WO1998058963A1 - Verfahren zur herstellung polyklonaler und monoklonaler antikörper - Google Patents

Verfahren zur herstellung polyklonaler und monoklonaler antikörper Download PDF

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WO1998058963A1
WO1998058963A1 PCT/EP1998/003844 EP9803844W WO9858963A1 WO 1998058963 A1 WO1998058963 A1 WO 1998058963A1 EP 9803844 W EP9803844 W EP 9803844W WO 9858963 A1 WO9858963 A1 WO 9858963A1
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Georg S. Wengler
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Wengler Georg S
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0271—Chimeric vertebrates, e.g. comprising exogenous cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals

Definitions

  • the invention relates to a method for using an animal life according to claim 1 and in particular to a method for producing human and mouse monoclonal antibodies using at least one animal being according to claims 10 and 15 and a bioreactor according to claim 20.
  • mice rats and rabbits are most commonly used for animal experiments, followed by dogs, sheep, goats and primates. The smaller the animal, the cheaper the cost of keeping it. In addition, breeding times are usually shorter for small animals. Advanced techniques, such as transgenic systems, have mainly been developed for mice (see for example DE 3301249 C2).
  • mice The disadvantage of the tests using mice is the large gap in the evolutionary origins of humans and mice. Therefore, many results obtained in experiments using mice are only an indication, but do not prove the exact transferability to humans.
  • a method for using an animal for producing monoclonal antibodies and / or testing human growth actuators and / or producing human immunoglobulms and blood components and / or producing polyclonal antisera and / or testing potential To create vaccines against infections, especially HIV infections, which enables relatively simple test and manufacturing conditions with high efficiency and reproducibility This problem is solved by the features of claim 1.
  • Claim 10 defines a particularly preferred embodiment of the present invention as a method for producing human onoclonal antibodies
  • Claim 1 teaches the use of an animal for different manufacturing and test methods, which has a tolerance to human cells due to the transplantation of a human or animal stem cell into a fertilized egg of the animal. This treatment is not an exchange of genetic material or a genetic manipulation
  • tissue cells, organs
  • transplantation of tissue has two major problems.
  • HLA tissue type
  • the donor attacks tissue from the Recipient.
  • What "self” means, each individual learns in an organ (the thymus) in the first phase of its development (in mammals in the first third of pregnancy). Everything that is not “self” later is qualified as “not self” (ie “foreign”) (with a few exceptions).
  • cell culture any type of cell culture (such as cell hybrid) and tissue.
  • any species could be considered as a recipient, that is, as an animal, in particular however, sheep, goat, rabbit, cow and chicken are preferred.
  • any species would also be conceivable as a donor of the cells to be transferred, but preferably humans, mice, cell cultures, hybridos and chicken.
  • the use of the horse and the sheep as an animal or recipient is particularly preferred.
  • the anatomical situation of the sheep during pregnancy allows the fetus to be manipulated under ECHOKON ⁇ TROLLE at an early stage.
  • Conducting an echo controlled Fetalmanipulation in sheep (but also the hare or the egg of a chicken) faces be ⁇ are known methods (eg peritoneal and uterine opening) a minimal intervention, the lightly loaded the animal as a receiver.
  • the present invention therefore also considered to protect the animal in the implementation of OF INVENTION ⁇ to the invention process as much as possible the effort.
  • Another preferred recipient is the rabbit, since its pregnancy physiology is much closer to that of the primate than that of the sheep. There is also the advantage of high reproducibility and a short pregnancy.
  • the cow as the recipient should be mentioned as particularly advantageous, since studies carried out within the scope of the invention have shown that the milk of the cow, for example when carrying out corresponding production steps, contains a large amount of antibodies (in unglobins) which are obtained by removing the milk can be obtained and processed in an extremely simple manner.
  • the egg would be (e.g. from Chicken to ostrich, which result in different sizes, different breeding times and different costs), because the entire fetal development takes place outside the mother's body.
  • Chicken eggs have a particularly short breeding time with low costs and easy keeping.
  • Monoclonal antibodies could be obtained from eggs which were later laid and which have a high content of immunoglobulins
  • another preferred method step is that after birth the recipient's tolerant state, preferably with molecular-biological methods or with the so-called FACS method (fluorescence activated cell sorting)
  • the method according to the invention takes advantage of the tolerance of the recipient (animal being) to carry out a large number of production and test methods.
  • the results of the tests can be transferred to humans in the case of transplantation of human stem cells
  • the tolerance does not change the fact that the living being to be used is an animal in which, for example, the transplantation of human atopoieic stem cells m utero (IUT) results in a tolerance due to an emerging relationship from blood cells of the recipient (such as the sheep) to those of the donor (human) from about 90% to 10% (animal to human blood) is produced
  • animal liver ⁇ system would be the implementation of an infection of human blood cells in the living beings with pathogens, such as HIV, malaria or Leish- Manea In such a case it would be possible new drugs and vaccines to a functioning human blood system, which is, however, present in a living animal
  • Another possibility according to the invention is the Hei position of specific oolyclonal immune sera (polyclonalei Immunoglobulins).
  • polyclonalei Immunoglobulins are the human blood cells in the tolerant animal organisms with specifi ⁇ rule antigens such as tetanus, rabies, etc., stimulates (ge ⁇ inoculated), indicating a specific immune reaction with formation of polyclonal immunoglobulins result has.
  • specifi ⁇ rule antigens such as tetanus, rabies, etc.
  • Another fundamental application that makes the method according to the invention possible is the mass production of mouse monoclonal antibodies.
  • such anti ⁇ body are obtained using mice, resulting in extremely small quantities but only per animal.
  • mouse hybridoma cells can now be injected mtrapentoneally without causing foreign body reactions.
  • the injected hybridoma cells multiply and begin with Formation of specific onoclonal antibodies This is clinically visible, for example, from the formation of an ascite.
  • the ascites contain hybridoma cells and serum fluid with the desired antibodies. The isolation of these antibodies from this fluid is possible using known methods.
  • the amount of ascites and thus the amount of antibodies to be obtained depends on the recipient, but is e.g. when using sheep or similarly large animals in the liter range and thus significantly higher than with the methods previously carried out with mice.
  • monoclonal antibodies could be obtained from the sheep's milk with the same isolation procedure, which contains a high level of immunoglobulins
  • the method according to claim 10 represents a further, particularly preferred application mode.
  • This relates to a method for producing human mono-ionic antibodies by producing a tolerance in animals, particularly a sheep or a cow, towards human beings
  • Cells by transplanting hematopoietic stem cells can stimulate the human immune system in the animal with any antigen (such as "alaria TBC, pabies, tumors, HIV, etc.) by subcutaneous in iz.erun ⁇ .
  • the result of the stimulation is that reactive B -Cells emerge, which are isolated and fused with immortal myelo cells.
  • the resulting hybrid orne can now m another, opposite animal which is tolerant to these myeloma cells are injected intraperitoneally. After injection, the cells grow and produce human human antibodies which can be removed, for example, from the ascites or milk or blood serum formed by suitable processes.
  • the inventive method according to claim 10 is therefore particularly advantageous in that it enables the production of human monoclonal antibodies in which high hopes are placed for the treatment of tumors. Since the inventive method can be used to produce human monoclonal antibodies, there are also Great advantages over the currently produced mouse antibodies, since they only work well in vitro.
  • the invention further relates to a bioreactor according to claim 20 and the subordinate claims 21 to 26 related thereto.
