DE19726597C1

DE19726597C1 - Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörper

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Publication number: DE19726597C1
Application number: DE19726597A
Authority: DE
Inventors: Georg S Dr Dr Wengler
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-06-23
Filing date: 1997-06-23
Publication date: 1998-11-19
Anticipated expiration: 2017-06-24
Also published as: EP0923607A1; US20030149996A1; WO1998058963A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von menschlichen und maus-monoklonalen Antikörpern unter Ver wendung zumindest eines tierischen Lebewesens gemäß Anspruch 1 bzw. 6.

Viele Strategien zur Diagnose und Therapie von menschlichen Erkrankungen basieren auf den Ergebnissen von Tierversuchen. Hierbei stehen verschiedene Versuchsmodelle zur Verfügung, um beispielsweise Fragen und Probleme der Pathogenese, der Empfinglichkeit von Diagnosetests, der Effizienz und der Sicherheit von Therapiemitteln und Impfstoffen zu untersu chen.

Am häufigsten werden für Tierversuche Mäuse, Ratten und Ka ninchen sowie danach Hunde, Schafe, Ziegen und Primaten ver wendet. Je kleiner das Tier ist, desto günstiger sind die Kosten für die Tierhaltung. Üblicherweise sind darüber hin aus bei Kleintieren die Züchtungszeiten kürzer. Hochent wickelte Techniken, wie beispielsweise transgene Systeme, sind hauptsächlich für Mäuse entwickelt worden (siehe bei spielsweise DE 33 01 249 C2).

Der Nachteil der Tests, bei denen Mäuse verwendet werden, ist der große Abstand in der evolutionären Herkunft von Mensch und Maus. Daher sind viele Resultate, die bei Versu chen unter Verwendung von Mäusen erzielt werden, lediglich ein Anhaltspunkt, beweisen jedoch nicht die genaue Übertrag barkeit auf den Menschen.

Im Hinblick auf die evolutionäre Nähe von nicht menschlichen Primaten zum Menschen wären in diesem Bereich die besten Möglichkeiten für Tiermodelle gegeben. Einschränkungen erge ben sich jedoch durch die hohen Kosten und die gerade in diesem Bereich immer wieder entstehenden Diskussionen über die grundsätzlich mit Tierversuchen einhergehenden ethischen Probleme.

Diese Probleme bestünden natürlich erst recht bei Versuchen an Menschen, obwohl diese prinzipiell am erfolgversprechend sten wären.

Da jedoch die moderne Medizin in ihren Diagnose- und Thera pieverfahren aufgrund der Kenntnisse über viele genetische Erkrankungen große Fortschritte gemacht hat, besteht nach wie vor ein großes Bedürfnis, geeignete Forschungsmodelle zur Verfügung zu stellen.

Ein neues Modell zum Studium menschlicher Erkrankungen ba siert auf der Verwendung von Schafen, in deren Fötus in utero menschliche Stammzellen transplantiert werden (Lite raturnachweise: Flake AW, Harrison MR, Adzick NS, Zanjani ED: Transplantation of Fetal hematopoietic Stem Cells in Utero: The Creation of Hematopoietic Chimeras. Science 233: 776, 1986, Zanjani E, Almeida-Porada G, Flake A: Retention and Multilineage Expression of Human Hematopoietic Stem Cells in Human-Sheep Chimeras. Stem Cells 13: 101, 1995). Bisher ist dieses Modell jedoch nur für Studien zur Untersu chung der immunologischen Unreife eines Fötus und die Mög lichkeiten für die Erzeugung einer Toleranz gegenüber menschlichen Xenotransplantaten verwendet worden.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verwendung eines tierischen Lebewesens zur Herstellung von menschlichen und maus-monoklonalen Antikörpern zu schaffen, das relativ einfache Herstellungsbedingungen mit hoher Effizienz und Reproduzierbarkeit ermöglicht.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch die Merkmale des Anspruchs 1 bzw. des Anspruchs 6.

Die Unteransprüche 2 bis 5 bzw. 7 bis 10 haben vorteilhafte Weiterbildungen dieses Verfahrens zum Inhalt.

