JP3672933B2 - 抗hbv抗体 - Google Patents
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Description
本発明は,B型肝炎ウイルス表面抗原に結合できるヒト抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を得る方法,それらのハイブリドーマ細胞系,それらの細胞系によって産生される抗体,およびそれらの様々な使用に関する.
発明の背景
B型肝炎ウイルス(HBV)感染は大きな世界的な健康上の問題である.世界の人口の約5%がHBVに感染していて,慢性的感染患者は肝硬変および肝臓細胞癌発症の高いリスクを有する(Progress in Hepatitis Research:Hepatitis B virus(HBV),Hepatitis C virus(HCV)and Hepatitis Delta virus(HDV),O.Crivelli編,Sorin Biomedica,1991).
HBV-コード抗原に対する免疫応答には,HBV感染細胞の排除に活性な細胞性免疫,ならびに循環ウイルス粒子のクリアランスに寄与するウイルスエンベロープ抗原に対する体液性免疫の両者が包含される.HBV感染時のウイルスの持続に有力な原因は弱い抗ウイルス免疫応答の発生である.
組換えHBVワクチンはHBVに対する能動免疫のための安全かつ有効な手段を提供するが,それらは十分かつ迅速な抗体応答を常に誘導するとは限らない.インターフェロン-αがB型肝炎感染の治療に使用されてきたが,高度に選択された患者でも有効率は30〜40%にすぎないことが示されている.
さらに,ヒトポリクローナル抗B型肝炎抗血清による受動免疫は,HBV感染の再発の遅延に有効であって,それを防止する場合さえあることが示されている(Wright,T.L.& Lau,J.Y.N.The Lancet 342:1340-1344,1933).このようなヒトポリクローナル抗血清は,免疫処置されたドナーのプール血漿から調製される.これらのプレパレーションはきわめて高価につき,比較的少量しか利用できない.さらにプールされた血漿には汚染された血液サンプルが含まれる可能性があり,このような抗血清による処置は,結局,患者が他のウイルス感染たとえばC型肝炎またはHIVに接触する危険を増大させる.
HBV感染の処置のための他のアプローチにはモノクローナル抗体(MoAb)の使用がある.
PCT特許出願PCT/NL94/00102には,ハイブリドーマ細胞系Mab 4-7BおよびMab 9H9によって分泌されるB型肝炎表面抗原に対するヒトモノクローナル抗体が開示されている.細胞系Mab 4-7Bによって分泌されるモノクローナル抗体はHBVsAgの線状エピトープを認識し,コンフォーメーショナルエピトープを認識するMab 9H9とは異なっている.慢性B型肝炎感染の処置におけるこれらの抗体の同時使用が請求されている.
PCT特許出願PCT/US92/09749には,ハイブリドーマ細胞系PE1-1,ZM1-1,ZM1-2,MD3-4およびLO3-3により分泌されるHBVsAgに対するヒトモノクローナル抗体が開示されている.これらの抗体は異なるHBVエピトープに結合し,循環HBVsAgレベルを低下させるために使用される.
日本特許出願JP93066104にはヒトリンパ球細胞株TAW-925とエプスタイン-バールウイルスでトランスフォームされたヒトリンパ球のハイブリドーマが開示されている.このハイブリドーマはHBVsAgに対するヒトモノクローナル抗体を産生する.
米国特許出願4,883,752には,ヒトへのHBVsAgワクチンの投与,彼らのリンパ球の回収,非特異的刺激物質によるリンパ球のインビトロにおける刺激,上記細胞の骨髄腫細胞との融合,および抗HBVsAg抗体を分泌するハイブリドーマの選択によるHBVsAgに対するヒト由来のモノクローナル抗体の製造が開示されている.
Ichimoriら,Biochem.and Biophysic.Research Communications 129(1):26-33,1985にはHBVsAgのa-決定基を認識するヒト抗HBVsAgモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが開示されている.その後,Ichimoriらは,同誌142(3):805-812,1987に,HBVsAgに対するヒトモノクローナル抗体を安定に分泌する他のハイブリドーマを開示している.
上述の抗体はすべて,抗HBV抗体陽性の個体からの抗体産生細胞のインビトロ不死化によって発生させたものである.
重症複合免疫不全(SCID)骨髄で放射線保護された致死的放射線照射マウス正常株へのヒト末梢血単核細胞(PMBC)の適応トランスファーを可能にする新しいアプローチが最近報告された(Lubin I.ら,Blood 83:2368,1994).このようなヒト/マウスキメラにおいては,各種想起抗原に対する二次体液性応答ならびに他の抗原に対する一次体液性応答が効果的に発生することが示されている(Marcus H.ら,Blood 86:398-406,1995).
