antikörperdatenbanken aus einem anderen menschlichen Antikörper ausgewählt werden. Der Rest des konstruierten Antikörpers kann von jedem geeigneten menschlichen Akzeptor-Immunglobulin abgeleitet werden.
  • Der konstruierte Antikörper hat somit vorzugsweise die Struktur eines natürlichen menschlichen Antikörpers oder eines Fragments davon und besitzt die Kombination an Eigenschaften, die für eine effektive therapeutische Verwendung, z. B. Behandlung von Entzündungskrankheiten im Menschen, die von IL4 vermittelt werden, oder für diagnostische Verwendungen nötig sind.
  • Als ein anderes Beispiel kann ein konstruierter Antikörper drei CDRs des variablen Bereichs der leichten Kette von 3B9 enthalten [SEQ ID NR: 16, 18, 20 und 28] und drei CDRs des variablen Bereichs der schweren Kette von 3B9 enthalten [SEQ ID NR: 22, 24 und 26]. Der resultierende humanisierte Antikörper ist durch die Antigenbindungsspezifität und hohe Affinität des MAb 3B9 charakterisiert.
  • Es wird vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet verstanden werden, daß ein konstruierter Antikörper durch Veränderungen bei den Aminosäuren der variablen Domäne weiter verändert werden kann, ohne damit notwendigerweise die Spezifität und hohe Affinität des Donorantikörpers zu beeinflussen (d. h. ein Analogon). Zum Beispiel wurden humanisierte monoclonale Antikörper konstruiert, bei denen der Aminosäurerest an Position 120 der leichten Kette ein Arginin [SEQ ID NR: 13 und 14] oder Threonin [SEQ ID NR: 57 und 58] war. Es wird vorrausgesetzt, daß die Aminosäuren der schweren und leichten Kette durch andere Aminosäuren in dem Gerüstbereich der variablen Domäne oder den CDRs oder bei beiden substituiert werden können.
  • Außerdem kann der konstante Bereich verändert werden, um die selektiven Eigenschaften des Moleküls der vorliegenden Erfindung zu erhöhen oder zu vermindern. Zum Beispiel die Dimerisierung, die Bindung an Fc-Rezeptoren oder die Fähigkeit, Komplement zu binden und aktivieren (vgl. z. B. Angal et al., Mol. Immunnol. 30: 105–108 (1993), Xu et al., J. Biol. Chem. 269: 3469–3474 (1994), Winter et al., EP 307,434-B ).
  • Ein Fusionsprotein, das ein chimärer Antikörper ist, unterscheidet sich von den vorstehend beschriebenen humanisierten Antikörpern, indem es die gesamten variablen Bereiche der schweren und leichten Kette des nicht-menschlichen Donorantikörpers, einschließlich der Gerüstbereiche, bereitstellt, in Assoziation mit den konstanten Bereichen für beide Ketten von menschlichem Immunglobulin. Es wird angenommen, daß chimäre Antikörper, die in Vergleich mit humanisierten Antikörpern dieser Erfindung zusätzliche nicht-menschliche Sequenz beibehalten, eine signifikante Immunantwort im Menschen hervorrufen können.
  • Solche Antikörper sind bei der Vorbeugung vor und Behandlung von durch IL4 vermittelten Störungen von Nutzen, wie nachstehend diskutiert.
  • VI. Produktion von Fusionsproteinen und konstruierten Antikörpern
  • Vorzugsweise werden die variablen Sequenzen der leichten und/oder schweren Kette und die CDRs von MAb 3B9 [SEQ ID NR: 16, 18, 20, 22, 24 und 26] oder von anderen geeigneten Donor-MAbs (z. B. 6A1) und ihre codierenden Nucleinsäuresequenzen bei der Konstruktion von Fusionsproteinen und konstruirten Antikörpern, vorzugsweise humanisierten Antikörpern, dieser Erfindung bei dem folgenden Verfahren verwendet. Dieselbe oder ähnliche Techniken können auch zur Herstellung ähnliche Ausführungsformen dieser Erfindung verwendet werden.
  • Ein Hybridom, das einen ausgewählten Donor-MAb produziert, z. B. den murinen Antikörper 3B9, wird herkömmlich cloniert und die DNA der variablen Bereiche seiner schweren und leichten Kette werden mittels Verfahren gewonnen, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, z. B. die Techniken, die in Sambrook et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2te Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) beschrieben sind. Die variablen schweren und leichten Bereiche von 3B9, die mindestens die CDRs und die Teile des Gerüstbereichs der leichten und/oder schweren variablen Domäne des Akzeptor-MAb enthalten, die erforderlich sind, um die Bindungsspezifität des Donor-MAb zu erhalten, ebenso wie die verbleibenden Immunglobulin-abgeleiteten Teile der Antikörperkette, abgeleitet von einem menschlichen Immunglobulin, werden unter Verwendung von Polynucleotidprimern und reverser Transkriptase erhalten. Die CDRs werden unter Verwendung einer bekannten Datenbank und durch Vergleich mit anderen Antikörpern identifiziert.
  • Ein chimärer Maus/Mensch-Antikörper kann dann hergestellt und auf seine Bindungsfähigkeit getestet werden. Solch ein chimärer Antikörper enthält die gesamten VH- und VL-Bereiche des nicht-menschlichen Donorantikörpers in Assoziation mit den konstanten Bereichen für beide Ketten von menschlichem Ig.
  • Homologe Gerüstbereiche des variablen Bereichs der schweren Kette von einem menschlichen Antikörper wurden unter Verwendung einer Computer-Datenbank, z. B. von KABAT®, identifiziert und es wurde ein menschlicher Antikörper als Akzeptorantikörper ausgewählt, der Homologie mit 3B9 hatte. Die Sequenzen der variablen Bereiche der synthetischen schweren Kette, die die CDRs von 3B9 innerhalb der Gerüstbereiche des menschlichen Antikörpers enthielten, wurden gegebenenfalls mit Nucleotidersatz in den Gerüstbereichen entworfen, um Restriktionsstellen einzuführen. Diese entworfene Sequenz wird dann mittels überlappender Oligonucleotide synthetisiert, mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und Fehler werden korrigiert.
  • Ein geeigneter Gerüstbereich der leichten Kette wurde in ähnlicher Weise entworfen.
  • Ein humanisierter Antikörper kann von dem chimären Antikörper abgeleitet werden, oder vorzugsweise synthetisch hergestellt werden, indem man die CDRs des Donor-MAb von den schweren und leichten Ketten in geeigneter Weise innerhalb des Gerüstbereichs der ausgewählten schweren und leichten Kette inseriert. In einer anderen Ausführungsform kann ein humanisierter Antikörper der Erfindung unter Verwendung von Standard-Mutageneseverfahren hergestellt werden. Somit enthält der resultierende humanisierte Antikörper menschliche Gerüstbereiche und CDRs vom Donor-MAb. Es kann eine anschließende Manipulation der Gerüstbereichsreste vorgenommen werden. Der resultierende humanisierte Antikörper kann in rekombinanten Wirtszellen exprimiert werden, z. B. COS- oder CHO-Zellen. Zusätzliche Details dieses Verfahrens werden in Beispiel 4 bereitgestellt. Andere humanisierte Antikörper können unter Anwendung dieses Verfahrens bei anderen geeigneten IL4-spezifischen, neutralisierenden nicht-menschlichen Antikörpern mit hohem Titer hergestellt werden.
  • Ein herkömmlicher Expressionsvektor oder ein herkömmliches rekombinantes Plasmid wird durch Platzierung dieser das Fusionsprotein codierenden Sequenzen in funktioneller Assoziation mit herkömmlichen regulatorischen Kontrollsequenzen hergestellt, die in der Lage sind, die Replikation und Expression in, und/oder Sezernierung von einer Wirtszelle zu kontrollieren. Regulatorische Sequenzen umfassen Promotorsequenzen, z. B. den CMV-Promotor, und Signalsequenzen, die von anderen bekannten Antikörpern abgeleitet werden können. In ähnlicher Weise wird ein zweiter Expressionsvektor produziert, der eine DNA-Sequenz hat, die die leichte und schweren Kette eines komplementären Antikörpers codiert. Vorzugsweise ist dieser zweite Expressionsvektor mit dem ersten insofern identisch, als die codierenden Sequenzen und selektierbaren Marker so ausgewählt sind, daß sie so weit wie möglich sicherstellen, daß jede Polypeptidkette funktionell exprimiert wird.
  • Eine ausgewählte Wirtszelle wird mit herkömmlichen Verfahren mit dem ersten und zweiten Vektor co-transfiziert oder einfach durch einen einzigen Vektor transfiziert, um eine transfizierte Wirtszelle der Erfindung zu erzeugen, die die rekombinanten oder synthetischen leichten und schweren Ketten enthält. Die transfizierte Zelle wird dann nach herkömmlichen Verfahren gezüchtet, um den konstruierten Antikörper der Erfindung zu produzieren. Auf den humanisierten Antikörper, der die Assoziation der rekombinanten schweren Kette und/oder leichten Kette umfaßt, wird mit einem geeigneten Test wie ELISA oder RIA in der Kultur durchmustert. Ähnliche herkömmliche Verfahren können angewendet werden, um andere Fusionsproteine und Moleküle dieser Erfindung zu konstruieren.