  • the present invention includes the term "bioreactor" to the extent that parts of animals which are kept alive with the aid of artificial life-supporting devices insofar as the body which has a tolerance to a donor has a functional blood circulation and a functional organ in which after injection of Hybridoma cells that elicit an antibody reaction, monoclonal antibodies can be generated.
  • this definition also includes a naturally living mammal or bird.
  • horses and sheep are particularly preferred, since particularly large amounts of antibodies can be produced in these animals.
  • the present invention thus encompasses both of the options explained above, the use of parts of the animal body which keep artificially alive has the advantage that the animal itself is dead, so that it no longer has any sensations, in particular pain sensations.
  • the use of parts of the animal body which keep artificially alive has the advantage that the animal itself is dead, so that it no longer has any sensations, in particular pain sensations.
  • pain in particular can be kept very low.
  • bioreactor is both the mouse-tolerant or the mouse / human-tolerant part of the animal body and the mouse or Mouse / human tolerant animal before injection of the antibody-causing hybridoma cells.
  • Figure 1 is a Pnnzipdargnagna for inducing To ⁇ leranz in an animal being
  • FIG. 2 shows a representation corresponding to FIG. 1 of a second possibility for inducing a tolerance in an animal being
  • F g 3 is a representation corresponding to FIGS. 1 and 2 of a third possibility for inducing a tolerance in an animal being,
  • 4A and 4B show a schematic diagram for the production of mouse mAb
  • 5A and 5B show a schematic diagram to explain a method for producing human monoclonal antibodies.
  • FIG. 1 schematically shows in a simplified manner how a tolerance can be induced by m utero transplantation of donor cells S in an embryo E of a carrier animal T.
  • the injection of donor cells S takes place in the first third of pregnancy, in which the foreign cells cannot yet be recognized as a foreign body by the embryo. Accordingly, an immune system is created that identifies the donor cell S injected in the first third as its own cells. An animal C is thus born that has the respective tolerance
  • FIG. 2 shows a second possibility of producing an animal with a certain tolerance.
  • a certain tolerance in this case it is a matter of tolerance induction in an egg of a bird (for example a chicken or ostrich).
  • the Er A also becomes the donor with the donor cells S vei see and then hatched
  • the result is a Animal in the form of a bird V, which shows the corresponding tolerance.
  • the method is preferably carried out under ultrasound control.
  • FIG. 3 An example of a fundamentally possible in vitro transplant is explained in FIG. 3.
  • artificial fertilization of the egg B with a sperm cell Z is first carried out.
  • Foreign cells for example hematopoietic stem cells HSC, are injected into the fertilized sperm cell B '.
  • the fertilized egg with the stem cells can then be injected into the womb of a carrier animal for the rest of the pregnancy. Again, an animal C with a tolerance corresponding to the injected cells is created.
  • FIGS. 4A and 4B A method for producing onoclonal mouse antibodies is shown schematically in FIGS. 4A and 4B.
  • the donor is a mouse, usually a mouse M from the inbred strain 3ald-C.
  • a carrier animal T for example sheep
  • fetal liver cells FLZ can be used in the embryo in the first third of pregnancy be implanted or injected.
  • birth there is an animal C that has a mouse tolerance
  • This animal C is used in accordance with the method steps in FIG. 4B to generate the monoclonal antibodies.
  • hybrid domains HC of the donor a mouse of the ⁇ aib-C inbred strain
  • the result is the growth of antibody-producing cells, which for example in the formation of an ascites ASC ze.gen From the liquid of the ascites (as well as from the blood ser ⁇ .'i and milk) the monoclonal mouse - Ant i -; Orpe r (mAK can be isolated.
  • the advantage of this method is above all n ⁇ aarin to see that the resulting amount of MAK we is considerably larger and the efficiency of the method according to the invention is markedly increased compared to previous methods in which only mice were used.
  • FIGS. 5A and 5B shows schematically a process for the preparation of human monoclonal antibodies ⁇ position 13 represents ⁇ provided. Mice from the Balb-C inbred strain and a human individual act as donors here.
  • the process is characterized first of all by the fact that two different tolerances have to be induced in two different animal organisms.
  • a mouse / human tolerance is generated with the help of animal stem cells 4 of a donor 10 and human stem cells 1 'in an embryo 5 of an animal being 6.
  • a living being 12 After birth, a living being 12 has arisen that has a double tolerance (mouse / human). (Fig. 5B)
  • a further animal 14 with a human tolerance is produced as shown in FIG. 5A.
  • a human stem line 1 is injected into an embryo 2 of another carrier animal 3.
  • the second animal 14 with a human tolerance arises.
  • a suitable antigen is injected 7 m into animal 14 with human tolerance.
  • the human part of the immune system of animal 14 to form human antibody-producing B-Zelier. 8 excited.
  • These B cells 8 are removed from the animal 14 and isolated and fused with tumor cells 9 (myelo a cells) of the donor 10.
  • the monoclonal antibodies 13 can now be obtained from the respective liquid, for example the ascites 15 shown in FIG. 5C, in a known manner
  • mice of the inbred strain Balb-C were used as animal donors, the cells of the original donor 10 (see FIG. 5B) cannot be distinguished from the cells of the other Balb-C mice since all are "quasi" genetically and phenotypically identical this is the result of the intensive inbred
  • the fusion of the human ⁇ union B cells with oen animal tumor cells 9 which originate also from Balb C mice 8 it is therefore sufficient that these cells 9 come from the Balb-C mice mentioned
  • the expected hybrid dome cells are cells which are produced by a cell fusion.
  • a ⁇ cell lymphocyte tissue
  • T J ⁇ PO is a cell collection with the following character ika
  • a myeloma is a tumor of a B cell that has the properties (a-e) mentioned.
  • mAb monoclonal antibodies
  • the tumor or myeloma cell 9 mentioned in connection with the explanation of FIG. 5A can originate, for example, from the Myeloma cell 1 X63-AG8 from Balb-C mice, which is commercially available.
  • Myelomazei ler. able. for use within the scope of the present invention as a fuse
  • the cells which contain the antibodies stimulated by the specific antigen are determined by testing.
  • a particular advantage of the method according to the invention can be seen in the fact that the number of cells that produce the corresponding specific antibodies is increased considerably by the excitation by a special antigen.
  • the test methods for determining the hybridoma cells that are specifically desired are known per se.
  • Ant igen A ⁇ molecules that react with antibodies. Their name results from their ability to produce antibodies. However, since some antigens cannot stimulate antibody production themselves, only those antigens that can induce antibody production are called immunogens.
  • Antibody molecules are generated in response to immunization with an antigen. They are the specific molecules of the human immune response and bind and neutralize phatogens or prepare them for uptake and destruction by pharocytes. The antibody molecule has a unique structure that enables it to bind to specific antigens. However, all antibodies have the same overall structure and are referred to collectively as immunoglobulins.
  • Mcncklonal mAK / mAb antibodies produced by a single antibody nucleus from B lymphocytes. Monoclonal antibodies are usually generated by the production of hybrid, antibody-forming cells from the fusion of myeloma cells with immune spleen cells.
  • B cells B cells or B lymphocytes is one of two main classes of lymphocytes.
  • the antigen receptor on E-cells which is sometimes referred to as the B cell receptor, is a cell surface immunoglobulin molecule. When activated by an antigen, E cells differentiate into cell-producing antibodies of the same specificity that the initializing receptor ha.
