BRPI0713484A2 - expressão diferencial de citocina em cáncer humano - Google Patents
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Abstract
EXPRESSãO DIFERENCIAL DE CITOCINA EM CáNCER HUMANO. A presente invenção refere-se a um processo para diagnóstico de um tipo de câncer, pelo que a expressão e citocinas antiapoptóticas é determinadas nas células de tumor. O diagnóstico diferencial da presente invenção é usado para classificar distúrbios de tumor e para recomendar o tratamento requerido e para monitorar o progresso e resposta ao tratamento.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE CITOCINA EM CÂNCER HUMANO".
Descrição
A presente invenção refere-se a um processo para diagnóstico de um tipo de câncer, pelo que a expressão de citocinas antiapoptóticas nas células de tumor é determinada. O diagnóstico diferencial da presente inven- ção é usado para classificar distúrbios de tumores e para recomendar o re- querido tratamento e para monitorar o progresso e resposta ao tratamento.
O balanço entre sobrevivência de célula e morte de célula é con- trolado por fatores pró-apoptóticos e antiapoptóticos, cuja desregulação con- tribui para o desenvolvimento de várias condições patológicas, incluindo câncer. Alta expressão de fatores antiapoptóticos é comumente encontrada em cânceres humanos e contribui para ambas, expansão de célula neoplás- tica e resistência à ação terapêutica de fármacos citotóxicos. Já foi reportado que produção autócrina de citocinas antiapoptóticas por células de tumor modula fortemente a suscetibilidade para o receptor e apoptose induzida por quimioterapia. Em particular, foi previamente reportado que IL-4 e IL-10 atu- am como fator de crescimento autócrino em células de câncer induzindo re- gulação ascendente de proteínas antiapoptóticas, que protegem as células de tumor da morte induzida por fármacos quimioterapêuticos (Stassi et al., Câncer Res. 63, 6784-90 (2003), Todaro et al., Câncer Res. 66, 1491-9 (2006)).
Tumores são compostos por uma combinação heterogênea de células, com diferentes características terapêuticas e diferentes potenciais proliferativos. Em particular, células de câncer podem originar progênie feno- tipicamente diversa de células, tanto dotadas com um definido potencial pro- Iiferativo como tendo um limitado ou nenhum potencial proliferativo.
Neste sentido recente evidência sugere que a capacidade de crescimento tumorigênico é de fato confinado a um pequeno subconjunto de assim chamadas células tronco de câncer (CSC). O pedido de patente inter- nacional PCT/IT2005/000523 mostra um processo de isolamento e cultura de células tronco a partir de tumores sólidos. Esta sub-população de células de câncer pode auto - renovar e originar uma população de células hetero- gêneas que exibem diversos graus de diferenciação. Além disso, foi recen- temente verificado que estas células tronco de câncer são significantemente resistentes a apoptose induzida por droga, assim escapando de terapias an- ti-tumor e esta sendo provavelmente a razão subjacente para ineficiência de quimioterapia.
Foi agora demonstrado que CSC produz predominantemente IL-4 e IL-10 e são responsáveis pela alteração mencionada acima de sensibili- dade de morte de célula induzida por fármaco. Foi agora verificado pelos inventores da presente invenção que
tumores sólidos podem ser diferenciados em relação a nível e/ou perfil de expressão de citocina antiapoptótica. A expressão de citocinas antiapotóti- cas difere entre tumores individuais do mesmo órgão e mesmo dentro de células ou porções de um tumor simples. Estes resultados conduzem a no- vas eficientes estratégias no diagnóstico e/ou terapia de tumor.
Em particular, um objeto da presente invenção foi prover um processo que permite a identificação e diagnóstico de tipos de câncer e célu- las de câncer que expressam citocinas antiapoptóticas.
Da mesma maneira, a presente invenção provê um processo para diagnóstico de tipos de tumores, especialmente tipos de tumores sóli- dos, usando citocinas antiapoptóticas como um alvo. Particularmente, a in- venção refere-se a um processo para diagnóstico de um tipo de câncer compreendendo as etapas de:
(a) provimento de uma amostra a partir de um tumor sólido com- preendendo células de tumor,
(b) determinação de expressão de pelo menos uma citocina an- tiapoptótica nas ditas células de tumor, e
(c) classificação de tumor sólido como um tumor expressando não-citocina ou como um tumor expressando citocina.
Portanto, a invenção refere-se a diagnóstico diferencial de tipos
de cânceres através da determinação e/ou quantificação do perfil de expres- são e/ou nível de citocinas antiapoptóticas na amostra de tumor. Como cito- cinas antiapoptóticas, IL-4 e/ou IL-10, particularmente IL-4, é preferida.
O diagnóstico diferencial da invenção permite classificar tipos de tumores e identificar aqueles que mostram expressão de citocinas antiapop- tóticas e que são refratários a tratamento com agentes quimioterapêuticos.
Portanto, a expressão de citocinas antiapoptóticas é um significante marca- dor para classificação de tumor o que permite a seleção de estratégias tera- pêuticas alvejadas.
Por exemplo, o processo da invenção pode ser útil para prever se um paciente sofrendo de um certo tipo de câncer pode ser resistente ou suscetível a uma certa terapia e para prover uma otimizada estratégia de tratamento.
De acordo com a presente invenção, foi verificado que tipos de câncer podem ser classificados como tumores expressando não-citocina ou como tumores expressando citocina. Quando determinando a expressão de IL-4 e/ou IL-10, mais par-
ticularmente, a expressão de IL-4, os tumores sólidos podem ser classifica- dos com relação a sua expressão de tanto somente IL-4 como somente IL-10 ou ambas IL-4 e IL-10. Por isso, o processo de acordo com a presente invenção permite a diferenciação entre tumor sólido classificado como tumo- res expressando IL-4 ou tumores não-expressando IL-4, tumor sólido classi- ficado como tumores expressando IL-10 ou tumores não-expressando IL-10 e tumor sólido classificado como tumores expressando IL-4 e IL-10 ou tumo- res expressando não-IL-4 e não-IL10.
O processo da presente invenção é preferivelmente realizado sobre tumores sólidos e em particular sobre tumores epiteliais. Os ditos tu- mores epiteliais podem ser escolhidos do grupo consistindo em câncer de tiróide, mama, próstata, bexiga, cólon, gástrico, pâncreas, rim, fígado e pul- mão. Mais preferivelmente, o tumor epitelial é um câncer de cólon, gástrico, mama, pulmão, bexiga ou próstata. O processo diagnóstico da presente invenção pode ser realizado
sobre várias amostras de células de um tumor sólido. Uma amostra teste é preferivelmente uma amostra de células de tumor primário e/ou do ambiente de tumor isolado de um sujeito, por exemplo, um paciente humano. Por e- xemplo, tecido de célula de tumor obtido por biópsia, ressecção, ou outras técnicas pode ser testado. A amostra de tumor compreende células de tu- mor. A expressão de citocina antiapoptótica nas células de tumor é preferi- velmente determinada sobre células de tumor primário e/ou células tronco de câncer.