Neben den eingangs bereits erläuterten Grundlagen basiert die vorliegende Erfindung auf folgendem Konzept:

Aufgrund der Transplantation einer menschlichen oder tieri schen Stammzelle in eine befruchtete Eizelle des tierischen Lebewesens hat dieses eine Toleranz gegen menschliche Zel len. Es handelt sich bei dieser Behandlung nicht um den Aus tausch von genetischem Material oder um eine genetische Manipulation.

Die Transplantation von Gewebe (Zellen, Organe) ist mit zwei wesentlichen Problemen konfrontiert:

a) Host versus Graft Reaktion (Empfänger/Spender-Reaktion):
Der Empfänger, soweit er nicht HLA-(Gewebetyp)identisch ist, stößt alles Freme, wie beispielsweise Spenderzellen oder Spenderorgane ab. Nachfolgend wird alles Fremde als "nicht-selbst" bezeichnet.
b) Graft versus Host Reaktion (Spender/Empfänger-Reaktion):
Der Spender (vor allem Lymphozyten) greift Gewebe des Empfängers an. Was "selbst" (also "nicht-fremd") bedeu tet, lernt jedes Individuum in einem Organ (dem Thymus) in der ersten Zeit seiner Entwicklung (bei Säugern im er sten Drittel der Schwangerschaft). Alles was später nicht "selbst" ist, wird als "nicht-selbst" (also fremd) (mit einigen Ausnahmen) qualifiziert.

Mit der Einführung bzw. Transplantation von jeglicher Art von Zellen im ersten Drittel der Schwangerschaft in einen Fötus ist es jedoch möglich, dem Empfänger das transplan tierte ("fremde") als "selbst" zu suggerieren, da der Fötus als Empfänger in dieser Zeit noch nicht dazu in der Lage ist, das Empfangene als "nicht-selbst" zu identifizieren.

Man spricht in diesem Fall von der zuvor bereits erwähnten "Toleranz" einem "nicht-selbst" Gewebe gegenüber. Mit dieser erreichten Toleranz kann man später z. B. Organe (wie Herz, Niere, Leber) vom selben Spender in den Empfänger verpflan zen, ohne jegliche Abstoßungsreaktion zu provozieren.

Als Zellen, die transplantiert werden können, kommen folgen de Zellen in Frage:

- Hematopoietische Stammzellen aus Knochenmark, Nabelschnur, Blut, fetaler Leber oder Milz und zirkulierende Blutstamm zellen im perpheren Blutkreislauf;
- embryonale Stammzellen (wobei bis zu einem gewissen Sta dium jede embryonale Zelle eine gewisse Omnipotenz zur Selbsterneuerung und Differenzierung besitzt);
- jegliche Art von Zellkulturen (wie Zellhybridome) und Gewebe.

Erfindungsgemäß käme als Empfänger, also als tierische Lebe wesen, grundsätzlich jegliche Spezies in Frage. Besonders bevorzugt sind jedoch Schaf, Ziege, Hase, Kuh und Huhn.

Als Spender der zu übertragenden Zellen wäre grundsätzlich ebenfalls jede Spezies denkbar, vorzugsweise jedoch Mensch, Maus, Zellkulturen, Hybridome und Huhn.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung des Schafes als tie risches Lebewesen bzw. Empfänger gemäß Anspruch 1. Denn die anatomische Situation des Schafes während der Schwanger schaft läßt eine Manipulation des Fötus unter ECHOKONTROLLE bereits zu einem frühen Zeitpunkt zu. Die Durchführung einer echokontrollierten Fetalmanipulation am Schaf (jedoch auch am Hasen oder am Ei eines Huhnes) stellt gegenüber bekannten Verfahren (z. B. Bauchhöhlen- und Uterusöffnung) einen mini malen Eingriff dar, der das Tier als Empfänger nur wenig be lastet. Die vorliegende Erfindung berücksichtigt somit auch das Bestreben, das Tier im Rahmen der Durchführung des er findungsgemäßen Verfahrens soweit als möglich zu schonen. Darüber hinaus ergibt sich der Vorteil, daß die Manipulation am Fötus dessen ansonsten normale Entwicklung und Sterblich keit, wenn überhaupt, nur gering beeinträchtigt.