  • Myeloma cell tumor cell with B cell lineage Stem cells Basophilic cells as the first stage in leukocyte development.
  • Stem cells Stem cells, hematological cells with self-renewal and differentiation capacity; used in the clinic for hematopoietic reconstitution after radiation or chemotherapy (bone marrow transplantation).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verwendung eines tierischen Lebewesens zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern und/oder menschlichen Wachstumsfaktoren und/oder zur Produktion von menschlichen Immunglobulinen und Blutkomponenten und/oder zur Produktion von polyklonalen Antiseren und/oder zur Testung von potentiellen Vakzinen gegen Infektionen, bei dem durch Transplantation einer menschlichen oder tierischen Stammzelle in eine befruchtete Eizelle des tierischen Lebewesens eine intakte menschliche bzw. tierische Hämatopoese erzeugt wird.

Description

Verfahren zur Herstellung poly lonaler und monoklonaler antikörper
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verwendung eines tierischen Lebenwesens gemäß Anspruch 1 sowie insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von menschlichen und Maus-monoklona- len Antikörpern unter Verwendung zumindest eines tierischen Lebewesens gemäß Anspruch 10 bzw. 15 und einen Bioreaktor gemäß Anspruch 20.
Viele Strategien zur Diagnose und Therapie von menschlichen Erkrankungen basieren auf den Ergebnissen von Tierversuchen. Hierbei stehen verschiedene Versuchsmodelle zur Verfügung, um beispielsweise Fragen und Probleme der Pathogenese, der Empfindlichkeit von Diagnosetests , der Effizienz und der Sicherheit von Therapiemitteln und Impfstoffen zu untersuchen.
Am häufigsten werden für Tierversuche Mäuse, Ratten und Kaninchen sowie danach Hunde, Schafe, Ziegen und Primaten verwendet. Je kleiner das Tier ist, desto günstiger sind die Kosten für die Tierhaltung. Üblicherweise sind darüber hinaus bei Kleintieren die Züchtungszeiten kürzer. Hochentwickelte Techniken, wie beispielsweise transgene Systeme, sind hauptsächlich für Mäuse entwickelt worden (siehe beispielsweise DE 3301249 C2 ) .
Der Nachteil der Tests, bei denen Mäuse verwendet werden, ist der große Abstand in der evolutionären Herkunft von Mensch und Maus. Daher sind viele Resultate, die bei Versuchen unter Verwendung von Mäusen erzielt werden, lediglich ein Anhaltspunkt, beweisen jedoch nicht die genaue Übertrag barkeit auf den Menschen.
Im Hinblick auf die evolutionäre Nähe von nicht menschlichen Primaten zum Menschen wären in diesem Bereich die besten Möglichkeiten für Tiermodelle gegeben. Einschränkungen er geben sich jedoch durch die hohen Kosten und die gerade m diesem Bereich immer wieder entstehenden Diskussionen über die grundsätzlich mit Tierversuchen einhergehenden ethischen Probleme .
Diese Probleme bestünden natürlich erst recht bei Versuchen am Menschen, obwohl diese prinzipiell am erfolgverspre¬ chendsten wären.
Da ]edoch die moderne Medizin in ihren Diagnose- und Thera¬ pieverfahren aufgrund der Kenntnisse über viele genetische Erkrankungen große Fortschritte gemacht hat, besteht nach wie vor ein großes Bedürfnis, geeignete Forschungsmodelle zur Verfugung zu stellen.
Ein neues Modell zum Studium menschlicher Erkrankungen ba¬ siert auf der Verwendung von Schafen, in deren Fötus in utero menschliche Stammzellen transplantiert werden (Literaturnachweis: Flake AW, Harrison MR, Adzick NS , Zanjam ED : Transplantation of Fetal hematopoietic Stern Cells in Utero: The Creation of Hematopoietic Chimeras . Science 233: 776, 1986; Zanjani E, Almeida- Porada G, Flake A. Retention and Multilmeage Expression of Human Hematopoietic Stern Cells in Hu an-Sheep Chimeras. Stern Cells 13: 101, 1995) Bisher ist dieses Modell jedoch nur für Studien zur Unter¬ suchung der immunologischen Unreife eines Fötus und die Mög¬ lichkeiten für die Erzeugung einer Toleranz gegenüber men¬ schlichen Xenotransplantaten verwendet worden.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verwendung eines tierischen Lebewesens zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern und/oder Testung von menschlichen Wachstums aktoren und/oder Produktion von menschlicnen I munoglobulmen und Blutkomponenten und/oder Produktion von polyclonalen Antiseren und/oder Testung von potentiellen Vakzinen gegen Infektionen, insbesondere HIV- Infekc lonen , zu schaffen, das relativ einfache Test- und Herstellungsbedingungen mit hoher Effizienz und Reproduzierbarkeit ermog licht Die Losung dieser Aufgabe erfolgt durch die Merkmale des Anspruchs 1.
Die Unteranspruche 2 bis 9 haben vorteilhafte Weiterbildungen dieses Verfahrens zum Inhalt.
In Anspruch 10 ist als eine besonders bevorzugte Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung e n Verfahren zur Herstellung von menschlichen onoklonalen Antikörpern definiert
Neben den eingangs bereits erläuterten Grundlagen basiert die vorliegende Erfindung auf folgendem Konzept
Anspruch 1 lehrt die Verwendung eines tierischen Lebewesens für unterschiedliche Herstellungs- und Testverfahren, das aufgrund der Transplantation einer menschlichen oder tierischen Stammzelle in eine befruchtete Eizelle des tierischen Lebewesens eine Toleranz gegen menschliche Zellen hat. Es handelt sich bei dieser Behandlung nicht um den Austausch von genetischem Material oder um eine genetische Manipulation
Die Transplantation von Gewebe (Zellen, Organe) ist mit zwei wesentlichen Problemen konf ontiert.
a Host versus Graft Reaction (Empfanger/Spenαer -Reak lon)
Der Empfanger, soweit er nicht HLA- (Gewebetyp) iden isch ist, stoßt alles Fremde, wie beispielsweise Spenαerzel len oder Spenderorgane, ab Nachfolgend wird alles Fremde als "nicht -selbst " bezeichnet
b Graft versus Host Reaktion (Spender/Empfangei - Reakt lon)
Der Spender (vor allem Ly phozyten) greift Gewebe des Empfängers an. Was "selbst" (also "nicht - fremd" ) bedeutet, lernt jedes Individuum in einem Organ (dem Thymus) in der ersten Zeit seiner Entwicklung (bei Säugern im ersten Drittel der Schwangerschaft) . Alles was später nicht-"selbst" ist, wird als "nicht -selbst " (also "fremd") (mit einigen Ausnahmen) qualifiziert.
Mit der Einführung bzw. Transplantation von jeglicher Art von Zellen im ersten Drittel der Schwangerschaft in einen Fötus ist es jedoch möglich, dem Empfänger das trans- plantierte ("fremde") als "selbst" zu suggerieren, da der Fötus als Empfänger in dieser Zeit noch nicht dazu m der Lage ist, das Empfangene als "nicht-selbst " zu identifizieren.
Man spricht in diesem Fall von der zuvor bereits erwähnten "Toleranz" einem "nicht-selbst" Gewebe gegenüber. Mit dieser erreichten Toleranz kann man später z.B. Organe (wie Herz, Niere, Leber) vom selben Spender in den Empfänger verpflanzen, ohne jegliche Abstoßungsreaktionen zu provozieren.