  • Geeignete Vektoren für die Clonierungs- und Subclonierungsschritte, die bei den Verfahren und Konstruktionen der Zusammensetzungen dieser Erfindung verwendet werden, können vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet ausgewählt werden. Zum Beispiel kann die herkömmliche pUC-Reihe an Clonierungsvektoren verwendet werden. Ein verwendeter Vektor ist pUC19, der kommerziell bei Lieferanten wie Amersham (Buckinghamshire, Vereinigtes Königreich) oder Pharmacia (Uppsala, Schweden) verfügbar ist. Außerdem kann jeder Vektor, der in der Lage ist, einfach zu replizieren, eine Vielzahl an Clonierungsstellen und Markergenen hat und leicht handhabbar ist, für die Clonierung verwendet werden. Somit ist die Auswahl des Clonierungsvektors kein limitierender Faktor bei dieser Erfindung.
  • In ähnlicher Weise können die Vektoren, die für die Expression der konstruierten Antikörper gemäß dieser Erfindung verwendet werden, vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet von jedem herkömmlichen Vektor auswählt werden. Die Vektoren enthalten auch ausgewählte regulatorische Sequenzen, die in funktioneller Assoziation mit den codierenden DNA-Sequenzen der Immunglobulinbereiche und in der Lage sind, die Replikation und Expression von heterologen DNA-Sequenzen in ausgewählten Wirtszellen zu steuern, wie die CMV-Promotoren. Diese Vektoren enthalten die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen, die den konstruierten Antikörper oder das konstruierte Fusionmolekül codieren. In einer anderen Ausführungsform können die Vektoren die ausgewählten Immunglobulinsequenzen modifiziert durch Inserierung von gewünschten Restriktionsstellen für die leichte Handhabung enthalten.
  • Die Expressionsvektoren können auch durch Markergene charakterisiert sein, die geeignet sind, die Expression von heterologen DNA-Sequenzen zu amplifizieren, z. B. das Dihydrofolat-Reduktasegen des Säugers (DHFR) oder das Neomycin-Resistenzgen (neo®). Andere bevorzugte Vektorsequenzen umfassen eine Poly A-Signalsequenz, wie die vom Rinderwachstumshormon (BGH) und von der Betaglobin-Promotorsequenz (betaglopro). Die hier nützlichen Expressionsvektoren können mittels Verfahren synthetisiert werden, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind.
  • Die Komponenten solcher Vektoren, z. B. Replicons, Selektionsgene, Enhancer, Promotoren, Signalsequenzen und dergleichen, können für die Verwendung bei der Steuerung der Expression und/oder Sezernierung des Produkts der rekombinanten DNA in einem ausgewählten Wirt aus natürlichen Quellen erhalten werden oder mit bekannten Verfahren synthetisiert werden. Andere geeignete Expressionsvektoren, von denen für die Expression im Säuger, in Bakterien, Insekten, Hefe und in Pilzen zahlreiche Arten im Stand der Technik bekannt sind, können für diesen Zweck ebenfalls ausgewählt werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Zelllinie, die mit einem rekombinanten Plasmid transfiziert ist, das die codierenden Sequenzen für die konstruierten Antikörper oder ihre Fusionsmoleküle enthält. Auch die Wirtszellen, die für die Clonierung und anderen Manipulationen dieser Clonierungsvektoren von Nutzen sind, sind herkömmlich. Am meisten erwünscht werden jedoch Zellen von den verschiedenen Stämmen von E. coli für die Replikation der Clonierungsvektoren und die anderen Schritte bei der Konstruktion der Fusionsproteine dieser Erfindung verwendet.
  • Geeignete Wirtszellen oder Wirtszelllinien für die Expression der konstruierten Antikörper oder Fusionsproteine der Erfindung sind vorzugsweise unter anderen eine eukaryontische Zelle wie CHO, COS, eine Fibroblastenzelle (z. B 3T3) und myeloide Zellen und am meisten bevorzugt eine Säugerzelle wie eine CHO-Zelle oder eine myeloide Zelle. Menschliche Zellen können verwendet werden und ermöglichen somit, daß das Molekül durch menschliche Glycosylierungsmuster modifiziert wird. In einer anderen Ausführungsform können andere eukaryontische Zelllinien verwendet werden. Die Auswahl von geeigneten Säugerwirtszellen und der Verfahren für die Transformation, Züchtung, Amplifikation, Durchmusterung und Produktherstellung und -reinigung sind im Stand der Technik bekannt. Vgl. z. B. Sambrook et al., vorstehend zitiert.
  • Bakterienzellen können sich als nützliche Wirtszellen für die Expression der rekombinanten MAbs der vorliegenden Erfindung erweisen. Jedoch wegen der Tendenz von Proteinen, die in Bakterienzellen exprimiert werden, in einer nicht gefalteten oder unzureichend gefalteten oder nicht glycosylierten Form vorzuliegen, müßte jeder rekombinante MAb, der in Bakterienzellen produziert wurde, auf die Beibehaltung seiner Fähigkeit der Antigenbindung überprüft werden. Wenn das durch die Bakterienzelle exprimierte Molekül in der richtig gefalteten Form produziert wurde, wäre die Bakterienzelle der gewünschte Wirt. Zum Beispiel sind viele Stämme von E. coli, die für die Expression verwendet werden, auf dem Gebiet der Biotechnologie bekannt als Wirtszellen. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Streptomyces, anderen Bazillen und dergleichen können auch bei diesem Verfahren verwendet werden.
  • Wo erwünscht sind auch Stämme von Hefezellen, die dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, als Wirtszellen verfügbar, ebenso wie Insektenzellen, z. B. Drosophila und Lepidoptera, und virale Expressionssyteme. Vgl. z. B. Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277–298, Plenum Press (1986) und dort zitierte Referenzen.
  • Die allgemeinen Verfahren, mit denen die Vektoren der Erfindung konstruiert werden können, die Transfektionsverfahren, die erforderlich sind, um die Wirtszellen der Erfindung zu produzieren, und die Züchtungsverfahren, die notwendig sind, um die Fusionsproteine oder konstruierten Antikörper der Erfindung von solchen Wirtszellen zu produzieren, sind alle herkömmliche Techniken. In ähnlicher Weise können die Fusionsproteine oder konstruierten Antikörper der Erfindung, nachdem sie einmal produziert sind, gemäß Standardverfahren des Standes der Technik, einschließlich Ammoniumsulfatfällung, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und dergleichen, aus der Zellkultur gereinigt werden. Solche Techniken sind im Stand der Technik und beschränken diese Erfindung nicht.
  • Noch ein anderes Verfahren der Expression der humanisierten Antikörper kann die Expression in transgenen Tieren verwenden, wie beschrieben im U.S.-Patent Nr. 4,873,316. Dieses betrifft ein Expressionssytem unter Verwendung des Caseinpromotors des Tieres, der, wenn er transgen in ein Säugetier eingebracht wird, dem weiblichen Tier die Produktion des gewünschten rekombinanten Proteins in seiner Milch erlaubt.
  • Wenn er einmal mit dem gewünschten Verfahren exprimiert wurde, wird der konstruierte Antikörper unter Verwendung eines geeigneten Tests auf in vitro-Aktivität überprüft. Gegenwärtig übliche ELISA-Testformate werden verwendet, um die qualitative und quantitative Bindung des konstruierten Antikörpers an ein IL4-Epitop zu bewerten. Außerdem können andere in vitro-Tests, z. B. BIAcore [Pharmacia], auch verwendet werden, um die neutralisierende Wirksamkeit vor den anschließenden klinischen Studien am Menschen zu verifizieren, die durchgeführt werden, um die Persistenz des gentechnischen Antikörpers im Körper trotz der üblichen Ausscheidungsmechanismen zu bewerten.
  • Gemäß den Verfahren, die für humanisierte Antikörper beschrieben werden, die von 3B9 hergestellt werden, kann ein Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet auch humanisierte Antikörper von anderen IL4-Donorantikörpern, Sequenzen des variablen Bereichs und CDR-Peptiden konstruieren, die hier beschrieben werden. Konstruierte Antikörper können mit variablen Gerüstbereichen produziert werden, die von den Empfängern des konstruierten Antikörpers potentiell als "eigen" erkannt werden. Kleinere Modifikationen an den variablen Gerüstbereichen können eingeführt werden, um eine starke Erhöhung der Antigenbindung ohne eine merkliche Erhöhung der Immunogenität für den Empfänger zu bewirken. Solche konstruierten Antikörper können einen Menschen mit von IL4 vermittelten Zuständen wirkungsvoll behandeln. Solche Antikörper können auch bei der Diagnose solcher Zustände von Nutzen sein.
  • VII. Therapeutische/prophylaktische Verwendungen
  • Diese Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von Menschen, die an einer allergischen Krankheit leiden, welches die Verabreichung einer wirksamen Dosis an Antikörpern umfaßt, einschließlich einen oder mehrere der hier beschriebenen konstruierten Antikörper oder Fusionsproteine oder Fragmente davon.