Als weiterer bevorzugter Empfänger ist der Hase zu nennen, da seine Schwangerschaftsphysiologie dem Primaten noch we sentlich näher ist als die des Schafes. Ferner ergibt sich der Vorteil einer hohen Reproduktivität und einer kurzen Schwangerschaftszeit.

Die Kuh als Empfänger ist insofern als besonders vorteilhaft zu nennen, da im Rahmen der Erfindung durchgeführte Unter suchungen ergeben haben, daß die Milch der Kuh, beispiels weise bei Durchführung entsprechender Herstellungsschritte, in hohem Maße Antikörper (Immunoglobuline) enthält, die durch Entnahme der Milch auf äußerst einfache Weise gewonnen und weiterverarbeitet werden können.

Für eine Massenproduktion wäre das Ei (beispielsweise von Huhn bis Strauß, die verschiedene Größen, verschiedene Brut zeiten und unterschiedlich hohe Kosten ergeben) gut geeig net, da die gesamte Fetalentwicklung außerhalb des mütterli chen Körpers stattfindet. Hühnereier weisen hierbei eine be sonders kurze Brutzeit mit geringen Kosten und leichter Hal tung auf. Die Gewinnung von monoklonalen Antikörpern könnte aus später gelegten Eiern erfolgen, die einen hohen Gehalt an Immunoglobulinen aufweisen.

Neben den zuvor bereits erläuterten Schritten der Isolierung oder Züchtung von zu injizierenden Spenderzellen und der Transplantation dieser Zellen innerhalb des ersten, vorzugs weise gegen Ende des ersten Drittels der Schwangerschaft intraperitoneal in den Fötus (Empfänger) ist als weiterer bevorzugter Verfahrensschritt zu nennen, daß nach der Geburt des Empfängers dessen toleranter Zustand, vorzugsweise mit molekular-biologischen Methoden oder mit der sogenannten FACS-Methode (Fluoreszenz Activated Cell Sorting), bestätigt wird.

Insoweit zusammenfassend ist festzuhalten, daß sich das er findungsgemäße Verfahren die erzeugte Toleranz des Empfän gers (tierischen Lebewesens) zunutze macht, um eine Vielzahl von Herstellungs- und Testmethoden durchzuführen. Die Ergeb nisse der Tests können im Falle der Transplantation mensch licher Stammzellen auf den Menschen übertragen werden. Hier bei ergibt sich der besondere Vorteil, daß die Toleranz nichts an dem Umstand ändert, daß das zu verwendende Lebewe sen ein Tier ist, bei dem beispielsweise durch die Trans plantation von menschlichen hematopoietischen Stammzellen in utero (IUT) eine Toleranz durch ein entstehendes Verhältnis von Blutzellen des Empfängers (wie beispielsweise des Scha fes) zu denen des Spenders (Mensch) von ca. 90% zu 10% (tie risches zu menschliches Blut) hergestellt wird.

Eine weitere grundsätzliche Anwendung, die das erfindungsge mäße Verfahren möglich macht, ist die Massenproduktion von maus-monoklonalen Antikörpern. Bisher werden derartige Anti körper unter Verwendung von Mäusen gewonnen, was jedoch nur äußerst geringe Quantitäten pro Tier ergibt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, eine To leranz gegenüber Maus-Zellen bei einem anderen tierischen Lebewesen, wie beispielsweise einem Schaf, zu erzeugen.

Hierbei bestehen grundsätzlich drei Möglichkeiten, eine To leranz zu erzeugen:

- Durchführung einer in utereo (intrauterinen) Transplanta tion von Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper produ zieren, direkt in den Embryo, beispielsweise des Schafes, hierbei besteht allerdings eine gewisse Gefahr einer tumo ralen Überwucherung des Embryos;
- eine in utero Transplantation von vor der Injektion be strahlten Hybridomzellen, die monoklonale Antikörper pro duzieren, so daß diese Hybridomzellen nicht mehr teilungs fähig, jedoch noch toleranz-induzierfähig sind;
- Erzeugung der Toleranz durch Transplantation von fetaler Leber aus Embryos des Balb-C-Maus-Inzuchtstammes.