Als Zellen, die gemäß Anspruch 1 transplantiert werden können, kommen folgende Zellen in Frage:
- Hematopoietische Stammzellen aus Knochenmark, Nabelschnur, Blut, fetaler Leber oder Milz und zirkulierende Blutstammzellen im peripheren Blutkreislauf;
- embryonale Stammzellen (wobei bis zu einem gewissen Stadium jede embryonale Zelle eine gewisse Omnipotenz zur Selbsterneuerung und Differenzierung besitzt),
- jegliche Art von Zellkulturen (wie Zellhybrido e ) und Gewebe .
Erf mdungsge aß käme als Empfänger, also als tierische Lebe wesen, grundsätzlich jegliche Spezies in Frage Besonders bevorzugt sind jedoch Schaf, Ziege, Hase, Kuh und Huhn.
Als Spender der zu übertragenden Zellen wäre grundsätzlich ebenfalls jede Spezies denkbar, vorzugsweise jedoch Mensch, Maus, Zellkulturen, Hybrido e und Huhn.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung des Pferdes und des Schafes als tierisches Lebewesen bzw. Empfanger gemäß Anspruch 1. Denn die anatomische Situation des Schafes wahrend der Schangerschaft läßt eine Manipulation des Fötus unter ECHOKON¬ TROLLE bereits zu einem frühen Zeitpunkt zu. Die Durchführung einer echokontrollierten Fetalmanipulation am Schaf (jedoch auch am Hasen oder am Ei eines Huhnes) stellt gegenüber be¬ kannten Verfahren (z.B. Bauchhöhlen- und Uterusöffnung) einen minimalen Eingriff dar, der das Tier als Empfänger nur wenig belastet. Die vorliegende Erfindung berücksichtigt somit auch das Bestreben, das Tier im Rahmen der Durchführung des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens soweit als möglich zu schonen. Darüber hinaus ergibt sich der Vorteil, daß die Manipulation am Fötus dessen ansonsten normale Entwicklung und Sterblichkeit, wenn überhaupt, nur gering beeinträchtigt.
Als weiterer bevorzugter Empfänger ist der Hase zu nennen, da seine Schwangerschaftsphysiologie dem Primaten noch wesentlich naher ist als die des Schafes. Ferner ergibt sich der Vorteil einer hohen Reproduktivität und einer kurzen Schwangerschaftszeit .
Die Kuh als Empfänger ist insofern als besonders vorteilhaft zu nennen, da im Rahmen der Erfindung durchgeführte Untersuchungen ergeben haben, daß die Milch der Kuh, beispiels weise bei Durchführung entsprechender Herstellungsschritte , in hohem Maße Antikörper ( Im unglobine) enthält, die durch Entnahme der Milch auf äußerst einfache Weise gewonnen und weiterverarbeitet werden können.
Für eine Massenproduk ion wäre das Ei (beispielsweise von Huhn bis Strauß, die verschiedene Großen, verschiedene Brutzeiten und unterschiedlich hohe Kosten ergeben) gut geeig net, da die gesamte Fetalentwicklung außerhalb des mutterlichen Körpers stattfindet Hühnereier weisen hierbei eine besonders kurze Brutzeit mit geringen Kosten und leichter Haltung auf. Die Gewinnung von monoclonalen Antikörpern konnte aus spater gelegten Eiern erfolgen, die einen hohen Gehalt an Immunoglobulinen aufweisen
Neben den zuvor bereits erläuterten Schritten der Isolierung oder Züchtung von zu injizierenden Spenderzellen und der Transplantation dieser Zellen innerhalb des ersten, vorzugsweise gegen Ende des ersten Drittels der Schwangerschaft mtraperitoneal in den Fötus (Empfanger) st als weiterer bevorzugter Verfahrensschritt zu nennen, daß nach der Geburt des Empfangers dessen toleranter Zustand, vorzugsweise mit molekular-biologischen Methoden oder mit der sogenannten FACS-Methode (Fluoreszenz Activated Cell Sortmg), bestätigt
Insoweit zusammenfassend ist festzuhalten, daß sich das er- f indungsgemaße Verfahren die erzeugte Toleranz des Empfangers (tierischen Lebewesens) zu Nutze macht, um eine Vielzahl von Herstellungs- und Testmethoden durchzufuhren Die Ergebnisse der Tests können im Falle der Transplantation menschlicher Stammzellen auf den Menschen übertragen werden Hierbei ergibt sich der besondere Vorteil, daß die Toleranz nichts an dem Umstand ändert, daß das zu verwendende Lebewesen ein Tier ist, bei dem beispielsweise durch die Trans plantation von menschlichen he atopoie ische Stammzellen m utero ( IUT) eine Toleranz durcn ein entstehendes Verhältnis von Blutzellen des Empfangers (wie beispielsweise des Scha fes) zu denen des Spenders (Mensch) von ca 90 % zu 10 % (tierisches zu menschliches Blut) hergestellt wird
Untei diesen Bedingungen kann das tierische Lebewesen im Rahmen αes erf indungsgemaßen Verfahrens bzw der erfinαungs gemäßen Verwendung, wie folgt, eingesetzt werden
Testung verschiedenster Wachstumsfaktoren für die mensch¬ liche Blutbildung (wie Colony Stimulatmg Factor CSF. G- CSF, GM-CSF, und Interleukine IL-3, SCF, IL-6, IL-7, IL-12 ) Der besondere Vorteil bestünde darin, daß das einen menschlichen Blutanteil aufweisende Tier unmittelbar zur Testung herangezogen werden konnte, ohne daß weitere vorbereitende Maßnahmen durchgeführt werden mußten Somit konnte beispielsweise überprüft werden, ob die menschliche Blutbildung als Ganzes von 10 % auf einen höheren Prozent satz gebracht werden konnte, oder ob nur einige Linien wie Granulozyten oder Lymphozyten, steigerungsfahig sind
Eine weitere Möglichkeit der Verwendung des tierischen Lebe¬ wesens gemäß Anspruch 1 bestünde in der Durchfuhrung einer Infektion von menschlichen Blutzellen in diesem Lebewesen mit Erregern, wie beispielsweise HIV, Malaria oder Leish- manea In einem solchen Fall wäre es möglich, neue Medikamente und Impfstoffe an einem funktionierenden menschlichen Biutsyste , das jedoch in einem lebenden Tier vorliegt, zu testen
Eine weitere Testungsmoglichkeit von Medikamenten für Tumor oder Leukamiezellen konnte ebenfalls an dem Tier gemäß An spruch 1 durchgeführt werden
Ferner ergibt sich die Möglichkeit der Herstellung von menschlichen (oder tierischen) Blutprodukten, wie I unglobul ine (die von B Zellen erzeugt werden) oder Interleukine oder hematopoiet ische Wachstums aktoren Das Hauptproblem menschlicher Blutprodukte aus Spenderblut, αie Gefahr von Infekten mit HIV, HBV, HCV etc konnte hierbei erf indungsgemaß vorteilnaf erweise umgangen werden
Eine weitere er f indungsgemaße Möglichkeit ist die Hei Stellung spezifischer oolyclonaler Immunseren (polyclonalei Immunglobuline) . Zur Durchführung dieses erfindungsgemäßen Verfahrens bzw. Verwendungszweckes werden die menschlichen Blutzellen im toleranten tierischen Lebewesen mit spezifi¬ schen Antigenen, wie Tetanus, Rabies usw., stimuliert (ge¬ impft) , was eine spezifische Immunreaktion mit Bildung von polyclonalen Immunglobulinen zur Folge hat. Hiermit könnten die gleichen Probleme wie bei der zuvor erläuterten Anwendungsmöglichkeit ausgeräumt werden, da bisher die genannten Immunglobuline zur passiven Immunisierung nach erfolgter Infektion ohne Erstschutz angewendet werden und von Personen mit durchgemachter Infektion aus deren Seren gewonnen werden müssen.