Processos para a determinação da expressão de citocina antia- poptótica nas células de tumor são bem-conhecidos na técnica. A determi- nação da expressão, em particular a superexpressão, da citocina antiapoptó- tica na célula de tumor é conduzida pela detecção da dita citocina no nível de proteína e/ou o nível de ácido nucléico.
A determinação de proteínas citocinas pode ser realizada nas células de tumor ou no microambiente de tumor. Processos para determina- ção de presença e quantidade de proteínas citocina em uma dada amostra são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica e podem ser proces- sos imuno-químicos como processos de imunohistoquímica, Western blot- ting, imunoprecipitação e ELISA. Ainda processos baseados em espectro- metria de massa, compreendendo MALDI-MS, podem ser usados para de- terminar a presença e quantidade de proteínas citocinas.
Ácidos nucléicos citocina são detectados e quantificados aqui através de qualquer um dos meios conhecidos por aqueles versados na téc- nica. Técnicas de hibridização junto com opcionais processos de amplifica- ção são freqüentemente usados para detecção de ácidos nucléicos. Expres- são de RNAms de citocina pode ser, por exemplo, detectada através de aná- lise Northem blot ou por transcrição reversa e subsequente amplificação por PCR.
O processo de acordo com a invenção ainda pode compreender a etapa de
(d) determinação de sensitividade das células de um tumor ex- pressando citocina contra pelo menos um agente quimioterapêutico ou pró- apoptótico na presença e/ou na ausência de um antagonista da dita citocina expressa e/ou seu receptor. De modo a investigar a sensitividade das células de tumor ex- pressando citocina a agentes quimioterapêuticos e/ou pró-apoptóticos, a vi- abilidade das células de tumor expostas aos ditos agentes quimioterapêuti- cos ou pró-apotóticos na ausência e/ou presença de agentes de neutraliza- ção de citocina pode ser medida. Processos para determinação de sensitivi- dade das células de tumor a um dado agente são bem-conhecidos por aque- les versados na técnica (por exemplo, como descrito em Exemplos).
Baseado nesta determinação, o processo de acordo com a pre- sente invenção ainda pode compreender a etapa de
(e) seleção de um tratamento específico para tipo de câncer.
Como já mencionado, a invenção é baseada na observação de que tumores sólidos podem ser diferenciados por sua expressão ou grau de expressão de citocinas antiapoptóticas e em particular citocinas IL-4 e IL-10. Uma vez que a expressão de citocinas antiapoptóticas IL-4 e IL-10 em tumo- res ou células de tumores é responsável pela refratariedade a tratamento, por exemplo, com agentes quimioterapêuticos e/ou pró-apoptóticos, as cito- cinas antiapoptóticas devem ser neutralizadas de modo a aumentar a sensi- tividade do tumor na direção de tratamento. Assim, a invenção também pode abranger um exame da sensitividade ou resistência a agentes quimiotera- pêuticos e/ou pró-apoptóticos em combinação com antagonistas de uma ci- tocina expressa pelo tumor.
Em uma modalidade preferida, o ensaio de sensitividade reali- zado na etapa (d) do processo conduz à determinação de um agente quimio- terapêutico ou pró-apoptótico contra o qual a célula dos tumores expressan- do citocina são particularmente sensíveis
Consequentemente, de acordo com a etapa (e) da presente in- venção, um tratamento específico de tipo de tumor pode ser selecionado compreendendo a administração de uma combinação de um agente de neu- tralização de citocina e um agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico.
Um agente de neutralização de citocina pode ser qualquer com- posto que reduz a quantidade e/ou atividade de uma citocina. Por exemplo, o agente de neutralização de citocina pode ser um agente que inibe um ca- minho de transdução de sinal disparado pela citocina expressa autocrina- mente pelas células de tumor. Portanto, qualquer agente é contemplado que seja capaz de modular a expressão, e/ou função de uma citocina diretamen- te e/ou indiretamente, por exemplo, afetando a expressão e/ou função da respectiva proteína citocina e/ou receptor de citocina.
Preferivelmente, o agente de neutralização de citocina é um a- gente de neutralização de IL4 e/ou IL-10, isto é, qualquer agente que seja capaz de inibir o caminho de transdução de sinal disparado pela expressão autócrina de IL-4 e/ou IL-10.
Agentes de neutralização de citocina podem ser selecionados, entre outros, de agentes que inibem e/ou reduzem a atividade de proteína citocina expressa, agentes que degradam a proteína citocina expressa e a- gentes que inibem a produção de citocina. Agentes que bloqueiam a ativida- de de citocina são, por exemplo, antagonistas que bloqueiam receptores de citocina, por exemplo, peptídeos, moléculas pequenas, variantes muteína das citocinas que mostram uma atividade antagonista comparado ao sinal original da citocina. Exemplos para tais muteínas são em particular muteínas IL-4 como Aerolast de Aerovance e Pitrakinra e BAY-36-1677 de Bayer. Ain- da anticorpos contra o receptor de citocina ou anticorpos contra a proteína citocina podem ser usados. O anticorpo é preferivelmente um anticorpo con- tra IL-4 e/ou IL-10, por exemplo, anticorpos de Amgen e Immunex ou um anticorpo contra o receptor de IL-4 e/ou o receptor de IL-10, por exemplo, o anticorpo Pascolizumab de Glaxo. O anticorpo pode ser um anticorpo com- pleto, por exemplo, um anticorpo IgG, ou um seu fragmento de ligação de antígeno. Preferivelmente, o anticorpo é um anticorpo humanizado ou qui- mérico monoclonal que tem domínios constantes humanos, por exemplo, domínios IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4 constantes humanos. Mais preferivel- mente, o anticorpo é um anticorpo humanizado que adicionalmente compre- ende regiões de estrutura humanas. Também são preferidos fragmentos de anticorpos, por exemplo, fragmentos de anticorpos monovalentes ou divalen- tes como os fragmentos F(ab)2. Por outro lado, o anticorpo pode ser um an- ticorpo recombinante, por exemplo, um anticorpo de cadeia simples ou um seu fragmento, por exemplo, um fragmento scFv.
Receptores de citocina solúveis, preferivelmente sem a extensão de membrana e o domínio intracelular, também podem ser usados como agentes de bloqueio de atividade de citocina. Estes receptores solúveis são, por exemplo, de Regeneron, em particular proteínas de fusão IL-4R/IL-13R- Fc1 e receptores solúveis de Amgen e Immunex, em particular Nuvance e Altrakincept. Exemplos específicos de receptores solúveis compreendem o domínio extracelular (ECD) de um receptor de IL-4 humana, por exemplo, um ECD encurtado de alfa aminoácido 24 de IL-4R até aminoácido 224, 225, 226, 227, 228, 229 ou 230, e ainda opcionalmente domínios, por exemplo, o domínio extracelular de um receptor de 11-13 humana e/ou um domínio de imunoglobulína Fc humana.