Nach der Transplantation und nach der Geburt des durch die Transplantation mit der Toleranz versehenen Tieres, wie z. B. des Schafes, können nunmehr Maus-Hybridomzellen intraperito neal injiziert werden, ohne daß es zu Fremdkörperreaktionen kommt. Die injizierten Hybridomzellen vermehren sich und be ginnen mit der Bildung spezifischer monoklonaler Antikörper. Klinisch ist dies beispielsweise an der Bildung eines Aszi tes sichtbar. Der Aszites enthält Hybridomzellen und Serum flüssigkeit mit den gewünschten Antikörpern. Die Isolierung dieser Antikörper aus dieser Flüssigkeit ist mit bekannten Methoden möglich. Die Menge von Aszites und damit die Menge der zu gewinnenden Antikörper hängt vom jeweiligen Empfänger ab, liegt jedoch z. B. bei Verwendung von Schafen oder ähn lich großen Tieren im Literbereich und somit wesentlich hö her als bei den bisher mit Mäusen durchgeführten Verfahren. Weiteres könnten monoklonale Antikörper (mAK) mit demselben Isolierverfahren aus der Milch der Schafe gewonnen werden, die einen hohen Gehalt an Immunoglobulinen enthält.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern kann durch die Erzeu gung einer Toleranz im Tier, insbesondere einem Schaf oder einer Kuh, gegenüber menschlichen Zellen im Wege der Trans plantation von hematopoietischen Stammzellen das menschliche Immunsystem im Tier mit jeglichem Antigen (wie z. B. Malaria, TBC, Rabies, Tumore, HIV usw. ) durch subkutane Injizierung stimuliert werden. Die Stimulierung hat zur Folge, daß reak tive B-Zellen entstehen, die isoliert und mit unsterblichen Myelom-Zellen fusioniert werden. Die entstehenden Hybridome können nun in ein weiteres, gegenüber diesen Myelom-Zellen tolerantes Tier intraperitoneal injiziert werden. Nach Inji zierung wachsen die Zellen und produzieren humane menschli che Antikörper, die beispielsweise der entstandenen Aszites oder der Milch oder dem entstandenen Blutserum durch geeig nete Verfahren entnommen werden können.

Dieses Verfahren ergibt gegenüber den bisher bekannten Ver fahren, die bei der Produktion von monoklonalen Antikörpern auf Mäuse beschränkt sind, erhebliche Vorteile, da das spä tere Wachstum von Hybridomen aus Maus und menschlichen Zel len (die Heterohybridome darstellen, vergleiche das zuvor genannte Patent DE 33 01 249 C2) in Kulturmedien noch nicht funktioniert.

Das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 1 ist daher insofern von besonderem Vorteil, da es die Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern ermöglicht, in die zur Behandlung von Tumoren große Hoffnungen gesetzt werden. Da mit dem erfindungsgemäßen Verfahren menschliche monoklonale Antikörper hergestellt werden können, ergeben sich ferner große Vorteile gegenüber den derzeit hergestellten Maus- Antikörpern, da diese nur in vitro gut funktionieren. Bei der Anwendung von maus-monoklonalen Antikörpern (maus mAb) im Menschen kommt es jedoch häufig zur Bildung von Abstos sungsreaktionen, da die maus mAb (Proteine) als "nicht selbst" erkannt werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren könnte jedoch dieses Problem umgangen werden, da zuerst eine menschliche Toleranz induziert wird und anschließend das menschliche Immunsystem zur Bildung von Antikörpern durch Gabe von Tumorzellen angeregt wird. Somit ist die Erzeugung von menschlichen monoklonalen Antikörpern unter Verwendung eines tierischen Lebewesens möglich.

Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus nachfolgender Beschreibung anhand der Zeichnung: Es zeigt:

Fig. 1 eine Prinzipdarstellung zur Induzierung einer Tole ranz in einem tierischen Lebewesen;

Fig. 2 eine der Fig. 1 entsprechende Darstellung einer zweiten Möglichkeit zur Induzierung einer Toleranz in einem tierischen Lebewesen;

Fig. 3 eine den Fig. 1 und 2 entsprechende Darstellung ei ner dritten Möglichkeit zur Induzierung einer Tole ranz in einem tierischen Lebewesen;

Fig. 4A und Fig. 4B eine Prinzipdarstellung zur Produktion von maus mAb; und

Fig. 5A und 5B eine Prinzipdarstellung zur Erläuterung eines Verfahrens zur Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern.

