DE2722038A1

DE2722038A1 - Stoffzusammensetzungen auf basis von isocyanat-reaktrionsprodukten, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2722038A1
Application number: DE19772722038
Authority: DE
Inventors: Jun William Anthony Eisenhardt; Eddie Hedaya; Spyros Theodoropulos
Original assignee: Union Carbide Corp
Current assignee: Union Carbide Corp
Priority date: 1976-05-17
Filing date: 1977-05-16
Publication date: 1977-12-15
Also published as: JPS5823699A; US4115539A; NL7705411A; DK213177A; AU519191B2; CA1093486A; DE2722038C2; SE446738B; FR2369284B1; FR2368453B1; JPS6332356B2; JPS5315359A; GB1586186A; SE7705191L; FR2369284A1; SE447025B; FR2368453A1; GB1586185A; SE8205750D0; AU2518777A

Description

New York, N.Y., Vereinigte Staaten von Amerika

Stoffzusammensetzungen auf Basis von Isooyanat-Reaktionsprcdukten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung

Beanspruchte

Priorität : 17. Mai 1976, V.St.A., Nr. 687 149

Die Erfindung betrifft neue Stoffzusammensetzungen, die für eine Analyse zahlreicher Substanzen in biologischen Flüssigkeiten oder dergleichen brauchbar sind, und insbesondere neue Isocyanate, die mit den interessierenden Verbindungen umsetzbar sind und Derivate bilden, die radioaktiv markiert werden können, sowie die Verwendung derartiger Stoffzusammensetzungen zur Durchführung von Analysen unter Verwendung solcher markierter Derivate.

Für eine Vielzahl von klinischen Zwecken, wie beispielsweise der Überprüfung der radioaktiven Strahlungsintensität von Dosierungszusammenstellungen, der Überprüfung von Hormonspiegeln

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einer kurz zuvor erfolgten Arzneimittelaufnahme oder der folgenden pharmakologischen Wirkungen auf eine Lebensnützlichkeit, der Absorption, des Abbaus oder der Ausscheidung, ist es von grossem Vorteil, die Konzentration von verschiedenen Arzneimitteln oder dergleichen hinsichtlich nanomolarer oder sogar picomolarer Mengen zu messen. Bekanntlich kann ein Radioimmunoassay von derartigen Analysen begleitet sein. Um eine Analyse durchzuführen, müssen annehmbare Ausrüstungen oder Systeme ein Antiserum, einen Standard der zu messenden Verbindung, ein radioaktiv markiertes Derivat der zu messenden Verbindung, eine

Verdrängungs-Puffersubstanz oder Puffersubstanzen und häufig ein / mittel vorhanden sein. Es ist bekannt, dass ein Antiserum von blutenden Tieren erzeugt wird, die durch Impfen, beispielsweise mit einem Hapten-Protein-Paar (immunogen) entsprechend der zu messenden Verbindung, das charakteristischerweise als "Antigen" bezeichnet wird, immunisiert worden sind.

Es ist bekannt, dass im allgemeinen die Technik des Radioimmunoassays den V/ettkampf zwischen dem radioaktiv markierten Antigen und dem nichtmarkierten Antigen hinsichtlich der Bindungsstellen an dem Antikörper im Antiserum misst. Durch einen Zusatz bekannter Mengen von zu untersuchendem Antigen und einem radioaktiv markierten Analogon zum Antiserum wird eine Dosisreizkurve für gebundenes oder freies Antigen gegenüber der Konzentration des Antigens aufgestellt. Nachdem Immunitätseichung durchgeführt worden ist, können dann unbekannte Konzentrationen mit der Standarddosis -Reizkurve zu Untersuchungszwecken verglichen werden. Entscheidend bei der-

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artigen Untersuchungen ist das Vorliegen radioaktiv markierter Antigene, die in wirksamer V/eise mit nicht radioaktiv markierten Antigenen in Wettbewerb treten. Um demgemäss eine grösstmögliche Genauigkeit, Richtigkeit, Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit des Versuchs zu erhalten, sind gereinigte, gut charakterisierte synthetische radioaktiv markierte Antigene erforderlich. Die Empfindlichkeit bezieht sich auf die Leistungsfähigkeit der Versuchstechnik, auf geringstmögliche Konzentrationen des Antigens (beispielsweise der zu untersuchenden Hormone, Arzneimittel oder dergleichen, zu reagieren. Die grösstmögliche Empfindlichkeit wird erreicht, wenn die Konzentration des freien, radioaktiv markierten Antigens vernachlässigbar ist und die Konzentration des nichtmarkierten /ntigens sich dem Wert Null nähert. Wenn das synthetische, radioaktiv markierte Antigen rein ist und sich genau an die Struktur des Antigens, das untersucht werden soll, anpasst, ist der Radioimmunoassay potentiell von höchster Empfindlichkeit und Spezifität.

Die Herstellung zufriedenstellender radioaktiv markierter Antigene erfordert deshalb bestimmte Richtlinien. Es müssen reine Reagentien mit einer geringstmöglichen Konzentration an Nebenprodukten eingesetzt werden. Ausserdem sind schonende Reaktionen, die in hoher Ausbeute verlaufen, und die das Antigen oder Hapten nicht umlagern, erwünscht, die nämlich lediglich geringfügige strukturelle Veränderungen des Haptens oder Antigens hervorrufen. Des weiteren ist es noch erwünscht, chemische Derivate einzusetzen, die die Unterschiede hinsicht-

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lieh der Affinität gegenüber dem Bindungsreagens, d.h. dem Antikörper, des Radioindikators und gegenüber dem ursprünglichen Hapten oder Antigen auf ein Minimum herabsetzen, so dass ein wirksamer kompetitiver Versuch möglich ist.

Das Markieren des Haptens oder des zu untersuchenden Antigens kann bekanntlich mit C oder H erreicht werden. Jedoch verlaufen derartige Analysen mit markierten Haptenen oder Antigenen bei diesen Techniken langsam und umständlich und können im allgemeinen nur mittels Flüssigkeits-Scintillationsmethoden ausgeführt werden. Es ist demzufolge bei einer radioaktiven Markierung erwünscht, sie mit einem radioaktiven Jodisotop,

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wie beispielsweise J durchzuführen. Jedoch können die meisten Verbindungen, die von Interesse sind, nicht mittels einer derartigen Technik markiert werden und müssen folglich mit einer jodaufnehmenden Gruppe umgesetzt werden. Aromatische Ringe und einige heterozyklische Ringe, insbesondere die für eine einfach durchzuführende Substitution aktiviert sind, sind deshalb die bevorzugten Bausteine für eine Kupplung zweier Verbindungen, um Derivate für eine Aufnahme einer Jodmarkierung zur Verfügung zu stellen. Aus diesem Grunde sind Tyrosin-methylester und Tyramin, die beide aktivierte phenolische Hydroxylgruppen enthalten, zur Herstellung von Derivaten verwendet worden, die dann später radioaktiv markiert werden können.

Eine der üblichen, früher angewendeten Methoden zur Herstellung markierter Steroide besteht in der anfänglichen Bildung eines Zwischenproduktaddukts durch Behandlung des Steroids mit einem

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Chlorformiat oder einem Bernsteinsäure-, Malonsäure-, Fumarsäure- oder Phthalsäureester oder -anhydrid mit anschliessender Umsetzung mit einem Jodakzeptor. Dieser Versuch ist beschrieben von Oliver und Mitarbeitern in"J. Clinical Investigation", 42 (1968), Seite 1035, wonach 3-0-Succinyl-digitoxigenin-tyrosin-

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methylester und dessen entsprechendes J-Derivat zur Verwendung beim Radioimmunoassay von Digitoxin bei Menschen hergestellt worden sind. Ein weiterer Versuch dieser Art ist in der US-PS 3 810 866 beschrieben, wonach Digitoxigenin an Derivate des Tyrosins, des 4-Hydroxy-phenyl-glycins, des 3-Hydroxytroptophans, des Tryptophans und des Histidins mittels einer Bernsteinsäure-, Malonsäure-, Fumarsäure- oder Phthalsäuregruppe gebunden wird.

Die Herstellung derartiger Derivate kann bis zu mehrere Monate dauern.

Ein weiteres Verfahren ist in der DT-OS 2 331 922 beschrieben. Bei diesem Verfahren werden Derivate von 14 verschiedenen Herzglycosiden beschrieben, die radioaktiv markiert werden, indem zuerst der endständige Digitoxose-Ring geöffnet und mit Perjodat zum Dialdehyd oxidiert wird. Der Dialdehyd wird dann mit einem Reagens, wie L-Tyrosin-methylester-hydrochlorid, gekuppelt. Das erhaltene Addukt wird dann mit Natrium-borhydrid reduziert, um die restlichen Hydroxylgruppen am endständigen Zuckerring zu reduzieren und nebenbei den Ester zur Säure zu verseifen. Dieses Addukt kann dann am aromatischen Ring mit radioaktivem Jod jodiert v/erden. Dieses Verfahren neigt jedoch dazu, beschwerlich zu verlaufen, bei den verschiedenen Zwi-

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schenstufen Nebenprodukte zu bilden und weiterhin verhältnismässig starke Reagentien zu verwenden.

Ein anderes Verfahren ist in der ZA-PS 73-8312 beschrieben. Dieses Kupplungsverfahren kann bei Steroidketonen, wie Testosteron, angewendet werden, indem zuerst das Carboxymethyl-oxim gebildet wird. Dann wird ein Jodakzeptor, wie beispielsweise Tyrosin-methylester, zur Reaktion mit einem typischen Carbodiimid, wie N.N-Dicyclohexyl-carbodiimidj in Gegenwart von Triäthylamin in Methylenchlorid zur Umsetzung gebracht, um das Tyrosin-methylester-amid des ursprünglichen O-Carboxymethyloxims zu erzeugen.

Aufgabe vorliegender Erfindung war es nun, neue Isocyanate zur Verfügung zu stellen, die in einfacher Weise mit Verbindungen von klinischem Interesse gekuppelt werden können, um Derivate zu schaffen, die für eine Markierung, wie eine radioaktive Markierung, aufnahmefähig sind.

Eine weitere Aufgabe vorliegender Erfindung besteht in der Zurverfügungstellung neuer Carbamat- und Harnstoff-Derivate von Verbindungen mit biologischem, klinischem oder anderem Interesse. Eine verwandte und speziellere Aufgabe liegt in der Zurverfügungstellung solcher Derivate, die für eine radioaktive Markierung aufnahmefähig sind.

Weiterhin wird eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin gesehen, Kupplungsrea^entien zur Verfügung zu stellen, die zur Bildung von Carbamaten oder Harnstoffen befähigt sind,

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welche brauchbar sind zur Bindung von Molekülen von klinischem Interesse an interessierende Substrate, wie Proteine, Enzyme, Polypeptide, Glasperlchen, Kohlehydrate, Kunststoffe und dergleichen.

Eine weitere Aufgabe besteht in der Zurverfügungstellung eines Radioassay-Verfahrens unter Verwendung der vorstehend beschriebenen radioaktiv markierten Carbamate oder Harnstoffe als Reagentien.

Ausserdem liegt eine Aufgabe vorliegender Erfindung in der Bereitstellung neuer Kupplungsmittel, die Addukte mit Verbindungen von klinischem Interesse mittels einer leicht durchführbaren, schonenden chemischen Reaktion bilden.

Zudem besteht eine Aufgabe vorliegender Erfindung in der Bildung von Addukten zwischen den neuen erfindungsgemässen Kupplungsmitteln und Verbindungen von klinischem oder anderem Interesse, die durch eine breite synthetische Anwendbarkeit, Einfachheit der Reaktion und der Verfahrensschritte und der relativen Freiheit von Nebenprodukten gekennzeichnet ist.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Zurverfügungstellung radioaktiv markierter Derivate, die die Zuverlässigkeit eines Radioimmunoassays, eines Immunoassays und von auf Nichtimmunität basierenden Techniken unter Verwendung von beispielsweise kompetitiven Bindungsmitteln verbessert.

Weitere Aufgaben und Vorteile vorliegender Erfindung sind aus

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der nachstehenden ausführlichen Beschreibung und aus der Zeichnung ersichtlich, die eine typische Dosierungsreizkurve veranschaulicht, die unter Verwendung eines mit radioaktivem Jod markierten Digoxin-Derivats vorliegender Erfindung als Radiomarkierungsmittel erhalten worden ist.

Obwohl die Erfindung zahlreiche Modifikationen und Veränderungen zulässt, sind hierin im einzelnen die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben. Es ist jedoch verständlich, dass die vorliegende Erfindung nicht auf diese beschriebenen speziellen Ausführungsformen beschränkt ist. Es wird im Gegenteil angestrebt, alle Modifikationen und Alternativen, die sinngemäss

fallen

unter den Umfang vorliegender Erfindung⁷, wie sie in den Ansprüchen ausgedrückt ist, zu umfassen. Obwohl die vorliegende Erfindung beispielsweise in Verbindung mit Versuchen beschrieben worden ist, die mittels der Radioimmunoassay-Technik durchgeführt worden sind, muss betont werden, dass die vorliegende Erfindung in gleicher Weise auf die Anwendung bei beliebigen Versuchstypen nach gleichen oder analogen Grundzügen anwendbar ist. Obwohl weiterhin die meisten Proteine und zahlreiche Peptide mit radioaktivem Jod markiert werden können, ohne einen Jodakzeptor daran zu kuppeln, kann es vorteilhaft sein, die neuen Kupplungsmittel vorliegender Erfindung einzusetzen, um zusätzliche Jod akzeptierende Stellen beim Protein oder Peptid zuzufügen, um dadurch eine grössere spezifische Aktivität in Betracht zu ziehen. Ausserdem kann es in den Fällen, bei denen starke Oxidations- und Reduktionsbedingungen, die häufig bei Verfahren zur Markierung mit radioaktivem Jod angewendet werden, Struktur und Eigenschaften der Proteine

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nachteilig beeinflussen, wünschenswert sein, die neuen Kupplungsmittel vorliegender Erfindung vorher mit radioaktivem Jod zu markieren, so dass die Kupplungsmittel anschliessend, gegebenenfalls nach einer Reinigung, mit dem Protein oder dem Peptid unter chemisch schonenden Bedingungen reagieren können. Ähnliche Betrachtungen können auch auf umfangreichere Gebilde angewendet werden, die Proteine, wie Viren, Bakterien, Zellen und dergleichen enthalten.

Gegenstand vorliegender Erfindung sind demzufolge Stoffzusammensetzungen, enthaltend ein Reaktionsprodukt aus

a) einer Substanz der Gruppe Steroide, Steroidglycocide, Arzneimittel, Drogen, Rauschgifte, Vitamine, pflanzliche und tierische Hormone, Peptide, Proteine, Aminosäuren, Enzyme, Pestizide, Polyamide, Viren, Bakterien, Zellen, Nikotinderivate und andere Metabolite, wobei diese Substanzen mindestens eine mit einer Isocyanatgruppe reagierende Gruppe aufweisen und

b) einer Isocyanatverbindung der allgemeinen Formeln I oder II

(R) ₃SiO—/ΟΥ— CH₂CH₂N=C=O

oder CO₂CH₃

(R) ₃Si0-^jC))—CH₂CHN=C=O (II)

in denen R ein bis zu 10 Kohlenstoffatome aufweisender Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkylrest ist.