発明の概要
本発明によれば,B型肝炎表面抗原(HBVsAg)に結合できるヒト抗体を分泌するハイブリドーマ細胞系が上述のヒト/マウスキメラを使用して得られることが見出された.本発明によれば,抗HBVsAg抗体陽性のヒトドナーからのヒト末消血リンパ球(PBL)を,致死的に放射線照射されSCID骨髄で放射線保護されたマウスの正常株に移植する.このようなキメラマウスをHBVsAgで免疫したのち,マウス脾臓からヒト細胞を得て,インビボにおいて異種骨髄細胞と融合させ,HBVsAgに高い親和性および特異性を有するヒト抗体を分泌するハイブリドーマを発生させる.
本発明はしたがって,B型肝炎表面抗原(HBVsAg)に結合できるヒトモノクローナル抗体(hMoAb)を得る方法において,
(a)異種造血細胞を有するキメラ齧歯類M4をB型肝炎表面抗原(HBVsAg)で免疫して異種抗体産生細胞を上記齧歯類に作成させ,この場合,齧歯類M4はその造血細胞が実質的に破壊された齧歯類M1であり,上記齧歯類M1は造血不全を有するマウスM2に由来する異種造血細胞を移植され,その異種造血細胞はヒトM3に由来し,
(b)上記抗体産生細胞を分離して不死化し,
(c)HBVsAgに結合できる抗体を産生する不死化抗体産生細胞を選択してクローニングし,ついで
(d)選択されたクローン化不死化抗体産生細胞により産生される抗体を単離することからなる方法を提供する.
本発明によれば,免疫処置されたキメラ齧歯類M4の脾臓をヒトPBLの移植後12〜20日,好ましくはその移植後14日に摘出する.この脾臓から細胞懸濁液を調製し,免疫処置されたキメラ齧歯類M4から得られる抗体産生細胞を好ましくはヒト-マウス融合パートナーたとえば異種骨髄腫と本技術分野でよく知られた技術(たとえば,Kohler & Milstein,Nature,256:495-497,1975)によって融合する.本発明により選択されたハイブリドーマ細胞系によって産生される抗体を単離するためには,ハイブリドーマ細胞系を適当な培地中インビトロで培養してその上清から所望のモノクローナル抗体を回収するか,または別法として,ハイブリドーマ細胞系をマウスの腹腔内に注射し,抗体をこれらのマウスの悪性腹水または血清から収穫する.ハイブリドーマ細胞系の上清を最初,本技術分野で周知の任意の方法たとえば,固相酵素免疫測定法(ELISA)またはラジオイムノアッセイ(RIA)によってヒトIgG抗体の産生についてスクリーニングする.ヒトIgGに陽性を示すハイブリドーマをさらに,それらのHBVsAgへの結合能によって抗HBVsAg抗体の産生についてスクリーニングする.
本発明における齧歯類M1は,好ましくは実験動物として慣用される齧歯類であり,最も好ましくはラットまたはマウスである.
マウスM2は,遺伝性造血不全ならびに誘導性造血不全を包含する任意の造血不全を有する.造血不全の非限定的な例には,SCID,Bg,Nu,Xidまたは上述の造血不全の合併を有するマウスが包含される.さらに,造血不全は遺伝子の欠失の結果でもよく,またトランスジェニックマウスも使用できる.
ドナーマウスM2に由来する造血細胞は非処置またはT細胞の枯渇による骨髄細胞のいずれかが好ましい.使用できる造血細胞の他の起源には,たとえば脾臓細胞,胎児肝細胞またはリンパ球がある.
ヒトM3に由来する異種造血細胞は好ましくはPBL細胞であるが,ヒト造血細胞たとえば骨髄細胞,臍帯血細胞,胸腺脾臓または類リンパ球等の任意適当な起源に由来するものであってもよい.
最も好ましい実施態様によれば,齧歯類M1は,マウスまたはラットであり,マウスM2はSCIDマウスであり,ヒトM3に由来する異種造血細胞は以前の感染の結果として自然にまたはワクチン接種により誘導されてHBVsAgに既に暴露されているヒトM3からのPBLである.このようなヒトは,HBVに感染したことがない個体に比較して比較的高力価の抗HBVsAg抗体を有し,したがって,このようなドナーからのPBLを本発明のM3ドナー細胞として使用した場合には,HBVsAgによるM4キメラマウスの免疫処置は,M4キメラマウスにおいて移植されたヒトPBLの二次免疫応答を誘発する.最も好ましいヒトドナーM3は,HBウイルス試験陰性であるが,HBVsAgに対する抗体は高力価を示すようなドナーである.ヒトM3ドナーからのこのようなPBLは,献血全血からまたは白血球泳動によって得ることができる.
