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Verfahren zur Züchtung von im Menschen- und Tierkörper parasitisch
vegetierenden Kleinlebewesen Die Erfindung bezieht sich auf die Züchtung von Kleinlebewesen,
insbesondere Erregern von Geschwülsten, unter Mitwirkung von sogenannten Zwischenwirten.
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Es ist bereits bekannt, derartige Erreger dadurch zu züchten, daß
eine Reinkultur einer geeigneten niederen Pflanze, z. B. von Mukor, auf einem sterilen
Nährboden hergestellt und Sporen dieser Kultur auf Tumorstückchen übertragen werden,
wodurch man zu Stammkulturen gelangt, welche den Mukor und in ihm vegetierend den
Erreger enthalten. Durch i berimpfung derartiger Stammkulturen auf geeignete Nährsubstrate
kann man alsdann größere Mengen von aus Mukor und Parasit bestehenden Kulturen züchten.
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Nach vorliegender Erfindung gelangt man zu erheblich besseren Ergebnissen,
und zwar dadurch, daß man die Zwischenwirte, z. B. niedere Pflanzen o. dgl., wie
z. B. Mukor racemosus, Mukor mucedo, Hefen usw., in natürliche oder auch künstlich
erzeugte Krankheitsherde selbst, z. B. in Tumoren, einführt, sie eine gewisse Zeit
in den Gewächsen beläßt, so daß sie mit Kleinlebewesen, Virusarten, Agens u. dgl.,
beladen werden können, worauf die niederen Pflanzen zusammen mit den zu züchtenden
Kleinlebewesen durch geeignete Methoden aus den Krankheitsherden gezüchtet und dann
gegebenenfalls auf Reinkulturen weiterverarbeitet werden können. Für die Durchführung
des vorliegenden Verfahrens in vivo kommen natürlich nur tierische Tumoren u. dgl.
in Betracht. Der Zwischenwirt, z. B. Mukor, kann für sich in den Krankheitsherd
eingeführt werden, woselbst er mit bereits dort befindlichen Erregern beladen wird.
Man kann aber auch außer dem Zwischenwirt, z. B. Mukor, noch Erregerkulturen, und
zwar -entweder getrennt von dem Zwischenwirt oder mit diesem zusammen, in den Krankheitsherd
einführen. Vorteilhaft verfährt man z. B. so, daß man den bereits z. B. mitt einem
krebserregenden Agens infizierten Zwischenwirt in den Tumor einspritzt. In diesen
Fällen wird die Virulenz und die Affinität der in den Krankheitsherd eingeführten
Kulturen zur menschlichen und tierischen Körperzelle beträchtlich gesteigert.
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Die in den Krankheitsherd eingeführten Pilzsporen, Hefen o. dgl. vermögen
sich eine gewisse Zeit in dem Tumor zu erhalten, wobei sie durch im Krankheitsherd
befindliche Erreger neu infiziert werden. In Fällen, in welchen außer dem Zwischenwirt
noch Erregerkulturen in den Krankheitsherd eingeführt worden sind, werden diese
zugleich infolge ihrer Virulenz verstärkt. Man kann nun z. B. derart verfahren,
daß man den behandelten Tumor oder Teile desselben vor Ablauf von Zeiträumen, innerhalb
welcher der Zwischenwirt sich zu erhalten vermag, z. B. vor Ablauf von 8 Tagen (z.
B. nach q. bis 6 Tagen), operativ entfernt, die Tumormasse zerkleinert und die einzelnen
Stückchen auf geeignete Nährböden, z. B. 'Zuckerbouillon oder Zuckerbouillonagar,
bringt. Bei geeigneter Temperatur, z. B. 'Zimmertempe-
Tatur, entwickelt
sich alsdann wieder der Zwischenwirt, z. B. Mukor (Hefen brauchen zum Wachsen etwas
höhere Temperaturen), welcher nun die virulenten Parasiten aus dem Krankheitsherd
enthält. Es gelingt alsdann, den Zwischenwirt plus Parasiten weiterzuzüchten unter
Erzielung sehr virulenter Kulturen.