Die vorliegende Erfindung basiert allgemein auf der Feststellung, dass neue Isocyanate als Verbindungen mit solchen Resten

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hergestellt werden können, von denen bekannt ist, dass sie für Markierungen, wie für eine radioaktive Markierung, aufnahmefähig sind, beispielsweise Tyramin und Tyrosin, und zwar mit tels eines Verfahrens, bei dem eine andere funktionelle reaktionsfähige Gruppe als die Isocyanatgruppe durch Haftung blockiert wird, so dass die Herstellung von Derivaten derartiger Isocyanate mit Verbindungen von klinischem oder anderem Interesse ermöglicht wird. Die erhaltenen Derivate können dann nach einer geeigneten Abspaltung der blockierenden Gruppe in einfacher Weise markiert und bei Techniken eingesetzt werden, wie beispielsweise dem Radioimmunoassay, um zuverlässige, genaue, empfindliche Versuche zur Verfügung zu stellen.

Nach vorliegender Erfindung sind neue Isocyanate vorgesehen, die einen blockierten bzw. geschützten Rest enthalten, der nach Abspalten der blockierenden bzw. schützenden Gruppe derart reagiert , dass sie eine reaktionsfähige Gruppe schafft , die entweder für eine Markierung oder eine Kupplung an ein interessierendes Substrat aufnahmefähig ist. Die Verwendung der neuen Isocyanate liefert bestimmte Vorteile gegenüber den früheren Verfahren, da die diese Derivate bildenden Reaktionen einfach und von Natur aus schonend verlaufen und nur eine geringfügige Änderung der Struktur der interessierenden Verbindung zur Folge haben.

Die blockierte bzw. geschützte funktionelle reaktionsfähige Gruppe bzw. die entsprechenden Gruppen des Isocyanats hängen von der beabsichtigten Anwendung ab. Wenn demzufolge ein Iso-

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cyanat zu verwenden ist, um letztlich ein mit radioaktivem Jod markiertes Addukt mit einer Verbindung von klinischem oder anderem Interesse zu bilden, muss die funktionelle reaktionsfähige Gruppe natürlich für eine radioaktive Jodmarkierung aufnahmefähig sein oder den Rest aktivieren, damit er mit radioaktivem Jod markierbar ist. Zu diesem Zweck bevorzugt man die Verwendung eines Isocyanats, das entweder auf Tyramin oder auf dem L-Tyrosin-methylester beruht. Bei diesen Verbindungen aktiviert bekanntlich die p-Hydroxygruppe den Ring, so dass eine Markierung mit radioaktivem Jod möglich ist.

Gegebenenfalls kann jedoch vom funktionellen Standpunkt aus betrachtet das angesetzte Isocyanat ein beliebiges Isocyanat darstellen, das einen Rest oder eine reaktionsfähige Gruppe besitzt, die für eine Markierung mit radioaktivem Jod aufnahmebereit ist. Innerhalb des Umfanges vorliegender Erfindung liegt demzufolge die Verwendung von Isocyanaten, die auf ungesättigten Verbindungen, wie Olefinen, beispielsweise Allylamin, basieren. Gegebenenfalls können auch Acetylene verwendet werden. Eine weitere Gruppe brauchbarer Isocyanate kann sich von Hydroxylgruppen enthaltenden Aminen, wie Brenzkatechinaminen, ableiten. Weitere brauchbare Verbindungen sind in der FR-PS 2 266 888 beschrieben. Diese Isocyanate enthalten Reste der nachstehenden allgemeinen Formel

- <^CH2>n

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in der η eine Zahl von 1 bis 5 ist und FL und R« Halogenatome oder Methyl-, Äthyl-, Methoxy- oder Äthoxygruppen bedeuten. Andere brauchbare Verbindungen sind Isocyanate, die sich vom 4-Hydroxy-phenyl-glycin, 5-Hydroxy-tryptophan, Tryptophan und Histidin ableiten. Weitere brauchbare Gruppen können sich von mit radioaktivem Jod markierten Hetereocyclen, wie Histamin, Imidazolen, Indolen, Cytosin, Pyrimidin, Adenin oder Adenosin, ableiten.

Für andere Anwendungsgebiete kann die Verwendung solcher Isocyanate erwünscht sein, die Licht absorbieren oder absorbiertes Licht, beispielsweise durch Fluoreszenz oder Phosphoreszenz, oder Laserstrahlen emittieren können. Isocyanate dieser Art können nach zwei verschiedenen Arten hergestellt werden. Einmal kann man ein Isocyanat mit einem solchen Rest herstellen, der selbst Licht absorbieren, beispielsweise Tyramin, absorbiertes Licht emittieren, beispielsweise Pyren oder Naphthalin, oder Laserstrahlen emittieren kann, beispielsweise der Farbstoff Rhodamin 6G. Wenn gegebenenfalls kein Isocyanat unmittelbar aus dem Rest gebildet werden kann, kann man ein Isocyanat verwenden, das eine mit solchen Resten reaktionsfähige Gruppe enthält. In diesem Zusammenhang kann sich als Anschauungsbeispiel ein brauchbares Isocyanat vom 1-Trifluoracetamido-6-aminohexan ableiten. Nach der Reaktion des Isocyanats und nach einer geeigneten Abspaltung der Schutzgruppe kann das Isocyanat-Addukt dann mit einem anderen interessierenden Rest umgesetzt werden. In einigen Fällen kann es erwünscht sein, sogar wenn ein Isocyanat aus einem solchen Rest

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gebildet werden kann, zuerst ein Isocyanat zu bilden, das anschliessend mit dem Rest umgesetzt wird. Als Beispiel könnte es nützlich sein, weiterhin einen Abstand des Restes von der interessierenden Verbindung zu erlauben, die mit dem Isocyanat umgesetzt wird.

Brauchbare Isocyanate können auch aus solchen Resten hergestellt werden, die mit einem gegebenenfalls radioaktiven Metal lion Chelate zu bilden vermögen. Derartige Beispiele sind Isocyanate, die sich von der Äthylendiainintetraessigsäure oder der Äthylentriaminpentaessigsäure ableiten. Es wird darauf hingewiesen, dass dieChelatgruppe in geeigneter Weise geschützt sein kann, so dass sie die Isocyanatherstellung übersteht.

Ein weiterer Typ von brauchbaren Isocyanaten kann sich von Resten ableiten, die ein Radionuclid enthalten. Beispielsweise

75 kann man ein Isocyanat verwenden, das sich vom Se-Selenomethionin ableitet.

Ein weiterer Typ von Isocyanaten, die verwendet werden können, kann sich von Resten ableiten, die durch die Elektronen-Spinresonanz-Spektroskopie festgestellt werden können. Beispielsweise kann sich ein brauchbares Isocyanat von einem Rest ableiten, der die nachstehende Gruppe enthält :

O
I
CH, ^ N -^ CH₃

-CH_{2 N}

CH₂ CH₂

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" ^Äfe" 2722Ö38

Ein weiteres brauchbares Isocyanat mit einem Spin-markierten Rest kann unter Verwendung des freien 4-Amino-2,2,6,6-tetramethyl-piperidino-oxy-Restes hergestellt werden.

Es liegt auch innerhalb des Umfanges vorliegender Erfindung, Isocyanate mit einem Rest zu verwenden, der eine andere reaktionsfähige Gruppe als die Isocyanatgruppe enthält und die das Isocyanat entweder an ein ausgesprochen unlösliches interessierendes Substrat oder an eine interessierende Verbindung kuppeln kann. Beispiele von interessierenden Substraten sind Glasperlchen, Dextrane, Cellulose und verschiedene Kunststoffe. Ein Beispiel eines Isocyanats mit einem geeigneten Kupplungsrest kann sich vom Triäthoxysilan-Rest ableiten. Zur Kupplung an Enzyme, wie Viren, Proteine oder Zellen, können sich geeignete Isocyanate von Resten mit Mercapto-, Carboxy- oder Aminogruppen ableiten.

Wie bereits ausgeführt worden ist, ist es, um ein Bestehenbleiben der gewünschten reaktionsfähigen Gruppe bei der Herstellung des Isocyanats zu gewährleisten, in typischer Weise erforderlich, die reaktionsfähige Gruppe in geeigneter Weise zu blockieren oder zu schützen.

Die gemäss vorliegender Erfindung brauchbaren Isocyanate können in gewünschter V/eise nach dem in der gleichzeitig eingereichten Patentanmeldung mit der beanspruchten Priorität vom 17.Mai 1976 in den Vereinigten Staaten von Amerika unter der Nr. 687 160 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Hierbei wird allgemein ein Carbaminsäuresalz aus dem ent-

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sprechenden primären Amin gebildet, das dann unter Bildung des entsprechenden Halogensilylcarbamats als Isocyanat-Vorstufe umgesetzt wird. Das Isocyanat bildet sich dann durch schwaches Erwärmen des Halogensilylcarbamats.

Bei der Bildung dieser Isocyanate kann man bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis etwa 15O⁰C ausgehen, wobei niedrigere Temperaturen im Bereich von etwa 30 bis etwa 60⁰C bevorzugt sind, um die Bildung von Nebenprodukten auf ein Mindestmass herabzusetzen. Die Umsetzungen können in Gegenwart entweder eines nichtpolaren Lösungsmittels oder eines polaren Lösungsmittels, wie eines tertiären Amins, durchgeführt werden. Weitere Einzelheiten sind aus der vorerwähnten Patentanmeldung zu entnehmen, deren Offenbarung ebenfalls Gegenstand vorliegender Erfindung ist.

Wenn eine Blockierung bzw. Schutzgruppenbildung erforderlich ist, um eine Polymerisation, eine innere Cyclisierung oder andere bei der Isocyanatherstellung unerwünschte Nebenprodukte bildende Reaktionen zu verhindern, ist es vorteilhaft, das in der vorerwähnten Patentanmeldung beschriebene Austauschverfahren anzuwenden. Bei diesem Verfahren erreicht man in eigentümlicher Weise eine Blockierung der reaktionsfähigen funktionellen Gruppe des Amins. Die Bildung des entsprechenden blokkierten Isocyanats aus Tyramin zeigt diese Schutzgruppenbildung. Wie nachstehend ausgeführt wird, bildet sich das Trialkylsilyl-carbamat durch Umsetzen von Tyramin mit Kohlendioxid und einem Halogensilan, wobei die Umsetzung in Triäthylamin als Lösungsmittel durchgeführt wird :

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/—\ , , Lösungsmittel.

^H°-\O/"^CH2^CH2^NH2 ^{+ C0}2 ^{+ 2}(^CH ₃)₃ ^sicl

^~^ 2 5 3

Wie ersichtlich ist, ergibt sich bei der Bildung des Trialkylsilyl-carbamats eine Blockierung der Hydroxylgruppe des Tyramins. Das Isocyanat kann dann durch eine trans-Silylierungsrekation unter Bildung des Halogensilylcarbamats und anschlies sendes Erhitzen gebildet werden. Diese Reaktionsfolge ist nachstehend angegeben :

(CH₃)₃SiO-^>-CH₂CH₂NHCOOSi(CH₃)₃ + Si

(CH ) SiO-^-CH₂CM₂IIHCOOSiCl₃

Bei dem vorstehenden Beispiel ist die Schutzgruppe die Trimethylsiloxy-Gruppe, doch stellt dies nur eine beispielhafte Ausführung dar. Die jeweilige Siloxy-Schutzgruppe hängt vom organischen Rest des zur Bildung des Silylcarbamats nach dem Austauschverfahren verwendeten Silylierungsmittel ab. Der organische Rest kann vom Begriff her ein beliebiger Rest sein, der die Bildung eines Silylcarbamats, die anschliessende Transsilylierung und die Umwandlung in das entsprechende Isocyanat gestattet.

Beispiele brauchbarer organischer Reste sind niedere Alkyl-

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reste mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, wie die Dimethyl-, die Methyläthyl- oder die Methylpropyl-Gruppe. Cycloalkylreste, wie die Cyclopentyl-, Cyclohexyl- oder Cycloheptyl-Gruppe, können auch verwendet werden, doch sollten sie etwa 10 Kohlenstoffatome oder weniger enthalten. Des weiteren können Aryl- und Alkarylreste mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen verwendet werden. Geeignete Beispiele sind die Phenyl-, Tolyl- und Xylylgruppe. Ausserdem können auch Aralkylreste mit bis zu etwa 10 Kohlenstoffatomen, wie die Benzylgruppe, verwendet werden. Jeder dieser Reste kann mit einem oder mehreren Halogenatomen substituiert sein. Es ist ersichtlich, dass die Verwendung organischer Reste mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen oder weniger eher eine bevorzugte Ausführungsform als eine Begrenzung darstellt. Die Verfügbarkeit und die Kosten bestimmen häufig das verwendete jeweilige Silan. Ein weiteres Merkmal ist die Leichtigkeit der Umwandlung in das Isocyanat, wobei grössere und umfangreichere organische Moleküle eine weniger leichte Umwandlung erleiden können.

Für Isocyanate auf der Basis von Tyramin kommt demgemäss die nachstehende Strukturformel in Betracht :

(R)₃SiO —■<" {J V- CH₂CK₂N=C=O (I)

in der R ein beliebiger organischer Rest sein kann, wie er in Verbindung mit dem Silylierungsmittel beschrieben ist. Auch kann der Rest R ein einheitlicher Rest oder ein gemischter Rest,

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wie der tert.-Butyl-dimethyl-Rest, sein. Für Isocyanate auf Basis des L-Tyrosin-methylesters kommt die nachstehende Strukturformel in Betracht :

CO₉CH

1 ^ J

(R)₃SiO —/ O / CH₂CHN=C=O (II)

in der R die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzt. In analoger Weise besitzen Isocyanate, die sich vom Äthanolamin ableiten, die nachstehende Strukturformel :

(R)₃SiO -(CH₂)₂N=C=0

Es wird darauf hingewiesen, dass, wenn Zinr>j Germanium-, Titan-, Phosphor- oder Schwefelverbindungen anstelle von Silanen verwendet werden, das Siliciumatom in analoger Weise in der Schutzgruppe ersetzt ist.