Como exemplo preferido de agentes que degradam a proteína citocina expressa proteases desenhistas podem ser mencionadas no contex- to da presente invenção. A produção das proteínas citocinas pode, por outro lado, ser inibida por exemplo, por agentes atuando sobre os níveis nucléicos tal como ácidos nucléicos antissenso, moléculas de siRNA e /ou ribozimas.
Antagonistas de citocina preferidos são descritos no pedido de patente internacional WO 2004/069274. Anticorpos direcionados contra cito- cinas são peferivelmente usados como agentes de neutralização de citocina. Anticorpos anti-IL-4 mostrados no pedido de patente EP-A-0 730 609 são especialmente apropriados como agentes de neutralização de citocina do processo da presente invenção. Em uma modalidade muito preferida, o anti- corpo derivado do anticorpo monoclonal 6a1 produzido por linha de célula hibridoma ACC93100620 ou um seu fragmento de ligação de antígeno é u- sado como agente de neutralização de citocina.
O agente quimioterapêutico usado em etapas (d) e/ou (e) é sele- cionado de antimetabólitos, agentes de fragmentação de DNA, agentes de reticulação de DNA, agentes intercalantes, inibidores de síntese de proteína, inibidores de topoisomerase I e II, agentes direcionados a microtúbulos, ini- bidores de cinase, hormônios e antagonistas de hormônios. Particularmente, o agente quimioterapêutico é selecionado de cisplatina, carboplatina, e oxa- liplatina. Como agentes pró-apoptóticos preferidos, TRAIL e Iigante CD95 podem ser selecionados.
Baseado nos resultados obtidos a partir da administração com- binada de antagonistas de citocina anti-terapêuticos e agentes quimiotera- pêuticos e/ou pró-apoptóticos à célula de tumor, uma estratégia terapêutica pode ser desenvolvida baseado em uma específica combinação de fármacos que provou ser efetiva.
Ainda um objeto da presente invenção é por isso o uso de uma combinação de um agente de neutralização de citocina e um agente quimio- terapêutico ou pró-apoptótico e a fabricação de um medicamento para o tra- tamento de tumor, tal como um tratamento de tumor de primeira linha ou como tratamento de tumor da segunda ou terceira linha, por exemplo, para o tratamento de tumores refratários, tais como tumores que se tornaram refra- tários contra um ou mais agentes antitumor.
Assim, ainda um aspecto da presente invenção é o uso de uma combinação de (i) pelo menos um agente de neutralização de citocina e (ii) pelo menos um agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico para a fabrica- ção de um medicamento para o tratamento de um tipo de câncer classificado como tumor expressando citocina.
Uma das principais causas de resistência a fámarvo em células de tumor é baseada na observação de que uma pequena população sobre- vivente de células de tumor, e em particular de células-tronco de tumor, após uma regressão aparentemente completa ou excisão cirúrgica do tumor pri- mário pode renovar o tumor e contribuir para a assim chamada doença resi- dual mínima (MRD).
Neste sentido, uma vez que a terapia de combinação é particu- larmente apropriada para aumento de sensitividade terapêutica de células- tronco de tumor, ainda um aspecto da presente invenção é o uso de uma combinação de
(iii) pelo menos um agente de neutralização de citocina e
(iv) pelo menos um agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doença residual mínima.
De acordo com uma realização preferida da presente invenção, o uso de uma terapia combinada dos agentes acima (i) e (ii) ainda pode ser em combinação com cirurgia e/ou terapia de irradiação. Em particular, a combinação de medicamentos é para terapia de combinação seqüencial, separada ou simultânea, com cirurgia e/ou terapia de irradiação.
De acordo com uma realização preferida da presente invenção, a administração de agente (i) e agente (ii) é iniciada simultaneamente. Alter- nativamente, a terapia de combinação pode ser iniciada em etapas. De a- cordo com esta realização preferida da invenção, o início da administração do agente de neutralização de citocina (i) é < 1 semana antes de administra- ção do agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico (ii). A administração do agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico (ii) por sua vez pode ser iniciada > 1 semana antes de administração do agnete de neutralização de citocina
(i).
Ainda uma modalidade da invenção é um polipeptídeo receptor de IL-4 solúvel ou polipeptídeo de fusão compreendendo um domínio extra- celular encurtado de terminal-C, por exemplo, um domínio encurtado por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais aminoácidos ou uma molécula de ácido nucléico codificando tal polipeptídeo. O domínio extracelular encurtado pode ser deri- vado, por exemplo, de receptor alfa de IL-4 humana acesso NCBI NP_000409) que termina com terminal-C em aminoácidos 230, 229, 228,227, 226, 225 ou 224. Preferivelmente a extremidade terminal-C é aminoáci- do 224. O polipeptídeo pode compreender pelo menos ainda um domínio, por exemplo, um peptídeo sinal terminal-N, ainda um domínio efetor, por e- xemplo, um domínio extracelular de receptor de IL-13, um domínio imuno- globulina Fc, e/ou um domínio de purificação. Um exemplo de um polipeptí- deo IL-4R encurtado é descrito no Exemplo 4. O polipeptídeo IL-4R encurta- do é apropriado para aplicações farmacêuticas, por exemplo, para o trata- mento de tumores, particularmente para o tratamento de tumores associados
com IL-4 como descrito acima.
A invenção é ainda ilustrada pelos exemplos que se seguem. Exemplos
Materiais e Processos
Tecidos humanos.
Espécimes de câncer foram obtidos no momento de tratamento cirúrgico, de acordo com os padrões éticos do comitê institucional responsá- vel por experimentação humana. Enquanto tecidos normais foram obtidos da parte contra - lateral do tumor removido cirurgicamente. Diagnóstico histoló- gico foi baseado nas características microscópicas comportamentais de cé- lulas de carcinoma determinando o tipo histológico e grau.
Purificação de célula primária humana.
Tecidos normais e de câncer foram digeridos por 2 horas com colagenase (1,5 mg/mL) (Gibco BRL1 Grand Island, NY) e hialuronidase (20 pg/mL) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) como previamente descrito (1). Uma vez digeridas, células foram mantidas sobre plástico em meio DMEM (EuroCLone Ltd., West York, UK) a 37°C em uma atmosfera umedecida de 5% de CO2. Seguindo ainda 12 horas de cultura, células de câncer foram deixadas crescer em monocamadas para a imuno citoquímica ou descoladas com tripsina +EDTA para análises de níveis de transcrito de gene e expres- são de proteína, funcional. Para cultura de células de cólon e gástricas, plás- tico foi revestido com / cm2 de colágeno (Calbiochem GmbH, Darmstadt, Germany). Células de câncer foram cultivadas na presença ou ausência de IL-4 recombinante humana (20ng/mL), IL-10 (40ng/mL) (Euroclone, Paign- ton, US), anticorpos neutralizantes contra IL-4 humana (10 μ/mL) (R&D Sys- tems, Europe, Ud) por 48 horas). Anti-CD95 (mAb CH-11; Upstate Biotech- nology Inc.) ou IgM controle (Sigma) ou TRAIL zipper isoleucina (iz-TRAlL; 200 ng/mL) foram usados para determiner sensitividade a apoptose induzida por TRAIL ou CD95 em células de câncer. Além disso, seguindo exposição a anti-IL-4 e anti-IL-10 células de câncer foram tratadas com oxaliplatina (100 μΜ) ou doxorrubicina (5 μΜ) ou cisplatina (300 ng/mL), ou taxol (5 μΜ) (Sig- ma) ou etoposide (1 μΜ; Biomol, Plymouth Meeting, PA).