  • Die therapeutische Reaktion, die durch die Verwendung der Moleküle der Erfindung induziert wird, wird durch die Bindung von menschlichem IL4 und somit anschließende Blockierung der IgE-Freisetzung produziert. Somit sind die Moleküle der vorliegenden Erfindung, wenn sie in Herstellungen und Formulierungen sind, die für die therapeutische Verwendung geeignet sind, sehr wünschenswert für die Personen, die unter einer allergischen Reaktion leiden, wie der allergischen Rhinitis, der Bindehautentzündung, der atopischen Dermatitis, dem atopische Asthma und dem anaphylaktischen Schock.
  • Die Fusionsproteine, Antikörper, konstruierten Antikörper oder Fragmente davon dieser Erfindung können auch in Verbindung mit anderen Antikörpern, insbesondere menschlichen MAbs verwendet werden, die mit anderen Markern (Epitopen) reagieren, die für die Zustände verantwortlich sind, gegen die der konstruierte Antikörper der Erfindung gerichtet ist. In ähnlicher Weise können MAbs, die mit Epitopen reagieren, die für den Zustand in einem ausgewählten Tier verantwortlich sind, gegen den der Antikörper der Erfindung gerichtet ist, auch in veterinären Zusammensetzungen verwendet werden.
  • Man nimmt an, daß die therapeutischen Mittel dieser Erfindung für eine Behandlung von allergischen Zuständen für einen Zeitraum von etwa 2 Tagen bis etwa 3 Wochen, oder wie erforderlich, wünschenswert sind. Zum Beispiel kann eine längere Behandlung erwünscht sein, wenn eine saisonale Rhinitis oder dergleichen behandelt wird. Dies stellt einen beträchtlichen Vorteil gegenüber den gegenwärtig verwendeten Infusionsprotokollen bei Behandlungen des Stands der Technik bei von IL4 vermittelten Störungen dar. Die Dosis und die Dauer der Behandlung hängt von der relativen Lebenszeit der Moleküle der vorliegenden Erfindung im menschlichen Kreislauf ab und kann vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet in Abhängigkeit vom zu behandelnden Zustand und der allgemeinen Gesundheit des Patienten angepaßt werden.
  • Der Weg der Verabreichung des therapeutischen Mittels der Erfindung kann jeder geeignete Weg sein, der das Mittel an den Empfänger verabreicht. Die Fusionsproteine, Antikörper, konstruierten Antikörper und Fragmente davon und die Arzneimittel der Erfindung sind insbesondere von Nutzen bei der parenteralen Verabreichung, z. B. subkutan, intramuskulär, intravenös oder intranasal.
  • Die therapeutischen Mittel der Erfindung können als Arzneimittel hergestellt werden, die eine wirksame Menge des konstruierten (z. B. humanisierten) Antikörpers der Erfindung als aktiven Inhaltsstoff in einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten. Bei den prophylaktischen Mitteln der Erfindung wird eine wäßrige Suspension oder Lösung, die den gentechnischen Antikörper enthält, vorzugsweise gepuffert bei physiologischem pH-Wert, in einer Form bevorzugt, die für die Injektion geeignet ist. Die Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung werden im Allgemeinen eine Lösung des konstruierten Antikörpers der Erfindung oder einen Cocktail davon, der in einem pharmazeutisch verträglichen Träger gelöst ist, vorzugsweise einem wäßrigen Träger umfassen. Eine Vielzahl an wäßrigen Trägern kann verwendet werden, z. B. 0,4%-ige Salzlösung, 0,3% Glycin, und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und im Allgemeinen frei von partikulärem Material. Dieses Lösungen können mit herkömmlichen, gut bekannten Techniken sterilisiert werden (z. B. Filtration). Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Hilfssubstanzen enthalten, wenn zur Angleichung an die physiologischen Bedingungen erforderlich, wie pH-Anpassungs- und Puffermittel, usw. Die Konzentration des Antikörpers der Erfindung in einer solchen pharmazeutischen Formulierung kann weit variieren, d. h. von weniger als etwa 0,5%, üblicherweise etwa 1 Gew.-% oder mindestens etwa 1 Gew.-% bis zu so viel wie 15 bis 20 Gew.-% und wird primär auf der Basis von Flüssigvolumina, Viskositäten usw. ausgewählt, gemäß des speziell gewählten Verabreichungswegs.
  • Somit könnte ein Arzneimittel der Erfindung für die intramuskuläre Injektion so hergestellt werden, daß es 1 ml steriles gepuffertes Wasser und zwischen etwa 1 ng bis zu etwa 100 mg, z. B. etwa 50 ng bis zu etwa 30 mg oder mehr bevorzugt etwa 5 mg bis zu etwa 25 mg eines konstruierten Antikörpers der Erfindung enthält. In ähnlicher Weise könnte ein Arzneimittel der Erfindung für die intravenöse Infusion so hergestellt werden, daß sie 250 ml sterile Ringer-Lösung und etwa 1 bis etwa 30 und vorzugsweise 5 mg bis etwa 25 mg eines konstruierten Antikörpers der Erfindung enthält. Aktuelle Verfahren für die Herstellung von parenteral zu verabreichenden Zusammensetzungen sind gut bekannt oder dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet offenbar und sind detaillierter beschrieben in zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Science, 15te Ausg., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.
  • Es wird bevorzugt, daß das therapeutische Mittel der Erfindung, wenn es in einer pharmazeutischen Herstellung ist, in Einheitsdosisform vorliegt. Die geeignete therapeutisch wirksame Dosis kann vom Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet einfach bestimmt werden. Um eine entzündliche Störung in einem Menschen oder einem anderen Tier wirksam zu behandeln, sollte eine Dosis von etwa 0,1 mg bis zu etwa 20 mg eines Proteins oder eines Antikörpers dieser Erfindung pro 70 kg Körpergewicht parenteral verabreicht werden, vorzugsweise i. m. (intramuskulär). Eine solche Dosis kann, falls erforderlich, in geeigneten Zeitabständen wiederholt werden, die von einem Arzt während der entzündlichen Reaktion als geeignet ausgewählt werden.
  • Diese Beschreibung beschreibt auch die Verabreichung von IL4-Fusionsproteinen dieser Erfindung gleichzeitig oder nacheinander mit anderen Antikörpern oder Fusionsproteinen, die durch eine anti-IL4-Aktivität charakterisiert sind, wie die anti-Tumornekrosisfaktor-Aktivität oder andere pharmazeutische Aktivitäten, die kompatibel sind mit der Fähigkeit der Fusionsproteine zur Bindung des IL4-Rezeptors dieser Erfindung. Solche anderen Antikörper sind kommerziell erhältlich und können in einer Weise entworfen werden, die der hier beschriebenen ähnlich ist.
  • Die Fusionsproteine und konstruierten Antikörper dieser Erfindung können auch in diagnostischen Schemata verwendet werden, wie für die Bestimmung von durch IL4 vermittelten Störungen oder zur Verfolgung des Verlaufs der Behandlung solcher Störungen. Als diagnostische Reagentien können diese Fusionsproteine für die Verwendung in ELISA's und anderen herkömmliches Testformaten für die Messung von IL4-Niveaus in Serum, Plasma oder anderen geeigneten Geweben in herkömmlicher Weise markiert sein. Die Natur des Tests, in dem die Fusionsproteine verwendet werden, ist herkömmlich und beschränkt diese Offenbarung nicht.
  • Die Antikörper, konstruierten Antikörper und ihre Fragmente, die hier beschrieben sind, können für die Lagerung lyophilisiert werden und vor der Verwendung in einem geeigneten Träger rekonstituiert werden. Mit herkömmlichen Immunglobulinen ist gezeigt worden, daß diese Technik wirksam ist, und es können im Stand der Technik bekannte Lyophilisierungs- und Rekonstitutionsverfahren verwendet werden.
  • Die folgenden Beispiele illustrieren verschiedene Aspekte dieser Erfindung, einschließlich der Konstruktion exemplarischer konstruierter Antikörper und ihrer Expression in geeigneten Vektoren und Wirtszellen, und sie sollen nicht so ausgelegt werden, daß sie den Umfang dieser Erfindung beschränken. Alle Aminosäuren werden durch die herkömmlichen Dreibuchstaben- oder Einzelbuchstabencodes bezeichnet. Alle erforderlichen Restriktionsenzyme, Plasmide und anderen Reagentien und Materialien wurden von kommerziellen Quellen bezogen, außer anders angegeben. Alle allgemeinen Clonierungs- und Ligierungsmethoden und anderen rekombinanten DNA-Verfahren wurden, durchgeführt wie von T. Maniatis et al., wie vorstehend zitiert, oder in der zweiten Ausgabe davon (1989), Hrsg. Sambrook et al., von demselben Herausgeber ("Sambrook et al."), dargestellt.