Obwohl in den meisten Fällen, wie sie mit Tyramin abgehandelt worden sind, die Anwendung des Austauschverfahrens eine adäquate Schutzgruppenbildung hervorruft, gibt es Situationen, in denen sich diese Art Schutzgruppe als inadäquat zeigt. Wenn beispielsweise eine Aminogruppe geschützt wird, kann dies mittels des Austauschverfahrens durchgeführt werden. Wenn jedoch das erhaltene Isocyanat mit einer Verbindung von klinischem oder anderem Interesse umgesetzt wird, kann eine vorzeitige Abspaltung der Schutzgruppe, beispielsweise durch Hydrolyse, auftreten, was unerwünschte Nebenreaktionen zur Folge hat. Dies kann man gegebenenfalls durch entsprechende

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Auswahl der Silylierungsmittel, die verhältnismässig umfangreiche Schutzgruppen ausbilden, oder durch Modifizieren der Reaktionsbedingungen vermeiden. Gegebenenfalls können andere bekannte Blockierungsverfahren angewendet werden. Beispielsweise könnte eine reaktionsfähige Gruppe durch Einführen des Trifluor-acetamido-Restes geschützt werden.

Die Isocyanate können dann mit beliebigen interessierenden Verbindungen umgesetzt werden, die selbstverständlich mit der Isocyanatgruppe reagieren können. Typische Beispiele von Verbindungen, die an die Isocyanate gekuppelt werden können, enthalten im klassischen Sinne aktive Wasserstoffatome, wie dies bei Verbindungen mit Hydroxyl-, Amino-, Sulfhydryl- oder Carboxylgruppen der Fall ist. Bekanntlich enthält eine grosse Anzahl von Proteinen, Aminosäuren, Polypeptiden, Enzymen, Steroiden, Arzneimitteln, Nikotinderivaten, Pestiziden, zahlreichen natürlichen Produkten, pflanzlichen und tierischen Hormonen, Viren, Polyaminen, Bakterien,Zellen und anderen Metaboliten derartige mit Isocyanatgruppen reaktionsfähige Gruppen. Spezielle Beispiele von Verbindungen von klinischem oder anderem Interesse sind Angiotensin I und II, Digoxin, Digitoxin, Digoxigenin, Dihydro-testosteron, Testosteron, Aldosteron, Cortisol, Östron, Östradiol, Östriol, Gentamicin, Penicillin, Theophyllin und HdL-Hydroxy-progesteron.

Es ist auch darauf hinzuweisen, dass die vorliegende Erfindung auch in bezug auf Verbindungen von Interesse angewendet werden kann, die keine mit Isocyanatgruppen reaktionsfähige Reste enthalten. Dies erfordert eine Modifizierung der Verbindungen, um

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eine derartige reaktionsfähige Gruppe einzuführen. Beispielsweise kann Nikotin verwendet werden, indem es zuerst in das 6-Amino-nicotin überführt wird, das dann mit dem gewünschten Isocyanat reagiert. Das erhaltene Addukt ist ein geeignetes Analogon zur Anwendung in Nikotinversuchen.

Die Isocyanat-Verbindung des interessierenden Addukts oder Derivats kann im allgemeinen unter Anwendung an sich bekannter Verfahrensbedingungen zur Umsetzung von Isocyanaten hergestellt werden. Es ist deshalb beispielsweise zweckmässig, das Addukt durch Umsetzung in einem Lösungsmittel - falls erforderlich bei einer Temperatur im Bereich von Raumtemperatur bis etwa 15O⁰C herzustellen. Gegebenenfalls kann man auch verschiedene Arten von Katalysatoren mitverwenden, die sich bei der Herstellung von Urethanen als brauchbar gezeigt haben. Beispiele von brauchbaren Katalysatoren sind tertiäre Amine, Salze organischer Säuren mit den verschiedensten Metallen, wie Alkalimetallen, und dergleichen. Beispiele von brauchbaren Lösungsmitteln sind Pyridin, Formamid, Tetrahydrofuran, Triäthylamin, Dimethylformamid, Äther, Methylenchlorid und dergleichen, wobei Pyridin bevorzugt ist.

Die Menge des gegebenenfalls vorhandenen Lösungsmittels kann gewünschtenfalls variieren und wird häufig durch den Zweck bei seiner Verwendung an erster Stelle bestimmt. Die relativen Mengen der verwendeten Reaktionsteilnehmer können in gleicher Weise wie gewünscht variieren, und ein geringer Überschuss eines der Reaktionsteilnehmer führt zu keinen nachteiligen Wirkungen. Die Verwendung eines der Reaktionsteilnehmer in

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einer geringeren als der stöchiometrischen Menge neigt - wie nicht anders zu erwarten - zur Herabsetzung der Ausbeute.

Wie ersichtlich ist, sollten die Bedingungen so gewählt sein, um zu gewährleisten, dass die Struktur der interessierenden Verbindung nicht abgebaut oder in anderer Weise nachteilig beeinflusst wird. Aus diesem Grunde bevorzugt man die Anwendung möglichst schonender Bedingungen.

Zahlreiche interessierende Verbindungen enthalten mehr als einen mit der Isocyanatgruppe reagierenden Rest. Dies kann zur Bildung von mehr als einer Spezies führen. Man kann diese Bildung auf ein Mindestmass herabsetzen oder sogar vermeiden, indem man besondere Techniken anwendet. Zu diesem Zweck und nach einer Ausführungsform vorliegender Erfindung kann deshalb die Umsetzung auf photochemischem Wege erfolgen.
Um die Herstellung von Urethanen zu ermöglichen, die nicht durch andere Verfahren hergestellt werden können, kann man bekanntlich die Reaktion in Tetrachlorkohlenstoff mit Ferrocen durchführen.

Beispielsweise besitzt Digoxin sechs Hydroxylgruppen.
Frühere Arbeiten vermuten, dass die Hydroxylgruppe am 15*— Kohlenstoffatom die reaktionsfähigste ist, gefolgt von der Hydroxylgruppe am 12-Kohlenstoffatom. Ohne Anwendung einer photochemischer. Reaktion stimmt die Analyse des Reaktionsproduktes eines auf Tyramin basierenden Isocyanats und Digoxin mit der Anwesenheit eines Gemisches von Digoxin-carbamaten überein, von denen eines eine Harnstoffbindung am 15'-Kohlen-

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stoffatom und von denen ein anderes eine Carbamatbindung sowohl am 15'- als auch am 12-Kohlenstoffatom aufweist. Es ist gefunden worden, dass die Anwendung einer photochemischen Reaktion nur eine einzige Art liefert, die mit einer Struktur mit einer Harnstoffbindung am ^'-Kohlenstoffatom übereinstimmt.

Begrifflich ergibt eine photochemische Reaktion in gleicher Weise eine einzige Verbindung in den Fällen, bei denen die reaktionsfähigen Reste der interessierenden Verbindung relativ unterschiedliche Reaktionsfähigkeiten in einer Grössenordnung ähnlich der der Hydroxylgruppen im Digoxin haben. Spezieller,

besagt dies,

d.h. in theoretischer Hinsicht,/dass die photochemische Reaktion in ausreichender Weise die Reaktionskinetik mit den meisten reaktionsfähigen Gruppen in bezug auf die Reaktionsfähigkeit der anderen Gruppen vergrössert, um die Bildung einer einzigen Verbindung zu gestatten.

Gegebenenfalls kann zur Schaffung einer besonders gewünschten Verbindung eine Blockierung aller reaktionsfähigen Gruppen erfolgen, der sich dann eine selektive Abspaltung der Schutzgruppen an den gewünschten Stellen anschliesst. Als spezielles Beispiel können bei Verwendung von 17ß-Östradiol die beiden Hydroxylgruppen mit jeweils einer Trimethylsilylgruppe durch Umsetzung mit Trimethylsilyl-NjN-dimethylcarbamat geschützt werden. Für ein selektives Entfernen der 3-Trimethylsilylgruppe unter Beibehaltung der Schutzgruppe in der 17-Stellung kann das Rohprodukt selektiv unter Anv/endung bekannter Spaltungsmittel, wie Methanol, gespalten werden, wie man

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durch die NMR-Spektroskopie überprüfen kann. Dieses Zwischenprodukt kann dann mit dem gewünschten Isocyanat umgesetzt werden, worauf sich eine Abspaltung der Schutzgruppe an der an sich unerwünschten Reaktionsstelle anschliesst.

Sofern gegebenenfalls des weiteren bei der Umsetzung mehr als eine Verbindung erzeugt wird, können übliche Trennverfahren, beispielsweise die Dünnschicht-Chromatographie, angewendet werden, um die gewünschte Verbindung zu isolieren. Ein Umkristallisieren oder dergleichen kann ebenfalls angewendet werden.

Wie aus der vorstehenden Beschreibung ersichtlich ist, wenn eine Blockierung des reaktionsfähigen Restes des Isocyanats erforderlich ist, bevorzugt man die Bildung des gewünschten Addukts oder Derivats vor einer Abspaltung der Schutzgruppe oder Schutzgruppen. Bekanntlich kann eine Abspaltung der Schutzgruppe zweckmässigerweise unter Verwendung verschiedener Lösungsmittel, wie wässriges Methanol oder dergleichen, durchgeführt werden. Die freigesetzte reaktionsfähige Gruppe kann dann zur Bildung des Addukts mit dem Substrat oder einem anderen interessierenden Material verwendet v/erden.

Die erfindungsgemässen Isocyanate, die einen markierten Rest oder einen markierbaren Rest enthalten, können in vorteilhafter V/eise in beliebigen der bekannten zahlreichen Verfahren zur Herstellung einer kompetitiven Bindung eingesetzt werden, um das Vorhandensein der interessierenden Verbindung in quantitativer V/eise zu bestimmen. Das jeweils verwendete

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Isocyanat hängt natürlich von der Markierungsart ab, die durch das ausgewählte Verfahren erforderlich ist. Das ausgewählte Verfahren wird zu einem grossen Teil durch die gewünschten Ergebnisse bestimmt. Wenn man demzufolge beispielsweise ein Verfahren zur Bestimmung des quantitativen Vorhandenseins einer Verbindung anwendet, wobei eine grösstmögliche Empfindlichkeit erwünscht ist, wie dies im allgemeinen der Fall bei Verbindungen von klinischem oder biologischen Interesse ist, bevorzugt man die Anwendung des Radioirnmunoassays und einer mit radioaktivem Jod markierten Verbindung.

Die radioaktive Markierung einer Isocyanatverbindung eines interessierenden Derivats kann mittels beliebiger an sich bekannter verschiedener Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise können die mit radioaktivem Jod markierten Derivate nach einer der nachstehenden Methoden hergestellt werden : Chloramin-T-Methode nach Hunter-Greenwood gemäss "Nature" 194 (1962), Seite 495; Jod-monochlorid-Methode nach Ceska, Grossmuller und Lundkvist, in "Acta Endocrinologia", 64 (1970), Seiten 112 bis 125; Isotopische Austauschmethode nach Counsell, Ranade, Pocha, Willette und Diguilio in "Journal Pharmaceut. Sciences" 57 (1968), Seite 1657 und Electrolytische Jodierung nach Pennisi und Rosa, in "Journal Nuclear Biol. & Medicine" J^ (1964), Seite 64.

1 25 Es ist erwünscht, als Radioisotop ^J zu verwenden, jedoch können auch andere Radioisotope, wie J, J oder J in gleicher V/eise eingesetzt werden.

Das radioaktiv markierte Derivat kann dann gereinigt werden,

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2 ! 11 U 6 b

um gegebenenfalls eine einzige Verbindung unter Anwendung üblicher bekannter Verfahren zu isolieren. Beispielsweise können die gebildeten mit radioaktivem Jod markierten Derivate, wie dies an sich bekannt ist, aus einem Gemisch von Mono- und Di-Jod-Verbindungen bestehen, und es kann vorteilhaft sein, eine einzige Art der Verbindungen zu isolieren.

Die erfindungsgemässen Derivate sind in hohem Masse vorteilhafte, gut charakterisierte Verbindungen, die ein Höchstmass an Genauigkeit, Richtigkeit, Empfindlichkeit, Spezifität und Reproduzierbarkeit erlauben. Je nach der Art der Herstellung können demzufolge reine Reagentien mit einer geringctmöglichen Konzentration an Ilebenorodukten gebildet werden, und die schonende Reaktion υλιγ Füldung der Derivate setzt die Möglichkeit einer Umlagerung der mit den erfindungsgemässen Isocyanaten gekuppelten klinischen Verbindung auf ein Mindestmass herab. Darüber hinaus verringert die Herstellung der Derivate die Unterschiede hinsichtlich der Affinität gegenüber dem Bindungsmittel des Radioindikators und des ursprünglichen Haptens oder Antigens, so dass ein wirksamer kompetitiver Versuch möglich ist.

Wie hieraus ersichtlich 1st, bildet einen weiteren Gegenstand vorliegendc-r £rfindunr die Verwendung eier erfindungsgemässen Addukte bei de;' Di,;· .'.hr'ihrun., eines kompeti tiven Bindungs-Radioaf;say.s einer i:: ten..·::.:; \ "Vl nden Verbindung. Dies hat bekanntlich die ^:" rs te [ Luti.·, :>n.ei' ί. ich- bzw. !!esskurve des Zerfalls je Ze i. te in'rieit ;e.;·.■".■;.^;.ibor¹ .(er Konzentration der interessierenden Verbindung :;ur L^oI ■,-■. üicce kann in einen vierstufigen Verfah-

27 22 O ^ R

ren erstellt werden, wobei miteinander reagieren °^σ

1) eine feste Anzahl von Bindungsstellen (beispielsweise Anti körper) , die spezifisch für die interessierende Verbindung sind,

2) eine feste Menge des Radiomarkierungsmittels oder Radioindikators und

3) unterschiedliche Mengen einer reinen Standard-Bezugsverbindung.

Für jede Verdünnung des Standards in der ersten Stufe werden die freien Verbindungen von den gebundenen Verbindungen getrennt. Die Trennung kann durch Anwendung üblicher Methoden erfolgen. Eine Anzahl derartiger Methoden sind bekannt, beispielsweise die Chromatoelektrophorese oder die Absorption und die Eluierung aus einer kleinen Säule mit einer Beschikkung von besonderer Aktivkohle_s einem Austauscherharz, Cellulose oder Siliciumdioxid. Unter Verwendung eines geeigneten Strahlungszählers wird der Zerfall je Zeiteinheit entweder bei der gebundenen oder bei der freien Fraktion jeder Reaktion oder Verdünnung bestimmt. Sine Standard-Zerxallskurve je Zeiteinheit gegen die Konzentration der reinen Bezugsverbindung kann danach konstruiert werden.

Der Zerfall je Zeiteinheit für eine interessierende Verbindung in einer Probe wird dann dadurch bestimmt, dass man die Probe kompetitiven 3iridungsbedingungen unterwirft. Dies wird unter Verwendung der ,-!eichen allgemeinen Stufen erreicht, wie sie bei der Ermittlung der* Standardkurve angewendet worden sind. Demzufolge reagieren bei der Probe miteinander die gleiche

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Anzahl von Bindungsstellen und die identische festgelegte Menge des bei der Ermittlung der Standardkurve verwendeten Radioindikators. Nach der Abtrennung der freien Verbindungen von den gebundenen Verbindungen kann der zuvor verwendete Strahlungszähler zur Bestimmung des Zerfalls je Zeiteinheit für die gleiche Fraktion eingesetzt werden, die zur Ermittlung der Standardkurve verwendet worden ist.