Eine weitere grundsätzliche Anwendung, die das erfindungs¬ gemäße Verfahren möglich macht, ist die Massenproduktion von maus-monoklonalen Antikörpern. Bisher werden derartige Anti¬ körper unter Verwendung von Mäusen gewonnen, was jedoch nur äußerst geringe Quantitäten pro Tier ergibt.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Anspruch 15 ist es möglich, eine Toleranz gegenüber Maus-Zellen bei einem anderen tierischen Lebewesen, wie beispielsweise einem Schaf oder Pferd, zu erzeugen, mit dem Ziel, die Menge an gewonnenen maus-monoklonalen Antikörpern erheblich zu erhohen.
Hieroei bestehen grundsätzlich drei Möglichkeiten, eine Toleranz zu erzeugen:
- Durchführung einer in utero ( intrauterinen) Transplanta tion von Hybπdomzellen, die monoklonale Antikörper produzieren, direkt in den Embryo, beispielsweise des Schafes, hierbei besteht allerdings eine gewisse Gefahr einer tumcralen Liberwucherung des Embryos,-
- eine in utero Transplantation von vor der Injektion bestrahlten Hybndomzellen , die monoklonale Antikörper pro duz eren, so daß diese Hybndomzellen nicht mehr tei lungsfahig, jedoch noch toleranz - induz lerfähig sind,
- Erzeugung der Toleranz durch Transplantation von fetaler Leber aus Embryos des Balb-C-Maus - Inzuchtstammes .
Nach der Transplantation und nach der Geburt des durch die Transplantation mit der Toleranz versehenen Tieres, wie z B des Schafes, können nunmehr Maus-Hybridomzellen mtrapen- toneal injiziert werden, ohne daß es zu Fremdkörperreakti onen kommt Die injizierten Hybndomzellen vermehren sich und beginnen mit der Bildung spezifischer onoklonaler Anti korper Klinisch ist dies beispielsweise an der Bildung eines Aszites sichtbar Der Aszites enthalt Hybridomzelien und Serumflüssigkeit mit den gewünschten Antikörpern Die Isolierung dieser Antikörper aus dieser Flüssigkeit ist mit bekannten Methoden möglich. Die Menge von Aszites und damit die Menge der zu gewinnenden Antikörper hängt vom jeweiligen Empfanger ab, liegt jedoch z.B. bei Verwendung von Schafen oder ähnlich großen Tieren im Literbereich und somit wesentlich hoher als bei den bisher mit Mausen durchgeführten Verfahren. Weiteres konnten monoclonale Antikörper (mAK) mit demselben Isolierver ahren aus der Milch der Schafe gewonnen werden, die einen hohen Gehalt an Immunglobulinen enthalt
Eine weitere, besonders bevorzugte Anwendungsmogl ιch eι t stellt das Verfahren gemäß Anspruch 10 dar. Hierbei r.andelt es s ch um ein Verfahren zur Herstellung von menschlichen mono ionalen Antikörpern Durch die Erzeugung einer Toleranz im Tier insbesondere einem Schaf oαei einer Kuh, gegenüber menschlichen Zellen im Wege der Transplantation von hematopoiet ischen Stammzellen kann das menschliche Immunsystem im Tier mit jeglichem Antigen (wie z B "alaria TBC, Pabies, Tumore, HIV usw ) durch subkutane In iz.erunα stimuliert werden Die Stimulierung hat zur Folge, caß reaktive B-Zellen entstehen, die isoliert und mit unsterblichen Myelo Zellen fusioniert werden Die entstehenden Hvbridorne können nun m ein weiteres, gegenüber diesen Myelom-Zellen tolerantes Tier intraperitoneal injiziert werden Nach Injizierung wachsen die Zellen und produzieren humane menschliche Antikörper, die beispielsweise der entstandenen Aszites oder der Milch oder dem entstandenen Blutserum durch geeignete Verfahren entnommen werden können.
Dieses Verfahren ergibt gegenüber den bisher bekannten Verfahren, die bei der Produktion von monoklonalen Antikörpern auf Mause beschrankt sind, erhebliche Vorteile, da das spatere Wachstum von Hybridomen aus Maus und menschlichen Zellen (die Heterohybridome darstellen, vergleiche das zuvor genannte Patent DE 3301249 C2 ) in Kulturmedien noch mcnt unk ioniert .
Das erf mdungsgemaße Verfahren gemäß Anspruch 10 ist daher insofern von besonderem Vorteil, da es die Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern ermöglicht, in die zur Behandlung von Tumoren große Hoffnungen gesetzt werden Da mit dem erf indungsgemaßen Verfahren menschliche monoklonale Antikörper hergestellt werden können, ergeben sich ferner große Vorteile gegenüber den derzeit hergestellten Maus - Antikörpern, da diese nur in vitro gut funktionieren Bei der Anwendung von maus-monoklonalen Antikörpern maus mAb) im Menschen kommt es jedoch häufig zur Bildung von Ab- stoßungsreaktionen, da die maus mAb (Proteine) als "nicht- selbst" erkannt werden Mit dem erf indungsgemaßen Verfahre" körnte jedoch dieses Problem umgangen werden, da zuerst
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menschliche Toleranz induziert wird und anschließend das nenschliche Immunsystem zur Bildung von Antikörpern durch Ga von Tumorzellen angeregt >urd Somit ist die Erzeugung menschlichen monoclonale" Antikörpern unter Verwendung 3inc tierischen Lebewesens moαlich Die Erfindung betrifft ferner einen Bioreaktor gemäß Anspruch 20 und den darauf ruckbezogenen Unteranspruchen 21 bis 26.
Die vorliegende Erfindung erfaßt insoweit mit dem Begriff "Bioreaktor" Teile von Tieren, die unter Zuhilfenahme künstlicher lebenserhaltender Gerate insoweit am Leben erhalten werden, als der eine Toleranz gegenüber einem Spender aufweisende Korper einen funktionsfähigen Blutkreislauf und ein funktionsfähiges Organ aufweist, in dem nach Injektion von Hybridoma- zellen, die eine Antikorperreaktion hervorrufen, monoklonale Antikörper erzeugbar sind.
Diese Definition umfaßt jedoch auch ein auf natürliche Weise lebendes Saugetier oder einen Vogel. Bei den Saugetieren sind vor allem Pferde und Schafe besonders bevorzugt, da bei diesen Tieren besonders große Mengen an Antikörpern erzeugbar sind.
Die vorliegende Erfindung umfaßt mit der Definition "Bioreaktor" also beide zuvor erläuterte Möglichkeiten, wobei die Verwendung von künstlich am Leben erhaltenden Tierkorperteilen den Vorteil ergibt, daß das Tier an sich tot ist, so daß es keinerlei Empfindungen, insbesondere Schmerzempfindungen, mehr hat. Allerdings ist zu betonen, daß auch bei Verwendung von auf natürliche Weise lebenden Tieren insbesondere Leiden durch Schmerzen sehr gering gehalten werden können.