  • Beispiel 1 – Produktion von MAb 3B9
  • A. Immunisierungsverfahren
  • Vier Mäuse (F1-Hybride von Balb/c und C57BL/6) wurden subkutan mit 50 μg rekombinantem menschlichem IL4 aus E. coli in vollständigem Freundschem Adjuvans immunisiert und 4 Wochen später erfolgte intraperitoneal (i. p.) mit 40 μg IL4 in unvollständigem Freundschem Adjuvans eine Auffrischung. Auf der Basis eines guten Antikörpertiters gegen IL4 im Serum erhielt eine Maus weitere Immunisierungen mit 200 μg IL4 (i. p. in Salzlösung) nach 8 Wochen, zwei Tage später mit 100 μg IL4 (i. p. in Salzlösung) und zwei Tage später mit 50 μg IL4 (i. p. in Salzlösung). Zwei Tage nach der letzten Immunisierung wurde eine Milzexstirpation durchgeführt.
  • B. Fusionsverfahren und Durchmusterungssystem
  • Die Milzzellen der Maus wurden verwendet, um Hybridome herzustellen (nach Standardverfahren, z. B. wie von Köhler et al., Nature, 256: 495 (1975) beschrieben, wobei unter Verwendung des kommerziell verfügbaren BIAcore-Systems und von nachstehend beschriebenen ELISA-Tests für die IL4-Bindung > 250 Zellclone auf die Sezernierung von Antikörper gegen IL4 durchmustert wurden. Fünf Mulden ergaben eine positive Reaktion. Nur 1 Clon von Mäusen, 3B9, war stark positiv. Alle von 3B9 abgeleiteten sekundären Clone waren positiv.
  • Beispiel 2 – ELISA-Tests und Affinitätskonstanten
  • A. ELISA
  • Der Durchmusterungstest, wie folgt durchgeführt, wurde entworfen, um die Affinität zu nativem menschlichem IL4 zu messen. Für das Experiment 1 wurden Aldehydaktivierte Platten mit 96 Mulden mit 100 μl/Mulde IL4 zu 1 μg/ml in 0,1 M Boratpuffer, pH 8,5, beschichtet und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Das hIL4 wurde kovalent an die Platte gebunden. Die IL4-Lösung wurde abgesaugt und nicht-spezifische Bindungsstellen (NSB) wurden mit 1%-igem Rinderserumalbumin (BSA) in TBS-Puffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0,02% NaN3, pH 7,4) 60 Minuten bei 37°C blockiert. Nach diesem und jedem der folgenden Schritte wurde die Platte 4 mal in Waschpuffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN3, pH 7,4) gewaschen. Danach wurden 50 μl Hybridommedium (oder gereinigter 3B9 oder Fab-Framente) und 50 μl Testpuffer (0,5% Rinder-gamma-Globulin in TBS-Puffer) zugegeben und die Platten wurden 60 Minuten bei 37°C inkubiert. 100 μl an biotinyliertem anti-Maus-Antikörper in Testpuffer wurden pro Mulde zugegeben und wie vorstehend inkubiert. 100 μl an mit alkalischer Phnsphatase konjugiertem Streptavidin wurden pro Mulde zugegeben und inkubiert (30 Minuten bei 37°C). Es wurden 100 μl/Mulde PNP-Substrat zugegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Messungen wurden bei einer optischen Dichte von 405 nm vorgenommen.
  • Für das Experiment 2 wurden mit Streptavidin beschichtete Platten (100 μl/Mulde, 1 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS)) über Nacht bei 4°C inkubiert und wie folgt getestet. Die Streptavidin-Lösung wurde abgesaugt, die NSB-Stellen wurden mit 1%-igem BSA in TBS-Puffer blockiert (60 Minuten bei 37°C). Nach diesem Schritt und nach jedem folgenden Schritt wurden die Platten 4 mal in Waschpuffer gewaschen. Es wurden 50 μl biotinyliertes IL4 wurden mit 50 μl Testpuffer zugegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurden 50 μl gereinigtes IgG oder Fab-Fragment von 3B9 (oder Hybridommedium) plus 50 μl Testpuffer zugegeben und 60 Minuten bei 37°C inkubiert. 100 μl anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase-Konjugat wurden zugegeben und 60 Minuten bei 37°C inkubiert. 100 μl PNP-Substrat wurden zugegeben und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Ablesung wurde wie vorstehend vorgenommen.
  • B. Berechnung der Affinität von 3B9 für IL-4
  • Unter Verwendung der Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Experimente und wie folgt zusammengefaßt wurde der Kd für 3B9, wie von Beatty et al, J. Immunol. Methods, 100: 173–179 (1987) beschrieben, berechnet:
    Figure 00360001
    Ab* = Konzentration von Ab gebunden an 150 ng/ml biotinyliertes hIL4
    Ab = Konzentration von Ab gebunden an 300 ng/ml biotinyliertes hIL4
  • Die Dissoziationskonstanten Kd wurden aus der folgenden Relation berechnet:
  • Figure 00360002
  • Experiment 1: ELISA-Test auf einer mit Streptavidin beschichteten Platte mit 96 Mulden (100 ng/Mulde). Kd = 2,2 × 10–10 M (3B9-Fab)
  • Experiment 2: ELISA-Test auf einer mit Streptavidin beschichteten Platte mit 96 Mulden (100 ng/Mulde). Kd = 1,4 × 10–10 M (3B9-IgG)
  • C. Spezifität
  • Der MAb 3B9 erkennt menschliches IL4, erkennt aber nicht IL4 des Rindes oder murines IL4. Ein Weg, um das zu bestimmen, geht wie folgt. Es kann ein ELISA unter Verwendung einer Platte mit 96 Mulden durchgeführt werden, die mit anti-Maus-IgG beschichtet ist und die anschließend mit Serumalbumin des Rindes blockiert wird, wonach 50 μl 3B9 (100 ng/ml), 25 μl nicht-menschliches IL4 und 25 μl Biotin-IL4 60 Minuten bei 37°C inkubiert wurden, gefolgt von Waschen, mit Streptavidin konkugierter alkalischer Phosphatase und PNP.
  • In ähnlicher Weise wurde gefunden, daß der MAb 6A1 das IL4 des Rindes oder murines IL4 nicht erkennt.
  • Beispiel 3 – Humanisierte Antikörper
  • Es wurden ein humanisierter Antikörper entworfen, der murine CDRs innerhalb eines menschlichen Antikörpergerüstbereichs enthalten sollte. Diese humanisierte Version des IL4-spezifischen Maus-Antikörpers 3B9 wurde mit den folgenden Arbeitsschritten hergestellt.
  • A. cDNA-Clonierung
  • cDNA-Clone wurden von den schweren und leichten 3B9-Ketten von mRNA gemacht, die unter Verwendung eines Kits von Boehringer Mannheim aus der 3B9-Hybridomzelllinie [Beispiel 1] extrahiert worden war. Für die Synthese des ersten Strangs wurden Primer verwendet, die für die Gelenk-Region oder die konstante kappa-Region spezifisch waren.
  • Der Primer der kappa-Kette ist [SEQ ID NR: 29]:
    5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACAATGGG-3'
  • Der Primer der schweren gamma-Kette ist [SEQ ID NR: 30]:
    5'-GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC-3'.
  • Die doppelsträngige cDNA wurde direkt in Plasmid pGEM7f+ [Promega] cloniert, mit dem dann E. coli DHS-α [Bethesda Research Labs] transformiert wurde.
  • B. DNA-Sequenzierung
  • Murine cDNA-Clone von acht schweren und einer leichten Kette vom vorstehenden Teil A wurden sequenziert. Die Ergebnisse der Sequenzierung der variablen Bereiche dieser Clone sind in der SEQ ID NR: 1 und 2 und 3 und 4 gezeigt. Jeder Clon enthielt Aminosäuren, von denen bekannt ist, daß sie in den variablen Bereichen der schweren Kette oder in den variablen Bereichen der leichten Kette der Maus konserviert sind und murine Signalsequenzen. Die CDR-Aminosäuresequenzen sind nachstehend aufgelistet.
  • Die CDR-Bereiche für die schwere Kette sind SEQ ID NR: 22, 24 und 26 (Aminosäuren 50–56, 71–86 und 119–129 von SEQ ID NR: 4). Vgl. 2. Diese Sequenzen werden codiert von SEQ ID NR: 21, SEQ ID NR: 23 bzw. SEQ ID NR: 25. Die CDR-Bereiche für die leichte Kette sind SEQ ID NR: 16, 18 und 20 (Aminosäuren 45–58, 74–80 und 113–121 von SEQ ID NR: 2). Vgl. 1. Diese Sequenzen werden codiert von SEQ ID NR: 15, 17 bzw. 19.
  • C. Auswahl der menschlichen Gerüstbereiche
  • Nach der Clonierung von 3B9 wurden die Aminosäuresequenzen des variablen Bereichs (Aminosäuren 21–132 von SEQ ID NR: 2 und Aminosäuren 20 bis 140 von SEQ ID NR: 4) unter Verwendung der KABAT®- und der SWISS-Datenbanken mit der Datenbank für die menschliche Immunglobulinsequenz verglichen, um einen menschlichen Gerüstbereich für die schweren und leichten Ketten zu identifizieren, der dem murinen Ausgangsbereich in Bezug auf die Sequenzhomologie am meisten gleicht. Zusätzlich zu dieses Recherchen für die Sequenzhomologie wurden die schweren und leichten Ketten auch gegen eine positionelle Datenbank überprüft, die aus strukturellen Modellen der Fab-Domäne erzeugt wurde, um potentielle Konflikte wegen Aminosäuressubstitutionen zu erkennen, die die Darbietung der CDRs beeinflussen könnten. Im vorliegenden Fall wurden bei der strukturellen Recherche keine offensichtlichen Konflikte entdeckt; daher wurde die codierende DNA verwendet, die aus den Aminosäuresequenz-Homologierecherchen abgeleitet wurde.