Unter Verwendung der Standardkurve entspricht die Konzentration der interessierenden Verbindung derjenigen Konzentration, die dem Zerfall je Zeiteinheit entspricht, wie sie zuvor für die Probe bestimmt worden ist.

Die Beispiele erläutern die Erfindung, jedoch beschränken sie nicht.

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Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines Isocyanats aus einem Amin, das weitere reaktionsfähige funktinnelle Gruppen aufweist, nämlich dem 2-(4'-Hydroxyphenyl)-äthylamin mit Trivialnamen Tyramin, das nach dem Abspalten der Schutzgruppe mit radioaktivem Jod markiert werden und dann mit einer klinisch interessierenden Verbindung gekuppelt werden kann.

Ein 250 ml fassender, mit Rückflußkühler, Gaseinleitungsrohr und magnetischem Rührer ausgerüsteter Dreihalskolben wird unter Stickstoffdruck mit 100 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran, 1,4 g (0,01 Mol) Tyramin und 5,0 ml Triäthylamin beschickt. Zu diesem Gemisch tropft man 3>0 ml Trimethylchlorsilan bei Raumtemperatur hinzu und rührt das Reaktionsgemisch J>0 Minuten. Anschließend leitet man mittels einer Injektionsnadel im Verlauf von 4 Stunden langsam Kohlendioxid in das Reaktionsgemisch ein, während das Gemisch gleichzeitig unter Rückfluß sieden gelassen wird. Nach Beendigung des Kohlendioxideinleitens fügt man unter Verwendung einer Injektionsspritze langsam 1,5 ml Siliciumtetrachlorid hinzu. Nach weiteren 30minütigem Erhitzen läßt man das Reaktionsgemisch abkühlen und filtriert das Triäthylamin-hydrochlorid ab. Anschließend entfernt man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck von 12 Torr bei 35 C und destilliert das erhaltene öl bei 88 bis 90⁰C unter 0,05 Torr. Man erhält 2-(4^f-Trimethyl-siloxy-phenyl)-äthylisocyanat als farblose Flüssigkeit.

Das IR-Spektrum dieser neuen Verbindung zeigt Absorptionsbanden bei 3,39, 4,41, 6,17 und 6,58 u. Das NMR-Spektrum in Deuterochloroform zeigt Absorptionsbanden beio= 7,08 und 6,77 (A₂B₀-Quartett, 4, J=8,4 Hz, aromatische 3¹-, 5'- und 2'-, 6^f-Protonen);

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3,43 (t, 2, J=6,6 Hz, -CH₂CH₂-N); 2,79 (t, 2, J=6, und 0,25 ppm (s, 9, -OSi (CH^)-^) ·

Das Massenspektrum zeigt ein Molekularion bei m/e 235 und weitere Maxima bei 179, I63, I07 und 73, sowie ein metastabiles Maximum bei 163,3·

Beispiel 2

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-Isocyanato-3-(4' -t: iTiethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester mit dem Trivialnamen geschütztes L-Tyrosin-methylester-isocyanat, die

nach Abspalten der Schutzgruppe mit radioaktivem Jod markiert werden kann.

Durch ein gerührtes Gemisch von 9*75 g (0,05 Mol) L-Tyrosinmethylester, der in 200 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran suspendiert ist, und 45 ml (0,30 Mol) Triäthylamin läßt man einen Strom wasserfreies Kohlendioxid durchperlen. Nach 30 Minuten fügt man langsam 20 ml (0,16 Mol) Trimethylchlorsilan hinzu. Das Reaktionsgemisch läßt man unter ständigem Durchleiten von Kohlendioxid 4 Stunden unter Rückfluß sieden und anschließend auf Raumtemperatur abkühlen. Das Einleiten von Kohlendioxid wird beendet. Dann fügt man langsam 8,5 g (6,0 ml; 10,05 Mol) Siliciumtetrachlorid hinzu und rührt das Reaktionsgemisch weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur.

Dann läßt man das Reaktionsgemisch 60 Minuten unter Rückfluß sieden, kühlt es auf Raumtemperatur und versetzt es mit 50 ml tert.-Butanol. Das Gemisch wird weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Stickstoff filtriert. Der Filterkuchen wird mit 30 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gewaschen.

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ORIGINAL INSPECTED

Die vereinigten Filtrate werden unter vsrmindertem Druck eingedampft und unter Verwendung einer Kurzwegkolonne destilliert.

Die unter einem Druck von 0,05 Torr bei 100 bis 145°C erhaltene Fraktion wird nochmals destilliert. Man erhält 5,8 g (= 39 % der Theorie) 2-Isocyanato-3-(4¹-trimethyl-siloxyphenyl)-propionsäuremethylester als viskoses farbloses öl vom Kp. 139 bis l40°C bei 0,1 Torr.

IR-Spektrum (unverdünnter Aufstrich): 3,38, 4,45 (N=C=O), 5,73 (Ester-C=O); 6,22, 6,64, 10,9 und 11,8 u.

NMR-Spektrum (CCl^): $ = 7,00 und 6,70 (AgBg-Quartett, 4, J=8,6 Hz, aromatische 3'-,5^!- und 2'-,6'-Protonen); 4,10 (t, 1, J=6,0 Hz, -CH₂-CH-); 3,66 (s, 3, -OCH,); 2,91 (d, 2, J=6,0 Hz, -CH₂-CH-) und 0,22 ppm (s, 9, (CH-J-zSi-).

Massenspektrum (7OeV): m/e (rel. Intensität): 293 (5), 278 (1,5), 250 (1), 234 (2,5), 218 (0,75), 179 (100J, I63 (2,3), 149 (2), 107 (2) und 73 (40).

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-Isocyanato-

3- (4'-tert.-butyl-dimethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester^ die nach Abspalten der Schutzgruppe radioaktiv jodiert werden kann.

Das Verfahren der Beispiele 1 bzw. 2 wird in analoger Weise wiederholt. In 100 ml wasserfreies Tetrahydrofuran werden 8,0 g (0,04 Mol) L-Tyrosin-methylester gegeben. Dann leitet man während 30 Minuten in das gerührte Reaktionsgemisch einen langsamen Strom

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HS

von wasserfreiem Kohlendioxid ein, währenddessen 50 ml Triäthyl- amin zugetropft werden. Dann gibt man 15 g (0,1 Mol) tert.-Butyldimethyl-chlorsilan hinzu und erhitzt das Reaktionsgemisch 4 Stunden unter Rückfluß. Nach dem Abkühlen werden 8,5 g (6,0 ml; 0,05 Mol) Siliciumtetrachlorid hinzugegeben. Danach rührt man das Reaktionsgemisch weitere 30 Minuten und erhitzt es zusätzlich 60 Minuten unter Rückfluß. Dann fügt man 50 ml tert.-Butanol hinzu, um gebildete Silylchloride zu zersetzen, und setzt das Rühren weitere J>0 Minuten fort.

Nach dem Filtrieren, Waschen und Einengen des Reaktionsgemisches, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben,gewinnt man 2,7 g (= 20 % der Theorie) des farblosen Isocyanats vom Kp. l80°C bei 0,5 Torr.

IR-Spektrum (Aufstrich): 3,38, 4,44, 5,71, 6,17 und 6,53 u.

NMR-Spektrum in CDCl, :<5= 7,13 und 6,83 (A₂B₂-Quartett, 4, J=8,6 Hz, aromatische 3'-,5'- und 2'-,6'-Protonen); 4,26 (t, 1, J=6,0 Hz, -CH₂CH); 3,83 (s, 3, -OCH,); 3,08 (d, 2, J=6,0 Hz, -CH₂CH-); 1,03 (s, 9, -C(CH,),) und 0,26 ppm (s, 6, -Si(CH,)₂).

Massenspektrum: m/e 335, 278, 250, 236, 221, 205, 172, 73 und 57.

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 2-Trimethylsiloxyäthyl-isocyanat nach dem vorstehend beschriebenen Austaus chve r fahren.

Unter Stickstoffatmosphäre werden 6,1 g (0,1 Mol) Äthanolamin und 100 ml Triäthylamin, die in 100 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst sind, mit gasförmigem Kohlendioxid behandelt, um das Carbaminsäuresalz zu bilden. Dann gibt man 24 ml (0,2 Mol) Trimethylchlorsilan mittels einer Injektionsspritze hinzu und erhitzt das Reaktionsgemisch 2 Stunden unter Rückfluß. Dann beendet man die Kohlendioxidbehandlung, kühlt das Reaktionsgemisch, filtriert und wäscht es wie in Beispiel 7 und führt das Piltrat und die Waschwässer, die Silylcarbamat enthalten, in das Vorratsgefäß zurück.

Während das Reaktionsgemisch gerührt wird, tropft man 12 ml (0,05 Mol) Siliciumtetrachlorid im Verlauf von 15 Minuten hinzu. Das Reaktionsgemisch wird dann über Nacht gerührt, anschließend filtriert, unter vermindertem Druck eingedampft und destilliert. Man erhält 2-Trimethyl-siloxyäthyl-isocyanat vom Kp. 27 bis 29 C bei 0,02 Torr.

IR-Spektrum (unverdünnter Aufstrich): 3,42, 4,42 (N=C=O); 8,0 (TMS), 9,0, 10,67 und 11,95 u.

NMR-Spektrum in CDCl₃: £= 3,71 (t, 2, J=5,0 Hz); 3,28 (t, 2, J=5,0 Hz) und 0,16 ppm (s, 9, Si-(CH),),).

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Il 5Γ' - 33"-

Beispiel 5

2722030

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3ß-O-/~O-ß· (3ß-O- ■[ N-/Carbomethoxy-2-(4' -hydroxyphenyl) -äthyl-l-yl_7J carbamyl-digitoxosyl)-(1 -> 4)-0-ß-digitoxosyl-(i -^ 4)-ßdigitoxos-l-yl_7-12ß,i4ß-dihydroxy-5ß-card-20(22)-enolid, Trivialbezeichnung: 15'-(Tyrosin-methylester)-carbamyl-digox.in:

Ein Gemisch von 0,300 g (3,84 χ 10" Mol) kristallinem Digoxin und 0,122 g (3,84 χ 10"⁴ Mol) 2-Isocyanato-3-(V-trimethylsiloxy-phenyl)-propionsäure-methylester, der nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, wird in 3 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und 6 Tage bei 45 - 50⁰C

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gerührt. Dann entfernt man das Pyridin bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck, versetzt den Rückstand mit 5 ml Methanol und rührt das Gemisch weitere 30 Minuten. Das Methanolvolumen wird dann unter vermindertem Druck auf etwa 1 ml vermindert. Das rohe Reaktionsgemisch wird dann einer preparativen Dünnschichtchromatographie an Silicagel (20 χ 20 χ 0,2 cm grosse,

vorbeschichtete Dünnschichtchromatographie-Platten) unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems unterworfen.

Nach dem Entwickeln werden 3 Hauptbanden und eine Nebenbande auf der Dünnschichtchromatographie-Platte unter einer kurzwelligen Ultraviolettlampe (254 mn) beobachtet. Das Sichtbarmachen der Banden als eine Reihe von bräunlich-schwarzen Flecken erfolgt durch vorsichtiges Herausschneiden eines 1,5 x 20 cm grossen Streifens von der jeweiligen senkrechten Kante der Dünnschichtchromatographie-Platte unter Verwendung eines Glasschneiders durch Besprühen des Streifens mit einer geringen Menge eines Aerosols von konzentrierter Schwefelsäure und durch Erhitzen auf 100⁰C, bis die Flecken deutlich genug geworden sind. Dann wird ein unmittelbarer Vergleich dieses Streifens mit dem Rest auf der Dünnschichtchromatographieplatte als alternierendes Mittel der Bandenlokalisierung angewendet. Von der Platte werden alle Banden abgeschabt und mit 10 Prozent Methanol enthaltendem Methylenchlorid eluiert. Das Lösungsmittel wird dann bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck entfernt.

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Die erste Hauptbande mit einem Laufwert R_f = 0,65 (für einen genaueren Vergleich der anderen drei Komponenten wird die relative Mobilität mit 1,0 bezeichnet) enthält 0,120 g (= 40 Prozent der Theorie) eines weissen Feststoffes vom Fp. 241 bis 244⁰C. Diese Verbindung wird durch Vergleich mit einer authentischen Probe als Digoxin identifiziert.

Die zweite Bande (Nebenbande) mit einem Lauft/ert R_f = 0,7 (relative Mobilität = 1,07) enthält Spuren (< 0,001 g) eines nicht identifizierbaren farblosen Feststoffes, der nicht weiter charakterisiert worden ist.

Die 3. Hauptbande, R_f = 0,76 (relative Mobilität = 1,17), ergibt 0,057 g (15 %) 3ß-0-/~0-ß^O- { N-/T-Carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyl)_J7-äth-1-yl) -carbamyl-digitoxosyl)-(i -^ 4)-0-ß-digitoxosyl-(1 -^ 4)-ß-digitoxos-1-yl7-12ß,i4ß-dihydroxy-5ß-card-20(22)-enolid als glasartigen farblosen Feststoff vom Fp. 215 - 220⁰C. (Zers.).

UV-Spektrum in CH₃OH: A _max 222 mn (6 = 11 930) und 275 mn (β = 1 870.

IR-Spektrum (KBr): 2,99 (-0H), 3,50, 5,78 (Lacton-C = 0), 5,83 (Ester-C = 0), 6,19, 6,65, 6,95, 7,27, 7,35, 7,96, 8,20, 8,63, 9,22, 9,41, 9,86, 11,56, 12,01 12,23 und 12,54/U.

NMR-Spektrum (50 % CDCl^Aceton-d^) S = 7,73 (s, 1, aromatisches-OH): 6,97 und 6,70 (A₂B₂-Quartett, 4, J = 8,6 Hz; Tyrosin-3'-,5'- und 2'-,6'-Protonen); 5,91 (s, 1, Lacton-C =

/ η 7

-36.

CH-); 3,74 (s, 3, Ester-OCH₃); 0,93 (s, 3, 19-CH₃) und 0,83 ppm (s, 3, 18-CH,), Trivialbezeichnung: 15^f-(TME)-carb-

amyldigoxin.

Die 4.Hauptbande, R_f = 0,79 (relative Mobilität = 1,22) ergibt 0,067 g (16 %) 3ß-0-/"0-ß-(3ß-0-tN-_/"i-Carbomethoxy-2-(4^f-hydroxyphenyl)-äth-1-yl_'7)-carbamyl-digitoxosyl)-(1 ·> 4)-0-ß-digitoxosyl-(1 ■» 4)-ß-digitoxos-1-yl_7-12ß-0-^N-/""i-carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyl)-äth-1-yl_7-carbamylJ -14ß-hydroxy-5ß-card-20(22>enolid als glasartigen farblosen Farbstoff vom Fp. 220 - 224°C. (Zers.).

UV-Spektrum in CH_xOH: λ ___v 222 nm (£ = 22 050) und 273 nm (£ = 11 540).