Ensaios de Sobrevivência e Morte.
Para avaliar eventos apoptóticos as análises de citometria de fluxo e manchamento de DNA foram realizadas. A porcentagem de núcleos hipodiplóides foi avaliada como descrito em Stassi et al., Câncer Res. 2003, 63 (20):6784-90. Alternativamente, células humanas purificadas de câncer foram revestidas em placas de 96 cavidades em triplicata em 1500 células / cavidade e cultivadas. O número de células viáveis foi detectado por CeIITi- ter Aqueous Assay Kit (Promega Corporation, Wl1 USA) seguindo as instru- ções do fabricante. Células HuT78 revestidas em 2x150mmL e tratadas com anticorpo de ativação - CD95 CH11 (200 ng/mL) foram usado como um con- trole positivo para medição de morte de células.
Análises Imuno Histoquímicas.
Imuno histoquímica foi realizada sobre seções de amostra de tumor e normal de cólon, gástrica, próstata, mama, pulmão, fígado, pân- creas, rim e bexiga embutidas em parafina de 5pm de espessura. Seções que tiveram a cera retirada foram tratadas por 10 minutos em forno de mi- croondas em tampão citrato 0,1M. Então, seções foram incubadas por 10 minutos com solução salina Tampão Tris (TBS) contendo soro humano AB 10% para bloquear o manchamento não-específico. Após eliminação de ex- cesso de soro, seções foram expostas por toda noite a 4°C a anticorpos es- pecíficos contra IL-4 (B-S4 camundongo IgGI, Caltag Laboratories, Burlin- game, CA), IL-10 (IgG2a, camundongo B-N10, caltag), IL-4Ralfa (IgG coelho C-20, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), IL-10R (IgG coelho C-20, Santa Cruz Biotechnology), TRAIL-R1 (lgG1 camundongo HS101, Aléxis Biochemicals, Lausen, CH), TRAIL-R2 (lgG1 camundongo HS201, Alexis) ou controles emparelhados - isotipo em apropriadas diluições. Seguindo expo- sição a anticorpo primário células foram tratadas com imunoglobulinas anti- camundongo ou anticoelho biotiniladas, lavadas em TBS e então incubadas com streptavidina peroxidase (Dako LSAB 2 Kit, Dako Corporation Carpinte- ria CA, USA). Manchamento foi detectado usando 3-amino-9-etil carbazol (AEC) como um substrato colorimétrico. Contra - manchamento de células foi realizado usando hematoxilina aquosa. Análises RT-PCR.
RNA total foi preparado a partir de células cultivadas usando o Rneasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Germany) de acordo com instruções do fa- bricante. Amplificação PCR e transcrição reversa para cada preparação com 1 µg de RNA total foram realizadas usando OneStep RT-PCR Kit (Qiagen). Dois iniciadores específicos para a seqüência codificando IL-4 5'-CCA CGG ACA CAA GTG CGA TA nucleotídeos 436-455 (exon 1) e 5'-CCT TGC AGA AGG TTT CCT TCT-3' complementares para nucleotídeos 564-584 (exon 3) (número de acesso GenBank NM 000589.2) foram selecionados para espe- cificamente amplicarem IL-4.
Gene GAPD foi amplificado a partir das mesmas preparações de RNA como controle doméstico (seqüência controle 5'-TGA CAT CAA GAA GGT GGT GA-3' nucleotídeos 843-863 e 5'-TCC ACC CTG TTG CTG TA-3' complementares para nucleotídeos 1033-1053; número de acesso NM- 002046). Trinta e cinco ciclos foram realizados, cada um consistindo nas seguintes condições: 94°C, 230 segundos; 598°C, 30 segundos; 72°C, 30 segundos.
Isolamento de proteína e análises de western blotting.
Péletes de células foram ressuspensas em tampão de lise NP- 40 resfriado com gelo (Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, NaCI 150 mM, EGTA 1 mM, NP-40 1%) contendo inibidores de protease como descrito em Stassi et al. Nature Immunology 2000, 1, 1-6. Imuno-manchamento para actina (Ab-1, IgM de camundongo, Calbiochem, Darmstadt, Germany), CD95L (G247-4, IGG1 camundongo, PharMingen, san Diego), CD95 (C-20, Santa Cruz Bio- technology), cFLIP (lgG1 camundongo NF6, Alexis Biochemicals, Switzer- land), PED/PEA-15 (IgG coelho gentilmente provida por G. Condorelli), CI-2 (124, IgGI camundongo, Upstate Biotechnology Inc.) e Bcl-X1 (H-5, IgGI camundongo, Santa Cruz Blotechnology) foi detectado por anticamundongo ou anticoelho Abs conjugado com HRP (Amersham Biosciences UK Limited, England) e visualizado com o sistema de detecção de quimioluminescência (SuperSignaI West Dura Extended duration Substrate, Pierce, Illinois, USA).
Exemplo 1
Produção autócrina de IL-4 em células de câncer
De modo a investigar se o microambiente de tumor influência fenótipo e função de célula de câncer, a presença de IL-4 e IL-10 previamen- te verificada ser produzida autocrinamente por tirócitos de câncer foi avalia- da. Análises de imuno histoquímica demonstraram que todos os histotipos de tumor sólido investigados expressaram altos níveis de IL-4, enquanto IL- 10 foi menos detectável. Resultados são mostrados na Tabela 1.
Tabela 1. Expressão de citocina em células de câncer
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Interessantemente, a reatividade contra IL-4 localizada para cé- lulas de colon, mama, pulmão, gástricas, fígado, próstata, pâncreas, rim e bexiga, sugerindo que células neoplásticas são a fonte de alta produção pa- ra IL-4 e menos para IL-10 (Tabela 1 e Fig. 1a). Para excluir a possibilidade de que a reatividade observada em células de tumor foi exclusivamente de- vido à liberação de citocinas tipo 2 através de infiltraçaão de células T, célu- las de câncer de cólon, mama, gástricas e de pulmão recentes foram anali- sadas por RT-PCR. Em concordância com resultados de imunohistoquímica, níveis de expressão de RNAm IL-4 de células de câncer purificadas foram altamente aumentados comparados a células normais relacionadas (Fig. 1b), demonstrando que produção autócrina de IL-4 não é restrita a células de câncer de tiróide mas também ocorre em outras células malignas epiteliais de tumores sólidos que produzem consideráveis quantidades de IL-4. Células de câncer epiteliais expressam altos níveis de proteínas antiapoptó- ticas.