  • Es wurden die Gerüstbereiche der schweren Kette eines Antikörpers verwendet, die von einem menschlichen Myelom-Immunglobulin (COR) erhalten worden waren [E. M. Press und N. M. Hogg, Biochem. J., 117: 641–660 (1970)]. Bei dieser Sequenz wurde gefunden, daß sie auf der Ebene der Aminosäuren zu etwa 77% homolog (69,4% Identität) mit dem Bereich der variablen Kette von 3B9 ist.
  • Für einen geeigneten variablen Gerüstbereich der leichten Kette wurde die variable Gerüstbereichssequenz der leichten Kette des menschlichen Antikörpers verwendet, der bei H. G. Klobeck et al, Nucl. Acids Res., 13: 6515–6529 (1985) identifiziert wurde. Es wurde gefunden, daß die menschliche Antikörpersequenz auf der Ebene der Aminosäuren zu etwa 80,2% homolog (72,0% Identität) mit dem variablen Bereich der leichten Kette des murinen 3B9 ist.
  • Auf der Basis der CDRs des murinen 3B9 [SEQ ID NR: 15–26] und der Sequenz des menschlichen Antikörpers wurde eine synthetische schwere Kette gemacht und eine PCR durchgeführt, um die DNA aufzufüllen und zu amplifizieren. Diese Sequenzen wurden mit den folgenden überlappenden Oligonucleotiden synthetisiert und mittels PCR amplifiziert. SEQ ID NR: 31–37 stellt fünf überlappende Oligos und 2 PCR-Primer bereit. Man findet, daß Oligo 1 [SEQ ID NR: 31] die Basen 5–121 überspannt. Man findet, daß Oligo 2 [SEQ ID NR: 32] die Basen 122–241 überspannt und man findet, daß Oligo 3 [SEQ ID NR: 33] die Basen 242–361 überspannt. Die beiden Primer des unteren Strangs SEQ ID NR: 34 und SEQ ID NR: 35 überspannen die Basen 134–110 und die Basen 253–230. Alle Fehler in den kartierten Sequenzen, die durch die PCR eingeführt wurden, wurden korrigiert. Unter Verwendung der Nucleotide 1–25 SEQ ID NR: 36 als 5'-Primer und der Nucleotide 361–341 SEQ ID NR: 37 als 3'-Primer wurde erneut eine PCR durchgeführt.
  • Der synthetische variable Bereich wurde zusammen mit der synthetischen Signalsequenz SEQ ID NR: 5 und 6 von dem chimären Konstrukt der schweren Kette und mit einem konstanten Bereich von menschlichem IgG1 in den Expressionsvektor pCD ligiert. Die synthetische Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von VH und von der Signalsequenz sind in der 4 bereitgestellt [SEQ ID NR: 11 und 12]. Die Aminosäuresequenzen der CDRs [SEQ ID NR: 22, 24 und 26] sind identisch mit den CDRs von murinem 3B9. Die codierenden Sequenzen für diese CDRs [SEQ ID NR: 54, 55 und 56] unterscheiden sich jedoch von den codierenden Sequenzen für murinen 3B9 [SEQ ID NR: 21, 23 und 25]. Der resultierende Expressionsvektor IL4hzhc1-1-Pcd ist in 9 gezeigt.
  • Die CDR-Genregionen eines bereits bestehenden Gerüstbereichs einer leichten Kette wurden durch Restriktionsverdau entfernt und durch die folgenden synthetischen IL-4-CDR-Gene ersetzt, die synthetisch hergestellt wurden.
  • Für CDR 1:
    SEQ ID NR: 38: 5'-CTAGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGG-3'
    SEQ ID NR: 39: CCTTGCAGTTGATGGTGGCCCTCTCGCCCAGAGACACAG
    SEQ ID NR: 40: TCGAGAGGCCTCCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATG AACTGGTATCAGCAGAAACCC
    SEQ ID NR: 41: GGGTTTCTGCTGATACCAGTTCATATAACTATCACCATCATAATCAACACTTTGGG AGGCCTC
  • Für CDR 2:
    SEQ ID NR: 44: GGGCAGCCTCCTAAGTTGCTCATTTACGCTGCATCCAATCTAGAATCTGGGGTAC
    SEQ ID NR: 45: CCCAGATTCTAGATTGGATGCAGCGTAAATGAGCAACTTAGGAGGCTGCCC
  • Für CDR 3:
    SEQ ID NR: 42 ATACTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCCGAGGTTCGGCGGAGGGAC
    SEQ ID NR: 43 CTTGGTCCCTCCGCCGAACCTCGGAGGATCCTCATTACTTTGCTGACAGTAGT
  • Die synthetische Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von VL und von der Signalsequenz sind in der 5 bereitgestellt [SEQ ID NR: 13 und 14]. Die Aminosäuresequenz der ersten beiden CDRs [SEQ ID NR: 16 und 18] sind identisch mit den entsprechenden murinen 3B9-CDRs. Die codierende Sequenz für den ersten CDR [SEQ ID NR: 53] unterscheidet sich jedoch von den codierenden Sequenzen für den murinen 3B9 [SEQ ID NR: 15]. Weiterhin wurden im letzten CDR zwei humanisierte Konstrukte der 3B9-Aminosäuresequenz konstruiert. Eine [SEQ ID NR: 28] unterscheidet sich um eine einzige Aminosäure [SEQ ID NR: 29] von der nativen murinen 3B9-Sequenz. SEQ ID NR: 28 wird von SEQ ID NR: 27 codiert. Die synthetischen variablen leichten Bereiche wurden zusammen mit der Signalsequenz [SEQ ID NR: 7 und 8] in den Expressionsvektor ligiert. Einer der resultierenden Vektoren, IL4hz1c-O-Pcn ist in 10 dargestellt.
  • Diese synthetischen variablen leichten und/oder schweren Kettensequenzen werden bei der Konstruktion eines humanisierten Antikörpers eingesetzt.
  • Beispiel 4 – Expression von humanisiertem MAb in COS- und CHO-Zellen
  • Es wurden pUC18-Subclone für die VH gemacht, um eine Signalsequenz zuzufügen, die ursprünglich aus einem menschlichen Antikörper SEQ ID NR: 5 erhalten wurde. Für die VL wurden pUC18-Subclone gemacht, um eine Signalsequenz SEQ ID NR: 7 zuzufügen.
  • Die humanisierte schwere Kette, abgeleitet von einem IgG1-Isotyp, zeigt auf der Ebene der Aminosäuren zu 89,3% Homologie (84,3% Identität) mit der schweren Kette von murinem 3B9. Diese synthetische VH wird in den Aminosäuren 20–141 von SEQ ID NR: 11 und 12 bereitgestellt.
  • Die humanisierte leichte Kette, eine menschliche kappa-Kette, zeigt auf der Ebene der Aminosäuren zu 92,0% Homologie (86,6% Identität) mit 3B9. Diese synthetische VL [Aminosäuren 21 bis 131 von SEQ ID NR: 13 und 14], die die 3B9-CDRs enthielt, wurde, wie vorstehend für die synthetischen schweren Ketten beschrieben, entworfen und synthetisiert.
  • Die DNA-Fragmente, die ihren jeweiligen Signale verknüpft mit den humanisierten variablen schweren oder leichten Bereichen hatten, wurden mit herkömmlichen Verfahren [Maniatis et al., vorstehend zitiert] in Säugerzell-Expressionsplasmide auf der Basis von pUC19 inseriert, die CMV-Promotoren und die konstanten Bereiche der menschlichen schweren Kette oder menschlichen leichten Ketten des Chimären, das in Beispiel 5 nachstehend produziert wurde, enthielten, um die Plasmide IL4hzhc1-1Pcd (schwere Kette) [9] und IL4hz1c1-o-Pcn (leichte Kette) [10] zu ergeben. Die HZHC- und HZLC-Plasmide werden gleichzeitig in COS-Zellen transfiziert und nach drei und fünf Tagen wurden Überstände mit dem ELISA, der unmittelbar vorstehend beschrieben wurde, auf die Anwesenheit von humanisiertem Antikörper getestet. Ein anderer humanisierter Antikörper wurde konstruiert, aber mit einem IgG4-Isotyp.
  • Das vorstehende Beispiel beschreibt die Herstellung eines beispielhaften konstruierten Antikörpers. Ähnliche Verfahren können unter Verwendung von anderen anti-IL4-Antikörpern (z. B. 6A1 – Beispiel 7), die auf herkömmliche Weise entwickelt wurden, für die Entwicklung anderer konstruierter Antikörper befolgt werden.