IR-Spektrum (KBr) tf = 3,01 (OH), 3,47, 5,78 (Lacton-C = 0),

5,82 Ester-C = 0), 6,17, 6,63, 6,95, 7,28, 7,35, 7,95, 8,19, 8,58, 8,87, 9,17, 9,40, 9,86, 10,05, 11,52, 11,89, 12,12 und 12,45/U.

NMR-Spektrum (60 MHz, 50 % CDCl^-Aceton-dg) S « 7,61 (s, 1, aromatisches-OH): 7,06 und 6,78 (A₂B₂-Quartett, 4, J = 8,6 Hz, Tyrosin-3^f-,5'- und 2'-,6·-Protonen); 7,02 und 6,78 (A₂B₂- uartett, 4, J = 8,6 Hz, Tyrosin-3'-5'- und 2'-, 6'-Protonen); 5,91 (s, 1, Lacton-C = CH-): 3,75 (s, 6, Ester-OCH^): 0,93 (s, 3, 19-CH₃) und 0,83 ppm (s, 3, 18-CH₃).

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«9

NMR-Spektrum (220 MHz, DMS0-d₆) 8 = 7,37 (s, 1, aromatisches OH): 7,03 und 6,99 (A₂B₂-Quartett, 4,J= 8,0 Hz, Tyrosin-3¹-, 5¹- und 2·-, o'-Protonen); 6,66 und 6,64 (A₂B₂-Quartett, 4, J m 8,0 Hz, Tyrosin-3'-,5'- und 2«-,6'-Protonen); 5,90 (s, 1, Lacton-CH = CH-): 3,61 (s, 3, Ester-OCH^); 3,60 (s, 1, Ester-0CH₃): 0,84 (s, 3, 19-CH₃) und 0,76 ppm (s, 3, 18-CH₃), Trivialbezeichnung: 12,15'-(Di—TME)-carbamyl-digoxin.

Beispiel 6

125
Zu einem Gemisch einer Na- J-Lösung mit 2,0 Millicurie, 25/Ul einer 0,5-m Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,5 und 2/Ug von in 20 /ul Methanol gelöstem 15'-(TME)-carbamyldigoxin in einem 1,5 ml Mikroproberöhrchen werden auieinmal 50/Ug Chloramin T (Natriumsalz des N-Chlor-para-toluolsulfonsäureamid-trihydrats) gegeben, die in 20/ul einer 0,05-m Kaliumphosphat-Pufferlösung vom pH 7,5 gelöst sind. Nach genau 20 Sekunden werden 100 /Ug Natriummetabisulfit zugegeben, die in 20/Ul einer 0,05-m Kaliumphosphat-Pufferiösung vom pH 7,5 gelöst sind, um die Reaktion zu beenden.

Eine 1 /ul Probe des Reaktionsgemisches wird auf eine analytische Silicagel-Dünnschichtchromatographie-Platte mit einer Grosse von 5 x 20 χ 0,025 cm aufgebracht. Der Rückstand wird in einer 6 χ 0,2 cm breiten Bande auf eine präparative Dünnschichtchromatographie-Platte der Abmessungen 20 χ 20 χ 0,2 cm aus einer Silicagelschicht in einer Entfernung von 2 cm von

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der Grundkante der Platte aufgetragen. Die Platten werden 15 Minuten an der Luft getrocknet und dann unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems entwickelt, bis die Lösungsmittelfront die Oberkante Jeder Platte erreicht hat. Die Platten werden dann 30 Minuten an der Luft getrocknet, dann mit einer dünnen transparenten Polyäthylenfolie umhüllt und mit einem Röntgenfilm und einem Radiochromatogramm-Abtaster analysiert, um die radioaktiven Banden auf den Platten zu lokalisieren und quantitativ zu bestimmen.

Jede Platte zeigt typischerweise drei radioaktive Banden (Flecken auf der analytischen Dünnschichtchromatographie-Platte). Die Bande beim Ausgangspunkt, R_f = 0,0, enthält typischerweise 200/uCi {10 Prozent der Gesamt-RadioaKtivität; und

125
entspricht nicht umgesetztem ,J.

Die Hauptbande, R- = 0,28 (präparative DUnnschichtchromatographieplatte) und 0,35 (analytische Dünnschichtchromatographieplatte) enthält 1600/uCi (80 Prozent der Gesamtradioaktivität) der Verbindung

3ß-0-/~0-ß- {3ß-0-/"N- {i-Carbomethoxy-2-/~4^l-hydroxy-3^t-(¹ -\j)-jod-phenyl_jj -äthyl-l-yl_7-carbamyl-digitoxosylj (1 ^ 4)-0-ß-digitoxosyl-(i > 4)-ß-digitoxos-l-yl_7-12ß,i4ßdihydroxy-5ß-card-20(22)-enolid (Trivialbezeichnung: 15'-(TME)-carbamyl-digoxin-J).

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Diese Bande wird von der präparativen Dünnschichtchromatographieplatte abgeschabt, in eine Glassäule der Abmessungen 15 x 0,9 cm überführt, die am unteren Ende mit einem Glaswolle-Pfropfen verschlossen ist, und mit 30 ml eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems in 1 ml Anteilen eluiert. Das gesammelte Eluat wird mittels eines Stroms von wasserfreiem Stickstoff zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 0,5 ml wasserfreiem Äthanol gelöst, die Lösung auf eine analytische DUnnschichtchromatographieplatte der Abmessungen 20 χ 20 χ 0,025 cm aufgebracht und dann unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems entwickeln gelassen. Die Dünnschichtchromatographieplatte wird dann an Luft getrocknet, mit einer dünnen transparenten Polyäthylenfolie umhüllt und mittels Autoradiographie unter Verwendung eines Röntgenfilms analysiert, um die radioaktiven Banden auf der Platte zu lokalisieren. Die radioaktive Bande, die dem 15'-(TME)-carbamyl-

125

digoxin- J entspricht, wird von der Dünnschichtchromatographieplatte abgeschabt, in eine Glassäue der Abmessungen 15 x 0,9 cm überführt, die am unteren Ende mit einem Glaswollepfropfen verschlossen ist, und aus dem Silicagel mittels 30 ml einer 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösung eluiert, die in 3 ml-Anteilen auf die Säule aufgebracht wird. Das Gesamteluat wird mittels eines Stromes wasserfreien Stickstoffs eingedampft. Der Rückstand wird in 1 ml wasserfreiem Äthanol gelöst. Die Dünnschichtchromatographie an Silicagel mit den Abmessungen 5 x 20 χ 0,025 cm zeigt unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmit-

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telsystems das Vorhandensein eines einzigen homogenen Flecks, Die gereinigte Substanz, die bei -2O⁰C aufbewahrt wird, ist mehrere Monate stabil.

Die dritte Bande (Nebenbande) mit einem Laufwert R- = 0,34 (präparative Dünnschichtchromatographieplatte) und 0,43 (analytische Dünnschichtchromatographieplatte) enthält 300/uCi (15 Prozent der Gesamt-Radioaktivität) der Verbindung

3ß-0-/~0-ß-f 3ß-0-/~N- ·£ 1 -Carbomethoxy-2-/~4 · -hydroxy-3 ·, 5' (¹²⁵J)-dijod-phenyl_7? -äthyl-l-yl_7-carbamyl-digitoxosyl} (1 > 4) -0-ß-digitoxosyl-(i > 4)-ß-digitoxos-l-yl_7-12ß,i4ßdihydroxy-5ß-card-20(22)-enolid (Trivialbezeichnung: 15'-(TME)-carbamyldigoxin-di-ⁱ²⁵J).

Diese Bande wird von der präparativen Dünnschichtchromatographieplatte abgeschabt, in eine Glassäule mit den Abmessungen 15 x 0,9 cm überführt, die am unteren Ende mit einem Glaswollepfropfen verschlossen ist, und mit 30 ml eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems eluiert. Das gesammelte Eluat wird unter einem Strom von wasserfreiem Stickstoff zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 0,5 ml wasserfreiem Äthanol gelöst und bei -20°C aufbewahrt.

Beispiel 7 Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von

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17ß-O-£ Ν-/~2-(4·-Hydroxyphenyl)-äthyl_7} -carbamyl-androst- 4-en-3-on, Trivialbezeichnung: 17-(Tyramin)-caramyl-testosteron:

Il ,_.

OCNHCH₂CH₂-(Oa⁰"

Diese Verbindung wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 5 beschrieben durch dreitägiges Reagierenlassen von 0,25 g Testosteron mit 0,24 g des nach Beispiel 1 hergestellten 2-(4'-Trimethyi- siloxyphenyl)-äthylisocyanats in 5 ml Methylenchlorid bei 50°C hergestellt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels erhält man das Rohprodukt. Nach dem Entfernen der Schutzgruppe mit Methanol und anschliessendem Kristallisieren aus dem gleichen Lösungsmittel erhält man 0,100 g der vorstehend genannten Verbindung vom Fp. 244 bis 246⁰C. Die Dünnschichtchromatographie an Silicagel mit den Plattenabmessungen 20 χ 5 x 0,025 cm unter Verwendung eines 5 Prozent Methanol enthaltenden Chloroform-Lösungsmittelsystems zeigt einen Laufwert R_f = 0,46 für diese Verbindung.

Diese Verbindung wird durch das IR-Spektrum (KBr) charakterisiert. Das Spektrum zeigt Banden bei :

3,05 (OH), 3,40, 5,92 (Carbamat-carbonyl), 6,02(Vinylcarbonyl), 6,20 (aromatisch), 6,60, 6,90, 7,90, 8,10, 9,52, 9,90,41,60 und 11,98/U.

Das NMR-Spektrum in 30 % CF₃CO₂H-CDCl₃ zeigt Signale bei 8 = 7,26 (s, 1, aromatisches-OH); 7,08 und 6,82 (A₂B,,-Quartett, 4,J= 8,4 Hz, Tyramin-3'-,5'- und 2'-,6'-Protonen), 5,96 (s, 1, -CH= C-); 1,25 (s, 3, 19-CH₃) und 0,86 ppm (s, 3, 18-CH₃).

Analyse :	ber:	74	C	H	25	3	N
	gef.:	74	,46	8,	05	3	,1
		,35	8,		,3

Beispiel 8

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 21-0- \ N-/~2-(4·-Hydroxyphenyl)-äthyl_7 } -carbamyl-pregn-4-en-i1ß, 17©C-diol-3,20-dion, Trivialbezeichnung: 21-(Tyramin)-carbamyl-cortisol :

0
Il

^HOvi r^d

df

Man lässt 4 Std. lang bei Raumtemperatur 0,150 g Cortisol mit 0,240 g 2-(4'-Trimethyl-siloxyphenyl)-äthylisocyanat in 2 ml Pyridin reagieren. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und nach dem Abspalten der Schutzgruppe mittels Methanol isoliert man das Carbamat mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 20 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems (R_f = 0,63).

Das IR-Spektrum dieser Verbindung an KBr zeigt die nachstehenden Banden :

2,98 (Hydroxyl), 3,42, 5,80 (Carbamat-C = 0), 5,85 (C20-C=0), 6,04 (Vinyl-C = 0), 6,62, 6,88, 7,o5, 7,20, 7,35, 7,90, 8,10, 8,52, 8,80, 8,95, 9,45, 9,70, 11,55, 12^5, 12,80 und 14,70/U.

Das NMR-Spektrum in 50 % CDCl,-DMSO-dg zeigt Signale bei 9- 7,55 (s, 1, aromatisches OH); 7,02 und 6,73 (A₂B₂-Quartett, 4,J = 8,2 Hz, Tyramin-3^f-,5'- und 2'-,6'-Protonen); 5,63 (s, 1, -CH = C); 1,44 (s, 3, 19-CH^) und 0,89 ppm (s, 3, 18-

Beispiel 9

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3-0- \ N- £"Z-(4«-Hydroxyphenyl)-äthy1_7} -carbamyl-östra-1,3,5(10)-trien-17-on, Trivialbezeichnung: 3-(Tyramin)-carbamyl-östron :

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-Vt-

In der gleichen allgemeinen Weise wie in Beispiel 5 beschrieben stellt man die vorgenannte Verbindung durch 24~stündiges Umsetzen von 0,190 g Östron und 0,360 g 2-(4'-Trimethylsiloxyphenyl)-äthylisocyanat, das in einem Gemisch von 3 ml Triäthylamin und 0,5 ml Dioxan gelöst ist, in Gegenwart von 0,050 g Triphenylphosphin als Katalysator bei 70⁰C die vorgenannte Verbindung her. Nach dem Abdampfen der Lösungsmittel unter vermindertem Druck und nach dem Entfernen der Schutzgruppe mit Methanol isoliert man die vorstehend genannte Verbindung mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel mit den Plattenabmessungen 20 χ 20 χ 0,2 cm unter Verwendung eines 2 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems (R- = 0,48).

Das IR-Spektrum (Aufstrich) zeigt Banden bei 3,03 (Hydroxyl), 3,43, 5,82 (breit, Carbonyl), 6,22, 6,68, 6,93, 7,40, 8,20, 9,50, 12,20 und 13,30/U.

Das NMR-Spektrum (CDCl,) zeigt Signale bei ό"'= 7,15 (m, 8 aromatische Protonen und aromatisches OH) und 0,83 ppm (s, 3_t 18-CH₃).

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ς*

Beispiel

10

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3ß-O-/~O-ß-(3ß-O-{ N-/~2-(4·-Hydroxyphenyl)-äthyl-l-yl_7V -carbamyl-digitoxosyl)-(1 ·> 4)-0-ß-digitoxosyl-(1 > 4)-ß-digitoxos-1-yl_7-12ß,14ß-dihydroxy-5ß-card-20(22)-enolid, Trivialbezeichnung: 15'-(Tyramin)-carbamyl-digoxin :

Ein Gemisch aus 0,200 g (2,56 χ 10 Mol) kristallinem Digoxin und 0,061 g (2,56 χ 10"^ Mol) des nach Beispiel 1 hergestellten 2-(4'-Trimethyl-siloxyphenyl)-äthylisocyanats wird in 3 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und 7 Tage bei 45 bis 50⁰C gerührt. Dann entfernt man das Pyridin unter ver-

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mindertem Druck bei Raumtemperatur, fügt 5 ml Methanol zu dem Rückstand und rührt das Gemisch weitere 30 Minuten. Das Methanolvolumen engt man unter vermindertem Druck auf etwa 1 ml ein und unterwirft das rohe Reaktionsgemisch der präparativen Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems. Nach dem Entwickeln werden auf der Dünnschichtchromatographieplatte unter UV-Licht der Wellenlänge 254 nm zwei Hauptbanden und zusätzlich eine Bande für nicht umgesetztes Digoxin beobachtet.

Die erste Bande, R_f = 0,44, enthält 0,030 g 15'-(Tyramin)-carbamyl-digoxin. Diese Verbindung wird durch das IR-Spektrum an KBr charakterisiert und liefert folgende Banden :

2,95 (Hydroxyl), 3,45, 5,80 (breit, Carbonyl), 6,18, 6,63, 6,90, 7,28, 8,55, 8,85, 9,35, 9,85, 11,50, 12,10 und 13,75/u.