Células de câncer de cólon, mama, gástrico e pulmão são resis- tentes a morte de célula induzida por quimioterapia e por ligante. Para de- terminar o mecanismo responsável por essa refratariedade, foi investigado se expressão aberrante de fatores antiapoptóticos pode estar implicada no prejudicado caminho de sinal apoptótico "extrínseco" e "intrínseco" gerado por Iigantes de morte ou quimioterapia. Foi verificado por imuno histoquímica e análises de Western blot que células de carcinoma epitelial expressam CD95, TRAIL-R1 e TRAIL-R2 (Fig. 2a e b). Por isso, os inventores da pre- sente invenção avaliaram a presença e mediram os níveis de expressão de cFLIP, PED/PEA-15, Bcl-xL e Bcl-2 em células de câncer e normais de co- lón, mama, gástricas e pulmão. Enquanto níveis de cFLIP e PED/PEA-15 foram aproximadamente três vezes maiores em células de câncer recente- mente purificadas, comparadas com células normais de cólon, mama e pul- mão (Fig. 2a), níveis de Bcl-xL foram quatro vezes maiores. Níveis de ex- pressão Bcl-2 foram somente duas vezes maiores em todas as células de câncer analisadas, comparadas com células normais. Assim, regulação as- cendente de genes antiapoptoticos em células de câncer de cólon, mama, gástrico e pulmão pode conferir resistência a apoptose induzida por quimio- terapia e TRAIL- CD95.
IL-4 aumenta sobrevivência, crescimento de células neoplásticas epiteliais. A expressão de receptor de IL-4 em ambas células normais e neoplásticas foi avaliada. Imuno histoquímica sobre seções embutidas em 25 parafina mostraram que receptor de IL-4 foi expresso em todos os tecidos de câncer analisados. Os resultados são mostrados na seguinte Tabela 2 e na Fig. 3a.
Tabela 2. Expressão de IL-4R em células de câncer
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De modo a investigar o possível envolvimento de IL-4 sobre so- brevivência de célula de tumor, células normais de cólon, mama, gástricas e de pulmão foram expostas a 20 ng/mL de IL-4 e analisadas para crescimen- to de célula. IL-4 aumentou significantemente a taxa de crescimento de célu- Ias normais de cólon, mama, e pulmão (Fig. 3b). Além disso, para determinar o envolvimento de IL-4 na refratariedade de células de câncer a agentes CD95, TRAIL e quimioterapêuticos, células normais de cólon, mama, gástri- cas e de pulmão foram pré-incubadas com IL-4 e então analisadas para ex- pressão daquelas proteínas antiapoptóticas implicadas na resistência de morte de célula por quimioterapia e Iigantes de morte. IL-4 aumentou os ní- veis de proteína de cFLIP, PED/PEA-15, Bcl-xL e Bcl-2 em células normais de cólon, mama (Fig. 3C) e gástricas e de pulmão, sugerindo que produção de IL-4 autócrina pode proteger células de câncer de estimulação de recep- tor de morte e quimioterapia, regulando ascendentemente fatores antiapop- tóticos.
Ngl,traição de IL-4 promove impedimento de crescimento e morte de célu- la induzida por CD95, TRAIL e quimioterapia em células de câncer
Para demonstrar diretamente que produção autócrina de IL-4 confere proteção de morte de célula induzida por CD95, TRAII e quimiotera- pia, foram investigados os efeitos de neutralização de IL-4 em células de câncer de cólon, mama, e pulmão. Exposição de células de câncer de cólon, mama, gástrico e de pulmão recentemente purificadas a anticorpos neutrali- zantes contra IL-4 por 48 horas sensibilizou células de câncer para morte de célula induzida por receptor e morte por quimioterapia confirmando o papel antiapoptótico de IL-4 em câncer sólido. Os resultados são mostrados nas Figuras 4a-c.
Além disso, neutralização de IL-4 bloqueou crescimento de célu-
la de tumor de cólon, mama, gástrico e pulmão até 15 dias (Fig. 5) e modu- lou descendentemente os níveis de expressão de proteína de cFLIP, PED/PEA-15, Bcl-xL e Bcl-2. Estes dados indicam que produção autócrina de IL-4 pode desempenha um papel importante em controle de crescimento e é especificamente requerida para sobrevivência de células de câncer.
Espécimes de tecido de pacientes de tumor operados recente- mente foram selecionados para expressão de IL-4 e IL-10 através de uma variedade de processos padrões como RT-PCR, western blots e imuno his- toquímica. Da mesma maneira, a expressão de seus respectivos receptores foi analisada através dos mesmos processos. Células de câncer purificadas foram então testadas para sua sensitividade contra agentes quimioterapêuti- cos tais como, por exemplo, etoposide, doxorrubicina, oxaliplatina e induto- res de apoptose como TRAIL e Iigante CD95. Os resultados são mostrados na seguinte Tabela 3. Tabela 3. Sensibilização a morte de célula induzida por quimioterapia e re- ceptores de morte
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Como mostrado a partir dos resultados na Tabela 3, foi surpre- endentemente verificado que células de tumor primário normalmente resis- tentes expressando IL-4 e/ou IL-10 tornaram-se sensíveis contra os agentes quimioterapêuticos testados e/ou os agentes pró-apoptóticos quando incu- badas na presença de um anticorpo IL-4 de modo que mais que 90% das células morreram em um par de dias. Particular sensibilização significante para morte de célula induzida por quimioterapia e receptores de morte foi mostrada para células de câncer de cólon, gástrico, mama, pulmão, próstata e bexiga.
Exemplo 2
Os dados reportados neste exemplo revelam que células tronco de câncer de cólon purificadas produzem altos níveis de IL-4 e que a exposi- ção das células de câncer a anticorpos neutralizantes contra IL-4 sensibiliza- ram células para apoptose induzida por TRAIL e fármaco citotóxico. Ainda, os dados que se seguem mostram que um tratamento combinado de tumo- res de cólon com agentes quimioterapêuticos e agentes anti-IL-4 reduz signi- ficantemente crescimento de tumor.
Para investigar a sensitividade de CSC de cólon a fármacos qui- mioterapêuticos, a viabilidade de esferóides CSC de cólon expostos a cispla- tinum (300 ng/mL) e oxaliplatina (100 μΜ) foi medida, doses equivalentes àquelas atingidas durante tratamento de câncer in vivo. Em adição, CSC de cólon foram tratadas com o ligante de morte de indução de apoptose TRAIL (200 ng/mL). Células primárias (aderentes) de espécimes de câncer de cólon humano mostraram alguma sensitividade in vitro a todos os três fármacos testados, enquanto CSC de cólon foram significantemente resistentes, con- firmando que CSC são relativamente inertes para apoptose induzida por fármacos (Fig. 6a). Isto sugere que CSC pode escapar de terapias anti - tumor e pode ser a razão subjacente para ineficiência de quimioterapia.