  • Beispiel 5 – Konstruktion von chimären Antikörpern
  • A. Durch Isolierung des variablen Bereichs einer murinen schweren Kette von dem ursprünglichen MAb 3B9 als EcoRI-BstEII-Restriktionsfragment wurde eine chimäre schwere Kette konstruiert. Es wurde ein kleines DNA-Oligomer entworfen und synthetisiert, um den variablen Bereich der Maus mit dem menschlichen konstanten IgG1-Bereich (BstEII – ApaI) zu verknüpfen:
    5'-Primer: SEQ ID NR: 50: GTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGGC
    3'-Primer: SEQ ID NR: 51: CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACG
  • Diese beiden Fragmente wurden in das Plasmid pCD ligiert (vgl. 7) (verdaut mit EcoRI und ApaI), welches bereits den konstanten Bereich von menschlichem IgG1 codiert. Dieser Clon exprimierte nicht; daher wurden das Wildtyp-5'UTR und die Signalsequenz deletiert und ersetzt durch SEQ ID NR: 5 und 6.
  • Weil am 3'-Ende der Signalsequenz keine geeignete Restriktionsendonucleasestelle verfügbar war, wurde mittels PCR eine BstEII-Stelle eingeführt (d. h. eine stille Mutation). Die folgenden PCR-Primer wurden verwendet:
    SEQ ID NR: 48: 5'-Primer: 5'CAGGTTACCCTGAAAGAGTC3'
    SEQ ID NR: 49: 3'-Primer: 5'GAAGTAGTCCTTGACCAG 3'
  • Aus diesem Plasmid wurde dann ein BstEII-PstI-Restriktionsfragment isoliert. Eine neue Signalsequenz und 5'UTR wurden dann entworfen und synthetisiert, die EcoRI- und BstEII-Enden hatten.
    SEQ ID NR: 46: 5'-Primer: AATTCGAGGACGCCAGCAACATGGTGTTGCAGACCCAGG TCTTCATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGCAG
    SEQ ID NR: 47: 3'-Primer: GTAACCTGCCCGTAGGCACCAGAGATCCAGAGCAACAG AGAAATGAAGACCTGGGTCTGCAACACCATGTTGCTGGCGTCCTCG
  • Die chimäre leichte Kette wurde durch Anwendung der PCR-Technik auf die leichte Kette des ursprünglichen murinen 3B9 konstruiert, die in pGEM72f(+) [Promega] cloniert war. Die verwendeten Primer waren der kommerziell erhältliche universelle reverse pUC18-Primer am 5'-Ende (EcoRI) und ein 3'-Primer, der eine NarI-Stelle einführte [5'CATCTAGATGGCGCCGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3' SEQ ID NR: 52], die verwendet wurde, um den variablen Bereich der Maus mit dem menschlichen konstanten Bereich zu fusionieren. Dieser variable Bereich wurde dann in den Expressionsvektor pCDN ligiert (EcoRI NarI) (8), der bereits den menschlichen kappa-Bereich enthält.
  • Die Überstände der Medien wurden drei und fünf Tage später gesammelt und mit dem vorstehend beschriebenen ELISA wie folgt getestet: die ELISA-Platten wurden mit 0,1 μg Ziegen-Antikörper beschichtet, der für den Fc-Bereich von menschlichen Antikörpern spezifisch ist. Die Überstände der Medien wurden für eine Stunde zugegeben. Ein mit Meerrettich-Peroxidase konjugierter Ziegen-Antikörper, der für einen gesamten menschlichen IgG-Antikörper spezifisch ist, wurde zugegeben. Dem folgte für eine Stunde die Zugabe von ABTS-Peroxidase-Substrat (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, MD). Die Expression des chimären Antikörpers wurde nachgewiesen. In einem zweiten ELISA banden die Überstände von COS-Zellen, die den chimären Antikörper enthielten, spezifisch an rekombinantes menschliches IL4-Protein. Dieses Resultat bestätigte, daß Gene, die einen Antikörper codieren, der spezifisch für IL4 ist, cloniert worden waren.
  • B. Eine humanisierte schwere Kette kann ebenfalls von dieser chimären schweren Kette erhalten werden. Die humanisierte schwere Kette wurde entworfen, indem die murinen CDRs in einen menschlichen Gerüstbereich inseriert wurden. Der ausgewählte menschliche Gerüstbereich war wie vorstehend die am meisten homologe Proteinsequenz in der Swiss Protein-Datenbank bezüglich der murinen 3B9-VH (Aminosäuren 20–140 der SEQ ID NR: 4). Diese humanisierte Sequenz der schweren Kette EcoRI ApaI) wurde synthetisch hergestellt und es wurde, wie vorstehend beschrieben, die PCR durchgeführt, um die DNA aufzufüllen und zu amplifizieren. Dieser synthetische variable Bereich wurde zusammen mit der synthetischen Signalsequenz SEQ ID NR: 5 und 6 von dem Konstrukt der chimären schweren Kette und einem konstanten Bereich von menschlichem IgG1 in den Expressionsvektor pCD EcoRI ApaI) ligiert.
  • In ähnlicher Weise kann eine humanisierte leichte Kette von der chimären leichten Kette abgeleitet werden, wie beschrieben für die schwere Kette. Dieses Gen (EcoRV NarI) wurde ebenfalls synthetisch hergestellt. Die humanisierte VL wurde zusammen mit einer Signalsequenz (EcoRI EcoRV) in den Expressionsvektor pCN ligiert, der mit EcoRI NarI verdaut worden war. Der Expressionsvektor stellte den menschlichen konstanten kappa-Bereich bereit.
  • Beispiel 6 – Reinigung und Thermodynamik – Humanisierter MAb
  • Die Reinigung von von CHO exprimiertem chimärem und humanisiertem 3B9 kann mit herkömmlicher Protein A (oder G)-Affinitätschromatographie erreicht werden, gefolgt von Ionenaustauscher- und Molekularsiebchromatographie. Ähnliche Verfahren wurden erfolgreich bei der Reinigung von bis zu > 95% Reinheit von anderen MAbs angewendet (z. B. bei respiratonischem Syncytial-Virus und Malaria-Circumsporozoit-Antigenen).
  • Die Affinität und detaillierte Thermodynamik der Bindung von IL4 an humanisierten MAb 3B9 und murinen 3B9 (Beispiel 1) wurden mittels Titrationsmikrokalorimetrie bestimmt. Dieses Verfahren mißt Bindungsreaktionen mittels ihrer intrinsischen Reaktionswärme (vgl. z. B. Wiseman et al., Anal. Biochem., 179: 131–137 (1989). Es wurde gefunden, daß die Affinität der beiden MAbs zu eng beieinander lag, um direkt bei Umgebungstemperatur zu messen. Daher wurde ein thermodynamischer Weg gewählt: i) die Affinität wurde bei 60°C gemessen, wo sie schwach genug ist, um direkt gemessen zu werden; und ii) die Temperaturabhängigkeit der Bindungsenthalpie wurde von 30–60°C gemessen. Zusammen erlauben diese Daten unter Verwendung der Gibbs-Helmholtz-Gleichung die Berechnung der Affinität über einen weiten Bereich von Temperaturen.
  • Eine Zusammenfassung der Thermodynamik der Bindung von IL4 an humanisierte und murine 3B9-Antikörper ist in Tabelle 1 dargestellt. Basierend auf den Veränderungen bei der freien Energie, Enthalpie, Entropy und Wärmekapazität der zwei MAbs ist die Bindungsthermodynamik nicht unterscheidbar.
  • Tabelle 1
    Figure 00440001
  • Die IL4-Affinitäten von humanisiertem 3B9 und murinem 3B9 wurden jeweils vierfach und doppelt gemessen.
  • Beispiel 7 – Produktion und Charakterisierung von MAb der Ratte
  • Der MAb 6A1, der wegen der Bindung mit hoher Affinität ausgewählt wurde, wurde von einer immunisierten Ratte abgeleitet, wobei dasselbe Immunisierungsprotokoll verwendet wurde, wie es in Beispiel 1 für die Maus beschrieben wurde. 6A1 wurde aus den Hybridomen ausgewählt (spezifisch Hybridom 3426A11C1B9), die aus Ratten gewonnen wurden, die mit menschlichem IL4 immunisiert worden waren.
  • Die Kd für 6A1 wurde, wie bei Beatty et al. J. Immunol. Methods, 100: 173–179 (1987) beschrieben, zu 2 × 10–10 M berechnet.
  • Das Hybridom 3426A11C1B9 wurde am 6. Oktober 1993 bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Vereinigtes Königreich, unter der Hinterlegungsnummer 931000620 hinterlegt und wurde gemäß dem Budapester Vertrag von 1977, der die Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke des Patentierungsverfahrens regelt, als Patenthinterlegung angenommen.
  • Beispiel 8 – Die biologische Aktivität von MAbs: 3B9 (humanisiert), 3B9 (murin) und 6A1
  • Die folgenden Tests wurden unter Verwendung der nachstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt.