Klarzustellen ist in diesem Zusammenhang auch, daß die Definition "Bioreaktor" sowohl den Maus-toleranten bzw. den Maus/Mensch-toleranten Tierkorperteil sowie auch das Mausbzw. Maus/Mensch-tolerante Tier vor Injektion der eine Antikorperreaktion hervorrufenden Hybridomazellen umfaßt.
Weitere Einzelheiten, Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus nachfolgender Beschreibung anhand der Zeichnung. Es zeigt: Fig 1 eine Pnnzipdarstellung zur Induzierung einer To¬ leranz in einem tierischen Lebewesen,
Fig. 2 eine der Fig. 1 entsprechende Darstellung einer zweiten Möglichkeit zur Induzierung einer Toleranz in einem tierischen Lebewesen,
F g 3 eine den Fig. 1 und 2 entsprechende Darstellung einer dritten Möglichkeit zur Induzierung einer Toleranz in einem tierischen Lebewesen,
Fig 4A und Fig. 4B eine Pnnzipdarstellung zur Produktion von maus mAb; und
Fig 5A und 5B eine Pnnzipdarstellung zur Erläuterung eines Verfahrens zur Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern .
In Fig 1 ist schematisch vereinfacht dargestellt, wie eine Toleranz durch m utero Transplantation von Spenderzellen S m einem Embryo E eines Tragertieres T induziert werden kann Wie zuvor erläutert wurde, erfolgt die Injizierung \ on Spenderzellen S im ersten Drittel der Schwangerschaft, m dem die Fremdzellen vom Embryo noch nicht als Fremdkörper erkannt werden können Dementsprechend entsteht ein Immun syste , das die im ersten Drittel injizierten Spenderzelle- S als eigene Zellen iden i iziert Es wird mithin ein tierisches Lebewesen C geboren, das die jeweilige Toleranz hat
In Fig 2 ist eine zweite Möglichkeit zur Eizeugung eines Tieres mit einer bestimmten Toleranz dargestellt In diese- Fall nandelt es sich um die Toleranzinduz lerung in einem Ei eines Vogels (beispielsweise eines Huhnes oder Straußes) Das Er A wird hrerber ebenfalls mit den Spenαerzellen S vei sehen und anschließend ausgebrütet Das Ergebnis ist ein Tier in Form eines Vogels V, der die entsprechende Toleranz zeigt Vorzugsweise wird das Verfahren unter Ultraschall- kontrolle durchgeführt.
In Fig. 3 ist ein Beispiel für eine grundsätzlich mögliche in vitro Transplantation erläutert. Hierzu wird zunächst eine künstliche Befruchtung des Eis B mit einer Samenzelle Z durchgeführt. In die befruchtete Samenzelle B' werden Fremdzellen, beispielsweise hematopoietische Stammzellen HSC, injiziert Anschließend kann das befruchtete und mit den Stammzellen versehene Ei in die Gebärmutter eines Trägertieres für den Rest der Schwangerschaft injiziert werden. Wiederum entsteht ein Tier C mit einer den injizierten Zellen entsprechenden Toleranz.
In den Fig. 4A und Fig. 4B ist schematisch ein Verfahren zur Herstellung onoklonaler Maus-Antikörper dargestellt.
In Fig. 4A ist zunächst der Schritt der Toleranzerzeugung erläutert. Beim Spender handelt es sich in diesem Falle um eine Maus, üblicherweise eine Maus M des Inzuchtstammes 3ald-C Zur Erzeugung einer Maustoleranz im Embryo E eines Tragertieres T (z.B Schaf) können beispielsweise fetale Leberzellen FLZ in den Embryo im ersten Drittel der Scnwan- gerschaft implantiert bzw injiziert werden. Nach der Geburt liegt ein Tier C vor, das eine Maustoleranz aufweist
Dieses Tier C wird entsprechend den Verfahrensschritten in Fig 4B zur Erzeugung der monoklonalen Antikörper verwendet Hierf r werden Hybndomzellen HC des Spenders (einer Maus des Ξaib-C Inzuchtstammes) in das Tier C injiziert Das Resultat ist das Wachstum Antikörper produzierender Zellen, die ri h beispielsweise in dem Entstehen einer Aszites ASC ze.gen Aus der Flüssigkeit der Aszites (sowie aus dem Blut serι.'i und der Milch) können die monoklonalen Maus - Ant i -;orpe r (mAK isoliert werden Der Vorteil dieses Verfahrens ist vor allenι aarin zu sehen, daß die entstehende Menge an mAK we sentlich größer ist und somit die Effizienz des erfindungs- gemaßen Verfahrens gegenüber bisherigen Verfahren, bei denen ausschließlich Mäuse verwendet wurden, markant gesteigert ist .
In den Fig. 5A und 5B ist schematisch ein Verfahren zur Her¬ stellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern 13 dar¬ gestellt. Als Spender fungieren hier beispielhaft Mäuse des Balb-C Inzuchtstammes und ein menschliches Individuum.
Das Verfahren zeichnet sich zunächst dadurch aus, daß zwei verschiedene Toleranzen in zwei verschiedenen tierischen Lebewesen induziert werden müssen. Zunächst wird eine Maus/ Mensch-Toleranz mit Hilfe von tierischen Stammzellen 4 eines Spenders 10 und menschlichen Stammzellen 1' in einem Embryo 5 eines tierischen Lebewesens 6 erzeugt. Nach der Geburt ist ein Lebewesen 12 entstanden, das eine zweifache Toleranz (Maus/Mensch) hat. (Fig. 5B)
Entsprechend den zuvor erläuterten Prinzipien wird ein weiteres Tier 14 mit einer menschlichen Toleranz gemäß der Darstellung der Fig. 5A erzeugt. Hierzu wird eine menschliche Stammzeile 1 in einen Embryo 2 eines anderen Trägertieres 3 injiziert. Es entsteht, wie gesagt, das zweite Tier 14 mit einer menschlichen Toleranz.