Para provar formalmente que produção de IL-4 em CSC de có- Ion é responsável por regulação ascendente de proteínas antiapoptóticas e por isso refratariedade a terapia, CSC foram pré-tratadas por dois dias com anticorpos neutralizantes de IL-4 e então medida morte de células e expres- são antiapoptótica. Níveis de proteínas de c-FLIP, Bcl-xL e PED, proteínas antiapoptóticas previamente mostradas serem reguladas por IL-4 em câncer, diminuíram por˜duas vezes em CSC expostas a anti-IL-4 (Fig. 6b-c). Mais importante, seguindo bloqueio de IL-4 morte de células CSC foi significante- mente aumentada através de tratamento com fármacos quimioterapêuticos ou TRAIL (Fig. 6d-e).
Para demonstrar diretamente que IL-4 protege câncer de cólon gerado por CSC de fármacos quimioterapêuticos, os efeitos de neutralização de IL-4 in vivo foram investigados. Tumores foram deixados crescer por 10 dias (tamanho~0,2cm^3) e então tratados intratumoralmente com anticorpos neutralizantes contra IL-4 ou IgG controle suas vezes por semana por 3 se- manas. Embora tratamento intraperitoneal (i.p.) com oxaliplatina, uma vez por semana por 4 semanas, combinado com IgG controle tenha reduzido tamanho de tumor em camundongos, a eficácia de tratamento de quimiote- rapia foi significantemente aperfeiçoada por anticorpo neutralizante de IL-4 (Fig. 7a e 7b).
Exemplo 3
Construção de um polipeptídeo de fusão IL4RIL13R-Fc
O peptídeo sinal e o domínio extracelular de receptor alfa de IL-4 (aa1-aa231 de acesso NCBI NP_000409) foram fundidos terminalmente-N ao domínio extracelular de receptor alfa de IL13 (aa27-aa343 de acesso NCBI NP_001551). Mutações de dois pontos foram introduzidas na seqüên- cia de IL4R-alfa1 (Gly2→Val2 e Cys207→Ser207) e uma mutação de pon- to simples foi introduzida na seqüência de IL13R-alfa1 (Cys46→Ala46). A numeração das mutações de ponto também refere-se a entradas de base de dados-NCBI NP_000409 para IL4R-alfa1 e NP_001551 para IL13R-alfa1.
Esta seqüência de proteína IL4RIL13R foi fundida à parte-Fc de IGHG1 humana (aa254-aa479 de acesso NCBI AAH69020). Adicionalmente, um elemento ligante flexível e um motivo Flexstreptag-II (SSSSSSAW- SHPQFEK) foi adicionado terminalmente-C. A sequência de aminoácidos do constructo IL4RIL13R-Fc resultante como mostrado abaixo foi contra - tra- duzida em uma seqüência de DNA sintética e sua utilização de códon otimi- zada para expressão baseada em célula mamífera. Síntese de gene foi feita por ENTELECHON GmbH (Regensburg, Germany). O cassete de expressão final foi subclonado em PCDNA4-HisMax-cadeia principal, usando os únicos sítios Hid-Ill e Not-I do plasmídeo.
SEQ ID NO: 1
SEQ IL4RIL13R-FC.PRO
PALAVRA CHAVE PROTEÍNA ORIGEM
1 MVWLCSGLLF PVSCLVLLQV ASSGNMKVLQ EPTCVSDYMS ISTCEWKMNG PTNCSTELRL
61 LYQLVFLLSE AHTCIPENNG GAGCVCHLLM DDVVSADNYT LDLWAGQQLL WKGSFKPSEH
121 VKPRAPGNLT VHTNVSDTLL LTWSNPYPPD NYLYNHLTYA VNIWSENDPA DFRIYNVTYL
181 EPSLRIAAST LKSGISYRAR VRAWAQSYNT TWSEWSPSTK WHNSYREPFE QAPTETQPPV
241 TNLSVSVENL ATVIWTWNPP EGASSNCSLW YFSHFGDKQD KKIAPETRRS IEVPLNERIC
301 LQVGSQCSTN ESEKPSILVE KCISPPEGDP ESAVTELQCI WHNLSYMKCS WLPGRNTSPD
361 TNYTLYYWHR SLEKIHQCEN IFREGQYFGC SFDLTKVKDS SFEQHSVQIM VKDNAGKIKP
421 SFNIVPLTSR VKPDPPHIKN LSFHNDDLYV QWENPQNFIS RCLFYEVEVN NSQTETHNVF
481 YVQEAKCENP EFERNVENTS CFMVPGVLPD TLNTVRIRVK TNKLCYEDDK LWSNWSQEMS
541 IGKKRNSTGD KTHTCPPCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP
601 EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVYNKALPAP
661 IEKTISKAKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY
721 KTTPLVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGSSSSS
781 SAWSHPQFEK
aal-aa23: peptídeo sinal aa24-aa231: IL-4R-afal ECD aa232-aa548: IL13R-alfal ECD aa54 9-aa775: parte Fc de IGHGI aa786-aa790: Flexstreptag-II
Modificações do polipeptídeo de fusão IL4R-IL13R-Fc podem ser como se segue:
- ausência do peptídeo sinal ou presença de um peptídeo sinal heterólogo;
- presença de um ECD IL-4R diferente, por exemplo, encurtado, por exemplo, sem ou com diferentes mutações, particularmente mutações de ponto,
- presença de um domínio efetor diferente,
- presença de um domínio Fc diferente, e/ou
- ausência do domínio de purificação terminal-C (particularmente
para aplicações farmacêuticas). Exemplo 4
Construção de um polipeptídeo de fusão IL4R-Fc
O peptídeo sinal e um domínio extracelular encurtado de recep- tor alfa de IL-4 (aa1-aa224 de acesso NCBI NP_000409) foram fundidos terminalmente-N à parte Fc de IGHG1 humana (aa250-aa479 de acesso NCBI AAH69020). Duas mutações de ponto foram introduzidas na seqüência de IL4R-alfa1 (Gly2 Val2 e Cys207 Ser207). Uma glicina simples foi inserida entre os dois domínios e Lys251 de IGHG1 humana na região arti- culada sofreu mutação para arginina. A numeração das mutações descritas também refere-se a entradas de base de dados NCBI NP_000409 para IL4R-alfa1 e acesso NCBI AAH69020 para IGHG1).
Adicionalmente, um elemento Iigante flexível e um motivo Flexs- treptag-ll (SSSSSSAWSHPQFEK) foi adicionado terminalmente-C. A se- quência de aminoácidos da resultante constructo IL4R-Fc como mostrada abaixo foi contra - traduzida em uma seqüência de DNA sintético e sua utili- zação de códon otimizada para expressão baseada em célula mamífera. Síntese de gene foi feita por ENTELECHON GmbH (Regensburg, Germany).
O cassete de expressão final foi subclonado em pCDNA4-HisMax-cadeia principal, usando os únicos sítios Hind-Ill e Not-I do plasmídeo.
