CZ295928B6 - Fúzní protein, oblast determinující komplementaritu, molekula nukleové kyseliny a její sekvence, protilátka, způsob její přípravy a vyšetření, farmaceutický prostředek, rekombinantní plazmid, hostitelská buňka a způsob diagnózy - Google Patents

Abstract

Jsou popsány fúzní protein s vazebnou specificitou pro lidský interleukinu-4 (IL4), oblast determinující komlementaritu (CDR) imunoglobulinového lehkého nebo těžkého řetězce, molekula nukleové kyseliny kódující CDR, humanizovaná a chimérní protilátka obsahující těžký a lehký řetězec, farmaceutický prostředek, který obsahuje fúzní protein, izolovaná sekvence nukleové kyseliny, rekombinantní plazmid, který zahrnuje takovou sekvenci, hostitelská buňka, která je transfekována rekombinantním plazmidem, způsob přípravy humanizované protilátky specifické pro lidský IL-4, způsob diagnózy alergií a jiných stavů spojených s nadměrnou produkcí imunoglobulinu E u člověka a způsob vyšetření monoklonálních protilátek proti lidskému IL4.

Description

Tento vynález se obecně týká oblasti fúze proteinů. Vynález se zvláště týká fúzního proteinu s vazebnou specificitou pro lidský interleukinu-4 (IL4), oblasti determinující komplementaritu (CDR) imunoglobulinového lehkého nebo těžkého řetězce, molekuly nukleové kyseliny kódující CDR, humanizované a chimérní protilátky obsahující těžký a lehký řetězec, farmaceutického prostředku, který obsahuje fúzní protein, izolované sekvence nukleové kyseliny, rekombinantního plazmidu, který zahrnuje takovou sekvenci, hostitelské buňky, která je transfekována rekombinantním plazmidem, způsobu přípravy humanizované protilátky specifické pro lidský 1L-4, způsobu diagnózy alergií a jiných stavů spojených s nadměrnou produkcí imunoglobulinu E u člověka a způsobu vyšetření monoklonálních protilátek proti lidskému IL4.

Dosavadní stav techniky

Atopické alergické choroby spadají do rozsahu relativně lehkých onemocnění, jako je sezónní rhinitida a konjuktivitida, vážnějších chorob, jako je atopická dermatitida a atopické astma, a onemocnění ohrožujících život, jako je anafylaktický šok. Spojnicí těchto stavů je imunitní odezva těla na alergeny, přičemž odezva zahrnuje produkci imunoglobulinových E (IgE) protilátek u geneticky předem disponovaných jedinců (atopie). Inhibice produkce IgE byla dlouho cílem ve specifické imunoterapii alergických onemocnění za použití desenzibilizačních vakcín. Avšak v posledních letech bezpečnost a účinnost vakcín je brána v potaz, ale požadavek na snížení hladin IgE se neztrácí.

Interleukin 4 (IL4) je proteinový mediátor v lymfoidním systému. Studie lymfocytů z atopických jedinců ukazuje na přítomnost vyššího než obvyklého počtu T lymfocytů se schopností secemovat IL4 v odezvu na stimulaci a větší počet IL4 secemovaného po stimulaci.

Bylo zjištěno, že anti-IL4 protilátka inhibuje IgE, avšak nikoli IgGi nebo IgG_2a (Finkelman a kol., Ann. Rev. Immunol. 8, 303 /1990/) a produkci IL5 secemujících T buněk (Maggi a kol., J. Immunol. 148, 2142 /1992/). Kromě toho nedávné údaje ukazují, že IL4 může mít vliv na hromadění eosinofilu ve tkáni (viz Tepper a kol. 62, 457 /1990/, Tepper a kol. 57, 503 /1989/).

Tak nadále v oboru trvá potřeba vysoce afinitního IL4 antagonistu, který by snížil inflamaci vyvolanou eosinofilem, jak snížením proliferace buněk secemujících IL5, tak inhibici adherenčního mechanizmu, při kterém se eosinofily mohou hromadit ve tkáni, a může se používat pro ošetřování, prevenci nebo diagnóze alergických reakcí.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je fúzní protein s vazebnou specificitou pro lidský interleukinu-4 (IL4), který zahrnuje oblasti determinující komplementaritu těžkého řetězce (CDRs), které mají aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID č. 22, SEQ ID č. 24 nebo SEQ ID č. 26 a oblasti determinující komplementaritu lehkého řetězce (CDRs), které mají aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID č. 16, SEQ ID č. 18, SEQ ID č. 20 nebo SEQ ID č. 28.

-1 CZ 295928 B6

Předmětem tohoto vynálezu je též oblast determinující komplementaritu (CDR) imunoglobulinového těžkého řetězce, jejíž aminokyselinová sekvence je vybrána ze souboru sestávajícího z

a) ThrSerGlyMetGlyValSer: SEQ ID č. 22,

b) HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: SEQ ID ě. 24 a

c) ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: SEQ ID č. 26, jakož i oblast determinující komplementaritu (CDR) imunoglobulinového lehkého řetězce, jejíž aminokyselinová sekvence je vybrána ze souboru sestávajícího z

a) LeuAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn: SEQ ID č. 16,

b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: SEQ ID č. 18,

c) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: SEQ ID ě. 28 a

d) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: SEQ Π) ě. 20.

Předmětem tohoto vynálezu je také molekula nukleové kyseliny kódující oblast determinující komplementaritu (CDR) imunoglobulinového těžkého řetězce, jejíž sekvence je vybrána ze souboru sestávajícího z

a) ACT TCT GGT ATG GGT GTG GTG AGC: SEQ ID ě. 21,

b) CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC: SEQ ID ě. 23,

c) AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC: SEQ ID č. 25,

d) ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC: SEQ ID č. 54,

e) CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC: SEQ ID ě. 55 a

f) CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT: SEQ ID ě. 56, stejně jako molekula nukleové kyseliny kódující oblast determinující komplementaritu (CDR) imunoglobulinového lehkého řetězce, jejíž sekvence je vybrána ze souboru sestávajícího z

a) AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG ACC: SEQ ID č. 15,

b) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC: SEQ ID č. 53,

c) GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT: SEQ ID č. 17,

d) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: SEQ ID ě. 19 a

e) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG: SEQ ID ě. 27.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž humanizovaná protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec vymezený svrchu, kde tato protilátka je charakterizována disociační konstantou rovnou

-2CZ 295928 B6 nebo menší než přibližně 2 x I O¹⁰ M pro lidský IL4, přičemž úseky základní struktury uvedeného těžkého řetězce a uvedeného lehkého řetězce jsou odvozeny od alespoň jedné zvolené lidské protilátky a aminokyselinové sekvence oblasti determinující komplementaritu každého z těchto řetězců jsou odvozené od nelidské neutralizující monoklonální protilátky specifické pro lidský IL4, která je charakterizována disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 2 x 10 '° M pro lidský IL4.

Předmětem tohoto vynálezu je také chimérní protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec vymezený svrchu, která je charakterizovaná disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 2 x 10“¹⁰ M pro lidský IL4, přičemž aminokyselinové sekvence oblasti determinující komplementaritu každého řetězce jsou odvozené od nelidské neutralizující monoklonální protilátky specifické pro lidský IL4, která je charakterizována disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 2 x 10~’° M pro lidský IL4.

Předmětem tohoto vynálezu je farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje svrchu vymezený fúzní protein a farmaceuticky přijatelnou nosnou látku.

Předmětem tohoto vynálezu je také izolovaná sekvence nukleové kyseliny, která je zvolena ze souboru sestávajícího ze

a) sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID č. 14 nebo SEQ ID č. 12,

b) sekvence nukleové kyseliny komplementární k a),

c) sekvence nukleové kyseliny z 18 nebo více nukleotidů schopných hybridizace s a) nebo b) za přísných podmínek a

d) fragmentu nebo analogu a), b) nebo c), který kóduje protein charakterizovaný specifícitou pro lidský interleukin-4, přičemž tato sekvence popřípadě obsahuje restrikční místo, jakož i izolovaná sekvence nukleové kyseliny, která je zvolena ze souboru sestávajícího ze

a) sekvence nukleové kyseliny kódující komplementaritu determinizující oblast (CDR), která má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze souboru zahrnujícího SEQ ID č. 22, SEQ ID č. 24, SEQ ID č. 26, SEQ ID č. 16, SEQ ID č. 18, SEQ ID č. 20 nebo SEQ ID č. 28,

b) sekvence nukleové kyseliny komplementární k a),

c) sekvence nukleové kyseliny z 18 nebo více nukleotidů schopných hybridizace s a) nebo b) za přísných podmínek a

d) fragmentu nebo analogu a), b) nebo c), který kóduje protein charakterizovaný specifícitou pro lidský interleukin-4.

Předmětem tohoto vynálezu je též rekombinantní plazmid, který zahrnuje svrchu vymezenou sekvenci nukleové kyseliny.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž hostitelská buňka, která je transfekována rekombinantním plazmidem vymezeným svrchu.

Předmět tohoto vynálezu také obsahuje způsob přípravy humanizované protilátky specifické pro lidský interleukin-4, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje kultivaci buněčné linie transfeko

-3 CZ 295928 B6 váné rekombinantním plazmidem vymezeným svrchu za řízení vybraných regulačních sekvencí schopných řídit expresi v těchto buňkách.

Předmětem tohoto vynálezu je také způsob diagnózy alergií a jiných stavů spojených s nadměrnou produkcí imunoglobulinu E u člověka, jehož podstata spočívá v tom, že se vzorek biologické kapaliny uvede do styku s monoklonální protilátkou, vymezenou svrchu, proti lidskému IL4 s disociační konstantou nižší než 2,0x10“¹⁰ M, která má vysoký titr pro lidský interleukin-4, a stanoví se výskyt vazby mezi uvedenou monoklonální protilátkou a lidským interleukinem-4.

Předmětem tohoto vynálezu je konečně způsob vyšetření monoklonálních protilátek vymezených svrchu proti lidskému IL4 s disociační konstantou nižší než 2,0x10“¹⁰ M, které mají vysoký titr pro lidský interleukin-4, jehož podstata spočívá v tom, že se

a) připraví hybridom buněčné linie charakterizované sekrecí monoklonální protilátky proti lidskému interleukinu-4 a

b) tato hybridomová buněčná linie vyšetří aldehydem kondenzovaným na lidský interleukin-4 nebo s biotinylovaným lidským interleukinem-4.

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje různé protilátky, jejich fragmenty a fúzní proteiny, zejména humanizované protilátky, které jsou charakterizovány vazebnou specificitou pro lidský IL4, neutralizační aktivitou a vysokou afinitou pro lidský IL4, jak je tomu například u myší MAb 3B9 nebo u krysí MAb 6A1. Tyto produkty jsou vhodné v terapeutických a farmaceutických prostředcích pro léčbu alergických reakcí zprostředkovaných IL4 a IgE. Tyto produkty jsou také vhodné pro diagnostiku stavu zprostředkovaného IL4, která se provádí měřením hladin cirkulujícího endogenního IL4 u člověka (například za použití enzym-vázaného imunosorbentního testu (ELISA)).

1. Definice „Fúzní protein“ označuje protein kódovaný fúzní molekulou, který může být získán expresí ve zvolené hostitelské buňce. Takovými fúzními proteiny jsou upravené protilátky, například chimérické nebo humanizované protilátky, nebo fragmenty protilátek, kterým chybí celý konstantní region imunoglobulinu nebo jeho část, například Fv, Fab nebo F(ab)2 a podobně.

„Fúzní molekula“ označuje sekvenci nukleové kyseliny kódující regiony určující komplementaritu (CDR) z non-lidského imunoglobulinu, které jsou inzertovány do prvního fůzního partnera, který obsahuje lidské variabilní sekvence pracovního regionu. Podle potřeby je první fúzní partner operativně navázán na druhý fúzní partneru.

„První fúzní partner“ označuje sekvenci nukleové kyseliny kódující region lidského pracovního rámce nebo variabilní region lidského imunoglobulinu, ve které jsou nativní (neboli přirozené) CDR nahrazeny CDR donorové protilátky. Lidským variabilním regionem může být imunoglobulinový těžký řetězec, lehký řetězec (nebo oba řetězce), jejich analog nebo jejich funkční fragment. Takové CDR nebo úseky CDR, umístěné ve variabilním úseku protilátek (imunoglobulinů), mohou být stanoveny způsoby známými v oboru. Například Kabat a kol. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. vyd., U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health /1987/) uvádí pravidla pro lokalizování CDR. Kromě toho jsou známy počítačové programy, které jsou vhodné pro identifikaci úseků a/nebo struktur CDR.

Výraz „vysoký titr“ označuje v souvislosti s protilátkou takovou protilátku, která má vazebnou afinitu pro lidský IL4 charakterizovanou hodnotou K_d, která je rovná nebo menší než 2 x 10“¹⁰ M.

-4CZ 295928 B6 „Vazebnou specificitou pro lidský IL4“ se rozumí vysoký titr (neboli afinita) pro lidský, nikoli však pro hovězí nebo myší, IL4.

„Druhý fúzní partner“ označuje jinou nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo peptid, se kterou je první fúzní partner fúzován ve čtecím rámci nebo pomocí obvyklé spojovací sekvence (to znamená operativně vázán). Výhodně jím je imunoglobulin. Druhý fúzní partner může zahrnovat sekvenci nukleové kyseliny kódující celý konstantní úsek pro stejnou (to znamená homologní - první a druhý fúzní protein jsou získány ze stejného zdroje) nebo jinou (to znamená heterologní) požadovanou protilátku. Může se jednat o těžký řetězec imunoglobulinu nebo o lehký řetězec imunoglobulinu (nebo o oba řetězce jako součást jediného polypeptidu). Druhý fúzní partner není omezen na konkrétní imunoglobulinovou třídu nebo izotyp. Kromě toho může druhý fúzní partner obsahovat část imunoglobulinového konstantního regionu, jako je tomu u Fab nebo F(ab)₂ (tj. samostatnou část vhodného lidského konstantního regionu nebo regionu pracovního rámce). Takový druhý fúzní partner může také obsahovat sekvenci kódující integrální membránový protein exponovaný na vnějším povrchu hostitelské buňky, například jako část fágové zobrazovací knihovny, nebo sekvence kódující protein pro analytické nebo diagnostické stanovení, jako je například křenová peroxidáza, β-galaktosidáza a podobně.

Výrazy Fv, Fc, Fab nebo F(ab)₂ se používají ve svém obvyklém významu (viz například Harlow a kol., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory /1988/).

Termín „upravená protilátka“, jak je zde použit, označuje typ fúzního proteinu, tj. syntetickou protilátku (například chimérickou nebo humanizovanou protilátku), ve které je část variabilních domén lehkého a/nebo těžkého řetězce zvolené akceptorové protilátky nahrazena analogickými částmi z jedné nebo více donorových protilátek, které mají specificitu pro zvolený epitop. Například mohou takové molekuly zahrnovat protilátky charakterizované humanizovaným těžkým řetězcem spojeným s nemodifikovaným lehkým řetězcem (nebo chimérickým lehkým řetězcem) nebo naopak. Upravené protilátky mohou být také charakterizovány změnami sekvencí nukleové kyseliny kódujících variabilní doménu pracovního rámečku lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové protilátky, které vedou k zachování vazebné specificity protilátky. Tyto protilátky mohou obsahovat nahrazení jednoho nebo většího počtu CDR (výhodně všech) v akceptorové protilátce CDR z donorové protilátky, jako je zde dále popsáno.

„Chimérická protilátka“ označuje typ upravené protilátky, která obsahuje přirozeně se vyskytující variabilní region (lehkého řetězce nebo těžkého řetězce) z donorové protilátky, ve spojení s konstantními regiony lehkého a těžkého řetězce z akceptorové protilátky.

„Humanizovaná protilátka“ označuje typ upravené protilátky, která má své CDR získané z nonlidského donorového imunoglobulinu, přičemž zbývající imunoglobulinové části molekuly jsou získané z jednoho (nebo více) lidských imunoglobulinů. Také mohou být pozměněny zbytky vytvářející pracovní rámec, aby se zachovala vazebná afinita (viz například Queen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 86,10029-10032 /1989/ a Hodgson a kol., Bio/Technology 9, 421 /1991/).

Výraz „donorová protilátka“ označuje protilátku (polyklonální, monoklonální nebo rekombinantní), která přispívá sekvencemi nukleové kyseliny pro své variabilní regiony, CDR nebo jiné funkční fragmenty nebo jejich analogy, k prvnímu fůznímu partnerovi, za zisku fúzní molekuly a následně exprimovaného fúzního proteinu s antigenní specificitou a neutralizační aktivitou donorové protilátky. Jednou donorovou protilátkou vhodnou pro použití podle tohoto vynálezu je non-lidská neutralizační monoklonální protilátka (tj. myší protilátka) označená jako 3B9. Protilátka 3B9 je definována jako vysoce afinitní neutralizační protilátky izotypu IgGi specifická pro lidský IL4 (to znamená nerozpoznávající hovězí nebo myší IL4), která má DNA a aminokyselinové sekvence pro variabilní lehký řetězec SEQ ID č. 1 a 2 a DNA a aminokyselinové sekvence pro variabilní těžký řetězec SEQ ID č. 3 a 4, na vhodném myším IgG konstantním regionu.

-5CZ 295928 B6

Výraz „akceptorová protilátka“ označuje protilátku (polyklonální, monoklonální nebo rekombinantní) heterologní k donorové protilátce, ze které jsou získány celé (nebo části, ale výhodně celé) sekvence nukleové kyseliny kódující pracovní regiony těžkého a/nebo lehkého řetězce a/nebo konstantní regiony těžkého a/nebo lehkého řetězce, čímž se získá druhý fúzní partner. Výhodně je akceptorovou protilátkou lidská protilátka.