Im nächsten Verfahrensschritt wird, je nach den zu erzeugenden monoklonalen Antikörpern, ein geeignetes Antigen 7 m das Tier 14 mit menschlicher Toleranz injiziert. Hierdurch wird der menschliche Anteil des I munsystems des Tieres 14 zur Bildung von humanen Ant ikorper-produzierenden B-Zelier. 8 angeregt. Diese B-Zellen 8 werden aus dem Tier 14 entnommen und isoliert und mit Tumorzellen 9 (Myelo a - Zellen) des Spenders 10 fusioniert Hierdurch entstehen (Mensch/Maus > Hyondomazellen 11, die in das Tier 12 mit zweifacher Toleranz (Mensch/Maus -Toleranz) injiziert werden. Dieses Tier 12 stoßt aufgrund seiner Toleranz die injizierten Hybriooma- zellen 11 nicht ab, sondern bildet vielmehr eine humane monoklonale Antikörper enthaltende Aszites 15, ein diese Antikörper enthaltendes Blutserum oder auch eine diese Anti- korper enthaltende Milch, wenn als Tier beispielsweise eine Kuh verwendet w rd
Aus der jeweiligen Flüssigkeit, beispielsweise der in Fig 5C dargestellten Aszites 15, können nunmehr die monoklonalen Antikörper 13 auf bekannte Art und Weise gewonnen werden
Zu den voranstehenoen Erläuterungen, insbesondere oem Verfahren gemäß den Fig 5A und 5B ist folgendes ergänzend her vorzuheben
Da bei der vorangehenden Erläuterung der Ausfuhrungsform gemäß den Fig 5A, 5B als tierische Spender Mause des Inzuchtstammes Balb-C verwendet wurden, sind die Zellen des ursprünglichen Spenders 10 (siehe Fig. 5B) nicht von den Zellen der anderen Balb-C Mause zu unterscheiden, da alle "quasi" genetisch und phenotypisch identisch sind Dies ist die Folge der intensiven Inzucht Bei der Fusion der mensch¬ lichen B-Zellen 8 mit oen tierischen Tumorzellen 9 die ebenfalls von Balb C Mausen stammen, ist es mithin ausreichend, daß diese Zellen 9 von den genannten Balb-C Mausen stammen
Wie zuvor erläutert wurde, handelt es sich bei den erwar-cen Hybndomzellen um Zellen die durch eine Zellfusion hergε stellt werden Im anhand der Fig 5A erläuterten Fall nan delt es sich vorzugsweise um die Fusionierung von einer Ξ Zelle ( LymphozvtensuDtvp) mit einer Myelomazelle
Zur Erläuterung st ferner zu berücksichtigen daß ein TJΓPO eine Zellansammlung mit folgenden Charakter ist ika -st
a) ungeregeltes Zel 1 Wachstum, b) ungeregelter Zellmigration (Metastasen) ,
c) "Unsterblichkeit" (besser "Längstlebigkeit " ) ,
d) teilweises Verschwinden von ursprünglichen Zelleigenschaften zugunsten neuer, und
e) Abstammung aller Zellen von einer einzigen entarteten Zelle (Clonalität) .
Ein Myeloma ist ein Tumor einer B-Zelle, der mit den genannten Eigenschaften (a-e) ausgestattet ist.
Zum besseren Verständnis vorliegender Erfindung sei ferner angeführt, daß eine B-Zelle einen einzigen Antikörper produziert. Viele B-Zellen produzieren viele verschiedene Antikörper (= Immunglobuline sind die Fraktion von Proteinen in der Plasmaelektrophorese , die alle Antikörper enthalten) .
Da per defimtionem alle Tumorzellen von einer Zelle abstammen, produzieren sie nur einen Antikörper (M-gradient in der Plasmaelektrophorese dieser Patienten) .
Diese Eigenschaf en werden bei der Fusion auf eine normale Spender - B - Zel le übertragen. Daher spricht man von monoklonalen Antikörpern (mAk) . "Mono" bedeutet hierbei "von einem Typ" und "clonale" bedeutet "von einer Zelle abstammend".
Die im Zusammenhang mit der Erläuterung der Fig. 5A erwähnte Tumor- bzw Myelomazelle 9 kann beispielsweise aus der Myeloma - Zel 1 mie X63-AG8 von Balb-C Mäusen stammen, die kommerziell erhältlich ist. Derartige Myelomazei ler. konner. im Rahmen vorliegender Erfindung als Fus lonspartr.er Verwendung f ir.den
Zur ergänzenden Offenbarung und Erläuterung wird -£ die auf der nächsten Seite zusammenge aßte Tabelle von Beαnffsde- finitionen verwiesen.
Zur ergänzenden Offenbarung ist ferner nachzutragen, daß nach Injektion des Antigens 7 (siehe Fig. 5A) und Fusionierung mit der Tumorzelle und nach im Labor durchgeführtem Wachstum durch Testung die Zellen ermittelt werden, die die durch das spezielle Antigen angeregten Antikörper enthalten. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemaßen Verfahrens ist hierbei darin zu sehen, daß durch die Anregung durch ein spezielles Antigen die Zahl der Zellen, die die entsprechenden spezifischen Antikörper produzieren, erheblich erhöht wird. Die Testungsverfahren zur Ermittlung der jeweils speziell gewünschten Hybridomazel- len sind an sich bekannt.
BEGRIFFSDEFINITON
Eeσri f f Abkürzung Def inition
Ant igen Aσ Moleküle, die mit Antikörpern reagieren. Ihr Name resultiert aus ihrer Fähigkeit, Antikörper zu erzeugen. Da jedoch manche Antigene nicht selbst die Antikörperproduktion anreizen können, werden nur die Antigene, die A-ntikörperpro- duktion induzieren können, als Immunogene bezeichnet.
An ikörper Ak/Ab Immunkörper; Reaktionsprodukte der (Antibcdy) Körperzellen auf die Reize der Antigene, gegen die sie spezifisch gerichtet sind. Plasmaproteine, die sich spezifisch an als Antigene bekannte Moleküle anlegen. Antikörper-Moleküle werden als Antwort auf die Immunisierung mit einem Antigen erzeugt. Sie sind die spezifischen Moleküle der menschlichen Immun- reaktion und binden und neutralisieren ' Phatogene oder bereiten diese zur Aufnahme und Zerstörung durch Phargozyten vor. Das Antikörper-Molekül hat eine einzigartige Struktur, die es ihm ermöglicht, sich an spezifische Antigene anzubinden. Alle Antikörper haben jedoch die gleiche Gesamtstruktur und werden insgesamt als Immunglobuline bezeichnet .
Mcncklonaler mAK/mAb Antikörper, die von einem einzelnen Antikörper Kern von B-Lymphozyten erzeugt werden. Monoklonale Antikörper werden üblicherweise durch die Herstellung von hybriden, Antikörper bildenden Zellen aus der Fusion von Myeloma- zellen mit immunen Milzzellen er- zeuσt .
B-Zellen B-Zellen oder B-Lymphzyten ist eine von zwei Hauptklasεεn von Lympho- zyten. Der Antigen-Rezeptor auf E- Zelien, der teilweise als B-Zell- Rezeptor bezeichnet wird, ist ein Zelloberflachen-Immunoglobulin-Molekül. Bei Aktivierung durch ein Antigen differenzieren sich E- Zellen in zellenproduzierende Antikörper der gleichen Spezifizität , die auch der initalisierende Rezeptor ha .
Balb-C-Maus Balb-C Bestimmter Maus -Inzuchtstamm Hämatopoese Bildung der zellularen Elemente des Blutes, inklusive der roten Blut- zellen, der Leukozyten und der Blutplättchen
Hybridoma Zelle, die durch Fusion einer spezifischen Antikörper produzierender. B-Zelle mit einer Myelomazelle entsteht .
Myelomazelle Tumorzelle mit B-Zellabstammung . Stammzellen Basophile Zellen als erste Stufe der Leukozytenentwicklung.
Stammzellen, hemato- logische Zellen mit Selbsterneuerungs- und Differenzierungskapazität; in der Klinik zur hematopoietischen Re- konstitution nach Bestrahlung oder Chemotherapie verwendet ( Knoche - markstransplantation) .
Toleranz Zustand spezifischer immunologischer Nichtreaktivität nach Kontakt mit einem normalerweise ar.tigenen Reiz (bei normaler Reaktion auf andere Antigene) .