In Fig. 1 ist schematisch vereinfacht dargestellt, wie eine Toleranz durch in utero Transplantation von Spenderzellen S in einem Embryo E eines Trägertieres T induziert werden kann. Wie zuvor erläutert wrude, erfolgt die Injizierung von Spenderzellen S im ersten Drittel der Schwangerschaft, in dem die Fremdzellen vom Embryo noch nicht als Fremdkörper erkannt werden können. Dementsprechend entsteht ein Immun system, das die im ersten Drittel injizierten Spenderzellen S als eigene Zellen identifiziert. Es wird mithin ein tieri sches Lebewesen C geboren, das die jeweilige Toleranz hat.

In Fig. 2 ist eine zweite Möglichkeit zur Erzeugung eines Tieres mit einer bestimmten Toleranz dargestellt. In diesem Fall handelt es sich um die Toleranzinduzierung in einem Ei eines Vogels (beispielsweise eines Huhnes oder Straußes). Das Ei A wird hierbei ebenfalls mit den Spenderzellen S ver sehen und anschließend ausgebrütet. Das Ergebnis ist ein Tier in Form eines Vogels V, der die entsprechende Toleranz zeigt. Vorzugsweise wird das Verfahren unter Ultraschallkon trolle durchgeführt.

In Fig. 3 ist ein Beispiel für eine grundsätzlich mögliche in vitro Transplantation erläutert. Hierzu wird zunächst ei ne künstliche Befruchtung des Eis B mit einer Samenzelle Z durchgeführt. In die befruchtete Samenzelle B' werden Fremd zellen, beispielsweise hematopoietische Stammzellen HSC, in jiziert. Anschließend kann das befruchtete und mit den Stammzellen versehene Ei in die Gebärmutter eines Trägertie res für den Rest der Schwangerschaft injiziert werden. Wie derum entsteht ein Tier C mit einer den injizierten Zellen entsprechenden Toleranz.

In den Fig. 4A und Fig. 4B ist schematisch ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Maus-Antikörper dargestellt.

In Fig. 4A ist zunächst der Schritt der Toleranzerzeugung erläutert. Beim Spender handelt es sich in diesem Falle um eine Maus, üblicherweise eine Maus M des Inzuchtstammes Bald-C. Zur Erzeugung einer Maustoleranz im Embryo E eines Trägertieres T (z. B. Schaf) können beispielsweise fetale Leberzellen FLZ in den Embryo im ersten Drittel der Schwan gerschaft implantiert bzw. injiziert werden. Nach der Geburt liegt ein Tier C vor, das eine Maustoleranz aufweist.

Dieses Tier C wird entsprechend den Verfahrensschritten in Fig. 4B zur Erzeugung der monoklonalen Antikörper verwendet. Hierfür werden Hybridomzellen HC des Spenders (einer Maus des Balb-C Inzuchtstammes) in das Tier C injiziert. Das Resultat ist das Wachstum Antikörper produzierender Zellen, die sich beispielsweise in dem Entstehen einer Aszites ASC zeigen. Aus der Flüssigkeit der Aszites (sowie aus dem Blut serum und der Milch) können die monoklonalen Maus-Antikörper (mAK) isoliert werden. Der Vorteil diesses Verfahrens ist vor allem darin zu sehen, daß die entstehende Menge an mAK wesentlich größer ist und somit die Effizienz des erfin dungsgemäßen Verfahrens gegenüber bisherigen Verfahren, bei denen ausschließlich Mäuse verwendet wurden, markant gestei gert ist.

In den Fig. 5A und 5B ist schematisch ein Verfahren zur Her stellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern 13 darge stellt. Als Spender fungieren hier beispielhaft Mäuse des Balb-C Inzuchtstammes und ein menschliches Individuum.