„CDR“ jsou definovány jako regiony určující komplementaritu aminokyselinových sekvencí protilátky, kterými jsou hypervariabilní úseky imunoglobulinových těžkých a lehkých řetězců (viz Kabat a kol., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. vyd., U. S. Department ofHealth and Human Services, National Institutes of Helath /1987/). Ve variabilních regionech imunoglobulinu existují tři CDR těžkého řetězce a tři CDR lehkého řetězce (nebo CDR regiony). Termín „CDR“, jak se zde používá, tedy označuje všechny tři CDR těžkého řetězce nebo všechny tři CDR lehkého řetězce (nebo jak všechny CDR těžkého řetězce, tak všechny CDR lehkého řetězce, pokud je to vhodné).

CDR poskytují většinu kontaktních zbytků pro navázání protilátky na antigen nebo epitop. CDR vhodné pro použití v tomto vynálezu jsou odvozeny od variabilních sekvencí těžkých a lehkých řetězců donorové protilátky a zahrnují analogy přirozeně se vyskytujících CDR, kde tyto analogy mají stejnou vazebnou specificitu pro antigen a/nebo neutralizační schopnost jako donorová protilátka, ze které jsou získány.

Výrazem „sdílet vazebnou specificitu nebo neutralizační aktivitu pro antigen“ se rozumí například to, že ačkoliv může být MAb 3B9 charakterizována určitou úrovní afinity k antigenu, a CDR kódovaný sekvencí nukleové kyseliny 3B9 může mít ve vhodném strukturním prostředí nižší nebo vyšší afinitu, tak CDR 3B9 v takovém prostředí rozpozná stejný epitop jako 3B9. Příkladný CDR těžkého řetězce 3B9 je tvořen SEQ ID č. 22, SEQ ID č. 24 a SEQ ID č. 26 a příkladný CDR lehkého řetězce 3B9 je tvořen SEQ ID č. 16, SEQ ID č. 18 a SEQ ID č. 20.

„Funkčním fragmentem“ je část variabilní sekvence těžkého nebo lehkého řetězce (například sekvence obsahující malé delece na koncové amino- nebo karboxy- konci variabilního regionu imunoglobulinu), za zachování stejné vazebné specificity pro antigen a/nebo neutralizační schopnosti, jako má protilátka, ze které je fragment odvozen.

„Analogem“ je aminokyselinová sekvence modifikovaná alespoň jednou aminokyselinou, kde tato modifikace může být chemická, substituční nebo způsobená přeskupením několika aminokyselin (ne více než 10), kde modifikace dovoluje aminokyselinové sekvenci zachovat si biologické charakteristiky, například specificitu pro antigen a vysoký titr nebo afinitu, nemodifikované sekvence. Například mohou být vytvořeny silentní mutace, pomocí substitucí, které slouží pro vytvoření restrikčních míst pro endonukleasy v nebo poblíž CDR regionů.

Analogy mohou také vznikat jako alelické variace. Výraz „alelická variace nebo modifikace“ označuje změnu v sekvenci nukleové kyseliny kódující aminokyselinové nebo peptidové sekvence podle tohoto vynálezu. Takové variace nebo modifikace mohou být důsledkem degenerace genetického kódu nebo mohou být záměrně konstruovány k získání požadovaných charakteristik. Tyto variace nebo modifikace mohou nebo nemusí mít za výsledek změny v kódované aminokyselinové sekvenci. Například, aminokyselinové sekvence CDR lehkého řetězce SEQ ID č. 16 jsou identické pro nativní myší a humanizovanou 3B9 protilátku. Tato CDR sekvence je však kódovaná jak SEQ ID č. 15, tak SEQ ID č. 53. Podobně, CDR SEQ IDč. 22 je kódována jak SEQ ID č. 21, tak SEQ ID č. 54; CDR SEQ ID č. 24 je kódována jak SEQ ID č. 23, tak SEQ ID č. 55; a CDR SEQ ID č. 26 je kódována jak SEQ ID č. 25, tak SEQ ID č. 56.

Výraz „efektorové prostředky“ označuje neproteinové nosiče, se kterými mohou být fúzní proteiny a/nebo přirozené nebo syntetické lehké nebo těžké řetězce donorové protilátky, nebo jiné fragmenty donorové protilátky, asociovány za použití obvyklých prostředků. Takové neproteinové nosiče zahrnují běžné nosiče používané v diagnostice, například polystyrénové nebo jiné plas

-6CZ 295928 B6 tové korálky, polysacharidy, například jak je tomu v systému BIAcore (Pharmacia), nebo jiné neproteinové substance používané v lékařské oblasti, které jsou bezpečné pro podávání lidem a zvířatům. Mezi další efektorové prostředky patří makrocykly pro chelatizaci atomů těžkých kovů, nebo radioizotopy. Tyto efektorové prostředky mohou být vhodné ke zvýšení poločasu fúzních proteinů, jak to způsobuje například polyethylenglykol.

II. Vysoce afinitní monoklonální protilátky proti IL4

Pro použití při konstrukci protilátek, fragmentů a fúzních proteinů podle tohoto vynálezu se mohou použít non-lidské druhy (například skot, ovce, primáti, hlodavci, jako například myši a krysy, a podobně), ve kterých se vytvoří požadovaný imunoglobulin, po imunizaci přirozeným lidským IL4 nebo jeho peptidovým epitopem. Běžné techniky hybridomů se použijí pro získání hybridních buněčných linií secemujících non-lidské MAb k IL4. Takové hybridomy se potom vyšetřují za použití IL4 kovalentně navázaného na 96-jamkové plotny nebo za použití biotinylovaného IL4, jak je popsáno podrobně v příkladu 2, dále. Jedním znakem tohoto vynálezu je tedy způsob detekce MAb k lidskému IL4, kde při tomto způsobu testování nedochází k denaturaci IL4. Bylo zjištěno, že tímto způsobem mohou být detekovány vysoce afinitní (s vysokým titrem) MAb k lidskému IL4.

Jako první příklad je popsána produkce neutralizační Mab s vysokou afinitou z myšího donoru. MAb 3B9, který je vhodnou myší (donorovou) protilátkou pro použití při výrobě chimérické nebo humanizované protilátky, je popsána podrobně v příkladu 1, který je uveden dále. 3B9 MAb je charakterizována vazebnou specificitou pro lidský IL4, s hodnotou K_d menší než 2,0 x 10^_1° M (přibližně 1,8 x 10“¹⁰ M) pro IL4. Hodnota K_d pro fragment Fab této 3B9 pro IL4 je menší než přibližně 3 x 10¹⁰ M. Epitop této protilátky nebyl mapován na IL4 při použití lineárních peptidů, a proto se tento epitop pokládá za nekontinuální epitop. Charakter vazby ukazuje na vazebné místo na B-C smyčce (zbytky 60 až 69) —> C závitu (zbytky 70 až 93). Tyto regiony jsou označeny na mapě uvedené v Cook a kol., J. Mol. Biol.218, 675-678 /1991/, Walter a kol., J. Biol. Chem. 267, 20371-20376 /1992/, Wlodaver a kol., FEBS Lett. 309, 59-64 /1992/, Redfiled a kol., Biochem. 30,11029-11035 /1991/, Smith a kol., J. Mol. Biol. 224, 899-904 /1992/, Garrett a kol. /1992/ a Powers a kol., Biochem. 31, 4334-4346 /1992/ a Science 256, 1673-1677 /1992/, které se zde uvádějí jako součást stavu techniky.

Jinou žádoucí donorovou protilátkou je krysí MAb, 6A1. Způsob přípravy této MAb je uveden v příkladu 7 dále. Tato MAb je charakterizována tím, že jde o IgG_2a a má disociační konstantu pro hIL4 menší než 2,0 x 10¹⁰ M (přibližně 1,6 x 10¹⁰ M). Jako u 3B9 není cílový epitop této 6A1 mapován při použití IL4 lineárních peptidů, a epitop se proto pokládá za nekontinuální a trojrozměrný. Charakter vazby na IL4 muteiny a její biologická aktivita ukazují na vazbu vD helixovém regionu lidského IL4 (aminokyselinové zbytky 109 až 127), nejpravděpodobněji okolo tyrosinu na aminokyselinovém zbytku #124.

Tento vynález není omezen na použití 3B9 MAb, 6A1 MAb nebo jejich hypervariabilních (to znamená CDR) sekvencí. Jakákoli jiná vhodná vysoce afinitní protilátka k IL4, který je charakterizován disociační konstantou rovnou nebo menší než 2,0 x 1(T¹⁰ M pro lidský IL4 a příslušnými anti-IL4 CDR, může být použita jako jejich náhrada. Kdekoli v následujícím popisu je donorová protilátka uvedena jako 3B9 nebo 6A1, tak je uvedena pouze pro ilustraci a zjednodušení popisu.

III. Protilátkové fragmenty

Tento vynález také zahrnuje použití Fab fragmentů F(ab')₂ fragmentů odvozených od MAb proti lidskému IL4. Tyto fragmenty jsou vhodné jako činidla in vivo účinná při stavech zprostředkovaných IL4 a IgE nebo in vitro jako součást detekce IL4. Fragment Fab obsahuje celý lehký řetězec a amino-koncovou část těžkého řetězce. Fragment F(ab')₂ je fragment tvořený dvěma fragmenty Fab, které jsou vázány disulfidovými vazbami. MAbs 3B9, 6A1 a jiné podobné vysoce

-7 CZ 295928 B6 afinitní protilátky vážící IL4 mohou být zdroji fragmentů Fab a F(ab')₂, které se mohou získat obvyklými způsoby, například štěpením MAb vhodnými proteolytickými enzymy, papainem a/nebo pepsinem, nebo rekombinantními způsoby. Tyto fragmenty Fab a F(ab')₂ jsou samy použitelné jako terapeutické, profylaktické nebo diagnostické prostředky a jako donory sekvencí zahrnujících variabilní regiony a CDR sekvence vhodné pro tvorbu rekombinantních nebo humanizovaných protilátek, jak je zde popsáno.

IV. Anti-IL4 aminokyselinové a nukleotidové sekvence

MAb 3B9 nebo jiné protilátky popsané výše mohou přispívat sekvencemi, jako jsou peptidové sekvence variabilních regionů těžkého a/nebo lehkého řetězce, pracovní sekvence, CDR sekvence, jejich funkční fragmenty a analogy, a jejich kódující sekvence nukleové kyseliny, které jsou použitelné při navrhování a získávání různých fúzních proteinů (včetně upravených protilátek), které jsou charakterizovány antigenní vazebnou specificitou donorové protilátky.

Jako jeden příklad tento vynález poskytuje sekvence variabilního regionu lehkého řetězce a variabilního regionu těžkého řetězce z myší IL4 protilátky 3B9 a sekvence od nich odvozené. Variabilní region těžkého řetězce 3B9 je charakterizován aminokyselinovými zbytky 20 až 140 SEQ ID č. 4. CDR úseky jsou na obr. 2 podtržené a jsou uvedeny v SEQ ID č. 22, SEQ ID č. 24 a SEQ ID č. 26. Variabilní region lehkého řetězce 3B9 je charakterizován aminokyselinovými zbytky 21 až 132 na obr. 1 (SEQ ID č. 2). CDR regiony jsou z aminokyselinových zbytků 44 až 58 (SEQ ID č. 16), 74 až 80 (SEQ ID č. 18) a 113 až 121 (SEQ ID č. 20).

Vynález poskytuje variabilní region chimérického těžkého řetězce a signální nukleotidové a aminokyselinové sekvence. Tyto sekvence jsou identické s 3B9 těžkým řetězcem svýjimkou signální sekvence. Signální sekvence chimérického těžkého řetězce je uvedena v SEQ ID č. 5 a 6. CDR regiony jsou na obr. 3 podtržené a jsou identické v aminokyselinové sekvenci s přirozenými myšími CDR (SEQ ID č. 21 až 26). Nukleotidové a aminokyselinové sekvence variabilního regionu chimérického lehkého řetězce jsou identické s nemodifikovanou 3B9 sekvencí (aminokyselinové zbytky 21 až 132 SEQ ID č. 2), což umožňuje použití přirozených myších signálních sekvencí (aminokyselinové zbytky 1 až 20 SEQ ID č. 2).

Variabilní regiony humanizovaného těžkého řetězce a signální sekvence jsou uvedeny na obr. 4 (SEQ ID č. 11 a 12). Signální sekvence je také uvedena v SEQ ID č. 5 a 6. Jiné vhodné signální sekvence, které jsou známé odborníkovi v oboru, mohou být nahrazeny signálními sekvencemi, jejichž příklady jsou zde uvedeny. Aminokyselinové sekvence CDR tohoto konstruktu jsou identické s přirozenými myšími CDR a CDR chimérického těžkého řetězce a jsou uvedeny v SEQ ID č. 22 (kódované SEQ ID č. 54), SEQ ID č. 24 (kódované SEQ ID č. 55) a SEQ ID č. 56 (kódované SEQ ID č. 26).

Příkladná (syntetická) variabilní sekvence humanizovaného lehkého řetězce je uvedena na obr. 5 (SEQ ID č. 13 a 14). Signální sekvence je v rozsahu aminokyselinových zbytků 1 až 19 SEQ ID č. 8. CDR sekvence z tohoto obr. jsou označeny podtržením a odlišují se od přirozených myších CDR jedinou aminokyselinou ze SEQ ID č. 20. Tak jsou CDR humanizovaného lehkého řetězce uvedeny v SEQ ID č. 53 a 16, SEQ EDč. 17al8a SEQ ID č. 27 a 28. Tento rozdíl je popsán podrobně v příkladu 3.

Sekvence nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu nebo jejich fragmenty, kódující peptidové sekvence pro variabilní regiony lehkého řetězce a těžkého řetězce, se používajív nemodifikované formě nebo se syntetizují tak, aby obsahovaly žádoucí modifikace, například restrikční místa. Izolované přirozeně se vyskytující nebo alternativně syntetické sekvence nukleové kyseliny, které jsou odvozeny od MAb 3B9 nebo od jiných požadovaných IL4 protilátek s vysokou afinitou, mohou volitelně obsahovat restrikční místa, k usnadnění inzerce nebo ligace do vhodné sekvence nukleové kyseliny, jako je sekvence kódující pracovní region požadované protilátky, ligace smu

-8CZ 295928 B6 to vánými CDR nebo fúze se sekvencí nukleové kyseliny, která kóduje vybraného druhého fúzního partnera.

Pokud se bere v úvahu degenerace genetického kódu, mohou se konstruovat různé kódující sekvence, které kódují aminokyselinové sekvence variabilních regionů těžkého a lehkého řetězce a CDR sekvence podle tohoto vynálezu, stejně jako jejich funkční fragmenty a analogy, které sdílejí antigenní specificitu donorové protilátky. Izolované sekvence nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, nebo jejich fragmenty, kódující peptidové sekvence variabilního řetězce nebo CDR, se mohou použít k přípravě fúzních proteinů, chimérických nebo humanizovaných protilátek, nebo jiných upravených protilátek podle tohoto vynálezu, pokud se operabilně kombinují s druhým fúzním partnerem.

Tyto sekvence jsou také vhodné pro mutagenní zavedení specifických změn do sekvencí nukleové kyseliny kódujících CDR nebo pracovní regiony a pro inkorporaci výsledné modifikované nebo fúzní sekvence nukleové kyseliny do plazmidů pro expresi. Například, silentní substituce v nukleotidové sekvenci pracovních regionů a CDR kódujících regionů se používají k vytvoření míst pro restrikční enzymy, které usnadňují inzerci mutovanýchCDR regionů (a/nebo pracovních regionů). Tyto CDR regiony se používají při konstrukci humanizované protilátky podle tohoto vynálezu.

Mělo by se poznamenat, že kromě izolovaných sekvencí nukleové kyseliny kódujících části fúzního proteinu a protilátek zde popsaných se mohou používat jiné takové sekvence nukleové kyseliny, jako sekvence komplementární k přirozeným sekvencím. Vhodné DNA sekvence zahrnují sekvence, které hybridizují za přísných hybridizačních podmínek (viz T. Maniatis a kol., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, str. 387 až 389 /1982/) na DNA sekvence. Jako jeden příklad takových přísných hybridizačních podmínek se uvádí hybridizace při 4XSSC za teploty 65 °C a potom promytí v 0,lXSSC za teploty 65 °C během 1 hodiny. Jiným příkladem přísných hybridizačních podmínek je 50% formamid, 4XSSC za teploty 42 °C. Výhodně mají tyto hybridizující DNA sekvence délku alespoň přibližně 18 nukleotidů, tj. přibližně velikost CDR.

V. Fúzní molekuly a fúzní proteiny

Fúzní molekuly mohou kódovat fúzní proteiny, které zahrnují upravené protilátky, jako chimérické protilátky a humanizované protilátky. Vhodná fúzní molekula obsahuje CDR sekvence kódující peptidy, které mají antigenní specificitu IL4 protilátky, výhodně protilátky svysokou afinitou podle tohoto vynálezu, inzertovanou do prvního fúzního partnera (pracovního nebo variabilního regionu lidského imunoglobulinu).

Výhodně je první fúzní partner operativně navázán na druhý fúzní partner. Druhý fúzní partner je definován výše a může zahrnovat sekvenci kódující požadovaný region druhé protilátky, například Fc region. Druhý fúzní partner může také obsahovat sekvence kódující jiné imunoglobuliny, se kterými se konstantní regiony lehkého nebo těžkého řetězce fúzují ve čtecím rámci nebo pomocí spojovací sekvence. Upravené protilátky proti funkčním fragmentům nebo analogům IL4 mohou být navrženy tak, aby vyvolaly zesílenou vazbu se stejnou protilátkou.

Druhý fúzní partner může být také navázán na efektorová činidla, jak jsou vymezena výše, mezi která patří neproteinové nosiče, se kterými může být druhý fúzní partner operativně vázán obvyklými způsoby.

Fúze neboli vazba mezi druhým fúzním partnerem, například protilátkovou sekvencí, a efektorovým činidlem, může být provedena libovolným vhodným způsobem, například pomocí obvyklých kovalentních nebo iontových vazeb, fúzemi proteinů nebo hetero-bifunkčními zesíťujícími spojovacími činidly, jako je karbodiimid, glutaraldehyd a podobně. Takové technické postupy jsou známé v oboru a jsou již popsány v obvyklých chemických a biochemických textech.