Das NMR-Spektrum in 50 % CDCl^-Aceton-dg zeigt Signale bei ^= 7,55 (s, 1, aromatisches OH); 7,05 und 6,79 (A₂B₂-Quartett, 4,J= 8,4 Hz, Tyramin-3^f-,5'- und 2'-,6»-Protonen); 5,90 (s, 1, Lacton-C = CH-); 0,93 (s, 3, 19-CH,) und 0,83 ppm (s, 3, 18-CH₃).

Die zweite Hauptbande, R_f = 0,55, liefert 0,030 g 12,15'-(Dityramin)-carbamyl-digoxin.

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NMR-Spektrum (50 % CDCl₃-Aceton-d₆) bei S = 7,73 (s, 1, aromatisches-OH); 7,08 und 6,76 (A₄B₄-Quartett, 8,J= 8,6 Hz, Tyramin-3',5'- und 2'-,6·-Protonen); 5,86 (d, 1, Lacton-C = CH); 0,93 (s, 3, 19-CH₃) und 0,83 ppm (s, 3, 18-Cg₃).

Beispiel 11

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 15'-(Tyramin)-carbamyl-digoxin unter Anwendung einer photochemischen Reaktion, wie sie von Bruner und Mitarbeitern in "Journal of the Chemical Society", Chemical Communications, (1974), S.253, beschrieben worden ist.

-U
Zu 0,100 g (1,28 χ 10 Mol) Digoxin, das in 100 ml entgastem Tetrachlorkohlenstoff suspendiert ist, werden 0,032 g (1,36 χ 10 Mol) 2-(4'-Trimethyl-siloxyphenyl)-äthylisocyanat und 0,003 g (1,61 χ 10 Mol) Ferrocen gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 12 Stunden unter ständiger Bestrahlung mit dem Licht einer Wolframlampe bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird in Methanol gelöst, um die Trimethylsilyl-Schutzgruppen abzuspalten.

Die Reinigung des Rohproduktes mittels präparativer Dünnschichtchromatographie wie in Beispiel 10 beschrieben ergibt 0,025 g 15'-(Tyramin)-carbamyl-digoxin. Es wird kein 12,15'-(Dityramin)-carbamyl-digoxin festgestellt.

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(ob Beispiel 12

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3ß-O- {n-/~2-(4·-Hydroxyphenyl)-äthyl_7f -carbamyl-^ß,I4ßdihydroxy-5ß-card-20(22)-enolid, Trivialbezeichnung: 3-(Tyramin)-carbamyl-digoxigenin :

Unter Anwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie in Beispiel 5 beschrieben werden 24 Stunden lang 0,100 g Digoxigenin mit 0,220 g 2-(4'-Trimethyl-siloxyphenyl)-äthylisocyanat in 2 ml wasserfreiem Pyridin bei 80⁰C umgesetzt. Dann entfernt man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck und behandelt den Rückstand mit Methanol, um die Trimethylsilyl-Schutzgruppe abzuspalten. Die Reinigung des Rohproduktes mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems ergibt 0,025 g der vorstehend genannten Verbindung (R_f = 0,57).

Das IR-Spektrum dieser Verbindung an KBr zeigt Absorptionsbanden bei :

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- kV -

3,00 (Hydroxyl), 3,48, 5,85 (breit, Carbonyl), 6,20, 6,62, 6,92, 7,05, 7,40, 7,95, 8,20, 8,55, 9,05, 9,72, 10,10, 10,50 und 12,00/U.

Das NMR-Spektrum in Methanol-d^ zeigt Signale bei S = 7,88 (s, 1, aromatisches OH); 7,05 und 6,70 (AgBg-Quartett, 4, J * 8,2 Hz, Tyramin-3¹-,5^I- und 2·-,6·-Protonen); 5,83 (s, 1, Lacton-C = CH); 0,96 (s, 3, 19-CH₃) und 0,85 ppm (s, 3, 18-CH₃),

Beispiel 13

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 21-0 £~Λ-Carbomethoxy-2-(4·-hydroxyphenyl)-äthyl_7J -carbamyl pregn-4-en-11ß,17©4-diol-3,20-dion, Trivialbezeichnung: 21-(Tyrosin-methyl-ester)-carbamyl-cortisol :

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Unter Anwendung des gleichen allgemeinen Verfahrens wie in Beispiel 5 beschrieben werden 4 Tage lang 0,362 g Cortisol mit 0,297 g 2-Isocyanato-3-(4'-trimethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester in 5 ml wasserfreiem Pyridin bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck löst man das rohe Reaktionsgemisch in . Methanol, um die Schutzgruppe zu entfernen. Dann reinigt man das erhaltene Produkt mittels präparativer DünnschichtChromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 50 Prozent Chloroform enthaltenden Acetonlösungsmittelsystems. Man erhält 0,445 g der vorstehend genannten Verbindung (R_f = 0,64).

Das IR-Spektrum an KBr zeigt die folgenden Banden :

3,00 (Hydroxyl), 3,48, 5,82 (breit, Carbonyl), 6,05 (Vinyl-

carbonyl), 6,65, 6,98, 7,35, 7,90, 8,20, 9,05, 9,48,

10,60, 10,93, 11,10, 11,55, 11,85, 12,00, 12,48, 12,80 und 13,65/U.

Das NMR-Spektrum in 50 % CDCl^-Aceton-dg zeigt Signale bei S ■ 7,66 (s, 1, aromatisches OH); 7,05 und 6,75 (A₂B₂-Quartett, 4,J= 8,4 Hz, Tyrosin^¹-^¹- und 2'-,6'-Protonen), 5,65 (s, 1,C= CH); 3,75 (s, 3, -OCH₃); 1,46 (s, 3, 19-CH₃) und 0,93 ppm (s, 3, 18-CH₃).

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Beispiel 14

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 17ß-0--f N-/"~l-Carbomethoxy-2-(4'-hydroxyphenyl)-äthyl_7_i -carbamylandrost-4-en-3-on, Trivialbezeichnung: 17-(Tyrosin-methylester)· carbamyl-testosteron :

In gleicher Weise wie in Beispiel 5 lässt man 4 Tage lang
0,200 g Testosteron mit 0,280 g 2-Isocyanato-3-(4'-trimethylsiloxyphenyl)-propionsäure-methylester in 3 ml wasserfreiem
Pyridin bei 50⁰C reagieren. Das Lösungsmittel wird unter
vermindertem Druck entf erntj und der Rückstand wird mit Methanol behandelt, um die Trimethylsilyl-Schutzgruppe abzuspalten. Nach der Reinigung mittels präparativer Dünnschicht-Chromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems erhält man 0,063 g der vorstehend genannten Verbindung (R_f = 0,68).

Das IR-Spektrum an KBr zeigt die folgenden Banden :

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2,99 (Hydroxyl), 3,40, 5,85 (breit, Carbonyl), 6,19 (Vinylcarbonyl), 6,68, 6,95, 7,42, 7,90, 8,30, 9,45, 11,55, 12,10, 12,50 und 12,90/U.

Das NMR-Spektrum (CDCl,) zeigt Signale bei % = 7,26 (s, 1, aromatisches OH); 6,98 und 6,73 (A₂B₂-Quartett, 4,J= 8,6 Hz, Tyrosin-3'-,5^f- und 2'-,6'-Protonen); 5,73 (s, 1,-C - CH); 3,73 (s, 3,-OCH₃); 1,16 (s, 3, 19CH₃) und 0,76 ppm (s, 3, 18-CH₃).

Beispiel 15

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3B-O-/~l-Carbomethoxy-2-(4·-hydroxyphenyl)-äthyl^/f -carbamyl-12ß, I4ß-dihydroxy-5ß-card-20(22)enolid, Trivialbezeichnung: 3-(Tyrosin-methylester)-carbamyl-digoxigenin :

OH M

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Unter Anwendung des in Beispiel 5 beschriebenen allgemeinen Verfahrens rührt man 3 Tage lang ein Gemisch von 0,1GO g Digoxigenin und 0,085 g 2-Isocyanato-3-(4'-trimethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester in 1,5 ml wasserfreies Pyridin bei 70°C. Dann entfernt man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck und löst den Rückstand in Methanol, um die Trimethylsilyl-Schutzgruppe abzuspalten. Dann unterwirft man das Reaktionsgemisch der präparativen DünnschichtChromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 5 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems. Man erhält 0,029 g der vorstehend genannten Verbindung (R_f = 0,60).

Das IR-Spektrum dieser Verbindung zeigt Banden bei :

3,00 (Hydroxyl), 3,45, 5,80 (breit, Carbonyl), 6,20, 6,65, 7,00, 7,38, 7,95, 8,20, 9,55, 9,80 und 12,00/U.

Das NMR-Spektrum in 50 % CDCl^-Aceton-dg zeigt Signale bei S - 7,51 (s, 1, aromatisches OH); 7,03 und 6,79 (A₂B₂-Quartett, 4,J= 8,6 Hz, Tyrosin^'-.S¹- und 2'-,6'-Protonen); 5,93 (s, 1, Lacton-C = CH); 3,75 (s, 3, OCH₃); 0,97 (s, 3, 19CH₃) und 0,86 ppm (s, 3, 18-CH₃).

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Beispiel 16

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3ß-O-/~O-ß-(3ß-O- -f N-/""l-Carbomethoxy-2- (4^f -hydroxyphenyl )_7-äth-l-ylJ carbamyl-digitoxosyl)-(i -^ 4)-0-ß-digitoxosyl-(1 -£· 4)-ßdigitoxos-l-yl_7-i4ß-hydroxy-5ß-card-20(22)-enolid, Trivialbezeichnung: ^'-(Tyrosin-methylesterJ-carbamyl-digitoxin :

Unter Anwendung des in Beispiel 5 beschriebenen allgemeinen Verfahrens lässt man 5 Tage lang ein Gemisch von 0,200 g Digitoxin und 0,100 g 2-Isocyanato-J5-(4^l-trimethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester in 2,5 ml wasserfreiem Pyridin bei 50⁰C reagieren. Das Lösungsmittel wird anschliessend unter vermindertem Druck abgedampft, und das rohe Reaktionsgemisch mit Methanol behandelt, um die Schutzgruppe abzuspalten. Nach der Reinigung des Rohprodukts mittels präparativer Dünnschicht-

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Chromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems erhält man 0,134 g der vorgenannten Verbindung (R ~ = 0,71).

Das IR-Spektrum zeigt Banden bei 2,95 (Hydroxyl), 3,42, 5,85 (breit, Carbonyl), 6,20, 6,65, 6,95, 7,35, 7,95, 8,28, 8,65, 8,90, 9,40 (breit), 11,60 und 12,20 /U.

Das NMR-Spektrum (50 % CDCl^-Aceton-dg) zeigt Signale bei $ = 7,71 (s, 1, aromatisches OH); 6,93 und 6,63 (A₂B₂-Quartett, 4,J = 8,6 Hz, Tyrosin-3'-,5'- und 2'-,6'-Protonen), 5,78 (s, 1, Lacton-C = CH); 3,61 (s, 3, OCH^i; 0,83 (s, 3, 19-CH₃) und 0,73 ppm (s, 3, 18-CH₃).

Beispiel 17

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3-0- I N-/"*1-Carbome thoxy-2-(k·-hydroxyphenyl)-äthyl 7r-carbamylöstra-1, 3,5(10)-trien-17-on, Trivialbezeichnung: 3-(Tyrosinmethylester)-carbamyl-östron :

:H₂CHNHCO CO₂CH₃

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Unter Anwendung des in Beispiel 5 beschriebenen allgemeinen Verfahrens lässt man 5 Tage lang ein Gemisch von 0,200 g Östron und 0,250 g 2-Isocyanato-3-(4'-trimethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester in 3 ml wasserfreiem Pyridin bei 60⁰C reagieren. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck löst man das erhaltene rohe Reaktionsgemisch in Methanol, um die Schutzgruppe abzuspalten. Nach der Reinigung mittels Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 5 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungsmittelsystems erhält man 0,079 g der vorgenannten Verbindung (R_f = 0,68).

Das IR-Spektrum dieser Verbindung zeigt Banden bei :

3,00 (Hydroxyl), 3,42, 5,78 (breit, Carbonyl), 6,23, 6,65, 6,95, 7,35, 7,95, 8,22, 8,50, 9,53, 10,00, 10,95, 12,00 und 12,90/U.

Das NMR-Spektrum in CDCl₃ zeigt Signale bei 8 - 6,83 (m, 7, aromatische Protonen); 3,66 (s, 3, OCH₃) und 0,81 ppm (s, 3, 18-CH₃).

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Beispiel 18

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3-0-/~l-Carbomethoxy-2-(4' -hydroxyphenyl )_j\ -carbamyl-^ß-hydroxyöstra-1,3,5(iO)-trien, Trivialbezeichnung: 3-(Tyrosin-methylester)-carbamyl-östradiol :

OH

CO₂CH₃

Zuerst wird die reaktionsfähige 17ß-Hydroxylgruppe mittels einer Trimethylsilyl-Gruppe (im folgenden abgekürzt als TMS-Gruppe) geschützt. Zu diesem Zweck rührt man eine Stunde lang ein Gemisch von 0,272 g 17ß-Östradiol und 2 ml Trimethylsilyl-Ν,Ν-dimethyl-carbamat (Überschuss) bei Raumtemperatur, um beide Hydroxylgruppen mit TMS-Gruppen zu schützen. Dann entfernt man nicht umgesetztes Trimethylsilyl-N.N-dimethyl-carbamat unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur.

Um eine 3-TMS-Gruppe selektiv abzuspalten, während die 17-TMS-Gruppe intakt bleibt, wird dann das rohe Reaktionsgemisch in 40 ml 50 Prozent Methanol enthaltender Chloroformlösung gelöst. Die Lösung wird zwei Stunden unter Rückfluss erhitzt. Die selektiv freigesetzte 3-Hydroxylgruppe wird dann wie folgt mittels NMR-Spektroskopie überprüft. Bei dem 3,17-disubstitu-

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ierten-TMS-Derivat in Deuterochloroform als Lösungsmittel erscheinen zwei scharfe Singuletts von gleicher Intensität, die der 3- und 17-TMS-Gruppe entsprechen, bei 30 bzw. 38,6 Hz oberhalb des Feldes des Signals für die 18-Methylgruppe. So wie die Freisetzung fortschreitet, verschwindet das Signal bei 30 Hz (3-TMS), während das Signal bei 38,6 Hz unverändert bestehen bleibt. Das Lösungsmittel wird dann unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur abgezogen, und man erhält 0,345 g der nur in der 17-Stellung geschützten 3»17-Dihydroxy-TMS-Verbindung.