本発明においてキメラ齧歯類M4の免疫処置に用いられるHBVsAgは,組換えDNA技術によって調製されたウイルスの精製主要表面抗原[Engerix(登録商標)-B,SIB Biological,Rixensart,Belgiuum]を含有するB型肝炎ウイルスワクチンとすることが好ましくい.
本発明はまた,HBVsAgに結合可能なヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系,ならびにHBVsAgに結合可能なヒトモノクローナル抗体および全抗体の抗原結合特性を実質的に維持するそのフラグメントを意図する.このようなフラグメントは,全抗体を本技術分野において既知の広く記述されている様々な酵素で消化して得られるたとえばFabまたはF(ab)2フラグメントとすることができる.抗体の抗原特性は標準アッセイたとえばRIA,ELISAまたはFACS分析を用いてある抗原決定基に対する抗体の結合を試験することによって決定される.
本発明の方法で得られるヒトモノクローナル抗体は,通常,競合的ELISAアッセイで測定して約10-9M〜約10-10Mの範囲の比較的高いHBVsAgに対する親和性を有する.
本発明の特異的な実施態様によれば,本明細書においては「18.5.1013」および「19.79.5」と命名され,それぞれ1996年5月22日付にて欧州培養細胞収集機関(European Collection of Cell Cultures,ECACC,CAMR,Salisbury,Wiltshire,SP40JG,UK)に受入番号906052170および96052168として寄託されたハイブリドーマ細胞系が提供される.上記ハイブリドーマ細胞系によって分泌され,本明細書ではそれぞれ「Ab18.5.1013」および「Ab19.79.5」と命名された抗HBVsAgヒトモノクローナル抗体,ならびにその抗体の抗原結合特性を維持するそれらのフラグメント,および「Ab18.5.1013」および「Ab19.79.5」によって結合される抗原エピトープに結合できる抗体も提供される.
上に定義した抗体によって結合される抗原もまた本発明の態様を構成する.
本発明のさらに他の態様には,ヒト抗HBVsAgモノクローナル抗体およびそれらによって結合されるAgの様々な診断的,予防的および治療的使用が包含される.本発明のこの態様においては,ヒト抗HBVsAgモノクローナル抗体からなる医薬組成物は,B型肝炎患者の処置のために,このような患者にモノクローナル抗体または抗HBVsAgに結合できるその部分の治療有効量,HBV感染の症状を緩和するかまたは個体における循環ウイルス粒子を低下させるのに有効な量を投与することにより使用される.
このような組成物は本発明の1種または2種以上の抗体から構成される.本発明の抗体に加えてさらに,医薬的組成物には所望により,本技術分野において既知の任意の担体から選択される担体を含有してもよい.このような担体の一例にはリポソームがある.本発明の医薬組成物にはさらに,それ自体既知の各種希釈剤および補助剤を添加することができる.
本発明の組成物は,非経口投与,経口投与等を包含する各種の投与様式によって投与することができる.
上述のように本発明の抗体からなる組成物は,他の抗ウイルス剤と併用して投与することもできる.このような薬剤には,非限定的な例として,インターフェロン,抗HBモノクローナル抗体,抗HBポリクローナル抗体,ヌクレオシド類縁体,およびDNAポリメラーゼの阻害剤が包含される.このような併用療法の場合には,抗体は抗ウイルス剤と同時にまたは抗ウイルス剤処置の前もしくは後に順次投与してもよい.
本発明の医薬組成物はまた,たとえば,HBV感染に対する新生児の免疫処置に,または肝移植患者におけるHBV感染再発の可能性を排除するための免疫処置に使用される.
さらに他の実施態様によれば,本発明の抗体は,試験個体から血液サンプル,リンパ液サンプルまたは他の任意の体液サンプルであってよい体液サンプルを取得し,体液サンプルを本発明の抗HBVsAg抗体と抗原-抗体複合体が形成される条件下に接触させることによって,個体のHBV感染を診断する方法に使用することもできる.このような複合体のレベルをついで本技術分野で周知の方法によって測定する.対照サンプルで形成されるよりも有意に高いレベルは試験個体におけるHV感染を指示する.同様にして,本発明の抗体によって結合される特異的抗原も診断に使用することができる.同様にして,本発明の特異的抗原も,体液サンプルをAgと接触させ,上述のサンプル中のAg-Ab複合体の存在を測定することによって個体におけるHBV感染の診断に使用できる.さらに,本発明のAgは個体を免疫処置してHBVに対する体液性応答を誘発させるために使用することもできる.