  • A. Bindung an glycosyliertes rhIL4
  • Die vorstehend identifizierten Antikörper wurden gegen nicht glycosyliertes rekombinantes menschliches IL4 (rhIL4) gebildet, das in E. coli produziert wurde. Weil natives menschliches IL4 glycosyliert ist, war es wichtig, die Bindung an Material zu bestätigen, das von einer Säugerzelllinie sezerniert wurde. 3B9 bindet gleichermaßen gut an glycosyliertes und nicht glycosyliertes menschliches rekombinantes IL4 und ist deswegen nicht gegen ein Epitop gerichtet, daß bei einem natürlichen menschlichen IL4 maskiert wäre.
  • B. Inhibierung der Bindung von IL4 an Rezeptor
  • Die Fähigkeit von 3B9, die Bindung von IL4 an seinen Rezeptor zu inhibieren, wurde unter Verwendung der Bindung von 125I-rhIL4 an die Gibbon-Zelllinie MLA [ATCC TIB201] untersucht, die etwa 6000 Rezeptoren pro Zelle trägt. MLA-Zellen wurde 30 Minuten bei 37°C mit 125I-IL4 inkubiert. Die Aufnahme von Radioaktivität wurde nach der Abtrennung von Zell-gebundenem 125I-IL4 durch Zentrifugation mit einem Öl-Gradienten in einem Gammazähler bestimmt. Die unspezifische Bindung wurde durch Inkubation in der Gegenwart eines 100-fachen molaren Überschusses von unmarkiertem IL4 bestimmt [Park et al, J. Exp. Med., 166: 476–488 (1987)]. Der IC50-Wert für unmarkiertes IL4 in diesem Test war 22 pM, wenn die Menge an (zugegebenem) IL4 83 pM war. Für intakten murinen (IgG) 3B9 war der IC50 63 pM und 93 pM für das Fab-Fragment. Bei einer anderen Konzentration von IL4 (218 pM) war die Testmenge für murinen (IgG) 3B9 109 pM.
  • C. Inhibierung der Lymphocytenproliferation
  • Unter Verwendung des bei Spits et al, J. Immunol., 139: 1142–1147 (1987) beschriebenen Verfahrens werden menschliche periphere Blutlymphocyten drei Tage mit Phytohämagglutinin, einem T-Zell-Mitogen, inkubiert, um den IL4-Rezeptor hochzuregulieren. Die resultierenden Blastenzellen werden für weitere drei Tage mit IL4 stimuliert. Die Proliferation wird durch Einbau von 3H-Tymidin gemessen. Die B-Zell-Proliferation wurde mittels des Tests von Callard et al, in Lymphokines and Interferons. A Practical Approach, Kap. 19, S. 345 gemessen, der wie folgt modifiziert war. Gereinigte menschliche B-Zellen der Mandeln werden 3 Tage mit IL4 und immobilisiertem anti-IgM stimuliert. Die Proliferation wird durch Einbau von 3H-Tymidin gemessen.
  • 3B9 (murin) inhibierte den Einbau von 3H-Tymidin durch menschliche periphere T-Lymphocyten des Bluts, die mit 133 pM IL4 stimuliert wurden, und menschliche B-Lymphocyten der Mandeln, die mit 167 pM IL4 stimuliert wurden. Mit IL2 stimulierte T-Lymphocyten wurden nicht beeinflußt. Die IC50 für die Inhibition der T-Zell-Proliferation war 30 pM und für die B-Zell-Proliferation 103 pM. Die entsprechenden Werte für das Fab-Fragment von 3B9 (murin) waren 108 und 393 pM.
  • D. Inhibition der Induktion von CD23
  • CD23 ist der Rezeptor mit niedriger Affinität für IgE (FcERII) und wird auf der Membran von ruhenden B-Lymphocyten durch niedrige Konzentrationen von IL4 als notwendige Vorraussetzung für die IgE-Produktion induziert. Gereinigte menschliche B-Zellen der Mandeln werden 2 Tage mit IL4 stimuliert. Der Prozentsatz der Zellen, die den CD23-Rezeptor exprimieren, wird mittels Durchflußcytometrie bestimmt [Defrance et al, J. Exp. Med., 165: 1459–1467 (1987)]. 3B9 (murin) inhibierte die Expression von CD23 auf menschlichen B-Lymphocyten der Mandeln, die mit 8,3 pM IL4 stimuliert waren, mit einem IC50-Wert von 136 pM.
  • E. Inhibition der Sezernierung von IgE
  • Anders als bei anderen Tests, bei denen IL4 mit EC50-Konzentrationen [Pere et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 6880–6884 (1988)] zugegeben wurde, wurde die Sezernierung von IgE in der Gegenwart von Konzentrationen an IL4 untersucht, die eine maximale Sezernierung ergaben, um die dem System inhärente Variabilität zu reduzieren. Die T-Zell-Proliferation wurde wie folgt gemessen. Menschliche periphere Blutlymphocyten wurden mit IL4 zwischen 10–18 Tage, vorzugsweise 12 Tage, inkubiert. Die Konzentration an IgE im Kulturüberstand wird mittels ELISA bestimmt.
  • Die Sezernierung von IgE wurde durch 3B9 (murin) und das Fab-Fragment von 3B9 in der Gegenwart von 1,7 nM IL4 inhibiert was IC50-Werte von 1,9 bzw. 5,0 nM ergibt. Das Experiment wurde unter Verwendung einer niedrigeren Konzentration an IL4, 667 pM, wiederholt, was den IC50-Wert auf 0,65 nM für 3B9 (murin) reduzierte. Das molare Verhältnis von Antikörper (IgG) zu IL4 blieb über die untersuchten Konzentrationsbereiche unverändert (1 : 1).
  • F. Zusammenfassung und Interpretation der Ergebnisse
  • Die molaren Verhältnisse von IL4 zu verschiedenen MAbs, die für 50% Inhibition der Funktion in Biotests erforderlich waren, sind in Tabelle 2 gezeigt.
    Figure 00470001
    • n
    Zahl an einzelnen Tests, die durchgeführt wurden.
  • Bei allen Tests, außer bei der IgE-Sezernierung, wurde IL4 mit etwa ED50-Konzentrationen zugegeben. Die molaren Verhältnisse von Antikörper zu IL4, die für 50% Inhibition erforderlich waren, waren in den beiden Lymphocytenproliferationstests ähnlich für humanisierten 3B9, murinen 3B9 und 6A1, für humanisierten 3B9 aber höher in dem CD23-Induktionstest. Der letztere ist ein besonders empfindlicher Test, der offensichtlich eine sehr niedrige (~5%) Rezeptorbelegung erfordert [Kruse et al., EMBO J., 12: 5121 (1993)] und er ist, wie aus den erhaltenen Ergebnissen mit murinem 3B9 ersichtlich, Variationen zwischen den Test unterworfen.
  • Ein Vergleich der Aktivitäten von 6A1 der Ratte und murinem 3B9 zeigte ein ähnliches Profil an funktionellen Wirkungen, aber ein unerwartetes Versagen von 6A1 bei der vollständigen Inhibition der Bindung von radioiodiertem IL4 an seinen Rezeptor. Man vermutet, daß das radioiodierte IL4, das in dem Rezeptorenbindungstest verwendet wird, an dem zugänglichen Tyrosinrest 124 iodiert wird. Wenn die Fähigkeit von 6A1 zur Inhibition der Expression von CD23, die von nicht markiertem oder iodiertem IL4 induziert wurde, verglichen wurde, wurde gefunden, daß die Inhibition bei dem iodierten Liganden weniger wirksam war. Dieses Ergebnisse zeigen, daß 6A1 an IL4 im Bereich von, aber nicht spezifisch an, Tyrosin 124 bindet.
  • Somit ist nach den vorliegenden Ergebisen 6A1 ein neutralisierender Antikörper mit hoher Affinität, der an einen ganz unterschiedlichen Bereich von IL4 bindet als 3B9.
  • Beispiel 9 – Pharmakokinetik
  • Die Pharmakokinetik von humanisiertem 3B9 wurde in der männlichen Sprague Dawley-Ratte untersucht. Humanisierter 3B9 wurde vier Tieren als eine iv-Bolusdosis mit 1 mg/kg verabreicht, Blut wurde nach der Dosierung 5 Wochen lang ständig entnommen. Die Plasma-Konzentrationen von humanisiertem 3B9 wurden unter Verwendung eines IL-4/anti-Mensch-IgG-Sandwich-ELISAs bestimmt, der so entworfen war, daß er nicht nur die Anwesenheit von zirkulierendem menschlichem IgG bestätigte, sondern auch seine Fähigkeit, an rekombinantes menschliches IL-4 zu binden.
  • Die Ergebnisse von dieser Untersuchung sind in Tabelle 3 zusammengefaßt.