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Läßt man die Sporen, Hefe o. dgl. längere Zeit in dem Krankheitsherd
(Tumor), so werden diese abgebaut, wobei die in den niedrigen Pflanzen befindlichen
Parasiten in den Krankheitsherd übertreten. Durch längeren, z. B. 2- bis 4wöchigen
Aufenthalt der Parasiten in der Geschwulst wird ihre, Virulenz, da sie jetzt unter
natürlichen biologischen Verhältnissen leben, sehr erheblich gesteigert und ihre
Affinität zur tierischen und menschlichen Zelle erhöht. Nachoperativer Entfernung
der Geschwulst oder eines. Teiles derselben ist es dann möglich, die in die Geschwulst
übergetretenen Parasiten in hochvi2ulentem Zustand wieder von der Geschwulstsubstanz
zu trennen und auf geeignete Nährböden .allein oder auch wieder in Gemeinschaft
mit geeigneten Zwischenwirten (niederen Pflanzen) weiterzuzüchten. In gegebenen
Fällen kann man auch derart verfahren, daß man mit Erregern infizierte Zwischenwirte
in den Krankheitsherd einführt, nach Abbau dieser Zwischenwirte und Virulenzsteigerung
der Erreger neue Zwischenwirte einführt und diese dann, nachdem sie durch die im
Krankheitsherd befindlichen hochvirulenten Erreger infiziert worden sind, zusammen
mit diesen aus der Geschwulst gewinnt und weiterzüchtet.
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An Stelle der Verwendung von ,auf natürlichem Wege entstandenen Krankheitsherden
kann man auch solche künstlich erzeugen, indem man das Tier mit geeigneten Erregerkulturen
behandelt und die hierdurch entstandenen Krankheitsherde (Tumoren) im Sinne der
Erfindung nutzbar macht.
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Nach einer Ausführungsform der Erfindung kann das Verfahren auch in
vitro durchgeführt werden, derart, daß man künstlich am Leben und im Wachstum gehaltene
Zellen im Sinne der Erfindung behandelt. Man bringt z. B. ein kleines Stückchen
eines malignen Gewebes (Tumorgewebes), das von Begleitbakterien möglichst frei ist,
in Ringersche Lösung oder ähnliche Substanz. Bei geeigneten Temperaturen, z. B.
3;" C, entwickeln sich die Zellen eine Zeitlang, z. B. 4 bis 6 Wochen oder länger,
unter Bildung neuer Zellen weiter. In diese Zellengebilde kann man im Sinne der
Erfindung einen Zwischenwirt, z. B. Muko@r, oder einen Zwischenwirt und .außerdem
eine Erregerkultur, zweckmäßig einen mit Erregern bereits beladenen Zwischenwirt,
einführen und aus dem Gewebe den Zwischenwirt in Symbiose mit virulenten Erregern
oder auch letztere für sich allein wiedergewinnen. Geeignete Methoden zur Züchtung
der aus den Krankheitsherden gewonnenen oder in virulenter Form wiedergewonnenen
Erreger sind u. a. in der Patentschrift 480 3 10, K1. 3oh, beschrieben.
Man kann z. B. derart verfahren, daß aus einem mit infiziertem oder nichtinfiziertem
Mukor behandelten Tumor nach 3 bis 8 Tagen ein Stückchen operativ entfernt und unter
Vermeidung von Sekundärinfektion in :etwa a mm große Stückchen geschnitten wird.
Jedes dieser Stückchen bringt man alsdann in einen geeigneten Nährboden, z. B. Peptonzuckerbouillon,
worauf man die Kulturen, nachdem sie mit Watte derart verpfropft sind, daß ein genügender
Zutritt von Sauerstoff gewährleistet ist, bei; Temperaturen zwischen 1a bis 2o°
C beläßt. Nach einigen Tagen entwickelt sich aus dem Tumorstückchen der Mukor, welcher,
da er ein großes Sauerstöftbedürfnis hat, mit dem Tumorstückchen an die Oberfläche
steigt. Bei fortschreitender Mycelentwicklung sproßt der Mukor, wobei Sporangien
und schließlich Sporen gebildet werden, über die Flüssigkeit hinaus. Die Parasiten
wandern während der Entwicklung aus den in das Tumorstückchen eingedrungenen infizierten
Sporn in die Mycelfäden und von diesen in die Sporangien und infizieren immer wieder
die Sporen von neuem. Durch überimpfen infizierter Sporen auf neue Nährsubstrate
kann man den Vorgang wiederholen. Der Parasit, der im Verlaufe von 14 Tagen bis
4 Wochen in dem Mukor einen vollständigen Entwicklungsgang durchgemacht hat und
sich ungeheuer vermehrt hat, kann nun nach üblichen Methoden gewonnen und gegebenenfalls
in Reinkultur gezüchtet werden.
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Kurz zus,ammengefaßt besteht nach allem das Wesen der vorliegenden
Erfindung darin, daß die Bildung der Symbiose zwischen; der niederen Pflanze und
dem Erreger innzrhalb eines natürlichen oder eines künstlich erzeugten Krankheitsherdes
stattfindet.