Die Gesamtausbeute an der Zwischenverbindung wird dann mit 0,400 g 2-Isocyanato-3-(4'-tert.-butyl-dimethyl-siloxyphenyl)-propionsäure-methylester in 4 ml wasserfreiem Pyridin 5 Tage lang bei Raumtemperatur umsetzen gelassen. Anschliessend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wird mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösungssystems gereinigt, und man erhält

3-0- { N-^r

phenyl)-äthyl_7}-carbamyl-17ß-trimethylsiloxy-östra-1,3,5(10)-

trien als reine Verbindung, R_f = 0,6.

Um beide Silyl-Schutzgruppen zu entfernen, rührt man ein Gemisch von 0,080 g dieser Verbindung, die in 5 ml Dioxan gelöst ist, 1 ml Methanol und 0,200 g Tetraäthylammoniumfluorid» das in 1 ml destilliertem Wasser gelöst ist, zwei Tage lang bei

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Raumtemperatur. Anschliessend werden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur abgezogen. Der erhaltene Feststoff wird mit destilliertem Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält die reine Verbindung.

Das IR-Spektrum (Aufstrich) der reinen Verbindung zeigt Banden bei :

3,00 (Hydroxyl), 3,42, 5,90 (breit, Carbonyl), 6,23, 6,68, 6,95, 7,42, 8,22, 9,45, 11,50, 12,20 und 12,90_/U.

Das NMR-Spektrum (Aceton-dg) zeigt Signale bei S = 6,85 (m, 7, aromatische Protonen): 3,66 (s, 3, OCH₅) und 0,76 ppm (s, 3, 18-CH₃).

Beispiel 19

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 3-0- ■{ N-/~l-Carbomethoxy-2-(4·-hydroxyphenyl)_7j -carbamyl-iooi,, 17ßdihydroxy-östra-1,3,5(10)-trien, Trivialbezeichnung: 3-(Tyrosin-methylester)-carbamyl-östriol :

OH

-CH-CHNHCO
²I
CO₂CH₃

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-ß9-

Zuerst werden die reaktionsfähigen I6c< - und 17ß-Hydroxylgruppen mit Trimethylsilyl-Gruppen geschützt. Zu diesem Zweck verrührt man 0,288 g Östriol mit 2 ml Trimethyl-silyl-N,N-dimethyl-carbamat (Überschuss) zwei Stunden lang bei 50⁰C, um alle drei Hydroxylgruppen mit TMS-Gruppen zu schützen. Nicht umgesetztes Trimethyl-silyl-NjN-dimethyl-carbamat wird anschliessend unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur abgezogen.

Um die 3-TMS-Gruppe selektiv zu entfernen, während die 16- und 17-TMS-Gruppen intakt bleiben, wird das rohe Reaktionsgemisch in 40 ml einer 50 Prozent Methanol enthaltenden Chloroformlösung gelöst. Die Lösung wird dann 4 Stunden unter Rückfluss zum Sieden erhitzt. Die selektive Freisetzung der 3-Hydroxylgruppe wird mittels NMR-Spektroskopie wie folgt überwacht: Bei dem 3,16,17-tri-substituierten TMS-Derivat in Deuterochloroform als Lösungsmittel erscheinen zwei scharfe Singuletts mit einem Intensitätsverhältnis von 1:2, die der 3-TMS-Gruppe bzw. den beiden zusammenfallenden 16- und 17-TMS-Gruppen entsprechen, bei 30,6 bzw. 36,6 Hz oberhalb des Feldes des Signals der 18-Methylgruppe. So wie die Freisetzung fortschreitet, verschwindet das Signal bei 30,6 Hz (3-TMS), während das Signal bei 36,6 Hz unverändert bestehen bleibt. Anschliessend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur entfernt, und man erhält 0,434 g (1,0 χ 10~⁵ Mol) der nur in den 16- und 17-Stellungen durch TMS-Gruppen geschützten 3,16,17-Trihydroxy-Verbindung.

Die Gesamtausbeute von 0,434 g dieser Zwischenverbindung wird

709850'/07SB

dann 3 Tage lang bei 64⁰C mit 1,47 g (5,0 χ 1O~³ Mol) 2-Isocyanato-3-(4'-tert.-butyl-dimethyl-s iloxyphenyl)-propionsäuremethylester in 3 ml wasserfreiem Pyridin umsetzen gelassen. Anschliessend entfernt man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck und reinigt das erhaltene Rohprodukt mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung von 10 Prozent Methanol enthaltendem Methylenchlorid-Lösungsmittelsystems. Man erhält

0,060 g 3-0-{ N-/~l-Carbomethoxy-2-(4'-tert.-butyl-dimethylsiloxyphenyl)-äthyl_7j -carbamyl-i6o<,IVß-bis-trimethyl-siloxy· östra-1,3,5(iO)-trien als reine Verbindung. R_f = 0,5.

Um die beiden Silyl-Schutzgruppen zu entfernen, rührt man einen Tag lang bei Raumtemperatur das Gemisch von 0,060 g dieser Verbindung, die in 10 ml Dioxan gelöst ist, und 0,150 g Tetraäthylammoniumfluorid, das in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst ist. Dann entfernt man die Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur, wäscht den erhaltenen Feststoff mit destilliertem Wasser und trocknet ihn unter vermindertem Druck. Man erhält die reine Verbindung.

Das IR-Spektrum dieser Verbindung (Aufstrich) zeigt Banden bei :

3,00 (Hydroxyl), 3,44, 5,90 (breit, Carbonyl), 6,22, 6,68, 6,95, 7,37, 8,15, 8,52, 9,45, 10,95, 12,15 und 12,75/U.

709850/0758

Das NMR-Spektrum (Aceton-dg) zeigt Signale bei <S = 8,00 (s, 1, aromatisches OH): 6,84 (m, 7, aromatische Protonen) *_f 3,70 (s, 3, OCH₃) und 0,81 ppm (s, 3, 18-CH₃).

Beispiel 20

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 11Λ-0-ΤΝ-/""l-Carbomethoxy-2-(4' -hydroxyphenyl )-äthyl_7/ -carbamyl-pregn-4-en-3,20-dion, Trivialbezeichnung: 11-(Tyrosin-methylester)-carbamyl-progesteron :

Unter Anwendung des in Beispiel 5 beschriebenen allgemeinen Verfahrens lässt man 0,166 g (5 x 10 Mol) 11 oc -Hydroxyprogesteron drei Tage lang bei 6O⁰C mit 0,200 g (6 χ 10 Mol) 2-Isocyanato-3-(4·-trimethyl-siloxy-phenyl)-propionsäuremethylester in 4 ml wasserfreiem Pyridin reagieren. Anschliessend entfernt man das Lösungsmittel unter vermindertem Druck und löst das Rohprodukt in Methanol, um die Trimethylsilyl-Gruppe abzuspalten. Nach der Reinigung mittels präparativer Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 10 Prozent Methanol enthaltenden Äthylacetat-Lösungsmittelsystems erhält man 0,207 g der vorgestehend genannten Verbindung (R_f = 0,71).

709830/0758

Das IR-Spektrum (KBr) zeigt Banden bei :

3,10 (Hydroxyl), 3,50, 5,80 (breit, Carbonyl), 6,00, 6,65, 6,98, 7,45, 8,25, 9,55 und 12,0OyU.

Das NMR-Spektrum (CDCl₃) zeigt Signale bei S = 6,98 (m, 5, aromatische Protonen und OH): 5,76 (s, 1, CH = C); 3,78 (s, 3, OCH₃); 2,11 (s, 3, CH₃C = 0); 1,23 (s, 3, 19-CH₃) und 0,70 ppm (s, 3, 18-CH₃).

Beispiel 21

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von 6-(TME)-ureido-nicotin (Trivialbezeichnung), einem Nicotinisocyanat-Addukt, das zur Durchführung des Nikotin-Versuchs geeignet ist :

HO —<(_χ J— CH₂CH-NHCNH

CO₂CH₃

Ein Gemisch von 0,280 g (0,00158 Mol) 6-Amino-nicotin und 0,500 g (0,0017 Mol) 2-Isocyanato-3-(4'-trimethyl-siloxypheny])-propionsäure-methylester, der nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, wird in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Anschliessend entfernt man das Pyridin unter vermin-

709850/0758

dertem Druck bei Raumtemperatur, fügt 5 ml Methanol hinzu und rührt das Gemisch weitere 30 Minuten.

Anschliessend wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck auf etwa 1 ml eingeengt und der präparativen Dünnschichtchromatographie an Silicagel mit den Plattenabmessungen 20 χ 20 χ 0,2 cm unter Verwendung eines 20 Prozent Methanol enthaltenden Athylacetat-Lösungsmittelsystems unterworfen. Man erhält die vorstehend genannte Verbindung (R- = 0,23).

Das IR-Spektrum (KBr) zeigt Banden bei :

3.1, 3,2 (NH), 5,8 (Ester-Carbonyl), 5,98 (Harnstoff-Carbonyl),

6.2, 6,3, 6,5, 6,7, 8,2 und 12,00/u.

Das UV-Spektrum in 0,1 - η NaOH zeigt Maxima bei λ = 286 nm (£ = 9540) und 237 nm (£ = 35 100).

Das NMR-Spektrum in DMSO-dg zeigt Signale bei S » 9,36 (s, 1, NH); 8,80 (breit, Dublett, 1, NHCH): 8,41 (s, 1, OH); 7,77 (m, 2, 2- und 4-Protonen); 6,98 und 6,66 (A₂B₂-Quartett, 4, J m 9,0 Hz, Tyrosin-3'-,5'- und 2'-,6'-Protonen); 4,50 (s, 1, Tyrosin-CHCH^; 3,61 (s, 3, CO₂CH₃) und 2,09. ppm (s, 3, NCH₃).

709850/0758

2722U38

Beispiel 22

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung eines anderen analogen Nicotin-isocyanat-Addukts, das zur Durchführung des Nikotin-Versuchs geeignet ist. Die Verbindung hat die Trivialbezeichnung 2-(TME)-ureido-nicotin.

CH.

^,— >v

OH

C-NHCHCH₂-^ Q V-

Ii I \ /

O CO₂CH₃

Ein Gemisch von 0,290 g 2-Amino-nicotin und 0,500 g des 2-Isocyanato-3-(4'-trimethyl-siloxyphenyl)-propionsäuremethylesters, der nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, wird in 5 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.

Man entfernt das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur, versetzt das Reaktionsgemisch mit Methanol und rührt es weitere 30 Minuten. Dann entfernt man das Methanol unter vermindertem Druck und kristallisiert das Rohprodukt aus Aceton um. Man erhält die in der Überschrift genannte Verbindung als Feststoff vom Fp. 205 bis 206⁰C (Zersetzung).

Diese Verbindung zeigt einen Laufwert R^. = 0,77, wenn es der Dünnschichtchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines 15 Prozent Methanol enthaltenden Methylenchlorid-

709850/0758

- 66 -

Lösungsmittelsystems unterworfen wird.

Das UV-Spektrum in 0,1-n NaOH zeigt Maxima bei Λ 286 nm (£ = 6 440) und 237 nm ( £ =21 800).

Das IR-Spektrum (KBr) zeigt Banden bei 3,3, 3,5, 5,75 (CO₂CH₃); 6,08, 6,32, 6,52, 6,97, A,45, 8,30, 11,94, 12,45 und 12,90/U.

Das NMR-Spektrum in DMSO-dg zeigt Signale bei <5 = 10,32 (s, 1, NH); 9,70 (breites Dublett, 1,J= 8,0 Hz, NH-CHCH₂); 9,23 (s, 1, -OH); 8,00 (d, 1,J= 4,9 Hz, 6-Proton); 7,55 (d, 1,J= 7,0 Hz, 4-Proton); 7,01 und 6,68 (A₂B₂-Quartett, 4, J = 8,1 Hz Tyrosin-3'-,5'- und 2·-,6·-Protonen); 6,91 (m, 1, 5-Proton); 4,50 (m, 1, Tyrosin-CH-CH₂); 3,64 (s, 3, CO₂CH₃); 2,95 (m, 2, Tyrosin-CHCH₂) und 2,13 ppm (s, 3, N-CH₃).

Beispiel 23

Dieses Beispiel zeigt die Anwendung vorliegender Erfindung bei der Bestimmung des Digoxinspiegels im Blutserum mittels der Radioimmunoassay-Technik.

Standardpraparate und unbekannte Präparate von Digoxin werden in getrennten Proberöhrchen mit monojodiertem 15'-(TME)-carbamyl-digoxin-J (kurz als Digoxin- "³J bezeichnet), das gemäss dem Verfahren in Beispiel 6 hergestellt worden ist, hinsichtlich einer begrenzten Anzahl von Bindungsstellen bei einem in Kaninchen erzeugten Digoxin-Antiserum miteinander in Konkurrenz treten gelassen. Nach der Inkubation wird das Reaktionsgemisch auf eine mit Styrol vernetztem Dextran

709850/0758

(fSephadex G-25^H, fein, der Firma Pharmacia Fine Chemicals Company) gefüllte Säule aufgebracht, wo die Trennung des gebundenen Digoxins von dem freien Digoxin bewirkt wird. Die Immunoreaktionen können im Gleichgewicht wie folgt dargestellt werden :

Digoxin- ^J + Serum-Digoxin + Anti-Digoxiri^ (Anti-Digoxin " Digoxin- J) + (Anti-Digoxin · Serum-Digoxin)

12*5
+ Digoxin- ^JJ + Digoxin

Das vorstehend gebildete Inkubationsgemisch wird auf die vorstehend genannten Säule aufgebracht. 1,7 ml-Anteile des Eluats werden so aufgebracht, dass die markierten und die nicht markierten Antigene absorbiert und die markierten und die nicht markierten Komplexe eluiert werden, und zwar mit dem folgenden Ergebnis :

im Eluat: (Anti-Digoxin-Digoxin- ^J) + (Anti-Digoxin) ·

Digoxin)

125
auf der Säule : Digoxin- ^J + Digoxin

Bei dem nachstehenden, im einzelnen beschriebenen Verfahren werden übliche Prototypen von einem Pipettenkarussel und einem automatischen Zentrifugalanalysator im Laboratiumsmassstab verwendet. Es wird eine Digoxin-Vorratslösung durch Auflösen von 0,010 g Digoxin in 50 ml 95 prozentigem Äthanol

709850/0758

- se -

hergestellt. 1 ml-Anteile werden in gefrorenem Zustand aufbewahrt. Ein Zwischenprodukt-Standard wird dadurch erhalten, dass man 1 ml der Digoxin-Vorratslösung mit 100 ml Phosphatpufferlösung verdünnt. Die Phosphatpufferlösung wird durch Auflösen von 1,392 g Dikaliumhydrogenphosphat, 0,276 g Natriumdihydrogenphosphat und 8,76 g Natriumchlorid in 750 ml destilliertem, voll-entsalztem Wasser, Einstellen der Lösung auf pH 7,4 und Verdünnen auf 800 ml mit destilliertem, voll-entsalztem Wasser hergestellt. Der Zwischenproduktstandard enthält 2,0/Ug/ml. Ein Arbeitsstandard, der durch Zugeben von 100/Ul des Zwischenproduktstandards zu 9,9 ml Phosphatpuffer hergestellt worden ist, enthält 20 ng/ml. Die Vorratslösung und die Zwischenproduktlösung können bis zur Verwendung in gefrorenem Zustand aufbewahrt werden. Es werden Standardlösungen hergestellt, die 20,0, 10,0, 5,0, 3»0, 2,0, 1,0, 0,4 und 0,0 ng/ml enthalten. Dann werden 250/Ul-Anteile der Standardverbindungen und der unbekannten Verbindungen in 0,5 ml-Probeschälchen eingebracht, die dann in das Pipettenkarussel eingesetzt werden.