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Verwendung eines tierischen Lebewesens
a. zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern und/oder
o. zur Produktion von Immunglobulinen und Blutkomponer.ter- und/oder
c. zur Produktion von polyklonaleπ Antikörpern (Antiseren) ,
oei dem der Verfahrensscnπt einer Transplantation einer menschlichen oder tierischen Stammzeile m eine befruchtete Eizelle des tierischen Lebewesens zur Erzeugung einer intakten menschlichen bzw. tierischen Hämatopoese durchgeführt w rd.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß d e Transplantation innerhalb des ersten Drittels der Fortentwicklung durchgeführt w rd.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oαer 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Stammzellen folgende Zellen verwendet werden:
Hamatopoietische Stammzellen aus Knochenmark, Nabelschnurblut, fetale Leber oder Milz und zirkulierende Blutstammzellen im peπpheren Blutkreislauf;
embryonale Stammzelien;
jegliche Art von Zellkulturen (wie Zellhvoridome) un Gewebe .
. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Spender-Stammzellen insbesondere Zellen von den Spendern Mensch und/oder Saugetieren, wie insbesondere Maus, Huhn, Pferd und Wiederkäuer und/oder Vögeln, wie insbesondere Huhn, und/oder Zellkulturen und Hybridomen verwendet werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurcn gekennzeichnet, daß als tierische Lebewesen als Empfanger der Stam zellen insbesondere Saugetiere, wie z.B. Schaf, Ziege, Wiederkäuer (Kuh) , Pferd oder Vogel, wie insbesondere Huhn, verwendet werden.
6. Verfanren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, daαurcn gekennzeichnet, daß die Transplantation m vitro erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Transplantation als m uterc Transplantation durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurcn gekennzeichnet, daß die Transplantation außerhalb αes mutterlicher- Korpers durcngefuhrt wird.
9. Verfanren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch ge- <ennzeicr.net , daß nach der Geburt des tieriscnen Lεcewe- sens, das die Stammzellen ernalten hat, der tolerante Zustand m t molekular-oiologischen Methoden oder mittels FACS-Methoden bestätigt wird.
IC. Verfahren zur Hersteilung vcn menscr_.lich.en mono -:1cnaler. Antikörpern (13) mit folgenden Verfahrensschritten:
a. Transplantieren einer menschlichen Stammzelle (1) eines spezifischen menschlichen Spenders in einen Embryo (2) eines ersten tierischen Lebewesens (3) , b. Transplantierεn einer tierischen Stammzeile (4) eines Spenders (10) und einer menschlichen Stammzelle (1') des spezifischen menschlichen Spenders m einen Embryo
(5) eines zweiten tierischen Lebewesεns (6);
c. Injiziεren eines Antigens (7) zur Immunstimulation des nach der Transplantation gemäß Schritt (a) geborenen ersten toleranten tierischen Lebewesens (14);
d. Isolieren von humanen Antikörper produzierenden 3- Zellen (8) aus dem ersten toleranten Lebewesen '14),
e. Fusion der B-Zellen (8) mit Tumor-Zellen (9), vorzugs¬ weise Myelo a-Zellen, eines die Stammzellen (4) gemäß Verfahrensschritt (b) spendenden Lebewesens (10) zur Erzeugung von Hybridomazellen (11);
f. Injizieren der Hybridomazellen (11) m das nach der Transplantation gemäß Schritt b. geborene zweite zwei¬ fach tolerante tierische Lebewesen (12);
g. Isolation der monoklonalen humanen Antikörpern 13 aus der entstandenen A.szites (15), dem entstandener. Blutserum, der produzierten Milch oder den gelegten Eiern des zweiten zweifach toleranten tierischen Lebewesens ( 12) .
.. Verfahren nacn Anspruch 10, dadurcn gekennzeichnet, daß als erstes und zweites tienschεs Lεbεwεsεn (3 bzw. 6) Saugεtiere, wie z.B. Schafe, Kühe oder Pferde, oder Vogei, wiε z.B. Huhnεr, verwendet werden.
? Verfahren nach Ansprucn 10 ooer 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Spender (10) eine Maus des Inzuchtstammes Balb C verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß nach der Geburt des ersten und zweiten toleranten Lebεwesens (12, 14) dεr tolεrante Zustand über¬ prüft wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß Antigene (7) von Erregern von Infektionserkrankungen, insbesondere Malaria, TBC, Rabies, Röteln, Tetanus, FSME, Herpes und HIV oder Antigene gegen Tumore oder Blutgruppen-Antigene (Rhesus aktor 2 ) oder Histokompatibilitats-Antigene (HLA- ntigene) verwendet werden .
15. Verfahren zur Herstellung von maus-monoklcnaler. Ar_.ti.-ccr- pern mit folgenden Verfahrεnsschritten:
a. Transplantieren einer Sta mzellε (FLZ) eines Maus- Spendertieres (M) in ein Embryo (E) eines tierischen Lebewesens (T) ;
b. Injizieren von Hybrioomazellen (HC) des Maus-Spender- tieres (M) m das r.acr. der Transplantation gemäß Schritt a. geborene a s-toierante tierische Lece esεr.
.C) ; und
c. Isolation von maus-monoklonalen Antikörpern (mAb) aus der entstandenen Aszites (ASC) , dem entstandenen Blutserum, der produzierten Milch oder der gelegten Eier des maus-toleranten Lebewesens (C) .
16. Verfahrεn nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß als tierisches Lebewesen Schafe oder Kühe oder Huhner verwendet werdεn.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß als Spender eine Maus des Inzuchtstammes Balb-C verwendet wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis l 1 , dadurcn gekennzeichnet, daß nach der Geburt des toleranten Lebewesens der tolerante Zustand überprüft wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß Antigene (7) von Erregern von Infektionserkrankungen, insbesonderε Malaria, TBC, Rabies, Rόtεin, Tetanus, FSME, Herpes und HIV oder Antigene gegen Tumore oder Blutgruppen-Antigene (Rhesusfaktor D) cder Histokompatibilitats-Antigene (HLA- ntigene) verwendet werden.
20. Bioreaktcr zur Erzeugung monoklonaier Antikörper
mit zumindest einem Teil eines am Leben erhaltenen tierischen Körpers, der einen funktionsfähigen Blutkreislauf aufweist; und
mit zumindest einem funktionsfähigen Organ des tierischen Körpers, m dem nach Injektion von Antikörper produzierenden Hybridomazellen eines Spenders monoklonale Antikörper erzeugbar sind oder naor. Injektion von Antigεnen Antiseren erzeugbar sind odεr m dem Blutprodukte produzierbar sind,
wobei der tierische Körper eine Toleranz gegenüber dem Spendεr dεr Zellen besitzt.
21. Bioreaktor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der tierische Körper geratetechnisch am Leben erhalten wird.
22. Bioreaktor nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des tierischen Korpers Teil eines auf natürliche Weisε am Leben erhaltenen Saugetiers oder Vogels ist.
23. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurcn ge- kennzεichnet, daß der Spencer ein Saugetier, z.B. eine Maus, ein Wiederkäuer, ein Pferd oder eine Ziege, ist und daß der tierische Korper eine Toleranz gegenüber dem Spender besitzt.
24. Bioreaktor nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der tierische Korper eine zweifache Toleranz besitzt.
25. ΞioreaKtcr nach Ansprucn 24, oadurcn gekenr.zeicr.net, oaß die zweifache Toleranz eine Maus/Menschtoleranz ist.
26. Bioreaktcr nach Anspruch 20, 24 odεr 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Hybrioomazelle (11) eine Fusionszεiie aus einer von einer Maus stammenden Tumorzelle (9) uno einer Human-Antikorper oder Maus-Antikorper produzierenden B-Zelle (8) ist.
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