Das Verfahren zeichnet sich zunächst dadurch aus, daß zwei verschiedene Toleranzen in zwei verschiedenen tierischen Lebewesen induziert werden müssen. Zunächst wird eine Maus/ Mensch-Toleranz mit Hilfe von tierischen Stammzellen 4 eines Spenders 10 und menschlichen Stammzellen 1' in einem Embryo 5 eines tierischen Lebewesens 6 erzeugt. Nach der Geburt ist ein Lebewesen 12 entstanden, das eine zweifache Toleranz (Maus/Mensch) = hat. (Fig. 5B)

Entsprechend den zuvor erläuterten Prinzipien wird ein wei teres Tier 14 mit einer menschlichen Toleranz gemäß der Dar stellung der Fig. 5A erzeugt. Hierzu wird eine menschliche Stammzelle 1 in einen Embryo 2 eines anderen Trägertieres 3 injiziert. Es entsteht, wie gesagt, das zweite Tier 14 mit einer menschlichen Toleranz.

Im nächsten Verfahrensschritt wird, je nach den zu erzeugen den monoklonalen Antikörpern, ein geeignetes Antigen 7 in das Tier 14 mit menschlicher Toleranz injiziert. Hierdurch wird der menschliche Anteil des Immunsystems des Tieres 14 zur Bildung von humanen Antikörper produzierenden B-Zellen 8 angeregt. Diese B-Zellen 8 werden aus dem Tier 14 entnommen und isoliert und mit Tumorzellen 9 (Myeloma-Zellen) des Spenders 10 fusioniert. Hierdurch entstehen (Mensch/Maus) Hybridomazellen 11, die in das Tier 12 mit zweifacher Tole ranz (Mensch/Maus-Toleranz) injiziert werden. Dieses Tier 12 stößt aufgrund seiner Toleranz die injizierten Hybridomazel len 11 nicht ab, sondern bildet vielmehr eine humane mono klonale Antikörper enthaltende Aszites 15, ein diese Anti körper enthaltendes Blutserum oder auch eine diese Antikör per enthaltende Milch, wenn als Tier beispielsweise eine Kuh verwendet wird.

Aus der jeweiligen Flüssigkeit, beispielsweise der in Fig. 5C dargestellten Aszites 15, können nunmehr die monoklonalen Antikörper 13 auf bekannte Art und Weise gewonnen werden.

Zu den voranstehenden Erläuterungen, insbesondere dem Ver fahren gemäß den Fig. 5A und 5B ist folgendes ergänzend her vorzuheben:

Da bei der vorangehenden Erläuterung der Ausführungsform ge mäß den Fig. 5A, 5B als tierische Spender Mäuse des Inzucht stammes Balb-C verwendet wurden, sind die Zellen des ur sprünglichen Spenders 10 (siehe Fig. 5B) nicht von den Zel len der anderen Balb-C Mäuse zu unterscheiden, da alle "qua si" genetisch und phenotypisch identisch sind. Dies ist die Folge der intensiven Inzucht. Bei der Fusion der menschli chen B-Zellen 8 mit den tierischen Tumorzellen 9, die eben falls von Balb-C Mäusen stammen, ist es mithin ausreichend, daß diese Zellen 9 von den genannten Balb-C Mäusen stammen.

Wie zuvor erläutert wurde, handelt es sich bei den erwähnten Hybridomzellen um Zellen, die durch eine Zellfusion herge stellt werden. Im anhand der Fig. 5A erläuterten Fall han delt es sich vorzugsweise um die Fusionierung von einer B- Zelle (Lymphozytensubtyp) mit einer Myelomazelle.

Zur Erläuterung ist ferner zu berücksichtigen, daß ein Tumor eine Zellansammlung mit folgenden Charakteristika ist:

a) ungeregeltes Zellwachstum,
b) ungeregelte Zellmigration (Metastasen)
c) "Unsterblichkeit" (besser "Längstlebigkeit"),
d) teilweises Verschwinden von ursprünglichen Zelleigen schaften zugunsten neuer, und
e) Abstammung aller Zellen von einer einzigen entarteten Zelle (Clonalität).

Ein Myeloma ist ein Tumor einer B-Zelle, der mit den genann ten Eigenschaften (a-e) ausgestattet ist.

Zum besseren Verständnis vorliegender Erfindung sei ferner angeführt, daß eine B-Zelle einen einzigen Antikörper produ ziert. Viele B-Zellen produzieren viele verschiedene Anti körper (= Immunoglobuline sind die Fraktion von Proteinen in der Plasmaelektrophorese, die alle Antikörper enthalten).