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Es ist zwar, wie eingangs bereits ausgeführt, bekannt, daß man Symbiosen
von niederen Pflanzen mit Krankheitserregern dadurch herstellen kann, daß man Sporen
der niederen Pflanzen, z. B. Schimmelpilzsporen, auf krankes Gewebe, z. B. auf Tumorstückchen,
in <<itro überträgt und sich hier entwickeln läßt. 1=s hat sich aber gezeigt,
daß ,es bei diesem Verfahren nur schwer gelingt, Kulturen von hoher Virulenz zu
erhalten, wie sie aber zur Gewinnung von Präparaten zu therapeutischen Zwecken notwendig
ist, und daß die Parasiten zeitweise überhaupt nicht in die Pilzsporen einwandern,
und so die beabsichtigte
Infektion mit den Pilzsporen nicht eintritt
und die erwünschte Symbiose nicht zustande kommt. Demgegenüber ist es als durchaus
neuartige Regel und als ein von besonderem Erfolg begleitetes Verfahren zu bezeichnen,
wenn gemäß vorliegender Erfindung die als Zwischenwirte dienenden niederen Pflanzen,
gegebenenfalls in Gegenwart von Erregern bzw. bereits infizierten niederen Pflanzen,
unmittelbar in einen bereits bestehenden Krankheitsherd eingeführt werden. Hierdurch
ist, weil hier (bei 3; bis 38- C) weit natürlichere Verhältnisse vorliegen, die
Einwanderung der Parasiten, z. B. Geschwulsterreger, und die Weiterentwicklung der
entstandenen Symbiose sowie die Weiterzüchtung in unmittelbarer Gegenwart der Nährstoffe
des lebenden tierischen Körpers gewährleistet, wobei die Virulenz der Parasiten
nicht nur nicht geschädigt, sondern durch die eingetretene Symbiose und den vorübergehenden
Auf--ntliaIt im Krankheitsherd erheblich erhöht wird. Das vorliegende Verfahren
eignet sich daher besonders zur Herstellung von hochvirulenten Reinkulturen z. B.
dadurch, daß die als Brutstätten herangezogenen Tumoren erst nach Abbau der eingeführten
Zwischenwirte ganz oder teilweise entfernt werden. Bei. dem bereits mehrfach erwähnten
bekannten Verfahren müssen die von Parasiten bewohnten Pflanzenteile in den tierischen
Körper subkutan injzierbar und hier resorbierbar sein und muß die niedere Pflanze
im tierischen Gewebe wenigstens vegetieren können, ohne ihre Lebensfähigkeit einzubüßen.
Die niedere Pflanze muß bei diesem Verfahren diese Voraussetzungen deswegen erfüllen,
weil bei der Immunisierung von Lebewesen gegen ciie betreffenden Krankheiten infolge
der Unvollkommenheiten dieses Verfahrens Pflanzenteile bzw. Erreger enthaltende
Pflanzenteile zusammen mit diesem in einen Organismus eingespritzt werden mußten,
wobei ein plötzliches Absterben der Wirtspflanze ungünstig hätte wirken können.
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Bei dem vorliegenden Verfahren erfolgt dagegen die Einführung der
niederen Pflanzen gegebenenfalls in Gegenwart von Erregern oder bereits infizierten
niederen Pflanzen nicht zum Zwecke der Immunisierung des betrettenden gesunden tierischen
Körpers, sondern zum Zwecke der Weiterzüchtung der Kleinlebewesen unter den virulenzerliöhenden
Bedingungen eines bereits vorhandenen Krank-Ileitsherdes. Auch war es bei dem Stande
der Technik zur Zeit des Bekanntwerdens vorerwähnten bekannten Verfahrens nicht
bekannt, daß man niedere Pflanzen oder einen Zwischenwirt und eine Erregerkultur,
zweckmäßig einen mit Erregern beladenen Zwischenwirt, auf zwar dein Körper entnommene,
aber in vitro Ge-@en<<; art Ringerscher Lösung weitergezüchtete -t'um;,rstüclcchen
zum Zwerke der Erhöhung bzw. Wiederherstellung der Virulenz übertragen kann. Für
das erwähnte bekannte Ver-Ea.hren wurde lediglich vorgeschlagen, den Mukor zu infizieren,
indem man seine Sporen mittels geglühter Platinöse auf ein in sterilem Kulturglas
befindliches Tumorstückchen aufträgt und sich hier bei Zimmertemperatur entwickeln
läßt. Ein sich selbst überlassenes Tumorstückchen kommt aber nach kurzer Zeit zum
Absterben, wenn -es nicht in besonderer Weise, z. B. durch Gegenwart Ringerscher
Lösung, am Leben erhalten und weiterentwickelt wird, was nach den oben gemachten
Angaben 4. bis 6 Wochen oder länger durchgeführt werden kann. Es ist ohne weiteres
ersichtlich, daß nur unter diesen Bedingungen die angestrebte Virulenzerhöhung bzw.
Virulenzwiederherstellung in genügendem Ausmaß eintreten kann.