本発明はさらに,本発明の抗体,本発明の抗体によって結合された抗原および試験サンプル中のこのような抗体または抗原を検出するために必要な他の試薬からなる,HBV感染の治療またはこのような感染の診断に使用するためのキットを提供する.
【図面の簡単な説明】
図1は,SCID骨髄で放射線保護された放射線照射マウス(キメラマウス)の血清中の総ヒトIgの量(mg/ml)および特異的抗HBs抗体の量(mU/ml)を示すグラフ表示である.
PBL+Engerix:キメラマウスはさらに抗HBs抗体陽性のドナーからのヒトPBLを移植され水酸化アルミニウムアジュバント(Alum)中Engerix Bでワクチン接種された.PBL+Alum:キメラマウスは,さらに抗HBs抗体陽性のドナーからのヒトPBLを移植され,Alum単独(Engerix Bを含まない)をワクチン接種された.SCID-BM+Engerix:キメラマウスはEngerix Bをワクチン接種された(ヒトPBLの移植は行われていない).SCID-BM+Alum:キメラマウスには,Alumをワクチン接種された(ヒトPBL移植およびEngerix Bのワクチン接種は行われていない).黒い線は,ヒトPBLドナーの血清中における抗HBs抗体の初期レベルを表す.
図2は,比活性すなわちヒトドナー(A〜D,黒色カラム)の血清中におけるヒトIg1mgあたりの抗HBVs抗体のレベル,および上記ドナー(A〜D,斜線カラム)のヒトPBLをそれぞれ移植されたキメラマウスの血清中の比活性を示すグラフ表示である.
図3はキメラマウスの血清中における抗HBs抗体の特異的活性(mU/mg)の時間反応曲線を示すグラフ表示である(点線).黒いカラムは総ヒトIgのレベル(mg/ml),斜線カラムは特異的抗HBs抗体のレベル(mU/ml)を表す.
図4はHBs粒子に対する抗HBs抗体の結合の競合的阻害を示すグラフ表示である.結合の程度は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG二次抗体を用いるELISAによって測定した.抗HBs抗体はグラフ中に指示したように培地中(白四角)または0.5μg/mlのHBs粒子(黒四角)中に希釈した.
図5は抗HBVs抗体で染色したB型肝炎感染肝切片を示す写真である.切片はすべて「二次抗体」すなわちビオチンに接合したヤギ抗ヒトIgで染色した.
A−陰性対照.一次抗体なし.
B−陽性対照.一次抗体−マウス抗HB抗体,二次抗体−抗−マウスIg.
C−抗HBVs抗体No.19.79.5で染色.
D−抗HBVs抗体No.18.5.1013で染色.
例示のために提供され本発明を限定する意図はない以下の実施例に詳細が記述される.
図6は15セットの特徴が明瞭に定義されているHBVsAg型へのAb19.79.5の結合の模式的に示した図である.
図7は,非処置群およびAb18.5.1013処置群(阻害モデル)での日11および18におけるHBV感染動物の百分率のグラフ表示である.
図8は,非処置群およびAb19.79.5処置群(予防/阻害複合モデル)での日10および17におけるHBV感染動物の百分率のグラフ表示である.
図9は,非処置群およびAb19.79.5処置群(阻害/処置複合モデル)での日11および19におけるHBV感染動物の百分率のグラフ表示である.
図10は,Ab19.79.5の可変ドメインの軽鎖の核酸配列および相当するアミノ酸配列である.
図11は,Ab19.79.5の可変ドメインの重鎖の核酸配列および相当するアミノ酸配列である.
実施例
材料および方法
マウス:
用いた動物は6〜10週齢であった.BALB/cマウスはHarlan(Weizmann Institute Animal Breeding Center,Rehovot,Israel)から,SCID/NODマウスはWeizmann Institute Animal Breeding Center,Rehovot,Israelから入手した.マウスはすべて,滅菌飼料およびシプロプロフロキサシン(20μg/ml,Bayer,Leverkusen,Germany)含有酸性水を供給した.必要な場合には常にマウスに,BMT(Glaxo Operations UK,Greenland,England)後5日間毎日,1mgのFortumを腹腔内注射した.
条件付け基準:
BALB/cマウスはガンマ線150-A 60Co光源(Atomic Energy of Canada,Kanata,Ontario製)からF.S.D.75cm,線量速度0.7Gy/分,4Gyついで3日後10〜11Gy(分割線量)の全身照射(TBI)に暴露した.