Die Vorratslösung des Antiserums wird durch Verdünnen von 0,5 ml eines Kaninchen-Antiserums mit dem Titer 1 : 2300 auf 10,0 ml mittels einer 2 prozentigen Rinderserumalbumins (RSA)/ phosphatgepufferten Kochsalzpufferlösung (PBS) hergestellt.

Die schliessliche Arbeitsverdünnung (Titer) beträgt demzufolge 1 : 46 000, von der je Probe 200 /ul verwendet werden. Dann werden Reagens-Schiffchen (15ml) zur Beschickung des Pipet-

70985 0/0758

tiergeräts in das Pipettiergerät eingesetzt und mit 10 ml Antiserum-Reagens, 2 ml des nach Beispiel 6 hergestellten

125
Digoxin- J und mit 5 ml PBS-Lösung beschickt. Das Volumen der Probe wird so eingestellt, dass 50/Ul auslaufen. Das Volumen der Probe plus Lösung wird so eingestellt, dass 99/ul (50/Ul der Probe plus 49 /Ul der PBS-Lösung) auslaufen.

Das Pipettiergerät wird so eingestellt, dass 200 /ul des Anti-

125 serums-Reagens und 50yul des radioaktiven Antigens Digoxin- J

auslaufen. Eine 30 Proben fassende Ubertragungsscheibe wird in der Mitte des Karussels angeordnet. Während die Übertragungsscheibe mit dem Pipettiergerät beschickt wird, werden 30 Prüfröhrchen mit den Abmessungen 15 χ 125 mm (Kimble 45042) in den Prüfröhrchenring des Inkubators/Separators eingesetzt. Dann wird eine ausreichende Anzahl von Säulen, die mit dem vorerwähnten mit Styrol vernetzten Dextran gefüllt sind, in die Prüfrührchen eingesetzt, so dass bei dem Ansatz die Anzahl der Standardproben derjenigen der unbekannten Proben, gewöhnlich doppelte Ansätze, entsprechen. Das System wird mit der PBS-Pufferlösung gefüllt, und der Inkubator wird 15 Minuten bebrütet. Das Elutionsvolumen wird auf 1,7 ml festgesetzt.

Wenn der Umlauf des Pipettiergeräts beendet ist, so dass Antiserum, Standardverbindungen, unbekannte Verbindungen und j

125 '

radioaktives Digoxin- ^J in die inneren und äusseren Sektio- ι nen der Ubertragungsscheibe ausgelaufen sind, werden die letzt-! genannten aus dem Inkubator/Separator vorsichtig entfernt, so dass die unterschiedlichen Lösungen in ihren betreffenden

Abteilen verbleiben. Dann wird der Inkubator/Separator ;

709850707B8

eingeschaltet und etwa 16 Minuten laufen gelassen, und zwar 15 Minuten für die Inkubation und eine Minute für die Eluierung durch die mit dem Styrol vernetzten Dextran-gefüllten Säulen. Die Rotation während der Inkubation beträgt etwa 100 Umdrehungen je Minute, wobei die 200/ul des Antiserums von den jeweiligen inneren Teilen der Ubertragungsscheibe in die jeweiligen äusseren Teile der Ubertragungsscheibe überführt werden, in denen jeweils 50/Ul der unbekannten Lösung oder der Standard-Antigenlösung mittels des Pipettiergerätes eingebracht worden sind. Nach 15 minütiger Inkubation wird die Rotation zum Eluieren und Spülen auf 200 Upm gesteigert. Nicht reagierter Antikörper, Serum und Antigen-Antikörper-Komplex werden durch die feinen Teilchen der auf Polystyrolbasierenden Perlchen gewaschen und auf den Boden der Prüfröhrchen angesammelt, während sich das markierte und nicht markierte freie Antigen durch Diffusion in die Poren der Perlchen langsamer bewegt und in den Säulen verbleibt.

Ein Strahlungsintensitätsmesser, der drei von den 30 Röhrchen gleichzeitig in einer Minute zählt und so konstruiert ist, dass nur der Eluatteil am Boden der Prüfröhrchen in den Strahlungsintensitätsmesser reicht, wird dann zur Zählung aller Proben eingesetzt. Das hintereinander erfolgende Zählen der 30 Röhrchen erfordert somit etwa 12 Minuten. Ein kleiner Computer mit Kopierfähigkeit druckt dann die Daten nach Beendigung des Umlaufs durch die 30 Lagen (20 mal bei drei Ablesungen gleichzeitig) aus. Der Druck liefert im Effekt die Dosisreiz-Kurve für den Ansatz des Antiserums, da üblicher-

?0985070758

weise 18 der 30 Röhrchen mit Standardlösungen und 12 mit unbekannten Lösungen gefüllt sind. In charakteristischer Weise laufen 4 bis 6 unbekannte Verbindungen als Doppelansätze. Der Mittelwerte von 1,4 + 0,4 ng/ml mit einem Bereich von 0,8 bis 2,4 ng/ml Digoxin ist bei nicht-toxischen Patienten gefunden worden. Der Mittelwert bei toxischen Patienten ist zu 3,3 + 1»5 ng/ml mit einem Bereich von 2,1 bis 8,7 ng/ml gefunden worden.

Eine typische Standardkurve ist in der anliegenden Zeichnung zu sehen. Daraus ist ersichtlich, dass nach vorliegender Erfindung eine bessere adäquate Empfindlichkeit erreicht wird.

Beispiel 24

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von Derivaten vorliegender Erfindung bei der Untersuchung von Cortisolspiegeln im Blutserum unter Verwendung der Technik des Radioimmunoassays.

Cortisolspiegel in 0,2 ml Serum werden nach einer Vorbehandlung durch Extrahieren des Cortisols aus nichtspezifischen Bindeproteinen mittels 0,8 ml einer 11 Prozent Methanol enthaltenden 0,05-m Barbital-Pufferlösung vom pH 8,6 und durch 30-minütiges Erhitzen auf 60⁰C bestimmt. Es werden die gleiche Vorrichtung und die gleichen Eluierungssäulen wie in Beispiel 23 verwendet, doch wird das Eluierungsvolumen auf 1,4 ml herabgesetzt. Die anderen verwendeten Reagentien sind eine Gelatine-Barbital-Pufferlösung, die aus 0,1 Prozent Gelatine in einer 0,05-ra Natriumbarbital-Pufferlösung besteht, Cortisol

J0985070758

und Cortisol-Antiserum aus Schafen (S-114), das in einer Verdünnung von 1 : 16 000 in 0,1-prozentiger Gelatine-Barbital-Pufferlösung vom pH 8,6 und einer 0,05-Molarität vorliegt. Der Arbeitsstandard von Cortisol beträgt 16 ng/50/ul. Die Volumen von Antiserum und Probe betragen wiederum 200/ul und 50/Ul. Die Inkubationszeit wird auf 30 Minuten und die Separationszeit auf 1,5 Minuten erhöht. Die Probe des radioaktiv markierten 21-(TME)-carbamyl-cortisol-¹²⁵J (1,5/uCi/0,5 ml Äthanol) wird mit 0,1~prozentiger Gelatine-Barbital-Puffer-

18 QOO
lösung verdünnt, so dass man /bis 20 000 cpm erhält.

Im Markierungsgerät findet man ein Verhältnis von 50 : 50 gebundene zu freie Verbindung bei einer weiteren Verdünnung von 1 : 10, d.h., etwa 1 800 cpm unter Versuchsbedingungen.

In der gleichen Weise liefert radioaktiv markiertes 21-(Tyramin)-carbamyl-cortisol- J ein Verhältnis von 1 : 2 von gebundener zu freier Verbindung bei 895 cpm (Zählungen Je Minute)

109850/0758

Claims

Patentansprüche

1. Stoffzusammensetzungen auf Basis von Isoeyanat-Reaktionsprodukcen, enthaltend ein Reaktionsproduke aus

a) einer Substanz der Gruppe Steroide, Steroidglycoside, Arzneimittel, Drogen, Rauschgifte, Vitamine, pflanzliche und tierische Hormone, Peptide, Proteine, Aminosäuren, Enzyme, Pestizide, Polyamide, Viren, Bakterien, Zellen, Nikotinderivate und andere Metabolite, wobei diese Substanzen mindestens eine mit einer Isocyanatgruppe reagierende Gruppe aufweisen, und

b) einer Isocyanatverbindung der allgemeinen Formeln (I) oder (II)

(R) ₃SiO—<jO)—CH₂CH₂N=C=O (i)

^Oder CO₂CH₃

(R)₃SiO <O) CK₂CHN-C=O (II)

in der R ein bis zu 10 Kohlenstoffatome aufweisender Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkylrest ist.

2. Stoffzusammensetzungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz (a) eine solche aus der Gruppe

7Π98Β0/0758

ORIGINAL INSPECTED

Angiotensin I oder II, Digoxin, Testosteron, Dihydrotestosteron, Aldosteron, Cortisol, Östron, Digoxigenin, Digitoxin, 17ß-Östradiol, Östriol, Hoir-Hydroxyprogesteron, Gentamicin, Penicillin, Theophyllin oder 2- oder 6-Amino-nicotin ist.

3. Stoffzusammensetzungen nach den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Hydroxyl-Derivate der Reaktionsprodukte enthalten.

4. Stoffzusammensetzungen nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie die mit radioaktivem Jod markierten Hydroxyl-Derivate der Reaktionsprodukte enthalten.

5. Stoffzusammensetzungen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie die mit radioaktivem Jod monojodierten Derivate der Reaktionsprodukte enthalten.

6. Stoffzusammensetzungen nach den Ansprüchen 4 oder 5, da-

125

durch gekennzeichnet, dass sie die mit J markierten Derivate der Reaktionsprodukte enthalten.

7. Verbindung der nachstehenden Strukturformel :

7nqRRO/0758

im

OCH.

8. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel

709850/0758

9. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel :

10. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel :

OCNHCHCh

₂-(

CO₂CH₃

-OH

11. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel

HO

709850/07SB

-TT-

S"

12. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel :

O CO₂CH₃

HO

13. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel

14. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel :

CO CH,

703850/07^8 ' ORIGINAL INSPECTED

15. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel :

16. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel

^HO"\Q)~^CH2^CK

17. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel :

H. HO-J \ η Η

OH

/ ^-OH

NH

OCH.

709850/076·

2722Ü38

18. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel :

CH„CHNHC0

CO₂CH₃

19. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel :

s η

OH

-CH CHNHCO'

20. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel

Il

,CHNKCO.

709850/0758

21. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel

ίί

'__\)~CH 2 CHNHCNH' CO₂CH₃

22. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel

-NHCHCH--

Il I ²

0 CO₂CH₃

OH

23. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel

OH CHO y=

OCNHCH₂CH₂-U ;>-0H

709850/0758

- ei -

ii 2 7 2 2 u 3 B

24. Verbindung nach der nachstehenden Strukturformel :

J&*

O CO₂CH₃
0CNHCHClI₂-/O^~^0H

25. Verbindungen nach einem der Ansprüche 11 bis 28 in Form des mit radioaktivem Jod markierten Derivats.

125 26. Verbindungen nach Anspruch 25 in Form des mit -Jod markierten Derivats.

27. Verfahren zur Herstellung der Stoffzusammensetzungen nach den Ansprüchen 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Substanz der Gruppe Steroide, Steroidglycoside, Arzneimittel, Drogen, Rauschgifte, Vitamine, pflanzliche und tierische Hormone, Peptide, Proteine, Aminosäuren, Enzyme, Pestizide, Polyamide, Viren, Bakterien, Zellen, Nikotinderivate und andere Metabolite, wobei diese Substanzen mindestens eine mit einer Isocyanatgruppe reagierende Gruppe aufweisen, mit einer Isocyanatverbindung der allgemeinen Formeln (I) oder (II)

(R) ₃Si0—\yj) CH₂CH₂N=C=O

^oder CO2CH3

(R) 3S1O—\O) CH₂CHN=C=O

7098S0/07S8

in denen R ein bis zu 10 Kohlenstoffatome aufweisender Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkylrest ist, eine ausreichende Zeit lang und bei einer geeigneten Temperatur zur Bildung des Reaktionsproduktes umsetzt und das Reaktionsprodukt isoliert.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umsetzung unter photochemischen Bedingungen durchführt.

29. Verwendung der Stoffzusammensetzungen nach den Ansprüchen 1 bis 26 zur quantitativen Analyse oder dergleichen.

30. Verwendung der Stoffzusammensetzungen nach den Ansprüchen

1 bis 26 zur Durchführung von kompetitiven Bindungs-Radioassays einer interessierenden Substanz oder Verbindung in einer klinischen Probe, wobei man

(a) eine Eich- bzw. Messkurve des Zerfalls je Zeiteinheit gegen die Konzentration der Substanz unter Verwendung eines mit radioaktivem Jod markierten Hydroxyl-Derivats eines Reaktionsproduktes aus der Substanz oder dessen Analogon und einer Isocyanatverbindung der allgemeinen Formeln (I) oder (II)

CH₂CH₂N=C=O

CO₅CH,, CH₂CHN=C=O (II)

709850/0758

'%' 2722Q38

in der R ein bis zu 10 Kohlenstoffatome aufweisender Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkylrest ist, aufstellt

(b) den Zerfall je Zeiteinheit der interessierenden Substanz bzw. Verbindung in der klinischen Probe bestimmt, indem man sie kompetitiven Bindungsbedingungen unterwirft, und

(c) die Konzentration der interessierenden Verbindung aus der Eich- bzw. Messkurve abliest.

31. Isocyanatverbindungen der allgemeinen Formel (III)

(R)₃SiO-R'-N=C=O (III)

in der R ein bis zu 10 Kohlenstoffatome aufweisender Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Alkaryl- oder Aralkylrest ist und R' eine der nachstehenden Gruppen

CO₂CH₃

, -<Q>-ch₂ch- oder -(CH₂J₂-.

bedeutet.

32. Isocyanatverbindung nach Anspruch 31, wobei R¹ die Gruppe

bedeutet.

709850/0758

"*" 27??Π38

33. Isocyanatverbindung nach Anspruch 31_t wobei R¹ die Gruppe

CO₂CH₃

CH CH-.

bedeutet.

34. Isocyanatverbindung nach Anspruch 31» wobei R¹ die Gruppe

bedeutet.

709850/075·