-9CZ 295928 B6

Dále mohou být do fůzní molekuly zapracovány běžné spojovací sekvence, které jednoduše poskytují požadované množství prostoru mezi druhým fúzním partnerem a efektorovým činidlem. Výběr takových spojovacích činidel je dobře znám odborníkovi v oboru.

Dále, signální sekvence pro molekuly podle tohoto vynálezu se mohou modifikovat tak, aby zvyšovaly expresi. Příklad požadovaného fúzního proteinu, jenž obsahuje aminokyselinovou sekvenci z myší sekvence těžkého řetězce, která je identická s chimérickým variabilním těžkým řetězcem (V_H) z obr. 2 (SEQ ID č. 4), má nahrazen původní signální peptid jinou signální sekvencí (aminokyselinové zbytky 1 až 20, SEQ ID č. 6).

Příklad fůzního proteinu obsahuje peptidovou nebo proteinovou sekvenci variabilního těžkého a/nebo lehkého řetězce mající antigenní specifícitu MAb 3B9, například Vh (aminokyselinové zbytky 21 až 141 SEQIDč. 9 a 10) a V_L řetězce (aminokyselinové zbytky 21 až 132 SEQID č. 1 a 2). Ještě jiný vhodný fúzní protein podle tohoto vynálezu je charakterizován aminokyselinovou sekvencí obsahující alespoň jeden a výhodně všechny CDR variabilního regionu těžkých a/nebo lehkých řetězců z molekuly 3B9 myší protilátky, a zbývající sekvence, které jsou lidského původu, nebo jejich funkční fragmenty nebo analogy. Viz například humanizované V_H a V_L regiony SEQ ID č. 11 a 12 a SEQ ID č. 13 a 14 (obr. 4 a 5).

V ještě jiném provedení může být upravená protilátka podle tohoto vynálezu navázána na další činidlo. Například se může použít způsob rekombinantní DNA technologie k přípravě protilátky podle tohoto vynálezu, ve které je Fc fragment nebo CH3 doména úplné molekuly protilátky nahrazen enzymem nebo jinou detekovatelnou molekulou (napříkladpolypeptidovou efektorovou nebo reportérovou molekulou).

Druhý fúzní partner může být také operativně navázán na neimunoglobulinový peptid, protein nebo jeho fragment heterologní k sekvenci obsahující CDR, která má antigenní specifícitu myší 3B9. Výsledný protein může mít po expresi jak anti-IL4 antigenní specifícitu, tak charakteristiky neimunoglobulinové molekuly. Touto charakteristikou fůzního partnera může být například funkční charakteristika, jako je jiná vazebná nebo receptorová doména, nebo terapeutická charakteristika, když je fúzní partner sám terapeutickým proteinem, nebo další antigenní charakteristika.

Jiný žádoucí protein podle tohoto vynálezu může obsahovat úplnou molekulu protilátky, která má kompletní těžký nebo lehký řetězec, nebo jejich diskrétní fragment, jako je Fabnebo F(ab')₂ fragment, dimer těžkého řetězce nebo jejich libovolné minimální rekombinantní fragmenty, jako je F_v nebo jednořetězcová protilátka (SCA) nebo nějaká jiná molekula se stejnou specifícitou jako má vybraná donorová MAb, například MAb 3B9 nebo 6A1. Takový protein může být použit ve formě fúzního proteinu nebo může být použit v nefúzované formě.

Kdykoli je druhý fúzní partner odvozen od jiné protilátky, například je pracovní region nebo konstantní region z imunoglobulinu jakékoliv třídy nebo izotypu, vzniká upravená protilátka. Upravené protilátky mohou obsahovat imunoglobulinové (Ig) konstantní regiony a variabilní pracovní regiony z jednoho zdroje, například akceptorové protilátky, a jeden nebo větší počet (výhodně všechny) CDR zdonorové protilátky, například anti-IL4 protilátky zde popsané. Kromě toho mohou být připraveny změny na úrovni nukleových kyselin nebo aminokyselin, například delece, substituce nebo adice, v pracovním regionu variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové Mab, nebo mohou být donorové CDR regiony upraveny za účelem uchování vazebné specifícity pro antigen donorové protilátky.

Takové upravené protilátky jsou navrženy tak, aby využily jeden (nebo oba) variabilní regiony těžkého a/nebo lehkého řetězce IL4 MAb (popřípadě modifikované způsobem popsaným výše), nebo jeden nebo větší počet z dále identifikovaných CDR těžkého nebo lehkého řetězce (viz příklad 3). Upravené protilátky podle tohoto vynálezu jsou neutralizační, to znamená, že požadova

-10CZ 295928 B6 ným způsobem blokují vazbu IL4 proteinu na receptor. Například, upravená protilátka odvozená od MAb 3B9 je namířena proti specifickému terciárnímu proteinovému epitopu lidského IL4, o kterém se předpokládá, že je v regionu B-C smyčka -> C helix, jak je popsáno výše.

Takové upravené protilátky zahrnují humanizovanou protilátku obsahující pracovní regiony zvoleného lidského imunoglobulinu nebo jeho subtypu, nebo chimérickou protilátku obsahující konstantní regiony lidského těžkého a lehkého řetězce fúzované k funkčním fragmentům IL4 protilátky. Vhodná lidská (nebo jiná zvířecí) akceptorová protilátka může být vybrána z obvyklé databáze, například databáze KABAT^(R), Los Alamos database, USA, a švýcarské Protein-Database, podle homologie s nukleotidovými a aminokyselinovými sekvencemi donorové protilátky. Lidská protilátka charakterizovaná homologií k pracovním regionům donorové protilátky (na aminokyselinové úrovni) může být vhodná k poskytnutí konstantního regionu těžkého řetězce a/nebo variabilního pracovního regionu lehkého řetězce pro inzerci donorových CDR. Vhodná akceptorová protilátka schopná poskytnout konstantní nebo variabilní pracovní regiony lehkého řetězce se může vybírat podobným způsobem. Je třeba uvést, že těžké a lehké řetězce akceptorové protilátky nemusí pocházet ze stejné akceptorové protilátky.

Je žádoucí, aby se heterologní pracovní regiony a konstantní regiony vybíraly ze tříd a izotypů lidských imunoglobulinů, jako je IgG (subtypy 1 až 4), IgM, IgA a IgE. Akceptorová protilátka nemusí obsahovat pouze lidské imunoglobulinové proteinové sekvence. Například můžebýt připraven gen, ve kterém je DNA sekvence kódující část lidského imunoglobulinového řetězce fúzována na DNA sekvenci kódující ne-imunoglobulinovou aminokyselinovou sekvenci, jako polypeptidová efektorová nebo reportérová molekula.

Příklad zvláště vhodné humanizované protilátky obsahuje CDR 3B9 inzertované do pracovních regionů zvolené lidské protilátkové sekvence. Pro neutralizační humanizované protilátky se jeden, dva nebo výhodně tři CDR variabilních regionů těžkého řetězce a/nebo lehkého řetězce IL4 protilátky inzertují do pracovních regionů zvolené lidské protilátkové sekvence, kde nahradí přirozené CDR této protilátky.

Výhodně jsou v humanizované protilátce variabilní domény jak lidského těžkého, tak lehkého řetězce upraveny jednou nebo větším počtem náhrad CDR. Je možné použít všech šesti CDR nebo různých kombinací méně než šesti CDR. Výhodně se však nahrazuje všech šest CDR. Je možné nahradit CDR pouze v lidském těžkém řetězci, za použití nemodifikovaného lehkého řetězce z lidské akceptorové protilátky jako lehkého řetězce. Ještě další alternativa spočívá v tom, že se kompatibilní lehký řetězec může zvolit z jiné lidské protilátky za pomoci obvyklé databáze protilátek. Zbytek upravené protilátky může být získán z libovolného vhodného akceptorového lidského imunoglobulinu.

Upravená humanizovaná protilátka tak má výhodně strukturu přirozeně lidské protilátky nebo jejího fragmentu a má kombinaci vlastností vyžadovaných pro účinné terapeutické použití, například pro léčbu zánětlivých chorob zprostředkovaných IL4 u člověka nebo pro diagnostická použití.

Jiným příkladem je upravená protilátka obsahující tři CDR variabilního regionu lehkého řetězce 3B9 (SEQ ID č. 16, 18, 20 a 28) a tři CDR variabilního regionu těžkého řetězce 3B9 (SEQ ID č. 22, 24 a 26). Výsledná humanizovaná protilátka je charakterizována antigenní vazebnou specificitou a vysokou afinitou MAb 3B9.

Odborník v oboru pochopí, že upravená protilátka může být dále modifikována změnami v aminokyselinách variabilní domény bez narušení specificity a vysoké afinity donorové protilátky (tj. vzniká tak analog). Například, byly zkonstruovány humanizované monoklonální protilátky, ve kterých je v lehkém řetězci aminokyselinovým zbytkem v poloze 120 arginin (SEQEDč. 13 a 14) nebo threonin (SEQ ID č. 57 a 58). Předpokládá se, že aminokyseliny těžkého a lehkého

-11 CZ 295928 B6 řetězce mohou být substituovány jinými aminokyselinami buď v pracovních regionech variabilní domény nebo CDR, nebo v obou.

Dále, konstantní region může být pozměněn za účelem zvýšení nebo snížení určitých vlastností molekul podle tohoto vynálezu, například dimerizací, vazbou na Fc receptory nebo schopností vázat a aktivovat komplement (viz například Angal a kol., Mol. Immunol. 30, 105-108 /1993/, Xu a kol., J. Biol. Chem. 269, 3469-3474 /1994/ a Winter a kol., EP 307 434B).

Fúzní protein, kterým je chimérická protilátka, se liší od humanizovaných protilátek popsaných výše tím, že obsahuje celé variabilní regiony těžkého řetězce a lehkého řetězce ne-humanizované donorové protilátky, včetně pracovních regionů, ve spojení s konstantními regiony lidského imunoglobulinu pro oba řetězce. Očekává se, že chimérické protilátky, které obsahují další nonlidské sekvence vzhledem k humanizovaným protilátkám podle tohoto vynálezu, mohou vyvolat signifikantní imunitní reakci u lidí.

Takové protilátky jsou vhodné při prevenci a léčbě alergických chorob zprostředkovaných IL4, jak je rozebráno dále.

VI. Způsob přípravy fúznich proteinů a upravených protilátek

Výhodně se při konstrukci fúznich proteinů a upravených protilátek, výhodně humanizovaných protilátek podle tohoto vynálezu, použijí sekvence variabilního lehkého a/nebo těžkého řetězce a CDR MAb 3B9 (SEQ ID č. 16, 18, 20, 22, 24 a 26) nebo jiné vhodné donorové MAbs (například 6A1) a jejich kódující nukleotidové sekvence, za použití dále uvedeného způsobu. Stejné nebo podobné techniky se mohou také použít k přípravě jiných provedení tohoto vynálezu.

Hybridom produkující zvolenou donorovou MAb, například myší protilátku 3B9, se klonuje obvyklým způsobem, a DNA variabilních regionů těžkého a lehkého řetězce se získá technikami známými odborníkovi v oboru, například technikami, které popsal Sambrook a kol., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory /1989/. Variabilní těžké a lehké regiony 3B9 obsahující alespoň CDR a ty části pracovního regionu variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce, které jsou nutné pro zachování vazebné specificity donorové Mab, stejně jako zbývající imunoglobulinové části protilátkového řetězce z lidského imunoglobulinu, se získají za použití polynukleotidových primerů a reverzní transkriptázy. CDR se identifikují za použití známé databáze a porovnáním sjinými protilátkami.

Potom se může připravit myší/lidská chimérická protilátka a ta se může testovat na vazebnou schopnost. Taková chimérická protilátka obsahuje celé V_H a V_L regiony non-lidské donorové protilátky, ve spojení s konstantními regiony lidského imunoglobulinu pro oba řetězce.

Homologní pracovní regiony variabilního regionu těžkého řetězce z lidské protilátky se identifikují za použití počítačových databází, například KABAT^(R), a lidská protilátka projevující homologii k 3B9 se vybere jako akceptorová protilátka. Sekvence syntetických variabilních regionů těžkého řetězce obsahující 3B9 CDR v pracovních regionech lidské protilátky se nevrhly tak, aby obsahovaly volitelné nukleotidové substituce pro vložení restrikčních míst. Takto navržené sekvence se potom syntetizují za použití překrývajících se oligonukleotidů, amplifikují se polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) a korigují se chyby.

Vhodné pracovní regiony variabilního regionu lehkého řetězce se navrhují podobným způsobem.

Humanizovaná protilátka se může odvodit od chimérické protilátky nebo se může výhodně připravit synteticky inzerováním CDR z těžkých a lehkých řetězců donorové Mab do vybraného pracovního regionu těžkého a lehkého řetězce. V jiném provedení se humanizovaná protilátka podle tohoto vynálezu může připravit za použití obvyklých technik mutageneze. Tak výsledná humanizovaná protilátka obsahuje lidské pracovní regiony a CDR donorové MAb. Ve zbytcích pracov

-12CZ 295928 B6 ního regionu se mohou provést dodatečné manipulace. Výsledná humanizovaná protilátka může být exprimována v rekombinantních hostitelských buňkách, například COS nebo CHO buněk. Další detaily tohoto postupu jsou uvedeny v příkladu 4. Jiné humanizované protilátky se mohou připravit za použití tohoto technického postupu na jiných vhodných IL4-specifických neutralizačních non-humanizovaných protilátkách s vysokým titrem.

Běžný expresní vektor nebo rekombinantní plazmid se připraví umístěním těchto kódujících sekvencí pro fúzní protein do operativní asociace s běžnými regulačními kontrolními sekvencemi schopnými řízení replikace a exprese v hostitelské buňce a/nebo sekrece z hostitelské buňky. Regulační sekvence zahrnují promotorové sekvence, například CMV promotor, a signální sekvence, které mohou být získány z jiných známých protilátek. Podobně se připraví druhý expresní vektor obsahující DNA sekvenci, která kóduje komplementární lehký nebo těžký řetězec protilátky. Výhodně je tento druhý expresní vektor identický sprvním, stou výjimkou, že kódující sekvence a volitelné signální znaky jsou uspořádány tak, aby byla co nejlépe zajištěna funkční exprese každého polypeptidového řetězce.

Zvolená hostitelská buňka se kotransfektuje obvyklými technickými postupy jak s prvními, tak s druhými vektory, nebo se jednoduše transfektuje jediným vektorem, aby se vytvořila transfektovaná hostitelská buňka podle tohoto vynálezu obsahující rekombinantní nebo syntetické lehké a těžké řetězce. Transfektovaná buňka se potom kultivuje obvyklými technickými způsoby za vzniku upravené protilátky podle tohoto vynálezu. Humanizovaná protilátka, ve které jsou spojeny rekombinantní těžký řetězec a lehký řetězec, se testuje v kultuře vhodným testem, jako je ELISA nebo RIA. Podobné běžné techniky se mohou použít ke konstrukci jiných fúzních proteinů a molekul podle tohoto vynálezu.

Vhodné vektory pro kroky klonování a subklonování, používané ve způsobech a konstrukci prostředků podle tohoto vynálezu, mohou být vybrány odborníkem v oboru. Například se mohou použít obvyklé pUC série klonovacích vektorů. Jedním z používaných vektorů je pUC19, který je komerčně dostupný od dodavatele, jako je Amersham (Buckinghamshire, Spojené Království) nebo Pharmacia (Uppsala, Švédsko). Pro klonování může být použit libovolný vektor, který se může snadno replikovat, má nadbytek klonovacích míst a obsahuje markerové geny, a dá se s ním snadno manipulovat. Výběr klonovacího vektoru tak není omezujícím činitelem tohoto vynálezu.

Podobně, vektory použité pro expresi upravených protilátek podle tohoto vynálezu, může vybrat odborník z oboru z libovolných obvyklých vektorů. Vektory také obsahují zvolené regulační sekvence, které jsou operativně navázané na DNA kódující sekvence imunoglobulinových regionů a jsou schopné řídit replikaci a expresi heterologních sekvencí DNA ve zvolených hostitelských buňkách, jako například CMV promotory. Tyto vektoiy obsahují výše popsané DNA sekvence, které kódují upravenou protilátku nebo fúzovanou molekulu. Podle jiného provedení vektory mohou obsahovat zvolené imunoglobulinové sekvence modifikované inzercí vhodných restrikčních míst pro snadnou manipulaci.

Expresní vektory mohou také obsahovat markerové geny vhodné pro amplifíkování exprese heterologních DNA sekvencí, například gen savčí dihydrofolát-reduktázy (DNFR) neo gen rezistence na neomycin (neo^R). Jiné výhodné vektorové sekvence obsahují póly A signální sekvenci, například z hovězího růstového hormonu (BGH) a β-globinovou promotorovou sekvenci (betaglopro). Expresní vektory vhodné podle zde popsaného řešení se mohou syntetizovat technikami dobře známými odborníkovi v oboru.

Složky takových vektorů, například replikony, selekční geny, zesilovače transkripce, promotory, signální sekvence a podobně, se mohou získat z přírodních zdrojů nebo se mohou připravit synteticky známými postupy a mohou být použity při řízení exprese a/nebo sekrece produktu z rekombinantní DNA ve zvoleném hostiteli. Pro tento účel mohou být vybrány také jiné vhodné

-13 CZ 295928 B6 expresní vektory, kterých je v oboru známo mnoho pro savčí, bakteriální, hmyzí, kvasinkovou a mykotickou expresi.

Tento vynález také zahrnuje buněčnou linii transfektovanou rekombinantním plazmidem obsahujícím kódující sekvence upravených protilátek nebo jejich fúzních molekul. Hostitelské buňky vhodné pro klonování a jiné manipulace s těmito klonujícími vektory jsou také obvyklé. Nejlépe se pro replikaci klonujících vektorů a jiných stupňů při konstrukci fúzních proteinů podle tohoto vynálezu použijí buňky z různých kmenů E. coli.