骨髄細胞の調製および移植:
マウスから大腿骨および脛骨を摘出して,滅菌50ml Omni-Mixerステンレス鋼チャンバー(Omni-Mixer Homogenize,Model No.17106,Omni International,Waterburg,CT,USA)中でホモジナイズした.
レシピエントマウスには照射後直ちに,4〜6×106SCID/NOD骨髄細胞(0.2ml PBS中)を静脈内注射した.
末梢血リンパ球の移植:
末梢血リンパ球(PBL)は,HBs抗体陽性およびHBV陰性ドナーから,インフォームドコンセント後に白血球泳動によって得た.PBLは2回洗浄し,計数し,PBS中に所望の濃度に再懸濁した.
100×106ヒトPBLを,上述のように条件付けしたレシピエントマウスに腹腔内注射した.対照マウスにはヒトPBLを注射しなかった.
キメラ動物の免疫処置:
マウスには,PBLとともにB型肝炎ワクチン[Engerix(登録商標)-B;SBBiological Rixensart,Belgiuum]を腹腔内投与して1回免疫処置した.
ヒトマウスキメラからの細胞および血漿の収集:
動物の眼窩後部の血管からヘパリン被覆を施したガラス毛細管を用いて採血した.血漿はヒト-Igの測定のために保存した.頸椎脱臼によって動物を屠殺したのち,脾臓を摘出し,細片に切断し,ステンレス鋼の篩を通過させてPBS中の細胞懸濁液を調製した.
細胞融合:
細胞をヒト-マウス異種骨髄腫HMMA2.11TG/0(Posnerら,Hybridoma,6:611-625,1987)と3:1の比率で混合した.融合は,50%(w/v)のPEG1500(Boehringer Manheim GmbH)により標準操作で行った.融合細胞は,HAT-補充栄養(1×)含有完全培地(Biological Industries,Beit Haemek,Israel)中96-ウエルのU底マイクロタイタープレート(Nunc,Denmark)に3000細胞/ウエルの濃度に接種した.細胞には1週後に新鮮なHAT培地を供給した.融合2週後に,上清をELISA用に収穫し,培地は新鮮なHAT培地によって置換した.
特異的な抗HBs Igを分泌する培養ハイブリドーマを96-ウエルのU底マイクロタイタープレート中0.5細胞/ウエルでクローン化した.
ヒト免疫グロブリンの測定:
血清を抗原特異的および総ヒトIgについて試験した.総ヒトIgは,捕獲剤としてヤギF(ab)2-精製抗-ヒトIgG+IgM+IgA(Zymed Laboratories,San Francisco,CA)および検出試薬としてペルオキシダーゼ接合精製ヤギ抗-ヒト(Zymed Laboratories)を用いたサンドイッチELISAによって定量した.免疫グロブリン濃度が既知のヒト血清を標準として使用した(Sigma,Rehovot,Israel).捕獲剤で予め被覆し(2.5μg/ml,50μl/ウエル),10%BSAによってブロックしたマイクロプレート(Nunc,Roskilde,Denmark)を,1:20000〜1:640000の血漿希釈液,または0.2〜0.06μg/mlの標準と4℃で一夜インキュベートし,ついでBSA-Tween溶液で5回洗浄した.検出試薬を加え,プレートを37℃で1時間インキュベートし,ついで再び3回洗浄した.新鮮な基質溶液(TMB,Sigma)を加え,ペルオキシダーゼ触媒発色後10%硫酸を添加して反応を停止させた.450nmにおける吸収をELISAリーダー(Dynatech,Port Guernsey,Channal Islands,UK)上で定量した.
マウス血清中の抗原特異的ヒト抗体の濃度は,HBsAb EIAキット(ZER,Jerusalem,Israel)によって測定した.
ハイブリドーマ上清中のヒト抗体は,ヤギ抗-ヒトIgG+M+A(Zymed)被覆プレート上,上清を二次試薬として接合させたヤギ抗-ヒトIgG-ペルオキシダーゼと一夜インキュベートすることにより測定した.
ハイブリドーマ上清中の抗原特異的抗体は,HBs抗原被覆プレートを用いて上述のように測定した.
ヒトIgGサブクラスの決定:
ヒトIgGサブクラスは,ヤギF(ab)2-精製抗-ヒトIgG+IgM+IgA(Zymed Laboratories,San Francisco,CA)被覆プレートおよびHBs抗原被覆プレートを用いて,サンドイッチELISAによって決定した.二次抗体としてマウス抗-ヒトIgGサブクラス(Sigma),検出試薬としてペルオキシダーゼ接合精製ヤギ抗-ヒト(Zymed Laboratories)を使用した.