  • Tabelle 3 Pharmakokinetik von humanisiertem 3B9 in männlichen Sprague Dawley-Ratten (Dosis: 1 mg/kg iv-Bolus)
    Figure 00490001
  • Die Abkürzungen für die pharmakokinetischen Parameter sind wie folgt: Clp, offensichtliche Klärung des Plasmas
  • Die Ergebnisse zeigten, daß die Variabilität zwischen den Tieren relativ klein war und daß das Verschwinden von humanisiertem 3B9 aus dem Plasma in zwei Phasen abzulaufen scheint. Die offenbare Plasmaklärung war niedrig (0,5 ml/h/kg). Die Halbwertszeit schien 11 Tage zu sein. Somit waren die pharmakokinetischen Charakteristika des von CHO-Zellen abgeleiteten humanisierten 3B9 konsistent mit anderen humanisierten monoclonalen Antikörpern in Ratten. Die lange Halbwertszeit der Zirkulation von humanisiertem 3B9 in der Ratte legt auch nahe, daß wenn humanisierter 3B9 einem Menschen verabreicht wird, er wahrscheinlich über einen längeren Zeitraum wirksam ist.
  • Zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind in der vorstehend dargelegten Beschreibung eingeschlossen und es ist anzunehmen, daß sie dem Durchschnittsfachmann auf dem Fachgebiet offensichtlich sind. Zum Beispiel können andere menschliche Gerüstbereiche oder Modifikationen davon als die vorstehend beschriebenen exemplarischen Antikörper bei der Konstruktion der humanisierten Antikörper verwendet werden. Wir nehmen an, daß solche Modifikationen oder Veränderungen bei den Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung im Umfang der beigefügten Ansprüche eingeschlossen sind.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (33)

  1. Fusionsprotein mit einer Bindungsspezifität für menschliches Interleukin-4 (IL4), das die Komplementarität-bestimmenden Bereiche (CDRs), die von einem nicht-menschlichen, neutralisierenden monoclonalen Antikörper stammen, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist, und einen ersten Fusionspartner umfasst.
  2. Fusionsprotein nach Anspruch 1, das funktionell mit einem zweiten Fusionspartner verbunden ist.
  3. Fusionsprotein nach Anspruch 2, wobei der zweite Fusionspartner die gesamte oder einen Teil einer konstanten schweren Kette eines Immunoglobulins oder einer konstanten leichten Kette eines Immunglobulins oder beide umfasst.
  4. Fusionsprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der nicht-menschliche, neutralisierende monoclonale Antikörper 6A1 ist, der von dem Hybridom ECACC 93100620 hergestellt wird.
  5. Fusionsprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Fusionspartnersequenz die schwere Kette-Sequenz der Aminosäuren 21–50, 56–71, 88–119 und 131–141 von SEQ ID NR: 12 ist.
  6. Fusionsprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die erste Fusionspartnersequenz die leichte Kette-Sequenz der Aminosäuren 20–42, 58–72, 80–111 und 121–131 von SEQ ID NR: 14 ist.
  7. Fusionsprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenzen der Komplementarität-bestimmenden Bereiche für die schwere Kette sind: (a) ThrSerGlyMetGlyValSer: SEQ ID NR: 22, (b) HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: SEQ ID NR: 24, oder (c) ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: SEQ ID NR: 26.
  8. Fusionsprotein nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Aminosäuresequenzen der Komplementarität-bestimmenden Bereiche für die leichte Kette sind: (a) LeuAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn: SEQ ID NR: 16, (b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: SEQ ID NR: 18, oder (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: SEQ ID NR: 28.
  9. Fusionsprotein nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenzen der Komplementarität-bestimmenden Bereiche für die leichte Kette sind: (a) LysAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn: SEQ ID NR: 16, (b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: SEQ ID NR: 18, oder (c) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: SEQ ID NR: 20.
  10. Fusionsprotein nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: SEQ ID NR: 24, und (b) ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: SEQ ID NR: 26.
  11. Fusionsprotein nach Anspruch 1, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: SEQ ID NR: 28, und (b) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: SEQ ID NR: 20.
  12. Nucleinsäuremolekül, das ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 codiert, welches einen Komplementarität-bestimmenden Bereich (CDR) einer schweren Kette eines Immunglobulins umfaßt, dessen Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC: SEQ ID NR: 21, (b) CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC: SEQ ID NR: 23, (c) AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC: SEQ ID NR: 25, (d) ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC: SEQ ID NR: 54, (e) CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC: SEQ ID NR: 55, und (f) CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT: SEQ ID NR: 56.
  13. Nucleinsäuremolekül, das ein Fusionsprotein nach Anspruch 1 codiert, welches einen Komplementarität-bestimmenden Bereich (CDR) einer leichten Kette eines Immunglobulins umfaßt, dessen Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC: SEQ ID NR: 53; (b) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: SEQ ID NR: 19, und (c) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG: SEQ ID NR: 27.
  14. Isolierte Nucleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einer Nucleinsäuresequenz, die das Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9 codiert; (b) einer Nucleinsäuresequenz, die komplementär zu (a) ist; und (c) einem Fragment oder Analogon von (a) oder (b), das ein Protein codiert, das dadurch charakterisiert ist, dass es eine Bindungsaffinität für menschliches Interleukin-4 hat, die charakterisiert ist durch einen Kd-Wert, der gleich oder weniger als 2 × 10–10 M ist.
  15. Isolierte Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 14, wobei die Sequenz, die das Fusionsprotein codiert, die Nucleinsäuresequenz von 5, SEQ ID NR: 13 umfaßt.
  16. Isolierte Nucleinsäuresequenz nach Anspruch 14, wobei die Sequenz, die das Fusionsprotein codiert, die Nucleinsäuresequenz von 4, SEQ ID NR: 11 umfaßt.
  17. Rekombinantes Plasmid, umfassend die Nucleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 14 bis 16.
  18. Wirtszelle, transfiziert mit dem rekombinantem Plasmid nach Anspruch 17.
  19. Verfahren zur Herstellung eines humanisierten Antikörpers, der spezifisch für menschliches Interleukin-4 ist umfassend Züchten einer Zelllinie, die mit dem rekombinanten Plasmid nach Anspruch 17 transfiziert ist, unter der Kontrolle von ausgewählten regulatorischen Sequenzen, welche die Expression davon in den Zellen bewirken können.
  20. Verfahren zur Diagnose von Allergien und anderen Zuständen, die mit übermäßiger Immunglobulin E-Produktion in einem Mensch verbunden sind, wobei das Verfahren umfaßt Inkontaktbringen einer Probe einer biologischen Flüssigkeit mit einem monoclonalen Antikörper, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als etwa 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist, und Testen auf das Auftreten einer Bindung zwischen dem monoclonalen Antikörper und menschlichem Interleukin-4.
  21. Verfahren zum Durchmustern von monoclonalen Antikörpern, die durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert sind, die gleich oder weniger als etwa 2 × 10–10 M für menschliches Interleukin-4 ist, wobei das Verfahren umfaßt: (a) Herstellen einer Hybridomzelllinie, die durch Sekretion eines monoclonalen Antikörpers gegen menschliches Interleukin-4 charakterisiert ist; und (b) Durchmustern der Hybridomzelllinie mit Aldehyd-gekoppeltem menschlichen Interleukin-4.
  22. Neutralisierender monoclonaler Antikörper, erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 21, der durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als etwa 2 × 10–10 M für menschliches Interleukin-4 ist.
  23. Neutralisierender monoclonaler Antikörper nach Anspruch 22, wobei der neutralisierende monoclonaler Antikörper von einem Nagetier stammt.
  24. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 22, wobei das Nagetier eine Maus ist.
  25. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 24, der die leichte Kette-Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 und die schwere Kette-Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 4 umfasst.
  26. Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 23, wobei das Nagetier eine Ratte ist.
  27. Hybridom, das einen Antikörper nach einem der Ansprüche 23 bis 26 produzieren kann.
  28. Hybridom nach Anspruch 27, wobei das Hybridom ECACC 93100620 ist.
  29. Humanisierter Antikörper, umfassend eine schwere Kette und eine leichte Kette, wobei der humanisierte Antikörper durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als etwa 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist, wobei die Rahmenbereiche der schweren und leichten Ketten von mindestens einem ausgewählten menschlichen Antikörper stammen und die Aminosäurequenzen der Komplementarität-bestimmenden Bereiche der schweren Kette und der leichten Kette von dem neutralisierenden monoclonalen Antiköper nach Anspruch 23 stammen.
  30. Antikörper nach Anspruch 29, wobei der Antikörper gegebenenfalls mit einem Effektorwirkstoff verbunden ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Nicht-Protein-Trägermolekül, Polystyrol und Plastikkügelchen.
  31. Chimärer Antikörper, umfassend eine schwere Kette und eine leichte Kette, wobei der chimäre Antikörper durch eine Dissoziationskonstante charakterisiert ist, die gleich oder weniger als etwa 2 × 10–10 M für menschliches IL4 ist, wobei die Aminosäuresequenzen der Komplementarität-bestimmenden Bereiche der schweren Kette und der leichten Kette von dem neutralisierenden monoclonalen Antikörper nach Anspruch 23 stammen.
  32. Arzneimittel, umfassend das Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder den Antikörper nach Anspruch 29, 30 oder 31 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
  33. Fusionsprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder Antikörper nach Anspruch 29, 30 oder 31 zur Verwendung bei der Behandlung von Allergien und anderen Zuständen, die mit übermäßiger IgE-Produktion in einem Mensch verbunden sind.
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