Vhodné hostitelské buňky nebo buněčné linie pro expresi upravené protilátky nebo fúzního proteinu podle tohoto vynálezu jsou eukaryotické buňky, jako jsou mimo jiné CHO, COS, fíbroblasty (například 3T3) a myeloidní buňky, přičemž nejvýhodnější je savčí buňka, jako CHO nebo myeloidní buňka. Mohou se používat lidské buňky, což umožňuje, aby molekula byla modifikována podle lidských glykosylačních vzorů. Alternativně se mohou používat jiné eukaryotické buněčné linie. Výběr vhodných savčích hostitelských buněk a způsobů transformace, kultivace, amplifíkace, testování, produkce produktu a jeho čištění, jsou známy v oboru, viz například Sambrook a kol., cit. výše.

Bakteriální buňky se mohou ukázat vhodné jako hostitelské buňky pro expresi rekombinantních MAb podle tohoto vynálezu. V důsledku tendence proteinů exprimovaných v bakteriálních buňkách k nesprávnému skládání (nebo neskládám) a vzhledem k tomu, že tyto proteiny nemusí být glykosylovány, je nutno jakoukoliv Mab produkovanou v bakteriální buňce testovat na zachování vazebné schopnosti k antigenu. Pokud se molekula exprimovaná bakteriální buňkou produkuje ve správně složené formě, tak může být bakteriální buňka vhodným hostitelem. Například různé kmeny E. coli používané pro expresi jsou dobře známé jako hostitelské buňky v oblasti biotechnologií. Různé kmeny B. subtilis, Streptomyces, jiné bacily a podobně, se mohou také použít při tomto způsobu.

Pokud je to žádoucí, tak jsou kmeny kvasinkových buněk známé odborníkovi v oboru také dostupné jako hostitelské buňky, stejně jako buňky hmyzu, například Drosophila a Lepidoptera, a virové expresní systémy (viz například Miller a kol., Genetic Engeneering 8, 277-298, Plenům Press /1986/ a citace zde uvedené).

Obecné způsoby, kterými se mohou konstruovat vektory podle tohoto vynálezu, transfekční metody nutné pro přípravu hostitelských buněk podle tohoto vynálezu a metody kultivace potřebné pro přípravu fúzního proteinu nebo upravené protilátky podle tohoto vynálezu z takové hostitelské buňky, jsou vždy obvyklými technickými postupy. Podobně, po přípravě jsou fúzní proteiny nebo upravené protilátky podle tohoto vynálezu čištěny z buněčné kultury obvyklými způsoby, včetně srážení síranem amonným, na afínitních kolonách, chromatografií na koloně, gelovou elektroforézou a podobně. Takové technické postupy jsou známé odborníkovi v oboru a nejsou omezením tohoto vynálezu.

Ještě jiný způsob exprese humanizovaných protilátek může používat expresi vtransgenním zvířeti, jako je popsána v patentu US 4 873 316. Uvedený patent se týká expresního systému využívajícího zvířecí kaseinový promotor, který - pokud se transgenně vpraví do savce - dovoluje samici produkovat požadovaný rekombinantní protein ve svém mléku.

Po expresi upravené protilátky vybranou metodou se tato protilátka testuje na aktivitu in vitro za použití vhodného testu. V současnosti se pro stanovení kvalitativní a kvantitativní vazby upravené protilátky na IL4 epitop používají běžné ELISA testy. Jiné testy in vitro, například BIAcore (Pharmacia), se mohou také použít k ověření neutralizační aktivity před následujícími klinickými studiemi prováděnými na lidech, což dovoluje ohodnotit stabilitu upravené protilátky v těle navzdory obvyklým mechanizmům eliminace.

-14CZ 295928 B6

Podle způsobů popsaných pro humanizované protilátky připravené z 3B9 může odborník v oboru také konstruovat humanizované protilátky z jiných donorových IL4 protilátek, sekvencí variabilních regionů a CDR peptidů zde popsaných. Upravené protilátky se mohou připravovat s variabilními pracovními regiony označovanými jako „vlastní“ pro příjemce upravené protilátky. Pro dosažení velikého zvýšení vazby na antigen bez příslušného zvýšení imunogenity pro příjemce se mohou provádět malé modifikace variabilního pracovního regjonu. Takto upravené protilátky mohou účinně léčit stavy zprostředkované IL4 u lidí. Takové protilátky mohou také být vhodné při diagnostice takových onemocnění.

VII. Terapeutické/profylaktické použití

Tento vynález se také týká způsobu léčby lidí trpících alergických onemocněním. Způsob zahrnuje podávání účinné dávky protilátek, včetně jedné nebo více upravených protilátek nebo fúzních proteinů podle předkládaného vynálezu.

Terapeutická odpověď dosažená použitím molekul podle tohoto vynálezu vzniká v důsledku vazby na lidský IL4 s následným blokováním uvolňování o IgE. Tak jsou molekuly podle tohoto vynálezu, když jsou v přípravcích a prostředcích vhodných pro terapeutické použití, vysoce žádoucí pro osoby s alergickou reakcí, jako je alergická rhinitida, konjuktivitida, atopická dermatitida, atopické astma a anafylaktický šok.

Fúzované proteiny, protilátky, upravené protilátky nebo jejich fragmenty podle tohoto vynálezu se mohou také používat ve spojení s jinými protilátkami, zvláště s lidskými MAb reagujícími s jinými signálními znaky (epitopy) odpovědnými za stav, proti kterému je zaměřena upravená protilátka podle tohoto vynálezu. Podobně, MAb reaktivní s epitopy odpovědnými za stavy u vybraných zvířat, proti kterým jsou protilátky podle tohoto vynálezu namířeny, se mohou také používat se veterinárních prostředcích.

Předpokládá se, že terapeutické prostředky podle tohoto vynálezu jsou vhodné pro léčbu alergických stavů po dobu od přibližně 2 dnů do zhruba 3 týdnů nebo podle potřeby. Například, delší ošetřování může být žádoucí, pokud se ošetřuje sezónní rhinitida nebo podobná onemocnění. To představuje žádoucí výhodu oproti v současné době používanému infuznímu protokolu pro léčbu onemocnění zprostředkovaných IL4. Dávka a doba ošetřování souvisí s relativní dobou setrvání molekul podle tohoto vynálezu v oběhu člověka, a mohou být upraveny odborníkem v oboru v závislosti na léčeném onemocnění a celkovém zdravotním stavu pacienta.

Způsobem podávání terapeutického prostředku podle tohoto vynálezu může být libovolný vhodný způsob, který dopraví prostředek do pacienta. Fúzní proteiny, protilátky, upravené protilátky a jejich fragmenty a také farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu, jsou zvláště vhodné pro parenterální podávání, to znamená pro podávání subkutánně, intramuskulárně, intravenózně nebo intranasálně.

Terapeutické prostředky podle tohoto vynálezu se mohou připravit jako farmaceutické prostředky, které obsahují účinné množství upravené protilátky (například humanizované protilátky) podle tohoto vynálezu jako účinnou látku ve farmaceuticky přijatelném nosiči. V profylaktickém prostředku podle tohoto vynálezu se výhodně použije vodná suspenze nebo roztok obsahující upravenou protilátku, který je nejlépe pufřovaný na fyziologickou hodnotu pH, výhodně ve formě připravené pro injekce. Prostředky pro parenterální podání budou obvykle obsahovat roztok upravené protilátky podle tohoto vynálezu nebo její směs, rozpuštěné ve farmaceuticky přijatelném nosiči, výhodně ve vodném nosiči. Mohou se použít různé vodné nosiče, například 0,4% fyziologický roztok, 0,3% glycin a podobně. Tyto roztoky jsou sterilizovány a obvykle zbaveny hmoty ve formě částic. Tyto roztoky se mohou sterilizovat obvyklými, dobře známými technickými způ soby sterilizace (například filtrací). Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky, které jsou nutné pro napodobení fyziologických podmínek, jako látky k úpravě hodnoty pH, pufrovací činidla a podobně. Koncentrace protilátky podle tohoto vynálezu v takovém

-15CZ 295928 B6 farmaceutickém prostředku se může široce měnit, to znamená od méně než přibližně 0,5 %, obvykle od 1 % nebo alespoň přibližně 1 %, až do 15 nebo 20 % hmotnostních, a bude vybrána především na základě objemů tekutin, viskozit atd., podle zvoleného způsobu podání.

Farmaceutický prostředek podle tohoto vynálezu pro intramuskulární injekci se tedy může připravit tak, že obsahuje 1 ml sterilní pufrované vody a od přibližně 1 ng do zhruba 100 mg, například od přibližně 50 ng do zhruba 30 mg nebo více, výhodně od přibližně 50 mg do zhruba 25 mg, upravené protilátky podle tohoto vynálezu. Podobně, farmaceutický prostředek podle tohoto vynálezu pro intravenózní injekce se může připravit tak, že obsahuje přibližně 250 ml sterilního Ringerova roztoku a od přibližně 1 do zhruba 30 mg, výhodně od 5 do zhruba 25 mg upravené protilátky podle tohoto vynálezu. Aktuální metody pro přípravu prostředků podávaných parenterálně jsou dobře známé nebo budou zřejmé odborníkovi v oboru a jsou podrobněji popsány například v Remingtonů Pharmaceutical Science, 15. vyd., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA.

Je výhodné, aby byl terapeutický prostředek podle tohoto vynálezu, pokud je ve formě farmaceutického prostředku, připraven ve formě dávkových jednotek. Vhodnou terapeuticky účinnou dávku může snadno stanovit odborník v oboru. K účinné léčbě zánětlivých onemocnění u lidí nebo jiných živočichů se má v jedné dávce podat od přibližně 0,1 do zhruba 20 mg proteinu nebo protilátky podle tohoto vynálezu na 70 kg tělesné hmotnosti parenterální cestou, výhodně intramuskulárně (i.m.). Taková dávka se může, pokud je to nutné, opakovat v příslušných časových intervalech, jak jsou zřejmé ošetřujícímu lékaři, během zánětlivé reakce.

Tento vynález také zahrnuje podávání IL4 fúzních proteinů podle tohoto vynálezu souběžně nebo postupně s jinými protilátkami nebo fúzního proteiny s anti-IL4 aktivitou, jako je aktivita proti tumor-nekrosis faktoru nebo jiná farmaceutická aktivita kompatibilní s vazbou fúzních proteinů podle tohoto vynálezu na IL4 receptor. Takové jiné protilátky jsou dostupné komerčně nebo mohou být navrženy způsobem, který je podobný jako je zde popsáno.

Fúzní proteiny a upravené protilátky podle tohoto vynálezu se mohou také používat v diagnostických režimech, jako pro diagnostikování chorob zprostředkovaných IL4 nebo pro sledování léčby takových chorob. Jako diagnostická činidla se tyto fúzní proteiny mohou běžně značit pro použití v ELIS A nebo jiných obvyklých testech pro testování hladin IL4 v séru, plazmě nebo jiné vhodné tkáni. Typ testu, ve kterém se používají fúzní proteiny, není omezením tohoto vynálezu.

Protilátky, upravené protilátky nebo jejich fragmenty zde popsané se mohou lyofílizovat pro skladování a mohou se rekonstituovat před použitím ve vhodném nosiči. Tento technický postup se ukázal být účinným u obvyklých imunoglobulinů. Mohou se používat v oboru známé lyofílizační a rekonstituční technické způsoby.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady ilustrují různé aspekty předkládaného vynálezu, včetně popisu přípravy upravených protilátek a jejich exprese ve vhodných vektorech a hostitelských buňkách, a tyto příklady nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Veškeré aminokyseliny jsou označeny běžným třípísmenným nebo jednopísmenným kódem. Všechny potřebné restrikční enzymy, plazmidy další činidla a materiály byly získány z komerčních zdrojů, pokud není uvedeno jinak. Všechny obecné klonovací ligace a další postupy rekombinantní DNA technologie byly provedeny podle T. Maniatis a kol., výše, nebo podle druhého -vydání této knihy (1989), vyd. Sambrook a kol., stejný vydavatel („Sambrook a kol.“).

-16CZ 295928 B6

Příklad 1

Způsob přípravy Mab 3B9

A. Imunizační postup

Čtyři myši (FI hybridy Balb/c a C57BL/6) se imunizují subkutánně 50 pg rekombinantního E. coli lidského IL4 ve Freudově kompletním adjuvans a o 4 týdny později uvedou do styku s 50 pg IL4 ve Freudově nekompletním adjuvants, zavedeném intraperitoneálně (i.p.). Na základě dobrého titru sérové protilátky vůči IL4 jedna myš se dále imunizuje 200 pg IL4 (i.p. ve fyziologickém roztoku) za 8 týdnů, o 2 dny později 100 pg IL4 (i.p. ve fyziologickém roztoku) a o 2 dny později 50 pg IL4 (i.p. ve fyziologickém roztoku). Za 2 dny po konečné imunizaci se provede splenektomie.

B. Způsob fúze a systém vyšetření

Buňky sleziny myší se použijí pro přípravu hydridomů (normalizovaných postupem, například jak popsal Kohler a kol. v Nátuře 256, 495 /1975/), ze kterých se více než 250 klonů buněk vyšetřuje na sekreci protilátky k IL4, za použití komerčně dostupného BIAcore systému a testů ELISA popsaných dále, pro vázání IL4. Pozitivní odezvu poskytne pět jamek. Pouze jeden klon z myši, 3B9, je silně pozitivní. Všechny sekundární klony odvozené od 3B9 jsou pozitivní.

Příklad 2

Testování ELISA a afinitní konstanty

A. Způsob testování ELISA

Vyšetření testováním, prováděné jak je popsáno dále, je určeno k měření afinity pro přírodní lidský IL4. Pro experiment 1 se deska s 96 jamkami aktivovaná aldehydem povleče IL4 v koncentraci 1 pg/ml, 100 pl/jamka, v 0,1 M borátovém pufru, o hodnotě pEl 8,5, a inkubuje přes noc za teploty místnosti. hIL4 se kovalentně váže k desce. Roztok IL4 se odsaje a nespecificky vazebná místa (NSB) se blokují 1% hovězím sérovým albuminem (BSA) v TBS pufru (50 mM Tris, 150 mM chloridu sodného, 1 mM chloridu hořečnatého a 0,02 % azidu sodného, hodnota pH 7,4) za teploty 37 °C po dobu 60 minut. Po tomto a každém z následujících kroků se deska promyje čtyřikrát pufrem (10 mM Tris, 150 mM chloridu sodného, 0,05 % Tween a 0,02 % azidu sodného, hodnota pH 7,4). Potom se přidá 50 pl hybridomového prostředí (nebo čištěného 3B9 nebo Fab fragmentů) a 50 pl zkušebního pufru (0,5 % hovězího τ-globulinu v TBS pufru) a desky se inkubují za teploty 37 °C po dobu 60 minut. 100 pl biotinylované anti-myší protilátky se přidá na jamku ve zkušebním pufru a inkubuje jako je popsáno výše. Na jamku se potom přidá 100 pl alkalickou fosfatázou konjugovaného streptavidinu a inkubuje (za teploty 37 °C po dobu 30 minut). Nato se přidá 100 pl/jamka PNP substrátu a vše se inkubuje za teploty 37 °C po dobu 30 minut. Odečtení se provede při optické hustotě 405 nm.

Pro experiment 2 se desky povlečené streptavidinem (100 pl/jamka, 1 pg/ml, ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS)) inkubují za teploty 4 °C přes noc a testují, jak je popsáno dále. Roztok streptavidinu se odsaje, NSB místa se blokují 1% BSA v TBS pufru (za teploty 37 °C po dobu 60 minut). Po tomto a každém z následujících kroků se desky promyjí čtyřikrát pufrem. Potom se přidá 50 pl biotinylovaného IL4 s 50 pl zkušebního pufru a vše inkubuje za teploty 37 °C po dobu 30 minut. Potom se přidá 50 pl čištěného 3B9 IgG nebo fragmentu Fab (nebo hybridomového prostředí) a 50 pl zkušebního pufru a vše se inkubuje za teploty 37 °C po dobu 60 minut. Potom se přidá 100 pl anti-myšího IgG alkalického fosfatázového konjugátu

- 17CZ 295928 B6 a inkubuje se za teploty 37 °C po dobu 60 minut. Nato se přidá 100 μΐ PNP substrátu a vše se inkubuje za teploty 37 °C po dobu 30 minut. Odečtení se provede jak je uvedeno výše.

B. Výpočet 3B9 afinity pro IL4

Za použití výsledků z experimentů popsaných výše a dále uvedeného souhrnu se vypočítá K_d pro 3B9, jak popsal Beatty a kol., J. Immunol. Methods, 100, 173-179 /1987/:

K_aff =--------------------,

2(2[Ab*]-[AbJ) kde

Ab* znamená koncentraci Ab vázaného při 150 ng/ml biotinylovaného hIL4 a

Ab znamená koncentraci Ab vázaného při 300 ng/ml biotinylovaného hIL4.

Disociační konstanta Kd se vypočítá ze vztahu

K_d =---------.

K_aff

Experiment 1: Test ELISA na streptavidinem povlečené desce s 96 jamkami (100 ng/jamka). K_d = 2,2 x ΙΟ“¹⁰ Μ (3B9 Fab).

Experiment 2: Test ELISA na streptavidinem povlečené desce s 96 jamkami (100 ng/jamka). K_d= 1,4 x 10^_I° Μ (3B9 IgG).

C. Specificita

MAb 3B9 vede k rozpoznání lidského IL4, ale nikoli k poznání hovězího nebo myšího IL4. Jedna cesta ke stanovení této skutečnosti se uvádí dále. ELISA se může provádět za použití desky s 96 jamkami povlečené anti-myším IgG a následně blokování hovězím sérovým albuminem, po kterém se s 50 μΐ 3B9 (100 ng/ml), 25 μΐ ne-lidského IL4 a 25 μΐ biotin-IL4 inkubuje za teploty 37 °C po dobu 60 minut, potom promytou streptavinem konjugovanou alkalickou fosfatázou a PNP.