統計解析:
統計解析に際しては,Mackintosh Quadra 605上でStat View IIプログラム(Abacus Concepts,Inc.,Barkley,CA)または486 DX2 PCコンパチブル上でMicrosoft Excel 5.0(Microsoft)を使用した.Studentのt-検定,Anovaの相関および回帰分析は確率(p)および相関係数(r)値の計算に使用した.結果は平均±標準誤差として示す.
親和性定数の測定:
ad抗原(Chemicon Cat.No.AG 850)に対する様々な抗-HBs抗体の溶液中での親和性定数(KD)の決定は,Friguetらの方法(Journal of Immunological Methods,77:305-319,1985)に従って実施した.様々な濃度(3.5×10-10M〜1.4×10-9M)の抗原を,2mM EDTAおよび10mg/mlのBSAを含有する0.1Mリン酸ナトリウム,pH7.8(メジウム緩衝液)中,一定量の抗体(3.4×10-11M)と溶液中で最初にインキュベートした.20℃でo.n.インキュベートしたのち,遊離の抗体を直接ELISAで測定した.各混合物300μl容量を,予めAdで被覆(0.1M NaHCO3緩衝液,pH9.6中1μg/ml,50μl/ウエル,37℃2時間)したマイクロタイタープレート(Nunc)のウエルに移し,20℃で2時間インキュベートした.0.04%Tween20含有PBSで洗浄したのちHRP-F(ab')2ヤギ抗ヒトIgG(Zymed)をメジウム緩衝液で1:3000に希釈して50μl/ウエル,20℃で2時間添加して結合した抗体を検出した.プレートをTMB色素源(Sigma T-3405錠)50μl/ウエルで発色させ,10%H2SO450μl/ウエルで反応を停止させ,プレートをELISAリーダーによって450nmで読み取った.条件は得られるf値(Friguetら参照)がほぼ0.1になるように選択された.用いた抗体濃度は同じプレート上で実施したELISA検量から推定した.親和性定数KDは関連するスキャッチャードプロットから計算した.
阻害アッセイ:
阻害アッセイはHBs粒子(PBS中2μg/ml)で被覆したマイクロタイタープレート内で行った.プレートはPBS中3%BSAでブロックした.抗-HBs抗体を含有するハイブリドーマ上清を系列希釈した.各希釈液50μlを,被覆したマイクロタイターウエルに加えた.ついで50μlのHBs粒子(ad/ay,PBS中0.5μ/ml)またはPBS単独を各ウエルに添加した.プレートを加湿チャンバー内において室温で一夜インキュベートし,PBS-Tweenで5回洗浄した.次に,HRPに接合したヤギ抗ヒトIgG(PBS中に1:5000に希釈)50μlを各ウエルに加えた.加湿チャンバー内において室温で4時間インキュベートしたのち,プレートをPBS-Tweenで5回洗浄し,各ウエルにTMBを加えた.結果はELISAリーダーを用いて波長450nmで読み取った.
免疫組織学的染色:
HBV陽性肝臓フラグメントを,4%中性緩衝化ホルムアルデヒド中に24時間固定し,ついで定常的な操作を用いてパラフィン中に包埋した.パラフィン塊から4μm厚の切片を切り出し,ポリリジン被覆スライドに載せた.脱パラフィン後に,本発明のモノクローナルヒト抗-HBsプロテインA-精製抗体を使用してペルオキシダーゼ消光染色を実施し,ついでHistostain-SPTMキット(Zymed,San Francisco,CA)を製造業者の指示に従って使用してビオチン化ヤギ抗-ヒトIgG(H+L)(Zymed)染色を行った.第1のヒト抗-HBs抗体を使用しない対照スライドも平行して染色した.
配列決定:
総RNAを,RNAsol B試薬(TEL-TEX,Inc.,Friendswood,Texas)により10×106ハイブリドーマ細胞から単離した.cDNAを標準操作に従い,逆転写酵素およびオリゴdT(Promega,Madison,WI)により総RNA 10μgから調製した.PCRはVH,VλまたはVK5'リーダープライマーおよびヒト不変領域に相当する3'プライマーによって1/50 RT反応混合物で実施した.PCRフラグメントは,pGEM-Tベクター(Promega)にクローン化した.挿入体の配列をABI377配列決定装置を用いて決定した.配列は,Genebankとの比較およびKabat配列(Kabatら,1991,Sequence of proteins of Immunological interest.(5th Ed.),U.S.Dept.of Health and Human Services,National Institutes of Health,Bethesda,MD)とのアライメントにより解析した.