SEQ ID NO:2
SEQ IL4RA-Fc.PRO
PALAVRA CHAVE PROTEÍNA
CORES
seqüência = 1
características = 0 ORIGEM
1 MVWLCSGLLF PVSCLVLLQV ASSGNMKVLQ EPTCVSDYMS ISTCEWKMNG PTNCSTELRL
. 61 LYQLVFLLSE AHTCIPENNG GAGCVCHLLM DDVVSADNYT LDLWAGQQLL
WKGSFKPSEH
.121 VKPRAPGNLT VHTNVSDTLL LTWSNPYPPD NYLYNHLTYA VNIWSENDPA DFRIYNVTYL
181 EPSLRIAAST LKSGISYRAR VRAWAQSYNT TWSEWSPSTK WHNSGSRSCD KTHTCPPCPA
241 PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP
301 REEQYNSTYR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG QPREPQVYTL
361 PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNY KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT
421 VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGSSSSS SAWSHPQFEK
Aal-aa23: peptídeo sinal IL4R-alfal Aa24-aa224: ECD IL4R-alfal Aa225-aa455: parte Fc de IGHG1 Aa456-aa470: Flexstreptag-II
Modificações do polipeptídeo de fusão IL-4R podem ser como se segue:
- ausência de um peptídeo sinal ou presença de um peptídeo sinal heterólogo;
- presença do diferente, por exemplo, ECD IL-4R encurtado, por exemplo, sem ou com diferentes mutações, particularmente mutações de ponto,
- presença de um domínio Fc diferente,
- uma diferente região de fusão entre o ECD IL-4R e o domínio Fc, por exemplo, supressão de um ou mais aminoácidos da seqüência RSC (posições 227-229), e/ou
- ausência do domínio de purificação terminal-C (particularmente para aplicações farmacêuticas).
Exemplo 5
Expressão e purificação de proteínas ligando - IL4, IL4R-Fc e IL4R-IL13R- Fc
Células Hek 293T crescidas em DMEM + GlutaMAX (Gibco) su- plementado com FBS10%, 100 unidades/mL de penicilina e 100 μg/mL S- treptomicina foram transientemente transfectadas com plasmídeos codifi- cando IL4R-Fe e IL4R-IL13R-Fc, respectivamente. Sobrenadantes de cultura de células contendo proteínas recombinantes foram colhidos três dias após transfecção e clareados por centrifugação em 300g seguido por filtração a- través de um filtro estéril de 0,22 μm. Para purificação por afinidade Streo- tactin Sepharose foi empacotada para uma coluna (leito de gel 1 mL), equili- brada com 15mL de tampão (Tris-HCl 100 mM, NaCI 150 mM pH 8,0) e o respectivo sobrenadante de cultura de célula foi aplicado à coluna com uma taxa de fluxo de 4 mL/minuto. Subseqüentemente, a coluna foi lavada com tampão W e IL4R-Fc ou IL4R-IL13R-Fc ligada foi eluída em etapas através de adição de 6x1mL de tampão E (Tris HC1100 mM, NaC1150 mM, Desthio- biotin 2,5 mM pH 8,0). A quantidade de proteína das frações de eluato foi quantificada e frações de pico foram concentradas por ultrafiltração e ainda purificadas por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Uma SDS- PAGE da purificação de afinidade de Streptactina de IL4R-IL13R-Fc seguida por manchamento com prata é mostrada na Figura 8A.
SEC foi realizada sobre uma coluna Superdex 200 usando um sistema de cromatografia Akta (GE-Healthcare). A coluna foi equilibrada com solução salina tamponada com fosfato e as IL4R-Fc ou IL4R-IL13R-FC, res- pectivamente, purificadas com streptactina, concentrada, foram carregadas sobre a coluna SEC em uma taxa de fluxo de 0,5 mL / minuto. O perfil de eluição monitorado por absorbância em 280 nm mostrou um proeminente pico de proteína em 10,31 mL para IL4R-IL13R-Fc (Figura 8B) e 12,97mL para IL4R-Fc (Figura 9A). Frações SEC para IL4R-Fc foram adicionalmente analisadas sob condições desnaturantes por SDS-PAGE e manchamento com prata (Figura 9B).
Para determinação do peso molecular aparente sob condições nativas uma coluna Superdex 200 foi carregada com proteínas padrão de peso molecular conhecido. Baseado no volume de eluição das proteínas pa- drão foi calculada uma curva de calibração e o peso molecular aparente de IL4R-FC purificada foi determinado ser 137 kDa que se adapta bem ao peso molecular observado por SDS-PAGE. O peso molecular teórico baseado na seqüência de aminoácidos de IL4R-Fc é de 52,8 kDa para a proteína mono- mérica. Baseado na análise bioquímica, IL4R-Fc muito provavelmente é ex- pressa como um dímero proteína.
Para IL4R-IL13R-Fc o peso molecular aparente baseado em SEC foi calculado ser cerca de 600 kDa. Baseado em análise SDS-PAGE a proteína corre como uma banda simples com cerca de 250 kDa. O peso mo- lecular teórico baseado na seqüência de aminoácidos de IL4R-IL13R-Fc é de 87,7 KDa. Em princípio a construção da molécula deve resultar em uma proteína dimérica estável com um peso molecular teórico de cerca de 180 Kda. O alto peso molecular aparente visto por SEC por isso tanto indica um incomum comportamento em SEC como ainda oligomerização da proteína. Ensaio de degradação de IL-4
Para testar específica ligação de IL4 de IL4R-\Fc e IL4R-IL13R- Fc1 4 pg de ambas proteínas, respectivamente, foram imobilizados para S- treptactina Sepharose via seus Strep-Tag. As proteínas imobilizadas foram subseqüentemente incubadas por 60 minutos com 400 ng de interleucina humana expressa recombinantemente (IL4) em um volume total de 400 pl_ de solução salina tamponada com fosfato. Subseqüentemente as pérolas foram lavadas e proteínas ligadas foram especificamente eluídas com desti- obiotina em um volume total de 40 pL de tampão de eluição. Proteínas eluí- das foram finalmente analisadas via SDS-PAGE e manchamento com prata. Como mostrado na Figura 10 ambas IL4R-Fc e IL4R-IL13R-Fc mostram li- gação específica de IL4 humana indicada pela presença de proteína IL4 (12KDa) que não pode ser vista em experimentos controles. Exemplo 6
Eficácia in vitro sobre células tronco de câncer e células de tumor primário Para testar a habilidade de IL4R-Fc e IL4R-IL13R-Fc para indu-
zir apoptose, ambas proteínas foram adicionadas ao meio de crescimento de células tronco de câncer de mama tanto sozinhas como em combinação com doxorrubicina. A Figura 11A mostra a análise de imunofluorescência de esfe- ras de câncer de mama pré-tratadas com PBS (w/o) ou 10 pg de IL4R-Fc, IL4R-IL13R-Fc ou anticorpo-IL4 por 24 horas e sucessivamente expostas por outras 24 horas a doxorrubicina 5 μΜ. As células foram manchadas com la- ranja acridina / brometo de ethidium (vermelho: células mortas; verde: célu- las viáveis). Em comparação com o tratamento simples (Doxorrubicina sozi- nha) a combinação de doxorrubicina com tanto IL4R-Fc como IL4R-IL13R- Fc, respectivamente, claramente aumentou a quantidade de células tronco de câncer de mama apoptóticas. Uma contagem de células diferenciando células apoptóticas e vivas, subseqüentemente plotada para a porcentagem de viabilidade de célula também demonstra a eficácia do tratamento de combinação para a indução de apoptose (Figura 11B). Importantemente, ambas IL4R-Fc e IL4R-IL13R-Fc são capazes de sensibilizar células tronco de câncer de mama para apoptose induzida por doxorrubicina na mesma faixa como mostrada para um anticorpo específico IL4, que foi usado como um controle positivo neste experimento.