Da per definitionem alle Tumorzellen von einer Zelle abstam men, produzieren sie nur einen Antikörper (M-gradient in der Plasmaelektrophorese dieser Patienten).

Diese Eigenschaften werden bei der Fusion auf eine normale Spender-B-Zelle übertragen. Daher spricht man von monoklona len Antikörpern (mAk). "Mono" bedeutet hierbei "von einem Typ" und "clonale" bedeutet "von einer Zelle abstammend".

Die im Zusammenhang mit der Erläuterung der Fig. 5A erwähnte Tumor- bzw. Myelomazelle 9 kann beispielsweise aus der Mye loma-Zellinie X63-AG8 von Balb-C Mäusen stammen, die kommer ziell erhältlich ist. Derartige Myelomazellen können im Rah men vorliegender Erfindung als Fusionspartner Verwendung finden.

Zur ergänzenden Offenbarung und Erläuterung wird auf die auf der nächsten Seite zusammengefaßte Tabelle von Begriffsdefi nitionen verwiesen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern (13) mit folgenden Verfahrensschritten:

a) Transplantieren einer menschlichen Stammzelle (1) ei nes spezifischen menschlichen Spenders in einen Em bryo (2) eines ersten tierischen Lebewesens (3);
b) Transplantation einer tierischen Stammzelle (4) eines Spenders (10) und einer menschlichen Stammzelle (1') des spezifischen menschlichen Spenders in einen Em bryo (5) enes zweiten tierischen Lebewesens (6);
c) Injizieren eines Antigens (7) zur Immunstimulation des nach der Transplantation gemäß Schritt (a) gebo renen ersten toleranten tierischen Lebewesens (14);
d) Isolieren von humanen Antikörper produzierenden B- Zellen (8) aus dem ersten toleranten Lebewesen (14);
e) Fusion der B-Zellen (8) mit Tumor-Zellen (9), insbesondere Myeloma-Zellen, eines die Stammzellen (4) gemäß Verfahrensschritt (b) spendenden Lebewesens (10) zur Erzeugung von Hybridomazellen (11);
f) Injizieren der Hybridomazellen (11) in das nach Transplantation gemäß Schritt b. geborene zweite zweifach tolerante tierische Lebewesen (12);
g) Isolation der monoklonalen humanen Antikörper (13) aus der entstandenen Aszites (15), dem entstandenen Blutserum, der produzierten Milch oder den gelegten Eiern des zweiten zweifach toleranten tierischen Lebewesens (12).

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als erstes und zweites tierisches Lebewesen (3 bzw. 6) Schafe oder Kühe oder Hühner verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich net, daß als Spender (10) eine Maus des Inzuchtstammes Balb-C verwendet wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß nach der Geburt des ersten und zweiten toleranten Lebewesens (12, 14) der tolerante Zustand überprüft wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß als Antigene (7) insbesondere Malaria, TBC, Rabies, Tumore, Tetanus und HIV verwendet werden.

6. Verfahren zur Herstellung von maus-monoklonalen Antikör pern mit folgenden Verfahrensschritten:

a) Transplantieren einer Stammzelle (FLZ) eines Maus- Spendertieres (M) in ein Embryo (E) eines tierischen Lebewesens (T);
b) Injizieren von Hybridomazellen (HC) des Maus-Spen dertieres (M) in das nach der Transplantation gemäß Schritt a. geborene maus-tolerante tierische Lebewe sen (C); und
c) Isolation von maus-monoklonalen Antikörpern (mAb) aus der entstandenen Aszites (ASC), dem entstandenen Blutserum, der produzierten Milch oder der gelegten Eier des maus-toleranten Lebewesens (C).

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als tierisches Lebewesen Schafe oder Kühe oder Hühner verwendet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeich net, daß als Spender eine Maus des Inzuchtstammes Balb-C verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch ge kennzeichnet, daß nach der Geburt des toleranten Lebe wesens der tolerante Zustand überprüft wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Antigene insbesondere Malaria, TBC, Rabies, Tumore und HIV verwendet werden.