実施例1:キメラマウスにおけるヒトヒト抗-HBs抗体の産生
抗-HBs抗体陽性のドナーからのヒト末梢血リンパ球(PBL)を,SCIDマウスからの骨髄の移植によって放射線保護された放射線照射BALB/Cマウスの腹腔内に移植した.キメラマウスをB型肝炎ワクチン(Engerix B)で免疫して二次免疫応答を誘発させた.総ヒトIg分泌とともに特異的な抗-HBs抗体の産生をマウス血清中で測定した.図1は,ヒトPBLの移植後14日のマウス血清における総ヒトIgおよび抗-HBs抗体のレベルを示す.ヒトIg分泌のレベルは免疫処置および対照マウスで類似していたが,B型肝炎ワクチンを接種したマウスでは対照群に比べて強力な免疫応答が発生する.免疫処置マウスにおいて抗原に応答して産生された特異的ヒト抗体のドナー血清中のそれらのレベルに対する比較では,5〜10倍の増加が指示される.しかも,マウス血清中に測定される特異的活性,すなわち分泌されるヒトIg1mgあたりの抗HBs特異的抗体のレベルはドナー中に認められる特異的活性よりも102〜104倍高い.この増加は,キメラマウスにおける抗原に応答した抗HBs抗体産生のきわめて高い増幅を示している(図2).ヒト抗体の産生は免疫処置後10日で検出可能になり,3週後にプラトーに達する.特異的活性は免疫処置後13日に高く,以後低下する(総ヒトIg分泌の増加による)(図3).
実施例2:HBsに対するヒトモノクローナル抗体の調製およびその特性
免疫処置2週後にマウス脾臓から収穫したヒトB細胞をヒト-マウス異種骨髄腫細胞(Posnerら,前出)に融合した.ハイブリドーマ細胞は,それらの成長速度,総Ig分泌および特異的抗体産生について試験した.対照融合実験はインビトロにおいてPWMおよびHBVsAgで活性化したドナーPBLについて行った.様々な実験における融合頻度は0.9-5×10-5の範囲である.増殖しているハイブリドーマクローンの大部分はヒトIgを分泌し,その0.1〜4%は特異的ヒト抗−HBs抗体を産生する.キメラマウスの脾臓に由来する抗-HBs分泌ハイブリドーマ細胞を,インビトロにおいて活性化したドナーPBLの融合から得られたハイブリドーマ細胞と,Ig型および安定性について以下の表1に示すように比較した.キメラマウスからのハイブリドーマの大部分はIgG型であることが見出され,すべてが12カ月以上安定であった.これに反し,ドナーPBLから誘導されたハイブリドーマは大部分が不安定で,1個のクローンのみが12カ月以上安定であった.特異的ヒト抗-HBsモノクロナール抗体を分泌する2つの安定なハイブリドーマクローンの特性を調べた.以下の表2に示すように,これらの抗体はプロテインAカラムならびに抗ヒトIg-アガロースカラム上で精製し,両者ともにIgG1サブクラスであることが見出された.親和性係数は,競合的ELISAで試験して1.3×10-9M〜6×10-9Mの範囲である.特異性はad-ay(1:1)サブタイプのHB表面抗原を用いた競合的阻害アッセイによって試験した(図4).図5は,HBVに対する本発明のヒトMoAbsの特異的結合をHBV感染ヒト肝臓フラグメントの染色によって示す.
Ab19.79.5の可変領域をコードする遺伝子を単離し,全配列を決定し,そのサブクラスおよびCDRを決定した.この抗体は,Genebank配列およびKabatタンパク質配列とのアライメントにより決定して完全なヒトIg遺伝子配列を有する.図10には,Ab19.79.5の可変領域の軽鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列およびその相当するアミノ酸配列を示す(配列番号1および3).図11には,Ab19.79.5の可変領域の重鎖をコードするcDNAのヌクレオチド配列およびその相当するアミノ酸配列を示す(配列番号2および4).配列決定データから,Ab19.75.5の可変領域は,サブグループVH3,JH2,Vλ3およびJλ3から構成されることが明らかになった.
HBVゲノムは,それらのヌクレオチド配列の類似の程度に基づいて6つの群A〜Fに分類される.HBVの遺伝子の多様性はHBVsAgの異なる血清型の存在を反映する.共通の決定基’a’と2対の互いに排他的な決定基’d/y’および’w/r’がHBsAgの主要な4種のサブタイプ:adw,adr,aywおよびayrの識別を可能にする.サブ決定基と呼ばれるwの付加的な決定基(w1〜w4)はarwの4種のサブタイプ(ayw 1〜4),およびadwの2種のサブタイプ,すなわち,adw 2およびadw 4の定義を可能にする.付加的サブタイプの変種がほとんどすべてのサブタイプに存在するq決定基により付加される.その不存在は’q-’の標識によってマークされる.