Podobně bylo zjištěno, že MAb 6A1 nevede k rozeznání hovězího nebo myšího IL4.

Příklad 3

Humanizovaná protilátka

U jedné humanizované protilátky je v úmyslu, aby obsahovala myší CDRs v základní struktuře humanizované protilátky. Tato humanizovaná verze IL4 specifické myší protilátky 3B9 se připraví za použití dále uvedených opatření.

A. Způsob cDNA klonování cDNA klony se zhotoví z 3B9 těžkých a lehkých řetězců z mRNA vyextrahované z 3B9 hybridomové buněčné linie (příklad 1) za použití soupravy Boehringer Mannheim, Primery specifické

-18CZ 295928 B6 buď pro myší pantovou oblast nebo kappa konstantní úsek se použijí pro první provazovou syntézu.

Primer s kappa řetězcem (SEQ ID č. 29):

₅ 5'-CTAACACTCATTCCTGTTOAAGCTCTTGACAATGGG-3’

Primer s τ těžkým řetězcem (SEQ ID č. 30):

5'GTACATATGCAAGGCTTACAACCACAATC 3'.

Dvouprovazová cDNA se klonuje přímo do plazmídů pGEM7f+ (Promega), které se potom transformují do E. coli DH5-oc (Bethesda Research Labs).

B. Způsob DNA sekvencování

Myší cDNA klony s 8 těžkými řetězci a 1 lehkým řetězcem z části A uvedené výše se sekvenují. Výsledky sekvenování variabilních úseků těchto klonů jsou znázorněny v SEQ ID č. 1 a 2 a 3 a 4.

Každý klon obsahující známé aminokyseliny, které se mají konzervovat mezi variabilními úseky těžkého řetězce myši a variabilními úseky lehkého řetězce myši a myšími signálními sekvencemi. CDR aminokyselinové sekvence jsou uvedeny dále.

CDR úseky pro těžký řetězec jsou SEQ ID č. 22, 24 a 26 (aminokyseliny 50 až 56, 71 až 86 20 a 119 až 129 ze SEQ ID č. 4), viz obr. 2. Tyto sekvence jsou kódovány SEQ ID č. 21, SEQ ID

č. 23 a SEQ ID č. 25. CDR úseky pro lehký řetězec jsou SEQ ID č. 16, 18 a 20 (aminokyseliny 45 až 58, 74 až 80 a 113 až 121 ze SEQ ID č. 2), viz obr. 1. Tyto sekvence jsou kódovány SEQ ID č. 15, 17 a 19.

C. Selekce humanizovaných základních struktur

Po klonování 3B9 se aminokyselinové sekvence variabilního úseku (aminokyseliny 21 až 132 ze SEQ ID č. 2 a aminokyseliny 20 až 140 ze SEQ ID č. 4) porovnají s lidskou imunoglobulinovou sekvencí z databáze využívající KABAT^(R) a databáze SWISS, za účelem rozpoznání lidské 30 základní struktury jak pro těžký řetězec, tak pro lehký řetězec, které patrně byly důkladně přizpůsobeny myšímu původnímu zdroji v sekvenční homologii. Kromě těchto zjištění pro sekvenční homologii se těžké a lehké řetězce také hodnotí proti poziční databázi vyvolané ze strukturních modelů domény Fab, ke stanovení případných rozporů v důsledku aminokyselinových substitucí, které mohou ovlivnit představení CDR. Pro přítomný případ se nestanoví žádná zřejmá neshoda 35 při hledání struktury, a proto se vyvozuje, že se použila kódující DNA z homologně zjištěné aminokyselinové sekvence.

Používají se úseky základní struktury těžkého řetězce protilátky získané z lidského myelomového imunoglobulinu (COR) (E. M. Press a N. M. Hogg, Biochem. J. 117, 641-660 /1970/). Bylo 40 zjištěno, že tato sekvence je z přibližně 77 % homologní (69,4 % identity) k 3B9 variabilnímu úseku řetězce v úrovni aminokyseliny.

Pro vhodný variabilní úsek základní struktury lehkého řetězce se použije variabilní sekvence základní struktury lehkého řetězce z lidské protilátky, kterou identifikoval H. G. Klobeck a kol., 45 Nucl. Acids Res. 13, 6515-6529 /1985/. Bylo nalezeno, že sekvence lidské protilátky je z přibližně 80,2 % homologní (72,0 % identity) k myšímu 3B9 variabilnímu úseku lehkého řetězce v úrovni aminokyseliny.

Dané myší 3B9 CDRs (SEQ ID č. 15 až 26) a sekvence lidské protilátky vedou k vytvoření 50 syntetického těžkého řetězce a PCR účinkuje při doplňování a zesílení DNA. Tyto sekvence se

-19CZ 295928 B6 syntetizují následujícími překrývajícími oligonukleotidy a zesilují PCR. SEQ ID č. 31 až 37 poskytne pět překrývajících oligů a 2 PCR primery. V oligo 1 (SEQ ID č. 31) jsou zjištěny překlenovací báze 5 až 121. V oligo 2 (SEQ ID č. 32) jsou zjištěny překlenovací báze 122 až 241 a v oligo 3 (SEQ ID č. 33) jsou zjištěny překlenovací báze 242 až 361. Oba spodní pramenové primery SEQ ID č. 34 a SEQ ID č. 35 překlenují báze 134 až 110 a báze 253 až 230. Jakékoli chyby v mapované sekvenci, které byly inzerovány PCR, jsou korigovány. PCR dovoluje znovu použití jako 5' příměrových nukleotidů 1 až 25 SEQ ID č. 36 a jako 3' příměrových nukleotidů 361 až 341 SEQ ID č. 37.

Syntetický variabilní úsek se liguje do expresního vektoru pCD současně se syntetickou signální sekvencí SEQ ID č. 5 a 6 z konstrukce chimérického těžkého řetězce spolu s IgGj lidským konstantním úsekem. Syntetický V_H, signální sekvence nukleotidu a aminokyselinové sekvence jsou uvedeny na obr. 4 (SEQ ID č. 11 a 12). Aminokyselinové sekvence CDRs (SEQ ID č. 22, 24 a 26) jsou identické s myšími 3B9 CDRs. Avšak kódující sekvence pro tyto CDRs (SEQ ID č. 54, 55 a 56) se odlišují od myších 3B9 kódujících sekvencí (SEQ ID Č. 21, 23 a 25). Výsledný expresní vektor, IL4hzhcl-l-Pcd je znázorněn na obr. 9.

CDR genové úseky předem existující základní struktury lehkého řetězce se odstraní restrikčními fragmenty a nahradí dále uvedenými IL-4 CDR geny, které se připravily synteticky.

ProCDRl:

SEQ ID č. 38: 5’CTAGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAAC TGCAAGG 3’

SEQ ID č. 39: CCTTGCAGTTGATGGTGGCCCTCrCGCCCAGAGACACAG

SEQ ID č. 40: TCGAGAGGCCTCCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAG TTATATGAACTGGTATCAGCAGAAACCC

SEQ ID č. 41: GGGTTTCTGCTGATACCAGTTCATATAACTATCACCATCATA

ATCAACACTTTGGGAGGCCTC

Pro CDR2;

SEQ ID č. 44: GGGCAGCCTCCTAAGTIIKrrcATTTACGCTGCATCCAATCTA GAATCTGGGGTAC

SEQ ID č. 45: CCCAGAJTCTAGATTGGATGCAGCGTAAATGAGCAACTTAGG AGGCTGCCC

Pro CDR3:

SEQ ID č. 42: ATACTACTGTCAGCAAAGTAATGAGGATCCTCCGAGGTrCGG CGGAGGGAC

SEQ ID č. 43: crTGGTCCCTC(XCCX3AACCTXXKíAGGAlXXICATTACrrnj CTGACAGTAGT

Tyto syntetické variabilní sekvence s lehkým a/nebo těžkým řetězcem se používají v konstrukci humanizované protilátky.

-20CZ 295928 B6

Příklad 4

Způsob exprese humanizovaného MAb v buňkách COS a CHO pUC18 subklony pro V_H se připraví přidáním signálních sekvencí původně získaných z lidské protilátky SEQ ID č. 4. 5. Pro V_L se pUC18 subklony připraví přidáním signální sekvence SEQ ID č. 7.

Humanizovaný těžký řetězec, odvozený od IgGj izotypu, projevuje 89,3% homologii (84,3 % identity) při úrovni aminokyseliny s myším těžkým řetězcem z 3B9. Tento syntetický V_H se dostane v aminokyselinách 20 až 141 ze SEQ ID č. 11 a 12.

Humanizovaný lehký řetězec, lidský kappa řetězec, projevuje 92,0% homologii (86,6 % identity) při úrovni aminokyseliny. Tento syntetický V_L (aminokyseliny 21 až 131 ze SEQ ID č. 13 a 14) obsahující 3B9 CDRs se navrhne a syntetizuje jak je popsáno výše pro syntetické těžké řetězce.

DNA fragmenty obsahující svůj příslušný signál vázaný buď k těžkým nebo lehkým variabilním úsekům se inzeruje do expresního plazmidu savčí buňky na bázi pUC19, který obsahuje CMV promotory a konstantní úseky lidského těžkého řetězce nebo lidského lehkého řetězce chiméry připravené v příkladu 5 dále, obvyklými způsoby (Maniatis a kol., cit. výše), za vzniku plazmidů IL4hzhcl-lPcd (těžký řetězec) (obr. 9) a IL4hzlcl-o-Pcn (lehký řetězec) (obr. 10). HZHC a HZLC plazmidy se kotransfekují do buněk COS a supematanty se zkoušejí pomocí testu ELISA, popsaného bezprostředně výše, na přítomnost humanizované protilátky po třech a po pěti dnech. Jiná humanizovaná protilátka se konstruuje s tím rozdílem, že se použije izotypu IgG4.

Výše uvedený příklad popisuje přípravu příkladné konstruované protilátky. Podobné postupy se mohou použít k vývoji jiných konstruovaných protilátek, za použití jiných anti-IL4 protilátek (například 6A1 v příkladu 7) vyvinutých běžnými prostředky.

Příklad 5

Způsob konstrukce chimérické protilátky

A. Chimérický těžký řetězec se konstruuje izolováním variabilního úseku myšího těžkého řetězce z původně myší MAb 3B9, jako EcoRI-BstEII restrikční fragment. Malý DNA oligomer se navrhne a syntetizuje k vázání myšího variabilního úseku s humanizovaným IgGj konstantním úsekem (BstEII-Apal):

5' primer: SEQ ID č. 50:

GTCACCGTCTCCrCAGCTAGCACCAAGGGGC

3'primer: SEQ ID č. 51:

CTTGGTGCTAGCTGAGGAGACG

Tyto dva fragmenty se ligují do plazmidu pCD (viz obr. 7) (digerováno s EcoRI a Apal), který již kóduje lidský IgGj konstantní úsek. Tento klon není exprimován, proto divoký typ 5'UTR a signální sekvence jsou deletovány a nahrazeny SEQ ID č. 5 a 6.

Protože obvyklá restrikce endonukleázového místa není dostupná na 3' konci signální sekvence, BstEII místo se zavede (to znamená provede se tichá mutace) přes PCR. Přitom se použijí tyto PCR primery:

-21 CZ 295928 B6

SEQ ID č. 48: 5' primer:

5'CAGGTTACCCTGAAAGAGTC 3'

SEQ ID č. 49: 3' primer:

5’GAAGTAGTCCTTGACCAG 3’

Z tohoto plazmidu se potom izoluje BstEII-Pstl restrikční fragment. Nová signální sekvence a 5'UTR se potom navrhnou a syntetizují s EcoRI a BstEII konci.

SEQ ID č. 46: 5' primer:

AATTCGAGGACGCCAGCAACATGGTGTTGCA

GACCCAGGTCTTCATTTCTCTGITGCTCTGGATCTCTGGTGCCTACGGGC

AG

SEQ ID č. 47: 3' primer:

GTAACCTGCCCGTAGGCACCAGAGATCCAGA GCAACAGAGAAATOAAGACCTGGGTCrGCAACACCATGTTGCTGGCGTC CTCG

Chimérický lehký řetězec se konstruuje aplikací PCR technického postupu na původní myší 3B9 lehký řetězec, který se klonuje do pGEM72f(+) (Promega). Použitými primery je komerčně dostupný pUC18 univerzální reverzní primer na konci 5' (EcoRI) a 3' primer, který zavede Narl místo [5’CATCTAGATGGCG CCGCCACAGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC3'

SEQ ID č. 52], použité k fúzi myšího variabilního úseku k lidskému konstantnímu úseku. Tento variabilní úsek se potom liguje do expresního vektoru pCDN (EcoRI Narl) (obr. 8), který již obsahuje lidský kappa úsek.

Prostředí supernatantů se zachytí o tři a pět dní později a testuje za použití ELISA tímto popsaným způsobem: Desky ELISA se povléknou 0,1 μg kozí protilátky specifické pro Fc úsek lidské protilátky. Prostředí supernatantů se přidá během 1 hodiny. Nato se přidá peroxidáza křenu selského konjugovaná s kozí protilátkou specifickou pro celou lidskou IgG protilátku. To se provádí přidáním ABTS peroxidázového substrátu (Kirkegaard & Perry Laboratories lne., Gaitersburg, MD, USA) během 1 hodiny. Stanoví se exprese chimérické protilátky. Při druhém testu ELISA se buňky COS ze supernatantů obsahující chimérické protilátky, vážou specificky k rekombinantnímu lidskému IL4 proteinu. Tento výsledek potvrzuje, že jsou klonovány geny kódující pro protilátku specificky pro IL4.

B. Humanizovaný těžký řetězec se také dostane z tohoto chimérického těžkého řetězce. Humanizovaný těžký řetězec je navržen z inzerce myších CDRs do lidské základní struktury. Zvolená humanizovaná základní struktura je, jak se popisuje výše, nejhomolognější proteinová sekvence ve Švýcarské proteinové databázi, založená na myší 3B9 V_H (aminokyseliny 20 až 140 SEQ ID č. 4). Tato sekvence humanizovaného těžkého řetězce (EcoRI Apal) se připravuje synteticky a PCR dovoluje zavést a zesílit DNA, jak je popsáno výše. Tento syntetický variabilní úsek se liguje do expresního vektoru pCD (EcoRI Apal) dohromady se syntetickou signální sekvencí SEQ ID č. 5 a 6 z konstrukce chimérického těžkého řetězce a IgG lidského konstantního úseku.

-22CZ 295928 B6

Podobně humanizovaný lehký řetězec může být odvozen od chimérického lehkého řetězce, jak je popsáno pro těžký řetězec. Tento gen (EcoR V Narl) se také připravuje synteticky. Humanizovaný V_L se liguje do expresního vektoru pCN, fragmentovaného s EcoRI Narl, spolu se signální sekvencí (EcoRI EcoV). Expresní vektor poskytuje humanizovaný kappa konstantní úsek.

Příklad 6

Způsob čištění a termodynamika - humanizovaný MAb

Čištění CHO exprimovaného chimérického a humanizovaného 3B9 se může dosáhnout běžnou proteinovou A (nebo G) afínitní chromatografíí, s následující výměnou iontů a chromatografíí na molekulovém sítě. Podobný způsob byl úspěšně použit pro čištění jiných MAbs (například na respirační syncyliární virus a malariové cirkumsporoziátové antigeny) na čistotu vyšší než 95%.

Afinita a podrobná termodynamika IL4 vázajícího se na humanizovanou MAb 3B9 a myší 3B9 (příklad 1) se stanovuje titrační mikrokalorimetrií. Tato metoda spočívá v měření vazebných reakcí na základě jejich vnitřního tepelného zabarvení reakce (viz například Wiseman a kol., Anal. Biochem. 179, 131-137 /1989/). Bylo zjištěno, že afinita obou MAbs je příliš malá pro měření přímo za teploty místnosti. Tak se provádí tento termodynamický postup:

i) afinita se měří za teploty 60 °C, která je dostatečně malá, aby byla měřena přímo, a ii) tepelná závislost vazebné entalpie se měří za teploty od 30 do 60 °C.

Dohromady tyto parametry dovolují vypočítat afinitu v širokém rozmezí teplot, za použití GibbsHelmholzovy rovnice.

Souhrn IL4 vazebných termodynamických hodnot humanizovaných a myších 3B9 protilátek je uveden v tabulce 1. Na základě změn volné energie, entalpie, entropie a tepelné kapacity dvou MAbs jsou termodynamické hodnoty nerozeznatelné.

Tabulka 1

Termodynamické hodnoty hIL4 vázajícího se k humanizované 3B9 a myší 3B9 při hodnotě pH 7,4, se 150 mM chloridu sodného, za teploty 25 °C

MAb	Kd pikomol	|G kJ/ mol IL4	|H kJ/ mol IL4	kS mol IL4	J/mol IL4/K
humanizovaný 3B9	11	-56,9+2,5	-91,2+8,4	34,3+8,8	-2428+670
myší 3B9	19	-55,7+2,5	-85,2+4,2	30,1+5,0	-2763+837

Afinity IL-4 humanizovaného 3B9 a myšího 3B9 se měří čtyřikrát a zdvojeně.

Příklad 7

Způsob výroby a charakterizace kiysího MAb

MAb 6A1, zvolená pro vysokou afínitní vazebnost, je odvozena od imunizované krysy, za použití stejného postupu imunizace, jako je popsán v příkladu 1 pro myš. 6A1 je vybrán zhybridomů (jmenovitě hybridomu 3426A11C1B9), připraveného z krys imunizovaných lidským IL4.

-23CZ 295928 B6

Hodnota K_d pro 6A1 se vypočítá jak popsal Beatty a kol., v J. Immunol. Methods 100, 173-179 /1987/ a odpovídá 2 x 10'¹⁰ M.