Sobre células de cólon primário as construções de IL4R-Fc e IL4R-IL13R-Fc foram testadas em combinação com tratamento com oxalipla- tina. Células de câncer de cólon primário pré-tratadas com PBS (w/o) ou 10 pg de IL4R-Fc, IL4R-IL13R-Fc ou anticorpo anti-IL4 por 24 horas e sucessi- vamente expostas por outras 24 horas a oxaliplatina 100 μΜ. Os gráficos mostram a porcentagem de viabilidade de célula medida por análise MTS (CeIITiter 96, Aquos, Promega). Como mostrado na Figura 11C, ambas construções são capazes de sensibilizar células de câncer de cólon primário para apoptose induzida por oxaliplatina, indicado por uma reduzida viabilida- de de célula em comparação com tratamento com oxaliplatina sozinha.
Claims (31)
1. Processo para diagnóstico de um tipo de câncer compreen- dendo as etapas de: (a) provimento de uma amostra a partir de um tumor sólido com- preendendo células de tumor, (b) determinação de expressão de pelo menos uma citocina an- tiapoptótica nas ditas células de tumor, e (c) classificação de tumor sólido como um tumor expressando não-citocina ou como um tumor expressando citocina.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, onde a citocina antiapoptótica é IL-4 e/ou IL-10, preferivelmente IL-4.
3. Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, onde o tu- mor sólido é classificado como um tumor não-expressando IL-4 ou um ex- pressando IL-4.
4. Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, onde o tu- mor sólido é classificado como um tumor não-expressando IL-10 ou um ex- pressando IL-10.
5. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 4 onde o tumor sólido é classificado como um tumor expressando uma IL-4 e IL-10 ou como um tumor expressando não-IL-4 e não-IL-10.
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, onde o tumor sólido é um tumor epitelial.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, onde o tumor epi- telial é selecionado do grupo consistindo em câncer de tiróide, mama, prós- tata, bexiga, cólon, gástrico, pâncreas, rim, fígado e pulmão.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, onde o tumor pre- ferivelmente é um câncer de cólon, gástrico, mama, pulmão, bexiga, ou prós- tata.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, onde as células de tumor são células de tumor primário e/ou células tronco de câncer.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, onde detecção de expressão de citocina antiapoptótica nas células de tumor compreende uma detecção no nível proteína e/ou no nível de ácido nucléico.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, onde a detec- ção no nível de proteína compreende a detecção da citocina antiapoptótica, preferivelmente com processos imunoquímicos e/ou espectrométricos de massa.
12. Processo de acordo com a reivindicação 10, onde a determi- nação no nível de ácido nucléico compreende determinação de níveis de expressão de RNAm de citocina antiapoptótica com hibridização de ácido nucléico e opcionalmente processos de amplificação, preferivelmente com processos de RT-PCR.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ainda compreendendo as etapas de (d) determinação de sensitividade das células a um tumor ex- pressando citocina contra pelo menos um agente quimioterapêutico ou pró- apoptótico na presença e/ou na ausência de um antagonista da dita citocina expressa, e/ou seu receptor e (e) opcionalmente selecionando um tratamento específico de tipo de câncer.
14. Processo de acordo com a reivindicação 13, onde na etapa (d) um agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico é determinado contra o qual as células do tumor expressando citocina são sensíveis.
15. Processo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, onde, na etapa 13(e), um tratamento é selecionado compreendendo a administração de uma combinação de um agnete de neutralização de citocina e um agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico.
16. Processo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, onde o agente quimioterapêutico é selecionado de antimetabólitos, agentes de fragmentação de DNA, agentes de reticulação de DNA1 agentes intercalan- tes, inibidores de síntese de proteína, inibidores de topoisomerase I e II, a- gentes direcionados a microtúbulos, inibidores de cinase, hormônios e anta- gonistas de hormônios.
17. Processo de acordo com a reivindicação 16, onde o agente quimioterapêutico é selecionado de cisplatina, carboplatina e oxaliplatina.
18. Processo de acordo com a reivindicação 14 ou 15, onde o agente pró-apoptótico é selecionado de TRAIL e Iigante CD95.
19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, onde o agente de neutralização de citocina é um anticorpo, preferi-velmente um anticorpo anti-IL-4 e/ou um anticorpo anti-IL-10 ou um seu fragmento de ligação de antígeno.
20. Processo de acordo com a reivindicação 19, onde o anticor- po anti-IL-4 é um anticorpo derivado da célula hibridoma ECACC 93100620 ou um seu fragmento de ligação de antígeno.
21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, onde o agente de neutralização de citocina é um polipeptídeo receptor de IL-4 solúvel ou polipeptídeo de fusão.
22. Uso de uma combinação de (i) pelo menos um agente de neutralização de citocina e (ii) pelo menos um agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doença residual mínima.
23. Uso de uma combinação de (i) pelo menos um agente de neutralização de citocina e (ii) pelo menos um agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um tipo de cân- cer classificado como tumor expressando citocina.
24. Uso de uma combinação de (i) pelo menos um agente de neutralização de citocina e (ii) pelo menos um agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um tipo de cân- cer classificado como tumor expressando citocina em combinação com ci- rurgia e/ou terapia de irradiação.
25. Uso de acordo com a reivindicação 24, onde o medicamento é para terapia de combinação simultânea, separada ou seqüencial com ci- rurgia e/ou terapia de irradiação.
26. Uso de uma combinação de (i) pelo menos um agente de neutralização de citocina e (ii) pelo menos um agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um tipo de cân- cer classificado como tumor expressando citocina onde a administração de (i) e (ii) é iniciada simultaneamente.
27. Uso de uma combinação de (i) pelo menos um agente de neutralização de citocina e (ii) pelo menos um agente quimioterapêutico ou pró-apoptótico para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um tipo de cân- cer classificado como tumor expressando citocina onde a administração de (i) e (ii) é iniciada em etapas.
28. Uso de acordo com a reivindicação 27, onde o início de ad- ministração de (i) é > 1 semana antes de (ii) ou onde o início de administra- ção de (ii) é > 1 semana antes de (i).
29. Polipeptídeo receptor de IL-4 solúvel compreendendo um domínio receptor de IL-4 extracelular encurtado terminalmente-C.
30. Polipeptídeo da reivindicação 29 que é um polipeptídeo de fusão.
31. Molécula de ácido nucléico codificando o polipeptídeo como definido na reivindicação 29 ou 30.
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