Ab19.79.5により認識される種類のHBV血清型を15種類の異なるHBsAgのセット(Norderら,1992,Journal of General Virology,73:3141;Magnius & Norder,1995,Intervirology:38;25-34)を用いて調べた.図6から明らかなように,Ab19.79.5は,異なるHBsAg血清型の複雑な認識パターンを有する.
実施例3:HBsに対するヒトモノクローナル抗体の生物活性
Ab19.79.5およびAb18.5.1013の生物活性の特徴を以下のHBV動物モデルを用いて調べた.すなわちマウスをヒト肝臓フラグメントの安定な移植が可能なように処置した.処置には,強度の放射線照射ついでSCID(重症複合免疫不全)マウス骨髄の移植が包含される.ヒト肝臓フラグメントのウイルス感染はHBV陽性ヒト血清(EP 699 235)を用いてエキソビボで実施した.動物モデルは抗体の様々な使用の可能性を示す3種の異なる様式で使用した.すなわち,感染の阻害様式,予防/阻害複合様式および阻害/処置複合様式である.
1.阻害様式−このモデルは,HBVによる肝臓の感染を阻害する抗体の能力を証明する.HBV陽性ヒト血清をAb18.5.1013と予めインキュベートし,ついで標準エキソビボ肝臓感染を行った.マウス血清中のHBV-DNAを移植後日11および18に試験した.図7から明らかなように,抗体処置群における感染動物の百分率は非処置群に比較して有意に低下した.
2.予防/阻害複合様式−このモデルは肝臓移植を表す.このモデルでは,マウスを肝臓移植の3日前にAb19.79.5(10 I.U./マウス)で処置し,ついでAb19.79.5(10 I.U.)の存在下にHBVでエキソビボ感染させたヒト肝臓フラグメントを移植した.マウス血清中のHBV DNAは移植後日10および17に試験した.図8から明らかなように,処置群における感染動物の百分率は対照群に比較して有意に低下した.
3.阻害/処置複合様式−a)HBV陽性ヒト血清をAb19.79.5と予めインキュベートし,ついで標準エキソビボ肝臓感染を行った.b)マウスは移植後日0および7にAb19.79.5で処置した.マウス血清中のHBV DNAは移植後日11および19に試験した.図9から明らかなように,Ab19.79.5処置群における感染動物の百分率は有意に低下したが,処置を中止したのち約2週でリバウンドが認められた.
実施例4:HBsに対するヒトモノクローナル抗体および抗ウイルス剤の併用療法
上述のHBVモデルを用い,マウスを移植後日17〜20に抗ウイルス剤(ヌクレオシド類縁体,0.5mg/マウス/日)で処置する.1群のマウスはさらに日19および20に本発明のヒトモノクローナル抗体によって処置する.マウス血清中におけるHBV DNAの存在を日21および27に試験した.
Claims (7)
- (a)欧州培養細胞収集機関(ECACC)に受付番号第96052168号として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体19.79.5;
(b)全抗体の抗原結合特性を実質的に維持する(a)の抗体のフラグメント;
(c)図10および図11に記載される核酸配列を含む核酸配列によってコードされるモノクローナル抗体;および
(d)図10および図11に記載されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体、
からなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体。 - 1996年5月22日付にてECACCに受付番号第96052168号として寄託されたハイブリドーマ細胞系。
- 活性成分として請求項1記載の抗体と医薬的に許容される担体からなるHBV感染の予防および/または処置用の医薬組成物。
- 体液サンプル中のHBVレベルを測定する方法において、
(a)サンプルを請求項1記載の抗体と抗体−抗原複合体の形成が可能な条件下に接触させ、
(b)形成した抗体−抗原複合体のレベルを測定することからなり、
対照サンプルにおいて形成されたより試験した体液サンプルにおける有意に高いレベルはHBV感染を指示するものとする方法。 - 活性成分として請求項1記載の抗体の少なくとも1種を少なくとも1種の他の活性成分としての抗ウイルス剤と併用するHBV感染の予防および/または処置用の医薬組成物。
- 抗ウイルス剤はインターフェロン、抗HBポリクローナル抗体、ヌクレオシド類縁体およびDNAポリメラーゼの阻害剤からなる群より選択される請求項5記載の医薬組成物。
- HBV感染の予防および/または処置用の医薬組成物の製造のための請求項1記載の抗体の使用。
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