Hybridom 3426A11C1B9 byl deponován dne 6. října 1993 vECACC (European Collection of Aminal Cell Cultures, Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology & Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG, Spojené království, pod depozitním číslem 93 100 620 a byl přijat jako deponovaný vzorek z důvodů patentování podle Budapešťské úmluvy z roku 1977, nařizující ukládání mikroorganizmů pro účely patentového řízení.

Příklad 8

Biologická aktivita MAbs: 3B9 (humanizovaný), 3B9 (myší) a 6A1

Provedly se dále uvedené testy za použití postupů popsaných v další části.

A. Vázání glykosylovaného rhIL4

Výše uvedené protilátky se uvedou do styku s neglykosylovaným rekombinantním lidským IL4 (rhIL4), který je produkován v E. coli. Protože přirozený lidský IL4 je glykosylován, je důležité potvrdit vázání na materiál secemovaný savčí buněčnou linií. 3B9 se váže rovněž tak dobře jak ke glykosylovanému, tak k neglykosylovanému lidskému rekombinantnímu IL4 a není proto zaměřen na epitop, který by byl maskován na přirozeném lidském IL4.

B. Inhibice IL4 vázání na receptor

Schopnost 3B9 inhibovat vázání IL4 na svůj receptor se studuje za použití ¹²⁵I-rhIL4 vázaného k buněčné linii gibona, MLA (ATCC TIB201), která nese přibližně 6000 receptorů na buňku. MLA buňky se inkubují se ¹²⁵I-IL4 za teploty 37 °C po dobu 30 minut. Zachycení radioaktivity se stanoví v τ-čítači po oddělení buněk s vázaným ^I25I-IL4 pomocí odstřeďování, při použití olejového gradientu. Nespecifické vázání se stanoví inkubací v přítomnosti stonásobného molámího přebytku neznačeného IL4 (Park a kol., J. Exp. Med. 166, 476-488 /1987/). Hodnota IC₅₀ pro neznačený IL4 při tomto testu je 22 pM, pokud množství (přidaného) IL4 činí 83 pM. Pro intaktní myší (IgG) 3B9 hodnota IC₅o odpovídá 63 pM a 93 pM pro fragment Fab. Při jiné koncentraci IL4 (218 pM) testem stanovené množství myší (IgG) 3B9 činí 109 pM.

C. Způsob inhibice proliferace lymfocytů

Za použití metody, kterou popsal Spits a kol. v J. Immunol. 139, 1142-1147 /1987/ se periferní krevní lymfocyty člověka inkubují po dobu 3 dnů s fytohemagglutininem, T buněčným mitogenem, k regulaci IL4 receptoru. Výsledné buňky se potom dále stimulují po dobu tří dnů IL4 receptorem. Proliferace se měří inkorporací ³H thymidinu. B buněčná proliferace se měří testem, který popsal Callard a kol. vLymphokines and Interferones, A Practical Approach, kap. 19, str. 345, modifikovaným jak je popsáno dále. Čištěné lidské tonsilámí B buňky se stimulují po dobu 3 dnů s IL4 imobilizovaným anti-IgM. Proliferace se měří inkorporací ³H thymidinu.

3B9 (myší) inhibuje ³H-thymidinovou inkorporací periferními krevními T lymfocyty člověka stimulovanými 133 pM IL4 a lidskými tonsilámími B lymfocyty stimulovanými 167 pM IL4. IL2 stimulované T lymfocyty nepůsobí. Hodnota IC₅₀ pro inhibici T buněčné proliferace činí 30 pM a pro B buněčnou proliferaci činí 103 pM. Odpovídající hodnoty pro Fab fragment 3B9 (myší) jsou 108 a 393 pM.

-24CZ 295928 B6

D. Způsob inhibice CD23 indukce

CD23 je nízko afinitní receptor pro IgE (FcERII) a je indukován na membráně zbývajících B lymfocytů nízkými koncentracemi IL4 jako nezbytně nutným předpokladem pro produkci IgE. Čištěné lidské tonsilární B buňky se stimulují po dobu 2 dnů s IL4. Procento buněk exprimujících CD23 receptor se stanoví průtokovou cytometrií (Defrance a kol., J. Exp. Med. 165, 1459-1467 /1987/). 3B9 (myší) inhibuje CD23 expresi lidských tonsilárních B lymfocytů stimulovanou 8,3 pM IL4 s hodnotou IC₅₀ odpovídající 136 pM.

E. Způsob inhibice IgE sekrece

Na rozdíl od jiných testů, kde se IL4 přidává při koncentracích EC₅₀ (Pere a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 85, 6880-6884 /1988/), IgE sekrece se zjišťuje v přítomnosti IL4 v koncentracích poskytujících maximální sekreci, za účelem snížení inherentní variability v tomto systému. T buněčná proliferace se stanoví jak je uvedeno dále. Periferní krevní lymfocyty člověka se inkubují s IL4 po dobu mezi 10 a 18 dny, výhodně 12 dnů. Koncentrace IgE v supematantu kultury se stanoví pomocí ELISA.

IgE sekrece se inhibuje 3B9 (myší) a Fab fragmentem 3B9 v přítomnosti 1,7 nM IL4, co poskytne hodnoty IC₅₀ odpovídající 1,9 a 5,0 nM. Experiment se opakuje za použití nižší koncentrace IL4, která činí 667 pM, co snižuje hodnotu IC₅₀ na 0,65 mM pro 3B9 (myší). Molámí poměr protilátky (IgG) k IL4 zůstává nezměněn (1:1) ve zkoušených koncentračních rozmezích.

F. Shrnutí a interpretace hodnot

Molární poměry IL4 k různým MAbs, vyžadované pro 50% inhibici funkce při biologických testech, jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Komparativní aktivity MAbs 3B9, 6A1 a humanizovaného 3B9 (varianty IgGi a IgG₄) při biologických testech závislých na IL4

Test	IC50 (pM) (rozmezí),.
Myší 3B9	Myší 3B9 (Fab)	Krysí 6A1	Humanizovaný 3B9 IgGl IgG4*
RBA	63 (17-109)2	93	>50 000
T buňka	30 (10-—40)4	108	87	44 (30-56)3 40
B buňka	103 (79-120)3	393	187	47 (10-80)3 79
CD23	136 (53-272)4	216	80	333
indukce
IgE	658 (370-1070)6		623 (412—833)2	54 (35-83)3
syntéza		1170		406

n = počet provedených oddělených testů * IgG] a IgG₄ varianty se testují v odlišnou dobu

Při všech testech, s výjimkou sekrece IgE, se IL4 přidává v koncentraci přibližně ED₅₀. Molámí poměry protilátky k IL4 vyžadované pro 50% inhibici jsou podobné pro lidský 3B9, myší 3B9 a 6A1 ve dvou testech proliferace lymfocytů, ale vyšší pro humanizovaný 3B9 při testu indukce CD23, co je zvláště citlivý test zřejmě vyžadující velmi nízkou náplň receptoru (přibližně 5 %)

-25CZ 295928 B6 (Kruše a kol., EMBO J. 12, 5121 /1993/), a jak je zřejmé z výsledků dosažených smyší 3B9, působí vnitřní změnu testu.

Porovnání aktivit krysí 6A1 a myší 3B9 dokládá podobný profil funkčních účinností, ale neočekávané selhání 6A1 při plné inhibici vázání radioaktivně jodovaného IL4 na své receptory. Za radioaktivně jodovaný IL4 používaný při testu vázání receptorů se má považovat jodovaný tyrosin přístupný na zbytku 124. Pokud se porovná schopnost 6A1 inhibovat expresi CD23 indukovanou buď neznačeným nebo jodovaným IL4, zjistí se, že inhibice je méně účinná oproti jodovanému ligandu. Tyto výsledky ukazují, že 6A1 se váže k IL4 v úseku tyrosinu 124, ale toto vázání není specifické.

Tak poslední hodnoty ukazují, že 6A1 je neutralizující protilátka o vysoké afinitě, vázající se k velmi odlišným úsekům IL4 spíše než 3B9.

Příklad 9

Farmakokinetické údaje

Farmakokinetika humanizované 3B9 se stanovuje u samčích krys kmene Sprague Dawley. Humanizovaná 3B9 se podá čtyřem zvířatům jako i.v. bolus v dávce 1 mg/kg, přičemž ve vzorkování krve se pokračuje po dobu 5 týdnů po dávce. Koncentrace humanizované 3B9 v plazmě se stanovuje za použití IL4/anti-lidského IgG sendviče ELISA určeného k potvrzení nejen přítomnosti cirkulujícího lidského IgG, ale také schopnosti vázat se k rekombinantnímu lidskému IL4.

Výsledky z této studie jsou shrnuty do tabulky 3.

Tabulka 3

Farmakokinetika humanizované 3B9 v samčích krysách kmene Sprague-Dawley (dávka 1 mg/kg, i.v. bolus)

CLP (ml/h/kg)

krysa 1	0,442
krysa 2	0,655
krysa 3	0,555
krysa 4	0,447
průměr	0,525
směrodatná odchylka	0,101

Zkratka farmakokinetického parametru:

Clp znamená zdánlivá clearance plazmy

Údaje ukazují, že interanimální variabilita je relativně malá a vymizení humanizované 3B9 z plazmy se zdá být dvojfázové. Zdánlivá clearance plazmy je nízká (0,5 ml/h/kg). Poločas života se zdá být 11 dnů. Tak farmakokinetické charakteristiky humanizované 3B9 odvozené od CHO buněk jsou konzistentní s jinými humanizovanými monoklonálními protilátkami u krys. Dlouhý poločas života humanizované 3B9 u krysy při cirkulaci také naznačuje, že když se podává humanizovaná 3B9 člověku, je pravděpodobně účinná během prodlouženého časového období.

Do výše uvedeného popisu je zahrnuta řada modifikací a variací a očekává se, že budou zřejmé odborníkovi v oboru. Například úseky lidské základní struktury nebo jejich modifikace, jiné než jsou výše popsané příklady protilátek, se mohou použít při konstrukci humanizovaných protilá-26CZ 295928 B6 tek. Takové modifikace a změny prostředků a způsobů podle tohoto vynálezu se pokládají za zahrnuté do rozsahu připojených patentových nároků.

Seznam sekvencí

1) Obecné informace

i) Přihlašovatel:

Stephen D. Holmes,

Mitchell S. Gross,

Daniel R. Sylvester ii) Název vynálezu: Rekombinantní IL4 protilátky použitelné pro ošetřování chorob zprostředkovaných IL4 iii) Počet sekvencí: 58 iv) Adresa pro korespondenci:

a) Adresát: SmithKlíne Beechem Corporation

b) Ulice: Corporate Intellectual Property,

UW2220 - 709 Swedeland Rd.

c) Město: King of Purssia

d) Stát: PA

e) Země: USA

f) PSČ (ZIP): 19406-2799

v) Počítačová čtecí forma:

a) Typ média: Floppy disk

b) Počítač: IBM PC kompatibilní

c) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS

d) Software: Patentln Release # 1.0,

Verze# 1,25 ví) Prioritní údaje přihlášky:

a) Číslo přihlášky: US 08/117 366

b) Datum podání: 7. září 1993

c) Zatřídění:

a) Číslo přihlášky: US 08/136 783

b) Datum podání: 14. října 1993

c) Zatřídění:

viii) Informace o zástupci:

a) Jméno: Jeffrey A. Sutton

b) Registrační číslo: 34 028

c) Číslo spisu: P50186-2

-27CZ 295928 B6 ix) Telekomunikační informace:

a) Telefon: (215)270 50 24

b) Telefax: (215)270 50 90

2) Informace pro SEQ ID č. 1:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 396 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..396

-28CZ 295928 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 1:

ATG Met: 1

GAG ACA GAC

ACA ATC CTG CTA

TGG GTG CTG CTG CTC TGG

GTT Val 15

CCA Pro

48

Glu

Thr Asp

Thr 5

Ile

Leu Leu

Trp

Val 10

Leu

Leu

Leu

Trp

GGC

TCC

ACT

GGT

GAC

ATT

GTG

CTG

ACC

CAA

TCT

CCA

GCT

TTG

GCT

96

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

20

25

30

GTG

TCT

CTA

GGG

CAG

AGG

GCC

ACC

ATC

TCC

TGC

AAG

GCC

AGC

CAA

AGT

144

Val

Ser

Leu

Gly

Gin

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

GTT

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

AGT

TAT

AAC

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCA

192

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyx

Hec

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

50

55

60

GGA

CAG

CCA

CCC

AAA

CTC

CTC

ATC

TAT

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

240

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

65

70

75

80

GGG

ATC

CCA

GCC

AGG

TTT

AGT

GGC

AGT

TCT

GGG

ACA

GAC

TTC

ACC

288

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

85

90

95

CTC

AAC

ATC

CAT

CCT

GTG

GAG

GAG

GAG

GAT

GCT

GCA

ACC

TAT

TAC

TGT

336

Leu

Asn

Ile

ais

Pro

val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tvr

Tyr

Cys

100

105

110

CAG

CAA

AGT

AAT

GAG

GAT

CCT

CCG

ACG

TTC

GGT

GGA

GGC

ACC

AAG

CTG

384

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

115 120 125

GAA ATC AAA CGG

396

Glu Ile Lys Arg

130

-29CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 2:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 132 aminokyselin

b) Typ: aminokyseliny

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 2:

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1

5

10

15

Gly

Ser

Thr

Gly

Asp

Ile

Val

Leu

Thr

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Leu

Ala

20

25

30

val

Ser

Leu

Gly

Gin

Arg

Ala

Thr

Ile

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

35

40

45

Val

Asp

Tyr

Asp

Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

50

55

60

Gly

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

65

70

75

30

Gly

Ile

Pro

Ala

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

85

90

95

Leu

Asn

Ile

His

Pro

Val

Glu

Glu

Glu

Asp

Ala

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

100

105

110

Gin

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Leu

115

120

125

Glu Ile Lys Arg

130

2) Informace pro SEQ ID č. 3:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 483 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA

-30CZ 295928 B6 ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 64..483 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 3:

GAATTCGCGG CCGCTATGCA GGGACAATCA GCAGCAGCAA TGAGGAAGTA AGCCTGTGCA

GAT	ATG	AAC	AGG	CTT ACT	TCC	TCA	TTG
	Met	Asn	Arg	Leu Thr	Ser	Ser	Leu
	1			5
TAT	GTC	CCG	TCC	CAG GTT	ACT	Leu	AAA
Tyr	Val	Leu	Ser	Gin val	Thr	Leu	Lys
				20
CAG	CCC	TCC	CAG	ACC CTC	AGT	CTG	ACT
Gin	Pro	Ser	Gin	Thr Leu	Ser	Leu	Thr
			35				40
CTG	AGC	ACT	TCT	GGT ATG	GGT	GTG	AGC
Leu	Ser	Thr	Ser	Gly Met	Gly	Val	Ser
		so				55
AAG	GGT	CTG	GAG	TGG- CTG	GCA	CAC	ATT
Lys	Gly	Leu	Glu	Trp Leu	Ala	His	Ile
	65				70
TAT	AAC	CCA	TCC	CTG AAG	AGC	CGG	CTC
Tyr	Asn	Pro	Ser	Leu Lys	Ser	Arg	Leu
80				85
AGC	AAC	CAG	GTA	TTC CTC	AAG	ATC	ACC
Ser	Asn	Gin	Val	Phe Leu	Lys	Ile	Thr
				100
GCC	ACA	TAC	TAC	TGT GCT	CGA	AGA	GAG
Ala	Thr	Tyr	Tyr	Cys Ala	Arg	Arg	Glu
			115				120
GAT'	GTC	TGG	GGC.	GCA GGG	ACC	ACG	GTC
Asp Val	Trp	Gly.	Ala Gly	Thr	Thr	Val
		130				135

CTG CTG CCG ATT GTC CCT GCA108

Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala

1015

GAG TCT GGC CCT GGG ATA TTG156

Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu

2530

TGT TCT TTC TCT GGG TTT TCA204

Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser

TGG ATT CGT CAG CCT TCA GGA252

Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gly

TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC300

Tyt Trp Asp Asp Asp Lys Arg

ACA ATC TCC AAG GAT ACC TCC348

Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser

9095

AGT GTG GAC ACT GCA GAT ACT396

Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr

105110

ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC444

Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe

125

ACC GTC TCC TCA483

Thr Val Ser Ser

140

-31 CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 4:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 140 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein o

xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 4:

Met Asn 1

Arg

Leu Thr Ser Ser Leu Leu Leu

Leu

Ile Val Pro Ala 15

Tyr

5

10

Val

Leu

Ser

Gin

Val

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly

ile

Leu

Gin

20

2S

30

Pro. Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

Leu

35

40

45

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

val

Ser

Trp

Zle

Arg

Gin

Pro

Ser

Gly

Lys

50

S5

60

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

Ile

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg

Tyr

65

70

75

80

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

Ser

85

90

95

Asn

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Ile

Thr

Ser

Val

Asp

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

100

105

110

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

Asp

115

120

125

Val

Trp

Gly

Ala

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

135

140

2) Informace pro SEQ ID č. 5:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 60 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá

-32CZ 295928 B6 ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..60 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 5:

ATG GIG TTG

CAG Gin

ACC CAG GTC TTC ATT TCT CTG TTG CTC TGG ATC TCT

48

Met Val 1

Leu

Thr Gin 5

val

Phe

Ile Ser 10

Leu

Leu

Leu Trp

Ile 15

Ser

GGT

GCC

TAC

GGG

50

Gly

Ala

Tyr

Gly

20

2) Informace pro SEQ ID č. 6:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 20 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 6:

Hec Val Leu Gin Thr Gin Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 15 10 15

Gly Ala Tyr Gly

2) Informace pro SEQ ID č. 7:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 57 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..57

-33CZ 295928 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 7:

ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT 43

Met Gly Trp Ser Cys lle lle Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 15 10 15

GTC CAC TCC

Val His Ser

2) Informace pro SEQ ID č. 8:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 19 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 8:

Met Gly Trp Ser Cys lle Xie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

5 io 15

Val His Ser

2) Informace pro SEQ ID č. 9:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 423 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá

-34CZ 295928 B6 ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..423

xi) '

Popis sekvence: SEQ ID č. 9

1;

ATG

GTG

TTG

CAG

ACC

CAG

GTC

TTC

ATT

TCT

CTG

TTG

CTC

TGG ATC

TCT

48

Met

val

Leu

Gin

Thr

Gin

Val

Phe

Ile

Ser

Leu

Leu

Leu

Trp Ile

Ser

L

5

10

15

GGT

GCC

TAC

GGG

CAG

GTT

ACC

CTG

AAA

GAG

TCT

GGC

CCT

GGG ATA

TTG

96

Gly

Ala

Tyr

Gly

Gin

Val

Thr

Leu

Lys

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly Ile

Leu

20

25

30

CAG

CCC

TCC

CAG

ACC

CTC

AGT

CTG

ACT

TGT

TCT

TTC

TCT

GGG TTT

TCA

144

Gin

Pro

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser

Gly Phe

Ser

35

40

45

CTG

AGC

ACT

TCT

'GGT

ATG

GGT

GTG

AGC

TGG

ATT

CGT

CAG

CCT TCA

GGA

192

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro Ser

Gly

50

55

60

AAG

GGT

CTG

GAG

TGG

CTG

GCA

CAC

ATT

TAC

TGG

GAT

GAT

GAC AAG

; CGC

240

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

Ile

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp Lys

Arg

65

70

75

80

TAT

AAC

CCA

TCC

CTG

AAG

AGC

CGG

CTC

ACA

ATC

TCC

AAG

GAT ACC

TCC

238

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp Thr

Ser

85

SO

95

AGC

AAC

CAG

GTA

TTC

CTC

AAG

ATC

ACC

AGT

GTG

GAC

ACT

GCA GAT

ACT

336

Ser

Asn

Gin

Val

Phe

Leu

Lys

Ile

Thr

Ser

Val

Asp

Thr

Ala Asp

Thr

100

105

110

GCC

ACA

TAC

TAC

TGT

GCT

CGA

AGA

GAG

ACT

GTG

TTC

TAC

TGG TAC

TTC

384

Ala

Thr

Tyr

Tyr Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp Tyr

Phe

115

120

125

GAT

GTC

TGG

GGC

GCA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

423

Asp

val

Trp

Gly Ala

Gly

Thr

Thr

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

135

140

35CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 10:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 141 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 10:

Met 1

Val

Leu

Gin

Thr 5

Gin

Val

Phe

Ile

Ser 10

Leu

Leu

Leu

Ile 15

Ser

Gly

Ala

Tyr

Gly 20

Gin

Val

Thr

Leu

Lys 25

Glu

Ser

Gly

Pro

Gly 30

Ile

Leu

Gin

Pro

Ser 35

Gin

Thr

Leu

Ser

Leu 40

Thr

Cys

Ser

Phe

Ser 45

Gly

Phe

Ser

Leu

Ser 50

Thr

Ser

Gly

Met

Gly 55

Val

Ser

Trp

Ile

Arg 60

Gin

Pro

Ser

Gly

Lys 65

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu 70

Ala

His

ile

Tyr

Trp 75

Asp

Asp

ASp

Lys

Arg 80

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu 85

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr 90

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr 95

Ser

Ser

Asn

Gin

Val 100

Phe

Leu

Lys

Ile

Thr 105

Ser

Val

Asp

Thr

Ala 110

Asp

Thr

Ala

Thr

Tyr 115

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg 120

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr 125

Trp

Tyr

Phe

Asp

Val 130

Trp

Gly

Ala

Gly

Thr 135

Thr

Val

Thr

Val

Ser 140

Ser

2) Informace pro SEQ ID č. 11:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 423 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA

-36CZ 295928 B6 ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..423 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 11:

ATG GTG TTG CAG ACC

CAG GTC

TTC Phe

ATT lle

TCT CTG

TTG CTC

TGG Trp

ATC lle 15

TCT Ser

48

Met 1

Val Leu

Gin Thr 5

Gin

Val

Ser 10

Leu

Leu

Leu

GGT

GCC

TAC

GGG

CAG

GTT

ACC

CTG

CGT

GAA

TCC

GGT

CCG

GCA

CTA

GTT

96

Gly

Ala

Tyr

Gly

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

val

20

25

30

AAA

CCG

ACC

CAG

ACC

CTG

ACG

TTA

ACC

TGC

ACC

TTC

TCC

GGT

TTC

TCC

144

Lys

Pro

Thr

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Sex

Gly

Phe

Ser

35

40

45

CTG

TCG

ACC

TCC

GGT

ATG

GGT

GTT

TCC

TGG

ATC

CGT

CAG

CCG

CCG

GGT

192

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

Val

Ser

Trp

lle

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

50

55

60

AAA

GGT

CTA

GAA

TGG

CTG

GCT

CAC

ATC

TAC

TGG

GAC

GAC

GAC

AAA

CGT

240

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

His

lle

Tyr

Trp

Asp

Asp

Asp

Lys

Arg

55

70

75

80

TAC

AAC

CCG

AGC

CTG

AAA

TCC

CGT

CTG

ACG

ATA

TCC

AAA

GAC

ACC

TCC

288

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

lle

Ser

Lvs

Asp

Thr

Ser

85

90

95

CGT

AAC

CAG

GTT

GTT

CTG

ACC

ATG

ACT

AAC

ATG

GAC

CCG

GTT

GAC

ACC

336

Arg

Asn

Gin

Val

Val

Leu

Thr

Met

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Val

Asp

Thr

ιαο

105

110

GCT

ACC

TAC

TAC

TGC

GCT

CGA

CGC

GAA

ACC

GTT

TTC

TAC

TGG

TAC

TTC

384

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg

Arg

Glu

Thr

val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

115

120

125

GAC

GTT

TGG

GGT

CGT

GGT

ACC

CCA

GTT

ACC

GTG

AGC

TCA

423

Asp

Val

Trp

Gly

Arg

Gly

Thr

Pro

val

Thr

Val

Ser

Ser

130

135

140

-37CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 12:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 141 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 12:

Mee Val Leu 1

Gin

Thr Gin Val Phe Ile Ser

Leu Leu Leu Trp Ile 15

Ser

5

10

Gly

Ala

Tyr

Gly

Gin

Val

Thr

Leu

Arg

Glu

Ser

Gly

Pro

Ala

Leu

Val

20

25

30

Lys

Pro

Thr

Gin

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Cys

Thr

Phe

Ser

Gly

Phe

Ser

35

40

45

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Met

Gly

Val

Ser

Trp

Ile

Arg

Gin

Pro

Pro

Gly

50

55

60

Lys

Gly

Leu

Glu

Trp

Leu

Ala

Kls

Ile

Tyr

Trp

ASp

Asp

Asp

Lys

Arg

65

70

75

80

Tyr

Asn

Pro

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Leu

Thr

Ile

Ser

Lys

Asp

Thr

Ser

85

90

95

Arg

Asn

Gin

Val

Val

Leu

Thr

Met

Thr

Asn

Met

Asp

Pro

Val

Asp

Thr

100

105

110

Ala

Thr

Tyr

Tyr

Cys

Ala

Arg Arg

Glu

Thr

Val

Phe

Tyr

Trp

Tyr

Phe

115

120

125

Asp

val

Trp

Gly

Arg

Gly

Thr

Pro

Val

Thr

Val

Ser

Ser

130

135

140

-38CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 13:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 393 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..393 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 13:

ATG Met 1

GGA IGG AGC TGT

ATC ATC CTC TTC

TTG Leu 10

GTA GCA ACA

GCT ACA

GGT Gly

48

Gly

Trp

Ser

Cys 5

Ile Ile

Leu Phe

Val

Ala

Thr

Ala

Thr 15

GTC

CAC

TCC

GAT

ATC

GTG

ATG

ACC

CAG

TCT

CCA

GAC

TCG

CTA

GCT

GTG

96

val

His

Ser

Asp

Ile

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Ser

Leu

Ala

Val

20

25

30

tct

CTG

GGC

GAG

AGG

GCC

ACC

ATC

AAC

TGC

AAG

GCC

TCC

CAA

AGT

GTT

144

Ser

Leu

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

35

40

45

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAT

CAG

CAG

AAA

CCC

GGG

192

Asp

Tyr

Asp

Gly Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

50

55

60

CAG

CCT

CCT

AAG

TTG

CTC

ATT

TAC

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

GGG

240

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

65

70

75

80

GTA

CCT

GAC

CGA

TTC

AGT

GGC

AGC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

288

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

85

90

95

ACC

ATC

AGC

AGC

CTG

CAG

GCT

GAA

GAT

GTG

GCA

GTA

TAC

TAC

TGT

CAG

336

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

100

105

110

CAA

AGT

AAT

GAG

GAT

CCT

CCG

AGG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAG

GTG

GAG

384

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Arg

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

lis 120 125

ATC AAA CGT

Ile Lys Arg

130

393

-39CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 14:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 131 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 14:

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

Ile

Leu

Phe

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

1

5

10

15

Val

His

Ser

Asp

Ile

val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Ser

Leu

Ala

Val

20

25

30

Ser

Leu

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

35

40

45

Asp

Tyr Asp Gly

Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

50

55

60

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

65

70

75

80

val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

85

90

95

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

1C0

105

110

Gin

Ser

Asn

Glu

ASp

Pro

Pro

Arg

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

115

120

125

Ile Lys Arg

130

2) Informace pro SEQ ID č. 15:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 45 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..45 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 15:

AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn

5 10 15

2) Informace pro SEQ ID č. 16:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 15 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 16:

Lys Ala Ser Gin Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15

2) Informace pro SEQ ID č. 17:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 21 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..21

-41 CZ 295928 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 17:

GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

5

2) Informace pro SEQ ID č. 18:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 7 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 18:

Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

5

2) Informace pro SEQ ID č. 19:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 27 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..27 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 19:

CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr

5

2) Informace pro SEQ ID č. 20:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 9 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein

-42CZ 295928 B6 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 20:

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr

5

2) Informace pro SEQ ID č. 21 :

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 21 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..21 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 21:

ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC

Thr Ser Gly Met Gly Val Ser

5

2) Informace pro SEQ ID č. 22:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 7 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 22:

Thr Ser Gly Met Gly Val Ser

5

2) Informace pro SEQ ED č. 23:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 48 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá

-43 CZ 295928 B6 ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..48 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 23:

CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC 48

His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

5 10 15

2) Informace pro SEQ ID č. 24:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 16 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 24:

His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

5 10 15

2) Informace pro SEQ ID č. 25:
i)	Charakteristiky sekvence:
	a) Délka: 33 párů bází b) Typ: nukleová kyselina c) Řetězec: dvojitý d) Topologie: neznámá
ii)	Typ molekuly: cDNA
ix)	Rysy:
	a) Jméno/klíč: CDS b) Lokace: 1..33
xi)	Popis sekvence: SEQ ID č. 25:
AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC	GAT GTC	33
Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe	Asp Val
	1 5	10

-44CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 26:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 11 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 26:

Arg Glu Thr Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 15 10

2) Informace pro SEQ ID č. 27:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 27 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..27 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 27:

CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg

5

2) Informace pro SEQ ID č. 28:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 9 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 28:

Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Arg

5

-45CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 29:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 36 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 29:

CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTJGAC AATGGG

2) Informace pro SEQ ID č. 30:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 29 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 30:

GTACATATGC AAGGCTTACA ACCACAATC 29

2) Informace pro SEQ ID č. 31:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 117 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 31:

GGICACCCTG CGTGAATCCG GTCCGGCACT AGaTAAACCG ACCCAGACCG 1GACGTTAAC

CttGCACCTTC TCCGGTTTCT CCCTGTCGAC CTCGGGTATG GGTGTCŤC07 GGATCCG

117

-46CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 32:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 120 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 32:

TCAGCCGCCG GGTAAAGGTC TAGAATGGCT GGCTCACATC TACTGGGACG ACGACAAACG 60

TTACAACCCG AGCCTGAAAT CCCGTCTGAC GATATCCAAA GACACCTCCC GTAACCAGGT 120

2) Informace pro SEQ ID č. 33:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 120 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 33:

TGTTCTGACC ATGGACCCGG TTGACACCGC TACGTACTAC TGCGCTCGTC GCGAAACCGT 50

TTTCTACTGG TACT2CGACG TTTGGGGTCG TGGTACGCCA GTTACCG2GA GC2CCCAACC 120

2) Informace pro SEQ ID č. 34:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 25 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID ě. 34:

ACCCGGCGGC TGACGGATCC AGGAA 25

2) Informace pro SEQ ID č. 35:

-47CZ 295928 B6

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 24 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 35:

ATGGTCAGAA CAACCTGGTT ACGG

2) Informace pro SEQ ID č. 36:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 25 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 36:

TTCGGGTTAC CCTGCGTGAA TCCGG 25

2) Informace pro SEQ ID č. 37:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 21 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 37:

CCAACCCTCG AGTGCCATTG A

2) Informace pro SEQ ID č. 38:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 43 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá

-48CZ 295928 B6 ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 38:

CTAGCTGTGT CTCTGGGCGA GAGGGCCACC ATCAACTGCA AGG

2) Informace pro SEQ ID č. 39:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 39 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 39:

CCTTGCAGTT GATGGTGGCC CTCTCGCCCA GAGACACAG

2) Informace pro SEQ ID č. 40:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 67 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 40:

TCGAGAGGCC TCCCAAAGTG TTGATTATGA TGGTGATAGT TATATGAACT GGTATCAGCA

GAAACCC

2) Informace pro SEQ ID č. 41:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 63 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 41:

-49CZ 295928 B6

GGGTTTCTGC TGATACCAGT TCATATAACT ATCACCATCA TAATCAACAC TTTGGGAGGC 60

CTC

2) Informace pro SEQ ID č. 42:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 51 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 42:

ATACTACTGT CAGCAAAGTA ATGAGGATCC TCCGAGGTTC GGCGGAGGGA C

2) Informace pro SEQ ID č. 43:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 53 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 43:

CTTGGTCCCT CCGCCGAACC TCGGAGGATC CTCATTACTT TGCTGACAGT AGT

2) Informace pro SEQ ID č. 44:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 55 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 44:

GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACGCT GCATCCAATC tagaatctgg ggtac

S5

-50CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 45:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 51 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 45:

CCCAGATTCT AGATTGGATG CAGCGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C 51

2) Informace pro SEQ ID č. 46:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 83 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 46:

AATTCGAGGA CGCCAGCAAC ATGGTGTTGC AGACCCAGGT CTTCATTTCT CTGTTGCTCT 60

GGATCTCTGG TGCCTACGGG CAG a 3

2) Informace pro SEQ ID č. 47:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 84 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 47:

GTAACCTGCC CGTAGGCACC AGAGATCCAG AGCAACAGAG AAATGAAGAC CTGGGTCTGC 60

AACACCATGT TGCTGGCGTC CTCG 84

-51 CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 48:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 20 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 48:

CAGGTTACCC TGAAAGAGTC

2) Informace pro SEQ ID č. 49:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 18 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 49:

GAAGTAGTCC TTGACCAG

2) Informace pro SEQ ID č. 50:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 31 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 50:

GTCACCGTCT CCTCAGCTAG CACCAAGGGG C ia

-52CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 51:

i) Charakteristiky sekvence;

a) Délka: 22 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 51:

CTTGGTGCTA GCTGAGGAGA CG

2) Informace pro SEQ ID č. 52:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 47 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jediný

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: DNA (genomická) xi) Popis sekvence: SEQ ID c. 52:

CATCTAGATG GCGCCGCCAC AGTACGTTTG ATCTCCAGCT TGGTCCC

2) Informace pro SEQ ID č. 53:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 45 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 53:

AAGGCCTCCC AAAGTGTTGA TTATGATGGT GATAGTTATA TGAAC

-53 CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 54:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 21 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 54:

ACCTCCGGTA TGGGTGTTTC C

2) Informace pro SEQ ID č. 55:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 48 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 55:

cacatctact GGGACGACGA CAAACGTTAC aacccgagcc tgaaatcc

2) Informace pro SEQ ID č. 56:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 33 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 56:

CGCGAAACCG TTTTCTACTG GTACTTCGAC GTT

2) Informace pro SEQ ID č. 57:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 393 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

-54CZ 295928 B6

c) Řetězec: dvojitý

d) Topologie: neznámá ii) Typ molekuly: cDNA ix) Rysy:

a) Jméno/klíč: CDS

b) Lokace: 1..393 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 57:

ATG Met 1

GGA TGG AGC

TGT ATC ATC CTC

TTC TTG GTA GCA ACA GCT

ACA Thr 15

GGT Gly

48

Gly

Trp Ser

Cys 5

ile

Ile Leu

Phe

Leu 10

Val

Ala

Thr

Ala

GTC

CAC

TCC

GAT

ATC

GTG

ATG

ACC

CAG

TCT

CCA

GAC

TCG

CTA

GCT

GTG

96

Val

His

Ser

Asp

Ile

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Ser

Leu

Ala

Val

20

25

30

tct

CTG

GGC

GAG

AGG

GCC

ACC ATC

AAC

TGC

AAG

GCC

TCC

CAA

AGT

GTT

144

Ser

Leu

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

35

40

45

GAT

TAT

GAT

GGT

GAT

AGT

TAT

ATG

AAC

TGG

TAT

CAG

CAG

AAA

CCC

GGG

192

Asp

Tyt Asp

Gly Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

50

55

60

CAG

CCT

CCT

AAG

<1 iU

CTC

ATT

TAC

GCT

GCA

TCC

AAT

CTA

GAA

TCT

GGG

240

Gin

Prc

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

65

70

75

80

GTA

CCT

GAC

CGA

TTC

AGT

GGC

AGC

GGG

TCT

GGG

ACA

GAT

TTC

ACT

CTC

288

Val

Pro

Asp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

85

90

95

ACC

ATC

AGC

AGC

CTG

CAG

GCT

GAA

GAT

GTG

GCA

GTA

TAC

TAC

TGT

CAG

336

Thr

Ila

Ser

Ser

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

Val

Tyr

Tyr

cys

Gin

100

105

110

CAA

AGT

AAT

GAG

GAT

CCT

CCG

ACG

TTC

GGC

GGA

GGG

ACC

AAA

GTG

GAG

384

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly Gly

Thr

Lys

Val

Glu

115 120 125

ATC AAA CGT

393

Ile Lys Arg

130

-55CZ 295928 B6

2) Informace pro SEQ ID č. 58:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 131 aminokyselin

b) Typ: aminokyselina

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: protein o

xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 58:

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile

Leu Phe Leu 10

Val

Ala Thr Ala

Thr Gly 15

1

5

val

His

Ser

Asp

Ile

Val

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Asp

Ser

Leu

Ala

Val

20

25

30

Sér

Leu

Gly

Glu

Arg

Ala

Thr

Ile

Asn

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Ser

Val

35

40

45

Asp

Tyr

Asp

Gly Asp

Ser

Tyr

Met

Asn

Trp

Tyr

Gin

Gin

Lys

Pro

Gly

50

55

60

Gin

Pro

Pro

Lys

Leu

Leu

Ile

Tyr

Ala

Ala

Ser

Asn

Leu

Glu

Ser

Gly

65

70

75

80

Val

Pro

ASp

Arg

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Leu

85

90

95

Thr

Ile

Ser

Ser

Leu

Gin

Ala

Glu

Asp

Val

Ala

val

Tyr

Tyr

Cys

Gin

100

105

110

Gin

Ser

Asn

Glu

Asp

Pro

Pro

Thr

Phe

Gly

Gly

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

115 120 125

Ile Lys Arg

130

-56CZ 295928 B6

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Fúzní protein s vazebnou specifickou pro lidský interleukmu-4 (IL4), který zahrnuje oblasti determinující komplementaritu těžkého řetězce (CDRs), které mají aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID č. 22, SEQ ID č. 24 nebo SEQ ID č. 26 a oblasti determinující komplementaritu lehkého řetězce (CDRs), které mají aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID č. 16, SEQ ID č. 18, SEQ ID č. 20 nebo SEQ ID č. 28.
2. 2. Fúzní protein podle nároku 1, který zahrnuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce znázorněnou v SEQ ID č. 12 a aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lehkého řetězce znázorněnou v SEQ ID č. 14.
3. 3. Oblast determinující komplementaritu (CDR) imunoglobulinového těžkého řetězce, jejíž aminokyselinová sekvence je vybrána ze souboru sestávajícího z

   a) ThrSerGlyMetGlyValSer: SEQ ID č. 22,

   b) HisIleTyrTrpAspAspAspLysArgTyrAsnProSerLeuLysSer: SEQ ID č. 24 a

   c) ArgGluThrValPheTyrTrpPheAspVal: SEQ ID č. 26.
4. 4. Oblast determinující komplementaritu (CDR) imunoglobulinového lehkého řetězce, jejíž aminokyselinová sekvence je vybrána ze souboru sestávajícího z

   a) LeuAlaSerGlnSerValAspTyrAspGlyAspSerTyrMetAsn: SEQ ID č. 16,

   b) AlaAlaSerAsnLeuGluSer: SEQ ID č. 18,

   c) GlnGlnSerAsnGluAspProProArg: SEQ ID č. 28 a

   d) GlnGlnSerAsnGluAspProProThr: SEQ ID č. 20.
5. 5. Molekula nukleové kyseliny kódující oblast determinující komplementaritu (CDR) ímunoglobulinového těžkého řetězce, jejíž sekvence je vybrána ze souboru sestávajícího z

   a) ACT TCT GGT ATG GGT GTG GTG AGC: SEQ ID č. 21,

   b) CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC: SEQ ID č. 23,

   c) AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC: SEQ ID č. 25,

   d) ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC: SEQ ID č. 54,

   e) CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC: SEQ ID č. 55 a

   f) CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT: SEQ ID č. 56.

   -57CZ 295928 B6
6. 6. Molekula nukleové kyseliny kódující oblast determinující komplementaritu (CDR) imunoglobulinového lehkého řetězce, jejíž sekvence je vybrána ze souboru sestávajícího z

   a) AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG ACC: SEQ ID č. 15,

   b) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC: SEQ ID č. 53,

   c) GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT: SEQ ID č. 17,

   d) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: SEQ ID č. 19 a

   e) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG: SEQ ID č. 27.
7. 7. Humanizovaná protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec podle nároku 1, kde tato protilátka je charakterizována disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 2 x 10“¹⁰ M pro lidský IL4, přičemž úseky základní struktury uvedeného těžkého řetězce a uvedeného lehkého řetězce jsou odvozeny od alespoň jedné zvolené lidské protilátky a aminokyselinové sekvence oblasti determinující komplementaritu každého z těchto řetězců jsou odvozené od nelidské neutralizující monoklonální protilátky specifické pro lidský IL4, která je charakterizována disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 2 x 10¹⁰ M pro lidský IL4.
8. 8. Protilátka podle nároku 7, která je účinně vázána k efektorovému prostředku zvolenému ze souboru sestávajícího z molekuly neproteinové nosné látky, polystyrenu a plastových kuliček.
9. 9. Chimérní protilátka obsahující těžký řetězec a lehký řetězec podle nároku 1, která je charakterizována disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 2 x 10¹⁰ M pro lidský IL4, přičemž aminokyselinové sekvence oblasti determinující komplementaritu každého řetězce jsou odvozené od nelidské neutralizující monoklonální protilátky specifické pro lidský IL4, která je charakterizována disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 2 x ΙΟ'¹⁰ M pro lidský IL4.
10. 10. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje fúzní protein podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelnou nosnou látku.
11. 11. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny, která je zvolena ze souboru sestávajícího ze

    a) sekvence nukleové kyseliny kódující fúzní protein mající aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID č. 14 nebo SEQ ID č. 12,

    b) sekvence nukleové kyseliny komplementární k a),

    c) sekvence nukleové kyseliny z 18 nebo více nukleotidů schopných hybridizace s a) nebo b) za přísných podmínek a

    d) fragmentu nebo analogu a), b) nebo c), který kóduje protein charakterizovaný specifícitou pro lidský interleukin-4, přičemž tato sekvence popřípadě obsahuje restrikční místo.

    -58CZ 295928 B6
12. 12. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny, která je zvolena ze souboru sestávajícího ze

    a) sekvence nukleové kyseliny kódující komplementaritu determinizující oblast (CDR), která má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze souboru zahrnujícího SEQ ID č. 22, SEQ ID Č. 24, SEQ ID č. 26, SEQ ID č. 16, SEQ ID č. 18, SEQ ID č. 20 nebo SEQ ID č. 28,

    b) sekvence nukleové kyseliny komplementární k a),

    c) sekvence nukleové kyseliny z 18 nebo více nukleotidů schopných hybridizace s a) nebo b) za přísných podmínek a

    d) fragmentu nebo analogu a), b) nebo c), který kóduje protein charakterizovaný specifícitou pro lidský interleukin-4.
13. 13. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny podle nároku 12, kde sekvence je vybrána ze souboru sekvencí kódujících oblast determinující komplementaritu těžkého řetězce, sestávajících z

    a) ACT TCT GGT ATG GGT GTG GTG AGC: SEQ ID č. 21,

    b) CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC: SEQ ID č. 23,

    c) AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC: SEQ ID č. 25,

    d) ACC TCC GGT ATG GGT GTT TCC: SEQ ID č. 54,

    e) CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC AAA CGT TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC: SEQ ID č. 55 a

    f) CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT: SEQ ID č. 56.
14. 14. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny podle nároku 12, kde sekvence je vybrána ze souboru sekvencí kódujících oblast determinující komplementaritu lehkého řetězce, sestávajících z

    a) AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG ACC: SEQ ID č. 15,

    b) AAG GCC TCC CAA AGT GTT GAT TAT GAT GGT GAT AGT TAT ATG AAC: SEQ ID č. 53,

    c) GCT GCA TCC AAT CTA GAA TCT: SEQ ID č. 17,

    d) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG ACG: SEQ ID č. 19 a

    e) CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCG AGG: SEQ ID č. 27.
15. 15. Rekombinantní plazmid, který zahrnuje sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 11.
16. 16. Rekombinantní plazmid, který zahrnuje sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 12.
17. 17. Hostitelská buňka, která je transfekována rekombinantním plazmidem podle nároku 15.
18. 18. Hostitelská buňka, která je transfekována rekombinantním plazmidem podle nároku 16.

    -59CZ 295928 B6
19. 19. Způsob přípravy humanizované protilátky specifické pro lidský interleukin-4, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci buněčné linie transfekované rekombinantním plazmidem podle nároku 15 za řízení vybraných regulačních sekvencí schopných řídit expresi v těchto buňkách.
20. 20. Způsob diagnózy alergií a jiných stavů spojených s nadměrnou produkcí imunoglobulinu E u člověka, vyznačující se tím, že se vzorek biologické kapaliny uvede do styku s monoklonální protilátkou podle nároku 1 proti lidskému IL4 s disociační konstantou nižší než 2,0x10“’° M, která má vysoký titr pro lidský interleukin-4, a stanoví se výskyt vazby mezi uvedenou monoklonální protilátkou a lidským interleukinem-4.
21. 21. Způsob vyšetření monoklonálních protilátek podle nároku 1 proti lidskému IL4 s disociační konstantou nižší než 2,0x10¹⁰ M, které mají vysoký titr pro lidský interleukin-4, vyznačující se tím, že se

    a) připraví hybridom buněčné linie charakterizované sekrecí monoklonální protilátky proti lidskému interleukinu-4 a

    b) tato hybridomová buněčná linie vyšetří aldehydem kondenzovaným na lidský interleukin-4 nebo s biotinylovaným lidským interleukinem-4.

    11 výkresů

    -60CZ 295928 B6

    Obr. 1

    Myši protilátka 3B9 s lehkým řetězcem Přirozená signální sekvence a variabilní úsek

    Nukleotidová sekvence SEQ ID č. 1

    Aminokyselinová sekvence SEQ ID č. 2

    ATG Met 1 GAG ACA GAC Asp ACA ATC Thr Ile 5 CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC 39 G1U Thr Leu Leu Trp Val 10 Leu Leu Leu TGG GTT CCA GGC TCC ACT GGT GAC ATT GTG CTG ACC CAA 78 Trn Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gin 15 20 25 TCT CCA GCT TCT TTG GCT GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC 117 Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala 30 35 ACC ATC TCC TGC AAG GCC AGC CAA AGT GTT GAT TAT GAT 156 Thr Ile Ser Cys Ly-a. -ňlá. Ser .Gin- Ser Val Asd Tyx. 40 45 50 GGT GAT AGT TAT ATG AAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA GGA 195 Glv Asp Ser Tyr Met ,Mn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly 55 60 65 CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT GCT GCA TCC AAT CTA 234 Gin Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ála. ňla Ser Asn Leu 70 75 GAA TCT GGG ATC CCA GCC AGG TTT AGT GGC AGT GGG TCT 273 Glu Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser so 85 90 GGG ACA GAC TTC ACC CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG 312 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu 95 100 GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT CAG CAA AGT AAT GAG 351 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Asn SJjJ 105 110 115 GAT CCT CCG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC 390 Asn -ΕΣ2- Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 120 125 130

    396

    AAA CGG Lys Arg

    -61 CZ 295928 B6

    Obr. 2

    Myší protilátka 3B9 s těžkým řetězcem

    Přirozená signální sekvence a variabilní úsek

    Nukleotidová sekvence SEQ ID č. 3

    Aminokyselinová sekvence SEQ ID č. 4

    GAATTCGCGG CCGCTATGCA GGGACAATCA GCAGCAGCAA4 0

    TGAGGAAGTA AGCCTGTGCA GAT ATG AAC AGC CTT ACT TCC81

    Met Asn Arg Leu Thr Ser

    TCA TTG CTG CTG CTG ATT GTC CCT GCA TAT GTC Val CTG Leu TCC Ser 120 Ser Leu Leu Leu 10 Leu Ile Val Pro Ala 15 Tyr CAG GTT ACT CTG AAA GAG TCT GGC CCT GGG ATA TTG CAG 159 Gin Val Thr Leu Lys Glu- Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gin 20 25 30 CCC TCC CAG ACC CTC AGT CTG ACT TGT TCT TTC TCT GGG 198 Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly 35 40 45 TTT TCA CTG AGC ACT TCT GGT ATG GGT GTG AGC TGG ATT 237 Phe Ser Leu Ser ins Ser Glv Met -G1V. va; Ser Trp Ile 50 55 CGT CAG CCT TCA GGA AAG GGT CTG GAG TGG CTG GCA CAC 276 Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His 60 65 70 ATT TAC TGG GAT· GAT GAC AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG 315 Ue Tvr Trp Aso Asd Asd Lvs Aru Tvr Asn Pro Ser Leu 75 80 AAG AGC CGC CTC ACA ATC TCC AAG GAT ACC TCC AGC AAC 354 LYg.... Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn 85 90 95 CAG GTA TTC CTC AAG ATC ACC AGT GTG GAC ACT GCA GAT 393 Gin Val Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp 100 105 110

    ACT GCC ACA TAC TAC TGT GCT CGA AGA GAG ACT GTG TTC 432 Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg. Glu Thr Val Phe 115 120

    -62CZ 295928 B6

    Obr. 2

    - pokračováni

    TAC TGG TAC TTC GAT GTC TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC 471 Tvr Trn Tvr 125 Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val 130 135 ACC GTC TCC TCA 433 Thr Val ser Ser 140

    -63 CZ 295928 B6

    Obr. 3

    Lidská/myší 3B9 chimérní protilátka s těžkým řetězcem Signální sekvence a variabilní úsek

    Nukleotidová sekvence SEQ ID č. 9

    Aminokyselinová sekvence SEQ ID č. 10

    ATG Met 1 GTG TTG CAG ACC CAG GTC TTC ATT TCT CTG TTG CTC 39 Val Leu Gin Thr Gin 5 Val Phe Ile Ser 10 Leu Leu Leu TGG ATC TCT GGT GCC TAC GGG CAG GTT ACC CTG AAA GAG 73 Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Gin val Thr Leu Lys G1U 15 20 25 TCT GGC CCT GGG ATA TTG CAG CCC TCC CAG ACC CTC AGT 117 Ser Giy Pro úly Ile Leu Gin Pro Ser Gin Thr Leu Ser 30 35 CTG ACT 1VJ, tct TTC TCT GGG TTT TCA CTG AGC ACT TCT 156 Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser 33111 Ser 40 45 50 GGT ATG GGT GTG AGC TGG ATT CGT CAG CCT TCA GGA AAG 195 Gly Met Glv vsi Ser Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gly Lys 55 60 65 GGT CTG GAG TGG CTG GCA CAC ATT TAC TGG GAT GAT GAC 234 Gly Leu Glu Trp Leu Ala His. XLL Tvr Trn Asn Aso 70 75 AAG CGC TAT AAC CCA TCC CTG AAG AGC CGG CTC ACA ATC 273 LYS- Ara Tvr Pro Leu „Lys -Ssr Arg Leu Thr Ile ao 85 90 TCC AAG GAT acc TCC AGC AAC CAG GTA TTC CTC AAG ATC 312 Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gin val Phe Leu Lys Ile 95 100 ACC AGT GTG GAC ACT GCA GAT ACT GCC ACA TAC TAC TGT 351 Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 105 110 115 GCT CGA AGA GAG ACT GTG TTC TAC TGG TAC TTC GAT GTC 390 Ala Arg Arq Glu Thr Val, Phe Tvr Trp Tvr ,EJae, Asd Val 120 125 130 TGG GGC GCA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA 423 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 135 140

    -64CZ 295928 B6

    Obr. 4

    Humanizovaná 3B9 protilátka s těžkým řetězcem Signální sekvence a variabilní úsek

    Nukleotidová sekvence SEQ ID č. 11

    Aminokyselinová sekvence SEQ ID č. 12

    ATG GTG TTG CAG ACC CAG GTC TTC Phe ATT Ile >r»£»n Ser 10 CTG TTG CTC Leu 39 Met Val 1 Leu Gin Thr Gin 5 Val Leu Leu T.GG ATC TCT GGT GCC TAC GGG CAG GTT ACC CTG CGT GAA 78 Trp Ile Ser Gly Ala Tyr Gly Gin Val Thr Leu Arg Glu 15 20 25 TCC GGT CCG GCA CTA GTT AAA CCG ACC CAG ACC CTG ACG 117 Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin Thr Leu Thr 30 35 TTA ACC TGC ACC TTC TCC GGT TTC TCC CTG TCG ACC TCC 156 Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 40 45 50 GGT ATG GGT GTT TCC TGG ATC CGT CAG CCG CCG GGT AAA 195 Slit Met. Glv Va,L. .Sag Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys 55 60 65 GGT CTA GAA TGG CTG GCT CAC ATC TAC TGG GAC GAC GAC 234 Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Tvr JX£L Asp Asp AsD 70 75 AAA CGT TAC AAC CCG AGC CTG AAA TCC CGT CTG ACG ATA 273 Lys Ara Tvr Asn Pro Ser Leu Lvs Ser Arg Leu Thr Ile 80 85 90 TCC AAA GAC ACC TCC CGT AAC CAG GTT GTT CTG ACC ATG 312 Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gin Val Val Leu Thr Met 95 100 ACT AAC ATG GAC CCG GTT GAC ACC GCT ACC TAC TAC TGC 351 Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 105 110 115 GCT CGA CGC GAA ACC GTT TTC TAC TGG TAC TTC GAC GTT 390 Ala Arg Aror -£Lu Val Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 120 125 130 TGG GGT CGT GGT ACC CCA GTT ACC GTG AGC TCA 4 23 Trp Gly Arg Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

    135 140

    -65CZ 295928 B6

    Obr. 5

    Humanizovaná 3B9 protilátka s lehkým řetězcem Signální sekvence a variabilní úsek